ES2245879B1 - Composicion para la reparacion osea o cartilaginosa. - Google Patents
Composicion para la reparacion osea o cartilaginosa.Info
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Abstract
Composición para la reparación ósea y cartilaginosa que comprende un conjunto de células madre mesenquimáticas humanas, diferenciadas hacia el linaje condroosteogénico mediante su amplificación con suero humano y un factor de crecimiento transformante beta 1 con un dominio molecular de unión al colágeno I (TGF-{be}1-DUC) obtenido en sistemas de expresión eucarióticos, y un material biocompatible al que se absorben las células así procesadas. Esta composición puede usarse mediante implantes en la zona a reparar o directamente por inyección de las células en suspensión, bien en el lugar de la lesión o incluso en la circulación sistémica para procurar su distribución generalizada.
Description
Composición para la reparación ósea o
cartilaginosa.
La presente invención tiene su aplicación dentro
de la industria biomédica dedicada a la fabricación de agentes que
intervienen en la reparación esquelética y, más concretamente, en
los procesos de reparación de cartílago y hueso de cualquier
etiología, fusiones o artrodesis espinales, osteosíntesis, prótesis
para artroplastias, osteoporosis, etc., y cualesquiera otros que
precisen reparación o regeneración de tejidos óseo o cartilaginoso
y en los que un aporte suplementario de células en diferenciación
suponga una ayuda efectiva para la consecución de la reparación
tisular de que se trate.
La regeneración tisular es un proceso complejo
que supone la culminación del trabajo de una gran variedad de
células que, o estaban presentes, o han sido reclutadas en el lugar
de la lesión. Todos los sucesos que ocurren en el proceso reparador
son guiados por una serie de interacciones entre factores de
crecimiento y citoquinas, células y las moléculas que constituyen
la matriz extracelular.
En el hueso coexisten una variedad de señales
inductoras y de factores de crecimiento que incluye
TGF-\beta, PDGF, BMPs, IGFs y FGFs (Becerra y
col. Med Clin 2001; 116:23-34.). De todos ellos,
sólo las BMPs son osteoinductores, sin embargo todos se ven
implicados en la reparación de una fractura determinada (Reddi
Nature Medicine 1998, 3: 837-839; Groeneveld y
Burger Eur J Endocrinol 2000; 142:9-21) También en
el hueso existen células precursoras osteogénicas que responden al
estímulo de la fractura, activándose y produciendo BMPs que inducen
la migración de células madre mesenquimáticas (CMMs), las cuales
proliferan y se diferencia en células formadoras de hueso (Guerado
y col. Rev Ortop Traumatol. 2003; 47, 362-374). No
obstante, el conocimiento de la compleja interrelación entre las
células madre mesenquimáticas y las precursoras osteoprogenitoras
con las señales bioquímicas que modulan su migración, proliferación
y diferenciación hacia el linaje osteogénico, presenta todavía
importantes
lagunas.
lagunas.
Los TGF-\betas constituyen un
grupo de factores de crecimiento, codificados por una familia
génica que se expresa en numerosos tejidos y especies (Kingsley
Genes Dev; 1994; 8: 133-146; Bostrom y Asnis, Clin
Orthop Relat R, 1998; 355S: 124-131). El hueso fue
uno de los primeros tejidos en los que se observó la producción
local de un TGF-\beta con capacidad para regular
la función celular (Centrella y col. J Bone Joint Surg 1991;
73-A: 1418-1428). Aunque la fuente
principal de TGF-\beta son las plaquetas, el hueso
es el depósito más importante, 100 veces mayor que la de otros
tejidos blandos, donde también existe una presencia compartida de
BMPs (Roberts y col. Biochemistry 1983;
22:5692-5698).
En los últimos años se han obtenido importantes
resultados, a veces contradictorios, cuando se añade
TGF-\beta a células osteoblásticas en cultivo. Su
efecto mitogénico u osteodiferenciador, o lo contrario, se ha
achacado a heterogeneidad celular en los cultivos, presencia de
otros factores de crecimiento, densidad celular, condiciones de
cultivo o a un posible efecto bifásico del factor (Noda y col.,
Endocrinology 1988; 124: 612-617; Stein y Lian,
Cellular and Molecular Biology of Bone. San Diego: Academic Press;
47-95 1993). Estudios recientes consideran también
la posible existencia de células diana diferentes para
TGF-\beta o BMPs: mientras que los primeros
parecen actuar sobre células madre ya comprometidas en el linaje
osteogénico, las BMPs pueden actuar sobre células no comprometidas
(Ballock y col., J. Oprthop. Res. 1997;
15:463-467). En cualquier caso, parece claro que las
CMMs son capaces de auto-renovación y amplificación
en presencia del TGF-\beta1 (Andrades y col.,
Cells. Exp Cell Res, 1999; 250:
485-498).
485-498).
Para controlar la biodisponibilidad y asegurar
la presencia con cierto control de TGF-\beta1 en
cultivos de CMMs, recientemente se ha desarrollado un procedimiento
experimental por el que, a partir de médula ósea de rata, se ha
podido aislar, amplificar e inducir hacia el linaje osteogénico,
una población de células, cuando se las cultiva en geles de
colágeno, en presencia de un TGF-\beta1 con un
dominio molecular de unión específica al colágeno I. Se ha
propuesto que el dominio de unión al colágeno permite una lenta
liberación del factor activo dentro del gel al que está unido,
alargando su vida media y mejorando su disponibilidad para actuar
sobre las células diana (Andrades y col. Cells. Exp Cell Res, 1999;
250: 485-498).
Es un hecho comprobado que la capacidad de
regeneración ósea disminuye con la edad. Mientras el número de
células madre hematopoyéticas de la médula ósea permanece a lo
largo de la vida, las CMMs de la misma disminuyen enormemente,
además de apreciarse una cierta dificultad de progreso por falta de
factores osteoinductores o por incapacidad de las propias células
para producirlos o responder a ellos (Haynesworth y col.,
Musculoskeletal Soft-Tissue Aging: Impact on
Mobility. Section 1, Chapter 7. Rosemont: AAOS,
80-86, 1994). Es deseable, por tanto, desarrollar
procedimientos que posibiliten la selección de CMMs de individuos
afectados de incapacidad de reparación ósea, su amplificación in
vitro y su capacitación hacia el linaje osteogénico.
Realizado fehacientemente lo anterior, es
preciso transferir las células así tratadas hasta los lugares donde
el paciente necesita de reparación esquelética, vehiculizándolas
con el biomaterial adecuado, desarrollando así una suerte de
terapia celular autóloga que permita establecer con eficacia la
función osteo-reparadora perdida o seriamente
comprometida. De esta forma se evitan, además, los efectos
indeseables de la inyección sistémica o local de factores
bioactivos, cuyo control más allá del lugar de reparación, de
momento, presenta dificultades y cuyos efectos pleitrópicos son una
amenaza que no debe ser obviada.
En cualquier caso, el transplante de células
capacitadas debe hacerse sobre un microambiente que propicie la
osteogénesis, cuando la consolidación de dos o más fragmentos óseos
es lo que se requiere. En este sentido cuando el foco fracturario o
de no consolidación (pseudoartrosis) se caracterice por ser
hipervascular con proliferación de tejido
condro-osteogénico (no unión o pseudoartrosis
hipertrófica), la simple estabilización rígida no dinámica del foco
mediante implantes intra o extramedulares debe propiciar la
consolidación. En estos casos, el transplante de células
capacitadas hacia linaje osteogénico sobre un transportador
("carrier") de hidroxiapatita o colágeno encuentra un lecho
hipervascular y estable tras la osteosíntesis, microambiente ideal
para el desarrollo del callo osteogénico. En los casos de no
consolidación o pseudoartrosis atrófica es preciso extirpar el
tejido fibroso interpuesto entre los fragmentos, dejando hueso con
hueso y buscar una fuente vascular mediante perforaciones óseas y
cubrimiento con tejido vascularizado (generalmente músculo). Ambos
fragmentos tienen que estabilizarse mediante osteosíntesis rígida
que evite la movilidad en la interfaz ósea, ya que en caso de
movimiento en la interfaz, se destruirá e impedirá la proliferación
vascular, así como se estimulará la expresión de mediadores
químicos que inducen condrogénesis en vez de osteogénesis (Rüedi y
Murphy, AO Principles of fracture management. Sttugart, Georg
Thieme Verlag. 2000; Browne y col., Skeletal Trauma, Basic Science,
Management, and Reconstruction. Philadelphia, Saunders,
2003).
2003).
Es deseable también, desarrollar procedimientos
para incrementar la capacidad de formación de masa ósea en
individuos osteoporóticos, por procedimientos que supongan actuar
en el desequilibrio existente en estos pacientes entre la formación
y la reabsorción ósea, en perjuicio de la primera. La inyección
sistémica de células capacitadas in vitro hacia el linaje
osteogénico permitirá equilibrar esta ecuación.
La presente invención tiene una evidente
aplicación para la preparación de agentes y composiciones que
sirven para la reparación esquelética, y más concretamente en los
procesos de reparación de cartílago, hueso, osteoporosis, prótesis
para artroplastias, etc., que pueden inyectarse in situ en
pequeñas fractura que no unen o en lesiones cartilaginosas, en la
circulación sistémica de individuos osteoporóticos o implantarse
adsorbidas en el biomaterial adecuado (colágeno, hidroxiapatita,
etc) para promover la formación de cartílago o hueso en lesiones de
cierta entidad. Así mismo pueden adsorberse en la hidroxiapatita
(periapatita) que recubre a las prótesis para artroplastias de
cadera, rodilla, etc, para facilitar la integración biológica de
dichas prótesis en el huésped, alargando la vida de las mismas.
Estos preparados pueden emplearse también en artrodesis del raquis
para promover las fusiones espinales y mejorar la eficiencia de
tales operaciones realizadas por los procedimientos habituales con
autoinjerto o hueso de banco.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente
invención, ésta proporciona un método para aumentar la formación de
hueso y/o cartílago en un humano con necesidad de ello mediante la
administración a éste de células madre mesenquimáticas humanas,
diferenciadas hacia el linaje condroosteogénico mediante su
amplificación con suero humano y un factor de crecimiento
transformante beta 1 con un dominio molecular de unión al colágeno
I (TGF-\beta1-DUC) obtenido en
sistemas de expresión eucarióticos.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, la administración de dichas células capacitadas
se realiza mediante inyección in situ, en la circulación
sistémica o mediante implantes, adsorbidas en el biomaterial
adecuado. De modo preferido se realiza mediante el empleo de
implantes, adsorbidas las células en el material adecuado, siendo
aún más preferido el empleo de hidroxiapatita reabsorbible, con un
50% de porosidad, cámaras de difusión o géles de colágeno.
En una realización preferida de la presente
invención, las CMMs humanas han sido ayudadas en su inducción hacia
el linaje condroosteogénico utilizando un glucocorticoide. Siendo
preferido el empleo de dexametaxona. De un modo aún más preferido,
esta inducción se realiza en presencia de dexametasoxa y
\beta-glicerofosfato.
De acuerdo con otra realización preferida de la
presente invención, el factor de crecimiento transformante beta 1
fusionado con un dominio molecular de unión al colágeno I se ha
expresado en sistemas de expresión eucarióticos. De modo preferido
se realiza la expresión empleando células de insecto, y aún más
preferido es el empleo de células de insecto transfectadas con
baculovirus.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento de capacitación in
vitro de células condroosteogénicas a partir de CMMs humanas,
el cual comprende las siguientes etapas:
- \sqbullet
- el cultivo primario de las células madre en un medio suplementado con suero humano y un factor de crecimiento transformante beta 1 con un dominio molecular de unión al colágeno I (TGF-\beta1-DUC);
- \sqbullet
- posterior amplificación mediante la suplementación con suero humano y TGF-\beta1-DUC;
- \sqbullet
- la inducción condro-osteogénica con dexametasona y \beta-glicerofosfato.
Las CMMs humanas pueden obtenerse de diferentes
tejidos y localizaciones del propio paciente, así como de la médula
ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica o de la masa
interna de blastocistos humanos congela-
dos.
dos.
En una realización preferida de dicho
procedimiento de capacitación, el factor de crecimiento
transformante beta 1 fusionado con una dominio molecular de unión
al colágeno I se ha expresado en sistemas de expresión
eucarióticos. De modo más preferido se emplean células de insecto
para la expresión. Siendo aún más preferido el empleo de células de
insecto transfectadas con baculovirus.
De acuerdo con otra realización preferida, el
cultivo primario se realiza en un gel de colágeno tipo I
humano.
Según otra realización preferida, la selección
de las CMMs de la médula ósea se realiza en un cultivo suplementado
con una cantidad entre el 0,1 y el 1% de suero humano,
preferiblemente el 0,5%.
Según una realización preferida, la
amplificación tiene lugar durante un periodo comprendido entre 1 a
25 días, durante los que el medio de cultivo se suplementa con una
cantidad entre el 5% y el 25% de suero humano, preferiblemente el
20%.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente
invención, ésta proporciona células con capacidad condroosteogénica
obtenibles de acuerdo con el procedimiento de capacitación
anterior, que comprende la selección, amplificación e inducción
condroosteogénica de las CMMs.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente
invención, se proporciona el uso de las células con capacidad
condroosteogénica obtenibles de acuerdo con el procedimiento de
capacitación anterior, en la preparación de una composición para la
reparación ósea y/o cartilaginosa en humanos.
De acuerdo con un quinto aspecto de la presente
invención, se proporciona una composición capaz de inducir
osteogénesis que comprende un material biocompatible y
osteoconductor, y un conjunto de células con capacidad
condroosteogénica obtenibles según el procedimiento de capacitación
anterior.
Figura 1.- a) Células de MO cultivadas in
vitro 10 días en gel de colágeno, en presencia de
rhTGF-\beta1-DUC. Se observan
escasas células aisladas. Células de MO cultivadas 35 días en gel
de colágeno (b y c), en presencia de
rhTGF-\beta1-DUC e inducidas con
dexametasona y \beta-glicerofosfato,
respectivamente. Se observa una mayor densidad de células y algunas
colonias de las mismas. x60.
Figura 2.- En a) se muestran radiografías de
cuatro cámaras de difusión tras el periodo de implantación en el
tejido subcutáneo de la rata. Las distintas densidades indican
diferente calidad y cantidad de tejido neoformado. b) Muestra una
sección histológica de una cámara tras el periodo de implantación,
en la que se pusieron células cultivadas en condiciones de control,
sin rhTGF-\beta1-DUC; su interior
está lleno de material más o menos fibroso, sin que se encuentren
acúmulos de tejido condro-osteoide (asterisco,
filtro de la cámara). Rojo sirio-hematoxilina. x10.
c) Aspecto que presenta la sección de una cámara a baja
magnificación, en la que se pusieron células procesadas in
vitro en presencia de
rhTGF-\beta1-DUC, en la que se
detectan varias condensaciones de tejido neoformado (flechas) junto
a los filtros (asterisco) que destacan del resto. Rojo
sirio-hematoxilina. x10. d) Detalle de uno de esas
condensaciones donde se distinguen dos clases de tejido, uno con
aspecto cartilaginoso (circulo lleno), poco teñido, y otro
intensamente teñido con aspecto osteoide (circulo vacío). Por fuera
del tejido pálido se observan unas fibras más teñidas que semejan
un pericondrio (flechas). Rojo sirio-hematoxilina.
x40. e) Sección paralela a la anterior, teñida con tricrómico de
Goldner que muestra de color azul intenso (circulo vacío) el tejido
mas denso (osteoide) y en color pálido lo que se asemeja a
cartílago (circulo lleno). Rodeando el acúmulo aparecen unas fibras
azuladas que parecen constituir una capa de pericondrio (flechas).
x40. f) Cuando se colorea otra sección paralela con Azul alciano,
el tejido cartilaginoso aparece de color azul (circulo lleno),
mientras que el osteoide aparece sin color (circulo vacío), así
como el pericondrio. x40. Estos hechos son congruentes con una
neo-formación condro-osteoide. Tanto
el Rojo sirio como el tricrómico tiñen intensamente el colágeno,
sobre todo el del tipo I, propio del tejido óseo y el pericondrio,
mientras que el Azul alciano tiñe los restos ácidos y sulfatados de
los proteoglucanos, abundantes en la matriz
cartilagi-
nosa.
nosa.
Figura 3.- Secciones de tejido formado en el
lugar donde se practicaron los implantes de hidroxiapatita con
células procesadas como se indica en el texto. Dado que el material
se descalcificó antes de ser cortado y coloreado, los espacios
vacíos (asteriscos) corresponden a las paredes de las trabéculas de
hidroxiapatita. Los huecos entre dichas paredes ahora se encuentran
llenos de un tejido que puede denominarse medular (círculos
llenos), mientras que adosado a dichas trabéculas aparecen unas
láminas finas de tejido neoformado (flechas). En a) se observa cómo
el tejido que tapiza las paredes de la hidroxiapatita se ha es
abundante en colágeno (rojo intenso con el Rojo sirio) (flechas),
como se demuestra por la birrefringencia que aparece en b) al
iluminar la misma sección con luz polarizada. Ese colágeno resulta
ser del tipo I, como lo demuestra la positividad (flechas) que
aparece cuando se tratan estos cortes de tejido con el antisuero
anti-colágeno I, mostrado en c). x20. En d) se
muestra, con mayores aumentos, que el nuevo tejido tiene células en
su interior a modo de osteoblastos que quedan atrapados en la
matriz que ellos mismos van sintetizando (Tricrómico de Goldner).
El nuevo tejido se presenta con una coloración roja (tejido más
maduro) o verdosa (tejido inmaduro). X40. En e) se presenta una
sección de una zona próxima a la hidroxiapatita implantada
(asteriscos) donde puede observarse que varias trabéculas de tejido
del huesped presentan nuevas aposiciones de hueso joven de color
verde-azulado, lo que indica cierta actividad
osteogénica, no sólo donde pusimos la HA, sino también en los
alrededores, lo que indica una "cierta osteoinducción a
distacia" provocada, probablemente, por las células que
"difunden" de la HA (Tricrómico de Goldner). x20. Por el
contrario, en f) se muestra la sección de una zona del mismo hueso
del huesped, alejada de donde fueron colocadas los fragmentos de
HA, donde se ve que las trabéculas óseas no muestran adición de
tejido nuevo, y por tanto que la osteoinducción no fue mucho más
allá de la zona de los implantes.
x20.
x20.
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos no limitativos.
El ADNc para el gen de
TGF-\beta1 se obtuvo mediante
RT-PCR, usando una ADN-polimerasa
con capacidad de corrección. Como molde se utilizó ARN total,
extraído mediante el método de Chomczynski y Sacchi (1987), a
partir de células de osteosarcoma humano MG63 (ref. en ATCC:
CRL-1427). Los cebadores (primers) son
diseñados con ayuda de un software (Oligo v6.6), a partir de
las secuencias de los ARNm publicadas en el genbank. Los
productos de PCR fueron clonados "en romo", en un plásmido de
mantenimiento (pBSK II, Stratagene). Una vez clonados los genes, se
comprobaron mediante secuenciación de ambas hebras. Usando como
molde estos plásmidos, se amplificaron por PCR con
pfu-AND-polimerasa, la región que codifica
para el péptido maduro. Los cebadores que se utilizan incorporan el
Dominio de Unión al Colágeno (DUC) y sitios de restricción adecuados
para clonar direccionalmente en un plásmido de transferencia de un
sistema de expresión en baculovirus, que contiene una
secuencia para un péptido señal de secreción, específico para
células de insecto (pAcGP67B, Pharmingen). Para obtener el factor
sin DUC, los cebadores tenían sólo los sitios de restricción. El
cebador para la cadena con sentido tenía la siguiente estructura:
5'- (BamHI)-secuencia del
DUC-GGAGGA-(NheI)-6 primeros
nucleótidos péptido maduro TGF-\beta1. El
cebador para la cadena antisentido estaba constituido por varios
nucleótidos del extremo 5' del gen y que comprendían el codón de
paro. Además tenía el sitio Not I. En todos los casos, se comprobó
la construcción mediante secuenciación del producto de PCR o del
plásmido de transferencia que lo contiene.
Una vez que tuvimos el plásmido de transferencia
para el factor con y sin DUC, se cotransfectaron células de insecto
(sf9) con una mezcla compuesta por el plásmido de transferencia y
un ADN de baculovirus comercial (BacVector3000, Novagen),
que tiene eliminado además del gen de la poliedrina, otros genes
que codifican para cistein-proteasas. Usamos un
método de transferencia mediado por liposomas (lipofectina,
Novagen), según las instrucciones de la casa comercial.
Una vez transferidos los ADN a las células, se
cultivaron en medio TNM-FH durante varios días,
hasta que se observó afectación en las células. Durante este
tiempo, en el interior de las células ocurre una recombinación
homóloga por la que se transfiere al ADN vírico, "río abajo"
del promotor de la poliedrina, una región del plásmido que
comprende la secuencia del péptido señal más la del factor con o sin
DUC. Este proceso genera virus infectivos que matan a la célula, se
liberan al medio e infectan a otras células.
De la mezcla de virus recombinantes que había en
el sobrenadante del cultivo se seleccionó un virus recombinante.
Esto se realizó mediante el ensayo de placa, el cual consiste en
sembrar un cultivo de células semiconfluente con diluciones del
sobrenadante de transfección. Tras el periodo de infección (1 h),
se cubrió la placa con agarosa disuelta en medio de cultivo y se
dejó cultivando 4 días. Con esto se consiguió que la dispersión de
la infección ocurra en el entorno de algunas células, lo cual
generó una placa de lisis. Estas placas de lisis fueron sacadas
individualmente y depositadas en un pequeño volumen de medio para
extraer los virus. En función del nº y tamaño de las placas de
lisis de la primera selección, este procedimiento se repitió una
vez más a partir de una placa de lisis anterior y así nos
aseguraremos de tener un virus recombinante clonado. Una vez
amplificado este virus se analizó por PCR con los cebadores
específicos para el factor, para comprobar que contenía el gen de
interés. A continuación fue necesario generar un stock de gran
volumen que había de ser titulado, para saber el nº de pfu/ml
(unidades formadoras de placa/ml).
A partir de este punto, para cada virus
recombinante, se establecieron las condiciones adecuadas de
infección, con objeto de obtener una producción óptima. Para ello,
se sembraron con un número conocido de células, placas de 12
pocillos. En ellas se planificó sembrar distintas proporciones de
nº de virus/célula (MOI, multiplicity of infection), además
de distintos tiempos de cultivo. Se probaron MOI de 0.1, 1 ó 10,
muestreando a 48, 72 y 96 h de incubación. Con objeto de que el
suero del medio de cultivo no contaminase con proteínas no
deseadas, tras las primeras 24 horas después de la infección, el
cultivo se continuó con medio sin suero o un porcentaje muy
pequeño. Una vez finalizada cada situación experimental, se recogió
el sobrenadante y se centrifugó para eliminar restos
celula-
res.
res.
Las células del pocillo se rompieron por
congelación-descongelación y se realizó un extracto
con PBS. Ambas muestras se analizaron por
SDS-electroforesis (condiciones desnaturalizantes)
y sin agentes reductores. El gel de poliacrilamida se tiñó con Azul
de Coomasie (si no fuese lo suficientemente sensible, se
puede realizar una tinción con plata). También se analizaron las
distintas muestras mediante inmunoblot utilizando
anticuerpos específicos para TGF-\beta1.
Utilizamos un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa y
detectamos su presencia por quimioluminiscencia (CSPD, Amersham).
Con esta información evaluamos la proporción de monómero/dímero que
se produjo y el rendimiento del sistema.
Para obtener una cantidad importante de
proteínas recombinantes, se inició un cultivo líquido de
aproximadamente 250 ml, con unas 500.000 cels/ml. Cuando alcanzó un
crecimiento de unos 2x106 cels/ml, se inoculó con el virus, usando
el MOI más alto y cuyo rendimiento fue mayor. A las 24 horas se
retiró el medio con suero y se siguió cultivando las células con
medio sin suero, el número de días determinado por los ensayos
previos. Transcurrido este tiempo, se purificaron las proteínas
según el protocolo descrito por Aono y col. (1995). El método
utiliza cromatografia de intercambio catiónico, usando una columna
de SP-Sepharosa
(Amesham-Pharmacia). El medio de cultivo se
equilibró a pH 8 y se añadió urea 4 M. La columna se equilibró con
un tampón Tris-HCl 20 mM pH8, urea 4 M. Tras pasar
por la columna el medio, se lavó con el tampón y se eluyeron las
proteínas con un gradiente lineal de NaCl entre 0 y 0.7 M. A las
distintas fracciones se midió la absorbancia a 280 nm y aquellas
que tenían proteínas fueron analizadas por electroforesis,
siguiendo la técnica descrita anteriormente. Las fracciones
positivas, fueron reunidas y concentradas por ultrafiltración y
utilizadas en ensayos de actividad biológica. La concentración de
proteínas de esta fracción final se midió por Bradford.
Las células madre mesenquimáticas humanas se
obtuvieron de médula ósea (MO) humana tras extracción quirúrgica de
la cresta ilíaca de donantes informados. El tejido medular se lavó
en medio completo (\alpha-MEM GIBCO, HD, EE.UU).
con antibióticos (100 mg/ml penicilina G (sigma), 50 mg/ml
gentamicina (sigma) y 0,3 mg/ml de fungizona (Flow- ICN)). La
suspensión de células individualizadas se obtuvo tras disgregación
secuencial a través de agujas de calibre 18, 20 y 22, y finalmente
filtradas a través de filtros estériles de teflón de 20 micrómetros
(Cell Strainer, Falcon, Lincoln Park, NJ) para separar restos de
tejido y acúmulos celulares.
La suspensión celular obtenida según el ejemplo
2, se centrifugó a 100 g durante 5 min. El centrifugado se
resuspendió en medio de cultivo con muy baja concentración de suero
del propio paciente (SH, 0,5%).
Antes de disponer las células en los pocillos de
cultivo, placas de 48, se depositó en el fondo de los mismos 100
ml. de una solución de colágeno I humano
(Sigma-Aldrich), a una concentración de 0,35 mg/ml.
a pH 7.4. Sobre una capa se depositaron 150 ml por pocillo, de una
mezcla de colágeno I, TGF-\beta1 a una
concentración de 1 mg/ ml. y 2x10^{6} células de médula ósea. Las
placas de cultivo se introdujeron en la estufa de cultivo a 37ºC,
durante 15 min. para permitir la formación del gel de colágeno, que
hasta este momento se mantenía líquido. A continuación se
depositaron 150 ml por pocillo de medio de cultivo que también
contenía la misma concentración de TGF-\beta1.
Los cultivos así dispuestos se cultivaron en atmósfera de 95% de
aire y 5% de CO_{2}, a 37ºC y 100% de humedad relativa. Cada 3
días se cambió el medio de cultivo, añadiendo en cada caso, la
misma concentración de TGF-\beta1.
La concentración óptima de
TGF-\beta1 fue investigada en ensayos previos de
respuesta quimiotáctica. Para cada condición experimental se
mezclaron 150 ml de colágeno (0,35 mg/ml) con la concentración del
factor previamente seleccionado como la de mayor capacidad
quimiotáctica. Cultivos confluentes de médula ósea de rata se
disociaron y las células se colocaron en el compartimento superior
de las cámaras Boyden (Neuroprobe, Rockville, MD) a una
concentración 2x10^{5} células/ml de \alpha-MEM.
El compartimiento inferior de la cámara contenía el medio con las
distintas concentraciones del factor a ensayar. Después de 4 h. de
incubación a 37ºC en 5% de CO_{2}, se sacaron los filtros y se
fijaron en metanol; se lavaron, se tiñeron y se montaron en portas.
La quimiotaxis se cuantificó contando el número de células que
migraban en 20 campos del microscopio (x400) en cada filtro.
Las células de MO se mantuvieron en las
condiciones experimentales descritas antes durante 10 días,
cambiando el medio de cultivo, y por tanto el
TGF-\beta1, cada 3 días. Transcurridos esos 10
días se implementó el medio de cultivo con 10% de suero del propio
paciente (SH 10%). Terminando así el período denominado de
selección y comienza el de amplificación, que se mantuvo durante el
tiempo necesario para obtener una cantidad de células que haga
posible el transplante, pero en todo caso, este período no debe
superar los 25 días. Terminado este período el medio se implementó
con dexametasona (10^{-8} M) y
\beta-glicerofosfato (2 mM) que actúan como
agentes químicos osteoinductores. A este período de sólo 2 días se
le llama de inducción.
Durante el tiempo que duró el cultivo de las
células, se tomaron muestras a los días 0, 10, 14, 18, 21, 24, 27,
30, 33 y 36 y se realizaron análisis del nº de células y presencia
de fosfatasa alcalina y contenido de calcio. Las Tablas I, II, III
representan los valores obtenidos. En ellas se observa cómo el
TGF-\beta1-DUC incrementa el
número de células respecto al control. Lo mismo ocurra con la
síntesis de fosfatasa alcalina. El contenido de calcio también va
incrementándose con los días de cultivo, mientras que en el control
los valores son imperceptibles.
El examen microscópico de los cultivos durante
el proceso descrito, muestra cómo las células proliferan a lo largo
de los días de cultivo e incluso forman colonias durante el período
de amplificación, cuando están en presencia de
TGF-\beta1-DUC (Figura 1). Cuando
las células son tratadas con el TGF-\beta1
comercial (R&D Systems, Minneapolis, MN), permanecen dispersas
o escasamente agrupadas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Terminado el período de cultivo, los geles de
colágeno se digirieron con colagenasa y se disgregaron las células
con tripsina 0,05% y EDTA 0,02%, a 37ºC. Las células se
centrifugaron, se lavaron y se resuspendieron en medio sin suero.
Tras el recuento correspondiente, parte de ellas se introdujeron en
cámaras de difusión Millipore que se implantaron en el tejido
subcutáneo de la rata, y otra parte se absorbieron en fragmentos de
hidroxiapatita que se implantan en una lesión ósea concreta (Figura
3).
Las cámaras de difusión con 1x10^{6} células
humanas capacitadas por el procedimiento descrito y suspendidas en
medio sin suero se implantaron subcutáneamente en la espalda de
ratas Fischer 344 hembras de 7 meses de edad, previa anestesia con
inyección subcutánea de pentobarbital sódico 3,5 mg/ 100 g de peso
corporal. Se practicó una incisión de 2 cm. en la línea media de la
espalda para introducir las cámaras. Cada rata albergó varias
cámaras con células tratadas con
TGF-\beta1-DUC y otras control,
con células que transcurrieron el período de cultivo sin
tratamiento o con TGF-\beta1 comercial. Las
heridas fueron suturadas y desinfectadas con Betadine. Cuatro
semanas después (período de implantación), las ratas fueron
sacrificadas por sobredosis de anestésico y las cámaras extraídas
para su estudio histológico y radiográfico. Este último se practicó
con rayos X de baja intensidad. Para el estudio histológico, las
cámaras se fijaron en Bounin o en Formalina tamponada al 10%. Tras
la fijación se disolvió el anillo plástico de las cámaras por
inmersión en acetona. Tras la deshidratación, se incluyeron en
parafina y se cortaron sagitalmente a varios niveles, a 5
micrómetros de grosor. Las secciones fueron teñidas por diferentes
técnicas histoquímicas o inmunocitoquímicas con anticuerpos contra
diferentes tipos de colágeno, con objeto de analizar el tejido
formado en el interior de las cámaras durante el período de
implantación.
En la figura 2 se presentan imágenes
radiográficas e histológicas de diferentes cámaras que demuestran
la naturaleza cartilaginosa y ósea del tejido formado en las
mismas. Frente a las cámaras control en las que apenas se observa
un tejido fibrilar, en las experimentales se observan grandes
superficies de tejido con características cartilaginosas, junto a
otras donde la matriz osteoide parece el preludio de un tejido óseo
plenamente constituido. Los datos sugieren que el tejido
cartilaginoso parece transformarse en osteoide-óseo, por lo que
ello parece indicar que en el interior de las cámaras se da un
autentico proceso de osificación endocondral.
Fragmentos de hidroxiapatita Proosteon 500
(Interpore) de alrededor de 0,5 cm de diámetro fueron embebidas con
la suspensión celular, goteando sobre ellas varios microlitros, y
cambiando la posición de las mismas para asegurar que la mayoría de
sus cavidades quedaban llenas de células. Las células así
dispuestas se trasladaron al quirófano, cuidando la asépsia y la
temperatura ligeramente por encima de los 0ºC. Anestesiado el
paciente, se procedió a la preparación de las superficies de
fractura y se introdujeron separadamente los fragmentos de
hidroxiapatita. Esta fractura era realmente una no unión o
pseudoartrosis atrófica, caracterizada por un foco avascular con
tejido fibroso, sin proliferación de tejido
condro-osteogénico vascularizado. Por tanto,
previamente al implante, y en el mismo tiempo quirúrgico, se
extirpó el tejido fibroso de los extremos fracturarios, dejando
ambas superficies en tejido óseo esclerótico y perforándolas hasta
encontrar respectivamente proximal y distalmente una fuente
vascular. Los fragmentos de hidroxiapatita se colocaron en los
agujeros y periféricos al foco fracturario "on lay". El resto
de los fragmentos de hidroxiapatita, hasta un total de 95, se
colocaron en la línea de fractura. Tras colocar los fragmentos de
hidroxiapatita con las células
cóndro-osteocompetentes, ambos fragmentos óseos se
estabilizaron de forma rígida, no dinámica, mediante una placa
atornillada de titanio a compresión con tornillos también de
titanio, cumpliendo un principio de neutralización.
En la figura 3 se presentan imágenes de
secciones histológicas realizadas en biopsia tras seis semanas de
implantación. En ellas se muestra el tejido neoformado en contacto
con las paredes de la hidroxiapatita con cualidades de tejido óseo,
así como la formación de tejido medular en los huecos que quedan
entre las trabéculas del mineral. Las pruebas que se presentan
demuestran que el tejido formado tiene características de hueso en
proceso de maduración. Así mismo, las imágenes muestran que la
osteoinducción se extiende a las proximidades de los implantes pero
no mucho más allá, lo que puede explicarse porque las células
transplantadas son las responsables de tal osteoinducción,
extendiéndose esta allí donde las células, de forma espontánea,
difunden en la zona del implante. Las zonas más alejadas del
implante no presentan síntomas de osteoinducción.
Claims (15)
1. Procedimiento de capacitación in vitro
de células condro-osteogénicas a partir de células
madre mesenquimáticas humanas que comprende:
- a.
- el cultivo primario de las células madre en un medio suplementado con suero humano y un factor de crecimiento transformante beta 1 con un dominio molecular de unión al colágeno I (TGF-\beta1-DUC);
- b.
- posterior amplificación mediante la suplementación con suero humano y TGF-\beta1-DUC;
- c.
- la inducción condro-osteogénica utilizando un glucocorticoide.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 donde el glucocorticoide es dexametasona.
3. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 - 2 donde en la inducción además se emplea
\beta-glicerofosfato.
4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 - 3 donde el factor de crecimiento
transformante beta 1 fusionado con un dominio molecular de unión al
colágeno I se ha expresado en sistemas de expresión
eucarióticos.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4 donde el sistema de expresión eucariótico empleado
son células de insecto.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5 donde las células de insecto son transfectadas con
baculovirus.
7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 - 6 donde el medio de cultivo es un gel de
colágeno tipo I humano.
8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 - 7 donde la suplementación inicial del
medio de cultivo se realiza con una cantidad entre el 0,1% y el 1%
de suero humano, preferiblemente el 0,5%.
9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 - 8 en el que la amplificación tiene lugar
durante un periodo comprendido entre 1 a 25 días durante los que el
medio de cultivo se suplementa con una cantidad entre el 5% y el
25% de suero humano, preferiblemente el 20%.
10. Células con capacidad
condro-osteogénica obtenibles de acuerdo con el
procedimiento de capacitación de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 9.
11. Uso de las células con capacidad
condro-osteogénica de acuerdo con la reivindicación
10 en la preparación de una composición para la reparación ósea y/o
cartilaginosa en humanos.
12. Composición para la reparación ósea y/o
cartilaginosa en humanos capaz de inducir osteogénesis que
comprende un material biocompatible, osteoconductor, y un conjunto
de células con capacidad condro-osteogénica según
la reivindicación 10.
13. Composición para la reparación ósea o
cartilaginosa en humanos de acuerdo con la reivindicación 12 donde
dicha composición se administra por inyección in situ en la
circulación sistémica.
14. Composición para la reparación ósea o
cartilaginosa en humanos de acuerdo con la reivindicación 12 donde
dicha composición se administra mediante implantes adsorbidas en el
material adecuado.
15. Composición para la reparación ósea o
cartilaginosa de acuerdo con la reivindicación 14 donde el material
empleado para el implante es hidroxiapatita o cámaras de
difusión.
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