JP5489462B2 - 骨病状の遺伝子治療のための組成物およびそれらの使用法 - Google Patents
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Description
本発明は、低骨密度の治療のための組成物および方法に関する。本発明はまた、オステオプロテジェリン依存性病状の治療のための組成物および方法にも関する。
骨の健康および骨粗鬆症に関する米国公衆衛生総監報告(Surgeon General's Report on Bone Health and Osteoporosis)は、2020年には年齢50歳以上の米国人のおよそ半数が骨粗鬆症を有する、またはそれを発症するリスクがあると推定している。米国骨粗鬆症基金(National Osteoporosis Foundation)は、米国には骨粗鬆症を現在有する症例が約1000万人おり、うち800万人が女性、200万人が男性であり、さらに3400万人の米国人が低骨量のために骨粗鬆症の深刻なリスクを有すると推定している。骨粗鬆症は年間150万件を上回る骨折の原因となっており、これには300,000件を上回る股関節部骨折;およそ700,000件の脊椎骨折;250,000件の手関節骨折;および300,000件の他部位の骨折が含まれる。骨粗鬆症性の股関節部骨折に対する米国全体での直接的費用の推定値(病院およびナーシングホーム)は、2002年に180億ドルであった。股関節部骨折の患者は今後さらに別の骨折を経験する可能性が非常に高い。これらの統計の背後にある生活の質の低下の大きさは筆舌に尽くしがたい。さらに、急性および部位特異的な低骨密度病状には、炎症媒介性骨溶解、腫瘍誘発性骨溶解、人工インプラントの弛み、歯周病(periodonitis)または骨関節炎が含まれる。
骨は、骨格内で絶え間ないリモデリング(吸収および置換)を受ける動的な組織である。骨格の維持を担う主要な細胞種は、吸収性の破骨細胞および骨合成性の骨芽細胞であり、それらはどちらもホルモン、増殖因子および炎症メディエーターによって影響される。間葉幹細胞由来の骨芽細胞による骨形成、ならびに単球/マクロファージ系列の造血前駆細胞から生じる破骨細胞によるそのモデリングおよびリモデリングは、1つの密接に調節された系である(Huang, W., et al., A rapid multiparameter approach to study factors that regulate osteoclastogenesis: Demonstration of the combinatorial dominant effects of TNF-a and TGF-β in RANKL-mediated osteoclastogenesis. Calcif. Tissue Int. 73:584-593 (2003)。正常骨量の維持は、局所性および全身性の両方の因子およびシグナルがかかわる、形成と吸収との間のホメオスタシス的な複雑な均衡に依存する。これらの2つのプロセス間に不均衡がある場合には、骨密度の上昇(大理石骨病)または低下(骨粗鬆症)が起こる。慢性の低骨密度は閉経後、加齢性および炎症性の疾患でみられ、一方、急性の低骨密度は人工関節(prosthesis)の弛みまたは腫瘍誘発性骨溶解において観察される。
破骨細胞は、特定のシグナルに応答して、単球/マクロファージ系列F4-80陽性細胞の造血前駆細胞から生じる(Boyle, W. J., et al., Osteoclast differentiation and activation. Nature 423, 337-342 (2003))。これが起こるためには、コロニー刺激因子-1(CSF-1;M-CSF)およびTNFスーパーファミリーのメンバーであるRANKL(NF-κBリガンドの受容体活性化因子;TRANCE、OPGLおよびODFとも呼ばれる)という2つの増殖因子が必要である。図1は、破骨細胞の分化に関与するシグナル伝達機構の概略図であり、ここでRANKLはその受容体であるRANKを活性化することによって破骨細胞の分化を活性化し、一方、オステオプロテジェリン(OPG、これは破骨細胞形成抑制因子としても知られる)は、RANKLを、細胞表面に対するその結合を阻止することで封鎖状態にする。
OPGは腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーのメンバーであり、約60kDの単量体形態およびジスルフィド結合した約120kDのホモ二量体形態として存在する分泌性で塩基性の401アミノ酸の糖タンパク質である。OPGは骨芽細胞および骨髄ストロマ細胞によって産生される。OPGは、RANKLがRANKと結合するのを妨げる可溶性「デコイ」受容体として機能することにより、破骨細胞形成を用量依存的な様式で阻害する(図1)。Schoppet, M., et al., RANK ligand and osteoprotegerin: paracrine regulators of bone metabolism and vascular function, Arterioscier Thromb Vasc Biol. 2002 Apr 1;22(4):549-53を参照。オステオプロテジェリンは1997年にSimonetらによって報告され、彼らはそれをインビトロおよびインビボで防御的な骨作用を有する腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーの分泌性メンバーとして同定し、特徴決定した(Simonet, W. S., et al. Osteoprotegerin: A Novel Secreted Protein Involved in the Regulation of Bone Density. Cell 1997 89, 309-319)。組換えOPGタンパク質の静脈内注射、およびOPG(-/-)マウスにおけるOPGのトランスジェニック性過剰発現はいずれも、OPG欠損マウスで観察される骨粗鬆症性の骨表現型を効果的に救済する。Min, H., et al., Osteoprotegerin reverses osteoporosis by inhibiting endosteal osteoclasts and prevents vascular calcification by blocking a process resembling osteoclastogenesis. J Exp Med 2000 192, 463-474を参照。
最近、同化促進アプローチ、例えば、骨形成タンパク質(BMP)の、または副甲状腺ホルモンのパルス状IV注入投与の使用への関心が急速に高まっている。これらの治療戦略は大いに有望であり、BMPの初期評価は期待の持てるものである。しかし、これらの治療アプローチに、骨の過成長、骨棘、異所性骨、血管石灰化またはさらには新生物のリスクがないわけではない。
最近の1件の小規模な臨床試験では、RANKLに対するヒトモノクローナル抗体の単回注射が、骨代謝回転マーカーを最長6カ月間にわたって低下させることが示されている(Bekker, P. J., et al., A single-dose placebo-controlled study of AMG 162, a fully human monoclonal antibody to RANKL, in postmenopausal women. J Bone Miner Res 2004 19, 1059-1066)。ヒトモノクローナル坑腫瘍壊死因子(TNF)抗体であるアダリムマブ(Humira(登録商標))は、関節リウマチの症状および徴候を効果的に軽減し、放射線検査で認められるびらん性関節変化の進行を予防する。
大部分が男性の退役軍人である大規模コホートの1件の試験では、スタチンの使用に伴って、脂質低下療法を行わない場合と比較して骨折リスクの36%の低下がみられ、他の脂質低下治療法と比較した場合には32%のリスク低下がみられた。スタチン系薬剤と、微小血管機能の改善を介した炎症軽減および新骨成長の促進を含む骨の健康状態との間の関連を説明するために、いくつかの生物学的機序が提唱されている(Scranton, R.E. (2005). Statin use and fracture risk: study of a US veterans population. Arch. Intern. Med. 165: 2007-2012)。
オステオプロテジェリンは破骨細胞の形成、機能および生存の阻害によって骨吸収を防止するタンパク質であり、これらの活性のために、組換えOPGは、骨粗鬆症などの慢性的な骨吸収疾患の治療のための魅力ある薬剤候補となっている。遺伝子治療は、抗吸収性タンパク質の遺伝子を送達することによって長期的治療を実現する可能性がある。OPGはアデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスにより、いずれもOPGのみまたはIgG Fc鎖との融合タンパク質をコードするDNAとして送達されている。rAAV-OPG-IRES-EGFPのインビボ投与は、注射部位での筋細胞の検出可能な形質導入および注射2日後の血清OPG発現レベルの有意な増加をもたらし、骨折リモデリングの低下も伴うが、治癒中の骨折の構造強度に対してはほとんど影響を及ぼさなかった。
ある好ましい態様において、本発明は、骨の損失を伴う骨病状の治療のための組成物および方法を提供する。好ましい態様において、本発明は、オステオプロテジェリン反応性病状の治療のための組成物および方法を提供する。好ましい態様において、治療は、本発明の組成物および方法を用いた経口投与による、オステオプロテジェリンまたはその機能的等価物のマクロファージ標的指向性発現によって媒介される。好ましい態様において、オステオプロテジェリンまたはその機能的等価物を発現するプラスミドDNAは、酵母グルカン粒子(YGP)または酵母グルカン-マンナン粒子(YGMP)を含む組成物中に、カチオン性ポリマー-DNAナノ複合体の形態で組み入れられる。これらのYGP-DNA微粒子およびYGMP-DNA微粒子は、粒子表面のグルカンおよびマンナン多糖に対する糖質受容体の結合を介した組織、粘膜および腸管付属リンパ組織(GALT)のマクロファージへの受容体媒介性取込みにより、全身的、粘膜的および経口的な生物学的利用能を有する。食作用を受けると粒子はエンドソーム区画に飲み込まれ、そこでカチオン性ポリマーがDNAを放出し、エンドソームを膨張させてDNAを細胞質中に放出させる。YGP-DNA製剤およびYGMP-DNA製剤への添加剤の組入れは、エンドソームDNA放出および核取込みを促進する。
酵母細胞壁粒子を送達媒体として用いるOPG遺伝子治療
好ましい態様において、本発明は、低骨密度および骨粗鬆症の治療法の現在の限界を克服するための、ヒトオステオプロテジェリンをコードするDNAを含むミクロンサイズの酵母細胞壁粒子の経口投与のための組成物および方法を提供する。好ましい態様において、骨中のマクロファージおよび破骨細胞におけるオステオプロテジェリンの有効な発現がみられる。
「対象」とは、哺乳動物および非哺乳動物を意味する。「哺乳動物」とは、ヒト、チンパンジーおよび他の無尾猿(ape)および有尾猿(monkey)種などの非ヒト霊長動物;ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギおよびブタなどの家畜;ウサギ、イヌおよびネコなどのペット(domestic animal);ラット、マウスおよびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物などを非限定的に含む、哺乳綱の任意のメンバーを意味する。非哺乳動物の例には、鳥類などが非限定的に含まれる。「対象」という用語は、特定の年齢または性別を表さない。
ペイロード捕捉分子は、好ましくは、薬学的に許容される添加剤である。ペイロードおよび捕捉分子はいずれも溶媒系の中に可溶性である;溶媒系は、酵母細胞粒子糖質マトリックスを通して吸収されて、ペイロードおよび捕捉ポリマーの吸収を可能にしなければならない。ペイロードおよび捕捉分子は水溶性であることが好ましい。好ましい態様において、捕捉分子は生分解性である。
本発明の微粒子送達系は、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、siRNA、酵素RNA、および発現ベクターを含む組換えDNA構築物などの核酸を非限定的に含むペイロード分子のインビボまたはインビトロにおける送達のために有用である。
ある態様において、タンパク質ペイロード分子は抗体である。本明細書で用いる場合、「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(Mab)という用語は、無傷の分子、ならびにタンパク質と特異的に結合しうる抗体断片(例えば、Fab断片およびF(ab')2断片など)を含むことを意味する。Fab断片およびF(ab')2断片は、無傷の抗体のFc断片を欠いており、循環血中からより急速に消失し、無傷の抗体よりも非特異的組織結合性が低い可能性がある。したがって、これらの断片が好ましく、Fabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物も同様である。さらに、本発明の抗体にはキメラ抗体、一本鎖抗体およびヒト化抗体も含まれる。
ヒトゲノムプロジェクトによって、疾患の遺伝的基盤に関する本発明者らの知識が増加した。全般については、http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/assist.shtmlを参照のこと。好ましい態様において、本発明は、遺伝性障害または遺伝要素を有する病状の治療のための組成物および方法を提供する。さらなる好ましい態様において、本発明は、遺伝性障害または遺伝要素を有する病状の治療用の医薬の製造のために有用な組成物を提供する。
投与の経路には、経口的、口腔内、舌下、肺、経皮的、経粘膜的、ならびに皮下、腹腔内、静脈内および筋肉内注射が非限定的に含まれる。好ましい投与の経路は、経口的、口腔内、舌下、肺および経粘膜的である。
骨減少性C57Bl/6Jマウス
ヒト集団におけるばらつきは最大骨塩密度および骨格量の著しい違いに結び付いており、これらの違いの70%ほどが遺伝的差異を原因とする。驚くことではないが、最大骨塩密度と骨粗鬆症のリスクとの間には逆相関関係がある。骨塩密度、機械的強度および骨の質的パラメーターもまた、マウスの異なる近交系の間で極めて著しい違いがあり、これはこのような11種の系統の表現型の綿密な比較によって明らかになっている(Turner, C. H., et al., (2001) Variation in bone biomechanical properties, microstructure, and density in BXH recombinant inbred mice. J Bone Miner Res 16, 206-213;Beamer, W. G., et al., (1996). Genetic variability in adult bone density among inbred系統s of mice. Bone 18, 397-403)。これらの違いの遺伝的基盤は調べられており、骨格の成長および維持の遺伝的制御には数多くの遺伝子座が必要であること、またさらに、脊椎および肢などの別々の骨格部位での骨量は、別々の遺伝因子に影響されることが明白になっている。全体的にみて、調べられた系統の中で最も低い骨密度、最も低い骨梁体積分率、および最も薄い皮質骨がみられたのはC57Bl/6J(B6)系統であり、最も高かったのはC3H/HEJ系統であった。B6の総大腿骨骨塩密度はC3H/HEJ(C3H)の66%未満であり、一方、骨長および総体質量に有意な違いはなかった。さらなる研究により、インビボにおける骨形成および骨塩付着の速度として、ならびにインビトロにおけるアルカリホスファターゼ活性および石灰化結節形成速度として測定した骨芽細胞活性も、B6の方がC3Hに比して低いことが示された(Sheng, M. H., et al., (2004). In vivo and in vitro evidence that the high osteoblastic activity in C3H/HeJ mice compared to C57BL/6J mice is intrinsic to bone cells. Bone 35, 711-719)。したがって、B6系統は、全身性骨減少症に対する有用かつ十分に特徴決定されたモデルである。この種の成体低骨量によって骨粗鬆症のリスクが最も大きいヒト集団も同定されるので、B6系統は治療的および/または予防的な戦略を検証するための適切なモデルとなる。
卵巣切除(OVX)マウスは、閉経後骨粗鬆症を模した低骨量を研究するための、十分に確立され広く利用されているもう1つのモデルである。若齢(典型的には、9〜16週齡)成体雌性マウスからの卵巣の除去は、破骨細胞性骨吸収の促進のために数週間以内で再現性のある骨粗鬆症を引き起こす。低骨密度は最も多くの場合、大腿骨または脛骨のいずれかの骨塩密度として、骨体積/総体積ならびに骨梁の幅および数のpQCT評価とともに測定される。骨表面当たりの破骨細胞および骨芽細胞が実験群間で異なるか否かを判定するために組織形態計測的評価を用いることもできる。このモデルを用いた最近の一例では、9週時点で実施したOVXから3週間後に、骨塩密度が10%以上低下し、骨体積/総体積(BV/TV)がおおよそ40%低下し、骨梁幅が10%以上減少し、骨梁数が30%以上減少した(Idris, A. I., et al., (2005) Regulation of bone mass, bone loss and osteoclast activity by cannabinoid receptors. Nat Med 11: 774-779)。最近のもう1つの研究では、OVXマウスモデルが、アデノウイルスOPG遺伝子治療の有効性を評価するために用いられた(Kostenuik, P.J., et al., (2004) Gene therapy with human recombinant osteoprotegerin reverses established osteopenia in ovariectomized mice. Bone 34:656-664)。このOVXマウスモデルは、低骨密度および治療介入の効果に関する多くの研究で同様に役立っている。したがって、OVXマウスは、hOPGを骨髄に送達するために経口摂取された、hOPG-発現構築物が装入された酵母細胞壁粒子の有効性を検証するための許容されるモデルである。
ゴーシェ病では骨格系の合併症が高頻度に観察されるが、それらは治療が困難であることが多い。ヒトゴーシェ表現型の長期生存マウスモデルは、新たな治療戦略を開発するために有意義である(Xu YH, et al., (1996) Turnover and distribution of intravenously administered mannose-terminated human acid beta-glucosidase in murine and human tissues. Pediatr Res. 39(2):313-22;Willemsen R, et al. (1995) A biochemical and ultrastructural evaluation of the type 2 Gaucher mouse. Mol Chem Neuropathol. 24(2-3):179-92)。同じ突然変異を有するゴーシェ病患者に類似した、骨減少症を含む生化学的および表現型上の異常を有するこれらの長期生存性L444Pゴーシェマウスが入手可能であることは、ゴーシェ病において観察される骨格病態の是正における経口投与による遺伝子治療の有効性を検証するための手段を与える(Hermann, G., et al., (1997) Gaucher disease: assessment of skeletal involvement and therapeutic responses to enzyme replacement. Skeletal Radiol 26:687-696)。マウスグルコセレブロシダーゼにおいてアミノ酸置換が行われて正常同腹仔における酵素活性レベルの半分未満まで内因性GC発現が有意に減少した、ゴーシェ病のトランスジェニックマウスモデルを用いた。マウス試料におけるグルコセレブロシダーゼ活性のアッセイは、蛍光標識基質である4-メチルウンベレフェリル-グルコピラノシド(4MUGP)を用いて行った。より軽症のゴーシェ病患者に認められるものに類似した点突然変異を、PCR突然変異誘発法によってマウスグルコセレブロシダーゼのゲノムクローンに導入した。これらの改変クローンを適切なベクターに挿入して、電気穿孔法によってRW4マウス胚性幹(ES)細胞にトランスフェクトした。グルコセレブロシダーゼ遺伝子の一方の対立遺伝子中に正しいターゲティングを受けた突然変異を含むESクローンを、C57BL/6マウス由来の胚盤胞に標準的な手法を用いて注入し、その後に仮親マウスに移した。これらの注入による雄性子孫をC57BL/6雌に対して試験交配させ、その後代を突然変異型グルコセレブロシダーゼ対立遺伝子の伝達に関してPCRおよびサザン分析によってスクリーニングした。
OPGの標的破壊に関してホモ接合性であるマウスは、骨粗鬆症の発生病理を研究するために有意義である上、低骨密度に対する新たな治療法の開発のための重要な手段でもある。重症の骨粗鬆症に典型的なように、8週齡よりも高齢のホモ接合性マウスでは、野生型同腹仔のそれと比較して、大腿骨における骨梁が有意に少なく、骨塩密度、乾燥重量、骨塩含量、硬度および強度が低い。OPG-/-ホモ接合性マウスで観察される高度の骨異常は、破骨細胞数の顕著な増加を伴う。野生型またはヘテロ接合性同腹仔とは対照的に、OPG-/-マウスでは骨梁および皮質骨の全体にわたって大量の破骨細胞が存在する。OPG-/-の骨では、野生型の親系統C57BL/6Jマウスと比較して、骨端の石灰化前線におけるTRAPおよびオステオポンチン染色の両方、さらにはカルセインも増加していることが報告されている。13週齡OPG-/-マウスでは、尾部、遠位大腿骨および脛骨の放射線濃度が低下している。OPG-/-マウスのマイクロCTは、骨梁の欠如、骨端線の破壊および異常な大腿骨皮質骨を示す。OPG-/-マウスで見られる骨異常は、重症の骨粗鬆症に典型的である。
J774細胞株を用いた予備的研究を、骨髄単球、マクロファージおよび分化中の破骨細胞におけるhOPG発現を評価するために初代マウス骨髄細胞培養物へと拡張する。YCWPは効率的に貪食され、細胞の生存および分化に対する明白な有害作用を伴うことなしに、破骨細胞前駆細胞によって保持される。破骨細胞の分化は以下の通りに実施する。2〜4週齡の正常マウスから新鮮な骨髄を入手する。単核細胞をHistopaque 1077(Sigma)による勾配遠心分離法によって分離する。続いて細胞を洗浄し、10%FBS(Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY)および1%抗生物質/抗真菌剤(Sigma)を加えたα-MEM中に再懸濁して、75cm2フラスコ(Coming)内で3×105個/mlの密度で24時間インキュベートし、その後に穏やかな撹拌によって非付着細胞を採取する。この細胞画分を、破骨細胞分化培地:10%FBS、抗真菌剤/抗生物質溶液(Sigma)、75ng/mLのCSF-1(Chiron)および30ng/mLの組換えマウスRANKリガンド(R&D Systems)を含むα-MEM中にて、1ウェル当たりおおよそ5×105個の密度で12ウェルプレートに(または比例させて他の培養容器に対して)プレーティングする。培地を隔日で交換しながら、培養物を95%空気および5%CO2の加湿雰囲気中にて37℃で6日間インキュベートすると、その時点で多数の大きな多核細胞を観察することができる。
大腿骨の総骨塩密度および体積骨塩密度を、Stratec XCT 960M装置を用いる末梢骨定量コンピュータ断層法(pQCT)によって測定する。非骨組織を他の組織と区別しさらに皮質骨を低密度骨と区別するため、ならびに総皮質幅を計算するための閾値は、この種の骨減少性マウスに関して以前に記載された通りにする。骨微細構造は、同じく記載された通りに(Turner et al., 2001)、卓上マイクロCT装置(iCT 20, Scanco Medical, Basserdorf, Switzerland)を用いるマイクロCTによって評価する。得られるパラメーターは、骨体積密度、骨表面密度、骨梁数、骨梁幅、骨梁間隙および骨梁数である。組織学的検査を脛骨に対して行う。
組織中のヒトOPGの測定により、経口投与されたマクロファージ/破骨細胞を標的とする遺伝子治療がマウス組織におけるOPGの発現を引き起こす時間的経過およびレベルに関するデータが提供される。ELISA、ウエスタンブロット法およびRT qPCR測定は、転写物およびタンパク質の両方のレベルでの酵素復元に関する情報を提供する。免疫組織化学分析および電子顕微鏡検査分析は、組織中の破骨細胞集団の程度に関するデータを提供する。
マウス中の骨の種々の位置でのヒトOPGの測定により、マクロファージ/破骨細胞を標的とする遺伝子治療がOPG発現を引き起こす時間的経過およびレベルに関するデータが提供される。ELISA、ウエスタンブロット法およびRT qPCR測定は、転写物およびタンパク質の両方のレベルでのOPGに関する情報を提供すると考えられる。種々の骨位置由来の試料を用いた免疫組織化学分析および電子顕微鏡検査分析は、ヒトOPGを発現するマクロファージの数および位置に関するデータを提供する。
OPG遺伝子治療に起因する変化を検出するために、野生型および低骨密度マウスの臨床的状態を追跡する。マウスを神経学的異常、歩行異常および他の異常に関して観察する。マウスには適宜、行動試験および運動試験を行う。これらのマウスに関する生理的検査には、ルーチン的な血液生化学検査および血液学的検査が含まれる。
実験の組織試料採取の時点で、承認されたプロトコールを用いて動物を安楽死させ、組織試料を全臓器(例えば、骨、骨髄、脾臓、胸腺、肝臓、肺、心臓、腎臓、脳、その他)から収集し、凍結するか分析のために固定する。組織をヒトOPGの発現に関して分析する。アッセイには、ELISA、リアルタイムqPCR、サザンブロット法、ノーザンブロット法および免疫組織化学が含まれる。
組織を、0.1%Triton X-100を含むリン酸緩衝食塩水(pH 7.5)中で均質化する(20%wt/vol)。組織ホモジネートを40℃、48,000×gで20分間遠心分離し、上清を-20℃で保存する。タンパク質含有量を、Bradfordの方法によって決定する。
組織培養細胞においてインビトロで産生されたOPGは培地中に分泌されるため、細胞および培地の両方をOPGに関してアッセイする。ヒトオステオプロテジェリンELISAは、血清、血漿、滑膜液または組織培養液におけるヒトオステオプロテジェリンの定量的測定を提供する、ビオチン標識抗体を利用したサンドイッチ酵素イムノアッセイである(Bio Vendor LLC, Candler, NC)。このヒトオステオプロテジェリンELISAでは、標準物質または試料を、マイクロタイターウェル内にコーティングされたマウスモノクローナル抗ヒトオステオプロテジェリン抗体とともにインキュベートする。1時間のインキュベーションおよび洗浄の後に、ビオチン標識したポリクローナル抗ヒトオステオプロテジェリン抗体を添加し、捕捉されたOPGとともにインキュベートする。十分な洗浄の後に、ストレプトアビジン・西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物を添加する。30分間のインキュベーションおよび最終洗浄段階の後に、結合した結合物を基質であるH2O2-テトラメチルベンジジンと反応させる。酸性溶液の添加によって反応を停止させ、得られた黄色生成物の吸光度を450nmで測定する。この吸光度はオステオプロテジェリンの濃度に比例する。未知の試料の濃度は、吸光度の値をオステオプロテジェリン標準物質の濃度に対してプロットすることによって作成した標準曲線を用いて決定する。検出限界(ブランクの平均吸光度+ブランクの吸光度の3標準誤差よりも高い吸光度を与えるOPGの濃度と定義される)は、0.4pmol/試料1リットルよりも良好である。組換えマウスOPGとの交差反応はおよそ1%未満であり、組換えヒトCD40、組換えヒトsTNF RIまたはsTNF RIIとの交差反応は0.06%に過ぎない。ヒトオステオプロテジェリンおよびヒトIgGのFcドメインからなる組換えキメラタンパク質(OPG/Fc)を標準物質として用いる。成熟OPG/Fcは、ジスルフィド結合したホモ二量体タンパク質である。各モノマーは、成熟OPG由来の380残基、ならびにFcタンパク質およびリンカー由来の243残基を含む。グリコシル化の結果として、OPG/Fcは還元条件下のSDS-PAGEでは77kDaタンパク質(以前はこれは100kDaと称していた)として移動する。
提唱されたインビボおよびインビボの遺伝子移入実験におけるヒトOPGの増加を判定するために、プロテインG免疫沈降キットを製造元のプロトコール(Sigma)に従って用いて、ヒトOPG細胞および組織抽出物を精製する。ヒトOPGに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をこの免疫沈降手順に従って用い、続いてウエスタンブロット分析を行う。
ルーチン的な化学検査、血液学検査ならびにOPG ELISAを含む他のアッセイのために、マウス血液をマウスの尾静脈または後眼窩の出血によって入手する。
ルーチン的な組織学的評価のために、脛骨を冷4%パラホルムアミド中で一晩固定し、EDTA中で脱灰して、その後にパラフィン中に包埋する。下記のように、切片をH&Eもしくはトルイジンブルーで染色するか、または免疫組織化学実験に用いる。骨塩形成の評価のために、脱灰されていないパラフィンブロックをクリオトームで切り出し、フォンコッサ染色した切片に対して、デジタル顕微鏡写真および画像解析ソフトウエア(ZeissのAxiovisionおよびOsteomeasure)を用いて、脛骨骨幹端における石灰化骨の形態計測学的測定を行う。一部の切片を、類骨と石灰化骨基質を対比して可視化するためにマッソントリクロムにより染色する。
組織学的分析のための非骨格組織試料を10%ホルマリン中で一晩固定し、PBS中ですすぎ洗いして、エタノールの強度を段階的に高めながら脱水して清浄化し、パラフィン中に包埋し、5ミクロン切片として切り出す。連続切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色する。
野生型および低骨密度のマウスを安楽死させ、4%パラホルムアミドを含むリン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4中で採取した組織を一晩固定し、パラフィン中に包埋する。免疫組織化学検査のための組織切片をクリオスタット(5〜10ミクロン)で切り出し、スライドガラスに乗せて脱パラフィン処理および再水和を行う。内因性ペルオキシダーゼを阻害するために、切片を5%H2O2のPBS溶液で5分間処理する。非特異的結合を防止するための1%ウシ血清アルブミン/PBS中での60分間のインキュベーションの後に、ヒトOPGに特異的なポリクローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体、ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次血清またはヤギ抗マウス二次血清およびABC複合体(Vectastain Eliteキット、Vector)を用いて切片を処理し、製造元のプロトコールに従ってDAB発色団により可視化する。CCDカメラを装着したZeiss顕微鏡およびScanalyticsソフトウエアを用いて画像を取り込む。一次抗体を用いない、または免疫前血清を用いる免疫染色を、陰性対照として用いる。
電子顕微鏡分析は、OPG発現の細胞性供給源のさらなる説明、ならびにOPG遺伝子治療に起因する破骨細胞構造の変化の特性決定を可能にする。ルーチン的な電子顕微鏡検査のための組織試料はグルタルアルデヒド中に固定する。免疫電子顕微鏡検査のためには試料を以前に記載された通りに固定し、抗ヒトOPG抗体とのインキュベーションによって免疫染色する。
インサイチューハイブリダイゼーション試験は、組織中でのヒトOPG発現の程度および持続時間の決定の一部として、処理および非処理マウスに対して1、3、6および12カ月の時点で行われる。マウスに麻酔を施し、次に生理的食塩水で、続いて4%パラホルムアミドのPBS溶液によって灌流を行う。骨組織の処理は、Marks, Jr., S.C., et al., (1999) Facial development and type III collagen RNA expression: concurrent repression in the osteopetrotic (toothless, tl) rat and rescue after treatment with colony-stimulating factor-l. Dev. Dyn. 215: 117-125によって記載された通りである。他の組織は摘出して、4%パラホルムアミドのPBS溶液中に1時間浸漬し、パラフィン包埋して、5μm切片をスライド上にマウントする。切片を脱パラフィン処理し、再水和させ、脱水して乾燥させる。インサイチュー分析のためのジゴキシゲニン標識したセンスおよびアンチセンスのリボプローブは、マウスまたはヒトのOPG cDNAの600〜700bpのサブクローニング断片から作製する。AmpliScribeTM T7高収量転写ジゴキシゲニンRNA標識キット(Epicentre, Inc.)を以前の記載の通りに用いる(Odgren, P.A., et al., (2003) Production of high-activity digoxigenin-labeled riboprobes for in-situ hybridization using the AmpliScribe T7 high yield transcription kit. Epicentre Forum 10: 6-7)。パラフィン中に包埋された組織切片を脱パラフィン処理し、ハイブリダイゼーションミックス(50%ホルムアミド、5×SSC、10%デキストラン硫酸、1×デンハルト液、1μl/mlのRNAアーゼ阻害剤および500μg/mlのtRNA)中の1:200希釈DIG標識プローブとハイブリダイズさせ、アルカリホスファターゼを結合させた抗ジゴキシゲニン抗体および比色基質NBT/BCIP(ニトロブルーテトラゾリウム/5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸)をプロトコール(Roche)を用いて検出する。対照ハイブリダイゼーションは、切片をRNaseA(100ug/ml)により37℃で30分間処理し、その後にアンチセンスプローブとのハイブリダイゼーションを行うことによって行う。
インビトロの細胞および培地においてならびにインビボのマウス組織において遺伝子移入がヒトOPGの発現を引き起こすことを確かめるために、ウエスタンブロット分析を行うことができる。試料を上記の通りに抽出する。電気泳動の前に、試料のタンパク質濃度を測定する(BioRadタンパク質アッセイ)。試料(25μgの全タンパク質)を12% SDS-PAGEで泳動させ、エレクトロブロット法によってニトロセルロース膜に移行させ、続いて、0.1%ウシ血清アルブミンのPBS溶液中にて、RTで60分間インキュベートする。膜を、0.1%ウシ血清アルブミンのPBS溶液中にて、ヒトOPGに対する適切な希釈度の抗血清とともに4℃で一晩インキュベートする。0.05% Tween 20を含むPBSによる5分間ずつの3回の洗浄の後に、Western Breezeキット(Invitrogen)を製造元のプロトコールに従って用いてブロットを処理する。化学発光はXAR-5フィルム(Kodak)を用いて検出する。
血液からのRNAの抽出は、QAIAmp RNA血液ミニキットを用いて行う。試料をRNase非含有DNaseで処理する。RNAを凍結組織からRNAeasy MiniまたはMicroキット中の動物組織用プロトコールを用いて抽出する。組織を採取し、-80℃で保存して、液体窒素下で粉砕する。溶解緩衝液を粉砕組織に添加した後に、溶解産物をQlAshredderカラムを用いて均質化し、RNase非含有DNase処理を含むQiagenプロトコールを推奨された通りに実行する。凍結組織をRNAlater-ICEを用いて転換させ、同様に処理する。28Sおよび18S rRNAバンドの完全性を、それぞれの全RNA試料の無傷性を決定するために用いる。
リアルタイムqPCR発現の測定は、Qiagen RNAeasyキットを製造元の指示に従って用いて単離した全RNAに対して、ABI 7900HT装置を用いて行われる。200ngの全RNAからのcDNA合成の前に、ゲノムDNAを除去するためにDNaseI処理を用いる。ランダムヘキサマーを、Qiagen Sensiscript逆転写酵素を製造元のプロトコールに従って用いる20μl中での第1鎖合成を惹起するために用いる。それぞれのTaqManアッセイを、転写レベルを測定するために3回ずつ行う。これらの測定は、経口投与による遺伝子治療後のヒトおよびマウスのOPG転写の時間的経過およびレベルに関するデータを提供する。
製造元のプロトコールに従ってRNAeasy(Qiagen)を用いて、野生型ならびに処理および非処理マウス組織から全RNAを単離する。8マイクログラムの全RNAを0.8%アガロースホルムアミドゲルの各レーンに対してローディングし、電気泳動性に分離されたRNAをナイロン膜(Hybond N, Amersham)に移行させる。ハイブリダイゼーションをExpressHyb溶液(BD Clontech)中にて68℃で1時間行い、洗浄を行って、オートラジオグラフィーを製造元のプロトコールに従って行う。マウスまたはヒトのOPGに特有のPCR断片に由来する32P標識プローブをハイブリダイゼーションのために用い、32P標識したα-アクチンおよび/またはGAPDHプローブを試料間の標準化のために用いる。
レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、細胞の位置、特定の細胞種(マクロファージ-対-破骨細胞など)の内部でのヒトOPGの発現の程度および持続時間に関する、分子レベルでの追加的なデータを入手するために用いられる。これらの検討はPixCell Ile LCM System(Arcturus Inc.)を用いて行われ、特定の組織標的からのRNAおよび/またはDNAの捕捉、単離、増幅および定量に対するLCMの広範囲にわたる経験を基にしている。LCM法は、凍結された、ホルマリン固定されてパラフィン包埋された、および蛍光標識された切片を含む、多岐にわたるスライド固定法と適合性がある。LCMは、DNAおよび/またはRNA分析のための試料を入手する目的で、関心対象の細胞集団を同定してそこに導くために用いられる。手短に述べると、PixCell Ile LCM Systemを用いて細胞を捕捉して生体分子を回収するための工程は、関心対象の細胞の位置を特定し、その後にLCM Capを標的領域に配置することを含む。キャップを通したレーザーのパルス照射によって、熱可塑性フィルムは、キャップと組織の間のギャップを架橋して標的細胞に付着する薄い突起を形成する。キャップを挙上すると、今やキャップに付着している標的細胞が取り出され、その後、捕捉された細胞を、さらなる処理のために0.5mlのDNase/RNase非含有エッペンドルフ微量遠心分離管の中に溶出させる。
LCM捕捉された細胞を伴うCapSure Macro LCM Capを、50ulのプロテイナーゼK抽出溶液を含む0.5ml微量遠心分離管の上に配置する。Cap Sure Capが挿入された微量遠心分離管を転置して、容量50μlのプロテイナーゼK溶液がキャップ集成体(assembly)の内部表面を確実に完全に覆うように穏やかに振盪する。65℃でのインキュベーション後に、キャップ-管の集成体を1,000×gで1分間遠心分離する。CapSure LCMキャップを除去して、抽出物を含む微量遠心分離管をプロテイナーゼKを失活させるために95℃で10分間加熱し、室温まで冷却して、PCR分析のために用いる。
手短に述べると、CapSure HS LCM Cap上に捕捉された細胞から、以下の通りにPicoPure RNA Isolation Kitプロトコールを用いてRNAを調製する。10マイクロリットルの抽出緩衝液を、CapSure-ExtracSure集成体の緩衝液ウェルに添加する。0.5mL微量遠心分離管をCapSure-ExtracSure集成体の上に配置し、集成体全体を42℃で30分間インキュベートする。CapSure-ExtracSure集成物を有する遠心分離管を800×gで2分間遠心分離することによって、細胞抽出物を収集する。続いて抽出物を直ちにRNA単離のために用いるか(以下を参照)、または-80℃で保存する。
データ解析は、SigmaPlot、SAS(SAS Institute Inc., Cary, NC)、NIH ImageおよびSPSSソフトウエア(SPSS Inc., Chicago, IL)を含む統計分析ソフトウエアパッケージを用い、一般的には、一般的な線形回帰およびスチューデントt検定を分析のために用いて行う。
全グルカン粒子(WGP、Lot W0282)は、Alpha-Beta Technologyから以前に入手した。一般に、全グルカン粒子は、酵母細胞壁からのアルカリ不溶性グルカン画分の抽出および精製によって酵母細胞から調製される。酵母細胞壁を破壊することなく酵母細胞を細胞のタンパク質および細胞内部分を消化する水酸化物の水溶液で処理し、有意なタンパク質混入がなく、かつβ(1-6)およびβ(1-3)結合グルカンの改変されていない細胞壁構造を実質的に有するグルカン壁成分が残るようにする。酵母細胞(S.セレビシエ(S. cerevisae)R4株)を、最小培地中にてフェドバッチ発酵条件下で中間対数期(midlog phase)になるまで増殖させた。細胞(乾燥細胞重量が約90g/L)を2000rpmで10分間のバッチ遠心分離によって採取した。続いて細胞を蒸留水で1回洗浄し、1リットルの1M NaOH中に再懸濁して90℃まで加熱した。細胞懸濁液をこの温度で1時間激しく撹拌した。細胞壁を含む不溶性材料を2000rpmで10分間の遠心分離によって回収した。続いてこの材料を1リットルの1M NaOH中に懸濁して、再び90℃まで加熱した。懸濁液をこの温度で1時間激しく撹拌した。続いて懸濁液を室温まで冷却し、抽出をさらに16時間続けた。不溶性残留物を2000rpmで10分間の遠心分離によって回収した。この材料を最後に、HClでpH 4.5にした水1リットル中にて75℃で1時間にわたり抽出した。不溶性残留物を遠心分離によって回収し、200ミリリットルの水で3回、200ミリリットルのイソプロパノールで4回、さらに200ミリリットルのアセトンで2回洗浄した。その結果得られたスラリーをガラス皿に入れて、減圧下にて55℃で乾燥させたところ、7.7gの白色微粉末が生じた。
S.セレビシエ(100gのFleishmansパン酵母)を1リットルの1M NaOH中に懸濁して、55℃に加熱した。細胞懸濁液をこの温度で1時間混合した。細胞壁を含む不溶性材料を、2000rpmでの10分間の遠心分離によって回収した。続いてこの材料を水1リットル中に懸濁し、HClでpH 4〜5にした上で、55℃で1時間インキュベートした。不溶性残留物を遠心分離によって回収し、1000ミリリットルの水で1回、200ミリリットルの脱水イソプロパノールで4回、さらに200ミリリットルのアセトンで2回洗浄した。その結果得られたスラリーをガラス皿に入れて室温で乾燥させたところ、12.4gのわずかに淡白色の微粉末が生じた。
S.セレビシエ(75gのSAF-マンナン)を水1リットル中に懸濁して、1M NaOHでpH 12〜12.5に調整した上で、55℃に加熱した。細胞懸濁液をこの温度で1時間混合した。細胞壁を含む不溶性材料を2000rpmでの10分間の遠心分離によって回収した。続いてこの材料を水1リットル中に懸濁し、HClでpH 4〜5にした上で、55℃で1時間インキュベートした。不溶性残留物を遠心分離によって回収し、1000ミリリットルの水で1回、200ミリリットルの脱水イソプロパノールで4回、さらに200ミリリットルのアセトンで2回洗浄した。その結果得られたスラリーをガラス皿に入れて室温で乾燥させたところ、15.6gのわずかに淡白色の微粉末が生じた。
American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)から入手した培養物に由来する酵母細胞(ロドトルラ属(Rhodotorula sp.))を、YPD中にて30℃で、定常期になるまで有酸素下で増殖させた。ATCCから入手可能なロドトルラ属培養物には、第886号、第917号、第9336号、第18101号、第20254号、第20837号および第28983号が含まれる。細胞(1L)を2000rpmでの10分間のバッチ遠心分離によって採取した。続いて細胞を蒸留水で1回洗浄し、その後HClでpH 4.5にした水中に再懸濁し、75℃で1時間おいた。細胞壁を含む不溶性材料を2000rpmでの10分間の遠心分離によって回収した。その後この材料を1リットルの1M NaOH中に懸濁して、1時間にわたり90℃に加熱した。続いて懸濁液を室温まで冷却して、抽出をさらに16時間続けた。不溶性残留物を2000rpmでの15分間の遠心分離によって回収し、1000ミリリットルの水で2回、200ミリリットルのイソプロパノールで4回、さらに200ミリリットルのアセトンで2回洗浄した。その結果得られたスラリーをガラス皿に入れて室温で乾燥させたところ、2.7gの淡褐色の微粉末が生じた。
*結果は乾燥分析材料の%w/wとして報告されている
**結果は%w/w糖質として報告されている
WGP‐全グルカン粒子‐先行技術;YGMP‐酵母グルカン-マンナン粒子;YGP‐酵母グルカン粒子;YCP‐酵母キチン粒子
キトサンが装入されたYGP粒子の調製
カチオン性捕捉ポリマーであるキトサンと共にYGP粒子を調製した。1%w/vキトサン溶液を、高分子量(HMW)キトサン(ほぼ70,000Mw、Sigma Chemical St. Louis, Mo)または低分子量(HMW)キトサン(ほぼ10,000Mw、Sigma Chemical St. Louis, Mo)のいずれかを用いて0.1M酢酸中で調製した。1%w/vのHMWおよびLMWキトサン溶液の両方を0.1M酢酸中で調製した。4mlのHMWまたはLMWのキトサン溶液を2gのYGPを有する50mlコニカル遠心分離管内に添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。この混合物を室温で1時間インキュベートして、液体を吸収させた。NaOH(40ml、0.1M)を各チューブに添加し、直ちにボルテックス処理して、キトサンをYGP内部に沈着させた。YGP:キトサン懸濁液を18ゲージ針に通過させ、YGP:キトサン粒子の微細懸濁液を作製した。YGP:キトサン粒子を遠心分離(2,000rpmで10分間)によって収集し、その後に、上清のpHが7〜8になるまでペレットを脱イオン水で洗浄した。続いてYGP:キトサン粒子をペレット体積の2倍のイソプロパノールで4回洗浄し、続いてペレット体積の2倍のアセトンで2回洗浄した。続いてYGP:キトサン粒子をフード内で室温で乾燥させた。この手順により、1.2g のYGP:LMWキトサン粒子および1.4gのYGP:HMWキトサン粒子が得られた。
専売されている水溶性のカチオン性ポリマートランスフェクション試薬である生分解性カチオン性捕捉ポリマー、CytoPure(商標)(Qbiogene, Inc., CA)とともにYGP粒子を調製した。20μlのCytoPure(商標)を0.5mlの脱イオン水で希釈し、0.5gのYGPを有する50mlコニカル遠心分離管内に添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。この混合物を4℃で15分間インキュベートして、液体を吸収させた。25mlのエタノールを各チューブに添加し、直ちにボルテックス処理して、CytoPure(商標)をYGPの内部に沈着させた。YGP:CytoPure(商標)懸濁液を超音波処理して、YGP:CytoPure(商標)粒子の微細懸濁液を作製した。YGP:CytoPure(商標)粒子を遠心分離(2,000rpmで10分間)によって収集し、その後にペレットをペレット体積の2倍のイソプロパノールで4回洗浄し、続いてペレット体積の2倍のアセトンで2回洗浄した。続いてYGP:CytoPure(商標)粒子をフード内で室温で乾燥させた。この手順により、0.45gのYGP:CytoPure(商標)粒子が得られた。
カチオン性捕捉ポリマーとしてのポリエチレンイミン(PEI)とともにYGP粒子を調製した。2%w/vのPEI(ほぼ50,000Mw、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)水溶液の0.5mlアリコートを、0.5g YGPを有する50mlコニカル遠心分離管内に添加して、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。この混合物を室温で1時間インキュベートして、液体を吸収させた。25mlのエタノールを各チューブに添加し、直ちにボルテックス処理して、PEIをYGPの内部に沈着させた。YGP:PEI懸濁液を18ゲージ針に通過させ、YGP:PEI粒子の微細懸濁液を作製した。YGP:PEI粒子を遠心分離(2,000rpmで10分間)によって収集し、その後に、ペレットをペレット体積の2倍のイソプロパノールで4回洗浄し、続いてペレット体積の2倍のアセトンで2回洗浄した。続いてYGP:PEI粒子をフード内で室温で乾燥させた。この手順により、0.48gのYGP:PEI粒子が得られた。
アニオン性捕捉ポリマーとしてのアルギン酸塩(F200またはF200L、Multi-Kem Corp., Ridgefield, NJ)とともにYGP粒子を調製した。1%w/vのアルギン酸水溶液の2mlアリコートを、1gのYGPを有する50mlコニカル遠心分離管内に添加し、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。この混合物を室温で1時間インキュベートして、液体を吸収させた。混合物を40mlの1%w/v塩化カルシウム水溶液で希釈した。YGP:アルギン酸塩懸濁液を18ゲージ針に通過させ、YGP:アルギン酸塩粒子の微細懸濁液を作製した。YGP:アルギン酸塩粒子を遠心分離(2,000rpmで10分間)によって収集した。YGP:アルギン酸塩粒子をペレット体積の2倍のイソプロパノールで4回洗浄し、続いてペレット体積の2倍のアセトンで2回洗浄した。続いてYGP:アルギン酸塩粒子をフード内で室温で乾燥させた。この手順により、0.95gのYGP:F200アルギン酸塩粒子および0.86gのYGP:F200Lアルギン酸塩粒子が得られた。
捕捉ポリマーとしてのポリ-L-リジン(PLL)とともにYGP粒子およびYGMP粒子を調製した。1%w/vのPLL(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)水溶液の4mlアリコートを、1gのYGPまたはYGMPを有する50mlコニカル遠心分離管内に添加した。この混合物を55℃で30分間インキュベートして、液体を吸収させた。10mlのエタノールを各チューブに添加し、それを均質化して(Polytronホモジナイザー)、YGP:PLL粒子またはYGMP:PLL粒子の微細懸濁液を作製した。YGP:PLL粒子またはYGMP:PLL粒子を遠心分離(2,000rpmで10分間)によって収集した。YGP:PLLまたはYGMP:PLLをペレット体積の2倍のイソプロパノールで4回洗浄し、続いてペレット体積の2倍のアセトンで2回洗浄した。続いてYGP:PLL粒子またはYGMP:PLL粒子をフード内で室温で乾燥させた。この手順により、1.3gのYGP:PLL粒子および1.1gのYGMP:PLL粒子が得られた。顕微鏡による評価では、遊離PLL凝集物はなく、YGP:PLL粒子またはYGMP:PLL粒子のみが示された。
アニオン性捕捉ポリマーとしてのキサンタンとともにYGP粒子およびYGMP粒子を調製した。1%w/vのキサンタン水溶液の4mlアリコートを、粘性を低下させるために55℃に加熱して、1gのYGPまたはYGMPを有する50mlコニカル遠心分離管内に添加した。この混合物を55℃で30分間インキュベートした。10mlのエタノールを各チューブに添加し、それを均質化して(Polytronホモジナイザー)、YGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子の微細懸濁液を作製した。YGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子を遠心分離(2,000rpmで10分間)によって収集した。YGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子をペレット体積の2倍のイソプロパノールで4回洗浄し、続いてペレット体積の2倍のアセトンで2回洗浄した。続いてYGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子をフード内で室温で乾燥させた。この手順により、1.2gのYGP:キサンタン粒子および1.1gのYGMP:キサンタン粒子が得られた。顕微鏡による評価では、遊離キサンタン凝集物はなく、YGP:キサンタン粒子またはYGMP:キサンタン粒子のみが示された。
YGP中にペイロードを捕捉するための手段としての物理的封じ込めについて評価するために、YGP:アガロースを調製した。2%w/vアガロース(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含むTE溶液を調製して、50℃に冷却した。1mg/mlのサケ***DNAを含むTEの貯蔵溶液を希釈し、50℃のTE中または1%アガロース中で0.5mg/ml DNAにした。YGPの500mgアリコートを、500μlのDNAを含むTEまたは500μlのDNAを含むアガロースと50℃で混合し、混合物を50℃で1時間インキュベートした。続いてこの混合物を、アガロースを固化させるために冷蔵庫で1時間冷却した。1時間後に、10mlのTEを添加し、混合物を冷蔵庫内で一晩インキュベートした。続いて混合物を遠心分離し、260nmでの吸収によって上清中のDNAを測定した。適用したDNAの約80%超がYGP:アガロースによって保持され、これに対してYGP:TE対照によって保持されたのは1%未満であった。これらの結果は、アガロースが物理的封じ込めによってDNAをYGPの内部に効果的に捕捉することを示している。
YGP中にペイロードを捕捉するための手段としての物理的封じ込めについて評価するために、YGP:ポリアクリルアミドを調製した。1mg/mlのサケ***DNAを含むTEの貯蔵溶液を、TE中または30%ポリアクリルアミド/bis(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)中で0.5mg/ml DNAとなるように希釈した。各DNA混合物にTEMED(N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン)を添加し(5mlのDNA溶液に対して1μlのTEMED)、各溶液の2mlアリコートを1gのYGPに添加した。この生成物を混合して均一な懸濁液を形成させ、室温で3時間インキュベートした。3時間のインキュベーション後に、10mlのTEを添加し、混合物を冷蔵庫内で一晩インキュベートした。続いて混合物を遠心分離し、260nmでの吸光度によって上清中のDNAを測定した。適用したDNAのほぼ95%超がYGP:ポリアクリルアミドによって保持され、これに対してYGP:TE対照によって保持されたのは1%未満であった。これらの結果は、ポリアクリルアミドが、物理的封じ込めによってDNAをYGPの内部に捕捉するために用いるのに有効な捕捉ポリマーであることを示している。
治療用のペプチドもしくはタンパク質、ワクチン抗原、または他のペプチドもしくはタンパク質の保持、輸送および送達に対する、本発明の送達系の有用性を、ウシ胎仔血清の混合タンパク質を用いて評価した。用いた酵母細胞壁粒子は、上記の通りに調製したYGP、YGP-PEIおよびYGP-キトサンであった。貯蔵溶液は、45ng/μlのウシ胎仔血清(FCS)(Fetal Bovine Serum, JRH Biosciences, Lenexa, KS)、0.2%PEIのTE溶液(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、0.05Mリン酸緩衝液、pH 7.2(P緩衝液)および0.05Mリン酸緩衝液、pH 7.2、1M NaCl(P+塩類緩衝液)とした。
DNA捕捉を最適化するため、ならびにマウスマクロファージ由来の細胞株であるJ774細胞への取込みの後のDNA送達および放出について評価するために、蛍光プラスミドDNA組成物を含むGPを調製した。蛍光pUC19プラスミドDNAは、1mg/mlのpUC19 DNA溶液を含む0.1M炭酸緩衝液(pH 9.2)1mlを、1mg/mlのDTAFを含む10mM炭酸緩衝液(pH 9.2)の懸濁液100μlと混合することによって調製した。37℃での一晩のインキュベーションの後に、200μlの1M Tris-HCl、pH 8.3を添加して、室温で15分間インキュベートした。続いて100μlの1M NaClおよび3mlのエタノールを、DNAのエタノール沈殿のために添加した。-20℃で一晩保存した後に、エタノール沈殿物を10,000rpmでの15分間の遠心分離によって収集した。このエタノール沈殿物を上清が清澄化するまで70%エタノールで洗浄して、1mlのTE中に再懸濁した。
YGP:pIRESとともにインキュベートしたJ774マウスマクロファージによるEGFP発現
pIRESプラスミドDNAはこの実施例では蛍光標識されておらず、その代わりに、pIRESによってコードされる緑色蛍光タンパク質(GFP)の機能的発現を、装入された酵母細胞壁粒子の取込み、pIRES DNAの細胞内放出、および蛍光の発生によって明示されるGFPの発現を実証するものとして用いた。
YCWPとともにインキュベートしたマウスRAW細胞におけるEGFP発現
YCWP-テキサスレッドおよびpgWIZ-GFPのインビトロ共送達(co-delivery)について、マウスRAW細胞を用いて検討した:マウスRAW 264.7細胞(ATCC, Manasas, VA、No. TIB-71(商標))を、J774マクロファージに関して上述した通りに6ウェルプレートにプレーティングした。YCWP内部のカチオン性tRNA/PEI/CTABナノポリプレックスの表面にアニオン性プラスミドDNAを吸着させることによって、正に荷電した酵母tRNA/PEI/CTABポリプレックスを含むYCWP-tRNA/PEI/CTAB粒子(1×107個)に対して、0.5mgのpgWizGFP DNA(Gene Therapy Systems, San Diego, CA)を装入した。続いて、YCWP-tRNA/PEI/CTAB/gWizGFP組成物をPEI(5mg)でコーティングした。同一の細胞の内部でのYCWP取込み(赤色粒子)およびGFP発現(緑色分散蛍光)を実証するために、粒子:細胞比が5であるこのYCWP-DNA組成物を、粒子:細胞比が5である空(empty)YCWP-TR(テキサスレッド、Molecular Probesにより化学的に標識されたYCWP)と混合し、続いてマウスRaw細胞とともにインキュベートした。図7Aおよび図7Bの蛍光顕微鏡写真において認められるように、YCWP-TRを取り込む細胞はGFPを発現する。
マウスにおけるYGP粒子およびYGMP粒子のインビボ経口生物学的利用能
酵母グルカン粒子の経口生物学的利用能に対する細胞表面糖質組成物の効果を、蛍光標識した酵母細胞壁粒子を用いて検討した。YGPおよびYGMPと、新たに調製した20mg/mlのジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン(DTAF)のDMSO溶液とを、0.1Mホウ酸緩衝液、pH 8中で37℃で2日間反応させることによって、蛍光標識した酵母グルカン粒子(YGP-F)および蛍光標識した酵母グルカン-マンナン粒子(YGMP-F)を調製した。余分なDTAFは1M Tris緩衝液、pH 8.3によって消光させ、滅菌PBSによる反復洗浄によって非反応生成物がなくなるように洗浄した。
YGP:pIRES2DsRED2-OPGとともにインキュベートしたJ774マウスマクロファージによるヒトオステオプロテジェリン発現
ペイロード分子である、ヒトオステオプロテジェリンを発現するpIRES2DsRED2-OPGプラスミドDNAを、酵母グルカン粒子(YGP)および酵母グルカンマンナン粒子(YGMP)の中にカチオン性ポリマー-DNAナノ複合体の形態で組み込んだ。マクロファージによる食作用を受けると、これらの粒子はファゴソーム中に配置され、ここでカチオン性ポリマーがファゴソームを膨張させて、DNAを細胞質中に放出する。放出されたDNAは核に移動し、細胞機構によってプロセシングを受けて、活性のある正常なオステオプロテジェリンを生成する。
これらの予備的実験に用いるpIRES2DsRED2-OPG-OPG構築物は、pIRES2DsRED2のマルチクローニングサイト(MCS)のBamH1部位とXho1部位の間に挿入されたヒトオステオプロテジェリンcDNAから構成される。pIRES2DsRED2ベクター(カタログ番号6990-1、Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)は、IRESエレメント、およびヒトオステオプロテジェリンDNA挿入配列の発現の原因となるCMVプロモーターを含む。ヒトOPG cDNAはヒト腎臓cDNAライブラリーからクローニングされているが、これは、疎水性リーダーペプチドおよび4つの潜在的なN結合型グリコシル化部位を含む、分泌型糖タンパク質の特徴を有する401アミノ酸ポリペプチドをコードする。
生理的に有意な量のhOPGの発現および分泌
2mgのpIRES2DsRED2-hOPG DNAが装入され、10mgのポリエチレンイミン(PEI, Aldrich)でコーティングされたYGPの組成物(5×107個)を、培養下にある3T3-D1マウス線維芽細胞株のトランスフェクションのために用いた。陽性対照として、従来のトランスフェクション剤(JetPEI、Gene Therapy Systems, San Diego, CA)を用いてpIRES2DsRED2-hOPG DNAを細胞にトランスフェクトした。pIRES2DsRED2-hOPG DNA(1mg)を含む0.15M NaCl 50mlを、2mgまたは4mgのJetPEIを含む50mlの0.15M NaClと混合し、直ちにボルテックス処理した。RTで20分間のインキュベーションの後に、マウスデクチン-1遺伝子が安定的にトランスフェクトされ、24ウェルプレート内の10%ウシ胎仔血清(Invitrogen)を含むDMEM中に集密度33%でプレーティングされた3T3-D1マウス線維芽細胞に、トランスフェクション混合物を添加した。細胞のトランスフェクションは、0.5mlの増殖培地中の細胞に対して、100mlのYGP-DNA-PEI組成物(5×105個の粒子中に20ngのDNA)または100mlのDNA-PEIポリプレックス(1mgのDNA)を滴下させながら添加することによって行った。陰性対照ウェルは非処理とした。CO2インキュベーター内での37℃での3時間のインキュベーションの後に、増殖培地を除去して、0.5mlの新たなD-MEM/10%ウシ胎仔血清を補充し、細胞を上記の通りにインキュベートした。
インビボにおいてマクロファージに組み込まれ、骨に大量に移行する、マウスに投与された酵母細胞壁粒子
YGPの骨格組織への生体内分布を評価するための1件の試験において、テキサスレッド(Molecular Probes)で標識したYGP粒子(YGP-TR)を腹腔内注射(IP;1mg/ml)によってマウスに投与した。マウスを第4日に安楽死させ、組織(脳、肝臓、脾臓および骨)を採取し、PBSで緩衝化した5%ホルマリン中で一晩固定して、YGP-TR粒子の組織分布に関する蛍光顕微鏡検査のために切片を調製した。マウス大腿骨の横断面における髄腔内のYGP-TR細胞内粒子(いくつかは骨内膜表面と連続しているように見える)。図10A〜図10Cは、4日前に蛍光標識YGP粒子のIP注射を受けたL444Pゴーシェマウス由来の大腿骨の組織切片の画像を示しており、これは蛍光標識粒子750が骨に分布したことを示している。図10Aは透過光の下で観察した骨切片を示している。図10Bは、蛍光顕微鏡検査によって観察した図10Aと同じ視野を示しており、蛍光標識粒子750を有するいくつかの細胞(矢印)を示している。図10Cは、図10B中に長方形によって表示された視野を含む、より高倍率の画像である。この試験は、マウスに投与されたYGP-DNA組成物がインビボでマクロファージ内に組み込まれて、骨格組織に大量に移行しうることを実証している。
Claims (25)
- オリゴヌクレオチド、mRNA、組換えDNA構築物、線状DNA断片、阻害された線状DNA断片およびそれらの混合物からなる群より選択され、オステオプロテジェリンをコードする核酸を含むペイロード(payload)分子;
キトサン、ポリエチレンイミン、ポリ-L-リジン、アルギン酸塩、キサンタン、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびそれらの混合物からなる群より選択されるペイロード捕捉分子;ならびに
酵母グルカン粒子または酵母グルカン-マンナン粒子より選択され、内部空間を規定しかつ6〜90重量パーセントのβグルカンを含む、抽出酵母細胞壁である担体であって、該ペイロード捕捉分子が担体によって規定される内部空間の中に含まれかつ担体中のペイロード分子の保持を促進するために存在する、担体
を含む、組成物。 - 組換えDNA構築物が、オステオプロテジェリンをコードするオープンリーディングフレームと機能的に連結された制御エレメントを含む発現ベクターである、請求項1記載の組成物。
- ペイロード分子がpIRES2DsRED2-hOPGである、請求項1記載の組成物。
- 発現ベクターがSEQ ID NO:1のポリヌクレオチドを含む、請求項2記載の組成物。
- 発現ベクターが、SEQ ID NO:2のポリペプチド、SEQ ID NO:2の28〜124位の残基からなるポリペプチド、SEQ ID NO:2の124〜185位の残基からなるポリペプチド、およびSEQ ID NO:2の28〜185位の残基からなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項2記載の組成物。
- 治療を必要とする対象における低骨密度を特徴とする病状を治療するのに使用するための組成物であって、経口、口腔内、舌下、肺または経粘膜用の剤形である、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物および薬学的に許容される添加剤を含む組成物。
- 組成物の有効量を対象に投与するために製剤化された、請求項6記載の組成物。
- 病状が骨粗鬆症、人工関節周囲(periprosthetic)骨溶解、廃用性骨減少症、動脈石灰化、または、腫瘍転移、骨癌性疼痛、若年性パジェット病、ゴーシェ病、HIVの抗ウイルス治療、関節炎、サラセミアもしくは炎症性腸疾患に伴う骨溶解である、請求項6記載の組成物。
- 治療を必要とする対象における低骨密度を特徴とする病状の治療用の医薬の製造のための、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物の使用。
- 治療を必要とする対象における骨粗鬆症、人工関節周囲骨溶解、廃用性骨減少症、動脈石灰化、または、腫瘍転移、骨癌性疼痛、若年性パジェット病、ゴーシェ病、HIVの抗ウイルス治療、関節炎、サラセミアもしくは炎症性腸疾患に伴う骨溶解の治療用の医薬の製造のための、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物の使用。
- インビトロで細胞におけるオステオプロテジェリンの発現を増加させる方法であって、以下の段階を含む方法:
請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物を含む送達系の有効量を提供する段階;
インビトロで細胞を送達系と接触させる段階;ならびに
オステオプロテジェリンを発現させる段階。 - ペイロード分子がpIRES2DsRED2-hOPGである、請求項11記載の方法。
- 発現ベクターがSEQ ID NO:1のポリヌクレオチドを含む、請求項11記載の方法。
- 発現ベクターが、SEQ ID NO:2のポリペプチド、SEQ ID NO:2の28〜124位の残基からなるポリペプチド、SEQ ID NO:2の124〜185位の残基からなるポリペプチド、およびSEQ ID NO:2の28〜185位の残基からなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項11記載の方法。
- 細胞がマクロファージ、破骨細胞、破骨細胞前駆細胞、パイエル板のM細胞、単球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、肺胞食細胞、腹腔マクロファージ、乳マクロファージ、ミクログリア細胞、好酸球、顆粒球、メサンギウム食細胞または滑膜A細胞である、請求項11記載の方法。
- 治療を必要とする対象におけるオステオプロテジェリン反応性の病状の治療用の医薬の製造のための、経口、口腔内、舌下、肺または経粘膜用の剤形である、請求項1〜5のいずれか一項記載の組成物および薬学的に許容される添加剤の使用。
- ペイロード分子がpIRES2DsRED2-hOPGである、請求項10または16記載の使用。
- ペイロード分子がSEQ ID NO:1のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである、請求項10または16記載の使用。
- ペイロード分子が、SEQ ID NO:2のポリペプチド、SEQ ID NO:2の28〜124位の残基からなるポリペプチド、SEQ ID NO:2の124〜185位の残基からなるポリペプチド、およびSEQ ID NO:2の28〜185位の残基からなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする発現ベクターである、請求項10または16記載の使用。
- 病状が骨粗鬆症、人工関節周囲骨溶解、廃用性骨減少症、動脈石灰化、または、腫瘍転移、骨癌性疼痛、若年性パジェット病、ゴーシェ病、HIVの抗ウイルス治療、関節炎、サラセミアもしくは炎症性腸疾患に伴う骨溶解である、請求項16記載の使用。
- オステオプロテジェリン送達系を作製する方法であって、以下の段階を含む方法:
オリゴヌクレオチド、mRNA、組換えDNA構築物、線状DNA断片、阻害された線状DNA断片およびそれらの混合物からなる群より選択され、オステオプロテジェリンをコードする核酸を含むペイロード分子を、キトサン、ポリエチレンイミン、ポリ-L-リジン、アルギン酸塩、キサンタン、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびそれらの混合物からなる群より選択されるペイロード捕捉分子;ならびに酵母グルカン粒子または酵母グルカン-マンナン粒子より選択され、内部空間を規定しかつ6〜90重量パーセントのβグルカンを含む、抽出酵母細胞壁である担体であって、該ペイロード捕捉分子が担体によって規定される内部空間の中に含まれかつ担体中のペイロード分子の保持を促進するために存在する、担体と接触させる段階。 - 組換えDNA構築物が、オステオプロテジェリンをコードするオープンリーディングフレームと機能的に連結された制御エレメントを含む発現ベクターである、請求項21記載の方法。
- ペイロード分子がpIRES2DsRED2-hOPGである、請求項21記載の方法。
- ペイロード分子がSEQ ID NO:1のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである、請求項21記載の方法。
- ペイロード分子が、SEQ ID NO:2のポリペプチド、SEQ ID NO:2の28〜124位の残基からなるポリペプチド、SEQ ID NO:2の124〜185位の残基からなるポリペプチド、およびSEQ ID NO:2の28〜185位の残基からなるポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする発現ベクターである、請求項21記載の方法。
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