CN109020854B - 一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法 - Google Patents

一种从发酵液中提取l-蛋氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从发酵液中提取L‑蛋氨酸的方法，将含L‑蛋氨酸的发酵液调节pH至1.5‑4后，过滤，取滤液采用强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，将含L‑蛋氨酸的洗脱液用活性炭脱色后减压浓缩，取浓缩液加入异丙醇搅拌结晶，取晶体用超纯水洗涤至无醇，干燥，得到L‑蛋氨酸。本发明首次采用离子交换树脂从发酵液中分离蛋氨酸，大大降低了分离的成本，收率和纯度也都能达到工业生产的水平；本发明方法操作简单、步骤短，所用试剂成本低、易得，具有较好的工业化前景。整个过程获得产品的收率高，最后得到的产品质量好，纯度高达99％，质量收率高达85％。

Description

一种从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生化工程领域，特别是一种从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法。
背景技术
蛋氨酸是构成人体的必需氨基酸之一，参与蛋白质合成。因其不能在体内自身生成，所以必须由外部获得。
目前工业生产蛋氨酸的方法主要是化学法。化学法工艺是以丙烯醛、甲硫醇为原料生产甲硫基丙醛(TPMA)，TPMA再与***或氰氢酸合成海因 (Hydantoin)，海因经碱水解，再用酸(或CO2)酸化，生产固体蛋氨酸，但是化学法通常只能生产DL-蛋氨酸。专利CN104755625A报道了一种化学法生产L- 蛋氨酸的方法，O-磷酸-L-高丝氨酸和甲硫醇通过酶转化为L-蛋氨酸和H3PO4，但是这种方法成本较高，不适合大规模工业生产。专利CN1894417A提供了一种从发酵液中分离L-蛋氨酸的方法，该工艺采用先加热提高甲硫氨酸的溶解度，然后进行蒸发冷却结晶的方法生产蛋氨酸。该方法里面需要将发酵液加热到很高的温度，大大增加了能耗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从L-蛋氨酸发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，操作简单，成本也较低，能对发酵液中L-蛋氨酸的分离达到很好的效果。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一种从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，所述方法为：
(1)发酵液的预处理：对发酵法产生的含有L-蛋氨酸发酵液调pH至1.5-4 (优选1.5-3)后，使一些盐离子沉淀下来，再使用陶瓷膜过滤，得到L-蛋氨酸滤液以及菌体蛋白，取滤液，即为预处理液；
(2)离子交换法：将步骤(1)获得预处理液采用强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，依次用去离子水和0.5-5mol/L氨水洗脱，根据茚三酮显色反应收集含 L-蛋氨酸的洗脱液，不显紫色时停止收集；
(3)脱色：将步骤(2)含L-蛋氨酸的洗脱液用活性炭在35℃-80℃(优选 40-65℃)水浴摇床里进行脱色，过滤，取滤液，即为含L-蛋氨酸的脱色液；
(4)结晶：将步骤(3)中的含L-蛋氨酸的脱色液减压浓缩至原体积的5-10％，取浓缩液加入异丙醇，在0℃-20℃(优选0℃)条件下搅拌结晶，取晶体用去离子水洗涤至无醇，干燥(优选0℃真空干燥或喷雾干燥)，得到L-蛋氨酸。
进一步，步骤(1)陶瓷膜孔径40-70nm，优选50nm。
进一步，步骤(2)强酸型阳离子交换树脂为氢型，优选为下列型号之一： 001x7、D296、D072、D061、D301或D001cc，更优选D061。
进一步，步骤(2)所述柱层析所用离子交换柱高径比为5-20:1，优选15:1，上样流速为0.5-2.0BV/h，优选1.0-2.0BV/h，最优选1BV/h。
进一步，步骤(2)所述洗脱方法为：先用超纯水冲洗3.0-4.0BV(优选3.0 BV)，再用0.5-5.0mol/L(优选2.0-3.0mol/L)氨水以0.5-2.0BV/h(优选1.0-2.0 BV/h，最优选1BV/h)流速洗脱，收集含L-蛋氨酸的洗脱液。
进一步，步骤(3)活性炭的用量以洗脱液体积计为1.0g/L-10.0g/L，优选 6.0-10.0g/L。
进一步，步骤(4)所述减压浓缩条件：温度40-80℃、100rpm，更优选50-65℃。
进一步，步骤(4)所述异丙醇的体积用量以浓缩液体积计为2％-10％，优选10％。
进一步，所述L-蛋氨酸发酵液中含5.0-30.0g/L(优选10-20g/L)的L-蛋氨酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明的优点是首次采用离子交换树脂进行分离蛋氨酸，大大降低了分离的成本，收率和纯度也都能达到工业生产的水平。
(2)本发明方法操作简单、步骤短，所用试剂成本低、易得，具有较好的工业化前景。
(3)整个过程获得产品的收率高，最后得到的产品质量好，纯度高达99％，质量收率高达85％。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。
本发明所述去离子水是用去离子纯水机除去水中的离子态杂质而得到的近于纯净的水。2％茚三酮溶液配制方法为：将2.0g茚三酮与0.08g氯化亚锡溶于 100mL蒸馏水中，然后搅拌过滤，取滤液避光保存。本发明所述收率均为质量百分收率。
实施例1
1、蛋氨酸发酵液
步骤1：将大肠杆菌E.coliW3110中metJ、metI基因敲除后导入pTrc99A/metA*/yjeH质粒构建成E.coliW3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH (Jiangfeng Huang etal.2016.Metabolic engineering of Escherichia coli for microbial production ofL-methionine.Biotechnology and Bioengineering. 114:843-851)。将E.coliW3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH菌株先接种到 100mL LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm摇床上过夜培养。
步骤2：再将步骤1中的100mL培养液接种到有3.0L MS培养基的发酵罐中培养，在30℃、150rpm培养发酵到OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM 的IPTG，继续培养至48h。得到3.0L发酵液，液相检测L-蛋氨酸含量16.4g/L。
LB培养基：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母提取物，10.0g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS培养基：葡萄糖20.0g/L、(NH4)2SO4 16.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、酵母提取物2.0g/L、CaCO3 10.0g/L(单独灭菌)，1.0mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；1.0mL/L微量元素溶液组成：0.15g/L Na2MoO4·2H2O、 2.5g/L Na3BO3、0.7g/L CoCl2·6H2O、0.25g/L CuSO4·5H2O、1.6g/L MnCl2·4H2O、 0.3g/L ZnSO4·7H2O，溶剂为去离子水。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去一些菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(等体积1.0mol/L HCl 浸泡2h后用蒸馏水洗到中性，再用等体积的1.0mol/LNaOH浸泡2h后用蒸馏水洗到中性，最后用等体积的1.0mol/LHCl浸泡2h，然后用蒸馏水洗到中性待用。) 的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴 2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液300mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液300mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液300mL。
步骤4：将300mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到成品L-蛋氨酸1.39g，纯度99.3％，收率85％。
实施例2
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝1.5，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液310mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液310mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液310mL。
步骤4：将310mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入2.8mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.389g，纯度98.9％，收率83.8％。
实施例3
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 001x7阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每 10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液280mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液280mL中加入2.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液280mL。
步骤4：将280mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到25mL浓缩液。
步骤5：向25mL浓缩液中加入2.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.21g，纯度94％，收率74％。
实施例4
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为0.5BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每 10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液310mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液310mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液310mL。
步骤4：将310mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.39g，纯度99％，收率85％。
实施例5
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为2.5BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上中的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每 10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液210mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液210mL中加入2.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液210mL。
步骤4：将210mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到20mL浓缩液。
步骤5：向20mL浓缩液中加入2.0mL异丙醇，在0℃水浴条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后 0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.004g，纯度98.4％，收率61％。
实施例6
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用0.5mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL 取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液390mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液390mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液390mL。
步骤4：将390mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.37g，纯度99.3％，收率83.6％。
实施例7
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型D061 阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用5.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL 取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液300mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液300mL中加入3.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液300mL。
步骤4：将300mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤5：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.38g，纯度98.6％，收率84.3％。
实施例8
1，蛋氨酸发酵液，同实施例1
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以0.5BV/h的流速进行洗脱，每10mL 取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液240mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液240mL中加入2.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液。
步骤4：将240mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到20mL浓缩液。
步骤5：向20mL浓缩液中加入2.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到成品L-蛋氨酸1.39g，纯度98.9％，收率85％。
对比例1
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：取实施例1中L-蛋氨酸发酵液3.0L，调pH＝1.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液3.0L。
步骤2：将100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去发酵液中的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液 150mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液150mL中加入5.0g活性炭(80目)，在60℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液150mL。
步骤4：将150mL脱色液加入旋蒸仪中以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到15mL浓缩液。
步骤5：向15mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，得到L-蛋氨酸成品0.18g，纯度98.5％，收率为11％。
对比例2
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、蛋氨酸的提取
步骤1：取实施例1中L-蛋氨酸发酵液3.0L，调pH＝5.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液3.0L。
步骤2：将100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用3.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每 10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液200mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液200mL中加入2.0g活性炭(80目)，在80℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液。
步骤4：将200mL脱色液加入旋蒸仪中以80℃，100rpm的转速进行浓缩，得到20mL浓缩液。
步骤5：向浓缩液20mL中加入2.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用30mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，得到L-蛋氨酸成品0.91g，纯度99.5％，收率达到55％。
对比例3
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：取实施例1中L-蛋氨酸发酵液3.0L，调pH＝9.0，再使用陶瓷膜(孔径50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液3.0L。
步骤2：将100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每 10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液100mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液100mL中加入2.0g活性炭(80目)，在60℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液100mL。
步骤4：将100mL脱色液加入旋蒸仪中以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤5：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，得到L-蛋氨酸成品 0.098g，纯度98.5％，收率为6％。
对比例4
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D101阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每 10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液120mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液100mL中加入5.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液100mL。
步骤4：将120mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤5：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品0.118g，纯度83％，收率7.2％。
对比例5
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型201x7 阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每10mL 取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液120mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液120mL中加入2.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液120mL。
步骤4：将120mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤5：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品0.092g，纯度87％，收率5.6％。
对比例6
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为3.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每 10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液160mL；
步骤3：向L-蛋氨酸洗脱液160mL中加入8.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液160mL。
步骤4：将160mL脱色液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤5：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品0.52g，纯度99％，收率32％。
对比例7
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入装有已经预处理好(同实施例1)的氢型 D061阳离子树脂离子交换柱(树脂装柱体积为45mL，高45cm，离子交换柱高径比为15:1)。上样流速为1.0BV/h，上样后用去离子水冲洗3.0BV，除去未吸附在树脂上的一些杂质，再用2.0mol/L氨水以1.0BV/h的流速进行洗脱，每 10mL取样使用茚三酮进行显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，烘干，若不显紫色则停止收集)，收集洗脱液，获得L-蛋氨酸的洗脱液300mL；
步骤3：将300mL洗脱液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到30mL浓缩液。
步骤4：向30mL浓缩液中加入3.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.41g，纯度87％，收率85.9％。
对比例8
1、蛋氨酸发酵液，同实施例1。
2、L-蛋氨酸的提取
步骤1：将L-蛋氨酸发酵液3.0L，调发酵液pH＝3.0，再使用陶瓷膜(孔径 50nm)过滤，除去菌体蛋白，得到预处理液2.9L。
步骤2：取100mL预处理液加入10.0g活性炭(80目)，在40℃水浴下搅拌1h，然后再过滤除去活性炭，得到脱色液100mL。
步骤3：将100mL洗脱液加入旋蒸仪中，以70℃，100rpm的转速进行浓缩，得到10mL浓缩液。
步骤4：向10mL浓缩液中加入1.0mL异丙醇，在0℃条件下搅拌，使蛋氨酸结晶出来，过滤分离出蛋氨酸晶体。再用50mL去离子水洗涤晶体，然后0℃真空干燥，得到L-蛋氨酸，使用高效液相色谱进行检测，结果得到L-蛋氨酸成品1.54g，纯度68.3％，收率93.9％。

Claims (8)

1.一种从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于所述方法为：
(1)发酵液的预处理：将E.coliW3110ΔmetJΔmetI/pTrc99A/metA*/yjeH菌株先接种到LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm摇床上过夜培养；再将培养液按0.1L/3L接种到有MS培养基的发酵罐中培养，在30℃、150rpm培养发酵到OD600＝0.8-1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至48h，得到含L-蛋氨酸的发酵液；将含L-蛋氨酸的发酵液调节pH至1.5-3后，陶瓷膜过滤，取滤液，即为预处理液；
(2)离子交换法：将步骤(1)获得预处理滤液采用强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，依次用超纯水和0.5-5.0mol/L氨水洗脱，收集含L-蛋氨酸的流出液；所述强酸型阳离子交换树脂型号为D061；柱层析所用离子交换柱高径比为2-30:1，上样流速为0.5-2.0BV/h；
(3)脱色：将步骤(2)含L-蛋氨酸的洗脱液用活性炭在40℃-65℃水浴条件下脱色，过滤，取滤液，即为含L-蛋氨酸的脱色液；
(4)结晶：将步骤(3)含L-蛋氨酸的脱色液减压浓缩至原体积的5-10％，取浓缩液加入异丙醇，在0℃下搅拌结晶，取晶体用去离子水洗涤至无醇，干燥，得到L-蛋氨酸。
2.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(1)所述发酵液中含5-30g/L的L-蛋氨酸。
3.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(1)陶瓷膜孔径为30-90nm。
4.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(2)所述洗脱的方法为：先用超纯水冲洗3-4BV，再用0.5-5.0mol/L氨水以0.5-2.0BV/h流速洗脱，收集含L-蛋氨酸的流出液。
5.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(3)活性炭的用量以洗脱液体积计为1.0g/L-10.0g/L。
6.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(4)中减压浓缩条件为40-80℃、100rpm。
7.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(4)所述异丙醇的体积用量以浓缩液体积计为2％-10％。
8.如权利要求1所述从发酵液中提取L-蛋氨酸的方法，其特征在于步骤(4)所述干燥方法为真空干燥或喷雾干燥。
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