CN114958690A - 一种芽孢杆菌及其筛选方法和在高效降解羽毛上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌及其筛选方法和在降解羽毛上的应用，涉及家禽养殖业环境资源应用领域，从家禽养殖场的土壤中，分离筛选到一株对鸡羽毛降解率达90％以上的菌株JY‑23，该菌株为芽孢杆菌，并命名为芽孢杆菌JY‑23(Bacillus sp.JY‑23)，现保藏于中国典型培养物保藏中心(菌种保藏号为CCTCC NO：M 20211638)。本发明的芽孢杆菌，能够将完整的鸡羽毛几乎降解，且羽毛降解过程可有效释放脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸和甘氨酸等有较大利用价值的游离氨基酸，为实现废弃羽毛角蛋白的资源化利用提供了基础，同时也能改善因羽毛废弃物大量累积及不当处理而造成的环境污染问题。

Description

一种芽孢杆菌及其筛选方法和在高效降解羽毛上的应用
技术领域
本发明涉及养殖业环境资源应用领域，具体讲是一种芽孢杆菌及其筛选方法和在高效降解羽毛上的应用。
背景技术
作为家禽养殖业的副产物，全球每年大量产生的羽毛除一小部分被用于生产羽毛产品及其副产品外，大部分作为垃圾填埋或者焚烧，给水、土壤和空气造成极大的污染，严重破环生态环境。角蛋白是羽毛的主要组成物质，占到羽毛总质量的90％左右。然而羽毛角蛋白结构致密，不溶于水和有机溶剂，并存在大量相互交联的二硫键、氢键和盐键等化学键，因此它对许多蛋白酶的蛋白水解具有极强的抵抗力，在自然条件下很难降解。
目前，羽毛的水解主要采用化学和物理方法处理。虽然这些方法在羽毛降解方面是可行的，但它们能耗高且对环境有二次污染，此外理化降解过程还会破坏一些必需氨基酸，包括色氨酸、赖氨酸和蛋氨酸等，显著影响了羽毛蛋白的利用价值。角蛋白酶(Keratinase，EC3.4.21/24/99.11)能够专一性降解角蛋白，不仅绿色环保、经济实用，而且不会破坏氨基酸的天然结构，是一种理想的羽毛角蛋白降解方式。角蛋白酶产生菌的来源与分布十分广泛，在细菌、放线菌和真菌中均发现有角蛋白酶的产生。目前发现的角蛋白酶大多产于细菌，其中又以芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为主。因此，研究利用微生物角蛋白酶这一绿色生物转化途径来处理羽毛废弃物，将其转变为可利用的蛋白质资源，不仅能缓解我国蛋白质饲料资源短缺的现状，而且也能改善当今由羽毛废弃物造成的环境污染问题，具有重要的现实意义和研究价值。
发明内容
本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种高效降解羽毛的芽孢杆菌及其筛选方法和应用。
本发明的技术解决方案如下：
一种芽孢杆菌，其分类名称为Bacillus sp.JY-23，于2021年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M20211638。
优选地，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，从家禽养殖场的土壤中筛选得到。
本发明还公开了一种芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一：采集含有芽孢杆菌的土壤；
步骤二：分别配制羽毛降解培养基、酪蛋白培养基以及Luria broth(LB)培养基；
步骤三：将步骤一所述的土壤加入无菌生理盐水中，制得土壤悬液，将土壤悬液加入到羽毛降解培养基中，进行富集培养；
步骤四：取富集后的培养液，加入无菌水进行逐级稀释，分别吸取10-4、10-5、10-6稀释液200μL涂布在酪蛋白培养基的平板上，于恒温培养箱中培养；观察酪蛋白培养基平板上微生物的生长情况及菌落形态，初筛获得在酪蛋白培养基的平板上具有明显水解圈且有不同形态的单菌落，然后接种至LB培养基试管斜面上培养和保藏；
步骤五：将初筛的菌株斜面用无菌水洗出，充分摇匀，制备菌悬液；吸取菌悬液加入到装有40mL LB培养基的250mL三角瓶中，进行培养，获得种子液；按规定的接种量，将种子液接种在羽毛降解培养基中，进行培养，测定羽毛的降解率，并根据各菌株的羽毛降解率大小，复筛获得羽毛高效降解菌株。
进一步地，所述羽毛降解培养基包括：鸡羽毛，K2HPO4，NaCl，MgSO4·7H2O，CaCl2，FeSO4·7H2O，蒸馏水，pH 7.4-7.6，121℃湿热灭菌。
进一步地，所述酪蛋白培养基包括：酪蛋白，牛肉膏，NaCl，CaCl2，琼脂，蒸馏水，pH7.2-7.6，121℃湿热灭菌。
进一步地，所述Luria broth(LB)培养基包括：蛋白胨，酵母浸粉，氯化钠，蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌。
本发明还公开了一种如上任一所述的芽孢杆菌或任一所述的筛选方法得到的芽孢杆菌在降解羽毛上的应用，在所述芽孢杆菌在以羽毛为唯一碳氮源的羽毛降解培养基下，前36h能够分泌角蛋白酶，致使羽毛角蛋白中的二硫键发生断裂，从而降解羽毛，在第72h时羽毛降解率至少为92％。
本发明的有益效果是：本发明的在家禽养殖场的土壤中筛选得到的芽孢杆菌，能够将完整羽毛几乎降解，且羽毛降解过程可有效释放脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸和甘氨酸等有较大利用价值的游离氨基酸，为实现废弃羽毛角蛋白的资源化利用提供了基础，同时也能改善因羽毛废弃物大量累积及不当处理而造成的环境污染问题。
附图说明
图1为初筛31株菌的羽毛降解情况图片；
图2为五株复筛菌株对羽毛的降解效果图；
图3为复筛菌株的菌落及菌体形态图；
图4为五株复筛菌株的生长发育树
图5为芽孢杆菌JY-23对羽毛的降解效果图；
图6为芽孢杆菌JY-23降解羽毛过程的羽毛降解率变化图；
图7为降解液中角蛋白酶活、pH以及可溶性蛋白的变化图；
图8为降解液中总氨基酸和氨基氮的变化图；
图9为羽毛降解液中的亚硫酸盐定性检验。
具体实施方式
下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果。
一、芽孢杆菌JY-23的分离筛选及鉴定
1.土样来源
土样采自家禽养殖场，采集好的土壤用取样袋密封冷藏保存，用于羽毛降解菌的分离筛选。
2.配制培养基
羽毛降解培养基：鸡羽毛4g，K2HPO4 1.5g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O0.025g，CaCl20.025g，FeSO4·7H2O 0.015g，蒸馏水1L，pH 7.4-7.6，121℃湿热灭菌20min。
酪蛋白培养基：酪蛋白4g，牛肉膏5g，NaCl 5g，CaCl2 3g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.2-7.6，121℃湿热灭菌20min。
Luria broth(LB)培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，pH 7.0，121℃灭菌20min。
3.筛选方法：
3.1羽毛降解菌的富集培养
称取10g采集的土样加入到带有玻璃珠的90mL无菌生理盐水中充分摇匀，得到土壤悬液，取0.2mL土壤悬液加入到50mL羽毛降解培养基中，在160r/min、37℃摇床条件下富集培养5d。
3.2羽毛降解菌株的初筛
取富集后的培养液100μL，加入到900μL的无菌水中进行逐级梯度稀释，分别吸取10-4、10-5、10-6稀释液200μL涂布在酪蛋白培养基平板上，于37℃恒温培养箱中培养24h。观察酪蛋白培养基平板上微生物的生长情况及菌落形态，将在酪蛋白平板上具有明显水解圈且有不同形态的单菌落，接种至18×180mm的LB培养基的试管斜面上。
3.3羽毛降解菌株的复筛
将初筛保藏好的菌株斜面用10mL无菌水洗出，充分摇匀，制备菌悬液；吸取200μL菌悬液加入到装有40mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃、160r/min条件下培养12h后成为种子液；按2％的接种量，将种子液接种在装量为40mL/250mL三角瓶的羽毛降解培养基中，37℃、160r/min震荡培养3d后，测定羽毛的降解率，并根据各菌株的羽毛降解率大小，获得羽毛高效降解菌株。
4.菌株的鉴定
4.1菌株的形态学鉴定
观察复筛出的菌株在LB平板上的菌落形态特征，并通过扫描电镜拍摄菌体形态。
4.2菌株的分子生物学鉴定
使用Ezup DNA提取试剂盒提取初筛得到菌株的总基因组DNA，并使用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增、纯化，将纯化得到的DNA送由上海生工进行16S rDNA测序。测序结果通过网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中的BLAST与Genbank中其它保藏序列进行比对，使用MEGA5.0软件的Neighbor-Joining进行校准排齐后绘制***发育树。
4.3菌株的生理生化特征
根据《常见细菌***鉴定手册》，对羽毛降解效果最好的菌株进行常规的生理生化进行鉴定。
二、芽孢杆菌JY-23(Bacillus sp.JY-23)羽毛降解工艺及其降解过程的生化参数变化
1.芽孢杆菌JY-23的羽毛降解方法
将保藏于18×180mm试管的Bacillus sp.JY-23斜面，用20mL无菌水洗出菌体，充分摇匀制成菌体悬液；吸取200μL菌悬液加入到装有40mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃、160r/min震荡培养12h后成为种子液；按2％的接种量，将种子液接种在羽毛降解培养基(羽毛4g，K2HPO4 1.5g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.025g，CaCl2 0.025g，FeSO4·7H2O0.015g，蒸馏水1L，pH 7.4-7.6，121℃湿热灭菌20min)装量为40mL的250mL三角瓶中，37℃、160r/min震荡培养72h，其中每12h取样一次测定与羽毛降解相关的生化参数。
2.羽毛降解率的测定
羽毛降解液经四层纱布过滤，收集纱布上残留的羽毛，放置在烘箱中60℃烘干至恒重，通过分析天平对烘干的羽毛进行称重，并按以下公式计算出羽毛的降解率：
Figure BDA0003718125900000061
式中：W初始为灭菌前羽毛的重量(g)，W残渣为降解后羽毛剩余的重量(g)。
3.羽毛降解液的生化参数测定
羽毛降解液经四层纱布过滤，将滤液8000r/min、4℃下离心20min，收集上清液，用于角蛋白酶酶活、可溶性蛋白、氨基氮、总氨基酸、游离氨基酸和含硫化合物等生化参数的测定。
3.1角蛋白酶活力测定
将1mL上清液、2mL pH 7.5的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液和10mg羽毛粉，在45℃水浴锅中混合反应60min后，添加2mL 10％的三氯乙酸终止反应。将终止后的反应体系在4000r/min下离心10min，取上清液于280nm波长处测定其吸光值。以等量蒸馏水替代上清液作对照，将1个酶活力单位(U/mL)定义为所测得的OD280值每升高0.01所需要的酶量。
3.2可溶性蛋白的测定
取上清液1mL，往其中加入5mL考马斯亮蓝G250溶液，摇匀后在595nm波长下测定吸光值，通过标准曲线计算出样品中所含可溶性蛋白的含量。其中，标准曲线以牛血清蛋白作为标准品，在OD595下绘制。
3.3氨基氮的测定
使用甲醛滴定法测定羽毛降解液中氨基氮含量。在2.5mL上清液中，加入10mL去离子水和3滴甲基红指示剂，用1mol/L盐酸滴定至微红色后放置3min，在滴定0.03569mol/L氢氧化钠，使颜色由微红至橙黄色，记录体积V1。再一次加入10mL的12％中性甲醛，放置3min后加入3滴酚酞指示剂，最后滴定0.03569mol/L氢氧化钠标准溶液使颜色变为微红色，记录体积V2，其计算方法如以下公式所示：
Figure BDA0003718125900000071
其中NNaOH为滴定时所用NaOH浓度，mol/L。
3.4总氨基酸的测定
采用水合茚三酮法对羽毛降解液中总氨基酸进行测定。将1mL上清液、0.1mL抗坏血酸、3.0mL水合茚三酮和1mL蒸馏水混合加入在20mL的刻度管内，沸水浴中反应15min，反应好的混合液冷却至常温后，用60％的乙醇定容，摇匀后于570nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算出降解液中总氨基氮含量。标准曲线以亮氨酸作为标准品，在OD570下绘制。
3.5游离氨基酸的测定
采用日立L8900氨基酸分析仪，对不同时间段内羽毛降解液中游离氨基酸的种类及含量进行测定。
3.6含硫化合物的测定
3.6.1亚硫酸盐的定性检测：采用BaCl2法对降解液中亚硫酸的含量进行定性检测，往羽毛降解上清液中加入饱和BaCl2溶液，若出现白色沉淀，且沉淀可以使KMnO4脱色，说明降解液中存在亚硫酸盐。
3.6.2巯基含量测定：在1mL羽毛降解上清液中加入2mL 0.1mol/mL pH 8.0的磷酸缓冲溶液、5mL蒸馏水和100μL 10mmol/L二硫双硝基苯甲酸溶液，摇匀后测定412nm处的吸光度值，并按以下公式计算巯基浓度：
Figure BDA0003718125900000081
式中：A412—为412nm处的吸光度值。
3.6.3半胱氨酸的测定：采用酸性茚三酮显色法测定降解液中的半胱氨酸。在试管中加入羽毛降解上清液0.5mL、0.5mL酸性茚三酮试剂和0.5mL冰乙酸，混合均匀后于沸水浴中反应10min，将反应好的混合液用流动的冷水冷却，再加入3.5mL 95％的乙醇，摇匀后于560nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算出降解液中半胱氨酸的含量。标准曲线以L-半胱氨酸作为标准品，在OD560下绘制。
3.6.4胱氨酸的测定：在0.5mL羽毛降解上清液中加入0.5mL 10umol/mL二硫苏糖醇反应30min，取0.5mL反应液按方法1.2.6.3测定其半胱氨酸含量。此时用计算得到的0.5mL裂解液半胱氨酸含量减去0.25mL降解液半胱氨酸含量，该差值的一半即为0.25mL上清胱氨酸含量。
3.6.5硫酸盐的测定：采用铬酸钡分光光度法测定降解液中的硫酸盐。在2mL羽毛降解上清液中加入8mL的去离子水、5mL的铬酸钡悬浊液混合、1mL的钙-氨溶液和10mL的95％乙醇后，用定性滤纸将混合液过滤除杂质，收集滤液于420nm波长下测定吸光值，根据标准曲线计算出降解液中硫酸盐的含量。标准曲线以硫酸钠作为标准品，在OD420下绘制。
3.6.6二硫键化合物的测定：采用NTSB显色法测定降解液中的二硫键化合物。将0.5mL羽毛降解上清液和3.0mL NTSB工作液混合，静置反应30min后于412nm波长下测定吸光值。根据标准曲线计算出降解液中二硫键化合物的含量。标准曲线以L-谷胱甘肽作为标准品，在OD412下绘制。
3.6.7硫离子的测定：采用亚甲基蓝显色法测定降解液中的硫离子。将2mL羽毛降解上清液、0.04mL 1mol/L NaOH溶液、0.5mL硫酸铁铵溶液、17.9mL去离子除氧水、5mL对氨基二甲基苯胺溶液和10.06mL乙酸锌-乙酸钠吸收液，混合静置反应10min后于665nm波长下测定吸光值。根据标准曲线计算出降解液中二硫键化合物的含量。标准曲线以L-谷胱甘肽作为标准品，在OD665下绘制。
三、结果与分析
1.芽孢杆菌JY-23的分离筛选及鉴定
1.1羽毛降解菌株的初筛
将在酪蛋白培养基平板上有明显水解圈的31株菌株进行羽毛降解的对比实验，所得结果如图1所示：与空白对照相比，在以羽毛作为唯一碳源和氮源的羽毛降解培养基中，多数菌株对羽毛具有较好的降解作用，其中编号为JY-10、JY-13、JY-23、JY-25和JY-27的5株菌株对羽毛的降解效果最为明显(即图中编号为10、13、23、25和27的摇瓶)，目测摇瓶中的羽毛基本降解完全。
1.2羽毛降解菌株的复筛与鉴定
1.2.1羽毛降解菌株的复筛与鉴定
将羽毛降解效果最好的五株菌(JY-10、JY-13、JY-23、JY-25和JY-27)进行复筛。在以羽毛作为唯一碳氮源的羽毛降解培养基下，测定了这五株菌株对羽毛的降解情况，最终的羽毛降解率如图2所示。该五株菌对羽毛具有较好的降解效果，第3d的降解率均在60％以上。其中，JY-23菌株的羽毛降解率显著高于其他4株菌，达到90％以上，说明该菌株在羽毛降解方面具有较大的潜能。
1.2.2复筛菌株的形态学观察
JY-10、JY-13、JY-23、JY-25和JY-27菌株的菌落形态和菌体形态观察结果如图3所示。在LB平板上，菌株JY-10、JY-13和JY-27的菌落形态较为相似，菌落边缘整齐呈浅白色，表面光滑、湿润，菌落相对较大；菌株JY-25呈乳白色，菌落边缘较为整齐，表面光滑、湿润，中间***，菌落相对较小；菌株JY-23的菌落颜色为黄色，菌落边缘参差不齐，表面粗糙、湿润，中间***，菌落较大。通过扫描电镜观察发现，菌株JY-10，JY-13，JY-23，JY-25和JY-27的菌体形态都呈现杆状形状，其中菌株JY-23呈现为长杆状，而另外四株菌为短杆状。
1.2.3复筛菌株的分子生物学鉴定
将上述五株菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库中其它菌株进行比对，所构建的***发育树如图4所示：菌株JY-10、JY-13和JY-27与Bacillus acidiceler在分子生物学上的同源性达到94％，菌株JY-23(基因序列如SEQ ID NO.1所示)与Bacillus sp.在分子生物学上具有99％的同源性，菌株JY-25与Ochrobactrum intermedium具有98％的同源性。
结合图3的菌落、菌体形态观察，可以将菌株JY-10、JY-13与JY-27确定为酸快生芽孢杆菌(Bacillus acidiceler)，菌株JY-23为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，可能为新种并命名为芽孢杆菌JY-23(Bacillus sp.JY-23)，菌株JY-25确定为中间苍白杆菌(Ochrobactrumintermedium)。
1.2.4菌株JY-23的生理生化特征
根据《常见细菌***鉴定手册》，对羽毛降解效果最好的菌株进行常规的生理生化进行鉴定。结果见表1，由表1可知，菌株JY-23的最适生长pH在中性之间，过酸过碱的环境下都不能生长。该菌株在NaCl浓度为2％生长、5％不生长。吲哚试验、水解淀粉试验、酪蛋白水解试验和H2S产生试验为阳性，半胱氨酸水解、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、甲基红试验、伏-普(V-P)试验、水解纤维素和接触酶试验为阴性。能利用麦芽糖、蔗糖、甘露醇和葡萄糖，不能利用半乳糖、山梨醇和乳糖。该结果与芽孢杆菌的生理生化结果整体相同，进一步确定菌株JY-23为芽孢杆菌。
表1菌株JY-23的生理生化特征
Figure BDA0003718125900000121
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性.
1.3芽孢杆菌JY-23的羽毛降解效果及其降解过程的生化参数变化1.3.1芽孢杆菌JY-23对羽毛的降解效果
在以羽毛作为唯一碳源和氮源的羽毛降解培养基下，Bacillus sp.JY-23对羽毛的直观降解效果如图5所示：随着降解时间的增加，三角瓶中羽毛残余量逐渐减少，当降解48h时，降解液中只剩少量的羽毛残渣，当降解时间达到72h时，在降解液中难以观察到羽毛的存在。进一步测定了各降解时段的羽毛降解率，结果图6所示：在降解第12h时，羽毛的降解率接近50％；而当降解时间达到72h，羽毛降解率高达92％，此时羽毛已经几乎被分解。以上结果再次表明，芽孢杆菌JY-23系一株羽毛高效降解菌株。1.3.2芽孢杆菌JY-23降解羽毛过程的生化参数变化
1.3.2.1降解液中pH、可溶性蛋白和角蛋白酶的变化
芽孢杆菌JY-23的降解效果不仅能通过降解率判断，也能通过降解液中可溶性蛋白和角蛋白酶的含量变化进行判断。即降解液中可溶性蛋白和角蛋白酶的含量越多，表明羽毛的降解效果越好。如图7所示，降解液前36h的可溶性蛋白含量与角蛋白酶酶活同时迅速增加，这表明芽孢杆菌JY-23快速生长并分泌产生角蛋白酶，导致大量的羽毛角蛋白降解成为可溶性蛋白质。与可溶性蛋白含量与角蛋白酶酶活变化趋势相一致的是，前36h降解液的pH呈现显著的增加趋势，这说明芽孢杆菌JY-23降解羽毛过程使得角蛋白的转氨和脱氨基反应加剧，致使该时间段内pH值快速上升。
1.3.2.2降解液中总氨基酸和氨基氮的变化
降解液中总氨基酸和氨基氮的变化结果如图8所示。在整个降解过程中，总氨基酸和氨基氮的含量呈现先上升后下降的趋势，整体趋势与可溶性蛋含量的大致相同。结合图7和图8的结果，可以推测芽孢杆菌JY-23对羽毛的降解过程：在36h时间内，芽孢杆菌JY-23就可快速分泌产生角蛋白酶将羽毛中角蛋白降解为可溶性蛋白、氨基酸和氨基氮等物质并导致一定的累积，由此造成降解液pH快速上升；当降解到达中后期，可溶性蛋白、氨基酸和氨基氮等物质略有下降，这可能是由于降解液的营养成分被动态用于芽孢杆菌JY-23的菌体生长及代谢维持所致。
1.3.2.3降解液中游离氨基酸的变化
为解析羽毛降解液的氨基酸产物变化，对不同时期的降解液中游离氨基酸的种类和含量进行了检测，结果如表2所示。随着降解时间的增加，相较于0h的降解液中仅含有少量的丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸和缬氨酸，不同降解时期的氨基酸种类和含量都明显提高。其中，羽毛降解液中谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸的浓度，相较于其它几种氨基酸一直处于优势地位。当芽孢杆菌JY-23降解羽毛72h后，降解液中存在着大量的脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸和甘氨酸，它们含量依次占总的游离氨基酸含量的25.27％、19.39％、15.42％和11.79％。可见，芽孢杆菌JY-23降解羽毛所累积生成的游离氨基酸可进一步开发利用于食品、饲料、医药等行业，实现羽毛的资源化利用。
表2羽毛降解过程中各种游离氨基酸的变化
Figure BDA0003718125900000141
1.3.3.4羽毛降解液中含硫化合物的消长
亚硫酸盐的定性检验结果如表3和图9所示。向0h时降解液中加入饱和BaCl2溶液后发现存在少量沉淀，红色开始变淡。之后，随着降解时间的增加，各试管的白色沉淀也在逐渐增多，并且红色全都褪去。因此在降解液中存在着亚硫酸盐，且亚硫酸盐的含量随着降解时间的增加在逐渐增多。
表3亚硫酸盐的定性检测结果
Figure BDA0003718125900000151
降解过程中其它含硫化合物含量的变化如表4所示。当羽毛降解培养基灭菌后，检测到含有12.0099μmol/L巯基、1.0118μmol/L硫酸根以及少量的胱氨酸、半胱氨酸和二硫键化合物，未检测到硫离子。当向羽毛降解培养基中接种芽孢杆菌JY-23后发现：巯基的含量随着降解时间的增加而增多，在72h后可以达到最大值38.5624μmol/L；胱氨酸和半胱氨酸的含量在72h后虽比0h时略有增多，但总体含量较少，分别为0.0101μmol/L和0.0694μmol/L；二硫键化合物的含量在降解36h内逐渐上升并达到最大值0.4812μmol/L，且随着降解时间的延长，其含量没有显著变化；硫酸盐的含量在整个降解阶段无显著变化；并且在发酵液中未检测出硫离子的存在。
表4羽毛降解过程的含硫化合物变化
Figure BDA0003718125900000152
Figure BDA0003718125900000161
以上结果说明了羽毛降解时的硫元素转化过程：在芽孢杆菌JY-23产生的角蛋白酶作用下，羽毛角蛋白中的二硫键不断发生断裂，断裂的二硫键被迅速氧化成亚硫酸盐，被打开后的角蛋白被分解成小分子蛋白和多肽类物质，而被降解二硫键中的硫元素主要存在于亚硫酸盐和含巯基的多肽中。
1.3结论
角蛋白作为废弃羽毛的主要成分，由于分子中存在大量相互交联的二硫键、氢键和盐键等化学键，导致其结构稳定难以有效降解，给环境造成了极大的压力。利用角蛋白降解微生物及其所产角蛋白酶对羽毛角蛋白进行降解，相较于物理化学水解的方法更加高效、经济和环保。
从采自家禽养殖场的土壤中，分离筛选到一株羽毛降解率达90％以上的菌株JY-23，经形态学观察、16S rDNA序列分析和生理生化鉴定，该菌株为芽孢杆菌，并命名为芽孢杆菌JY-23(Bacillus sp.JY-23)，现保藏于中国典型培养物保藏中心(菌种保藏号为CCTCCNO：M 20211638)。对芽孢杆菌JY-23的羽毛降解实效及其降解过程的生化参数变化进行了测定，结果表明：随着降解时间的增加，羽毛以肉眼可见的状态被分解，且在72h的降解率高达92％；芽孢杆菌JY-23为角蛋白酶典型产生菌，在以羽毛为唯一碳氮源的羽毛降解培养基下，前36h就可快速分泌角蛋白酶，在降解羽毛的过程中致使可溶性蛋白质、氨基酸和氨基氮等物质产生显著的积累，尤其是可有效释放脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸和甘氨酸等有较大利用价值的游离氨基酸；对羽毛角蛋白中硫元素的转化过程进行研究发现，芽孢杆菌JY-23产生的角蛋白酶会将羽毛角蛋白中的二硫键不断发生断裂，断裂的二硫键被迅速氧化成亚硫酸盐，而被打开后的角蛋白被分解成小分子蛋白和含巯基的多肽类物质。
总之，家禽羽毛作为一种潜在的蛋白质资源，含有大量的氨基酸，分离筛选到的羽毛高效降解菌株芽孢杆菌JY-23(Bacillus sp.JY-23)为实现废弃羽毛角蛋白的资源化利用提供了基础，同时也能改善因羽毛废弃物大量累积及不当处理而造成的环境污染问题。
在不出现冲突的前提下，本领域技术人员可以将上述附加技术特征自由组合以及叠加使用。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，只要以基本相同手段实现本发明目的的技术方案都属于本发明的保护范围之内。
芽孢杆菌JY-23的16S rDNA序列
SEQ ID NO.1
TTGGAAAATGGGCGGGGGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACCTCTTCGGAGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGAAGCTAATACCGGATAAGTTTTTGAACCGCATGGTTCAAAATGGAAAGATGGTTTCGGCTATCACTTACAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGCGAAAGCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTCAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTGATTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGAAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGTTGCGAGACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCATAAAATTGTTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCGTAAGGAGCCAGCCGCTAAGTTGACAGATGT
SEQUENCE LISTING
<110> 广东海洋大学
<120> 一种芽孢杆菌及其筛选方法和在高效降解羽毛上的应用
<130> 芽孢杆菌JY-23
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1448
<212> DNA
<213> 广东海洋大学
<400> 1
ttggaaaatg ggcgggggtg cctaatacat gcaagtcgag cggacctctt cggaggttag 60
cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata acttcgggaa 120
accgaagcta ataccggata agtttttgaa ccgcatggtt caaaatggaa agatggtttc 180
ggctatcact tacagatgga cccgcgtcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240
aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatgggcgaa agcctgaccg 360
agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt cagggaagaa 420
caagtacgag agtaactgct cgtaccttga cggtacctga ttagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcgagcgtt atccggaatt attgggcgta 540
aagcgcgcgc aggcggtctt ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg 600
tcattggaaa ctgggagact tgagtgcaga agagaagagc ggaattccac gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc ggctctttgg tctgtaactg 720
acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatga gtgctaagtg ttagagggtt tccgcccttt agtgctgaag ttaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatcctc tgacaaccct agagataggg ctttcccttc ggggacagag tgacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg acaatacaaa gggttgcgag accgcgaggt ggagcgaatc ccataaaatt 1260
gttctcagtt cggattgcag gctgcaactc gcctgcatga agccggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
acgagagttt gtaacacccg aagtcggtgg ggtaaccgta aggagccagc cgctaagttg 1440
acagatgt 1448

Claims (8)

1.一种芽孢杆菌，其特征在于，命名为芽孢杆菌JY-23(Bacillus sp.JY-23)，于2021年12月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M20211638。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种如权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于，从家禽养殖场的土壤中筛选得到。
4.一种芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：采集含有芽孢杆菌的土壤；
步骤二：分别配制羽毛降解培养基、酪蛋白培养基以及LB培养基；
步骤三：将步骤一所述的土壤加入无菌生理盐水中，制得土壤悬液，将土壤悬液加入到羽毛降解培养基中，进行富集培养；
步骤四：取富集后的培养液，加入无菌水进行逐级稀释，分别吸取10-4、10-5、10-6稀释液200μL涂布在酪蛋白培养基的平板上，于恒温培养箱中培养；观察酪蛋白培养基平板上微生物的生长情况及菌落形态，初筛获得在酪蛋白培养基的平板上具有明显水解圈且有不同形态的单菌落，然后接种至LB培养基试管斜面上培养和保藏；
步骤五：将初筛的菌株斜面用无菌水洗出，充分摇匀，制备菌悬液；吸取菌悬液加入到装有40mL LB培养基的250mL三角瓶中，进行培养，获得种子液；按规定的接种量，将种子液接种在羽毛降解培养基中，进行培养，测定羽毛的降解率，并根据各菌株的羽毛降解率大小，复筛获得羽毛高效降解菌株。
5.根据权利要求4所述的一种芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述羽毛降解培养基包括：鸡羽毛，K2HPO4，NaCl，MgSO4·7H2O，CaCl2，FeSO4·7H2O，蒸馏水，pH 7.4-7.6，121℃湿热灭菌。
6.根据权利要求4所述的一种芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述酪蛋白培养基包括：酪蛋白，牛肉膏，NaCl，CaCl2，琼脂，蒸馏水，pH 7.2-7.6，121℃湿热灭菌。
7.根据权利要求4所述的一种芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述Luria broth(LB)培养基包括：蛋白胨，酵母浸粉，氯化钠，蒸馏水，pH 7.0，121℃灭菌。
8.一种如权利要求1-3任一所述的芽孢杆菌或4-7任一所述的筛选方法得到的芽孢杆菌在降解羽毛上的应用，其特征在于，在所述芽孢杆菌在以羽毛为唯一碳氮源的羽毛降解培养基下，前36h能够分泌角蛋白酶，致使羽毛角蛋白中的二硫键发生断裂，，在第72h时羽毛降解率至少为92％，且羽毛降解过程有效释放脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸和甘氨酸的游离氨基酸。
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