CN110106090B - 一种粗糙脉孢菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品生物技术领域，具体公开了一种粗糙脉孢菌株及其应用。所述菌株为粗糙脉孢菌Neurospora crassa，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年01月16日，保藏号为CGMCC NO：3.19233。所述粗糙脉孢菌株LY03发酵扩培后与玉米粉或淀粉等载体混合制备成发酵菌饼，将发酵菌饼接入豆渣中制作红菌豆腐。发酵菌饼中添加的玉米粉、淀粉等成分有利于发酵菌株菌丝分散、增强纤维酶活力，降低豆渣中的纤维、多糖等碳水化合物含量，增加成品中总蛋白的含量，改善口感。本发明克服了传统工艺发酵菌株靠自然馈赠，菌株批次不一，质量不稳定、生产规模小的缺点，同时拓宽了大豆及其附属物料生产产业链，具有良好的应用前景。

Description

一种粗糙脉孢菌株及其应用
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种粗糙脉孢菌株及其应用。
背景技术
“红菌豆腐”产于福建省武平县，历史有多久，无从考证，仅知在味精问世之前，经常被当作味精来使用。红菌豆腐发酵迅速，3～5d即可发酵完成，发酵后的“红菌豆腐”具有甘鲜、甜润的口感，因此当地人将其作为味精使用，为食物增鲜增香。此外，据研究，“红菌豆腐”还具有重要的保健作用，它能改善人体肠道功能，增加肠道的挪动性，并且可以吸附肠道内的油脂并排出体外，对肠道内的毒素进行清理，减轻肝脏的解毒负担，对三高人群是一个非常不错的食品。此外，“红菌豆腐”使用的原料是废弃的豆渣，实现了废物利用，具有良好的商业价值。中国每年有大约9000万吨的豆渣，这些豆渣得不到合理的利用，产生资源浪费。如果能够对红菌豆腐进行深入研究，创造出更加优良品种的产品，其将是一项非常可观的创业创富之路。
但是，长久以来，武平“红菌豆腐”略带一点神秘色彩，其菌种从何而来，尚不明确；其主要发酵菌株红菌具有怎样的生长规律，暂时也还没有人研究出来。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种粗糙脉孢菌株，所述菌株为粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年01月16日，保藏号为CGMCC NO：3.19233。
本发明通过分离武平传统“红菌豆腐”主要发酵菌群，结果表明红色面包霉是武平传统“红菌豆腐”主要发酵菌群，学名粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)，属于脉孢菌属(Neurospora)的一种常见真菌，其具有疏松网状的菌丝，有分枝和分隔，无性繁殖形成分生孢子。研究表明其营养条件简单、生长迅速、发酵周期短、实际生产过程易于控制，并且可产高活力纤维素酶，从而为农副废弃物的开发利用提供了一条有效地途径。但武平传统的“红菌豆腐”发酵菌株主要靠自然“馈赠”，受气候、人为等影响较大，成品批次质量不一，因此工业规模化生产受到限制，也影响了该产品的市场推广。在公知技术中，目前有一些粗糙脉孢菌应用于稻草、秸秆等农副产品生产蛋白饲料的方法，但应用于食品领域还未有报到。此外，公知技术中也有一些报道提高粗糙脉孢菌纤维转化能力的方法，但也还未应用到食品领域。
有鉴于此，本发明的另一个目的在于将粗糙脉孢菌LY03应用于红菌豆腐的制作过程中。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：将所述粗糙脉孢菌株LY03接种至液体培养基中发酵扩培后，所得菌液与玉米粉或淀粉等载体混合制备成发酵菌饼，将所述发酵菌饼接入豆渣中制作红菌豆腐。
液体培养基组成为：蔗糖2～3％，玉米秸秆粉2.0～3.0％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，硫酸镁0.1～0.2％，氯化钠0.4～0.5％，pH6.8～7.0。
发酵条件为：好氧，转速150～180r/min，28～30℃，发酵48～72h。
进一步，所述红菌豆腐的制作方法如下：将豆渣压榨后晾干，控制豆渣含水量在20％以下，然后将豆渣铺平、压块，将发酵菌饼均匀的撒在豆渣表面，在室温条件下发酵24-48h。发酵过程中，待菌丝长满豆渣表面，将豆渣翻面，将发酵菌饼均匀的撒到豆渣另一表面继续发酵，直至豆渣另一表面长满菌丝，即发酵结束，得到红菌豆腐。
所述发酵菌饼的用量为豆渣质量的0.05-0.1％。
本发明采用以上技术方案，提供了一种利用粗糙脉孢菌发酵豆渣制备红菌豆腐的工艺。其中，发酵菌饼中添加的玉米粉、淀粉等成分有利于发酵菌株菌丝分散、增强纤维酶活力，降低豆渣中的纤维、多糖等碳水化合物含量，增加成品中总蛋白的含量，改善口感。本发明工艺制备的红菌豆腐与传统工艺相比，其总蛋白、脂肪含量分别提高43.45～61.35％和2.08～4.08％，碳水化合物减少28.86～ 29.10％，纤维酶总活力提高了67.27～95.32％，外观、口感更佳，更容易被消费者所青睐。此外，发酵菌饼制备工艺简便，适合工业化生产，菌株保留活性时间长，克服了传统工艺发酵菌株靠“自然馈赠”，菌株批次不一，质量不稳定、生产规模小的缺点。本发明工艺能充分利用豆渣等废弃物料进行工业化生产，拓宽了大豆及其附属物料生产产业链，具有良好的应用前景。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
图1为LY03菌株的平板菌落形态图；
图2为实施例1中的PCR电泳图；
图3为LY03菌株同源关系图。
具体实施方式
实施例1
菌株的分离、鉴定
采用PDA培养基从购买的武平“红菌豆腐”中分离发酵菌株，并通过培养菌落的形态观察、显微鉴定，确定所分离发酵菌株的基本生物学特性，并对该菌株进行ITS系列引物测序，在NCBI上与已知菌株进行序列比对，确定该菌株的种属类型和亲缘关系。
具体工艺流程如下：
(1)配置PDA培养基：马铃薯180～220克，葡萄糖20～25克，琼脂15～20 克，水1000毫升，自然PH；按照常规方法配置后，121℃灭菌30分钟，倒好平板。
(2)菌株的分离
无菌操作台中，采用无菌镊子或接种铲从购买的武平红菌豆腐中挖一小块菌株到PDA平板中，置于30℃培养箱中培养24-48小时。观察是否有菌丝长出。
纯化：将菌丝再挖一小块到新的PDA平板中，再次培养24-48小时。观察是否有菌丝长出。观察菌丝菌落及纤维形态特征，挑选无污染、菌丝粗壮的平板用于菌株鉴定。
(3)菌株的鉴定
将选定的平板菌株(命名LY03)进行菌落及纤维形态鉴定，提取其DAN，送至铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序，登录NCBI比对，确定其进化关系和属性。平板菌落形态如图1所示。结果表明：所挑选的菌符合真菌的基本形态及生物学特征，其具有疏松网状的菌丝，菌丝透明，无色或灰色，有分枝和分隔，无性繁殖形成分生孢子。子囊大小160～185×20～22μm，子囊孢子8个，25～ 34×12～18μm。分生孢子呈浅橙色，直径6～7μm。
对目标菌株LY03进行l8S rDNA序列分析。
正向引物(如SEQ ID NO:1所示)：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；
反向引物(如SEQ ID NO:2所示)：ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。扩增片段长度600bp左右，PCR电泳图如图2所示，测定的引物序列如SEQ ID NO:3所示。将该引物序列登录NCBI进行Blast比对，其同源关系如图3所示。结果表明，所分离的LY03菌株与脉孢菌属(Neurospora)的几个菌株的亲源关系最近，相似性均达98％以上，综合LY03菌株的形态特征以及l8S rDNA序列分析结果，将其鉴定为定为粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)，俗称红色面包霉，并将菌株送至中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏号：CGMCC3.19233。
实施例2
利用粗糙脉孢菌LY03发酵豆渣，制作红菌豆腐
(1)发酵菌饼的制作：将粗糙脉孢菌株LY03接种至液体培养基中发酵扩培后，所得菌液与经过干燥的玉米粉、淀粉(作为载体)混合制备成发酵菌饼。
液体培养基：蔗糖2.5％，玉米秸秆粉2.0％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.1％，氯化钠0.45％，pH6.8。
发酵条件：好氧，转速150r/min，28℃，发酵48h。
(2)红菌豆腐的制作：将已磨过豆浆的豆渣压榨，自然晾干，控制豆渣含水量在20％以下，然后将豆渣铺平、压块，将发酵菌饼均匀的撒在豆渣表面，发酵菌饼的用量为豆渣质量的0.05％，在室温条件下发酵24h。发酵过程中，待菌丝长满豆渣表面，将豆渣翻面，将发酵菌饼均匀的撒到豆渣另一表面继续发酵，直至豆渣另一表面长满菌丝，即发酵结束，得到红菌豆腐。
测定市场购买的传统工艺武平“红菌豆腐”和本发明工艺制备的“红菌豆腐”发酵后营养物质的组成，并将两种工艺豆渣表面的菌丝，接入发酵液中发酵(发酵条件同上)48h，取上清液用于测定发酵菌株的纤维酶总活力，测定方法为纤维酶总活力测定法。对比两个工艺的发酵性能指标，结果如表1所示。其中，总蛋白的测定采用凯氏定氮法、脂肪的测定采用索氏提取法、碳水化合物的测定采用蒽酮比色法。结果表明，本实施例制备的“红菌豆腐”与传统工艺相比，其总蛋白、脂肪含量更高，分别提高了43.45％和2.08％，碳水化合物减少28.86％，纤维酶总活力提高了67.27％，外观、口感更佳。
表1传统工艺和本发明工艺制备的红菌豆腐营养成分对比
Figure BDA0001964026080000051
实施例3
利用粗糙脉孢菌LY03发酵豆渣，制作红菌豆腐
(1)发酵菌饼的制作：将粗糙脉孢菌株LY03接种至液体培养基中发酵扩培后，所得菌液与经过干燥的玉米粉、淀粉(作为载体)混合制备成发酵菌饼。
液体培养基：蔗糖3.0％，玉米秸秆粉3.0％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.15％，氯化钠0.50％，pH7.0。
发酵条件：好氧，转速180r/min，30℃，发酵72h。
(2)红菌豆腐的制作：将已磨过豆浆的豆渣压榨，自然晾干，控制豆渣含水量在20％以下，然后将豆渣铺平、压块，将发酵菌饼均匀的撒在豆渣表面，发酵菌饼的用量为豆渣质量的0.1％，在室温条件下发酵48h。发酵过程中，待菌丝长满豆渣表面，将豆渣翻面，将发酵菌饼均匀的撒到豆渣另一表面继续发酵，直至豆渣另一表面长满菌丝，即发酵结束，得到红菌豆腐。
测定市场购买的传统工艺武平“红菌豆腐”和本发明工艺制备的“红菌豆腐”发酵后营养物质的组成，并将两种工艺豆渣表面的菌丝，接入发酵液中发酵(发酵条件同上)72h，取上清液用于测定发酵菌株的纤维酶总活力，测定方法为纤维酶总活力测定法。对比两个工艺的发酵性能指标，结果如表2所示。其中，总蛋白的测定采用凯氏定氮法、脂肪的测定采用索氏提取法、碳水化合物的测定采用蒽酮比色法。结果表明，本实施例制备的“红菌豆腐”与传统工艺相比，其总蛋白、脂肪含量更高，分别提高了72.39％和4.08％，碳水化合物减少29.10％，纤维酶总活力提高了95.32％，外观、口感更佳。
表2传统工艺和本发明工艺制备的红菌豆腐营养成分对比
Figure BDA0001964026080000061
序列表
<110> 龙岩学院
<120> 一种粗糙脉孢菌株及其应用
<130> 2019
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 611
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc ttaagttcag cgggtattcc tacctgatcc gaggtcaacc 60
ttagaaatgg ggggttttac ggcaagaacc cgccgcacga ccatagcgat gtagagttac 120
tacgctcggt gtgactagcg agcccgccac tgattttgag ggaccgcgga cagccgcgga 180
tccccaacgc aagcagagct tgatggttga aatgacgctc gaacaggcat gctcgccaga 240
atactggcga gcgcaatgtg cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac 300
attacttatc gcatttcgct gcgttcttca tcgatgccag aaccaagaga tccgttgttg 360
aaagttttga cttatttaaa agtttactca gagagacata aaatatcaag agtttagttt 420
cggcactccg gcgggcagcc tcccgcgagc gggagacccg aggatccggg agggcccgag 480
ggcctttccg gaccgccagc gccgaggcaa ccgtacgggt aagattcgcg atggtttgtg 540
ggagttttgc aactctgtaa tgatccctcc gctggttcac caacggagac cttgttacga 600
cttttacttc c 611

Claims (8)

1.一种粗糙脉孢菌株，其特征在于：所述菌株为粗糙脉孢菌LY03（Neurospora crassa），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年01月16日，保藏号为CGMCC NO：3.19233。
2.如权利要求1所述的粗糙脉孢菌株在制备红菌豆腐中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：将所述粗糙脉孢菌株LY03接种至液体培养基中发酵扩培后，所得菌液与载体混合制备成发酵菌饼，将所述发酵菌饼接入豆渣中制作红菌豆腐。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述发酵扩培的条件是：温度28-30℃，转速150-180r/min，好氧发酵48-72h。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述载体为玉米粉或淀粉。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述红菌豆腐的制作方法如下：将豆渣压榨后晾干，然后将豆渣铺平、压块，将发酵菌饼均匀的撒在豆渣表面，在室温条件下进行发酵，待菌丝长满豆渣表面，将豆渣翻面，将发酵菌饼均匀的撒到豆渣另一表面继续发酵，直至豆渣另一表面长满菌丝，即发酵结束，得到红菌豆腐。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述发酵菌饼的用量为豆渣质量的0.05-0.1%。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：压榨、晾干后的豆渣含水量控制在20%以下。
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