CN105255771B - 一种产胶原蛋白酶的琥珀葡萄球菌及其应用 - Google Patents
一种产胶原蛋白酶的琥珀葡萄球菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种产胶原蛋白酶的新型微生物琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）SM12及其发酵生产与应用，该菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.11254。本发明所提供的琥珀葡萄球菌SM12是从近海有机质丰富的水土混合物中分离筛选得到的。该菌株能够产生高活性的胞外胶原蛋白酶，对富含大分子胶原蛋白的鱼皮、鱼鳞等水产加工下脚料具有很好的降解效应，在小分子胶原蛋白多肽的产品制备方面具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种产胶原蛋白酶的琥珀葡萄球菌和培养方法及其在富含胶原蛋白的水产加工下脚料的水解应用，属于微生物技术领域。
背景技术
胶原蛋白是构成动物细胞外基质的主要成分, 是整个动物世界的构筑支架，约占哺乳动物体内蛋白质总量的1/3以上，广泛存在于动物骨骼、软骨、皮肤和***中。胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，3 条α肽链以右手螺旋方式相互缠绕构成特有的杆状结构，性质十分稳定，从而导致其消化吸收困难，难以被利用。
将胶原蛋白水解为胶原多肽，具有易吸收、抗溃疡、抗过敏、降血压、抗菌、抗氧化、降胆固醇、抗衰老、促进伤口愈合、预防骨质疏松及关节炎、促进角膜上皮损伤修复等多种生理活性，使得胶原多肽成为胶原蛋白高值化利用的研究热点。
胶原蛋白酶是一种水解天然胶原的蛋白水解酶，能在适当的pH和温度下只切割活性胶原螺旋区或明胶而不作用于其他蛋白底物的酶类。胶原蛋白酶的降解活力、稳定性等因素成为高效利用胶原蛋白关键。胶原蛋白酶按照其来源可分为植物胶原蛋白酶、动物胶原蛋白酶和微生物胶原蛋白酶，其中细菌来源胶原蛋白酶可以分泌到细胞外，通过发酵大量获得，因此微生物来源的胶原蛋白酶在应用方面更加广泛。目前研究最多的微生物胶原蛋白酶为溶组织梭状芽孢杆菌（Clostridium histolyticum），但其为病原菌，伴有毒素产生，并非理想的胶原蛋白酶来源。
水产品加工企业每年产生大量鱼皮、鱼鳞、鱼头、鱼鳍、鱼尾、鱼骨等下脚料，该类物质含有丰富的胶原蛋白，如鱼皮的胶原蛋白含量最高可占其蛋白质总量的80%以上，这些下脚料的丢弃会造成资源浪费且污染生态环境。本发明的目的就是要解决水产加工下脚料的综合利用难题，提供一种产胶原蛋白酶的琥珀葡萄球菌，利用产生的胶原蛋白酶制备胶原蛋白多肽，使水产品加工的下脚料得到高附加值的利用，减少环境污染，同时也产生良好的经济效益。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种生产胶原蛋白酶的琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus），以该菌株为出发菌株，经液体发酵的方法生产胶原蛋白酶，该酶可通过高效水解胶原蛋白来生产胶原蛋白多肽。
本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种琥珀葡萄球菌，其特征在于其保藏名称为：SM12，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年8月19日，保藏号为CGMCC No.11254，分类命名：琥珀葡萄球菌Staphylococcus succinus。
本发明的琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）通过如下方法分离、筛选得到：
1）收集丰富有机质淤泥，梯度稀释后涂布初筛培养基，28℃培养至长出单菌落，观察并挑取产生透明圈的菌株，接种复筛培养基中，培养20～48h（28℃，180rpm），8000r/min离心10min，取上清测定酶活后确定胶原蛋白酶活力高的菌株SM12。
2）通过明胶透明圈法筛选得到的高活力胶原酶产生菌株SM12在筛选培养基的固体平板上呈圆形且中央凸起，白色，表面干燥，周围粗糙，不透明也无光泽。显微镜观察呈现球状但是不成链，革兰氏阳性菌。生理生化测定发现其产淀粉酶，分解葡萄糖产酸，能使明胶液化。
以菌株SM12的总DNA为模板，采用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，检测得到一条1414bp的条带，切胶测序得到的16S rDNA序列。去掉杂峰区序列后的800bp，在NCBI上同源性比较，同源性较高的为Staphylococcus succinus，同源性为99%以上。因此该菌株SM12属于琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）。
本发明的另一个目的是提供一种琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）SM12发酵生产胶原蛋白酶的方法及其将胶原蛋白或明胶降解为胶原蛋白多肽的工艺，包括如下步骤：
1）菌种活化
种子培养基：10g/L葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L明胶，5g/L NaCl， 0.5g/L K2HPO4，0.2g/L MgSO4， 0.1g/L MnSO4，pH7.5。装液量100 mL/500 mL瓶，在37℃的200rpm恒温摇床中培养活化18～24h，即得种子液。
2）发酵生产
采用优化的培养组分和条件：15～25g/L葡萄糖，10～20g/L牛肉膏，10～25g/LNaCl，3～10g/L明胶，pH7.0～7.5，装液量为50～100mL/500mL瓶，按照5～7.5%（v/v）接种量接入活化菌种，在32～37℃的200rpm恒温摇床中培养24～48h，即为发酵粗酶液。
3）胶原蛋白酶粉的制备
胶原蛋白酶的粗酶液经8000r/min离心6min，收集上清液并添加硫酸铵至75%的饱和度，在4℃下盐析沉淀15h，然后再经10000r/min冷冻离心（5℃）8min，收集沉淀的酶蛋白。浓缩沉淀的酶蛋白经透析脱盐处理，然后将透析袋附于聚乙二醇（PEG）20000上浓缩蛋白，浓缩的酶蛋白进行冷冻干燥，即可获得胶原蛋白酶粉。
4）胶原蛋白多肽的制备
称取一定量的鳕鱼皮胶原蛋白粉，按照1：15的比例加入150ml磷酸缓冲液（pH7.4）中，然后加入胶原蛋白酶粉（底物与酶量比为10：1），在37℃条件下缓慢振摇反应6～20h后终止反应。胶原蛋白水解液经90℃加热灭酶10min，经10000r/min离心8min去除蛋白沉淀，在-75℃下冷冻干燥获得胶原蛋白多肽粉。
本发明的有益效果在于：
1）本发明的琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）SM12为腌制食物中的常见菌，非致病菌，对营养要求低，发酵条件易操作，产酶量高。
2）该菌株所产胶原蛋白酶对胶原蛋白的水解效率高，对鱼皮等大分子的胶原蛋白具有较好的水解作用，利用该菌株进行胶原蛋白或明胶的降解并用于胶原蛋白多肽的生产将具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。
采用的胶原蛋白酶活力测定方法：1mg的鱼鳞胶原蛋白，用0.5mL磷酸缓冲液溶解（pH7.4），加入0.1mL稀释酶液，37℃反应40min。加0.5mL三氯乙酸（10%，m/v）终止反应，再加入0.9mL乙酸缓冲液（pH5.4）和1mL茚三酮显色液混匀。100℃下水浴加热10min，冷却后用3mL的60%％乙醇稀释，在570nm下比色测定。
所用的酶活力测定的对照组处理：为消除干扰，首先取0.1mL的稀释酶液在100℃下水浴煮沸10min将酶进行灭活，其余步骤同酶活力测定。
所用的酶活力计算方法：在37℃条件下以每mL酶液水解胶原蛋白每min生成1ug的甘氨酸的量为一个酶活力单位（U）。
所用的相对酶活力计算方法：（对照品酶活力—样品酶活力）/对照品酶活力×100%。
实施例1：菌株SM12的分离筛选
采集自烟台养马岛、海滨浴场、芝罘岛和第一海水浴场的水土混合样，吸取1mL入事先灭菌的富集培养基，在30℃和200rpm条件下培养30h。吸取1mL富集培养液经逐级稀释后涂布筛选培养基的固体平板，在30℃的培养箱中培养2d。分离获得产生明胶降解圈的菌株52株，对透明圈与菌落直径比数值大的部分菌株进行胶原酶活力测定，结果见表1。由表1可以看出，分离自养马岛海域的菌株SM12产胶原酶活力最高，为33.63U/mL。
表1 产生透明水解圈的胶原蛋白酶活力
所用的富集培养基如下：10g/L明胶，1g/L酵母粉，4g/L蛋白胨，pH7.0。
所用的筛选培养基如下：20g/L明胶，3g/L酵母粉，20g/L琼脂，5g/L NaCl，2g/LK2HPO4，0.2g/L MgSO4，0.1g/L MnSO4，pH 7.0。
所用的分纯培养基如下：10g/L明胶，15g/L酵母粉，20g/L琼脂，5g/L NaCl，pH7.0。
实施例2：菌株SM12的菌属鉴定
通过明胶透明圈法筛选得到的高活力胶原酶产生菌株SM12在筛选培养基的固体平板上形态：圆形且中央凸起，白色，表面干燥，周围粗糙，不透明也无光泽。
显微观察呈现球状但是不成链，革兰氏阳性菌。生理生化测定发现其产淀粉酶，分解葡萄糖产酸，能使明胶液化。
以菌株SM12的总DNA为模板，采用16S rDNA通用引物进行PCR扩增（16S-FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 16S-R AAGGAGGTGATCCAGCCGCA），PCR程序设定：预变性95℃5min，循环95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，35个循环，延伸10min。检测得到一条1414bp的条带，切胶测序得16S rDNA序列。去掉杂峰区序列后的800bp在NCBI上同源性比较，同源性较高的为Staphylococcus succinus，同源性为99%以上。因此该菌株SM12属于琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）。
实施例3：培养组分对琥珀葡萄球菌SM12产胶原蛋白酶的影响
（1）碳源使用量的确定
所用的发酵培养基（g/L）：碳源10，牛肉膏10，明胶10，NaCl 5，pH 7.0。由表2可以看出，最佳产胶原酶碳源为葡萄糖，其次为麦芽糖、甘油和果糖，而蔗糖、淀粉和甘露醇为碳源时胶原蛋白酶酶产量较低。随着葡萄糖浓度增加，酶产量增加，最佳葡萄糖浓度为20g/L。
表2 碳源对产胶原蛋白酶的影响
选用葡萄糖浓度梯度为1g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L和25g/L，确定其对胶原蛋白酶产量的影响，各浓度梯度的相对酶活力分别为36.69%、48.52%、57.99%、88.75%、100%和85.21%，因此最佳葡萄糖使用量为20g/L。
（2）氮源使用量的确定
所用的发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，氮源10，明胶10， NaCL 5。由表3看出，最佳产酶氮源为牛肉膏，其次为速效氮源（尿素、硫酸铵和氯化铵）。
表3 碳源对产胶原蛋白酶的影响
选用牛肉膏浓度梯度为1g/L、5g/L、10g/L、15g/L和20g/L，确定其对胶原蛋白酶产量的影响，各浓度梯度的相对酶活力分别为35.77%、71.11%、82.59%、100%和81.11%，因此最佳牛肉膏用量为15g/L。
（3）金属盐使用量的确定
所用的发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，牛肉膏15，金属盐5，明胶10，pH7.5。由表4可以看出，最佳产酶的金属盐为NaCl。随着NaCl浓度上升，酶产量逐渐增加，在20g/L浓度下获得最大相对酶活力，且在10～30g/L的浓度区间内酶活差异相对不显著。
表4 金属盐对产胶原蛋白酶的影响
选用氯化钠浓度依次为5g/L、10g/L、15g/L、20g/L和25g/L，确定其对胶原蛋白酶产量的影响，各浓度梯度的相对酶活力分别为41.10%、90.69%、95.61%、100%、99.50%和98.46%，因此最佳的氯化钠浓度为20g/L。
实施例4：培养条件对琥珀葡萄球菌SM12产胶原蛋白酶的影响
（1）培养最适pH的确定
初始pH对产胶原蛋白酶的影响见表5，采用发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，牛肉膏15，明胶10， NaCL 20。由表5可以看出，最佳产酶的初始pH为7.5，其次是pH7.0，在略偏碱性条件下产酶量为宜。
表5 培养pH对产胶原蛋白酶的影响
（2）最适装液量的确定
装液量对菌株SM12产胶原酶的影响见表6，最佳装液量为100mL，50mL装液量的产酶能力与100mL装液量时情形接近，故菌株SM12对氧有一定趋向需求。
表6 装液量对产胶原蛋白酶的影响
（3）接种量的确定
接种量对琥珀葡萄球菌SM12产胶原酶的影响见表7，最佳产酶的接种量为7.5%（v/v），接种量太低或太高均不利于胶原酶的产生。
表7 接种量对产胶原蛋白酶的影响
（4）最佳培养温度的确定
培养温度对产胶原蛋白酶的影响见表8，最佳产酶培养温度为37℃，在28～37℃区间的产酶量均较高且差异不明显，而培养温度超过37℃后酶产量迅速降低。
表8 培养温度对产胶原蛋白酶的影响
（5）培养时间对产胶原蛋白酶的影响
表9 培养时间对产胶原蛋白酶的影响
由表9可以看出，胶原蛋白酶在发酵24h后获得最大酶活性。随着发酵时间延长，当超过24h时酶活呈现逐渐降低趋势，且在35～60h区间下降缓慢。
实施例5：琥珀葡萄球菌SM12来源胶原蛋白酶的生产
1）种子活化
种子培养基：10g/L葡萄糖，5g/L牛肉膏，3g/L明胶，5g/L NaCl， 0.5g/L K2HPO4，0.2g/L MgSO4， 0.1g/L MnSO4，pH7.5。装液量50mL/500mL瓶，在37℃的200rpm恒温摇床中培养活化20h，即得种子液，菌体浓度为2×108 cfu/mL。
2）发酵生产
采用优化的培养组分：20g/L葡萄糖，15g/L牛肉膏，20g/L NaCl，10g/L明胶，pH7.5，装液量为100mL/500mL瓶。按照7.5%（v/v）接种量接入活化菌种，在37℃的200rpm恒温摇床中培养24h，即可发酵粗酶液，经测定其酶活值为185.32 U/mL。
3）胶原蛋白酶粉的制备
胶原蛋白酶的粗酶液经8000r/min离心6min，收集上清液并添加硫酸铵至75%的饱和度，在4℃下盐析沉淀15h，然后再经10000r/min冷冻离心（5℃）8min，收集沉淀的酶蛋白。
浓缩沉淀的酶蛋白经透析脱盐处理，然后将透析袋附于聚乙二醇（PEG）20000上浓缩蛋白，浓缩的酶蛋白进行冷冻干燥，即可获得胶原蛋白酶粉。
实施例6：水解胶原蛋白制备胶原蛋白多肽
1）胶原蛋白的水解试验（1）
称取10g鳕鱼皮胶原蛋白粉，加入150mL磷酸缓冲液（pH7.4）中，然后加入1g胶原蛋白酶粉（6200U/g），在37℃条件下缓慢振摇反应12h后终止反应。将蛋白水解液经10000r/min冷冻离心（5℃）8min，采用茚三酮显色法测定水解蛋白液中的-NH2含量，计算水解度后确定胶原蛋白的水解率为57%。
所用的水解度计算方法如下：
水解度（DH）=h/hb×100%，式中h为水解后每克胶原蛋白被裂解的肽键毫摩尔数，hb为每克胶原蛋白原料的肽键毫摩尔数（为8.41）。
胶原蛋白水解液经90℃加热灭酶10min，经10000r/min离心8min去除蛋白沉淀，在-75℃下冷冻干燥获得胶原蛋白多肽粉5.2g。
2）胶原蛋白的水解试验（2）
称取10g鳕鱼皮胶原蛋白粉，加入150mL磷酸缓冲液（pH8.0）中，然后加入1g胶原蛋白酶粉（6200U/g），在42℃条件下缓慢振摇反应20h后终止反应。将蛋白水解液经10000r/min冷冻离心（5℃）8min，采用茚三酮显色法测定水解蛋白液中的-NH2含量，计算水解度后确定胶原蛋白的水解率为74%。
胶原蛋白水解液经90℃加热灭酶10min，经10000r/min离心8min去除蛋白沉淀，在-75℃下冷冻干燥获得胶原蛋白多肽粉6.9g。
<110> 鲁东大学
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<211> 800
<212> DNA
<213> 琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）
<400> 1
Claims (3)
1.一种产胶原蛋白酶的微生物菌株，其特征在于该菌株为琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）SM12，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.11254。
2.如权利要求1所述的琥珀葡萄球菌SM12的培养方法，包括对保藏号为CGMCCNo.11254的菌株采用如下培养组分和条件进行培养：15～25g/L葡萄糖，10～20g/L牛肉膏，10～25g/L NaCl，3～10g/L明胶，pH7.0～7.5，装液量为50～100mL/500mL瓶，按照5～7.5%（v/v）接种量接入活化菌种，在32～37℃的200rpm恒温摇床中培养24～48h。
3.如权利要求1所述的琥珀葡萄球菌SM12在富含胶原蛋白的水产加工下脚料中的水解应用。
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Effective date of registration: 20210910 Address after: 710016 B 1616, Tiandi Times Plaza, Fengcheng two road, Weiyang District, Xi'an, Shaanxi. Patentee after: Liu Jiaojiao Address before: 264025 School of life sciences, Ludong University, 186 Hongqi Middle Road, Yantai City, Shandong Province Patentee before: LUDONG University |
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