KR20160111285A

KR20160111285A - 사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물

Info

Publication number: KR20160111285A
Application number: KR1020150036260A
Authority: KR
Inventors: 허인경; 손성광; 최진근; 김소영; 신용욱; 이재희; 성진우; 이윤재; 임진성; 정준영
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2015-03-16
Filing date: 2015-03-16
Publication date: 2016-09-26
Also published as: EP3272225B1; ES2870480T3; EP3272225A4; US20180042267A1; JP6671390B2; BR112017019153A2; RU2017134360A3; SG11201707612QA; WO2016148488A1; CN107404904A; AU2016234065A1; AU2016234065B2; JP2020031656A; DK3272225T3; RU2017134360A; RU2692656C2; EP3272225A1; MY183101A; PL3272225T3; JP2018509152A

Abstract

본 발명은 L-메티오닌 함량이 높은 사료첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 60 내지 99.90 중량%의 높은 함량의 L-메티오닌과 L-페닐알라닌 및 L-티로신을 포함하는 사료첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물에 관한 것이다.

Description

사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물{FEED ADDITIVE COMPOSITION AND ANIMAL FEED COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물에 관한 것이다.

메티오닌은 생체내의 필수 아미노산의 한 종류로, 동물 사료, 식품 첨가제, 의약용 수액제 및 의약품의 합성 원료 등으로 사용된다. 메티오닌은 화학적 합성과 생물학적 합성을 통하여 생산할 수 있다.

화학적 합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)-하이단토인(5-(β-methylmercapto ethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여 D, L-메티오닌을 생산하는 것이다.

생물학적 합성의 예로, 미국 등록특허 US7745195B2 호는 시스타치오닌 신타아제 (cystathionine synthase)에 변이를 가하여 미생물이 시스테인을 이용하지 않고 직접 H₂S 또는 CH₃SH를 이용하여 호모시스테인 또는 메티오닌을 직접 생산하는 방법을 개시하고 있다. 이와 더불어, 대한민국 등록특허공보 제10-0905381호는 미생물 발효로 L-메티오닌 전구체를 생산한 후 이를 기질로 효소전환 반응을 통해 L-메티오닌을 생산하는 이단계 공법을 개시하고 있다.

종래 화학적으로 생산된 메티오닌은 D,L-메티오닌이 혼합된 형태로 생산되어 L-메티오닌 만을 수득하기 위해서는 고가의 추가 정제반응을 요구한다. 한편, 생물학적 합성으로 미생물로부터 직접 생산되는 메티오닌은 L형이라는 장점이 있으나 생산량이 매우 미량이고, 대규모 발효 생산이 어려울 뿐 아니라 균일한 상태의 발효물을 얻기 어렵다. 따라서, 종래 저렴한 사료 첨가제에서는 L-메티오닌이 주성분으로 포함될 수 없었다.

US 7745195B2 (공개일 2010.06.29) KR 10-0905381B1 (공고일 2009.06.30)

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 극복하기 위해 연구를 거듭한 결과, 미생물 발효로 L-메티오닌 전구체를 생산한 후 효소 전환반응을 통해 L-메티오닌을 대량으로 수득하였다. 이후, 이에 대한 정제공정 개발을 통하여 균일한 품질의 L-메티오닌 함량이 높은 조성물을 제공할 수 있고, 이와 같은 조성물을 함유하는 사료 첨가제가 동물에서 우수한 효과를 보임을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 L-메티오닌 함량이 높은 사료 첨가제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 동물 사료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 60 내지 99.90 중량%의 L-메티오닌, 0.05 내지 5 중량%의 L-페닐알라닌 및 0.01 내지 3 중량%의 L-티로신을 포함하는 사료 첨가제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 동물 사료 조성물을 제공한다.

본 발명은 미생물 발효에 의한 L-메티오닌 전구체의 생산 및 이의 효소 전환반응을 통해 L-메티오닌을 대량 생산하고 이를 결정화함으로써, 기존의 사료 첨가제보다 동물의 영양 공급을 개선시킬 수 있는 L-메티오닌의 함량이 높은 사료첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물을 제공하는데 유용하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 첫 번째 양태로서, 본 발명은 L-메티오닌 함량이 높은 사료첨가제용 조성물을 제공한다.

상기 L-메티오닌 함량이 높은 조성물은 함량이 증대된 L-메티오닌을 포함하는 것으로, 구체적으로 L-메치오닌과 L-페닐알라닌 및 L-티로신을 포함할 수 있다. 추가적으로 상기 L-메티오닌 함량이 높은 조성물에 L-메티오닌, L-페닐알라닌 및 L-티로신을 제외한 하나 이상의 추가적인 영양 성분을 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 영양 성분은 L-메티오닌, L-페닐알라닌 및 L-티로신을 제외한 기타 아미노산, 아세테이트, 이온일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 조성물은 L-메티오닌을 과량으로 포함시킬 수 있는 생산방법이면 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 기존의 특허에 명기된 2단계 공정으로 구성된 L-메티오닌 생산 방법에 따라서 L-메티오닌을 생산한 후, 결정화시키는 공정을 통하여 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 2단계 공정으로 구성된 L-메티오닌 생산 방법은 대한민국 등록특허 제10-0905381호, 대한민국 등록특허 제10-0905381호, 대한민국 등록특허 제10-1136289호, 대한민국 등록특허 제10-1117012호, 대한민국 등록특허 제10-1200179호, 대한민국 등록특허 제10-1250651호 등에 개시되어 있으며, 이 특허는 본 발명에 내용 전체가 참고로 인용되어 있다.

보다 구체적으로, 상기 2단계 공정으로 구성된 L-메티오닌 생산 방법은 1단계로서 L-메티오닌 전구체 생산 균주를 배지에서 배양하여 L-메티오닌 전구체를 생산하는 단계; 및 2단계로서 상기 단계에서 생산된 L-메티오닌 전구체에 황원을 첨가하여 효소 반응으로 L-메티오닌을 생산하는 단계로 구성된다.

먼저, L-메치오닌 전구체는 이를 생산할 수 있는 미생물 변이체 또는 재조합 미생물을 적정한 배지에서 배양함으로써 생산할 수 있다. 구체적으로, L-메티오닌 전구체는 O-아실 호모세린(O-acyl homoserine), 예를 들어, O-아세틸 호모세린 (O-Acetyl homoserine), O-숙시닐 호모세린 (O-succinyl homoserine), 프로피오닐 호모세린 (Propionyl homoserine), 아세토아세틸 호모세린 (Acetoacetyl homoserine), 쿠마로일 호모세린 (Coumaroyl homoserine), 말로닐 호모세린 (Malonyl homoserine), 하이드록시메틸글루타릴 호모세린 (Hydroxymethylglutaryl homoserine), 피메릴 호모세린 (Pimelylhomoserine)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, O-아세틸 호모세린 (O-Acetyl homoserine) 또는 O-숙시닐 호모세린 (O-succinyl homoserine)일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 O-아세틸 호모세린일 수 있다.

L-메티오닌 전구체 생산 균주의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다.　상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.　탄소원은 포도당(glucose), 젖당(lactose), 자당(sucrose), 유당, 과당(fructose), 맥아당(maltose), 녹말(starch) 및 섬유소(cellulose)와 같은 탄수화물; 콩 기름(soybean oil), 해바라기 기름(sunflower oil), 피마자 기름, 베버 기름(castor oil) 및 코코넛 기름(coconut oil)과 같은 지방; 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)산과 같은 지방산; 글리세롤(glycerol) 및 에탄올(ethanol)과 같은 알코올과 아세트산(acetic acid)과 같은 유기산(organic acid)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤(peptone), 효모추출액(yeast extract), 육수(gravy), 맥아추출액(malt extract), 옥수수침출액(corn steep liquor (CSL)) 및 콩가루(bean flour)와 같은 유기 질소원 및 요소(urea), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 암모늄 클로라이드(chloride), 암모늄 포스페이트(phosphate), 암모늄 카보네이트(carbonate) 및 암모늄 니트레이트(nitrate)와 같은 무기 질소원을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 디히드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 포타슘 히드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 및 상응하는 소듐 포함 염들(sodium-containing salts)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배지는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 또는 아이언 설페이트(iron sulfate)와 같은 금속을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다.

배양물의 온도는 통상 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 L-메티오닌 전구체의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간, 더욱 바람직하게는 15 내지 80시간이다.

다음으로, L-메티오닌 전구체 생산 균주에 의하여 생산된 L-메치오닌 전구체와 황원을 기질로 이용하는 전환효소 또는 전환효소를 포함하는 균주를 이용한 효소전환 반응을 통하여 L-메치오닌 및 유기산을 생산할 수 있다. 상기 전환효소는 황원 전이 효소일 수 있으며, 구체적으로 시스타치오닌 신타제(Cystathionine synthase) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 활성을 가지는 효소, 더욱 구체적으로는 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 활성을 가지는 효소일 수 있다. 상기 황원은 황 원소를 공급해주는 물질로, 구체적으로 메틸 머캅탄 또는 이의 염일 수 있으며, 더욱 구체적으로 메틸 머캅탄을 사용할 수 있다.

일 구현예로, 미생물 발효로 축적된 O-숙시닐 호모세린(O-succinyl homoserine) 또는 O-아세틸 호모세린과 메틸머캅탄과 같은 황원을 기질로 이용하여 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase) 또는 O-숙시닐 호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 등의 효소 반응을 이용하여 L-메티오닌을 생산할 수 있으며, 구체적으로 O-아세틸 호모세린과 메틸머캅탄을 기질로 이용하여 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 효소를 이용하여 L-메치오닌과 아세테이트를 생산할 수 있다.

상기 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자의 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본의 DNA 데이터 뱅크(KEGG)와 같은 데이터베이스로부터 용이하게 얻을 수 있다.

상기와 같은 방법으로 생산된 L-메티오닌은 결정화를 통하여 분리, 정제될 수 있고, 이것에 의하여 본 발명의 L-메티오닌 함량이 높은 조성물을 얻을 수 있다.

구체적으로, L-메티오닌의 결정화 방법은

a) 메티오닌 반응액을 농축시킨 후 결정화된 메티오닌을 분리 후, 모액을 회수하는 단계; 및

b) 분리된 메티오닌 결정을 시드로 이용하여 과립을 생성하고, 생성된 과립을 건조하여 분말화시키는 단계

를 포함할 수 있다.

추가적인 결정화 변형법에 따르면, a) 단계에서 분리된 모액은

a-1) 다시 농축하고 결정화되어 b)에서 분리된 메티오닌 결정과 혼합되어 세정되고 건조되거나,

a-2) 다시 농축하고 결정화된 후 용해되어 다른 메티오닌 반응액에 부가된다.

추가적으로, 상기 결정화 방법은 상기 a) 단계 이전에 메티오닌 반응액을 pH 4.0~5.5로 조정하는 단계를 포함할 수 있으며, 또한 pH 조정 단계 후, 메티오닌 반응액을 활성탄으로 여과하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구현에서, 본 발명에 따른 L-메티오닌 함량이 높은 조성물은 상기 효소전환 반응에 의하여 얻어진 L-메티오닌 반응액에 메티오닌의 농도가 150 ~ 200 g/L이 될 때까지 농축하거나 농축 전에 황산을 투입하여 pH 4.0 ~ 5.5로 적정하고 농축한 후, 결정 분리기를 이용해 결정을 분리하여 모액(mother liquid, ML)을 회수하고, 분리된 메티오닌 결정을 시드(seed)로 사용하여 과립기에서 모액을 분무 건조하여 분말화함으로써 얻어진다. 이렇게 얻어진 L-메티오닌 조성물 중 L-메티오닌의 함량은 조성물 전체 중량에 대하여 약 60 내지 70 중량%의 범위일 수 있다.

다른 구현에서, 본 발명에 따른 L-메티오닌 조성물은 상기 효소전환반응에 의하여 얻어진 L-메티오닌 반응액에 메티오닌의 농도가 150 ~ 200 g/L이 될 때까지 농축하거나 농축 전에 황산을 투입하여 pH4.0 ~ 5.5로 적정하고 농축한 후, 결정 분리기를 이용해 1차로 결정을 분리하여 모액을 회수하고, 분리된 모액을 다시 메티오닌의 농도가 150 ~ 200 g/L이 될 때까지 농축하여 2차 결정을 획득하고, 얻어진 1차 결정 및 2차 결정을 혼합, 세척하고 이를 건조하여 얻어진다. 이렇게 얻어진 L-메티오닌 조성물 중 L-메티오닌의 함량은 조성물 전체 중량에 대하여 약 80 내지 95 중량%의 범위일 수 있다.

또 다른 구현에서, 본 발명에 따른 L-메티오닌 조성물은 상기 효소전환 반응에 의하여 얻어진 L-메티오닌 반응액에 황산을 투입하여 pH 4.0 ~ 5.5로 적정하고, 메티오닌 총량의 0.5 ~ 2%의 활성탄을 첨가하여 50℃에서 1 ~ 2시간 동안 혼합한 후 여과하여 활성탄 및 불순물을 제거하고, 당해 여과액을 메티오닌의 농도가 150 ~ 200 g/L이 될 때까지 농축하고, 결정 분리기를 이용해 1차로 결정을 회수한다. 분리된 모액을 다시 메티오닌의 농도가 150 ~ 200 g/L이 될 때까지 농축하여 2차 결정을 획득하고, 얻어진 2차 결정을 용해하여 L-메티오닌 반응액에 재투입하여 사용함으로써 얻어진다. 이렇게 얻어진 L-메티오닌 조성물 중 L-메티오닌의 함량은 조성물 전체 중량에 대하여 약 95 내지 99.90 중량%의 범위일 수 있다.

상기 분리, 정제에 의하여 얻어진 본 발명의 조성물 중 L-메티오닌의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로, 60 내지 99.90 중량% 범위일 수 있다. 일 구현에서, 상기 조성물은 약 60 내지 70 중량%의 L-메티오닌을 포함할 수 있다. 다른 구현에서, 상기 조성물은 약 80 내지 95 중량%의 L-메티오닌을 포함할 수 있다. 또 다른 구현에서, 상기 조성물은 약 95 내지 99.90 중량%의 L-메티오닌을 포함할 수 있다.

구체적으로는, 상기 방법에 따라 정제된 L-메티오닌 함량이 높은 사료 첨가용 조성물은 60 내지 99.90 중량%의 L-메티오닌과 함께 0.05 내지 5 중량%의 L-페닐알라닌 및 0.01 내지 3 중량%의 L-티로신을 포함할 수 있다.

상기 L-메티오닌 함량이 높은 사료 첨가용 조성물은 상기 L-메티오닌, L-페닐알라닌 및 L-티로신을 제외한 0.01 내지 13 중량%의 기타 아미노산을 포함할 수 있고, 여기에서 이 아미노산은 글루타메이트, 호모세린 또는 O-아세틸 호모세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 글루타메이트의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 11 중량% 범위일 수 있다.

상기 호모세린의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량% 범위일 수 있다.

상기 O-아세틸 호모세린의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량% 범위일 수 있다.

또한, 상기 L-메티오닌 함량이 높은 조성물은 추가로 0.01 내지 20 중량%의 이온을 포함할 수 있다.

또한, 상기 L-메티오닌 함량이 높은 조성물은 추가로 0 초과 2 미만의 중량% 범위의 아세테이트를 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 상기와 같이 L-메티오닌은 결정화를 통하여 분리, 정제되어 얻어진 L-메티오닌 함량이 높은 조성물을 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 기술되지 않았더라도 본 발명의 사료 첨가용 조성물은 당업자가 예상할 수 있는 범위 내의 다른 기타 영양성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 두 번째 양태로서, 본 발명은 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 동물 사료 조성물을 제공한다.

상기 사료 첨가용 조성물은 당업자가 예상 가능한 범위로 포함할 수 있으며, 이는 사용되는 동물의 종류, 연령 및 상태 등에 따라서 적절한 수준으로 조정될 수 있다. 구체적으로 상기 사료 첨가제는 0.01 내지 0.5 중량%의 범위로 포함될 수 있다.

본 발명의 L-메티오닌 함량이 높은 사료 첨가용 조성물은 상업적으로 통상적인 동물 사료 조성물 내로 혼입될 수 있고, 예를 들어, 소, 돼지, 양, 가금류 등에 공급될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 사료 첨가용 조성물은 통상적인 동물 사료 구성 성분들과 혼합될 수 있고, 필요하다면 정제화된 형태로 가공될 수 있다.

통상적인 동물 사료 구성성분은 예를 들어, 옥수수, 보리, 귀리, 대두, 어분, 겨, 대두유, 무기물, 미량 원소, 아미노산 및 비타민이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: L-메티오닌 전구체 생산 균주의 발효

본 실시예에서는 L-메티오닌 전구체를 생산하기 위하여 발효조 배양을 실시하였다.

메치오닌 전구체 생산 균주로서 O-아세틸 호모세린 생산균주인 대장균 KCCM-10568 (대한민국 등록특허 제10-0905381호)를 이용하여 메치오닌 전구체(O-아세틸 호모세린)를 대량 생산하기 위하여 5L 발효조 배양을 실시하였다. 항생제가 함유된 평판 LB 배지에 상기 균주를 접종하여 31℃에서 하룻밤 배양하였다. 그 후, 단일 콜로니를 항생제가 포함된10 ml LB 배지에 접종한 후 31℃에서 5시간 배양하고, 다시 200ml 메치오닌 전구체 시드(Seed배지)를 포함한 1000ml 삼각플라스크에 100배 희석하여 31℃, 200 rpm에서 3 ~ 10시간 배양 후 5L 발효조에 접종하여 유가식 배양(Fed batch) 발효법으로 50 ~ 100시간 배양하였다. 주 배양 발효 배지의 조성을 하기 표 1에 나타내었다.

메티오닌 전구체 생산 발효조 배지 조성

조성	시드 배지 (seed media)	주 배지 (Main media)	피드 배지 (Feed media)
Glucose(g/L)	10.1	40	600
MgSO₄·7H₂0(g/L)	0.5	4.2
Yeast extract(g/L)	10	3.2
KH₂PO₄	3	3	8
Ammonium sulfate(g/L)		6.3
NH₄Cl(g/L)	1
NaCl(g/L)	0.5
Na₂HPO₄·12H₂O(g/L)	5.07
DL-Methionine(g/L)		0.5	0.5
L-Isoleucine(g/L)	0.05	0.5	0.5
L-Threonine(g/L)		0.5	0.5

실시예 2: 메티오닌 전환반응

상기 실시예 1에서 생산된 발효 배양액을 막 여과(membrane filtration)를 이용하여 여과함으로써, O-아세틸 호모세린 배양액과 세포를 분리하였다. 0.1㎛의 막을 이용하여 통과된 액체, 즉 세포를 분리한 나머지를 투과액(permeate)이라 하고, 세포 슬러지(cell sludge)를 보유액(retentate)이라 하였다.

상기 보유액에 탈이온수(deionized water)를 첨가하여 남아있는 O-아세틸 호모세린을 재 회수 하였다.

상기 투과액에 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 포함한 균주를 이용하여 메팁머캅탄과 L-메티오닌 전환효소인 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 또는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래 O-아세틸 호모세린 설피드랄라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)(대한민국 등록특허 제10-1250651호)를 첨가하여 효소전환반응을 수행하였다.

반응 중 잔존 O-아세틸 호모세린의 농도를 측정하고 메틸머캅탄을 공급하여 6시간 동안 효소전환 반응을 수행하여 O-아세틸 호모세린의 농도가 측정되지 않을 때 반응을 종료하였다.

실시예 3: L-메티오닌의 결정화 공정

L-메티오닌의 함량이 높은 조성물을 얻기 위하여, 상기 실시예 2에서 제조된 메티오닌 반응액을 결정화하였다. 본 실시예에 따른 결정화 방법에 의하여 최소 60.00 중량% 내지 최대 99.90 중량%의 메티오닌을 함유하는 조성물을 획득할 수 있었다.

(1) A 결정화 방법

실시예 2에서 얻어진 메티오닌 반응액 상에 메티오닌 농도가 150 ~ 200g/L될 때까지 반응액을 농축하였고, 결정 분리기를 이용해 결정을 분리하여 모액(mother liquid, ML)을 회수하였다. 분리된 메티오닌 결정을 시드(seed)로 사용하여, 과립기에서 모액을 분사하면서 건조하여 분말화된 메티오닌 조성물을 얻었다.

이렇게 하여 얻어진 메티오닌 조성물을 하기 표 2에 나타내었다.

조성 (%)
L-Methionine	60~70
Acetate	0~1
Ion	13~19
Phenylalanine	0.05~4.5
Tyrosine	0.02~2.5
Glutamate	0.5~11
Homoserine	0.05~1
O-Acetylhomoserine	0.1~1

(2) B 결정화 방법

실시예 2에서 얻어진 메티오닌 반응액을 농축하거나 황산을 투입하여 pH 4.0 ~ 5.5으로 적정한 후 농축하였다. 메티오닌 농도가 150 ~ 200g/L될 때까지 반응액을 농축하였고, 결정 분리기를 이용해 1차 결정을 분리하고 모액을 회수하였다. 1차 결정이 분리된 모액을 다시 메티오닌 농도가 150 ~ 200g/L될 때까지 농축하여 2차 결정을 획득하였다. 1차 결정과 2차 결정을 혼합하여 세척하였고, 이를 건조시켜 분말화된 메티오닌 조성물을 만들었다.

이렇게 하여 얻어진 메티오닌 조성물을 하기 표 3에 나타내었다.

조성 (%)
L-Methionine	80~95
Acetate	0~1
Ion	0.5~5.5
Phenylalanine	0.05~4
Tyrosine	0.01~2
Glutamate	0.05~5.5
Homoserine	0.05~1
O-Acetylhomoserine	0.1~1

(3) C 결정화 방법

실시예 2에서 얻어진 메티오닌 반응액에 황산을 투입하여 pH 4.0 ~ 5.5로 적정하였다. 반응액에 메티오닌 총량의 0.5 ~ 2 중량%의 활성탄(active carbon)을 첨가하여 50℃에서 1 ~ 2hr 동안 혼합한 후 여과하여 활성탄 및 불순물을 제거하였다. 여과액은 메티오닌의 농도가 150 ~ 200g/L가 될 때까지 농축하였고, 결정 분리기를 이용해 결정을 획득하였다. 결정을 분리하고 회수된 모액은 다시 농축하여 2차 결정을 회수하였고, 획득된 2차 결정은 용해하여 pH 4.0 ~ 5.5로 적정된 L-메티오닌 반응액에 재투입하여 상기 과정을 반복하여 사용하였다.

이렇게 하여 얻어진 메티오닌 조성물을 하기 표 4에 나타내었다.

조성 (%)
L-Methionine	95.00~99.90
Acetate	0~1
Ion	0.01~0.2
Phenylalanine	0.05~1
Tyrosine	0.01~1
Glutamate	0.01~1
Homoserine	0.01~0.8
O-Acetylhomoserine	0.0~0.5

실시예 4: 메티오닌 조성물의 효능 확인

상기 실시예 3에서 얻어진 메티오닌 조성물의 효능을 확인하기 위하여 사양실험을 실시하였다. 본 실시예에서는 실시예 3의 C 결정화 방법을 통하여 얻어진 L-메티오닌 함량이 높은 조성물(이하, L-Met이라 칭함)을 사용하였고, 대조군으로서 D,L-메티오닌을 함유하는 조성물(여기서 D,L-메티오닌은 화학적 공법으로 생산된 순도 99.99% 이상이며, 이하, D,L-Met이라 칭함)을 사용하였다.

(1) 25주령 이유기 닭에서의 L-메티오닌 조성물의 효능

달걀에의 영향을 확인하고자, 산란계에 L-Met과 D,L-Met을 각각 처리하였다.

실험 설계

- 태어난지 25주령의 이유기 닭(25wk of age, laying hens)

- 기초 식이(basal diet, BD)에 L-Met 또는 D,L-Met를 각각 0.1 중량%, 0.2 중량%의 양으로 첨가

기초식이의 조성

%
Corn	50
Wheat	7
Wheat Bran	3
Soybean meal	26
Others	14

결과

unit %		Egg production rate (%)	Egg weight (g/egg)	Egg mass (g/day/bird)
BD		100.0	100.0	100.0
L-Met	0.1%	103.6	104.1	107.8
L-Met	0.2%	104.9	104.4	109.7
DL-Met	0.1%	101.9	102.7	104.6
DL-Met	0.2%	104.6	102.7	107.4
DL-Met 대비 L-Met 증가량	0.1%	101.6	101.3	103.1
DL-Met 대비 L-Met 증가량	0.2%	100.3	101.7	102.1

상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 기초 식이에 비하여 대조군인D,L-Met 처리군 및 L-Met 처리군 모두에서 달걀에 좋은 영향을 가져옴을 확인하였다. 이에 L-Met처리군과 D,L-Met 처리군을 비교하면, L-Met 처리군에서 달걀 생산능 및 알의 무게는 약 1% 향상되었으며, 알의 두께는 약 2 ~ 3% 증가를 보여 주었다.

이에 D,L-Met 첨가에 비해 L-Met을 첨가했을 때 산란계에서 긍정적인 효과를 가져옴을 확인하였다.

(2) 새끼돼지에서의 L-메티오닌 조성물의 효능

새끼 돼지에서의 L-메티오닌 조성물의 효능을 확인하고자, L-Met과 D,L-Met을 각각 처리한 후 하루 증체량을 비교하였다.

실험 설계

- 새끼 돼지(piglet)

- 기초 식이(basal diet, BD)에 L-Met 또는 D,L-Met를 각각 0.05 중량%, 0.11 중량%의 양으로 첨가

기초 식이의 조성

%
Corn	60.7
SBM	3.0
Plasma protein	11.0
Whey dried	20.0
Grease	1.0
Sand
Corn starch	0.5
others	3.8

결과

ADG (kg/d)	Basal diet	Added DL-Met, %		Added L-Met, %
ADG (kg/d)	Basal diet	0.05	0.11	0.05	0.11
0-7 day	100.0	151.6	159.1	171.1	201.9
14-21day	100.0	120.6	126.9	125.3	132.2

*ADG: 평균 하루 증체량(Average daily gain)

상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 새끼 돼지의 하루 증체량을 비교해보면 기초 식이 대비 D,L-Met 처리군은 최고 약 60% 향상되었고, L-Met 처리군은 최고 100% 향상됨을 확인할 수 있었다. 그리고, D,L-Met 처리군 대비 L-Met 처리군을 비교해보면, L-Met 처리군이 D,L-Met 처리군에 비하여 약 5 ~ 40%의 높은 증체율을 가져옴을 확인할 수 있었다.

(3) 육계에서의 L-메티오닌 조성물의 효능

육계에서의 L-메티오닌 조성물의 효능을 확인하기 위하여, L-Met과 D,L-Met을 각각 처리한 후 증체 효율을 비교하였다(Gain:Feed ratio, G:F ratio).

실험 설계

- 태어난지 1일된 육계의 닭(1d of age, ross308)

- 기초 식이(basal diet, BD)에 L-Met 또는 D,L-Met를 각각 0.1 중량%, 0.2 중량%, 0.3 중량%의 양으로 첨가

기초 식이의 조성

%
Yellow corn	59
Soybean meal	34
Others	7

결과

Gain:feed	BD(%)	Added DL-Met, %			Added L-Met, %			DL-Met대비 L-Met 의 증가량(%)
Gain:feed	BD(%)	0.1	0.2	0.3	0.1	0.2	0.3	0.1	0.2	0.3
0 ~7 day	100.0	102.0	101.2	102.0	102.8	106.1	106.1	100.8	104.8	104.0
7~14 day	100.0	111.9	112.7	114.1	113.9	114.8	115.8	101.8	101.9	101.5
14~21 day	100.0	116.1	118.1	118.6	116.7	122.1	124.7	100.6	103.4	105.2
0~21day	100.0	112.8	113.9	114.7	113.9	117.4	119.2	101.0	103.1	103.9

상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 기초 식이에 L-Met 또는 DL-Met 첨가한 모든 군에서 증체 효율이 좋아짐을 확인할 수 있었다. L-Met 처리군과 D,L-Met 처리군을 비교하여 보면, L-Met 처리군이 테스트 초반부터 종료시점까지 0.5% ~ 5%까지의 높은 증체 효율을 보이는 것을 확인하였고, 테스트 종료 시점에서도 L-Met 처리군에서 약 1 ~ 4%의 높은 증체 효율을 보이고 있음을 확인하였다.

Claims

60 내지 99.90 중량%의 L-메티오닌, 0.05 내지 5 중량%의 L-페닐알라닌 및 0.01 내지 3 중량%의 L-티로신을 포함하는, 사료첨가제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 추가로 상기 L-메티오닌, L-페닐알라닌 및 L-티로신을 제외한 0.01 내지 13 중량%의 기타 아미노산을 포함하는 조성물.
제2항에 있어서,
상기 기타 아미노산은 글루타메이트를 포함하며, 당해 글루타메이트의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 11 중량% 범위인 조성물.
제2항에 있어서,
상기 기타 아미노산은 호모세린을 포함하며, 당해 호모세린의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량% 범위인 조성물.
제2항에 있어서,
상기 기타아미노산은 O-아세틸 호모세린을 포함하며, 당해 O-아세틸 호모세린의 함량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 1 중량% 범위인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 추가로 0.01 내지 20 중량%의 이온을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 추가로 0 초과 2 미만의 중량%의 아세테이트를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 동물 사료 조성물.