TWI329131B - Production of methionine - Google Patents

Description

1329131 為改良此等微生物對於製造特定分子之表現性質，可使 用突變形成、篩擇及突變篩擇，或重組去氧核糖核酸 (DNA)技術之方法，該等方法經由放大或關閉個別之胺基 · 酸生物合成基因之表現並因此引發胺基酸製造之改良而用 - 於製造胺基酸之菌株（例如，棒桿菌之菌株）之菌株改良。 例如’ WO-A-02/10209及德國專利_Α·ι〇1 36 986敘述藉 由發酵’使用製造L·甲硫胺酸之遺傳修飾之棒桿菌狀之細 菌而製造L-甲硫胺酸之方法。其中，除了其他以外，提供 用於製造L-甲硫胺酸之方法之說明，該方法包含該細菌之 % 發酵、該胺基酸於培養基中或於細菌中之增加及該胺基酸 之分離。此外，敘述用於自發酵液體培養基（br〇th)製造含 L-甲硫胺酸之動物飼料添加劑之方法，其包含下列步驟： a)發酵產生L·甲硫胺酸之微生物；b)濃縮該發酵液體培養 基，例如經由蒸發；c)分離出生物量（〇1〇〇%)，例如經由 離心，及d)乾燥，例如經由冷凍乾燥或噴霧乾燥，喷霧造 粒0

Swapan 等人於 j. Micr〇bial Bi〇techn〇1〇gy，4⑴，35 4i 籲 (1989)中敘述藉巨大芽孢桿菌（Baeillus 株突 支經由自發酵液體培養基中分離出細胞、調節卩11至5、以 活性碳及離子交換層析處理，以微生物地製造 曱硫胺酸。 德國專利-A-35 33 198揭示，經由使用特殊嗜熱性細菌· 之發酵而製造L-白胺酸。該發酵係於+6(rc連續地進行，暫 連同生物量之保留、含產物夕敗 度物之廢培養基之分離、於結晶器 中之冷卻（至+2。〇、已έ士曰ψ夕的括^ 曰出之胺基酸之產生及母液之再 98006.doc 1329131 循環至反應器中。此中未敘述甲硫胺酸經由發酵之製造。 對於甲硫胺酸之微生物製造敘述之方法迄今尚未滿足以 工業規模製造之需要。對於此之原因係，首先，甲硫胺酸 · 於水性發酵培養基中有限之溶度，其具有在高生物合成輸 - 出時’曱硫胺酸自該發酵液體培養基中沉殿出之效應，及 因此使純化困難。另一原因係，於根據先前技藝工作之案 例中’產生可觀之廢棄物流，其之處置係與高成本相關。 【發明内容】 因此，本發明之一項目的係，提供用於分離經由發酵而 _ 製造之甲硫胺酸之改良方法，該方法係可應用於，特定言 之，包含部分為結晶形式之甲硫胺酸之彼等發酵液體培養 基。另一目的為提供用於含甲硫胺酸之發酵液體培養基之 處理方法，該方法實質上不產生廢棄物流及因此可係特別 經濟地實施。 本發明人等已發現，以上目的係經由提供處理方法而令 人驚訝地達成，該方法特定地利用甲硫胺酸之溶度性質以 分離出生物量。該方法使用結晶作用作為用於經由發酵❿· 製造之L-甲硫胺酸之純化方法。其產生兩種產物以使用作 為飼料添加劑（低濃度及高濃度產物）。於較佳之不同形式 中，實質上不產生廢棄物流及因此容許於工業規模之特別 地經濟之甲硫胺酸製造。 【實施方式】 A) 一般定義 ’ "甲硫胺酸，，’用於本發明之目的，原則上包括卜及队甲 98006.doc 1329131 硫胺酸、此等異構物之混合物，例如外消旋物類，但較佳 係L-曱硫胺酸。 甲硫胺酸於水中於赃之溶度係約3〇克，升，及於心 其係高於90克/升。於發酵液體培養基中於此等條件下， 觀察到可比較之數量級之溶度。 用於本發明之目的，方法步驟諸如"濃縮"、"分離，，、" 洗滌”、"乾燥”，涵蓋於專家技能之領域中存在之所有方 法。例如，可採用"濃縮"以意表於大氣壓力下或連同真空 之施用蒸發液相。”濃縮"可係，例如，使用熟悉之技術， 諸如逆滲透或奈米級過濾（nanofiltrati〇n)或習用之裝置（例 如落膜式蒸發器、薄膜蒸發器或旋轉蒸發器、或其等之組 合）而實施分離”可涵蓋，例如，離心、過濾、傾析、 或此等方法之組合。"洗滌"可涵蓋，例如，固體之過濾出 及倘若於懸浮該過濾殘渣之後係適合的，則單次或重複之 洗滌。”乾燥”可涵蓋’例如，冷凍乾燥、噴霧乾燥、喷霧 粒化、流體化床乾燥或此等方法之組合。 B)發明之較佳具體實施例 本發明首先係關於一種用於分離經由發酵而製造之甲硫 胺酸之方法，該方法包含 a)加熱於製造甲硫胺酸之微生物之發酵中製造之含曱硫胺 酸之液體部分（該液體部分包含，特定言之，於部分未 溶解形式之甲硫胺酸），至足夠以提高甲硫胺酸於該液 相中溶度之溫度，較佳地至致使甲硫胺酸實質上完全進 入溶液中之溫度， 98006.doc 1329131 b) 自其獲得甲硫胺酸濃化之液相，及 c) 結晶出甲硫胺酸，倘若適合，則於濃縮該經濃化之液相 之後。 以於液相中之總甲硫胺酸含量為基準，倘^硫胺酸 係，例如，超過95%溶解，較佳地超過98%溶解，特定言 之100%溶解，則甲硫胺酸係"實質上，，完全於溶液中。 含甲硫胺酸之，，液體部分”通常係自發酵方法獲得之液體 培養基及包含，特定言之，於部分未溶解形式之甲硫胺酸 及倘若適合，則可具有習用地可存在於發酵液體培養基中 之其他固體成分；或自該液體培養基衍生之液體，例如經 由適合之預處理而獲得者。"預處理"可在於，例如，經由 蒸發之濃縮、或物質之添加。例如，可將含f硫胺酸之部 分、或促進下列之處理步驟或如指示促進產物之用途（例 如，飼料添加劑）之佐劑（見以下）加入來自先前處理批次之 液體培養基中。 以發酵液體培養基之總重量為基準，未溶解之甲硫胺酸 於該（倘若係適合的）經強化之發酵液體培養基中之含量係 於約1至10重量％之範圍内’較佳係於約3至8重量％，或 者’以總固體含量為基準，於約30至80重量％之範圍内， 較佳係於約50至57重量％。 例如，一種本發明之發酵於通常之發酵溫度可產生約96 克/升之甲硫胺酸含量，其中約46克/升係於溶液中及約50 克/升係未溶解的。 經濃化之液相之曱硫胺酸含量’以其之乾剩餘物為基 98006.doc •10· 1329131 準’係於约6〇至丨00重量％或約90至100重量。/〇之範圍内， 如例如約75至85重量％，或約95至100重量。/❶，每種係以乾 質量為基準。 為了使f硫胺酸實質上進入溶液中，於步驟&)中，視將 /合解之產物之數量而定，加熱液體至於約⑹至之範 圍内之溫度，較佳係約70至120°C。倘若適合，則於略為 提间之壓力（例如約丨至5大氣壓力）操作可係必要的。 較佳地’於步驟a)中使用之液體部分係含生物量之發酵 液體培養基而無進一步之預處理。 步驟b)之甲硫胺酸濃化之液相較佳地係經由自以溶解的 甲硫胺酸濃化之經加熱之發酵液體培養基分離出生物量而 獲得。A 了避免該甲硫胺酸之過早之結晶作用，於生物量 刀離之期間使用同樣地提高之溫度車交佳地於以上指定之 範圍内之溫度。 於本發明之一種較佳具體實施例中 d) 分離出該結晶之甲硫胺酸， e) 倘若適合，則洗膝該已分離出之固體（較佳係結晶）甲硫 胺酸及 f) 倘若適合，則乾燥。 根據另一種較佳方法不n r , . ,... 古不冋形式，於步驟b)中分離出之生 物量係 g 1)倘若適合地洗滌，則Λ _ 則加熱（倘若適合）於該洗滁中使用 之液體及 g3)乾燥。 98006.doc

-1U 1329131 倘若’例如’固體f硫胺酸係存在於該分離出之生物量 部分中，則加熱該洗滌液體可變成必要的，及自該生物量 部分儘可能地製造甲硫胺酸係需要的。 為了避免廢棄物流，較佳地 g2)於步驟gi)中產生之洗滌液體係與來自步驟b)之曱硫胺 酸濃化之液相組合》

然後’進一步濃縮根據以上程序獲得之步驟b)之含甲硫 胺酸之液相，例如經由連同加熱之蒸發及倘若適合則施加 真空。於生成之濃縮物中曱硫胺酸之含量，以該濃縮物之 總重量為基準，係於約10至4〇重量％之範圍内。曱硫胺酸 較佳係經由冷卻結晶作用而分離出。對於此程序，溶液係 冷卻至於0至20。(：之範圍内之溫度。於完成結晶作用之 後’該固體甲硫胺酸係以冷洗滌液體（例如水）洗滌、及乾 燥’倘若適合則以溫和之加熱乾燥。

根據另一種方法不同形式，於步驟d)中產生之母液係 dl)與來自使用製造曱硫胺酸之微生物之另一個發酵批次 之含甲硫胺酸之液體部分組合；或 d2)於根據步驟g3)之乾燥之前，加入自使用製造甲硫胺酸 之微生物之同一或另一個發酵批次分離出之生物量 中0 根據另一種方法不同形式’於步驟e)中產生之洗滌液體 係 el)與來自使用製造甲硫胺酸之微生物之另一個發酵批次 之含甲硫胺酸之液體部分組合；或 98006.doc •12- e2)於根據步驟g3)之乾燥之前，加入自使用製造甲硫胺酸 之微生物之同一或另一個發酵批次分離出之生物量 中〇 再循環母液及洗滌液體，進—步避免廢棄流之產生。 此外，根據本發明，較佳地，根據步驟g3)之乾燥包含 噴霧乾燥步驟。 本發明進一步係關於一種經由發酵而製造甲硫胺酸之方 法，其中天然或重組體微生物係以就其本身已知之方式發 酵及生成之甲硫胺酸係經由以上定義之方法而分離。 於一種較佳具體實施例中，本發明之方法係使用自棒桿 菌屬之天然或重組體細菌選出之製造甲硫胺酸之微生物而 進行。 本發明進一步係關於根據以上步驟g3)可獲得之乾燥物 質用於製造飼料或飼料補充物（飼料添加劑）之用途β 本發明亦係關於發明地分離之甲硫胺酸用於製造食物或 飼料或者食物補充物或飼料補充物之用途。 本發明最後係關於經由根據以上定義之方法而可獲得之 含甲硫胺酸之乾燥生物量；包含此種類型之生物量之飼料 添加劑；及亦除了習用之飼料成分外，亦包含此種飼料添 加劑之飼料組合物。 於以下之段落中’敘述本發明之進一步發展。 C)根據本發明使用之宿主細胞 對於本發明之方法，較佳地使用棒桿菌狀之細菌。較佳 地’此等係棒桿菌屬之細菌。於棒桿菌屬中，特定言之提 98006.doc .13- 1329131 390 73、德國專利-A-102 390 82及德國專利-A-102 228 58 中，該等專利係以提及之方式明確地併入本文中。

為了减少可降低甲硫胺酸含量之酶之活性或數量，熟諳 此技藝之士可個別地或組合地實施不同之措施。經由降低 對於本發明之蛋白質編碼之基因之轉錄頻率，可降低相關 之蛋白質之濃度。此可係由熟諳此技藝之士經由修飾或交 換啟動子或調節區域及亦該編碼基因之核糖體結合位置而 達成。於該編碼區域之下游，熟諳此技藝之士可修飾終止 子或引進導致該轉錄產物之安定性降低之序列。此等方法 降低信使核糖核酸（mRNA)之壽命，致使降低相關之蛋白 質之表現及因此其之濃度變成可能的。

於表現之酶之含量，融合之序列可導致增加之損壞速率 及因此同樣地導致蛋白質之濃度之降低。此外，熟諳此技 藝之士，經由該編碼基因之定點之突變形成或未定點之突 變形成，可改變活性、基質親和力及基質種別性。酶之活 性可係經由於對應之基因中以致使發生酶反應之反應速度 之部分或完全降低之方式突變而影響。對於熟諳此技藝之 士，此等突變之實例係熟知的（Motoyama H. Yano H. Terasaki Y. Anazawa Η. Applied & Environmental Microbiology. 67:3064-70, 2001, Eikmanns B J. Eggeling L. SahmH. Antonie van Leeuwenhoek. 64:145-63，1993-94)。蛋白質之 突變型亦可導致酶複合物之降低或抑制之同質多分子聚合 作用或異質多分子聚合作用，及因此同樣地導致酶性質之 損傷。 98006.doc -15· 1329131

Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)， -對於丙糖-填酸鹽異構酶編瑪之基因tpi(Eikmanns (1992)， Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)， -對於升絲胺酸0-乙醯基轉送酶編碼之基因metA(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 725)， -對於耽硫謎·7 -合酶編碼之基因metB(EP i 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3491)， -對於胱硫醚r_裂解酶編碼之基因metC(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061)， -對於胱硫醚合酶編碼之基因metH(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663)， -對於絲胺酸羥基甲基轉送酶編碼之基因glyA(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1110)， -對於Ο-乙醯基升絲胺酸疏氫基水解酶編碼之基因metY(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726) * -對於亞甲基四氫葉酸鹽還原酶編碼之基因metF(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379)， -對於磷絲胺酸胺基轉送酶編碼之基因serC(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 928)， -對於磷絲胺酸磷酸酶編碼之基因serB(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767) » -對於絲胺酸乙醯基-轉送酶編碼之基因cysE(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)， 98006.doc • 17· 1329131 -對於半胱胺酸合酶編碼之基因cysK(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817)， -對於升絲胺酸脫氫酶編碼之基因hom(EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1306)。 此外，對於甲硫胺酸之本發明製造，以致使對應之蛋白 質之活性（與未經突變之蛋白質比較）係經由代謝物而受影 響至較低之程度、或不受影響、或者致使增加彼等之特定 活性之方式同時突變至少一種之下列基因，可係有利的：

-對於天門冬胺酸鹽激酶編碼之基因lysC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 281)， -對於丙酮酸鹽叛化酶編碼之基因pyc (Eikmanns (1992)，

Journal of Bacteriology 174: 6076-6086) > -對於升絲胺酸O-乙醯基轉送酶編碼之基因metA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 725)，

-對於胱硫醚丫-合酶編碼之基因metB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3491) · -對於胱硫醚r -裂解酶編碼之基因metC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3061)， -對於胱硫醚合酶編碼之基因metH (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1663) « -對於絲胺酸羥基甲基轉送酶編碼之基因glyA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1110)， -對於O-乙醯基升絲胺酸硫氫基水解酶編碼之基因metY (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 726)， 98006.doc -18- 1329131 -對於亞甲基四氫葉酸鹽還原酶編碼之基因metF (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2379) > -對於磷絲胺酸胺基轉送酶編碼之基因serC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 928)， -對於磷絲胺酸磷酸酶編碼之基因serB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 334, DNA-SEQ NO. 467, DNA-SEQ NO. 2767)，

-對於絲胺酸乙醯基轉送酶編碼之基因cysE (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2818)， -對於半胱胺酸合酶編碼之基因cysK (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2817)， -對於升絲胺酸脫氫酶編碼之基因hom (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 1306)。 此外，對於甲硫胺酸之製造，减弱一種或多種之下列基 因表現，特定言之，降低或關閉彼等之表現，可係有利

的： -對於S-腺苷曱硫胺酸合酶編碼之基因metK(E.C.2.5.1.6)， -對於升絲胺酸激酶編碼之基因thrB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3453)， -對於蘇胺酸脫水酶編碼之基因ilvA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2328)， % -對於蘇胺酸合酶編碼之基因thrC (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO· 3486)， -對於中-二胺基庚二酸鹽D-脫氫酶編碼之基因ddh (EP 1 98006.doc -19- 1329131 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3494)， -對於磷烯醇丙酮酸鹽羧基激酶編碼之基因pck (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3157)， -對於葡萄糖-6-磷酸鹽6-異構酶編碼之基因pgi (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 950) > -對於丙酮酸鹽氧化酶編碼之基因poxB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 2873)，

-對於二氫二（2-吡啶曱酸鹽）合酶編碼之基因dapA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3476)， -對於二氫二（2_吡啶甲酸鹽）還原酶編碼之基因dapB (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3477)， -對於二胺基二（2-吡啶甲酸鹽）脫羧酶編碼之基因lySA (EP 1 108 790 A2; DNA-SEQ NO. 3451)。

此外，對於甲硫胺酸之製造，以致使對應之蛋白質之酶 活性係部分或完全减少之方式突變至少一種之上述基因 metK、thrB、ilvA、thrC、ddh、pck、pgi、poxB、dapA、 dapB、lysA，可係有利的。 此外，對於甲硫胺酸之製造，除去另外之不受歡迎之副 反應，可係有利的（Nakayama: "Breeding of Amino Acid

Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.) Academic Press, London，UK, 1982)。 為了達成過量表現，熟諸此技藝之士可個別地或組合地 採用不同之措施。因此，可增加對應之基因之套數之數 98006.doc -20· 1329131

目，或者可突變於構築基因之上游之啟動子及調節區域或 染色體結合位置。表現卡匣（cassettes)以相同之方式作 用，其等係於構築基因之上游組合。經由可誘導之啟動 子，於經由發酵而製造L-甲硫胺酸之過程中增加該表現亦 係可能的。延長信使核糖核酸之壽命之措施同樣地改良表 現。此外，經由抑制酶蛋白質之損壞，同樣地增加酶活 性。基因或基因構築可係連同不同數目之套數存在於質體 中或整合於染色體中及放大表現。或者，相關基因之過量 表現可係經由改變培養基組成或培養條件而進一步達成。 於此方面，熟諳此技藝之士’除了其他以外，於Martin 等人（Biotechnology 5，137-146 (1987))中、於 Guerrero等人 (Gene 138，35-41 (1994))中、於 Tsuchiya 及 Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))中、於 Eikmanns 等人 (Gene 102, 93-98 (1991))中、於歐洲專利 0472869 中、於美

國專泮ij 4,601，893 中、於 Schwarzer及 Puhler (Biotechnology 9, 84-87 (1991))中、於 Remscheid 等人（Applied and

Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))中、於

LaBarre 等人（Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))中、於 WO 96/15246 中、於 Malumbres 等人（Gene 134, 15-24 (1993))中、於日本專利-A-10-229891 申、於 Jensen 及 Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))中、於 Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996))中以及於遺傳學及分子生物學之已知之 教科書中找到指示。 98006.doc -21 · 1329131 D)進行發明之發酵

根據本發明製造之微生物可係連續地或於批式方法（批 式培養）中或於進料批式方法、或重複之進料批式方法中 分批地培養以用於甲硫胺酸之製造。已知之培養方法之概 述可係於由Chmiel之教科書（Bioproze/Jtechnik 1. Einfiihrung in die Bioverfanrenstecnnik [Process Biotechnology 1. Introduction to process biotechnology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))中或於由 Storhas 之教科書 (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripherals] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)) 中找到。 使用之培養基必須以適合之方式滿足個別之菌株之需 要。不同之微生物之培養基之說明係於the American Society ftir Bacteriology 之手冊"Manual of Methods ftir General Bacteriology" (Washington D. C.，USA, 1981)中提

供。 可根據本發明使用之介質通常包含一種或多種之碳來 源、氮來源、無機鹽類、維生素及/或痕量元素。 較佳之碳來源係糖類，諸如單醣類、雙醣類或多醣類。 很良好之碳來源係，例如，葡萄糖、果糖 '甘露糖、半乳 糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子 糖、澱粉或纖維素。糖類亦可係經由複雜之化合物而加入 該培養基中，諸如糖蜜、或糖之精製之其他副產物。將多 種碳來源之混合物加入’亦可係有利的。其他可能之碳來 98006.doc 22· 1329131 源係油類及脂肪類’例如黄豆油、葵花子油、花生油及椰 子脂；脂肪酸類，例如軟脂酸、硬脂酸或亞麻油酸；醇 類，例如甘油、曱醇或乙醇；及有機酸類，例如乙酸或乳 酸。 氮來源通常係有機或無機之氮化合物或包含此等化合物 之物質。氮來源之實例包括氨氣或銨鹽類諸如硫酸錄、氣 化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨、硝酸鹽類、尿素、胺基 酸類或複雜之氮來源諸如榖物浸潰液（c〇rn steep 、

黄豆粉、黃豆蛋白質、酵母萃取物、肉萃取物及其他。氮 來源可係個別地或如混合物使用。 可存在於培養基t之無機鹽化合物類包括鈣、鎖、鈉、 鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅及鐵之氣化物類、磷酸鹽類或硫 酸鹽類。 可使用於曱硫胺酸之製造之硫來源係無機硫化合物類， 例如硫酸鹽類、亞硫酸鹽類、二硫磺酸鹽類、四硫確酸鹽

類、硫代硫酸鹽、硫化物類，而且亦有機之硫化合物類， 諸如硫醇類。 作為磷來源，可使用磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或 對應之鈉鹽類。 可將甜合劑類加入培養基中，以維持金屬離子於溶液 中。特別適合之鉗合劑類包括二羥基酚類，諸如兒茶紛或 兒茶齡曱酸鹽’或者有機酸類，諸如檸檬酸。 根據本發明使用之發酵培養基通常亦包含其他之生長因 子類，諸如維生素類或生長促進劑類，其等包括，例如， 98006.doc • 11- 1329131

生物素、核黃素、1^胺、葉酸、於驗酸、泛酸鹽及°比σ多 醇。生長因子類及鹽類時常起源自複雜之培養基成分，諸 如酵母萃取物、糖蜜、榖物浸潰液及其類似物。此外，可 將適合之先質加入培養基中。培養基化合物之精確之組成 主要係視分別之實驗而定，及係對於每種特定之案例分別 地決定。對於培養基最適化之資訊係自教科書"Applied Microbiol· Physiology, A Practical Approach”（編輯 P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 55-73, ISBN 0 19 963577 3)可獲得。生長培養基亦可係自商業供應商獲 得，諸如 Standard 1 (Merck)或 BHI (Brain heart infusion, DIFCO)及其類似物 所有之培養基成分係經由加熱（於1.5巴及121 °C歷時20分 鐘）或經由無菌過濾而殺菌。該等成分可係共同地或者若 必要則分別地殺菌。所有之培養基成分可係於培養之開始 存在或視需要可係連續地或分批地添加。

培養之溫度通常係15°C至45°C，較佳係25°C至40°C，及 於實驗之期間可係維持於常數或改變。培養基之pH應係於 5至8.5之範圍内，較佳係約7.0。於培養之期間，用於培養 之pH可係經由添加驗性化合物類，諸如氫氧化鈉、氫氧化 鉀、氨或氨水，或酸性化合物類，諸如磷酸或硫酸而調 節。為了控制泡沫發生，可使用防沫劑，例如脂肪酸聚乙 二醇酯類。為了維持質體之安定性，可將適合之選擇之物 質，例如抗生素類，加入培養基中。為了維持好氧之條 件，將氧或含氧之氣體混合物（例如周圍空氣）引進入培養 98006.doc -24· 中繼續培養，直到已生成最大量之需要產物為止。此種 目的通常係於10小時至160小時之内達成。 生成之含甲硫胺酸之發酵液體培養基通常具有7.5至25 重量％之乾質量。 此外，倘若發酵至少於末期，但特定言之於至少3〇%之 發酵時間之期間’係於限制糖之條件下進行，則係有利 的。即，於此期間内於發酵培養基中可利用之糖之濃度係 維持於$0至3克/升，或係降低。 E)甲硫胺酸之純化 倘若根據本發明於結晶作用之後獲得之甲硫胺酸仍然不 具有需要之純度，則其可係進一步純化。對於此目的，該 產物係以溶解之形式經歷使用適合樹脂之層析術，需要之 產物或雜質係完全或部分保留於層析之樹脂中。倘若需 要，則可重複此種層析之步驟，其中使用相同或不同之層 析之樹脂。對於適合之層析之樹脂及彼等之最有效用途之 選擇’熟諳此技藝之士係精通的。經純化之產物可係經由 過;慮或超過滤而濃縮’及於產物之安定性係最高之溫度下 儲存》 經分離之化合物之認明及純度可係經由已知之技術而決 定。此等包括高效能液體層析術（HPLC)、光譜方法、顏色 方法、薄層層析術、近紅外線光譜學（NIRS)、酶試驗及微 生物之試驗。此等分析方法係概述於下列中：Patek等人 (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova等 人（1996) Biotekhnologiya 11 27-32;及 Schmidt 等人（1998) 98006.doc -25- 1329131

Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, 575-581及 pp. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A.等人（1987) Applications of HPLC in

Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17。 F)乾燥生物量

於完成發酵之後，可直接處理含曱硫胺酸之發酵液體培 養基，以產生成品乾燥飼料添加劑。然而，根據本發明之 一種較佳具體實施例，首先生物量内容物係，例如經由離 心，而自發酵液體培養基完全地或部分地（較佳係完全地） 移出，及處理以生成本發明之飼料添加劑》生成之生物量 仍然包含某些比率之甲硫胺酸，其倘若需要則可係經由洗 滌步驟之中間安排而降低。 本發明之生物量可係經由來自先前技藝就其本身已為吾 人所知之各種方法而處理，以產生適合之乾燥產物。特定 言之，用於製造之適合之方法係乾燥方法，諸如喷霧乾 燥、喷霧粒化、接觸乾燥、流體化床乾燥或冷凍乾燥。適 合之方法係’例如，於下列中敘述：0. Krischer，W. Kast， Trocknungstechnik [Drying technology]第一册，"Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik" [The scientific bases of drying technology]，Springer-Verlag 98006.doc •26· 1329131 1978; Krischer/Kroll, Trocknungstechnik [Drying technology] 第二冊，"Trockner und Trocknungsverfahren" [Dryers and drying methods], Springer-Verlag 1959; K. Kroll, W. Kast, Trocknungstechnik% # ， "Trocknen und Trockner in der

Produktion" [Drying and dryers in production], Springer-Verlag 1989; K. Masters, "Spray Drying Handbook", Longman Scientific & Technical 1991，725 頁；H. Uhlemann，

L. Mori, "Wirbelschicht-Spruhgranulation" [Fluidized-bed spray granulation], Springer-Verlag 2000; Freeze drying: Georg-Wilhelm Oetjen, "Gefriertrocknen" [Freeze drying], VCH 1997 ;及亦歐洲專利-A-0 809 940。上述之出版物之揭示 係以提及之方式明確地併入本文中。 特別較佳地，本發明之乾燥步驟係經由喷霧乾燥（例如 以整合之流體化床之喷霧乾燥）、或經由喷霧粒化而進 行0

倘若需要，則乾燥可係於適合於飼料用途之適合之載體 材料之存在下進行，由於其之結果，特定言之，可改良自 由流動之能力及因此產物品質。 適合於飼料用途及可使用之載體材料係習用之惰性載 體。"惰性”載體對於存在於添加劑中之食物佐劑應不顯示 任何負面之交互作用，及對於在飼料添加劑中作為助劑之 用途必須係安全的。可提及之適合之載體材料之實例係： 天然或合成來源之無機或有機之化合物。適合之低分子量 無機載體之實例係鹽類，諸如氯化鈉、碳酸鈣、硫酸鈉及 98006.doc • 27· 1329131 硫酸鎂’或矽酸。適合之有機載體之實例係，特定言之， 糖類’例如葡萄糖、果糖、蔗糖及亦糊精類及澱粉產物。 . 可提及之高分子量有機載體之實例係：澱粉及纖維素配製 品類，諸如，特定言之，玉米澱粉、榖物粉末（例如小 麥、裸麥、大麥及燕麥粉、或其等之混合物、或粗小麥麩 粉（wheat semolina bran))。以乾燥為基準，載體材料可係 以約5至8 5重量°/。之數量存在於配製品中，例如約丨〇至3 〇 重量％、約20至40重量％或約50至85重量％。 於後文中，某些較佳乾燥技術係以通常形式概要地處 % 理。 噴霧乾燥可係經由首先泵送該仍然濕潤之生物量至於噴 務塔中之霧化器而進行。該霧化係，例如，經由壓力噴嘴 (單一成分噴嘴）、雙成分喷嘴或離心霧化器而進行。液滴 係經由流動進入該喷霧乾燥器中之熱空氣流而乾燥。當使 用離心霧化器時，乾燥較佳係以同向流動進行。當使用噴 嘴時，乾燥亦可係以反向流動或交又流動進行。該經乾燥 ，粉末可係於該塔排出或其係連同該空氣流帶出及於旋風馨 器及/或過;慮器中分離。視產物及程序而^，可需要後-乾 燥’其可係於連結於該噴霧乾燥器之内部之流體化床中或 於外部之流體化床中進行。 一 :本心月之乾燥方法之不同形式中，於乾燥步驟，特定 · η之噴務乾燥，之下游提供連續或分批之流體化床黏聚。 為了此目的，炉'•太0+ ea u 、万法之開始，以粉末狀材料（例如經由啥 霧乾燥而獲得之格古此.死丨、 、 私末狀添加劑）進料至流體化床乾燥器。 98006.doc -28- 1329131 該材料係，例如，經由進料經預熱之空氣而流體化。將液 相（例如另外之生物量或含黏合劑之溶液）噴霧於流體化床 上，及結果已進料之粉末係以此種溶液潤濕及，經由其之 黏著之性質，逐漸地黏聚。於同時，連續地或半連續地， 以循環之方式於時間之間隔，自該流體化床排出次數量之 黏聚物。該排出物係，例如使罔篩網而分級。於此種程序 中產生之粗材料可係粉碎及連續地再循環至流體化床。微 細粉末，例如來自排出空氣過濾器系統，同樣地可係連續 地再肩環。 另一種較佳之方法不同形式包含喷霧乾燥生物量以產生 粉末，結合該經噴霧乾燥之粉末之隨後黏聚。此可係分批 地或連續地進行。較佳者係連續之程序。此種類型之方法 可係使用習用之喷霧乾燥工廠而進行。然而，有利地該 程序係於如FSD(流體化喷霧乾燥器）、_(喷霧床乾燥器） 或MSD(多階段乾燥器）已為吾人所知之裝置中進行。 用於本發明之乾燥產物之連續製造之 叩戦燥工廠料言之可係根據下列之路徑操== 物量係通過進料管路而引進人該FSD乾燥器之頂部中及使 用霧化器而霧化。乾燥係經由以同向流動引進空氣而進 仃。空氣係通過加熱器而預熱。經噴霧乾燥之粉末收集於 在違FSD乾燥器之底部中之整合之流體化床中及係於該處 使用喷霧裝置（該嘴霧裝置使用，例如，屋縮空氣）而連同 黏合劑溶液噴霧，及使用引進之空氣而流體化。用於此目 的之空氣係預熱及經由進料管路而於該整合之流體化床之 98006.doc •29· 1329131 氣體分配器下方進料。然後，生成之預黏聚物流動進入下 游外部流體化床中。經預熱之空氣係自下方經由另外之進 料管路而引進入此外部流體化床中。於該流體化床中進料 之預黏聚物係使用另外之噴霧裝置使用壓縮空氣（例如連 同黏合劑溶液）而再噴霧，及黏聚以生成最後產物。成品 黏聚物係自流體化床排出及可係如以上敘述進一步處理。 噴霧之液體之組成及數量係視噴霧進入之溶液之黏著性 質、達成之黏聚物尺寸及方法條件而定。 於該經噴霧之生物量之黏著性質不足夠以確保該等粒子 於喷霧之後安定地黏結一起之案例_，黏合劑另外之使用 係有利的。此避免黏聚物於乾燥之後再崩解。於此等案例 中，將可溶解或可分散於水性介質令之黏合劑喷霧進入流 體化床中，係較佳的。可提及之適合之黏合劑之實例係碳 水化合物類（例如葡萄糖、蔗糖、糊精及其他）、糖醇類（例 女甘露糖醇）之/谷液、或聚合物溶液，例如經基丙基甲基 纖維素（HPMC)、聚乙烯吡咯啶酮（pvp)、經乙氧基化之纖 維素（EC)、乙基纖維素或丙基纖維素之溶液。由於喷霧進 入之黏合劑之數量及黏著性質之適合選擇之結果，因此生 成不同尺寸及強度之黏聚物。 倘若黏合劑係如分別之溶液喷霧，則以溶液之總重量為 基準，溶液之黏合劑含量係於約丄至儿重量％之^圍=: 於此種案例巾存在之黏合㈣樣地係溶解於水性介質中， 較佳係無菌之去礦質水。習用之添加劑，例：容 解化劑，同樣地可存在。 98006.doc 1329131 根據本發明’黏合劑於最後產物中之含量係0至約2〇重 置％，例如約1至6重量％。最適之數量亦係選擇之黏合劑 之類型之函數。確保對於產物之負面效應係避免，係必要 的。 G)調配物 i)飼料添加劑及飼料組合物 本發明之含甲硫胺酸之飼料添加劑較佳係於微細地分割 之自由流動粉末之形式 '或於經粒化之形式。顆粒可係， 例如於5至200微米之尺寸範圍内，例如丨〇至i 5〇微米、2〇 至1〇〇微米或30至80微米，但不受其限制。 本發明之添加劑之體密度可係，例如，於約1〇〇至6〇〇克 /升之钯圍内，例如15〇至4〇〇克/升、或2〇〇至35〇克/升但 不受其限制。 本發明之添加劑之甲硫胺酸含量根據製造之方法而變 動。 根據本發明可獲得之甲硫胺酸晶體具有大於60重量％之 甲硫胺酸含量，例如約7〇至98重量％，較佳係約8〇至95重 量/。，特別較佳係約87至95重量％。鹽類（來自發酵液體培 養基之剩餘物）之含量可係於約〇至2〇重量％之範圍内，特 定s之約5至15重量％。其他發酵次要成分可係以約〇至2〇 重量°/〇之數量存在，特定言之約5至15重量％。 本發明之甲硫胺酸生物量具有大於3重量0/〇之曱硫胺酸 3量，例如約5至40重量％，或約1 〇至3 5重量鹽類之含 量可係於約0至30重量％之範圍内，諸如約5至25重量％。 98006.doc •31· 1329131 其他次要之發酵成分可係以約〇至20重量％之含量存在， 諸如約5至15重量％。 以添加劑之總重量為基準，成品添加劑之剩餘之水分含 墨較佳係於低於約3-5重量％之範圍内。以上之重量百分率 係以乾產物之總重量為基準（較佳地無剩餘之水分）。

除了上述之成分以外，本發明之調配物，如已於以上述 及’可包含另外之佐劑，其等可係於生物量之處理之前、 之期間或之後加入。可提及之實例係防腐劑、抗生素、抗 微生物添加劑、抗乳化劑、甜合劑、生理上無害之鹽類' 調味劑類、顏料類及其類似物。亦可存在與營養相關之佐 劑’例如維生素類（例如維生素A、、B2、B6、B12、C、 D3、及/或Ε、Κ3、葉酸、菸驗酸、泛酸）、牛績酸、羧酸 類及其之鹽類（例如二缓酸類’諸如择樣酸鹽、異檸檬酸 鹽、反-/順-烏頭酸鹽及/或升檸檬酸鹽）、酶類、類胡蘿葡 素、礦物質類（例如Ρ、Ca、Mg及/或Fe)、及痕量元素類 (諸如Se、Cr、Ζη、Μη)、蛋白質、碳水化合物、脂肪、胺 基酸。此外’可存在丙酮酸、L_肉鹼、硫辛酸、輔酶 Q10、胺基羧酸類（例如肌酸、血嘧啶酸）、肌醇、黃嗣類 化合物類、甜菜鹼、對胺基苯曱酸。 本發明之含甲硫胺酸之飼料添加劑可係組合入商業上習 用之動物飼料調配物中，然後其可係飼育於，例如牛、 豬、羊 '家禽及其類似動物。用於此目的，本發明之添加 劑係與習用之動物飼料成分混合及倘若適合，則加工成最 後之形式，例如形成小球。習用之動物飼料成分係例 98006.doc •32· 1329131 如，玉米、大麥、樹薯、燕麥、黄豆、乾魚粉、粗小麥麩 粉、黄豆油、白堊、礦物質類、痕量元素類、胺基酸類及 維生素類。 ii)食物及飼料補充物

發明地製造之甲硫胺酸係使用作為於食物或飼料中之佐 劑或作為於於食物補充物或飼料補充物中之佐劑，例如多 種維生素配製物中之佐劑。用於此目的，發明地製造之產 物可係以需要之數量及以就其本身而論已知之方法組合入 習用之食物及飼料或食物補充物及飼料補充物中。於此種 案例中’視用途而定’甲硫胺酸可係以不同之有利之數量 存在。 iii)經塗布之調配物 倘若適合，則上述之發明之調配物可另外具有塗層。於 此種案例中，彼等係以包含至少一種自下列選出之化合物 之塗料組合物最後加工：

-聚（伸烷基二醇）類，特定言之聚（乙二醇）類，例如具 有約400至15,000之數目平均分子量者，例如400至 10,000 ； -聚（氧化烯烴）聚合物類或共聚物類，例如具有約4,000 至20,000之數目平均分子量者，特定言之聚氧乙烯與 聚氧丙烯之嵌段共聚物類； •經取代之聚苯乙烯類、順丁烯二酸衍生物類及苯乙 烯-順丁烯二酸共聚物類； •乙烯型聚合物類，特定言之聚乙烯吡咯啶酮類，例如 98006.doc •33· 1329131 具有約7,000至1，000,000之數目平均分子量者；單獨 地或於與其他化合物（諸如纖維素醚類或澱粉類）組 合； •乙烯吡咯啶酮/乙酸乙烯酯共聚物類，例如具有約 30,000至100,000之數目平均分子量者； -聚（乙烯醇）類，例如具有約10,000至200 000之數目平 均分子量者，及聚（醜酸乙稀酯）類；

-沒基丙基甲基纖維素類’例如具有約6,000至8〇 〇〇〇之 數目平均分子量者； •(甲基）丙烯酸烷基酯聚合物類及共聚物類，例如具有 約100,000至1，〇〇〇,〇〇〇之數目平均分子量者，特定々 之丙烯酸乙酯/曱基丙烯酸甲酯共聚物類及甲基丙烯 酸S旨/丙烯酸乙醋共聚物類； -聚（乙酸乙烯酯）類，例如具有約250,000至700 000之 數目平均分子量者，倘若適合，則以聚乙烯吡咯啶酮 安定化；

聚烯烴類，特定言之聚乙烯類； ，芳族聚合物類，例如木質素類； '聚（丙烯酸）類； -聚丙烯醯胺類； 聚· fl基丙稀酸S旨類； '笨氧基乙酸-甲醛樹脂類； 、纖維素衍生物類，諸如乙基纖維素、乙基甲基纖維 素、甲基纖維素'羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖 98〇〇6_d〇c -34· 1329131 維素、羧基甲基纖維素、纖維素乙酸酯酞酸酯； -動物、蔬菜或合成之脂肪類及經修飾之脂肪類，例如 聚乙二醇類、脂肪醇類、經乙氧化之脂肪醇類、高碳 ' 脂肪酸類；高碳脂肪酸類之單-、二·及三甘油醋類， 、 例如單硬脂酸甘油酯、烷基芳基乙氧基酸酯類及椰子 基單乙辱胺酿胺類（cocomonoethano丨amides); -動物及植物蠟類或經化學修飾之動物及植物蠛類，諸 如蜂蠟、堪地里拉蠟（candelilla wax)、棕摘躐、褐煤 酯蠟及米芽油蠟、鯨蠟、羊毛脂、荷荷葩蠟、沙索壞 ^ (sasol wax)； -動物及植物蛋白質類，例如明膠、明膠衍生物類、明 夥取代物類、路蛋白、乳清、角蛋白、黄豆蛋白；玉 米蛋白及小麥蛋白； -單-及二醣類、寡醣類、多醣類，例如玻糖醛酸、黏 稠性多糖（pullulan)、elsinan、澱粉類、經修飾之殿粉

類、及亦果膠類、海藻酸鹽類、聚葡萄胺醣、鹿角菜 苷； -植物油類、例如葵花子油、薊油、棉子油、黃豆油、 玉米胚芽油、撖欖油、菜子油 '亞麻仁油、椰子油、 棕櫚仁油；合成或半合成之油類，例如中等鏈三甘油 雖類或礦物油類；動物油類’例如鯡魚油、沙丁 #，、由 及鯨魚油類； 類’例如屬 、經氫化之 -經硬化（經氫化或經部分氫化）之油類/脂肪 於以上提及者，特定言之經氫化之棕櫚油 98006.doc -35- 1329131 亞麻仁油、經氫化之黃豆油； 喷漆塗料類’例如箱稀類，特定言之蟲膠、妥路香 膠、秘魯香膠、山達脂、及聚矽氧樹脂類； 脂肪酸類，飽和及亦單不飽和及多不飽和之。至匕^ 羧酸類； -石夕石類 及其等之混合物。 倘若適合，則於塗布之前將塑化劑類或乳化劑類加入脂 肪類或壞類中以改良膜之撓性，可係有利的。 塗料，倘若適合，則係連同添加劑以就其本身而論已知 之方法，通常經由用於作滴狀添加之裝置或經由喷霧於已 進料於混合器中之有價值之產物上而塗布。此裝置之實例 係噴管（lances)、灑水龍頭、單一流體或多流體喷嘴、或 旋轉滴下或霧化裝置。於最簡單之案例中，如濃縮之噴出 物局部地作添加，亦係可能的。或者，首先可將塗布材料 進料入混合器中，俾能於其後將有價值之產物加入。另一 種可能性係，最初固體塗布材料之添加，其由於壁加熱、 或由於輸入之機械能，炫解及塗布有價值之產物。 本發明現在將係參考附隨之圖而較詳細地說明。 實例1 : a)曱硫胺酸經由發酵之製造 為了製造用於甲硫胺酸之純化之代表性發酵液體培養 基’進行實驗室之發酵。海蜃鑀襻淨彦菌株ATCC13032 (American Type Culture Collection，Manassas，USA)係於 98006.doc -36- 1329131

Techfors發酵器中之200毫升之BHI培養基（Difco/Becton Dickinson Franklin Lakes, USA)之初步培養中生長，然後 將該初步培養接種入培養基（約14升）中。 主要培養之發酵培養基具有下列之組成 2克/升之KH2P04 2克/升之Κ2ΗΡ04 10克/升之硫酸銨 100克/升之葡萄糖 5克/升之酵母萃取物 20毫克/升之康納黴素（kanamycin) 1克/升之KS911 ASM防沫劑 pH 7.0 以去礦質水補充至需要之最後體積 痕量鹽溶液1毫升/升之培養基

FeS04 · 7H20 10克/升 MnS04 * 4-6H20 10克/升 ZnS04 2克/升 MgS04 · 7H20 250克/升 使用HC1調節至pH 1 1毫升/升之兒茶酚甲酸鹽溶液（儲備溶液300毫克/10毫 升） 生物素 1毫克/升 噻胺 1毫克/升 98006.doc -37-

CaCl2 5毫克/升。 於發酵器已用初步培養接種之後，發酵器係經由加入鹼 (25% NtUOH)而維持於pH 7及發酵直到糖係已消耗掉為 止°此係經由於p〇2值中之增加或經由於操作溫度範圍 (OTR)及臨界溫度範圍（Ctr)中之降低而顯示。 b)發酵液體培養基之處理 用於處理之程序係於圖1中圖解地概述。 根據段落a)製造之發酵液體培養基係充當開始材料。於 30至40°C之間之發酵溫度，約50%之存在之甲硫胺酸係於 結晶形式《該開始產物具有約86%之水含量，約9%之經強 化之甲硫胺酸含量及約3%之生物量含量。其他之發酵副 產物及礦物質係以痕量（約25重量％)存在於發酵液體培養 基中。 於70。(：加熱20公斤之此種發酵液體培養基歷時15分鐘。 結果，該甲硫胺酸完全進入溶液中。然後於固定溫度，離 心分離出生物量。然後於1〇(rc及大氣壓力濃縮上清液（約 15公斤）至20%之曱硫胺酸含量。然後以5凱氏溫度/小時 (K/h)之速率冷卻該濃縮物至5〇c，由於其之結果大部分 之甲硫胺酸結晶出。然後晶體係於真空過濾器上自晶體搪 糊刀離出以4升之先刖於5 °C平衡之水洗蘇然後以於4〇 之氮吹乾。經由此種程序’ 1>3公斤之乾燥f硫胺酸係以 約90%之純度分離出。 離心之剩餘物（約5公斤），除了乾燥之生物量以外亦 包含約6%甲硫胺酸。經由喷霧乾燥，可轉變此種剩餘物 9S006.doc -38- 1329131 成為約0.7公斤之具有3%之剩餘水分之略為帶黃色並且自 由流動之乾燥粉末，其，除了乾燥之生物量及其他發酵副 產物及礦物鹽類以外’亦包含甲硫胺酸（約3〇%)。 喷霧乾燥係於實驗室噴霧乾燥器中使用下列之儀器設定 而進行： 入口溫度：20〇。(：， 出 口溫度：80-82°C。 使用之加熱氣體係6〇米3/小時之氮。喷嘴氣體係以2巴之 屋力通過1.2毫米喷嘴喷霧。 實例2 : 自相同之開始材料開始，方法係修飾至生物量係經由離 心而分離出、然後該分離出之生物量係以5升之水洗滌之 程度（圖2)。於離心之後，將生成之上清液加入第一次生物 量分離之上清液中。K10(rc及大氣壓力濃縮整個上清液 至16%之甲硫胺酸含量。經由以5凱氏溫度/小時之速率冷 卻該濃縮物至5X：，甲硫胺酸係結晶出。晶體係於真空過 濾益上分離出，以45升之先前於5〇c平衡之水洗滌然後以 於40<t之氮乾燥。經由此種程序，乾燥曱硫胺酸之數量係 增加至約1.5公斤。分離之晶體之純度再次係約。 經分離出並經洗滌之生物量之剩餘物係經由噴霧乾燥而 轉變成約0.5公斤之乾燥產物。 如此製造之產物（其，除了乾燥之生物量及其他發酵副 產物及礦物鹽類以外，亦包含曱硫胺酸（約10%))係自由流 動的。 98006.doc •39· 丄以9131 實例3 : 自相同之開始材料開始，實例2之方法係另外修飾至當 刀離出結晶甲硫胺酸時產生之母液及洗滌水係於下一批次 中加入含甲硫胺酸之發酵液體培養基中之程度（圖3)。 以於其他方面相似於實例2之程序，以約9〇%之純度自 結晶作用獲得於發酵中約1.5公斤之乾燥甲硫胺酸、及自 具有約10%之甲硫胺酸含量之經噴霧乾燥之生物量獲得約 0.5公斤之產物。 實例4 : 自相同之開始材料開始，實例2之方法係另外修飾至當 分離出結晶甲硫胺酸時產生之母液及洗條水係加人於喷霧 乾燥之前之生物量流中之程度（圖4)。 以於其他方面相似於實例2之程序，製造約M公斤之含 甲硫胺酸之生物量’其’除了乾燥之生物量及其他發酵副 產物及礦物鹽類以外，，亦包含甲硫胺酸(約3〇%)。乾燥曱 硫胺酸之數量係！.5公斤，具有約9G%之純度。 ” 實例5 : 亦可擬想一種方法不同形式，其令將一部分之母液及一 部勿之洗滌水’於甲硫胺酸之結晶作用之後，加入於生物 量分離之前之發酵器液體培養基中，及將其他之次流加入 於喷霧乾燥之前之生物量流中（實例3與實例4之組 【圖式簡單說明】 13 ° 圖1至4顯示，用於製造結晶乾燥甲硫胺酸及乾浮 胺酸之生物量(，，生物量甲硫胺酸")之本發明之方法之不： 98006.doc 1329131 發展。 圖1顯不用於發酵之處理之程序。 圖2顯示用於發酵之處理之經修飾之程序，其中生物量 係經由離心而分離出及該分離出之生物量然後係以水洗 條。 圖3顯示用於發酵之處理之經修飾之程序，其中當分離 出結晶曱硫胺酸時產生之母液及洗滌液係於下一批次中加 入含甲硫胺酸之發酵液體培養基中。 圖4顯示用於發酵之處理之經修飾之程序，其中當分離 出結晶甲硫胺酸時產生之母液及洗滌液係於喷霧乾燥之前 加入生物量流中。 98006.doc

Claims (1)

1329131 55ΓΧΤΓ 年月

第093139533號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(99年5月） 十、申請專利範圍： 1. 一種製備曱硫胺酸之方法，包含 a)於適合製造甲硫胺酸之條件下培養製造甲硫胺酸之微 生物， b) 加熱培養物至60°C至120°C —段時間使足以將任何已 結晶之甲硫胺酸溶解，及 c) 將溫度維持於60°C至120°C並從微生物分離出發酵液 體培養基。 2. 如請求項1之方法，其中步驟b)之加熱係進行至約70至 100°C之溫度。 3. 如請求項1之方法，其中該微生物係天然或重組微生 物。 4. 如請求項3之方法，其中該微生物係棒桿菌屬之天然或 重組細菌。 5. 如請求項3之方法，其係製出L-甲硫胺酸。 6. 如請求項1之方法，進一步包含濃縮該發酵液體培養基 且之後從該濃縮該發酵液體培養基結晶出曱硫胺酸。 7. 如請求項1之方法，其中含微生物部分中曱硫胺酸之含 量範圍從大於3重量％至約40重量°/〇。 8. 如請求項1之方法，進一步包含 d) 從發酵液體培養基結晶出曱硫胺酸。 9. 如請求項8之方法，進一步包含 e) 分離出結晶之曱硫胺酸以產生母液， f) 洗滌已分離之結晶曱硫胺酸以產生洗滌液，及 98006-990531.doc 1329131 g)乾燥結晶之甲硫胺酸。 ίο. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 如清求項9之方法，其中步碌 -女夕人m )灰付之母液與另一發缺^ 之a甲硫胺酸液體部分結合。 發酵抵 如請求項9之方法，其中步 杣a *入 J製件之洗滌液與另一路热 —人之3曱硫胺酸液體部分結合。 發酵 如請求項9之方法，進一步 分離出楙&榀 3欠I目同或另一發酵抵次 出微生物，且將步驟匀製 微生物。 于之母液加入該分離出之 如請求項9之方法，進一步包 八鲍山 7包含從相同或另一發酵批次 刀離出微生物，且將步驟〇製 表仔之洗滌液加入該分離出 I微生物。 如:月求項1之方法，進一步包含洗滌該微生物以產生廢 、1液並將廢洗務液加入步驟c)之發酵液體培養基。 如吻求項14之方法’進—步包含乾燥該經洗務之微生 物。 如請求項15之方法，其中乾燥包含喷霧乾燥。 98006-990531.doc