TW424110B - Method for production of an immunostimulatory <beta>-glucan-mannan preparation, and products thereof - Google Patents

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4 4 2 4 1^0 A7 ~1 —______________ B7 五、發明説明（1 ) 本發明係關於具有生物活性的点·聚葡糖-甘露聚糖製劑 ’及其分離万法β特定而言，本發明係關於包含^(1_3)聚 葡糖的心聚葡糖·甘露聚糖，其由包括但不限於酵母的微 生物所產製，以及產製点_聚葡糠·甘露聚糖製劑之方法， 該方法避免使用到濃縮的鹼或酸。 發明背景 达多醣類廣泛地分布在自然界中，而且它們在維持細菌' 眞菌和植物細胞之結構完整上的角色是特別重要的聚葡糖 是D-葡萄糖的聚合物，而D-葡萄糖可以以各種方式連結 在一起。例如，以】·3、丨_4、^6和12連結的聚葡糖都 是已知的·•键結的變化可能意味著聚葡糖通常是高度分支 的化合物》因爲它們的化學特性，已經發現聚葡糖在化學 、食品和藥學工業上的各種用途。例如，它們可以用來作 爲増黏劑、乳化劑、纖維、軟片、塗覆物質、親和層析法 和凝膠電泳的支撑物，在細胞培養介質中作爲濾墊，以及 在水泥中》它們也被廣泛地使用在食品增稠劑，並作爲膳 食纖維的來源，並在藥學產物中作爲載劑和塗覆劑。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 已經對聚葡糖，特別是(1_3)·聚葡糖進行了非常廣泛 的研究，除了前文所述的之外，已經顯示出它們具有各種 藥學活性，包括但不限於抗膽固醇血的活性、低血糖之活 性、加速重金屬的***’並刺激免疫系統。心聚葡糖的 免疫刺激之活性，導出它們可用來當作抗_癌症劑或用來 治療HIV之感染、作爲刺激傷口癒合之製劑，或是作爲與 抗生素混合使用或單獨使用之抗-感染劑的聯想。 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 Α7 ________B7 五、發明説明（2 ) 孩心聚葡糖也可以在植物中誘發對疾病的抵抗反應，諸 如植物抗毒素的產生和枯萎。這亦導出可在植物中利用它 們作爲抗-感染劑和生長促進劑的聯想。 因爲《'集的豕禽、動物 '魚類或甲殼類動物產品所引起 的問題，亦已經提出使用聚葡糖作爲這些飼料的添加 物，來降低感染的發生率，而因此促進生長並減少抗生素 的需求。 々0-3)-聚葡糖是酵母細胞重要的細胞壁成份。酒酵母 菌（Sa-ccharomyces cerevisiae)的細胞壁主要是由点連結的 聚葡糖構成，其主要是0 (1-3)-連結之葡萄糖單位的主鏈 ，具有經々（1 -6)連結之分子間和分子内分支的次要成份。 因爲酵母在食品和釀造業上，以及在工業等級_醇之產製 上的廣泛用途，使用過的酵母細胞是主要的工業副產物。 酵母-衍生的產物本身具有重要的商業價値，例如在諸如 酵母萃取物之類的產物中、調味劑、香味增效劑，如鳥嘌 哈核:y：單磷酸鹽和肌苷單磷酸鹽，以及在酵素 '精細化學 藥品和生物化學與藥學工業所使用之產物的製造中，如海 藥糖、胸腺核善、核：y：和核货酸等等β由釀造業中剩下的 酵母，是/5 -聚葡糖的主要來源。 此外，其他種類的酵母也可以用來當作心聚葡糖的來源 ，包括但不限於酒酵母菌以外的其他酵母菌品系、脆壁克 魯維酵母（Kluyveromyces fragilis)，以及念珠菌屬（Candida) ’如產阮假絲酵母（Candida utilis)。所有的這些酵母品系 均可以利用培養’在食品等及的營養物中，藉著分批發酵 一—_ ·5- 本^^尺度適用中賴家^準（CNS ) Α4ίϋ( 2ΐ0χ 297^Ά ' ------ ^ _---「‘裝— (請先Μ讀背面之注ft,ΦΓ填寫本頁) 訂 j 經濟部中央梯準局員工消費合作社印裝 424110- ' A7 ____B7_ 五、發明説明（3 ) 法或連續發酵法來產製之。在此項技藝中已經報告了作爲 聚葡糖來源的許多其他種類之微生物，包括細菌、眞 菌和單細胞莲類。 已經廣泛地研究了從酵母和其他生物中純化々_聚葡糖的 方法，並已經知道各種方法。這些方法大部分依賴卢（卜 3)-聚葡糖在鹼中或是在有機溶劑中的不溶性β主要的已 知方法爲： (a) 利用濃縮氫氧化鈉的高溫萃取作用，隨後是利用酸 的鬲溫萃取作用，並與乙醇一起沉澱（參見例如Manne' D.J.等人，Biochem. J.坦，19-3〔（1973)，Jamas，s 等人，美 國專利第4810646號，美國專利第5〇287〇3號，美國專利第 5250436號’以及由 Philips Petroleum Company提出的澳大 利亞專利第62S?52號卜這些草案大部份都需要酵母細胞 的預先均質化作用，且許多需要多次重複每個萃取步驟。 (b) 以濃縮的氩氧化鈉萃取，隨後是高溫的酸萃取和酵 素處理，以便修正或純化聚葡糖（參見例如由Masler，L等 人提出；捷克專利第890038號，其報告了藉著鹼-酸萃取 作用，隨後以具有澱粉酶活性的酵素處理，來純化Π 聚葡糖）。 (c) 利用濃縮的酚：水（1:1)，萃取酵母細胞壁之製品， 導致酵母的自溶或酵素降解作用（參見例如由£ 等人提出之美國專利第4138479號）a ⑷利用錢溶劑的萃取作用，單獨使用或在㈣存在 下進行’如異丙醇、乙醇、丙酮或甲醇等（參見例如曰本 適用+國國i標準（規格（210X29?公釐）』~~ - --------_---^裝-- (讀先閱讀背面之注意事{+1填寫本頁)

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U 經濟部中央搮隼局員工消費合作社印裝 Α7 Β7 五、發明説明（4 ) 專利第7051081號、第6340701號、第5295003號和第 30〇22〇2號；歐洲專利請案第515216號）。 已知酸處理減少了在聚葡糖物質中卢（id)-鍵結的數目 ，而其結果爲增加了黏性。 酵母的細胞壁主要包括：- (i) 絲狀的’不溶於驗的(1 -3)-連結之聚葡糖，帶有 卢（1-6)-連結之聚葡糖的側支。 (ii) 可溶於鹼的7? (1-3)-連結之聚葡糖，帶有卢（1-6)-連結之聚葡糖的侧支。 (iii) 無定形的、可溶於酸的&gt; (1-6)-聚葡糖，帶有間斷 的(1-3)-鍵結。 (iv) 無定形、可溶於鹼，連結到蛋白質上的甘露聚糖 〇 絲狀的聚葡糖成份，係位在鄰近酵母原生質膜之處，並 被一層無定形、主要由甘露糖蛋白質構成的物質從外侧覆 蓋（Kopecka M.等人，J，Cell. Biol.，拉 68-76 (1974))。已知 從酒酵母菌之細胞壁中分離出的微粒物質，具有作爲非特 異性免疫刺激劑的能力》酵母細胞壁微粒的生物活性大部 份歸因於冷（1-3)-連結之聚葡搪的存在，但是其他兩種形 式的聚葡糖及甘露聚糖也具有一些刺激免疫系統的能力。 報告指出甘露聚糖藉著免疫系統的細胞，來調節微粒物質 ，如不可溶之々（1-3)-聚葡糖的吸附及呑噬作用（Giaimis, J, 等人，Journal Of Leukocyte Biology h 564-571 (1993); Sun-Sang，J.等人，Journal Of Cell Biology 96 160-166 (1983))。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ί〇Χ297公釐） 請先閱讀背面之注意事c-h填寫本頁) •裝. 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 42411 Ο Α7 |_______ Β7 五、發明説明（5 ) 分離聚葡糖的現存方法，通常是利用多重步驟的鹼_ 酸萃取法（Manners, D.J.等人，j· 〇en. Micro.迎 411-417 (1974))。檢萃取步驟移除大部份的無定形甘露糖蛋白質和 聚葡糖物質’而後績的酸萃取步驟則從絲狀的主要点（卜 3)·連結之聚葡糖中，移除肝糖和大部份的0 —側分支 。最後的溶劑萃取步驟有時用來移除脂質。 雖然有些f請案已經提供了聚葡糖的零售價格，利用現 存已經公告或申請專利的方法來產製聚葡糖的成本，在經 濟上並不是可實行。這些方法有下列問題：_ (i) 他們企圖僅產製絲狀的'不溶於鹼之形式的聚葡 糖。將細胞壁中存在的其他形式之聚葡糖和甘露聚醣當作 該過程之副產物而將其移除。這些表示额外含量的聚葡糖 ’其可能明顯地増加聚葡糖產量，且它們可能在功能上具 有重要性。 (ii) 現存的方法需要大資本的投資。 (iii) 現存的方法是兔險的’因爲需要在高溫下以高濃 度腐轴劑和酸來處理。 (iv) 該方法得到含有不溶於鹼之聚葡糖的溶液，以傳 統方法爲基礎來分離它是困難的，因爲其結果爲不良的回 收〇 (v) 當與許多申請書中之產物的價値相比較時，產製 的成本高。 酵母細胞壁的電子顯微鏡研究（K〇pecka M等人，j Cell Biol.，竺68·76 1974)顯示，當藉著酵素處理而移除外側無 本紙張尺巧用巾國围家標準（CNS) A4^ (训心7公瘦j—-—~ - (請先閱請背面之注意事π ,ρ填寫本頁) •裝· 訂 ---—— B7 五、發明説明（6 ) 定形的甘露糖蛋白質層時，便露出細胞壁的絲狀成份。 在此項技藝中’明顯需要一種迅速且價廉的点-聚葡糖萃 取方法’它不必使用高濃度的鹼或酸，也不必使用高溫， 它更避免了可溶於鹼之聚葡糖和甘露聚糖的喪失，並改善 了聚葡糖和甘露糖的回收，而得到具有生物活性的製品。 現在已經意外地發現，在接近-中性的pIi値和稍微昇高 的溫度下’可利用簡單的自溶過程來分離点_聚葡糖_甘露 聚糖的製品，而獲得極佳產量的產物，它具有高度的免疫 刺激活性’可包括刺激呑噬細胞之活性、過氧化物產製、 對病原和感染増加抵抗力。可在溫和的條件下，以酵素或 其他藥劑處理，來增補自溶作用，若需要可藉著酸處理、 均質化的程度’或藉著改變所使用之酵素的種類，來修改 聚葡糖·甘露聚糖產物的性質。 發明概述 根據第一個觀點，本發明提供一種產製免疫刺激性之心 聚葡糖-甘露聚糖製劑的方法，包括在從自溶之產物中分 離固體物質之前’先在5到6的pH値和35到6CTC的溫度下， 進行微生物細胞的自溶步驟6到48小時。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 在第二個觀點中，本發明提供一種從微生物細胞中產製 免疫刺激性之聚葡糖-甘露聚糖製劑的改良方法，包括使 該微生物經歷引起自溶作用之條件的步驟；其特徵在於該 條件包括在從自溶產物中分離固體物質之前，先在5到6的 pH値和35到60°C的溫度下培養該微生物6到48小時。 在第三個觀點中，本發明提供_種從微生物細胞中產製 經濟部中央橾準局—工消費合作社印製 ^^4 1 1 〇^：4| A7 ___________B7 五、發明説明（7 ) 免疫刺激性之聚葡糖-甘露聚糖製劑的在環境上穩定的方 法’該改良包括使該微生物經歷引起自溶作用之溫和條件 的步驟；其中該條件包括在從自溶產物中分離固體物質之 前，先在5到6的pH値和35到60°C的溫度下培養該微生物6 到48小時。 在第四觀點中’本發明提供一種產製免疫刺激性之聚_葡 糖-甘露聚糖製劑的經濟方法，係利用如同上述之引起微 生細胞自溶作用的條件。 根據上述提供的培養條件，而能夠廉價、有效地，並以 不危險之方式來製備含有聚葡‘和甘露聚糖的具有免疫刺 激效力之製品。 在特佳的具體實施例中，上述的方法導致產製出含有冷 (U)-聚葡糖的免疫刺激性之製品，更隹的是聚葡 糖-甘露聚糖之製劑。 在該方法中所使用的微生物細胞，亦最好是經歷更進一 步的自溶作用’係在一或多種選自包括氣化鈉、乙醇、蛋 白水解酵素 '甘露聚糖酶、澱粉酶和聚葡糖酶的製劑 的存在下，在4到6的pH値和35到60°C的溫度下進行6到48 小時’再從經過自溶的產物中分離出固體物質。 若需要也可以在最初的細胞自溶作用之後使用酵素。也 就是在從自溶產物中分離固體物質之前，先在一或多種選 自包括蛋白水解酵素、甘露聚搪酶、澱粉酶和万_聚葡糖 酶之製劑的存在下’將自溶作用當成進一步的步驟來經營 ----------- &quot; 1〇 - 成張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（2iOX297公釐） I (請先閲讀背面之注意事C _'Tr填寫本頁) ，裝·

、1T 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 4 2411 Ο * Α7 ____Β7 五、發明説明（8 ) 較佳的是在50到60eC的溫度下經營自溶作用“到^小時 0 在特佳的具體實施例中’如此製備出之乃·聚葡糖-甘露 聚糖製劑的免疫刺激效力，藉著酸化至pH 2到4進—步地 改良；藉著酸化pH 2到4’隨後再以熱處理，而達到更太 的改良。該製品較佳地藉著增強呑噬活性或非、特異性的 免疫反應來刺激免疫系統。 更佳的是，經由使用機械破裂法，如研磨、超音波處理 或壓力均質化作用，藉著降低經過萃取之物質的顆粒大小 至2微米以下而使如此產製之々r聚葡糖_甘露聚糖製劑的免 疫刺激效力和黏性更爲增加，更佳的是小於]微米。 在其他的具體f施例中’利用經過研磨的酵母而獲得万_ 聚葡糖-甘露聚糖製劑。在研磨時期内或之後，利用如同 上述之條件使酵母細胞接受自溶作用和酵素消化作用。 在另一個特佳的具體實施例中，藉著改變在萃取過程中 所使用之酵母的性質，來改變/?-聚葡糖-甘露聚糖製劑的 免疫刺激效力和黏性。

在本發明的方法中，得自發酵工業之無用酵母是特別有 用的’將會清楚地知道’本發明適用於任何來源，諸如其 中有高比例之聚葡糖存在的微生物或植物物質。已經 報告可作爲有用的聚葡糖來源之微生物包括但不限於 細菌’如產鹼样菌屬（Alkaligenes) ’特別是菲卡則產鹼捍 菌（Alkaligenes faecalis)的各種混種（ATCC-21680) ; 土壤桿 菌（Agrobacterium);單胞菌屬（Cellulomonas)，如 ATCC 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） --------装-- { (請先閱讀背面之注意事1/填寫本頁) -11 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 4 2 4 r! Ο ' A7 __\__ B7__:_ 五、發明説明（9 ) 21399和產寬纖維單胞囷（Cellulomonas flavigena)(ATCC 5S703);以及盤多毛抱屬（pestalotia);眞菌，例如短梗徵 菌（Aureobasidum)，如出芽短梗黴菌（Aureobasidum pullulans)品系 IF0446和短梗黴菌 K-1 種（FERM P1289);縫 皮側耳（Pleurotus ostreatus);大莖點菌（Macrophomopsis)， 如品系 KOB55 ;靈芝（Ganoderma);裂褶菌（Schizophylla); 非凱馬菌（Fachyma hoelen);盤多毛孢屬；以及革蓋菌 (Coriolus)。除了釀造業酵母之外，其他食品和發酵業中 所使用的酵母也適用於本發明之目的·»這包括但不限於： 在產製增黏劑、乳化劑、纖維二軟片、塗覆物質、親和層 析法和凝膠電泳的支撑物，在細胞培養基、濾墊，以及在 水泥中時所使用的酵母。它們也被廣泛地當作食品增稠劑 來使用’並作爲膳食纖維的來源，亦在藥學產物中作爲載 劑和塗覆劑。 熟諳此藝者將能夠迅速地定出最適當的條件，在該條件 之下使得本發明方法能夠適用於酵母以外的微生物。 熟諳此藝者將會察覺，關於聚葡糖和甘露聚糖的一些 應用，係有利地以脱水形式來提供使用本發明方法來產製 的製品。藉著任何適當的方法將該品適切地脱水，包括但 不限於冷凍-乾燥、滾筒乾燥、烘箱·乾燥、噴霧-乾燥、 環狀-乾燥或利用成膜設備將其脱水，可直接使用而不進 一步加工，或可以利用任何適當的技術將其研磨或較佳的 低於20微米的顆粒大小。關於其他應用。諸如有黏性的糊 漿之類的潮濕產物也是適合的，可直接使用該製品而不需 _- 12-___ 本紙張欠度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐] ~' I----^---^---;裝— 請先閲讀背面之注意事i ip填寫本頁 訂 經濟部中央棣準局貝工消費合作社印製 4 2 4 110、:，· A7 —---------—- _____B7 五、發明説明（1〇 ) 進一步加工，或是接著利用機械破裂作用來增加它的黏性 並降低顆粒大小。 根據第五個觀點，本發明提供以本發明方法產製之聚 葡糖-甘露聚糖製劑，根據本發明之聚葡糖_甘露聚糖製劑 ’製佳的是主要含有聚葡糖（例如高達80%)，和一些甘露 聚糖（例如高達50%)。該製品可含有点々u、点1-4 和点1-6聚葡糖。 該製品可以單獨使用。然而最常見的是，將其與其他成 份結合再提供使用。因此，在本發明的此一觀點中，較佳 的具體實施例包括但不限於家禽#、魚類、甲殼類動物或貝 類飼料組合物’其含有本發明之卢_聚葡糖_甘露聚糖製劑 ’與一或多種在獸醫學上可接受之食品成份在―起；一種 免疫刺激之抗膽固醇血、低血糖或重金屬***的刺激性組 合物’其含有本發明之卢-聚葡糖_甘露聚糖製劑，和藥學 上可接受之載劑在一起；一種醫藥组合物，其包括具有藥 學活性之製劑，以及作爲載劑或佐劑，或爲了諸如錠劑或 膝囊之類固體劑量形式，作爲塗料的本發明之点_聚葡糖_ 甘露聚糖製劑；以及一種植物保護组合物，其含有本發明 之点-聚葡糖-甘露聚糖製劑，與在農業上可接受之載劑在 一起，並可視需要含有在農業上可接受之營養物或殺蟲劑 。也可將該聚葡糖-甘露聚糖製劑以飲水之形式供給家 禽或動物，或以周圍水的形式提供魚類、甲殼類動物或貝 類。 將會清楚地瞭解到’本發明之製品通常適合用在某些產 -13- 本紙張尺度適用中國國豕標隼（CNS) A4規格（2丨0X 297公釐） ^ -裝— (請先閱讀背面之注意事一 填寫本頁) 訂 424 11 Ο Α7 _____- Β7 五、發明説明（11 ) 物中’對該產物而言，已知^聚葡糖是有用的。在一些 案例中。如果可使用這類已知之純化步驟本身可能想要 或需要進一步的純化作用。 發明詳述 現在僅藉著參考下列未加以限制之實例，來詳細地説明 本發明。 -實例1 自溶萃取作用 使酵母試樣接受自溶萃取作用處理。在3 5至6〇，C下培養 1公升使用過的啤酒酵母（15%乾重）6到48小時，並加以攪 拌。在需要時利用2M的NaOH或2M的HC1，將pH調整到5 與6之間。這些條件促進酵母的自溶作用，以及細胞壁降 解酵素的釋放。離心該物質（3〇〇〇克，4到20*C 15分鐘），並 在噴霧-或冷凍-乾燥之前，先以等體積的水沖洗該沉降物 α 實例2 酵素萃取作用 藉著添加已知能引酵母自溶作用的物質，來修改藉著實 例1之自溶萃取過程的聚葡糖-甘露聚糖的產製作用。 藉著實例1之酵素程序來處理1公升使用過的啤酒酵母 (15%乾重）》藉著加入蛋白水解酵素（木瓜蛋白酶， Optimase APL440 (Solvay) ' Protomex (Novo)) » 及 /或甘露 聚糖酶（Gist Brocades)，及 /或 α 澱粉酶（Optidex L300 (Solvay)、Ban 240L (Novo))，及/或葡聚糖酶（SP 299 (Novo) 、Tunicase (Solvay))誘發更進一步的自溶作用。在需要時 藉著使用2M NaOH或2M HC1，將pH値調整到酵素活性最 ^_______-14 -____________________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4规格（210X297公釐） 請先閱讀背面之注意事 一羔填寫本頁 -裝

、1T 經濟部中央棵準局員工消费合作社印製 424 1 1 Ο &gt; Α7 Β7 五、發明説明（12 ) 合適的卩!1値。在35到6(TC下培養該酵母6到48小時，並加 以攪拌。離心該物質（3〇〇〇克，4到2(TC 15分鐘），並以等禮 積的水沖洗該沉降物。如同較早的描述將該沉降物脱水。 tMl 藉著先前技藝（鹼-酸）方法產製之聚葡糖，斑藉著 主_發明（自溶和酵素的）方法產製之聚葡糖·甘霞罕 糖相比較 爲了比較之目的，利用以Manners, D.J.等人， Biochemical Journal 135_ 19-30 (1973)爲基礎的鹼-酸萃取法 ’來製備經過純化之々（1-3)聚葡糖的試樣。 經濟部中央榡準局員工消費合作社印策 在100X下利用等體積的氫氧尼鈉（4%重量/體積）萃取1公 升使用過的啤滴酵母（20%乾重）3小時，並加以攪拌，以 移除甘露糖蛋白。離心該物質（30〇〇克，在4。(：下15分鐘）， 抛棄上清液’再以氫氧化鈉（4%重量/體積）萃取小球4次。 以水（2公升）沖洗得自最終腐蝕性萃取階段的沉降物，在 l〇〇°C下以醋酸（〇.15M)萃取3小時，並加以攪拌，以移除 肝糖。離心該物質（3〇〇〇克，在4。〇下15分鐘），並重覆該酸 性萃取步驟三次。以水（2公升）沖洗得自最終酸性步驟的 沉降物兩次，然後再以150毫升乙醇（96%體積/體積）沖洗 之。在使該物質喷霧-乾燥或冷凍乾燥之前，先將其離心 (3000克，在4°C下15分鐘）。 將利用先前技藝方法（上述方法）製備之試樣，或藉著鹼-酸萃取作用製備之可購得的聚葡糖試樣，與根據本發明製 備的聚葡糖相比較。 根據 Official Methods Of Analysis of the Association of 本紙張尺度適用中國囷家標準（CNS )从说格（2i〇x297公瘦） Α7 Β7 4 241 1 Ο -λ 五、發明説明（13 )

Official Analytical Chemists，方法 27.8.04、27.6.08、32.1.14 (mod)、27.8.〇5，第16版，1995來進行近似分析。在表I中 顯示這些分析的結果。

表I 藉著鹼-酸、自溶和酵素程序來產製之聚葡糖的比較 分析（％以乾重 爲基礎） 鹼-酸聚葡糖 自溶的聚葡糖 酵素的聚葡糖 灰粉 3 2 3 ' 脂肪 4 4 6 蛋白質 1 27 20 碳水化合物 90 66 71 &quot; r II 1 顯示藉著先前技藝方法（鹼-酸）產製之聚葡糖，與藉著本 發明方法產製之試樣相比較方法具有較少的蛋白質和較多 的碳水化合物，如表I所示。 利用Perkins-Elmer分光光度計記錄聚葡糖製劑的傳里葉 (Fourier)·變換紅外光（FTIR)光譜。將試樣冷凍乾燥以移除 任何殘餘的濕氣、在四氣乙烯中形成淤漿，並在水平的衰 減全反射（ATR)電池上進行分析。整個光譜顯示於圖1中。 由先前技藝（鹼-酸）製備之試樣的FTIR光譜與由本發明方 法（自溶或酵素法，如圖Ϊ所示）製備之試樣不同。由先前 技藝方法製備之試樣在295S到2855公分-!(代表飽和脂肪酸） ' 1744公分·!(代表糖甞）' 165〇公分·i (代表蛋白質）之處缺 乏強吸光率。由先前技藝（鹼-酸）方法製備之聚葡糖試樣的 光譜，類似經過純化之万-聚葡糖製劑之光譜，在95〇公分」 處具有強吸光率。 -16- 木纸張尺度適用中國國家楳準（CNS )八4規格（2ί〇χ297公釐） f請先閔讀背面之注意事一 填寫本頁) -裝. 訂 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 42411 ϋ 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 Α7 _______Β7_____五、發明説明（Ί4 ) 在藉由先前技藝（鹼-酸）和本發明方法（自溶和酵素法）製 備之試樣中的聚葡糖和甘露聚糖的含量，係藉著選擇性萃 取作用和比色分析（以 Stewart, P.R.，Methods In Cell Biology 各狂111-145 (1975)爲基礎）來決定之。如表H所示，與藉著 本發明方法製備之試樣相比，藉著先前方法製備之聚葡糖 試樣只含有一點點的甘露聚糖。 亦將試樣水解，並藉著氣相層析來分析之，以確認糖的 組成。在lotrc下、在氬氣之下利用4M三氟乙酸水解該試 樣4小時*在氮蒸氣之下藉著蒸發來移除酸，隨後按照 Harris, P.J.等人’ Carbohydrate Research 127 59-73 (1984)中 的描述將該試樣還原和乙醯化。藉著氣相層析在丑？又7〇管 柱上，利用火燄電離檢測器來分析水解產物。注射器和檢 測器溫度分別爲280和300X：。將烘箱保持在185。〇1分鐘， 然後以每分鐘3eC的速率昇至260。(：，並保持在最終溫度下 5分鐘。 藉著先前技藝方法製備之聚葡糖試樣顯示出僅相當於葡 萄糖的峰値。代表碳水化合物的組成主要是聚葡糖，如表 II所示。藉著本發明方法製備之試樣，含有葡萄糖和相當 量的甘露糖，表示碳水化合物的組成爲甘露聚糖和聚葡糖 的/昆合物》與甘露聚糖相比，不可溶之汐聚葡糖對 於酸性水解作用較具有抵抗力：因此與比色法相比較，氣 相層析法低估了葡萄糖（因此是聚葡糖）的濃度。 —;---—----- - I / - 本紙張尺度賴t @國家標準（CNS )八4胁（21〇ϋ公M y __~- {請先閱讀背面之注意事(-1.填寫本頁) 裝. 訂 -(▲·, 424 11 Ο , Α7 Β7 五、發明説明（15 )

表II 藉著鹼-酸、自溶和酵素程序產製之聚葡糖的比較：碳水 化合物分析 分析(％重量/ 重量） 鹼-酸聚葡糖 自溶的聚葡糖 酵素的聚葡糖 聚葡糖比色分析 88 48 54 甘露聚糖比色分析 1 9 8 葡萄糖GC分析 65 50 45 甘露糖GC分析 未檢測 25 15 在利用鹼-酸萃取作用和本發哂方法（自溶和酵素法）製備 之聚葡糖試樣中葡萄糖殘基之間的鍵結種類，係藉著利用 以 Harris, P‘J.等人，Carbohydrate Research 127 59-73 (1984)

爲基礎之程序的甲基化作用分析來決定β 在表III中的結果顯示，與根據本發明之方法製備之試樣 相比較，藉著鹼-酸法製備之試樣主要由（1-3)-連結的葡萄 糖組成。 表III 藉著鹼-酸、自溶和酵素程序產製之聚葡糖的比較：键結 分析 -----_---^---裝-- (請先閏讀背面之注意事C ..T,填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 葡萄糖單體的键結 分析（相對百分比） 餘-酸聚葡糖 自溶的聚葡糖 酵素的聚葡糖 末端 4 26 24 1-2連結 0 14 14 1-3連結 94 29 40 1-4連結 2 25 14 1-6連結 0 6 8 -18- 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公蔆） 經濟部中央橾準局負工消費合作社印製 藉著鹼-酸、自溶和酵素程序產製之聚葡糖的比較；绣導 呑噬細胞的能力 1 分析 — _ 鹼·酸聚葡糖 自溶的聚葡糖 酵素的聚葡ίΓ 在腺腔内的細胞 (xlO6) 11,9 11,9 1^1111-- 15 %吞嗤性巨禮細胞 45 50 ------1 70 %呑噬性嗜中性白血球 16 33 424110 A7 __________B7 五、發明説明（Ί6 ) 利用老鼠模式測試聚葡糖試樣的生物活性。藉這三種程 序中每一種產製出的物質，主要具有1〇〇_3〇〇微米的顆粒 大小》在小珠研磨機中將經過脱水的物質研磨成&lt;20微米 顆粒直徑，並利用該物質對老鼠進行腹腔内注射（2毫克/ 老鼠）。在72小時之後，從腹腔中採收誘導細胞進入的腹 腔滲出液，與熱殺的酵母細胞一起培養，並計算呑噬細胞 的百分比。 根據本發明（自溶或酵素法）製備之物質，比起藉鹼/酸萃 取程序製備之物質，更有效地誘導出非_特異性的免疫反 應’如同藉著在腹腔中細胞數if的增加所示，係歸因於經 過注射之物質吸引炎症細胞的化學吸引作用，以及呑嗟性 嗜中性白血球和巨喔細胞數目的增加。這些結果顯示於表 IV中。

表IV 爲了獲得有利的效果，不希望受到任何經過計劃之機制 的束縛’我們相信甘露聚糖和非_卢（1_3)-連結的聚葡糖可 以協同的方式與絲狀的0 (1_3)_連結的聚葡糖—起作用， 而產生更好的免疫反應。 ______-19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A规格（21〇χ 297公釐) - -- (請先閱讀背面之注意事t 填寫本頁 -裝- 訂 424Π0, Α7 Β7 五、發明説明（17 ) i例4 藉著酸化作用改善聚葡糖-甘露糖製品的效力 藉著實例1之酵素法來處理1公升使用過的啤酒酵母（15% 乾重）。將一等份的沉降物冷凍-乾燥◊利用氫氣酸或醋酸 將剩下沉降物的pH値調整成2到4，然後將該沉降物冷康_ 乾燥’或在80°C下以烘箱-乾燥。如同實例3中的描述，藉 著GC-MS分析糖的鍵結。 將聚葡糖-甘露糖研磨成&lt;20微米；並如同實例3中的描 述，測試其誘導呑噬細胞的能力。在表V中的結果顯示酸 化作用接著以烘箱-乾燥，改善了聚葡糖-甘露聚糖刺激免 疫反應的效力，且酸化作用接著加熱處理，使一些々（L 6)-連結的聚葡糖損壞，可能在微絲狀聚葡糖中顯露出較 多的活性位置β 請先閲讀背面之注意事一填寫本頁〕 --3 _ Γ

表V 熱-乾燥經過酸化之物質的影響 分析 冷凍乾燥沒 有酸化作用 冷凍乾燥隨 後是酸化作用 烘箱乾燥f 後是酸化作用 在腹腔内的細胞 (xlO6) 4.15 3.9 7.1 %呑噬性巨噬細胞 55 52 68 %呑唆性嗜中性白血 球 43 41 -------» 50 在聚葡糖中点（卜3)對 卢（1-6)鍵結的比例 4.9:1 5.28:1 7.3:1 實例5 藉著改變顆粒大小來改善聚葡糖-甘露聚糖製劑 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 的效力 已知可藉著改變顆粒大小而明顯地改變一些物質的效力 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇 X 297公釐） 42411 Ο Α7 Β7 五 、發明説明（18 。藉著實例1之酵素法來處理1公升使用過的啤酒酵母（1〇% 乾重）。將終沉降物懸浮於水中（2〇%乾重）a在此一階段， 聚葡糖-甘露聚糖物質在顯微鏡下呈現出大約4到6微米直 輕的個別球體。在布老恩（Braun)細胞勾漿器中，利用在小 珠大小上’直徑從〇·25變化到1毫米的珠璃小珠，處理一 等份經過懸浮的沉降物6分鐘。這使得聚葡糖球體***成 大小低於2微米的顆粒，產生具有起泡乳霜之濃稠度的高 黏性產物。然後藉著實例3中描述的方法來測試該產物， 顯示出刺激非·特異性免疫反應的良好能力。 在該方法的變化中，將剛收穫的酵母細胞珠狀研磨，以 便使細胞破裂。在研磨期間或之後，利用類似實例〖或2中 描述的那些條件，使該酵母細胞接受自溶或酵素消化作用 。藉著離心獲得不溶的物質，並利用老鼠模式測試其生物 活性。將結果摘述於表VI中。

表VI 改變聚葡糖顆粒大小的影響 ； ： 、裝-- (請先閱讀背面之注意事^為填寫本頁)

•II 分析: 經濟部t央標準局員工消費合作社印製 完整的聚 葡 糖顆粒 (4-6微米） 破裂的聚葡 糖顆粒 (&lt;1微米） 破裂後再以酵素 消化的酵素顆粒 (&lt;1微米） %增加 在細胞/腹腔中 %增加 在吞禮性巨嗤細胞中 %增加 在呑噬性嗜中性白血球中 150 250 250 50 118 125 24 30 -21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 424 1 1 〇 Α7 --------------Β7_ 五、發明説明（19 ) *與經過乾燥之酵母或冑聚驢對照組比較 關於酵母或聚葡糖顆粒的分解’可以使用其他的濕式研 磨法和設備β這些包括但不限於壓力均質化作用（Mant〇n Gaulin)、小球研磨和球磨（Dyn〇研磨機、研磨機、 Netzsch研磨機）。 -實$ 6 蓮L著改變所使用之酵素的性質朿改善聚葡糖-甘 .露聚播Μ劑的效力 以水沖洗新鮮酵母的淤漿（16 5%乾重），然後在5〇1下培 養17小時’並加以攪拌《將經過自溶的酵母加熱到i〇〇°c 30分鐘’然後分成兩批。 - 一批以得自Solvay的酵素來處理。在47。(：和pH値9之下 ’將該酵母與1%重量/重量的Optimase APL-440 (蛋白水解 酵素）一起培養2小時，並加以攪拌。然後將pH値降至7.5 ，並加入1%重量/重量的TunicaseFN (聚葡糖酶）酵素。在 培養6小時之後’加入1 % 〇ptidex (葡糖澱粉酶），然後在60 °C和pH値4_ 5下，再培養該混合物6小時β得到有黏性的沉 降物。將該沉殿物冷凍乾燥並以球磨研磨之。 以得自Novo的酵素培養第二批。在ρΗ値5.5之下，將該 酵母與1%重量/重量BAN (葡糖澱粉酶）和1%重量/重量 Mutanase SP299 (聚葡糖酶）酵素一起培養6小時，並加以攪 拌β加入1% Protomex (蛋白水解酵素），並在55°C和pH値 5,5下再培養該混合物16小時* 在不同的實驗中，以1%重量/重量Tunicase (pH値7.5，在 35°C下6小時）處理根據實例1製備之聚葡糖-甘露聚糖。利 -22- 本纸張尺度適用中离國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ；---：---Ί装— Ϊ先聞读背面之注意事CT.填寫本頁) ，1r 424 1 1 Ο Α7 Β7 五、發明説明（2〇 )

用Tumcase處理過的聚葡糖-甘露聚糖增加了黏度。離心該 製品’並將該沉降物冷凍乾燥並加以研磨β將得自經 Tunicase處理之聚葡糖的上清液，對蒸餾水進行廣泛的透 析，並冷康乾燥之β 按照實例3中的描述，分析在聚葡糖試樣中葡萄糖殘餘 物之間的鍵結種類。亦利用老鼠模式來測試生物活性a結 果顯示於表VII中，顯示可利用酵素來改變聚葡糖製劑之 性質。例如，以Tunicase (Solvay)處理，得到有黏性的產 物，在聚葡糖製劑中具有降低鍵結。也可以利 用酵素來產製具有生物活性的可^容形式之聚葡糖。 表VII 酵素活性的影響 分析* Solvay Novo Tunicase 酵素法 酵素法 沉降物 在聚葡糖中卢（1-3)對 25:1 4.6:1 5,4:1 点（1-6)鍵結的比例 %增加 330 268 110 在細胞/腹腔中 %增加 65 90 &quot; 丨 — 96 在呑噬性巨噬細胞中 Tunicase 上清液 未檢測 65 140 C请先閲讀背面之注意事^ .-f.填寫本頁 -裝- 訂 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 tMl 改變聚葡糖-甘露聚糖製劑之黏性 也可以藉著酸化作用（實例4)、藉著研磨（實例5)和藉著 改變所用之酵素的種類（實例6)，來改變按照實例2中之插 述來製備之聚葡糖-甘露糖的黏性。使用帶有毫米之板 子的CSL100流變儀，來測量黏性。以1〇〇/秒之剪切速率， -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐 五、發明説明（21 Α7 Β7 利用10%重量/體積的聚葡糖懸浮液，在20°c下取得測量値 ，並將結果摘述於表VIII中》表νπι 改變聚葡糖-甘露聚糖製劑的黏性 處理 黏性(Pa.s) 按照利用pH値4.5之實例2來製備的聚葡糖 5,8 X 10_3 按照利用pH値4.5，並煮沸10分鐘之實例2 7.82 X 10_3 來製備的聚葡糖 按照利用pH値4.5、煮沸10分鐘並研磨至小 1.10 於1微米之實例2來製備的聚葡糖 按照利用pH値3、煮沸10分鐘並研磨至小 1.40 於1微米之實例2來製備的聚葡糖 按照實例6，利用Tunicase來製備之聚葡糖 1.50 ----^---_---粜-- (請先閔讀背面之注意事1 ..V填寫本頁)

U:J 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 因此’可利用熱、酸、酵素，和藉著改變顆粒大小來改 變聚葡糖-甘露聚糖製劑的黏性，而產生有黏性的物質β 這種物質可用來作爲乳霜'凝膠或其類似物。 .實例8 聚葡糖-甘露聚糖製劑在魚類身上作爲免疫促進 劑的效力 從維多利亞的商業農場獲得虹缚魚（Qnc〇rhynchUs mykiss °這群魚具有13克的平均體重，並使其分散在6 x 260公升 的實驗槽中，在每個魚槽中有12隻魚。在開始實驗之前先 使魚群適應環境7天。 使用標準鳟魚小球，並以每天大約5%體重的量，每天 銀食魚群兩次。將聚葡糖-甘露聚糖製劑與飲食合併，得 到在最終飼料中〇1重量％/重量的終濃度。將包括對照组 -24- •V3 Μ 424 11 〇 Α7 Β7 五、發明説明（22 ) 飲食的所有飲食再製成小球，並在5 〇eC下脱水。在飼養3 週之後，將魚群以苯佐卡因（benzo***e)(l :10,000)麻醉 並犧牲之。 在每毫升含有1單位肝素的纽織培養培養基中收獲前腎 。通過不銹鋼80規格之網篩來處理該组織，以便分離單一 細胞。以杜必可（Dulbecco's)經過修改之魔氏培養基 (DMEM)(Gibco Laboratories)來沖洗該細胞懸浮液。使該細 胞接受氮藍四唑分析，以檢測過氧化物陰離子的產生（以 Rook, J.等人，J. Immunol. Methods 82^ 161-167 (1985))，並 接受呑噬作用分析，以檢測巨噬細胞呑噬酵母細胞的能力 〇 發現按照實例2中之描述所產製的聚葡糖-甘露聚糖，在 分離自虹鱒魚之前腎的細胞中，増加了呑噬活性和過氧化 物陰離子的產製，如表IX所示。數據顯示按照實例2中之 描述所產製的聚勤糖-甘露聚糖能夠在虹罐魚中刺激免疫 系統a

表IX 在魚類中作爲免疫促進劑效力 —----_---：---、-裝-- (請先閏讀背面之注意事一 if填寫本頁) 訂 經濟部中央樓隼局員工消費合作社印製 飲食 對照组 聚葡糖-甘露聚糖製劑 (酵素法） 呑噬作用％ ϋ氧化物的產劁 27.2 一 取 ___0.038 37.1 0.068 實例9 聚葡糖-甘露聚糖製劑在魚類中座^死亡率的能 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨〇 X 297公釐） 4 2411 0 ^ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印褽 Α7 __Β7__五、發明説明（23 ) 從塔斯馬尼亞的商業農場獲得一年以下的虹鳟魚 (Oncorhynchus)。牠們具有65克的平均體重。將魚群分教 在六個隔離的魚槽中，每個魚槽中有16隻魚。將魚群保持 在15°C的氣溫和13-18eC的水溫下，並在開始實驗之前先 使其適應環境7天。 每天使用吉普森（Gibson's)鳟魚小球，以每天大約2.5%體 重的量來餵飽魚群&quot;將聚葡糖（根據實例2製備之聚葡糖， 或利用鹼/酸萃取法製備之聚葡糖）合併到5%重量/重量的 明膠溶液中，並塗覆在小球上，以便在最終飼料中提供 0.1%重量/重量的聚葡糖濃度《餵飼對照組魚群的小球則 僅塗覆明膠。利用下列的餵飼計劃：14天以經過補充的飼 料，接著42天以未經補充的飼料，然後另14天以經過補充 的飼料。在第二個補充物週期之後一週，以鰻弧菌（Vibrio anguillarum)來桃戰魚群。 使用鰻弧菌血清型C的塔斯馬尼亞品系（相當於清型01) (Munday，Β.等人，Immunology and Cell Biology 70 391-397 (1992))。使該生物生長在補充有2% NaCl的營養肉湯培養 基中。 藉著腹腔内注射3xl07 c.f.u. (LD5〇劑量），以鰻弧菌來挑 戰魚群，並且每天至少觀察兩次，持續10天，所有死亡的 魚均對鳗弧菌進行培養 在接種後第三天發生死亡。在接種後第3和第4天，對 照組大部份是不活潑的，並在魚鰭的基部和肚子上有充血 ，雖然在該組中未記錄到更多的死亡率。 ______________- 26 -_________________ 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----1-------Ί裝------訂-----^4.^ (請先閱讀背面之注意事一 1·填寫本頁) 11 Ο Α7 Β7 五、 發明説明（24 以缓浪菌排戰之後，證實了根據本發明之聚葡糖的保護 作用。使用鹼-酸萃取法製備之聚葡糖具有較低的效力， 如同表X所示β 表X 聚葡糖-甘露聚糖在魚類上降低死亡的能力 飲食 ........... 在挑戰之後10天的死亡率％ 對照組 15.6 聚葡糖製劑（酵素法） 3.1 聚葡糖製劑（鹼/酸法） 9.4 結果顯示可利用按照實例2中之描述所產製的聚葡糖-甘 露聚糖’來改善虹鱒魚對鳗篆菌引起之感染的抵抗力，並 勝過先前技藝的聚葡糖製劑。 實例1〇 聚葡糖-甘露聚糖製劑在蝦子（Penaeus monodon、身 請先閱讀背面之注意事(.+,填寫本頁 絮- 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 上降低死亡率的能力 從昆士藺（Queensland)的農場獲得5-10克的蝦子》在 12x60公升的魚槽中將12雙蝦子稱重。使蝦子在魚槽中適 應環境5天，然後餵食對照组或處理组的飲食。在23天之 後，以1&gt;1)50劑量之哈氏弧菌（Vibrio harveyi)注射瑕子。持 續7天監視死亡率。在這段期間内，以對照組或處理组之 飲食來銀食蝦子β 所有的蝦子均餵食蒸氣小球化的標準飲食（CP 100)。藉 著以明膠黏到小球的表面上，將根據本發明之聚葡糖-甘 露聚糖加至處理组飲食中。製備大約5%重量/體積之明膠 溶液的溶液，並以1 〇〇毫升/每公斤小球之比例，混合到對 -27· 本紙張尺度適用中國國家標孪（CNS ) A4規格（210〆297公釐〉 .求 A7 B7 五、發明説明（25 ) 照组飲食中。處理組所使用之明膠溶液，含有足夠的根據 實例2製備之聚葡糖-甘露聚糖，或利用鹼/酸萃取法產製 之聚葡糖，以確保在終飲食中含有〇. 1 %重量/重量的終濃 度。餵食比例爲蝦子體重的6,5到5%/天。 挑戰研究使用分離自垂死之（p. esculentus)瑕的哈氏派菌 品系656的病原品系。在26-28°C下，在含有維生素的海水 液態肉湯中繼代培養細菌過夜。以〇·73%重量/體積的生理 食鹽水&amp;液沖洗細胞二次’並在4〇°C下以2,000 rpm離心30 分鐘β每個步驟中均使用渦流混合β製備細菌懸浮液的連 績稀釋’並將每種稀釋度注射到未經處理的蝦子中，以便 計算LDso値。從每個連續的稀釋度中取〇丨毫升，與25毫 升42°C、含有纖生素的海洋瓊脂（μα V)混合，然後倒入陪 氏m中。在26-28°C下24小時之後，計算菌落並計算在每 個接種懸浮液中細菌的數目a使用傾倒盤來計算在〇 〇5毫 升之注射體積中的細菌數目。 關於lDm的挑戰，最後選擇在〇.05毫升中含有12χ1〇5的 劑量來注射哈氏弧菌品系656 〇在第二個腹節處注射瑕子 經濟部中央橾隼局員工消費合作社印製 。在接下來七天中每天記錄死亡率，以下法來計算死亡率 百分比：-

死亡率％ =死亡蝦子的數目·Α xlOO 瑕子總數-A A=在第1天之後的死亡率 在以哈氏政菌挑戰之前的餵飼時期中，監視嘏予的行爲 和健康。同時在生長方面沒有明顯的影響，以按照實你2 28-

-----^---_---「裝-- (請先閔讀背面之注意事！ί 乂填寫本頁J .Ίτ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格 (210X297公釐 42411〇 Α7 B7 五、發明説明（26 ) -------^--1 裝-- (诗先閏讀背面之注意事填寫本頁) 描述來製備之聚葡糖-甘露聚糖的飲食來餵飼的蝦子具有 較好的食慾，是較活潑的，並顯示出較低死$率的發生。 在以哈氏弧菌挑戰之後，證實了本發明之聚葡糖的保護 效力。根據鹼/酸法製備之聚葡糖的效力較差，如同表又工 所示。

表XI 在瑕子中死亡率的降低 飲食 在挑戰後7天 的死亡率％ 挑戰所使用的 瑕子數目 對照組 50 99 聚葡糖製劑（酵素法） 11* 92 聚葡糖製劑（鹼/酸法） 18 55 &quot;W &gt;1 II _ -- 與對照組有顯著差異。 因此可利用按照實例2中之描述製備的聚葡糖甘露聚糖 ，成功地改善了瑕子的疾病抵抗力β iJUi聚葡糖-甘露聚糖製^^龛之疾病抵抗力的 能力 _|本 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 將240隻混合性別的幼雞分成四個不同的飲食處理组。 將一日齡的幼難飼養在兩组育雜箱中，並均勻地分成24個 隔間，每個隔間有10隻雞。以標準未·攙藥物的商業飲食（ 對照組），或是以1克/公斤飼料之比例將聚葡糖_甘露聚糖 合併到甸料中的標準飲食來餵飼雞群&amp;該聚葡糖_甘露聚 糖係根據實例2或實例5 (在酵素作用期間或之後加以研磨） 中的方法來製備之。在一日齡到21日齡之間無限制提供雞 群該飲食。並以每週爲間隔來監视生長速率。 -29- &amp;度適用中國國家標準（〇阳）八4規格（2^7^7公楚)~~------- 4 24110 A7 B7 五、發明説明（27 ) 在銀食試驗結束時’從每種處理中取18隻鳥將其放血β 以經過肝素處理的試管收集血液，並以PBS沖洗兩次。藉 著從少量的血液試樣中分離白血球，並與有生存能力的金 黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)懸浮液一起培養，來 評估循環血液中白血球的殺細菌活性。在一小時的培養期 間之後，溶解血球細胞’並測量存活細菌的數目。 另外從每種處理中取出20隻鳥移至泡罩隔離器中，每個 隔離器中一種處理组。從每隻鳥身上取得共泄腔擦拭物以 確認烏群是不含沙門桿菌的。以紫外線照射飼料以確保其 不含沙門样菌《利用鼠傷^沙門氏样菌（Salm〇neUa typhimurium)的遺傳工程品系（具莕啶酮酸抵抗力），經口接 種予鳥群。以不同的時間間隔，犧牲每種處理组中的五隻 鳥，並從胃腸道中取得沙門桿菌計數。結果摘述於表χπ 和XIII中。 表XII 聚葡糖-甘露聚糖對家禽健康的影響：生長速率和單核球 活性 ,—^1裝— (諳先閱讀背面之注填寫本頁) 訂 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 處理 第21天體重（克） 存活的細菌 (cfu/毫升） 對照組 799 2.3 X 104 0.1%聚葡糖（酵素法） 813 1.2 X 104 0.1%聚葡糖 818 7.7 X 103 經過研磨然後以酵素消化 30- 本紙張尺度適用中国國家標率（CNS ) A4規格（2丨OX2?7公釐） 4 2411 Ο Α7 Β7 五、發明説明（28 表 XIII 挑戰試驗：沙門样菌的殖民 分析 對照組 0.1%聚葡糖 (酵素法） 0.1%聚葡糖 經過研磨然後 再以酵素消化 在2天後 被殖民鳥隻的％ 93 0 60 在4天後 被殖民烏隻的％ 100 60 20 在第2天時的 沙門桿菌數目 (CFU/克） 2364 0 760 在第4天時的 沙門捍菌數目 (CFU/克） 30000 15840 6000 ----------叫-裝-- (请先閱讀背面之注意事填寫本頁) ,ιτ 經濟部中央標準局員工消費合作，社印製 表XII顯示聚葡糖-甘露聚糖在生長速率方面產生了 2-3% 的改善^該聚葡糖-甘露聚糖製劑在幼難身上補強了免疫 反應’並促進其抵抗感染的能力，另一方面，表XIII顯示 將聚葡糖-甘露聚糖添加到飲食中，明顯地降低了沙門桿 囷對幼難殖民的發生率和嚴重程度。 實例12機能飲枓 可將根據本發明之聚葡糖-甘露聚糖製劑加至飲料或食 物（例如優格）中，來改善易於受到感染之人類的健康，如 免疫-妥協的個體、密集訓練的運動員，以及具有癆病生 命型式或易罹患胃腸道問題的人。適合使用的調配物是不 含酒精的飲料： 31 - 衣紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A&lt;5規格（2I0X297公爱） 424 Η ο - A7 —__ B7 五、發明説明（29 ) &quot; 〜〜' 25%的紅蘿蔔、蕃茄及/或柑橘的果汁含量 1β/° (重量/體積）聚葡糖製劑。 (1)我們產製含有甘露聚糖、並具有免疫刺激之活性 的顆粒狀聚葡糖製劑的方法，與先前已知的方法有相當大 的差異，先前已知的方法係以鹼·酸、酚：水或溶劑萃取 作用爲基礎》 (H)藉著我們的方法產製之聚葡糖-甘露聚糖物質，比 藉著驗·酸萃取法產製的更不純，然而其在老鼠身上刺數 非·特異性的免疫反應卻更爲有效β (111)藉著在加熱-乾燥之前先將該聚葡糖-甘露聚糖物 質酸化，可以改善該物質之活性。

Gv)可藉著改變顆粒大小、酸處理和酵素處理，而明 顯地改變聚葡糖-甘露聚糖物質的黏性和生物活性。 本發明之聚葡糖-甘露聚糖物質，在許多領域中均是有 用的，包括但不限於：- 0 養殖漁業：爲了增加硬骨魚類和甲殼類種類對各 種水-生感染的抵抗力。可將該聚葡糖物質投予在已經製 備好的魚飼料中。 ϋ) 畜牧業：可在飼料原料中、寵物食品中，以及以 液態形式將該聚葡糖物質以投予動物和家禽》 iii) 獸醫和醫學上的用途：可將該聚葡糖-甘露聚糖物 質當作局部傷口-癒合乳霜或薄膜來投予，或是可經口、 鼻内或經由非經腸之注射來投予。 ____ -32-__ 本纸蒗尺度適用中國圉家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） « - - ) n I_ H I—I n ^ 扯衣I ~\靖先聞讀背面之注意事填寫本頁} .訂· 經濟部中央棣準局員工消費合作社印製 A IH139號專利申請案 中文說明書修正頁 Α7 五 '發明説明（3〇 ) TT~=rr 年月 g補充 經濟部中央樣隼局員工消费合作.社印«. ιν)作為食品補充物：酵母細胞壁物質產製成的副產 物’幾乎疋公認的食品添加物，用來當作增稠劑或是在沙 拉調味料、湯、塗麵包之物（如奶油 '果醬）、醬料等等 中’提供飲食的纖維，並可使用於，，機能”食品和飲料中， 以促進對疾病的抵抗力。 V) 化妝品：在例如減少日曬的乳霜或乳液中，以及 在敏感皮膚使用的調配物中α VI) 藥學上：作為傷口-癒合製劑、抗-癌症製劑，或 是在免疫抑制的患者或易受到感染之患者身上作為抗—感 染製劑。本發明之產物可β乳霜、乳液、錠劑、漱口藥水 之形式來使用，或是使該物質在經乾燥後形成薄膜，而用 來作為燒傷的包紮3也可用它來當作疫苗、抗生素或其他 藥學製品的佐劑。 將能夠清楚地瞭解到*本發明之聚葡糖-甘露聚糖產品 可應用在已經描述於前項技藝中之聚葡糖的用途上a 對熟讀此藝者而言’顯然為了清楚和明暸的目的，在一 些細目中已經說明了本發明，可以對本文中描述之具體實 施例和方法進行各種修改和變化，而不違背在此專利說明 書中揭示之發明概念的範圍。 圖式簡要說明_ 圖1係顯示獲自實例1至3聚萄糖樣本之F τ I R光譜= -33- 本紙浪尺度遑用中國理家橾準（CNS ) A4規格（2丨OX 297公羹） ---：—=-----裝— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線

Claims (1)

1. 修正 補充 在2ΙΊ39號專利中請案 中文申請專利範圍修正本(89年11月） ~ Τ~89：Τί：Τ 六、申請專利範! 1 一種製造免疫刺激性含有沒·聚葡糖及甘露聚糖製劑的 方法，其中該/?·聚葡糖包含13-0-聚葡糖及丨，。^-聚葡糖，該方法包含下列步驟： a) 在5到6之pH值和35至6 0°C之溫度下，將具有高比 例万-聚葡糖存在的酵母、細菌或真菌細胞進行第 一次自溶步驟6到4 8小時，以產生顆粒大小[〇 〇至 300微米之物質； b) 從自溶產物中分離出固體物質； c )在4到6之p Η值和3 5至6 0 °C之溫度下，將步驟b )之 產物於一或多種選自包含蛋白水解酵素、甘露聚擔 酶、殿粉酶和沒-聚葡糖酶所组成之群之製劑的存 在下’進行第二次自溶步驟6到4 8小時； d) 從自溶產物中分離出固體物質；並再 e) 降低其自溶產物之顆粒至小於2微米。 2 ‘根據申請專利範圍第1項之方法，其中該酵母為選自包 含酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)、脆壁克 魯維酵母（Kluyveromyces fragilis)和念珠菌屬 (C a n d i d a)所組成之群的菌種。 3·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該細菌為選自包 含產驗样菌屬（Alkaligenes) 、 土壤梓菌 (Agrobacterium)、單胞菌屬（Cellulomonas)和盤 多毛抱屬（Pestalotia)所组成之群的菌屬。 4 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中該真菌為選自包 含短梗徵菌（Aureobasidum)、 侧耳屬 本紙法尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4规格（210X2!&gt;7公釐） ---------裝------訂 、^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印I 1 1 〇 ABCD 經濟部中央梂準局貝工消費合作社印製 夂、申請專利範圍 (Pleurotus)、大莖點.菌（Marcophomopsis)、靈芝 (Ganoderma) ' 裂裡菌（Schizophylla)、非孰馬菌 (Fachyme)和革蓋菌（Coriolus)所组成之群》 5 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該蛋白水解酵素 係選自包含經發酵地衣芽孢样菌（BacillUs licheniformis)製得之鹼性細菌蛋白酶及分離自芽孢 桿菌屬菌種（Bacillus species)之蛋白酶所組成之 群- 6 ·根據中請專利範圍第1項之方法，其中該卢-聚葡糖酶 係選自經發酵節桿菌屬菌種（Arthrobacter Speeies) 製得之酵母細胞壁分解酶及經發酵毒性木霉 (Trichoderma harzianum)製得之酵素複合物所組 成之群。 7 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中該澱粉酶係選自 經發麴霉菌（Aspergillus)菌株製得之葡糖澱粉酶所 组成之群。 8 . —種免疫刺激性製劑，其包含点-聚葡糖及甘露聚糖， 其中該石-聚葡糖包含l，3-y?·聚葡糖及1&gt;6•沒_聚葡 糖，其係由下列步驟製得： a) 在5到6之pH值和35至60 °C之溫度下，將具有言比 例召-聚葡糖存在的酵母、細菌或真菌細胞進行自 溶步驟6到4 8小時；並再 b) 在4到6之pH值和35至60°C之溫度下，將步驟&amp;)之 產物於一或多種選自包含蛋白水解酵素、甘露聚糖 本紙涑尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） I I . I ϋ ^ -裝 n I I 訂 H II 『 冰 (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) Α8 Β3 C8 D8 六、申請專利範圍 酶、澱粉酶和点-聚葡糖酶所组成之群之製劑的存 在下’進行自溶步驟6到4 8小時； 且其顆粒大小小於2微米。 9 .根據申請專利範圍第&amp;項免疫刺激性製劑，其係由包本 下列步驟之方法製得： a)在5到6之pH值和35至6CTC之溫度下，將具有高比 例沒-聚葡糖存在的酵母、細菌或真菌細胞進行自 溶步騾6到4 8小時； b )從自溶產物中分離出固體物質； c) 在4到6之pH值和35至6〇°C之溫度下，將步驟…之 產物於一或多種選自包含蛋白水解酵素、甘露聚糖 酶、殿粉酶和/3 -聚葡糖酶所組成之群之製劑的存 在下’進行自溶步驟6到4 8小時； d) 從自溶產物中分離出固體物質；並再 e )降低其自溶產物之顆粒至小於2微米。 10.根據申請專利範圍第9項之免疫刺激性製劑，其中該顆 粒之大小係小於1微米。 根據申請專利範圍第1項之製造免疫刺激性製劑的方 法’其中第一次自溶步驟之p Η值係界於5至6間，溫度 係維持於3 5至6 0。C間進行6至4 8小時，且該顆粒之直 把係小於2微米。 12.根據中請專利範圍第1項之方法，其中該產物包含 1 ? 3 -聯結及丨，6 _聯結葡糖單體，且其中丨，3 •聯結比 1 ’ 6 -聯結葡糖單體之比例為4 9 %至7 3 %。 __Γ ---------^ 裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央棣準局負工消費合作社印製 -3 -

   A2AU Ο Α8 Β8 C8 D8 申請專利範圍 13.根據申請專利範圍第9項之免疫刺激性製劑，其中p H 值係界於5至6間，溫度係維持於3 5至6 〇。C間進行6至 4 8小時，且該顆粒大小係小於2微米a 14‘根據申請專利範圍第9項之免疫刺激性製劑，其中該顆 粒之平均直徑係小於2微米。 n. 1^, &lt; n I (請先閲讀背面之注項再填寫本頁) 經濟部中央標準局®:工消资合作社印製 本紙張尺度適用中國國家梂準（CNS ) A4规格（210X297公釐）