CN115772482A - 一株多功能贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株多功能贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及其应用，涉及微生物开发与应用技术领域。所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24943。本发明筛选到一株既具有较强降解毛发角蛋白能力，同时兼具强降解动物蛋白质和水解明胶和纤维素能力的多功能微生物菌株，该菌株可快速高效将羽毛或动物尸体蛋白降解成小分子肽或氨基酸，尤其是可降解成5KD左右的小分子肽，使得动物毛发或动物尸体可被降解形成动物源性生物肥料，用于促进植物生长；同时该菌株还有较好的耐盐碱性、耐酸性及对植物病原菌抑菌谱较广，是一株综合性能优异的多功能菌株，应用价值高。

Description

一株多功能贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物开发与应用技术领域，尤其是涉及一株多功能贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及其应用。

背景技术

近年来，新闻报道了一些动物尸体乱丢弃事件，引发了社会和公众对动物尸体如何处理的广泛关注。动物尸体如何安全处理关系人民生命健康安全，将畜牧、家禽养殖和屠宰过程中产生的动物尸体实施无害化处理，对防疫和保障食品安全尤为重要。常用的动物尸体无害化处理方法主要包括焚烧法、掩埋法、化学水解法、生物降解法(麻觉文等，2014)。焚烧法是通过氧化燃烧杀灭病原微生物，把动物尸体变为灰渣的过程，可以通过高温消灭病原微生物，但焚烧法会产生大气污染物，还存在疫病扩散的危险(***，2013)，需要消耗大量燃料，增加了处理成本(Kalbasi A等，2005)。掩埋法是将动物尸体及相关动物产品投入化尸窖或掩埋坑中并用石灰等覆盖、消毒，使之发酵或分解的方法；但其受到场地限制，容易造成土壤和地下水污染甚至病原微生物的再次扩散，同时对若干年后生物安全性难以评价，因此欧盟已禁止使用掩埋法处理动物尸体(范时，2012)。化制法是通过机械、加热或化学处理等方式，使动物尸体转变成肥料、蛋白固形物、可溶性脂肪或油脂和水的过程。化制法虽然能够灭活大部分病原，并可产生有价值的副产品，但对于温度及压力要求高，需要专门设备，前成本高(宋建德，2013)，并且无法杀灭朊病毒等，因此存在一定的生物风险。化学水解法是指在高温和碱性或酸性催化剂作用快速分解的化学反应下，将动物尸体、组织水解为骨渣和无菌水溶液的处理过程。生物降解是指利用微生物强大分解转化有机物质的能力，通过细菌或酶制剂分解有机物质(如动物尸体组织)变成有机肥料的过程，其分解后的产物经处理可做成有机肥，实现资源化再利用，因其简单实用、经济环保并能产生稳定高效植物肥料的特点，将成为染疫动物尸体无害化处理的主流方式。

组成生物体主要元素是C、H、O、N、P、S，N元素是植物生长过程中必不可少的养分，其在动物体内主要以蛋白质形式存在，蛋白质在动物体内是肉和血液的主要成分，废弃动物尸体含有大量肉和血液，因此废弃动物尸体是一种丰富的可利用资源，可将其降解为植物可吸收利用的养分，实现资源再利用。但是动物尸体的组成成分复杂，包括动物毛发、血液、皮、肉、脂肪、各种肠胃内容物、骨头、蹄以及犄角等各种成分，其中毛发主要组成是角蛋白，皮的主要组成是胶原蛋白和脂肪，肠胃内容物的主要组成为纤维素和脂肪，肉和血的组成主要是蛋白质，需根据动物尸体不同的组成成分筛选不同的酶进行特异性降解，然而酶制剂的组合难搭配，因为每一种酶的最佳催化酶解条件不一，很难达到统一。而微生物降解可以很好的解决这些问题，其产生的生物刺激素能够促进植物生长发育、缓解非生物胁迫及提高作物品质(白由路，2017)。因此，筛选可降解动物尸体的多功能微生物菌株具有重要的意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一株多功能贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及其应用。本发明菌株可快速高效将羽毛或动物尸体蛋白降解成小分子肽或氨基酸，尤其是可将羽毛粉/动物尸体蛋白降解成5KD左右的小分子肽，使得动物毛发以及动物尸体可被降解形成动物源性生物肥料，用于促进植物生长。

本发明提供的技术方案如下：

在一个方面，本发明提供了一株多功能贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24943。

本发明采用富集-高通量法筛选具有强降解毛发角蛋白，同时兼具强降解动物蛋白质能力和水解明胶和纤维素的多功能微生物。从土壤样品中筛选得到207株可降解毛发角蛋白能力的微生物，其中38株具有较强的、高效快速降解角蛋白的微生物，有8株同时兼具相对较强的降解蛋白质、角蛋白降解能力和水解纤维素、明胶功能的微生物菌株，其中有一株各种能力都相对较强的目标菌株命名为KY950a。研究发现该菌株在液体发酵羽毛粉以及液体发酵(经高温消毒处理的)动物尸体的条件下能较强的提高发酵液中水溶性蛋白质含量与氨基酸含量：与对照相比，在羽毛粉发酵中水溶性蛋白质含量提高达93.7％，氨基酸含量提高104.1％；在动物尸体发酵液中蛋白质含量提高117.5％，氨基酸含量提高256.7％。在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，只有菌株KY950a可将羽毛粉/动物尸体蛋白降解成主要集中在4.6-10KD左右的小分子肽或氨基酸。

根据对菌株KY950a进行16s rDNA序列(SEQ ID No.1)的测定结果，确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。

在一个方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂包含前述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a或其代谢产物。在本发明中，所述菌剂还可包含辅料或载体。所述辅料或载体为微生物菌剂中常用的辅料或载体。

在一个方面，本发明提供了前述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a或前述的菌剂的应用，所述应用包括以下一种或多种：(a)将角蛋白或含角蛋白的物质降解为5KD以下的多肽和氨基酸混合物；(b)将动物尸体蛋白降解为5KD以下的多肽和氨基酸混合物；(c)降解蛋白质；(d)水解纤维素或含纤维素的物质；(e)水解明胶或含明胶的物质；(f)促进植物生长或拮抗植物病原菌。

毛发的降解是动物尸体降解的重要环节之一，毛发主要由α-角蛋白或β-角蛋白组成，本发明在以毛发降解为突破点，先筛选解毛发角蛋白降解能力强的菌株，本发明菌株降解角蛋白的能力较强，角蛋白水解圈直径达到9.5mm，显著大于其他菌株；并且该菌株能够在解蛋白固体培养基、含明胶的液体培养基以及解纤维素固体培养基上进行生长，表明其同时具有蛋白质、明胶、纤维素水解功能。因此，本发明提供了该菌株在降解羽毛粉或动物尸体蛋白生产氨基酸、多肽和/或可溶性肽方面的应用。

不同的微生物会产生不同的酶种类，并且对相同对象的降解效果会产生很大差异。肽是介于氨基酸和蛋白质之间的物质，是生物刺激素的功能性物质之一。小分子肽是重要的胞间信号感应分子，是氨基酸肥料发挥作用的重要成分。本发明筛选出的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a可快速高效将动物尸体蛋白降解为小分子肽和氨基酸的菌株，特别是将含角蛋白的羽毛粉或动物尸体蛋白降解成5KD左右的小分子肽、氨基酸，可用于降解羽毛粉或动物尸体以形成动物源性肥料，进而用于植物种植或栽培，促进植物生长或拮抗植物病原菌。

在一个实施方案中，所述含角蛋白的物质包括动物毛发例如家禽羽毛；优选地，所述含角蛋白的物质为羽毛粉。本发明菌株可直接利用未经过处理的动物尸体或经处理过(例如高温或化学法处理)的动物尸体。

在一个实施方案中，所述植物病原菌包括番茄早疫病菌、梨黑斑病菌、水稻纹枯病菌、苹果斑点落叶病菌、小麦纹枯病菌、白枯病菌中的一种或多种。在一个实施方案中，所述促进植物生长或拮抗植物病原菌包括促进作物例如玉米等作物的生长，如菌株KY950a羽毛粉发酵液或菌株KY950a处理(经高温消毒处理的)动物尸体的发酵液可提升干重、叶绿素含量及氮含量，经处理的玉米长势更好，叶片更翠绿且舒展度较大。

在一个方面，本发明提供了一种降解羽毛或动物尸体蛋白生产可溶性肽或氨基酸溶液的方法，所述方法包括利用前述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a的菌液与羽毛或动物尸体共同进行液体发酵。

在一个方面，本发明提供了一种酶菌联合降解羽毛或动物尸体的方法，所述方法包括使用前述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a的菌液与酶制剂共同对羽毛或动物尸体进行协同发酵。在一个实施方案中，所述酶制剂包括蛋白酶、纤维素酶、胶原蛋白水解酶、淀粉酶中的一种或多种；优选为蛋白酶。

在一个方面，本发明提供了一种含生物刺激素的发酵肥料，其特征在于，所述发酵肥料由前述任一项方法制备获得。在一个方面，本发明提供了所述的发酵肥料在促进植物生长和/或植物防病中的应用。

本发明可利用微生物降解的方法处理经高温消毒或他方法(如化学法)处理的动物尸体产生含氨基酸的肥料，含氨基酸的肥料是一种生物刺激素类产品，包含氨基酸、肽类、糖类等的混合物。氨基酸肥料中小分子肽是氨基酸肥料发挥作用的重要成分，本发明的研究也表明与其他菌株(包括其他贝莱斯芽孢杆菌菌株)相比，菌株KY950a与羽毛粉/经高温消毒处理的动物尸体发酵液对植物(如玉米)的生长促进作用更强。所述肥料产品富含生物刺激素、氨基酸、小分子肽、蛋白质。

生物样品保藏信息：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a，该菌株已于2022年5月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为：CGMCC No.24943；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。经保藏中心于2022年5月23日检测为存活菌株。

有益效果：

本发明菌株除了高效降解毛发角蛋白和动物蛋白，同时是一株兼具明胶(动物尸体皮的主要成分)、纤维素(动物尸体肠胃内容物的主要成分)水解的多功能微生物菌株，以该多功能微生物菌株处理经高温消毒处理后的动物尸体组织，可形成一款富含生物刺激素、氨基酸、小分子肽、蛋白质的生态安全的氨基酸肥料产品。

本发明菌株对动物尸体的降解能力强，可将动物尸体蛋白降解转化成为具有促进植物健康生长功能的小分子肽或氨基酸(处理动物尸体发酵液样品均集中在4.6-10KDa左右，且主要集中在5KDa左右)，可同时实现促进植物生长、防治植物病害。

本发明菌株KY950a羽毛粉发酵液或菌株KY950a处理(经高温消毒处理的)动物尸体的发酵液对植物生长有促进作用，这种明显高于0.1M NaOH、酶制剂1、商业菌株92068、DSM7以及同为贝莱斯芽孢杆菌KY913(J-913)处理的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的角蛋白培养基筛选阳性菌株示意图；

图2为本发明实施例提供的角蛋白/蛋白/纤维素培养基菌株水解情况对比示例图(其中，a和b为角蛋白固体培养基；c和d为蛋白质固体培养基；e和f为纤维素固体培养基)；

图3为本发明实施例提供的不同方法、不同菌株对(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液的SDS-PAGE结果(泳道1-9分别为水，0.1M HCL，0.1M NaOH，酶制剂1(康生元粗提酶制剂)，酶制剂2(市售的常规中性蛋白酶制剂)，酶制剂3(市售的常规胃蛋白酶制剂)，92068，J-676、J-962发酵处理的经高温消毒处理的动物尸体发酵液样品；泳道10-18分别为菌株J-806、J-955、J-913(即KY-913)、J-552、J-568、J-577、J-662、KY950a、J-997发酵处理的经高温消毒处理的动物尸体发酵液样品)；

图4为本发明实施例提供的菌株KY950a显微镜下观察结果；

图5为本发明实施例提供的不同羽毛粉发酵液浇灌玉米植株的生物学结果；

图6为本发明实施例提供的不同处理(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌玉米植株的生物学结果(1)；

图7为本发明实施例提供的不同处理(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌玉米植株的生物学结果(2)；

图8为本发明实施例提供的菌株KY950a与植物病原真菌和细菌的拮抗试验结果(其中，a为番茄早疫病；b为梨黑斑病；c为水稻纹枯病；d为苹果斑点落叶病；e为小麦纹枯病；f为病原细菌白枯病)；

图9为本发明实施例提供的菌株KY950a抗逆性测定结果(其中，a为pH4.6的培养基；b为pH10.5的培养基；c为pH11.7的培养基；d为10％KNO₃的培养基；e为15％KNO₃的培养基；f为20％KNO₃的培养基)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.利用高通量法筛选具有降解角蛋白能力的微生物菌株

1.1土样的采集

选择具有代表性的样品，样品可以来源于农田、牧草地、森林土等不同的区域，每个点采集15-20g样品，同时标明来源地(省，县)、采集年和月、土壤的来源(植物或其他)，保藏于-80℃冰箱。

1.2利用富集法筛选具有降解角蛋白能力的微生物菌株

第一步富集：取0.5g土样于50mL纯净水中摇匀，取其中500μL混合液于含0.5％角蛋白的液体培养基中(角蛋白5g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠0.5g，水1L，121℃灭菌20min)，在30℃下200r/min震荡培养2-3天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。

第二步富集：取上一步富集的菌液500μL于含0.5％角蛋白的液体培养基，在30℃下，200r/min震荡培养2-3天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。

第三步富集：取第二步富集的菌液500μL于含0.5％角蛋白的液体培养基，30℃，200r/min震荡培养2-3天，观察记录液体培养基颜色、浑浊度等的变化。

1.3涂布法筛选具有降解角蛋白的功能微生物菌株

取最后一次富集的菌液100μL经稀释后涂布于含0.5％角蛋白的固体选择培养基(角蛋白5g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠0.5g，琼脂粉15g，水1L，121℃灭菌20min)，观察记录含0.5％角蛋白的选择性培养基菌株生长及水解角蛋白情况。从上述培养基中挑取具有角蛋白水解功能的菌株于R2A培养基(蛋白胨0.5g，酵母粉0.5g，葡萄糖0.5g，胰蛋白胨0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，丙酮酸钠0.3g，琼脂粉15g，水1L，121℃灭菌20min)上划线培养纯化。

1.4重复验证

为了确保菌株降解角蛋白能力，将所得可降解角蛋白的目标菌株，再次划线针刺于角蛋白固体选择培养基，30℃培养，验证所挑取的菌落是否具有降解角蛋白功能，排除假阳性菌落。图1为角蛋白培养基筛选阳性菌株示意图。

1.5结果

通过上述方法对所采集到的17个不同省市的69个土样进行富集-高通量法筛选，筛选得到207株具有降解角蛋白能力的微生物菌株菌株，其中38株具有较强的、高效快速降解角蛋白的微生物。

由于动物尸体主要成分复杂，不仅含有毛发，还有皮、脂肪、肉、骨头、肠胃内容物、蹄角等成分，且不同微生物菌株产生胞外蛋白水解酶的种类和数量不同，对不同成分的降解能力就会产生差异，而这些差异主要反映在肽分子大小、氨基酸的组成比例以及生物大分子组成的不同，会对植物生长促进作用产生差异化影响。

为此本发明旨在筛选可将(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白等动物尸体难降解的(如毛发、皮、肠胃内容物等)、含量最多的成分实现快速降解的多功能微生物菌株，故首先从筛选降解毛发的微生物菌株入手，筛选具有特异性降解角蛋白的微生物菌株，接着从这38株较强的可高效快速降解角蛋白的微生物菌株中筛选出具有更强的蛋白质、明胶、纤维素水解功能的菌株，接着利用BCA法和茚三酮法测定不同微生物对羽毛粉以及(经高温消毒处理的)动物尸体在液体发酵条件下的可溶性蛋白含量和氨基酸含量，然后进一步利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)法筛选出可以把(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白降解成5KDa左右小分子物质的目标微生物菌株。

实施例2.筛选可以把(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白降解成5KDa左右的小分子肽、氨基酸的目标微生物菌株

2.1筛选具有更强的蛋白质、明胶、纤维素水解功能的菌株

2.1.1筛选具有更强的蛋白质水解功能的菌株

将筛选到的38株可降解角蛋白的微生物菌株在R2A培养基上培养生长2天，针刺于含0.5％角蛋白的固体选择培养基(角蛋白5g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠0.5g，琼脂粉15g，水1L，121℃灭菌20min)和解蛋白质固体培养基(蛋白胨0.5g，酵母粉0.5g，葡萄糖0.5g，胰蛋白胨0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，丙酮酸钠0.3g，脱脂奶粉5g，琼脂粉15g，水1000mL，121℃灭菌20min)中，室温下培养，待水解圈出现后测量不同菌株的角蛋白/蛋白水解圈的直径，单位mm。设置商业菌株92068为对照(菌株92068是市场上常用的枯草芽孢杆菌，多用于植物防病、促生)。

解角蛋白/蛋白能力＝解角蛋白/蛋白圈直径的毫米数+X；

X为加权系数，根据菌株解蛋白圈的透明程度，相应的为0、1、2；(注：X为加权系数，根据菌株水解圈的透明程度，相应的为：0、1、2。数字2代表水解圈全完全透明；数字1代表溶解圈半透明；0代表溶解圈不透明。)

2.1.2筛选具有明胶水解功能的菌株

将筛选到的38株可降解角蛋白的微生物菌株在R2A培养基上培养生长2天，以OD_600nm＝0.05的量接种到含1％明胶的液体培养基(明胶10g，葡萄糖1g，蛋白胨0.25g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，水1L，121℃灭菌20min)中，设置空白对照后，30℃室温下200rpm/min摇床培养过夜，待液体浑浊后将其至于4℃环境下，观察液体是否凝固，若凝固则表明该菌株不具有水解明胶的能力，若液体可流动，则说明菌株具有水解明胶的能力。

2.1.3筛选具有更强纤维素水解功能的菌株

将筛选到的38株可降解角蛋白的微生物菌株在R2A培养基上培养生长2天，针刺于解纤维素固体培养基(羧甲基纤维素钠2g，酵母粉2g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.25g，琼脂粉15g，水1000mL，121℃灭菌20min)中，设置商业枯草芽孢细菌(菌株92068)为对照，30℃温箱培养1-2d，然后用碘液熏蒸，测定解CMC圈的直径，单位mm。

解CMC能力＝解CMC圈直径的毫米数+X；

X为加权系数，根据菌株水解圈的透明程度，相应的为0、1、2(注：X为加权系数，根据菌株水解圈的透明程度，相应的为：0、1、2。数字2代表水解圈全完全透明；数字1代表溶解圈半透明；0代表溶解圈不透明。)

2.1.4微生物菌株角蛋白/蛋白质/明胶/纤维素水解功能测定结果

对筛选的到的38株微生物菌株进行角蛋白/蛋白质/明胶/纤维素水解功能测定，结果发现38株微生物菌株中有8株(J-577、J-662、J-997、J-552、J-568、J-955、J-676和KY950a)同时兼具相对较强的降解蛋白质、角蛋白降解能力和水解纤维素、明胶功能的微生物菌株。

图2示出了角蛋白/蛋白/纤维素培养基菌株水解情况。表1示出了部分菌株对角蛋白、蛋白质、纤维素和明胶的水解能力的结果。

表1.部分菌株对角蛋白、蛋白质、纤维素和明胶的水解能力的结果

从图2和表1可以看出，部分微生物菌株同时具有强角蛋白降解能力和强蛋白质降解能力，还兼具水解纤维素、明胶功能，如菌株KY950a、J-997、J-955、J-577等；但也可反映出，微生物菌株降解角蛋白能力与其降解蛋白质的能力不一定成正相关。降解角蛋白能力较弱的，其降解蛋白质能力也可以很强，如菌株J-456、J-806、J-913；相反降解角蛋白较强的菌株，其降解蛋白质的能力可以很弱，如菌株J-568。在这38株中，菌株J-913(在本发明中也称为KY-913)及同为贝莱斯芽孢杆菌菌株，但其降解角蛋白能力非常弱。

因此需利用BCA法测定这8株微生物菌株在液体发酵中是否具有预期降解羽毛角蛋白以及(经高温消毒处理的)动物尸体的能力，接着进一步利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)法筛选出可以把羽毛角蛋白及(经高温消毒处理的)动物尸体降解成5KDa左右小分子物质的目标微生物菌株。

2.2利用BCA法测定微生物菌株在液体发酵条件下降解羽毛粉及(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白质的能力

2.2.1液体发酵

将筛选得到的8株菌株，分别接种到100mL液体培养基(豆粕1g，葡萄糖1g，磷酸氢二钾0.30g，丙酮酸钠0.30g，硫酸镁0.05g，水1000mL，121℃灭菌20min)，30℃，200rpm下摇瓶培养过夜，然后各取10mL菌液加入已装有10g羽毛粉/(经高温消毒处理的)动物尸体(猪、牛混合动物尸体，经≥140℃，绝对压力≥0.5MPa的高温高压处理≥4小时)的锥形瓶中进行液体发酵，设置等体积水以及等体积商业菌株92068菌液处理的羽毛粉/(经高温消毒处理的)动物尸体液体发酵液为对照，发酵完成后取上清用BCA法和茚三酮法进行测定，测定其上清液中可溶性蛋白的含量和氨基酸含量。

2.2.2BCA法测定可溶性蛋白的含量

取各个稀释度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各0.1mL，加入到标记好的试管中；在每个试管中加入2.0mL工作液，充分混合；将试管密封，37℃，孵育30min，后将试管冷却至室温；将分光光度计设定在562nm，以水为对照调零，在10分钟内依次检测样品的吸光值；将各个标准品和待测样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值；将BSA标准品在562nm处经过空白校正的吸光值对其浓度(μg/mL)作图，绘制标准曲线，使用该标准曲线来确定每个待测样品的蛋白质浓度。

2.2.3茚三酮法测定发酵液氨基酸的含量

1.取50mg的色氨酸标准品，加水定容至100mL，得0.5mg/mL的色氨酸标准溶液，按一定梯度(0、50、100、150、200、250、300μg/mL)取标准液与茚三酮试剂显色，用分光光度计测定OD_570nm。以OD_570nm为纵坐标绘制标准曲线。

2.取样品液0.1mL，加入pH 5.5，0.2mol/L醋酸缓冲液2mL和茚三酮显色液2mL,混匀后于100℃沸水浴中煮沸30min，自来水冷却室温。放置5min后，加6mL 50％乙醇稀释，摇匀后测定OD_570nm(生成的颜色在60min内稳定)。将样品测定的OD_570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量(μg/ml)。

2.2.4结果

将筛选得到的菌株的菌液与羽毛粉/(经高温消毒处理的)动物尸体进行液体发酵后离心取上清用BCA法和茚三酮法进行测定，测定其上清液中可溶性蛋白的含量和氨基酸含量，结果如下表2和表3：

表2.菌株与羽毛粉/(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白质发酵后BCA测定可溶性蛋白结果

表3.部分菌株与羽毛粉/(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白质发酵后茚三酮测定氨基酸含量结果

从表2和表3可以看出，在液体发酵条件下，与对照(水处理羽毛粉/动物尸体发酵液)相比，筛选得到的8株菌株的羽毛粉/(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液中水溶蛋白的含量均有不同程度的提高，且不同菌株对羽毛粉/(经高温消毒处理的)动物尸体的水解能力有一定差别菌株，其中菌株KY950a能在液体发酵羽毛粉及(经高温消毒处理的)动物尸体条件下可较强地提高发酵液中水溶性蛋白质含量和氨基酸含量：与对照相比，在羽毛粉发酵中水溶性蛋白质含量提高达93.7％，氨基酸含量提高104.1％；在(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液中蛋白质含量提高117.5％，氨基酸含量提高256.7％。

因此可初步将KY950a确定为本研究的目标菌株，以进行后续试验。接着利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)对此筛选所得菌株进行进一步筛选，最终确定可将(经高温消毒处理的)动物尸体降解到5KDa左右小分子肽、氨基酸的目标菌株。

2.3利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)进一步筛选可将羽毛粉/(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白质降解到5KDa左右小分子肽、氨基酸的目标菌株

2.3.1利用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)测定目标菌株降解(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白质的能力

SDS-PAGE：分离胶16.5％；浓缩胶5％。

16.5％分离胶(10mL)的组成：1.8mL蒸馏水；5.5mL 30％胶贮液(Acry)；2.5mLpH8.8 Tris-Hcl缓冲液；0.1mL 10％SDS；0.1mL 10％AP；4μL TEMED；1.0mL甘油。

5％浓缩胶(5mL)的组成：3.40mL蒸馏水；0.83mL 30％胶贮液(Acry)；0.63mL pH6.8Tris-Hcl缓冲液；0.05mL 10％SDS；0.05mL 10％AP；2μL TEMED。

1.用加样枪将上述配制的分离胶溶液注入准备好的制胶玻板中，至2/3处停止，立即在胶上方用蒸馏水或无水乙醇封闭。室温放置约60min，见清晰界线。倒去蒸馏水或无水乙醇，用滤纸吸干残留液体。按上述配制浓缩胶，注入玻板间，立即加入梳子，固定约40min。

2.根据BCA所测得蛋白浓度，每个孔上样量为60μg，计算蛋白样品体积，与5×上样缓冲液混合，混匀，100℃煮沸变性5min。

3.浓缩胶凝固后，组装好电泳装置，加入SDS电泳缓冲液，拔下梳子，上样(以Thermo Spectra^TM多色低分子量蛋白分子量标准为Marker)，设置用水、酸、碱、3种不同酶制剂、92068发酵处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液为对照，进行电泳，电泳条件是：浓缩胶80V恒压、分离胶120V恒压。当溴酚蓝大约跑至胶底部，即停止电泳。

2.3.2结果

对跑完电泳的凝胶用染色液进行染色后，用脱色液进行脱色至条带清晰可见，放置于电泳成像仪中进行成像，结果见图3。泳道2-6与泳道1空白对照水处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液样品相比，在同等上样量的条件下，0.1M HCL、0.1M NaOH及三种不同酶制剂对(经高温消毒处理的)动物尸体是具有降解作用的，跑胶结果显示酸、碱以及酶制剂2对(经高温消毒处理的)动物尸体有一定的降解能力，但对降解能力最强的为泳道4和6所对应的酶制剂1、酶制剂3，二者所得的产物均已降解成氨基酸分子，但由于氨基酸分子量为128Da，因此在胶上没有条带显示，此为正常现象；泳道7--18为不同菌株处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液样品的跑胶结果，可以看出在同等上样量的条件下，不同菌株对(经高温消毒处理的)动物尸体的水解能力有一定的差别，与泳道2-3(0.1M HCL，0.1MNaOH)、泳道4，6(酶制剂1，3)的跑胶结果相比，泳道7-9、泳道10-12、泳道14所对应的微生物菌株对(经高温消毒处理的)动物尸体的降解能力相对较弱，体现在凝胶上：对应泳道每个区间均有数量较多且深浅不一的条带；泳道13、泳道15-18所对应的菌株处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液跑胶结果表明与泳道7-9、泳道10-12、泳道14所对应的微生物菌株相比，用这些菌株处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液样品在凝胶上的产物分子量条带数量较少且颜色相对较浅，说明对(经高温消毒处理的)动物尸体的降解能力更强；其中泳道17(KY950a)处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液样品均集中在4.6-10KDa左右，且主要集中在5KDa左右，同时比酶制剂2对经高温消毒处理的)动物尸体的降解能力强，因此本研究以该菌株为研究对象开展后续试验。

实施例3.目标菌株KY950a的16sDNA测序及菌株生理形态分析

3.1菌株KY950a的16S DNA测序

3.1.1CTAB法提取细菌DNA

1、接种一单菌落于5mL R2A中，30℃培养过夜；

2、取1mL种子培养液接入100mL R2A液体中，37℃、220r/min培养16小时；

3、5000r/min离心10分钟，弃去上清。

4、加入10mL TE离心洗涤后，用10mL TE溶解菌体，混匀，-20℃保存备用；

5、取3.5mL菌悬液，加入184μL 10％SDS，混匀，加入37μL 10mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育1小时；

6、加入740μL 5mol/L NaCl，再加入512μL CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10分钟；

7、加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；

8、上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混匀，10000r/min离心5分钟，保留上清；

9、加入0.6倍的异丙醇，混匀，10000r/min离心5分钟，收集DNA沉淀，用70％乙醇离心洗涤DNA沉淀；

10、用1mL TE溶解DNA，加入终浓度为20μg/mL RNaseA，4℃保存。

3.1.2扩增与测序

采用16S rDNA通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQ ID No.2)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，SEQ ID No.3)进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性30s；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化测序。

菌株KY950a的16S DNA测序结果如下序列1(SEQ ID No.1)：

GGACTGGGCGGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGGACAGAGTG。

根据获得KY950a的16S rDNA序列(序列1)在GenBank搜索同源序列并进行同源序列分析对比，同时与国际细菌学委员会认可的16sRNA数据库(chun’s lab)进行序列比对并结合文献分析，来确定目标微生物的分类地位(Yoon,S.H.,Ha,S.M.,Kwon,S.,Lim,J.,Kim,Y.,Seo,H.and Chun,J.(2017).Introducing EzBioCloud:A taxonomically uniteddatabase of 16S rRNA and whole genome assemblies.Int J Syst EvolMicrobiol.67:1613-1617)。结果表明，该菌株的1456碱基序列与菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)具有99.22相似度的高度同源，确定KY950a为Bacillusvelezensis。

3.2KY950a(Bacillus velezensis)菌株形态观察

将筛选的菌株接种到R2A平板上，室温下培养24h，观察菌落的大小、形状、颜色、光泽度、黏稠度、***形状、透明度、边缘特征等。

3.2.1菌株形态观察结果

经观察，菌株KY950a在R2A培养基上培养生长2d，显微镜下观察KY950A菌株呈杆状，菌落在培养基上呈圆形，菌落白色，边缘较整齐，较大，不透明，粘稠，经显微镜测定其菌落直径约4-8μm左右，孢子直径约2-3μm。

实施例4.菌株KY950a+羽毛粉/经高温消毒处理的动物尸体发酵液的生物学测定

为了验证菌株KY950a水解发酵羽毛粉/(经高温消毒处理的)动物尸体的能力，拟采用以一株广泛应用的商业菌株92068(菌株92068是市场上常用的枯草芽孢杆菌，多用于植物防病、促生)为对照，比较它们对植物的生长是否具有促进作用。同时，进一步利用菌酶协同的方法，将KY950a菌株与酶制剂复配作优化，将动物尸体尽可能水解成肽、氨基酸，与KY950a本身所产生的细菌生物刺激素组合形成“生物刺激素-氨基酸肥料”产品。

4.1菌株KY950a羽毛粉发酵液对玉米植株生长作用的生物学测定

取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子播种于装有蛭石的盆栽中，观察盆中蛭石的湿润情况，适时浇灌(一般间隔2天浇灌一次)，直至玉米萌发；对照菌株：选取商业菌株92068、菌株DSM7(市场上常用的解淀粉芽孢杆菌，多用于植物防病、促生)以及与另外一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY913做对照菌株；将OD₆₀₀＝0.05的92068、DSM7、KY913、KY950a菌株接种到含100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下200r/min培养48小时；将上述菌悬液分别等体积加入含100克羽毛粉的烧杯中混匀，室温静置发酵24小时；将商业菌株92068-羽毛粉发酵液、DSM7-羽毛粉发酵液、KY913-羽毛粉发酵液、KY950a-羽毛粉发酵液经稀释相同倍数后适时等量浇灌于玉米盆栽，设置水为空白对照，水-羽毛粉发酵液为阴性对照，酶制剂1和0.1M NaOH处理的羽毛粉发酵液为阳性对照；每天观察记录玉米生长情况，定时补浇。待玉米植株生长，每隔2天用叶绿素测定仪测定并记录不同组别玉米植株叶面的叶绿素含量和氮素含量；

玉米生长30天后，将不同组别的玉米茎叶部剪下，放入已烘干的培养皿，置于烘箱进行烘干(105℃杀青，85℃烘干至恒重)，记录不同组别玉米植株干重。

4.1.1菌株KY950a羽毛粉发酵液对玉米植株生长作用的生物学测定结果

玉米生长30天后，对不同组别玉米(每组6棵)进行叶绿素含量及氮含量测定，同时拍照记录不同组别玉米植株间的区别，完成后对玉米茎叶部进行烘干处理，结果如下：

表4.不同组别的玉米烘干后干重

表5.不同组别的玉米叶面叶绿素含量及氮素含量结果

从表4可见：①用不同菌株处理与水处理的羽毛粉发酵液浇灌的玉米烘干后干重比单纯浇水的玉米干重高；②KY950a菌株的羽毛粉发酵液浇灌的玉米烘干后干重比水、水+羽毛粉处理提高95.7％和40.6％，且明显高于0.1M NaOH、酶制剂1、商业菌株92068、DSM7以及同为贝莱斯芽孢杆菌KY913处理的羽毛粉发酵液所浇灌的玉米干重。

由表5可得：①用不同菌株处理与水处理的羽毛粉发酵液浇灌的玉米平均叶绿素含量和平均氮素含量比单纯浇水的玉米干重高；②浇灌KY950a处理的羽毛粉发酵液的玉米的平均叶绿素含量和平均氮素含量明显高于浇灌水、0.1M NaOH、商业菌株92068、DSM7及同为贝莱斯芽孢杆菌KY913处理的羽毛粉发酵液所浇灌的玉米；浇灌KY950a处理的羽毛粉发酵液的玉米的平均叶绿素含量和平均氮素含量与酶制剂1处理的羽毛粉发酵液的玉米差别不大。

从图5中A-B可以看出，浇灌KY950a处理的羽毛粉发酵液的玉米与单纯浇水及用水处理的羽毛粉发酵液浇灌的玉米长势更好，且从俯视图可以看出浇灌KY950a处理的羽毛粉发酵液的玉米的叶面更加翠绿和宽大；从图5中C-H可以看出，与0.1MNaOH、商业菌株92068、DSM7处理的羽毛粉发酵液浇灌的玉米植株相比，浇灌KY950a处理的羽毛粉发酵液的玉米的叶面舒展度、颜色及叶面大小更胜一筹；从图5中I-L可以看出，与酶制剂1及同为贝莱斯芽孢杆菌的菌株KY913处理的羽毛粉发酵液浇灌的玉米植株相比，浇灌KY950a处理的羽毛粉发酵液的玉米植株整体植株更高大，叶片更为翠绿且舒展度较大。

综上可得，不管是玉米植株干重、平均叶绿素含量和平均氮素含量还是玉米叶面宽度，经菌株KY950a处理的羽毛粉发酵液浇灌的玉米生长情况都要更好，表明KY950a菌株本身对羽毛粉降解作用更强，且其对植物的生长具有较强促进的作用。

4.2菌株KY950a处理(经高温消毒处理的)动物尸体的发酵液对玉米植株生长作用的生物学测定

(1)取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子播种于装有蛭石的盆栽中，观察盆中蛭石的湿润情况，适时浇灌(一般间隔2天浇灌一次)，直至玉米萌发；

(2)对照菌株：选取商业菌株92068、菌株DSM7(市场上常用的解淀粉芽孢杆菌，多用于植物防病、促生)以及与另外一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY913做对照菌株；

(3)将OD₆₀₀＝0.05的92068、DSM7、KY913、KY950a菌株接种到含100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃下200r/min培养48小时；

(4)将上述菌悬液分别等体积加入含100克经高温消毒处理的动物尸体(以下简称“动物尸体”)的烧杯中混匀，室温静置发酵24小时；

(5)将商业商业菌株92068-动物尸体发酵液、DSM7-动物尸体发酵液、KY913-动物尸体发酵液、酶制剂1-动物尸体发酵液、酶制剂2-动物尸体发酵液、KY950a-动物尸体发酵液、KY950a-酶制剂1-动物尸体发酵液经稀释相同倍数后适时等量浇灌于玉米盆栽，设置水为空白对照，水-动物尸体发酵液为阴性对照，酶制剂1、酶制剂2和0.1M NaOH处理的羽毛粉发酵液为阳性对照；每天观察记录玉米生长情况，定时补浇。

(6)待玉米植株生长，每隔2天用叶绿素测定仪测定并记录不同组别玉米植株叶面的叶绿素含量和氮素含量；

(7)玉米生长30天后，将不同组别的玉米茎叶部剪下，放入已烘干的培养皿，置于烘箱进行烘干(105℃杀青，85℃烘干至恒重)，记录不同组别玉米植株干重。

4.2.1菌株KY950a处理(经高温消毒处理的)动物尸体的发酵液对玉米植株生长作用的生物学测定结果

玉米生长30天后，对不同组别玉米(每组6棵)进行叶绿素含量及氮含量测定，同时拍照记录不同组别玉米植株间的区别，完成后对玉米茎叶部进行烘干处理，结果如下：

表6.不同组别的玉米烘干后干重

表7.不同组别的玉米叶面叶绿素含量及氮素含量结果

从表6可见：①用不同菌株处理与水处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌的玉米烘干后干重比单纯浇水的玉米干重高；②KY950a菌株的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌的玉米烘干后干重比单纯水浇灌、水处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌的干重提高104.3％和51.6％，且明显高于0.1M NaOH、酶制剂1、商业菌株92068、DSM7以及同为贝莱斯芽孢杆菌KY913处理的水处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液发酵液所浇灌的玉米干重；③KY950a菌株复合酶制剂1处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌的玉米干重最高。

由表7可得：①用不同菌株处理与水处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌的玉米平均叶绿素含量和平均氮素含量比单纯浇水的玉米干重高；②浇灌KY950a处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液的玉米的平均叶绿素含量和平均氮素含量最高，且明显高于浇灌水、0.1M NaOH、酶制剂1、酶制剂2、商业菌株92068、DSM7及同为贝莱斯芽孢杆菌KY913处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液所浇灌的玉米。

从图6中a-j可以看出，浇灌KY950a处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液的玉米与单纯浇水、用水处理的、0.1M NaOH、商业菌株92068、DSM7及同为贝莱斯芽孢杆菌的菌株KY913处理(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌浇灌的玉米长势更好，且从俯视图可以看出浇灌KY950a处理的发酵液的玉米的叶面更加翠绿和宽大；从图7中k-n可以看出，与酶制剂1、酶制剂2处理的发酵液浇灌的玉米植株相比，浇灌KY950a处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌的玉米植株整体植株更高大，叶片更为翠绿且舒展度较大。

综上可得，(经高温消毒处理的)动物尸体经微生物菌株处理后能提供植物生长所需的营养成分，且不同菌株处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液对植物的生长促进作用有一定的差异。与商业菌株92068、DSM7以及同为贝莱斯芽孢杆菌的菌株KY913相比，不管是玉米植株干重、平均叶绿素含量和平均氮素含量还是玉米叶面宽度，经菌株KY950a处理的羽毛粉或者(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液浇灌的玉米生长情况都要更好，同时也强于用化学方法处理和单一酶制剂处理的(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液，由此表明KY950a对植物的生长促进作用更强，同时也表明菌株KY950a在其生长繁殖过程中能产生促进植物生长的物质，用其发酵的羽毛粉发酵液和(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液能将此作用放大，实现“1+1>2”的效果。

实施例5.KY950a菌株多功能试验测定

由于菌株KY950a处理的动物尸体发酵液产品含有微生物菌株KY950a，而据报道此微生物菌株具有高效广谱抗菌活性和植物促生能力，因此本试验的目的是测定该菌株具体的抗植物病原真菌和细菌作用以及测定该菌株的其他功能，以确保后续该动物源氨基酸发酵液产品对真菌的抗性，提高产品效果。

5.1菌株与植物病原真菌和细菌的拮抗试验

植物病原真菌拮抗实验：将菌株KY950a与实验室现有植物病原真菌接种到PDA培养基上进行平板对峙试验，根据不同病原真菌适宜的温度分别培养，观察试验结果，测定菌株对病原真菌抗性。设置枯草芽孢杆菌92068菌株为对照。

植物病原细菌拮抗实验：将植物病原细菌接种到R2A液体培养基中，30℃培养24h，测定OD₆₀₀，后按终浓度OD₆₀₀＝0.05稀释于R2A固体培养基中，倒平皿，将菌株KY950a接种在该培养皿上，测定菌株对病原细菌的抗性。设置枯草芽孢杆菌92068菌株为对照。

5.1.1菌株抗植物病原菌试验结果

结果测定(图8)表明，与对照菌株92068相比，菌株KY950a对番茄早疫病、梨黑斑病、水稻纹枯病、苹果斑点落叶病、小麦纹枯病具有更强或者相似的拮抗作用，且具有更强的拮抗植物病原细菌白枯病的作用。

5.2菌株抗逆性测定

将菌株KY950a分别接种到条件为pH4.6、pH10.5、pH11.7、10％KNO₃、15％KNO₃、20％KNO₃的R2A培养基上，观察菌株是否生长，以及生长是否受抑制和生长速度的快慢。设置枯草芽孢杆菌92068菌株为对照。

5.2.1菌株KY950a抗逆性测定结果

结果测定(图9)表明，与对照菌株92068相比，菌株KY950a具有相似的耐盐性和耐碱性；但菌株KY950a比菌株92068具有更强的耐酸性。

结论：本发明通过采用高通量法筛选方法从山东省淄博市高青县大官村采集的土壤中分离到了一株具有可将(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白降解成5KD左右的小分子肽、氨基酸，促进植物生长同时兼具提高作物生防及抗逆能力的贝莱斯芽孢杆菌KY950a，该菌株的1456碱基序列与菌株Bacillus velezensis具有99.22％的高度同源，确定KY950a为Bacillus velezensis。本发明发现KY950a与商业菌株枯草芽孢菌株92068相比，KY950a对(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白和角蛋白的水解能力更强，其水解(经高温消毒处理的)动物尸体蛋白产物均集中在5KDa左右；与商业菌株92068、商业酶制剂处理的羽毛粉发酵液和(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液相比，KY950a处理的羽毛粉发酵液和(经高温消毒处理的)动物尸体发酵液具有更强的促进植物生长的能力；研究还发现菌株KY950a还兼具较强的纤维素降解能力和明胶水解能力，同时该菌还有较好的耐盐、耐碱性、耐酸性及对植物病原菌抑菌谱较广的特点。可见，KY950a是一株对(经高温消毒处理的)动物尸体各种复杂组分都有强降解能力，可将(经高温消毒处理的)动物尸体转化成小分子肽、氨基酸，可促进植物生长同时兼具防治植物病害、可耐盐和耐酸碱的功能性微生物菌株。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一株多功能贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24943。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a或其代谢产物。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a或权利要求2所述的菌剂的应用，其特征在于，所述应用包括以下一种或多种：

(a)将角蛋白或含角蛋白的物质降解为5KD以下的多肽和氨基酸混合物；

(b)将动物尸体蛋白降解为5KD以下的多肽和氨基酸混合物；

(c)降解蛋白质；

(d)水解纤维素或含纤维素的物质；

(e)水解明胶或含明胶的物质；

(f)促进植物生长或拮抗植物病原菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含角蛋白的物质包括动物毛发；优选地，所述含角蛋白的物质为羽毛粉。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌包括番茄早疫病菌、梨黑斑病菌、水稻纹枯病菌、苹果斑点落叶病菌、小麦纹枯病菌、白枯病菌中的一种或多种。

6.一种降解羽毛或动物尸体蛋白生产可溶性肽或氨基酸溶液的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a的菌液与羽毛或动物尸体进行液体发酵。

7.一种酶菌联合降解羽毛或动物尸体的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)KY950a的菌液与酶制剂对羽毛或动物尸体进行协同发酵。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶制剂包括蛋白酶、纤维素酶、胶原蛋白水解酶、淀粉酶中的一种或多种；优选为蛋白酶。

9.一种含生物刺激素的发酵肥料，其特征在于，所述发酵肥料由权利要求6-8中任一项所述的方法制备获得。

10.权利要求9所述的发酵肥料在促进植物生长和/或植物防病中的应用。

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