TW201915165A - 製備醱酵羽毛粉的枯草桿菌菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的有二，第一為協助改善水解羽毛粉之缺點，利用枯草桿菌加入水解之羽毛粉，經一日之作用後，提高其羽毛粉胃蛋白酶消化率。第二目的為本菌株另具有蛋白分解酵素及角蛋白分解酵素，可供動物飼料之添加物，增加營養價值。本發明之枯草桿菌(Bacillus subtilis ) 531-7係由堆肥中篩檢出來，再經羽毛分解力及酵素活性比對，確認有商業價值。本發明之新穎枯草桿菌(Bacillus subtilis )菌株，經16S rDNA基因序列分析及gyrB 基因序列分析比對鑑定確認。

Description

製備醱酵羽毛粉的枯草桿菌菌株及其用途
本發明係有關於一種自堆肥中分離之新穎枯草桿菌菌株，用於產生羽毛粉及角蛋白酶與蛋白酶酵素活性的菌株。本發明另涉及一種水解羽毛粉再加工的製備方法。
羽毛中主要蛋白為角蛋白，是由不可溶的結構蛋白質-角蛋白(keratin)構成。角蛋白含有高量的雙硫鍵和疏水性及氫鍵鍵結，不易被一般蛋白質水解酵素分解，而動物體本身缺乏此種蛋白質分解酵素，所以對禽畜而言，角蛋白不能直接利用。
現有技術中水解羽毛粉之方法主要為利用蒸氣水解羽毛來實現。具體而言如圖13所示，將濕羽毛去水後(步驟301)，係將羽毛輸入精煉爐內，注入蒸氣後將羽毛均勻加溫並攪拌。當羽毛及水在蒸煮機中，加入10巴(bar)蒸氣，並將溫度控制在187°C之條件下；此時蒸煮機中的水化為水蒸氣，水蒸氣體積漲大產生壓力，幫助羽毛的水解作用；而後，將蒸煮機維持在3 bar、145°C的環境下持續蒸煮50分鐘，將羽毛水解而保存可利用的蛋白質。高壓水解後的羽毛成糊狀(步驟302)，再經真空乾燥後，抽出含水量在12%以下的乾燥羽毛粉(步驟303)。待獲得乾燥羽毛粉後，將其放入收集槽散熱以降低溫度，等乾燥羽毛粉降溫後再輸送至震動篩網並將粗塊或廢棄物篩出；而後再輸送至粉碎機、裝袋及秤量即為水解羽毛粉(步驟304)。
然而，根據以往水解羽毛粉之方法，蒸氣壓與時間的控制會影響水解羽毛粉品質。過度水解會降解大量胺基酸，使養份流失；但水解不足反而會使雙硫鍵未完全分解，致使蛋白質的品質不良。
現有技術指出，水浴加熱法雖可一定程度地增加營養成分，但會損失必需胺基酸[如離胺酸(lysine)、甲硫胺酸(methionine)和色胺酸(tryptonphan)等]的含量，並導致離胺丙胺酸(lysinoalanine)和羊毛硫胺酸(lanthionine)等非必需胺基酸含量的增加。即便是利用水浴加熱法水解羽毛，若過度水解也會存在破壞胺基酸、降低蛋白質品質、或所得之羽毛粉消化率較低等問題。
再者，不同來源或不同批次生產之水解羽毛粉品質可能不同。現有飼料公司福壽實業提供8種不同來源或不同批次的水解羽毛粉商品，經分析水解羽毛粉之胃蛋白酶消化率約在23.5%至92.8%，粗蛋白含量約在79.7%至93.3%。飼料業者對於胃蛋白酶消化率非常重視，消化率低常會導致家禽或家畜生病。一般政府要求水解羽毛粉商品中胃蛋白酶消化率需高於70%或75%。國產或進口之水解羽毛粉粗蛋白含量在79.7%至93.3%，但消化率則在23.5%至92.8%之間，顯示不能以粗蛋白含量來判斷水解羽毛粉之消化率。對於水解羽毛粉中之胺基酸成份，飼料業者認為可藉由後續添加調整，因此水解羽毛粉中之胺基酸成份對家禽或家畜之重要性不如胃蛋白酶消化率。
近年由於飼料魚粉價格高升，廢棄羽毛轉製的羽毛粉即為產業鎖定的替代品之一，但目前水解羽毛粉品質不穩定，造成以其調配的飼料消化率也不穩定，對於業者而言是相當大的困擾。此外，如羽毛藉由蒸氣水解得到的產物，動物不易消化，因此尋求生物分解以改善消化之困難性。但生物分解需一定時日，而屠宰場之廢棄羽毛需立即處理避免發臭。
有鑑於此，現有技術有需改善的必要。提供快速製備穩定優質的羽毛粉品質，同時避免產生羽毛堆積的情形仍待發展。
為了克服現有技術之缺點，本發明之目的有二，第一為協助改善水解羽毛粉之缺點，利用枯草桿菌加入水解之羽毛粉，經一日之作用後，提高其羽毛粉胃蛋白酶消化率。第二目的為利用本菌株生產蛋白分解酵素及角蛋白分解酵素，可供動物飼料之添加物，增加營養價值。本發明之枯草桿菌(Bacillus subtilis )確有商業價值。
為達到上述之發明目的，本發明提供一種枯草桿菌531-7 (Bacillus subtilis 531-7)菌株，其係寄存於臺灣財團法人新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910793，寄存日期為2017年08月09日；亦寄存於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2017495，保藏日期為2017年09月06日。
本發明另提供一種微生物製劑，其係包含如前述之枯草桿菌531-7菌株的培養物做為有效成分。
本發明另提供一種如上述的枯草桿菌531-7菌株作為飼料或飼料添加劑的用途；較佳的，所述飼料為動物飼料或魚飼料。
本發明另提供一種如上述的枯草桿菌531-7菌株作為肥料或肥料添加劑的用途。本發明之枯草桿菌531-7菌株供添加至有機堆肥，可以促進堆肥肥效。
本發明另提供一種製備細菌醱酵羽毛粉的方法，其包含以下步驟：(1) 齊備羽毛(如白肉雞羽毛，黃土雞羽毛，烏骨雞羽毛)，將羽毛剪碎後置於培養基，所述培養基包含但不限於基礎鹽類培養基或地下水(地下水pH值7.72，電導度為657 μS/cm，鹽度325 ppm，總溶解固體(TDS)為456 mg/L)，獲得重量體積比為1% (w/v)至6.5% (w/v)羽毛培養基；(2) 將如前所述之枯草桿菌531-7菌株添加於羽毛培養基，使枯草桿菌531-7菌株濃度成為每毫升105 至107 菌落單位(CFU/mL)進行培養3天至8天，溫度介於20°C至40°C；(3) 將培養後之含枯草桿菌531-7菌株之羽毛培養基滅菌後進行乾燥，再以均質機打碎與球磨機研磨至小於0.15mm，獲得細菌醱酵羽毛粉。此外，本發明當所述步驟(1)培養基為地下水時，亦能達成相似之效果。
較佳的，所述之步驟(1)中，重量體積比為5% (w/v)至6.5% (w/v)羽毛培養基。較佳的，羽毛培養基的羽毛包含，但不限於雞羽毛；更佳的，雞羽毛包含，但不限於白肉雞羽毛。
較佳的，所述之步驟(2)中，係將枯草桿菌531-7菌株添加於羽毛培養基培養1天至8天，更佳為6天。
較佳的，所述之步驟(2)中，培養溫度是37°C。
本發明提供一種細菌醱酵羽毛粉，其係上述之方法所製備而得。其中胃蛋白酶消化率為86.3%、粗蛋白94.7%、胺基酸總含量99.1%；其中水解胺基酸含量值(胺基酸除以粗蛋白，a.a. mg/ CP mg，%)為：甲硫胺酸(Met) 0.3%、離胺酸(Lys) 1.6%、組胺酸(His) 0.5%、色胺酸(Trp) 0.5%、酥胺酸(Thr) 4.6%、纈胺酸(Val) 6.3%、胱胺酸(Cys) 6.7%、異白胺酸(Ile) 4.4%、白胺酸(Leu) 8.1%、酪胺酸(Tyr) 3.3%、***酸(Phe) 5.4%、精胺酸(Arg) 6.4%、丙胺酸(Ala) 4.5%、天門冬胺酸(Asp) 6.6%、麩胺酸(Glu) 10.4%、甘胺酸(Gly) 7.6%、脯胺酸(Pro) 11.6%、絲胺酸(Ser) 10.5%。
本發明另提供一種如前述之細菌醱酵羽毛粉作為飼料或飼料添加劑的用途。
本發明另提供一種如前述之細菌醱酵羽毛粉作為肥料或肥料添加劑的用途。
本發明另提供一種加工醱酵羽毛粉的製備方法，其包含以下步驟：(1) 齊備水解羽毛粉，將水解羽毛粉置於培養基，所述培養基包含但不限於基礎鹽類培養基或地下水，獲得重量體積比為1% (w/v)至20% (w/v)水解羽毛粉培養基；(2) 將如前所述之枯草桿菌531-7菌株添加於水解羽毛粉培養基，使枯草桿菌531-7菌株濃度成為每毫升105 至107 菌落單位(CFU/mL)進行培養1天至3天(37°C)；(3) 培養1天至3天後，將含有枯草桿菌531-7菌株之水解羽毛粉培養基經滅菌乾燥後，以均質機打碎(不研磨)，獲得加工醱酵羽毛粉。此外，本發明當所述步驟(1)培養基為地下水時，亦能達成相似之效果。
較佳的，所述水解羽毛粉包含，但不限於市售水解羽毛粉。
本發明所述「市售水解羽毛粉」，係指未經本發明枯草桿菌531-7菌株培養之羽毛粉，將羽毛以高壓水解成水解羽毛粉。
較佳的，所述之步驟(2)中，培養時間為72小時。低度水解羽毛粉培養72小時後，其消化率由23.5%改善至83.4%。如培養24小時消化率改善至62.8%。高度水解羽毛粉培養72小時後，其消化率由78.9% 改善至84.9%。
本發明另提供一種加工醱酵羽毛粉，其係上述之方法所製備而得。
本發明另提供一種酵素的製備方法，其包含以下步驟：(1) 齊備一原料，將原料置於培養基，獲得重量體積比為1% (w/v)至10% (w/v)原料培養基；(2) 將如請求項1所述之枯草桿菌531-7菌株添加於原料培養基，使枯草桿菌531-7菌株濃度成為每毫升105 至107 菌落單位(CFU/mL)進行培養。(3) 將含有枯草桿菌531-7菌株之原料培養基進行乾燥，獲得酵素。
較佳的，其中於步驟(1)中，原料為羽毛；其中於步驟(1)至(3)中，原料培養基為羽毛培養基；其中於步驟(3)中，酵素包含角蛋白酶。
較佳的，其中於步驟(1)中，原料為黃豆；其中於步驟(1)至(3)中，原料培養基為黃豆培養基；其中於步驟(3)中，酵素包含酪蛋白酶。
本發明的優點在於：
1. 本發明之枯草桿菌531-7菌株，為具備蛋白酶，主要包括角蛋白酶與酪蛋白酶等兩種功能活性之菌種，藉由菌株生產蛋白酶做為肥料或動物飼料；此外，前述菌株分解之羽毛粉品質穩定(如下表4)，如一致的胃蛋白酶消化率(如下表4)。基於上述特徵本菌可開發為羽毛廢棄物處理、動物飼料添加、肥料等之用途。
2. 本發明可利用製備細菌醱酵羽毛粉的方法進行酵素之收集。細菌加入基礎鹽類培養基中(含2%羽毛)，培養6天(37ºC)後，過濾後取濾液得到粗酵素，不經滅菌處理，獲得角蛋白酶。蛋白酶之收集，以下列方法進行：細菌加入基礎鹽類培養基中(含1%豆粉)，培養2天(37ºC)後，過濾後取濾液得到粗酵素，不經滅菌處理，獲得蛋白酶。藉由本發明所獲得之蛋白酶(主要包括角蛋白酶與酪蛋白酶)可做為動物飼料之添加物增加營養價值，亦可做為肥料使用。
3. 本發明之加工醱酵羽毛粉的製備方法，藉由前述菌株加入低度水解之羽毛粉，作用後提高其羽毛粉品質(如胃蛋白酶消化率、粗蛋白含量)，改善市售水解羽毛粉之缺點，使加工醱酵羽毛粉做為動物飼料之添加物更具營養價值且易消化，亦可做為肥料使用。
以下配合圖式及本發明之較佳實施例，進一步闡述本發明為達成目的所採取的技術手段。
製備例1 細菌菌株之來源與分離純化
本案新穎菌株代號為枯草桿菌531-7菌株 (Bacillus subtilis 531-7)是分離自堆肥，再經羽毛分解效力比對，並寄存於臺灣新竹之財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，編號為BCRC 910793，寄存日期為2017年08月09日；亦寄存於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2017495，保藏日期為2017年09月06日。以下為菌株之三階段篩選方法：
第一階段：酪蛋白分解力比較
取土壤1克(g)加入9毫升(mL)無菌水，以80°C、20分鐘水浴處理或是直接(室溫)稀釋成0.01倍和0.001倍後塗在具有1%酪蛋白的基礎鹽培養基(basal salt medium)[內含0.7 g/L磷酸二氫鉀(KH2 PO4 )、1.4 g/L磷酸氫二鉀(K2 HPO4 )、0.5g/L氯化鈉(NaCl)、0.1 g/L硫酸鎂(MgSO4 )、10 g/L酪蛋白(casein)、pH 7.2、15 g/L洋菜膠(agar)]上，選擇有透明環的單一菌落以LA培養基[LB培養基(Lysogeny broth)加上青黴素(ampicillin)]活化20小時後，以滅菌牙籤沾取單一菌落，點於酪蛋白培養基上，於37°C培養24小時後，觀察菌落周圍是否出現透明環，拍照並記錄菌落及透明環大小，選擇透明環與菌落比較大者進入第2階段。
第二階段：單根羽毛分解力目視比較
配製羽毛磷酸緩衝液(phosphate buffered saline，PBS)：將PBS分裝10 mL於螺旋試管中，並添加一根完整的雞羽毛單根重約為0.05克，進行高溫高壓滅菌備用。將供試菌株於LA上活化並以5 mL LB液培20小時後，調整菌量為OD600 =0.3 (108 cfu/mL)並吸取100微升(μl)加入試管中，於37°C下培養6天後觀查羽毛的完整性，並以不添加供試菌株者作為空白組(blank)。取分解力三級或四級的菌株進行下一個階段4克羽毛之細菌分解率比較。分解力共分四級，零級：無明顯分解情形。一級：有部份分解，只有少許羽毛碎屑懸浮。二級：羽毛明顯分解，且碎屑沉澱量多。三級：羽毛呈粉碎狀，只剩羽軸。四級，羽毛全分解，外觀無殘留(請參閱圖1)。
第三階段：4克羽毛之細菌分解率(%)比較
配製200 mL基礎鹽培養基(0.7 g/L KH2 PO4 ，1.4 g/L K2 HPO4 ，0.5 g/L NaCl，0.1 g/L MgSO4 ，pH 7.2)，並添加4克白肉雞羽毛於500 mL三角瓶中成為2%羽毛培養基，高溫滅菌後，加入已活化增量於LB中24小時之供試菌株，菌液為OD600 =0.3 (108 CFU/ml)，使菌液於羽毛培養基的體積百分比為2% (v/v)。將三角瓶於37°C、150 rpm下培養6天後，濾紙[ADVANTEC No.1，孔徑＞10微米(μm)]進行過濾(收集之濾液為粗酵素)，將截留之羽毛殘留物放入65°C烘箱烘乾後，秤重並計算羽毛分解率(%)，分解率大於80%以上之菌株，再進行羽毛粉之製作及兩種粗酵素活性試驗(角蛋白酶酵素及蛋白酶酵素)，以篩檢出具商品價值之具分解羽毛之菌株及酵素。
製備例2 菌株基本生理特性測試
1. 菌株的基本特性：
枯草桿菌531-7菌株之外觀：如圖2所示為革蘭氏陽性菌，單個細胞大小約為0.4 μm至0.6 μm × 1.0 μm至1.6 μm，菌端半圓形且單個或呈短鏈。如圖3所示，在細胞頂端部位形成芽孢，芽孢為橢圓形或圓形，大小約為0.6 μm至0.7μm × 1.0 μm至1.6 μm。如圖4所示，枯草桿菌531-7菌株之電子顯微鏡相片可看到前孢子。如圖5所示，本發明枯草桿菌531-7菌株在LA培養基生長時，初期(24小時)菌落形狀為圓形，白色，表面形成***的菌落，邊緣不規則的菌落或邊緣光滑整齊；如圖6所示，在3至4天後菌落表面乾燥皺褶。
2. pH值測定
將3天及6天之培養基取過濾後之羽毛分解濾液測pH值。結果顯示羽毛分解液在3天後pH值7.6至7.7，6天後pH值為8.5至8.7。
3. 生長曲線測定-菌體混濁度(OD)值及菌落數(CFU)
以接種環沾取單一完整菌落於含6 mL LB培養液於15 mL離心管中，在37°C下振盪培養(轉速為150 rpm) 24小時。調整菌液OD600 ＜ 0.06。取調整好之1 mL菌液(OD600 ＜ 0.06)置50 mL LB培養液中(OD600 ＜ 0.01)，於37°C下振盪培養(轉速為150 rpm)再分別於0、1、2、4、6、8、24、26、28、30及32小時(視生長曲線調整後端時間點)取樣計數生菌數及測OD值。每個時間點取2 mL測其OD值(校正液為LB培養液)。並另取0.1 mL計數生菌數(37°C，24小時)(如圖7所示)。菌液在培養2小時至6小時為對數生長期，在培養6小時之後進入遲滯期。
製備例3 菌株鑑定方法
1. BIOLOG菌種鑑定與碳源利用能力測定
(1) 以BIOLOG鑑定系統測定本發明菌株之菌種，將所獲得之數值與BIOLOG公司資料庫比對，若該菌株71種碳源與23種化學敏感試驗的OD595 值與資料庫的菌株數值相似度達到0.50以上便給予該測定菌株之接近鑑別ID。以BIOLOG公司提供之MicroStationTM 系統軟體分析之結果，得知其表現型與Bacillus subtilis 菌株的相似度最高，其相似度為0.64，可能機率為0.77，因此將菌株命名為枯草桿菌531-7菌株(Bacillus subtilis 531-7)。
(2) 枯草桿菌531-7菌株可利用之碳源及化學敏感試驗：可利用之碳源為23種。分別為葡萄醣(α-D-Glucose)、糊精(Dextrin)、甘霧醣(D-Mannose)、麥芽糖(D-Maltose)、海藻糖(D-Trehalose)、纖維二糖(D-Celloblose)、龍膽二糖(Gentioblose)、蔗糖(Sucrose)、蘋果酸(L-Malic Acid)、葡萄醣酸(D-Gluconic Acid)、乳酸(L-Lactic Acid)、檸檬酸(Citric Acid)、丙胺酸(L-Alanine)、天門冬胺酸(L-Aspartic Acid)、麩胺酸(L-Glutamic Acid)、山梨糖醇(D-Sorbitol)、甘露醇(D-Mannitol)、丙三醇(Glycerol)、肌醇(myo-inositol)、半乳糖酸內酯(L-Galactonic Acid Lactone)、水楊苷(D-Sallcin)、甲基葡萄糖苷(β-methyl-D-Glucoside)及葡萄糖二酸(D-Saccharic acid)共23種。
化學敏感試驗結果為耐鹽度1、4、8% NaCl，耐酸鹼度pH 5及pH 6，對1%乳酸鈉(Sodium Lactate)，安達菌素(Aztreonam)，氯化鋰(Lithium Chloride)，丁酸鈉(Sodium Butyrate)，亞碲酸鉀(Potassium tellurite)有化學敏感性。碳源利用能力及化學敏感試驗結果可供枯草桿菌531-7菌株增量培養之參考。
5. API-50CHB菌種鑑定與碳源利用能力測定
(1) 以API-50CHB套組(bioMerieux, Inc.公司)測定本發明菌株之菌種及碳水化合物利用能力。在API 50 CH strip的各個試驗孔中，含有49種不同的碳水化合物，可測知細菌對碳源的利用情形；在接種細菌之後，細菌在其中生長會造成培養基的pH值的改變，可由培養基的顏色變化來判定細菌的種類。依照bioMerieux, Inc., Hazelwood, MO公司提供的說明書所述之方法進行判讀，結果顯示，531-7菌株經API 50CHB鑑定為Bacillus licheniformis (99.9 %)。然而，API 50CHB主要用於分析不同碳水化合物之利用性，菌種鑑定之準確性習知不如DNA序列鑑定之準確。
(2) 碳源利用能力：本發明篩選之531-7菌株由API 50CHB分析結果可知本菌在49種碳源中可利用34種，分別為甘油、L-***糖、D-核糖、D-木糖、L-木糖、D-核糖醇、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、半乳糖醇、肌醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、甲基α-D-吡喃葡萄糖苷、N-乙醯葡萄糖胺、扁桃苷、熊果素、栗糖/檸檬酸鐵、水楊苷、D-纖維二糖、D-麥芽糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、菊糖、D-棉子糖、澱粉、肝糖、龍胆二糖、D-松二糖、D-塔格糖、葡萄糖酸鉀。
2. 細菌菌株16S 核糖體DNA(rDNA)鑑定法
萃取菌株DNA，並以細菌16S rDNA通用引子對：正向引子(F：SEQ ID NO.1)及反向引子(R：SEQ ID NO.2)進行聚合酶連鎖反應(PCR)，產物長度為1481鹼基對(base pair，bp)。將增殖後之DNA產物進行核苷酸定序，並以BLAST之程式進行線上基因庫(GenBank)之查詢與比對，以進行菌屬鑑定。分離的菌株經以細菌通用引子對進行16S rDNA基因進行增幅後，結果可發現分離株可增幅到16S rDNA基因片段，定序為Bacillus subtilis (1504bp，SEQ ID NO.3，相似度達99%)。
3. 細菌菌株gyrB 基因鑑定法
萃取菌株DNA，並以細菌gyrB 基因引子對：正向引子(F：SEQ ID NO.4)及反向引子(F：SEQ ID NO.5)針對Bacillus 屬菌種進行種之鑑定。增殖後之DNA產物進行核苷酸定序與比對，確認此菌株片段序列為枯草桿菌菌種，大小約為1.3 kb，定序結果為Bacillus subtilis (1259bp，SEQ ID NO.6，相似度為99%)。
將菌株以16S rDNA (圖8)與gyrB 基因比對親緣性(圖9)：菌株包括枯草桿菌531-7菌株與8株寄存於美國典型培養物保藏中心(american type culture collection，ATCC)不同芽孢桿菌，以由Neighbor-joining (NJ)方法分析親緣演化樹；枝條上的數字代表自展值(bootstrap值)。
實施例1 酵素活性試驗
(1) 經羽毛培養基所獲得之蛋白酶中角蛋白酶活性分析
取經製備例3篩選出之枯草桿菌531-7菌株，培養於LB並將菌液調整為OD600 = 0.3 (108 CFU/mL)，取4 mL菌液至2%羽毛培養基(4克羽毛)共200 mL，使枯草桿菌531-7菌株於羽毛培養基的濃度成為2×106 CFU/mL，再於37°C、150 rpm下培養3天後，培養液置於冰上，再以布氏漏斗過濾(ADVANTEC 1號濾紙)，於冰上收集液體即為第一粗酵素液(約180 mL)，並立即取新鮮的第一粗酵素液1 mL分析角蛋白酶活性(U/mL)及蛋白質含量，換算為比活性(U/mg)；其中，枯草桿菌531-7菌株經羽毛培養基以所培養出的蛋白酶種類繁多，在此以主要的蛋白酶-角蛋白酶做為活性分析。其餘的第一粗酵素液除菌後進行冷凍乾燥成為冷凍乾燥的第一粗酵素。除菌方式為濾液除菌：以4°C、8500×g離心後，分次取上清液(約1 mL至2 mL)在冰上以0.45 μm過濾膜(mixed cellulose ester，ADVANTEC® )抽氣過濾(全程需置於冰上)。 表1、枯草桿菌531-7菌株第一粗酵素與市售商品角蛋白酶比活性 *市售商品係取自臺灣永信藥品工業股份有限公司幫美國BioResource International (BRI)代工生產之福碩酶600散(versazyme® 600，1 kg，台省農畜飼添字第AN00561號；使用對象：家禽、家畜；用途：改善飼料效率，促進動物生長及增加家禽產蛋率)。
由上表1可知本發明之枯草桿菌531-7菌株的第一粗酵素液因冷凍乾燥成濃縮狀態而增加角蛋白酶比活性，且枯草桿菌531-7菌株的第一粗酵素液無論是新鮮或是經冷凍乾燥，角蛋白酶比活性皆比市售商品來得更佳，約高出3至5倍。
(2) 經黃豆培養液所獲得之蛋白酶中酪蛋白酶活性分析：
取經製備例3篩選出之枯草桿菌531-7菌株，培養於LB並將菌液調整為OD600 = 0.3 (108 CFU/mL)，取4 mL菌液至1%黃豆培養液(2克黃豆粉加入200 mL之基礎鹽類培養基)，使枯草桿菌531-7菌株於黃豆培養基的濃度成為2×106 CFU/mL，於37°C、150 rpm下培養2天後，再以濾膜(ADVANTEC 1號濾紙)過濾收集液體即為第二粗酵素液(約180 mL)，並取第二粗酵素液分析酪蛋白酶活性(U/mL)及蛋白質含量，換算為比活性(U/mg)；其中，枯草桿菌531-7菌株經黃豆培養液所培養出的蛋白酶種類繁多，在此以主要的蛋白酶-酪蛋白酶做為活性分析。其餘的第二粗酵素液除菌後進行冷凍乾燥成為冷凍乾燥的第二粗酵素。 表2、枯草桿菌531-7菌株第二粗酵素與市售商品酪蛋白酶比活性 *市售商品係取自臺灣永信藥品工業股份有限公司幫美國BioResource International (BRI)代工生產之福碩酶600散(versazyme® 600，1 kg，台省農畜飼添字第AN00561號；使用對象：家禽、家畜；用途：改善飼料效率，促進動物生長及增加家禽產蛋率)。
由上表1可知本發明之枯草桿菌531-7菌株的第一粗酵素液不會因為冷凍乾燥而響影角蛋白酶比活性，且枯草桿菌531-7菌株的第一粗酵素液無論是新鮮或是經冷凍乾燥，角蛋白酶比活性皆比市售商品來得更佳。由上表2可知本發明之枯草桿菌531-7菌株的第二粗酵素液不會因為冷凍乾燥而響影酪蛋白酶比活性，且枯草桿菌531-7菌株的第二粗酵素液無論是新鮮或是經冷凍乾燥，酪蛋白酶比活性皆比市售商品來得更佳，約高出2倍。
(3) 粗酵素之濃縮與蛋白分子量分析。
實驗分為4組： (a) 11594粗酵素：將BCRC 11594(地衣芽孢桿菌，Bacillus licheniformis )同實施例1(1)的方式獲得11594粗酵素。 (b) 531-7粗酵素：取自實施例1(1)之第一粗酵素液。 (c) 531-7沉澱酵素：將未經稀釋之新鮮的第一粗酵素液[取自實施例1(1)，其中菌液經2%或10%羽毛培養基培養] 50 mL置於冰浴中，緩慢添加固體硫酸銨40%至80%飽和度(約增加10 mL)，待溶解後靜置20分鐘，離心9000×g、20分鐘後去除上清液，將沉澱物溶解於10 mL 0.1M PBS (pH 7.2)，獲得531-7沉澱酵素。 並將以上3組進行聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)，以考馬斯藍(coomassie blue)染劑進行膠片染色。
請參閱圖10所示，第1行及第8行為蛋白標準品(Protein Ladder, Thermo, #26616LCS)。第2行和第4行為531-7粗酵素(2%羽毛培養基)經0.2倍稀釋之粗酵素液，條帶不明顯。第3行和第5行為531-7沉澱酵素(2%羽毛培養基)經5倍稀釋，約有4個明顯條帶；其中有1個條帶介於55 - 70 kDa之間，有1個條帶介於55 - 40 kDa之間，有2個條帶介於35 - 25 kDa之間。第6行為531-7沉澱酵素(10%羽毛培養基)經5倍稀釋，約有7個條帶；其中有1個條帶位於130 kDa，有1個條帶介於55 - 70 kDa之間，有1個條帶位於35 kDa，有2個條帶介於35 - 25 kDa之間，有2個條帶介於15 - 25 kDa之間。第7行為11594粗酵素經0.2倍稀釋，約有5個條帶；其中有1個條帶介於55 - 40 kDa之間，有1個條帶位於40 kDa，有1個條帶介於35 - 25 kDa之間，有1個條帶位於15 kDa，有1個條帶位於10 kDa。大部份的文獻指出角蛋白酶分子量在30 - 40 kDa之間，因此枯草桿菌531-7菌株之角蛋白酶分子量約在25 - 35 kDa之間，為鹼性角蛋白酶(pH值8.9)。SDS PAGE分析顯示羽毛分解物中含有大量之低分子量多胜肽(小於13kDa)。
實施例2 細菌醱酵羽毛粉製備
(1)請參閱圖11所示，取經過清洗滅菌乾燥之雞羽毛剪碎後25克加入500 mL基礎鹽類培養基(成為5%至6.5% (w/v)羽毛培養基)(步驟101)，將含有製備例3之枯草桿菌531-7菌株之菌液調整為OD600 = 0.3 (108 CFU/mL)，並添加5 mL菌液於5%羽毛培養基500 mL中，使枯草桿菌531-7菌株於羽毛培養基的濃度成為106 CFU/mL，再於37ºC、150 rpm下培養發酵1至6天後(1天開始分解，3天後分解力約有60%，6天後分解力大於86%)(步驟102)，將此培養液滅菌15分鐘後(121ºC，每平方英寸15psi)，再以80ºC烘乾48小時，收集乾燥物進行研磨至適當大小，即獲得細菌醱酵羽毛粉(步驟103)。其品質分析如下表3： 表3、531-7細菌醱酵羽毛粉消化率、粗蛋白及胺基酸分析 表4、市售水解羽毛粉與發明菌株產製之細菌醱酵羽毛粉品質比較 *市售水解羽毛粉9批次之平均值。統計方式為平均值±標準差(mean±SD)。
細菌醱酵羽毛粉之品質(表3)，較市售水解羽毛粉佳(表4)，且由上表4可知，市售水解羽毛粉之標準差較大，表示每批次的品質相當不穩定；相較於本發明之細菌醱酵羽毛粉標準差小，表示品質穩定。最重要的是改善胃蛋白消化率，由65.6%提高至86.3%。且粗蛋白含量也提高，而胺基酸總含量略高於市售水解羽毛粉。
(2)以實施例2(1)步驟，其中菌液於2%或10%羽毛培養基培養發酵6天後之分解液進行靜置分兩層，並過濾上層液與下層液。其中分解液、上層液與下層液含大量胺基酸(表5)，可用於有機肥料之添加物。 表5、以2%或10%羽毛培養基培養獲得分解液之胺基酸分析
實施例3 加工醱酵羽毛粉製備
請參閱圖12所示，取市售低度水解羽毛粉10克加入200 mL基礎鹽類培養基(5%水解羽毛粉培養基)(步驟201)，將含有製備例3之枯草桿菌531-7菌株之菌液調整為OD600 =0.3 (108 CFU/mL)，並取10 mL菌液至5%水解羽毛粉培養基200 mL中，使枯草桿菌531-7菌株於水解羽毛粉培養基的濃度成為5×106 CFU/mL，再於37°C、150rpm下培養醱酵1天後(步驟202)，將此培養液滅菌15分鐘後以80°C烘乾至少48小時，收集乾燥物進行研磨即為加工醱酵羽毛粉(步驟203)。將市售低度水解羽毛粉(代號L5、L6、M3)(取自臺灣福壽實業)，與加工醱酵羽毛粉進行胃蛋白酶消化率比較。胃蛋白酶分解試驗如下：取0.3 g羽毛粉加入50 mL新鮮配製且已預熱45°C之0.2 %胃蛋白酶(活性1:10000)之0.075N鹽酸(HCl)中，混合後於45°C、150 rpm震盪反應16小時，以Whatmen #541濾紙過濾，將分解後之剩餘不溶物以80°C烘乾秤重，並將剩餘不溶物進行蛋白含量分析，及胃蛋白酶消化率。
如下表6所示，經比較胃蛋白酶之消化率，市售水解羽毛粉L5、L6、M3之消化率分別為23.5、29.2及68.3%，經加工後獲得之加工醱酵羽毛粉消化率分別提高至62.8、67.4及79.2%， 消化率約提升2.3、2.7及1.2倍。 表6、市售水解羽毛粉與經加工醱酵羽毛粉對消化率之比較
如下表7所示，加工醱酵羽毛粉其粗蛋白含量較加工前水解羽毛粉，粗蛋白含量增加約3.5%至13.8%。 表7、市售水解羽毛粉與經加工醱酵羽毛粉對粗蛋白之影響
根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。
S101‧‧‧步驟101
S102‧‧‧步驟102
S103‧‧‧步驟103
S201‧‧‧步驟201
S202‧‧‧步驟202
S203‧‧‧步驟203
S301‧‧‧步驟301
S302‧‧‧步驟302
S303‧‧‧步驟303
S304‧‧‧步驟304
圖1為羽毛分解程度之照片。 圖2為本發明之枯草桿菌531-7菌株之革蘭氏染色鏡檢圖。 圖3為本發明之枯草桿菌531-7菌株之內孢子染色鏡檢圖。 圖4為本發明之枯草桿菌531-7菌株之電子顯微鏡照片。 圖5為本發明之枯草桿菌531-7菌株培養24小時之菌落形態之照片。 圖6為本發明之枯草桿菌531-7菌株培養72小時之菌落形態之照片。 圖7為本發明之枯草桿菌531-7菌株培基後在各個時間點之菌液O.D.600 值及菌落形成單位(CFU)與時間關係之折線圖。 圖8為本發明之枯草桿菌531-7菌株與8株公開菌以16S rDNA之親源演化樹狀圖。 圖9為本發明之枯草桿菌531-7菌株與8株公開菌以gyrB 基因之親源演化樹狀圖。 圖10為本發明之枯草桿菌531-7菌株之蛋白質電泳染色圖。 圖11為醱酵羽毛粉的製備流程圖；S101至S103代表步驟101至步驟103。 圖12為加工羽毛粉的製備流程圖；S201至S203代表步驟201至步驟203。 圖13為現有技術水解羽毛粉的製備流程圖；S301至S304代表步驟301至步驟304。
TW中華民國、食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、2017/08/09、BCRC 910793。
CN中國大陸、中國典型培養物保藏中心、2017/09/06、CCTCC M 2017495。
＜110＞ 行政院農業委員會農業藥物毒物試驗所 ＜120＞ 製備醱酵羽毛粉的枯草桿菌菌株及其用途 ＜130＞ P117537 ＜160＞ 6 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 16S rDNA正向引子 ＜400＞ 1 gtttgatcct ggctcag 17 ＜210＞ 2 ＜211＞ 16 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 16S rDNA反向引子 ＜400＞ 2 taccttgtta cgactt 16 ＜210＞ 3 ＜211＞ 1504 ＜212＞ DNA ＜213＞ 枯草桿菌種(Bacillus subtilis ) ＜400＞ 3 gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa gccgagcgga 60 cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct 120 gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt tgtttgaacc 180 gcatggttca aacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat 240 tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac ctgagagggt 300 gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa 360 tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatgt aggttttcgg 420 atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtaccgttc gaatagggcg gtaccttgac 480 ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540 gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct taagtctgat 600 gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa 660 gagagagtgg aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg 720 gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca 780 ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc 840 cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga 900 ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960 aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg 1020 tccccttcgg gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg 1140 cactctaagg tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1200 tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac 1260 cgcgaggtta agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga 1320 ctgcgtgaag ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1380 gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg 1440 taacctttta ggagccagcc gccgaaggtg ggacagatga ttggggtgaa gtcgtaacaa 1500 ggta 1504 ＜210＞ 4 ＜211＞ 41 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ gyrB正向引子 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (27)..(27) ＜223＞ n is a, c, g, or t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (30)..(30) ＜223＞ n is a, c, g, or t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (33)..(33) ＜223＞ n is a, c, g, or t ＜400＞ 4 gaagtcatca tgaccgttct gcaygcnggn ggnaarttyg a 41 ＜210＞ 5 ＜211＞ 44 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ gyrB反向引子 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (27)..(27) ＜223＞ n is a, c, g, or t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (33)..(33) ＜223＞ n is a, c, g, or t ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (39)..(39) ＜223＞ n is a, c, g, or t ＜400＞ 5 agcagggtac ggatgtgcga gccrtcnacr tcngcrtcng tcat 44 ＜210＞ 6 ＜211＞ 1259 ＜212＞ DNA ＜213＞ 枯草桿菌種(Bacillus subtilis ) ＜400＞ 6 gaagtcatca tgaccgttct gcacgccgga ggcaaatttg acggaagcgg ctataaagta 60 tccggaggat tacacggtgt aggtgcgtcg gtcgtaaacg cactatcaac agagcttgat 120 gtgacggttc accgtgacgg taaaattcac cgccaaacct ataaacgcgg agttccggtt 180 acagaccttg aaatcattgg cgaaacggat catacaggaa cgacgacaca ttttgtcccg 240 gaccctgaaa ttttctcgga aacaaccgag tatgattacg atctgcttgc taaccgcgtg 300 cgtgaattag cctttttaac aaagggcgta aacatcacga ttgaagataa acgtgaagga 360 caagagcgca aaaatgaata ccattacgaa ggcggaatta aaagttatgt agagtattta 420 aaccgctcta aagaggttgt ccatgaagaa ccgatttaca ttgaaggcga aaaggacggc 480 attacggttg aagtggcttt gcaatacaat gacagctaca caagcaacat ttactcgttt 540 acaaacaaca ttaacacgta cgaaggcggt acccatgaag ctggcttcaa aacgggcctg 600 actcgtgtta ttaacgatta cgccagaaaa aaagggctta ttaaagaaaa tgatccaaac 660 ctaagcggag atgacgtaag ggaagggctg acagcgatta tttcaatcaa acaccctgat 720 ccgcagtttg agggccaaac gaaaacaaag ctgggcaact cagaagcacg gacgatcacc 780 gatacgttat tttctacggc gatggaaaca tttatgctgg aaaatccaga tgcagccaaa 840 aaaattgtcg ataaaggctt aatggcggca agagcaagaa tggctgcgaa aaaagcccgt 900 gaactaacac gtcgtaagag tgctttggaa atttcaaacc tgcccggtaa gttagcggac 960 tgctcttcaa aagatccgag catctccgag ttatatatcg tagagggtga ctctgccgga 1020 ggatctgcta aacaaggacg cgacagacat ttccaagcca ttttgccgct tagaggtaaa 1080 atcctaaacg ttgaaaaggc cagactggat aaaatccttt ctaacaacga ggttcgctct 1140 atgatcacag cgctcggcac cggtattggg gaagacttca accttgagaa agcccgttac 1200 cacaaagttg tcattatgac ggatgcggat gtcgacggct cgcacatccg taccctgct 1259

Claims (15)

  1. 一種枯草桿菌531-7 (Bacillus subtilis 531-7)菌株，其係寄存於臺灣財團法人新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 910793。
  2. 一種微生物製劑，其係包含如請求項1所述之枯草桿菌531-7菌株的培養物做為有效成分。
  3. 一種如請求項1所述的枯草桿菌531-7菌株作為飼料或飼料添加劑的用途。
  4. 一種如請求項1所述的枯草桿菌531-7菌株作為肥料或肥料添加劑的用途。
  5. 一種製備細菌醱酵羽毛粉的方法，其包含以下步驟： (1) 齊備羽毛，將羽毛剪碎後置於培養基，獲得重量體積比為1% (w/v)至20% (w/v)羽毛培養基； (2) 將如請求項1所述之枯草桿菌531-7菌株添加於羽毛培養基，使枯草桿菌531-7菌株濃度成為每毫升105 至107 菌落單位(CFU/mL)進行培養； (3) 將含有枯草桿菌531-7菌株之羽毛培養基進行乾燥研磨，獲得細菌醱酵羽毛粉。
  6. 如請求項5所述之方法，其中於步驟(2)中，係將枯草桿菌531-7菌株添加於羽毛培養基培養1天至8天。
  7. 一種細菌醱酵羽毛粉，其係由請求項5或6所述之方法所製備而得。
  8. 一種如請求項7所述之細菌醱酵羽毛粉作為飼料、肥料或其添加劑的用途。
  9. 一種加工醱酵羽毛粉的製備方法，其包含以下步驟： (1) 齊備水解羽毛粉，將水解羽毛粉置於培養基，獲得重量體積比為1% (w/v)至20% (w/v)水解羽毛粉培養基； (2) 將如請求項1所述之枯草桿菌531-7菌株添加於水解羽毛粉培養基，使枯草桿菌531-7菌株濃度成為每毫升105 至107 菌落單位(CFU/mL)進行培養； (3) 將含有枯草桿菌531-7菌株之水解羽毛粉培養基進行乾燥研磨，獲得加工醱酵羽毛粉。
  10. 如請求項9所述之方法，其中於步驟(2)中，係將該枯草桿菌531-7菌株添加於水解羽毛粉培養基培養24小時至72小時。
  11. 一種加工醱酵羽毛粉，其係由請求項9或10所述之方法所製備而得。
  12. 一種如請求項11所述之加工醱酵羽毛粉作為飼料、肥料或其添加劑的用途。
  13. 一種酵素的製備方法，其包含以下步驟： (1) 齊備一原料，將原料置於培養基，獲得重量體積比為1% (w/v)至10% (w/v)原料培養基； (2) 將如請求項1所述之枯草桿菌531-7菌株添加於原料培養基，使枯草桿菌531-7菌株濃度成為每毫升105 至107 菌落單位(CFU/mL)進行培養； (3) 將含有枯草桿菌531-7菌株之原料培養基進行乾燥，獲得酵素。
  14. 如請求項13所述之方法，其中於步驟(1)中，原料為羽毛；其中於步驟(1)至(3)中，原料培養基為羽毛培養基；其中於步驟(3)中，酵素包含角蛋白酶。
  15. 如請求項13所述之方法，其中於步驟(1)中，原料為黃豆；其中於步驟(1)至(3)中，原料培養基為黃豆培養基；其中於步驟(3)中，酵素包含酪蛋白酶。
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