JP2007514430A - メチオニンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
メチオニンは、食料工業、飼料工業、化粧品工業及び製薬工業を含めた種々の分野で使用されている。
従って本発明の課題は、特に、メチオニンを部分的に結晶形で含有する発酵ブロスに使用できる、発酵により製造されたメチオニンの改善された単離方法を提供することである。別の課題は、実際に廃棄物流が生じず、これにより特に経済的に実施できる、メチオニンを含有する発酵ブロスの後処理方法を提供することである。
A)一般的な定義
「メチオニン」は、本発明の意味においては、原則的に、L−メチオニン又はD−メチオニン、これらの異性体の混合物、例えばラセミ体を含むが、L−メチオニンが好ましい。
本発明の第一の対象は、発酵により製造されたメチオニンを単離する方法において、
a)メチオニン生産微生物の発酵の際に生じ、メチオニンを含有し、特にメチオニンを部分的に未溶解の形で含有する液体分画を、液相中のメチオニンの溶解度が増大するのに十分な温度、好ましくはメチオニンが実質的に完全に溶解するのに十分な温度に加熱し、
b)この液体分画から、メチオニンが富化された液相を得て、そして、
c)場合により富化された液相を濃縮した後に、メチオニンを結晶化する方法に関する。
d)結晶化されたメチオニンを分離し、
e)分離された固体の、好ましくは結晶性メチオニンを、場合により洗浄し、そして
f)それを場合により乾燥させる。
g1)場合により洗浄し、その際、洗浄に使用される液体を場合により加熱し、そして
g3)それを乾燥させる。
g2)段階g1)において生じた洗液と、段階b)のメチオニンが富化された液相とを合する。
d1)メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか;又は
d2)メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階g3)による乾燥の前に添加する。
e1)メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか;又は
d2)メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階g3)による乾燥の前に添加する。
本発明にかかる方法には、コリネフォルム細菌を使用することが好ましい。コリネバクテリウム属の細菌が好ましい。コリネバクテリウム属からは、特にL−アミノ酸生産能が当業者に知られているコリネバクテリウム・グルタミクム種を挙げることができる。
コリネバクテリウム属から:
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム(Colynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム(Colynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870、コリネバクテリウム・テルモアミノゲネス(Colynebacterium thermoaminogenes) FERM BP−1539、コリネバクテリウム・メラッセコラ(Colynebacterium melassecola) ATCC17965;コリネバクテリウム・グルタミクム KFCC10065;又はコリネバクテリウム・グルタミクム ATCC21608、
又は、ブレビバクテリウム属から:
ブレビバクテリウム・フラブム(Brevibacterium flavum) ATCC14067;ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869及びブレビバクテリウム・ジバリカツム(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020を挙げることができる;
(KFCC=韓国連合細胞保存機関(Korean Federation of Culture Collection);ATCC=米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection);FERM BP=生命工学工業技術研究所保存機関、科学技術振興機構、日本(Sammlung des National institute of bioscience and Human-Technology, agency of Industrial Science and Technology, Japan))。
− アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC(EP1108790号A2;DNA−配列番号281)、
− アスパラギン酸セミアルデヒドをコードする遺伝子asd(EP1108790号A2;DNA−配列番号282)、
− グリセリンアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子gap(エイクマン著(1992年)ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、174号:6076〜6086頁(Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174:6076~6086))、
− 3−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子pgk(エイクマン著(1992年)ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、174号:6076〜6086頁)、
− ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc(エイクマン著(1992年)ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、174号:6076〜6086頁)、
− トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子tpi(エイクマン著(1992年)ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、174号:6076〜6086頁)、
− ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA(EP1108790号A2;DNA−配列番号725)、
− シスタチオニン−ガンマ−合成酵素をコードする遺伝子metB(EP1108790号A2;DNA−配列番号3491)、
− シスタチオニン−ガンマ−リアーゼをコードする遺伝子metC(EP1108790号A2;DNA−配列番号3061)、
− シスタチオニン−合成酵素をコードする遺伝子metH(EP1108790号A2;DNA−配列番号1663)、
− セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA(EP1108790号A2;DNA−配列番号1110)、
− O−アセチルホモセリン−スルフヒドリアーゼをコードする遺伝子metY(EP1108790号A2;DNA−配列番号726)、
− メチレンテトラヒドロ葉酸−レダクターゼをコードする遺伝子metF(EP1108790号A2;DNA−配列番号2379)、
− ホスホセリン−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC(EP1108790号A2;DNA−配列番号928)、
− ホスホセリンホスファターゼをコードする遺伝子serB(EP1108790号A2;DNA−配列番号334、DNA−配列番号467、DNA−配列番号2767)、
− セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE(EP1108790号A2;DNA−配列番号2818)、
− システイン合成酵素をコードする遺伝子cysK(EP1108790号A2;DNA−配列番号2817)、
− ホモセリン−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom(EP1108790号A2;DNA−配列番号1306)。
− アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子lysC(EP1108790号A2;DNA−配列番号281)、
− ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子pyc(エイクマン著(1992年)ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、174号:6076〜6086頁)、
− ホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子metA(EP1108790号A2;DNA−配列番号725)、
− シスタチオニン−ガンマ−合成酵素をコードする遺伝子metB(EP1108790号A2;DNA−配列番号3491)、
− シスタチオニン−ガンマ−リアーゼをコードする遺伝子metC(EP1108790号A2;DNA−配列番号3061)、
− メチオニン合成酵素をコードする遺伝子metH(EP1108790号A2;DNA−配列番号1663)、
− セリン−ヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子glyA(EP1108790号A2;DNA−配列番号1110)、
− O−アセチルホモセリン−スルフヒドリラーゼをコードする遺伝子metY(EP1108790号A2;DNA−配列番号726)、
− メチレンテトラヒドロ葉酸−レダクターゼをコードする遺伝子metF(EP1108790号A2;DNA−配列番号2379)、
− ホスホセリン−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子serC(EP1108790号A2;DNA−配列番号928)、
− ホスホセリン−ホスファターゼをコードする遺伝子serB(EP1108790号A2;DNA−配列番号334、DNA−配列番号467、DNA−配列番号2767)、
− セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子cysE(EP1108790号A2;DNA−配列番号2818)、
− システイン合成酵素をコードする遺伝子cysK(EP1108790号A2;DNA−配列番号2817)、
− ホモセリン−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子hom(EP1108790号A2;DNA−配列番号1306)。
− S−アデノシルメチオニン合成酵素(E.C.2.5.1.6)をコードする遺伝子metK、
− ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子thrB(EP1108790号A2;DNA−配列番号3453)、
− トレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ilvA(EP1108790号A2;DNA−配列番号2328)、
− トレオニン合成酵素をコードする遺伝子thrC(EP1108790号A2;DNA−配列番号3486)、
− メソ−ジアミノピメリン酸D−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ddh(EP1108790号A2;DNA−配列番号3494)、
− ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子pck(EP1108790号A2;DNA−配列番号3157)、
− グルコース−6−ホスフェート−6−イソメラーゼをコードする遺伝子pgi(EP1108790号A2;DNA−配列番号950)、
− ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子poxB(EP1108790号A2;DNA−配列番号2873)
− ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子dapA(EP1108790号A2;DNA−配列番号3476)、
− ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする遺伝子dapB(EP1108790号A2;DNA−配列番号3477)、
− ジアミノジピコリン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子lysA(EP1108790号A2;DNA−配列番号3451)。
本発明により製造された微生物は、連続的に又は不連続的に、メチオニンの生産のために、回分法(回分培養)か又は半回分法(供給法(zulaufverfahren))若しくは反復半回分法(Repeated fed batch Verfahren)(繰り返し供給法repetitive zulaufverfahren))により、培養できる。公知の培養法に関する概要は、クミエル(Chmiel)の教本(バイオプロセステクニック1 生物的方法技術入門(グスタフ・フィッシャー出版、シュツットガルト、1991年))(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))又はシュトラス(Storhas)の教本(バイオリアクターとその周辺装置(フィエーク出版、ブラウンシュバイク/ビイスバデン、1994年))(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden,1994))に見出すことができる。
本発明により結晶化の後に得られたメチオニンが、依然として所望の純度を有していないのであれば、これらを更に精製してよい。このために、この生成物を溶解した形で、好適な樹脂を有するクロマトグラフィーにかけ、その際、この所望の生成物又は不純物が完全に又は部分的にクロマトグラフィー樹脂上に留まる。このクロマトグラフィー段階は、必要であれば、繰り返してよく、その際、同じ又は別のクロマトグラフィー樹脂を使用する。当業者は、好適なクロマトグラフィー樹脂及びその有効な使用の選択に精通している。精製された生成物は、濾過又は限外濾過によって濃縮し、そして、生成物の安定性が最大である温度で貯蔵してよい。
発酵の完了後に、メチオニンを含有する発酵ブロスを、最終的な乾燥飼料添加剤に直接加工してよい。しかしながら、本発明の好ましい実施形態によれば、最初に、この発酵ブロスからバイオマス分を完全に又は部分的に、好ましくは完全に、例えば遠心分離によって取り出して、そして本発明にかかる飼料添加剤に加工する。生じたバイオマスは、依然として所定のメチオニン分を含有し、該メチオニン分は所望により、中間に提供された洗浄段階によって減少していてよい。
O・クリシェール、W・カスト著 乾燥技術 第1巻「乾燥技術の科学的基礎」、シュプリンガー出版(1978年)(O. Krischer, W. Kast, Trocknungstechnik Erster Band, "Die wissenschaftlichen Grundlagen der Trocknungstechnik", Springer-Verlag 1978);クリシュール/クレール著 乾燥技術 第2巻「乾燥剤と乾燥方法」シュプリンガー出版(1959年)(Krischer/Kroell., Trocknungstechnik Zweiter Band, "Trockner und Trocknungsverfahren", Springer-Verlag 1959);K・クレール、W・カスト著 乾燥技術 第3巻「製造における乾燥と乾燥剤」シュプリンガー出版(1989年)(K.Kroell, W. Kast, Trocknungstechnik Dritter Band,"Trocknen und Trochner in der Produktion", Springer-Verlag 1989);K・マスターズ著「噴霧乾燥ハンドブック」ロングマンサイエンティフィック&テクニカル1991年、725頁(K. Masters, "Spray Drying Handbook", Longman Scientific & Technical 1991, 725 Seiten);H・ウールマン、L・メール著「流動層−噴霧造粒」シュプリンガー出版(2000年)(H.Uhlemann, L. Moerl, "Wirbelschicht-Spruehgranulation", Springer-Verlag 2000);凍結乾燥:ゲオルグ−ヴィルハイム エトイエン著、「凍結乾燥」、VCH1997年(Gefriertrocknung: Georg-Wilheim Oetjen, "Gefrietrocknen", VCH1997)並びにEP−A0809940号に記載されている。上述の文献は参照をもって開示されたものとする。
i)飼料添加剤及び飼料組成物:
本発明にかかるメチオニンを含有する飼料添加剤は、流動性の微細な粉末として若しくは造粒された形で存在していることが好ましい。この場合、粒子は、例えば5〜200μm、例えば10〜150μm、20〜100μm又は30〜80μmの大きさの範囲内であってよいが、これらに限定されるものではない。
本発明により製造されたメチオニンは、食品又は飼料中の添加剤又は栄養補助剤及び飼料補助剤、例えば総合ビタミン剤中の添加剤として使用される。このために、本発明により製造された生成物は、所望の量で、かつ自体公知のように、市販の食料及び飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤中に添加してよい。この場合、使用に応じて種々の適切な含有率で含まれていてよい。
上述の本発明にかかる配合物は、場合により付加的に被覆を有していてよい。この場合、以下から選択された少なくとも1種の化合物を有する被覆剤を施す:
− ポリアルキレングリコール、特にポリエチレングリコール、例えば数平均分子量は約400〜約15000、例えば400〜10000である;
− ポリアルキレンオキシドポリマー又はポリアルキレンオキシドコポリマー、例えば数量的な分子量は約4000〜約20000であり、特にポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー;
− 置換ポリスチレン、マレイン酸誘導体及びスチレン−マレイン酸コポリマー;
− ビニルポリマー、特にポリビニルピロリドン、例えば数平均分子量は約7000〜約1000000である;単独又は他の化合物、例えばセルロースエーテル又はデンプンとの組み合わせの何れか;
− ビニルピロリドン/ビニルアセテート−コポリマー、例えば数平均分子量は約30000〜約100000である;
− ポリビニルアルコール、例えば数平均分子量が約10000〜約200000でありポリビニルアルコール、及びポリフタル酸ビニルエステル;
− ヒドロキシプロピルメチルセルロース、例えば数平均分子量は約6000〜約80000である;
− アルキル(メタ)アクリレートポリマー及びアルキル(メタ)アクリレートコポリマー、例えば数平均分子量は約100000〜約1000000であり、特にエチルアクリレート/メチルメタクリレート−コポリマー及びメタクリレート/エチルアクリレート−コポリマー;
− ポリビニルアセテート、例えば数平均分子量は約250000〜約700000であり、場合により、ポリビニルピロリドンで安定化されている;
− ポリアルキレン、特にポリエチレン;
− 芳香族ポリマー、例えばリグニン;
− ポリアクリル酸;
− ポリアクリルアミド;
− ポリシアノアクリレート;
− フェノキシ酢酸−ホルムアルデヒド−樹脂;
− セルロース誘導体、例えばエチルセルロース、エチルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート;
− 動物性脂肪、植物性脂肪又は合成脂肪及び改質脂肪、例えばポリグリコール、脂肪アルコール、エトキシ化脂肪アルコール、高級脂肪酸;高級脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリド、例えばグリセリンモノステアラート、アルキルアリールエトキシレート及びヤシ油モノエタノールアミド;
動物性及び植物性ろう又は化学的に改質された動物性及び植物性ろう、例えば蜜ろう、カンデリラろう、カルナウバろう、モンタンエステルろう及び米胚芽ろう、鯨ろう、ラノリン、ホホバろう、サソールろう(sasolwachs);
− 動物性及び植物性タンパク質、例えばゼラチン、ゼラチン誘導体、ゼラチン置換物、カゼイン、ホエイ、ケラチン、大豆タンパク質;ゼイン及び小麦タンパク質;
− モノ−及びジサッカリド、オリゴサッカリド、ポリサッカリド、例えばヒアルロン酸、プルラン、エルシナン、デンプン、化工デンプン、並びにペクチン、アルギン酸塩、キトサン、ガラギナン;
− 植物性油、例えばヒマワリ油、アザミ油、綿実油、大豆油、コーン胚芽油、オリーブ油、ナタネ油、アマニ油、オイルツリー(oelbaum)油、ヤシ油、アブラヤシ油;合成又は半合成油、例えば中鎖トリグリセリド又は鉱物油;動物性油、例えばニシン油、イワシ油、及び鯨油;
− 硬化(水素化又は部分水素化された)油/脂肪、例えば上述のうちの、特に水素化パーム油、水素化綿実油、水素化大豆油;
− 塗料被覆、例えばテルペン、特にセラック、トルーバルサム、ペルーバルサム、サンダラック及びシリコーン樹脂;
− 脂肪酸、飽和C6〜C24カルボン酸及びモノ不飽和又はポリ不飽和のC6〜C24カルボン酸の両方;
− ケイ酸;
及びこれらの混合物。
a)発酵によるメチオニンの製造
メチオニン精製のための代表的な発酵ブロスの製造のために、実験室発酵を実施した。コリネバクテリウム・グルタミクム株ATCC13032(米国培養細胞系統保存機関 マナッサス、アメリカ合衆国)を、200mlのBHI培地(Difco/Becton Dickinson社、フランクリンレイク(Frankin Lakes)、アメリカ合衆国)の予備培養物中で培養した。次いで、Techfors型発酵槽中において、この予備培養物を培養培地(約14l)中に移種した。
2g/l KH2PO4
2g/l K2HPO4
10g/l 硫酸アンモニウム
100g/l グルコース
5g/l 酵母エキス
20mg/l カナマイシン
1g/l KS911 ASM 消泡剤
pH7.0
であり、脱塩水を所望の最終容量になるまで補充した。
ビオチン 1mg/l
チアミン 1mg/l
CaCl2 5mg/l。
後処理の手順を、図1において図式を用いて概要を示す。
入口温度:200℃
出口温度:80〜82℃。
同じ出発材料を出発点として、この方法を改変し、バイオマスを遠心分離によって分離し、次いで分離されたバイオマスを5lの水で洗浄する(図2)。遠心分離後に、生じた上清を最初のバイオマス分離物に添加する。全ての上清を、100℃かつ大気圧で、メチオニン含有率が16%になるまで濃縮する。この濃縮物を5K/hで5℃に冷却することによって、メチオニンを結晶化する。この結晶を、ヌッチェフィルター上で分離し、事前に平衡化された4.5リットルの水(5℃)で洗浄し、次いで窒素を用いて40℃で乾燥させる。この手順によって、乾燥メチオニンの量が約1.5kgまで高まる。更に、単離された結晶体の純度は、約90%である。
同じ出発材料を出発点として、実施例2からの方法を更に改変し、結晶性メチオニンの分離の際に生ずる母液及び洗浄水を、次のバッチ中において、メチオニンを含有する発酵ブロスに再び添加する(図3)。
同じ出発物質を出発点として、実施例2からの方法を更に改変し、結晶性メチオニンの分離の際に生ずる母液及び洗浄水をバイオマス流に、噴霧乾燥の前に添加する(図4)。
メチオニン結晶化の後の母液及び洗浄水の一部を、バイオマス分離の前に発酵ブロスに添加し、そして他方の部分流を噴霧乾燥の前にバイオマス流に添加する変法(実施例3及び4の組み合わせ)も考えられる。
Claims (19)
- 発酵により製造されたメチオニンを単離する方法において、
a)メチオニン生産微生物の発酵の際に生ずるメチオニンを含有する液体分画を、液相中のメチオニンの溶解度が増大するのに十分な温度に加熱し、
b)この液体分画から、メチオニンが富化された液相を得て、そして
c)場合により富化された液相を濃縮した後に、メチオニンを結晶化する方法。 - 段階a)において、メチオニンを実質的に完全に溶解させるのに十分な条件を選択する、請求項1に記載の方法。
- 約60℃〜約120℃、好ましくは約70℃〜約100℃の範囲内の温度に加熱する、請求項1又は2に記載の方法。
- 段階a)において使用される液体分画が、バイオマスを含有する発酵ブロスである、請求項1から3までの何れか1項に記載の方法。
- 段階b)のメチオニンが富化された液相を、それが富化された発酵ブロスからバイオマスを分離することによって得る、請求項4に記載の方法。
- d)結晶化されたメチオニンを分離し、
e)分離された固体メチオニンを場合により洗浄し、そして
f)それを場合により乾燥させる、請求項1から5までの何れか1項に記載の方法。 - 段階b)において分離されたバイオマスを、
g1)場合により洗浄し、その際、洗浄に使用される液体を場合により加熱し、そして
g3)それを乾燥させる、請求項5又は6に記載の方法。 - g2)段階g1)において生じた洗液と、段階b)のメチオニンが富化された液相とを合する、請求項7に記載の方法。
- 段階d)において生じた母液を、
d1)メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか;又は
d2)メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階g3)による乾燥の前に添加する、請求項6から8までの何れか1項に記載の方法。 - 段階e)において生じた洗液を、
e1)メチオニン生産微生物を有する別の発酵バッチからのメチオニンを含有する液体分画と合するか;又は
e2)メチオニン生産微生物を有する同じ又は別の発酵バッチから分離されたバイオマスに、段階g3)による乾燥の前に添加する、請求項6から9までの何れか1項に記載の方法。 - 段階g3)による乾燥が噴霧乾燥段階を含む、請求項7から10までの何れか1項に記載の方法。
- メチオニンを発酵により製造する方法において、天然微生物又は組換え微生物を自体公知のように発酵させ、そして形成されたメチオニンを、請求項1から11までの何れか1項に記載の方法によって単離する方法。
- メチオニン生産微生物が、コリネバクテリウム属の天然細菌又は組換え細菌から選択される、請求項1から12までの何れか1項に記載の方法。
- L−メチオニンを単離する、請求項1から13までの何れか1項に記載の方法。
- 飼料又は飼料補助剤の製造のための、請求項7から11までの何れか1項に記載の方法によって得られた段階g3)の乾燥物の使用。
- 食料又は飼料若しくは食料補助剤又は飼料補助剤の製造のための、請求項1から14までの何れか1項に記載の方法によって単離されたメチオニンの使用。
- 請求項5から11までの何れか1項に記載の方法によって得られた、メチオニンを含有するバイオマス。
- 請求項17に記載のバイオマス及び/又は請求項1から4までの何れか1項に記載の方法によって得られたメチオニンを含有する飼料添加剤。
- 請求項18に記載の飼料添加剤を含有する飼料組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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