CN102517235B

CN102517235B - 一种枯草芽孢杆菌

Info

Publication number: CN102517235B
Application number: CN 201110443948
Authority: CN
Inventors: 陈金军; 胡能渊; 张铁瀚
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2031-12-27
Also published as: CN102517235A

Abstract

本发明菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CH-001，已于2011年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏编号为：CCTCC NO：M 2011111。本发明菌株具有广谱降解角蛋白的特性，降解发酵条件温和，产酶活性高，稳定性好。不仅能产生高活性角蛋白酶，同时可降解胶原蛋白，对金黄色葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，具有益生菌特性，适用于动物蛋白饲料添加剂、角蛋白酶发酵生产的工程菌开发等。解决了大多数微生物产高活性角蛋白酶与其具对人或家禽有致病性的冲突及对角蛋白的广谱降解特性，研究了其对相关致病菌的拮抗作用。是一种低碳经济、高效安全的绿色生物资源，具有创造经济、社会效益的巨大潜在价值。

Description

一种枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明属于微生物种质资源的开发与利用领域，尤其涉及一种可高效降解角蛋白和胶原蛋白、并对相关致病菌有拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CH-001。

背景技术

角蛋白在自然界中资源丰富，我国年产数十多万吨，它主要存在于各种动物羽毛、毛发、蹄等。其中禽类羽毛中含75％～85％的硬质角蛋白，羽毛角蛋白中的氨基酸大部分为疏水性氨基酸，其中胱氨酸二硫键很难被蛋白质水解酶打开，所以羽毛角蛋白性质极其稳定，在稀酸稀碱中不易水解，如果仅靠动物自身消化道中的消化酶是无法将其吸收的。

目前羽毛角蛋白的处理方法主要有传统水解法和生物技术法。传统物理、化学降解法存在众多缺陷，诸如产品的营养组成易被破坏、效率低、耗能高、污染大。而采用微生物降解法效果显著，既利用了蛋白资源，也有利于环境保护。同时角蛋白及角蛋白酶的应用还体现在各行各业中，有广阔的前景及较高的经济价值和社会价值。因此近年来利用生物技术途径开发羽毛角蛋白资源，已成为国内外研究热点，主要技术途径包括微生物降解和酶降解两种。

在国内外对产角蛋白酶菌株的筛选、开发与利用的研究十分激烈。目前已发现的可分泌角蛋白酶的微生物具有多样性特点，从南极土壤到温泉，从需氧到厌氧，包括细菌、真菌和放线菌等。

自然界中许多真菌都能降解角蛋白，参与角蛋白的碳、氮和硫的循环。由于医学和兽医方面的应用需求，早期研究的产角蛋白酶的真菌主要为皮肤类真菌，如发癣菌(Trichophyton)和小孢子菌(Microsporum)。利用生物技术降解角蛋白的需求日益明显，陆续发现了一些具有开发应用价值的产角蛋白酶的非致病真菌，如曲霉(Aspergillus)(Santos et al.1996；Farag and Hassan2004)、拟青霉属(Paecilomyces)(Gradisar et al.2005)、弯孢霉属(Curvularia)、木霉(Trichoderma)(Cao et al.2008)、漆斑菌属(Myrothecium)(Moreira-Gasparin et al.2009)等。

产角蛋白酶的放线菌主要是链霉菌属(Streptomyces)，这些微生物来自各种土壤。从南极土壤中分离到的两种具高角蛋白酶活性的放线菌Streptomycesflavis 2BG(适常温的)和Microbispora aerata IMBAS-11A(嗜热的)，(Gushterova et al.2005)；还有从火山口土壤中分离的一些嗜热的产角蛋白酶的放线菌如Streptomyces thermonitrificans(Mohamedin 1999)、treptomyces gulbarguensis(Syed et al.2009)等。嗜常温的产角蛋白酶的放线菌种类还有Streptomyces albidoflavus K1-02(Bressollier et al.1999)和Streptomyces graminofaciens(Szabo et al.2000)。

目前已经筛选和分离到很多能降解角蛋白的细菌，大多集中在芽孢杆菌属，包括地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilus)(Lin et al.1999；Suh and Lee 2001；Manczinger et al.2003；Balaji et al.2008；Cai et al.2008；Zhang et al.2009)，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，蜡状芽孢杆菌(Baeillus cereus)(Kim et al.2001；Werlang and Brandelli 2005；Kumar et al.2008；Ghosh et al.2008)，嗜热、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)(Takami et al.1992，1999)，Bacillis pseudofirmus AL-8(Gessesse et al.2003)，Bacillis pseudofirmusFA30-01(Kojima et al.2006)等。从亚马逊盆地分离到的嗜常温的一些芽孢杆菌。从芽孢杆菌属不同的种中分离纯化的角蛋白酶各不相同，这充分展示了微生物的多样性。也为不同的生物技术应用提供了可能。除了芽孢杆菌属外，弧菌(Vivrio sp Kr2)(Sangali et al.2000)，黄单胞菌(XanthomonasmaltoPhilia)(De Toni et al.2002；王晶等2007)，寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp Dl)(Yamamura S et al.2002学位论文)，金黄杆菌(Chryseobacterium sp.Kr6)(Riffel et al.2007学位论文)，微杆菌(Microbacterium sp.)(Gupta et al.2006；季金殿学位论文)等也具有降解角蛋白的能力。某些极端环境下的嗜热微生物如，Fervidobacterium pennavorans(Friedrich and Antranikian 1996)，Fervidobacterium islandicum(Nam etal.2002)，Meiothermus ruber H328(Matsui et al.2009)，Clostridiumsporogenes(Ionata et al.2008)等都有报道具有降解角蛋白的能力。

此外，还报道了一些从极端环境中分离出来的产角蛋白酶的古细菌，它们生存在一般生物不能存活的极端环境，如极端的温度、pH、盐和压力(Kublanovet al.2009b)。

在市场应用领域中：要利用家禽羽毛作为饲料，必须得经过处理，而目前处理羽毛角蛋白的物理、化学加工方法效果不理想。生物发酵技术现正处于起步阶段，在实际生产应用也较少。21世纪初，韩国Insect Biotech公司成功分离出一种产高活性蛋白酶Arazyme；该蛋白酶具有较强的蛋白分解能力，且耐高温、宽pH值；能够很好的降解羽毛角蛋白。已成功应用到饲料添加剂、临床药物、工业废水处理、食品加工、化妆品等领域，展现了巨大的应用前景。而我国在这方面的研究与应用刚起步，国内市场大量高价进口国外如InsectBiotech公司加入了Arazyme高活性蛋白酶的

康畜宝饲料等蛋白酶饲料产品，且对其需求量仍在加大。

角蛋白和胶原均为很好的动物蛋白资源，但由于两者特殊的化学结构，性质较稳定，动物难以大量直接吸收，许多蛋白酶也无法将其水解，这局限了其在饲料方面的发展。而微生物来源的蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的纤维蛋白，如角蛋白和胶原等。如果可获得单个细菌同时具有降解角蛋白和胶原蛋白的综合降解能力较强的菌株，并运用到饲料中后，将大大提高原料的利用率，减低生产工序，从而减低生产成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种益生菌——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CH-001。本发明菌株不仅能高效降解角蛋白，同时可降解胶原蛋白，对人体、动物无毒害作用，对相关致病菌有拮抗作用。解决了大多数微生物降解角蛋白或胶原蛋白与其对人或家禽有致病性的矛盾，以及只降解角蛋白或胶原蛋白的单功能性。

本发明所述的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CH-001，于2011年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO.M 2011111，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学。

本发明菌株CH-001于37℃在LB培养基中划线培养生长，菌落圆形、表面湿润、粗糙不透明，边缘不整齐、白色或微黄色。挑取其中的单菌落，进行革兰氏染色，革兰氏染色后呈紫色、短杆状说明本发明菌株为革兰氏阳性菌，如图1。在电镜中观察菌体为：杆状、单个细胞大小为0.6～0.7×2～3微米，着色均匀，无荚膜，见图2。

本发明菌株在不同底物时的培养特征：在接种有本发明菌株的无机盐羽毛培养液中加入麸皮、甘露醇等物质，对羽毛的降解有明显的促进；而加入葡萄糖、硝酸铵等，对其有明显的抑制作用；加入豆粑粉、次硝酸铋等，有微弱的抑制作用；加入玉米粉、鱼粉、豆饼粉等，无明显作用。金属Ca²⁺、Mg²⁺对其降解羽毛有促进作用，Zn²⁺对其降解羽毛有抑制作用。本发明菌株降解羽毛的最适pH值为8.0左右，在小于pH5.0的酸性环境下不生长，不可降解羽毛；在pH12的碱性环境下可生长，降解羽毛良好。

将得到的本发明菌株的16SrDNA序列于genebank数据库中进行blast比对，结果表明本发明菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilisstrain DSM 10的16SrDNA的序列同源性为99％。鉴定表明本发明菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus sub tilis)的一个新种，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CH-001，本发明菌株的***发育树见图3。

本发明菌株对金黄色葡萄球菌具有拮抗作用，且接种0.1-0.5％本发明菌株于无机盐羽毛培养液中发酵培养，其发酵液可降解角蛋白和胶原蛋白，发酵条件为：摇瓶至OD₆₀₀为0.5，温度35-41℃，转速160r/min，发酵时间为12-36h，pH 7.0-8.0；较佳的发酵条件为：摇瓶至OD₆₀₀为0.5，按0.1％接种发酵，温度37℃，转速160r/min，发酵时间为24h，pH 8.0。

如此，本发明菌株具有广谱降解角蛋白的特性，降解发酵条件温和，产酶活性高，稳定性好。不仅能产生高活性角蛋白酶，同时可降解胶原蛋白，对金黄色葡萄球菌等致病菌有拮抗作用，具有益生菌特性，适用于动物蛋白饲料添加剂、角蛋白酶发酵生产的工程菌开发等。解决了大多数微生物产高活性角蛋白酶与其具对人或家禽有致病性的冲突及对角蛋白的广谱降解特性，研究了其对相关致病菌的拮抗作用。是一种低碳经济、高效安全的绿色生物资源，具有创造经济、社会效益的巨大潜在价值。

附图说明

图1为本发明菌株革兰氏染色图。

图2为本发明菌株的电镜图。

图3为本发明菌株的***发育树。

图4是本发明菌株经不同时间培养后对羽毛的降解效果。

其中：A：空白液(上图)与粗酶液(下图)培养12h；B：空白液(上图)与粗酶液(下图)培养24h；C：空白液(上图)与粗酶液(下图)培养36h。

图5为本发明菌株的粗酶液最佳酶活反应的培养时间测定。

图6为粗酶液与偶氮酪蛋白的反应最佳时间测定。

图7为粗酶液与偶氮酪蛋白的反应最佳pH测定。

图8为本发明菌株对金黄色葡萄球菌的拮抗作用图。

具体实施方式

实施例1：

取湖南农业大学校内长期堆放羽毛的土壤，放入无菌蒸馏水中混匀，静置，澄清后取上清液涂布于固体无机盐羽毛培养基中，37℃培养2-3天，获得菌落。将涂布获得的菌落用牙签挑取分离，接种于无机盐羽毛培养液中，37℃培养48h，观察羽毛降解程度，初筛出有效菌株，蘸取其培养液多次划线培养，并再挑取单菌落于无机盐羽毛培养液中培养进行反复筛选，获得降解效果较好的纯菌株，最后接种单菌落于明胶培养基中，37℃培养12h，即得本发明菌株。

实施例2：本发明菌株的菌体染色、电镜观察、菌落形态特征观察实验

本发明菌株于37℃在LB液体培养基中划线培养生长，菌落圆形、表面湿润、粗糙不透明，边缘不整齐、白色或微黄色。挑取其中的单菌落，进行革兰氏染色，革兰氏染色后呈紫色、短杆状说明本发明菌株为革兰氏阳性菌，如图1。在电镜中观察菌体为：杆状、单个细胞大小为0.6～0.7×2～3微米，着色均匀。无荚膜，如图2。

实施例3：本发明菌株的16SrDNA鉴定及***发育树的构建

本发明中采用EDTA法提取本发明菌株基因组DNA，利用16S rDNA引物F：agtggccattacggccagagtttgatcmtggctcag(如SEQ ID No：1所示)；R：agaggccgaggcggcctacgggytaccttgttacgactt(如SEQ ID No：2所示)获得优势菌株高保真序列，PCR体系为：ddH₂O：40.0ul、10×Buffer(Mg²⁺ plus)：5ul、d NTPs：1ul、F：1.0ul、R：1.0ul、Taq酶：1ul、DNA模板：1ul、total volume50ul，95℃预变性4min，95℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸1.5min循环30次，72℃终末延伸15min，4℃至∞。PCR完成后，经电泳检测得于约1500p处有较亮目的条带，用QlAquick Gel Extraction Kit进行切胶回收纯化，以PUM-T为载体与纯化的目的片段连接进行A-T克隆，再利用CaCl2转化法，将重组子转入XL1-blue大肠杆菌中，加入1.0ml LB培养液(不加Amp⁺)恢复培养2h后，涂板于加Amp⁺的LB固体培养基(Amp⁺最终浓度100mg/ml)中37℃培养12h，挑取单菌落于30ml加Amp⁺的LB液体培养基中(Amp⁺最终浓度100mg/ml)37℃摇床培养过夜，保存各菌悬液后，提取质粒PCR验证，将含有约1500bp的目的片段的对应保存菌液送至基因测序公司进行测序。本发明菌株的16SrDNA序列如SEQ ID No：3所示。

在Genbank数据库中做序列同源性比较，进行分子遗传学检测，确定本发明菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis strain DSM 10的16SrDNA的序列同源性为99％。结果表明，本发明菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的一个新种，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CH-001。用clustal软件比对同源序列并构建***发育树，如图3所示。

实施例4：本发明菌种的保存、培养、发酵降解羽毛

本发明菌株可用最终浓度约为20％的甘油LB培养基保存于-20℃。即接种本发明菌株的单菌落于30ml LB液体培养基培养12h后，取500ul培养菌悬液和300ul高温灭菌的60％甘油于1.5ml离心管混匀，便可置于-20℃保存。

取30ml无机盐羽毛培养液于100ml的三角瓶中，灭菌后，挑取本发明菌株的单菌落0.1％接种于该培养液内，37℃，160rpm/min摇床培养，可观察到：培养8h后，培养液变浑浊并有大量的断裂羽***，但未与羽轴分离；培养12h后，培养基表面出现较多极细的羽毛粉粒并吸附于玻璃壁上，断裂羽***变短，基部未与羽轴分离；培养16h后，断裂羽***基本降解完全，有较小的球状羽毛粒形成，但还剩下羽轴；培养45h后，羽轴被部分降解而变细短。

实施例5：不同底物培养(C源、N源)特征

在接种有0.1％本发明菌株的无机盐羽毛培养液中加入0.1％的不同碳源或氮源，于37℃，160rpm/min摇床培养24h，取其上清液获得粗酶液，并测定各粗酶液的活性，可得到加入麸皮、甘露醇等有较高的酶活性，明显地促进了羽毛的降解；加入葡萄糖、硝酸铵等对其有明显地抑制作用；加入豆粑粉、次硝酸铋等有微弱的抑制作用；加入玉米粉、鱼粉、豆饼粉等无明显作用。分别加入α角蛋白类：猪蹄等和β角蛋白类：鸡毛、头发等及胶原蛋白类：牛筋、明胶等都有降解作用。

通过测定不同pH值与金属离子对本发明菌株降解羽毛速率的影响，并初步优化了生长条件。本发明菌株降解羽毛的最适pH值为8.0左右，在小于pH 5.0的酸性环境下不生长，不可降解羽毛，在pH12的碱性环境下可生长，降解羽毛良好，金属Ca²⁺、Mg²⁺对其降解羽毛有促进作用，Zn²⁺对其降解羽毛有抑制作用。

实施例6：检测角蛋白酶对羽毛的降解效果

采用茚三酮法测定不同时间(12h、24h、36h)取出的粗酶液(接种本发明菌株的无机盐羽毛培养液摇床培养后，经4℃，10000rpm离心5min，0.22um过滤除菌获得)中的总游离α-氨基酸含量。以不接种本发明菌株的无机盐羽毛培养液直接摇床培养相同时间后，经4℃，10000rpm离心5min，0.22um过滤除菌获得的滤液为空白液。获得羽毛降解情况与其对应的溶液中总游离α-氨基酸含量的关系，结果参见下表1及图4，可知随着培养时间的增加，培养液中羽毛被逐渐降解，而液体中游离氨基酸的含量增加，但培养24h后降解作用不明显，说明本发明菌株的发酵液中产生了对羽毛具有降解作用的角蛋白酶，也同时说明了该角蛋白酶对羽毛的降解效果。

表1培养时间与培养液中游离氨基酸的含量关系

实施例7：粗酶液活性测定

实验组：在装有1.5ml 10％Azocasein的试管中加入1.0ml分别发酵培养8h、14h、24h、30h、36h后的粗酶液(接种0.1％本发明菌株于150ml无机盐羽毛培养液摇床培养后，经4℃，10000rpm离心5min，0.22um过滤除菌获得。)的5倍稀释液。在37℃反应不同时间(0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min)后立即加入1.0ml 10％TCA，于4℃静置30min，10000rpm离心3min，取其上清液测定335nm波段处的吸收值，结果如图5。

对照液：在装有1.5ml 10％Azocasein的试管中加入1.0ml分别发酵培养8h、14h、24h、30h、36h后的空白液(不接种本发明菌株的150ml无机盐羽毛培养液直接摇床培养后，经4℃，10000rpm离心5min，0.22um过滤除菌获得。)的5倍稀释液，37℃反应不同时(0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min)后立即加入1.0ml 10％TCA，4℃静置30min，10000rpm离心3min，取其上清液在335nm波段处校准调零。

观察酶活随反应时间的变化，测得本发明菌株的粗酶液最佳酶活的发酵培养时间为24h，见图5，粗酶液与偶氮酪蛋白的反应最佳时间均为2h左右，如图6。

在装有1.5ml10％Azocasein的试管中加入1.0ml用无机盐溶液稀释5倍的不同pH的粗酶液(在粗酶液中加入一定量的磷酸缓冲液使反应pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等获得)，37℃反应2h后立刻加入1.0ml 10％TCA，4℃静置30min，10000rpm离心3min，取其上清液测定335nm波段处的吸收值。观察酶活随pH的变化，得出最佳酶活反应的pH为8.0，如图7。

定义酶活单位为：在最适条件下，波长为335nm的测定中，反应1h的吸光度增加0.1为一个酶活单位记1U。综合上述各酶活反应条件测得最高酶活为：10.19U，与其他此类菌的活性相比本发明菌株有较高的酶活性。

实施例8：本发明菌株对金黄色葡萄球菌的拮抗作用

牛肉膏蛋白胨固体培养基经高温灭菌后，待冷却至不烫手且尚未凝固时，用吸液枪吸取200ul已用无菌去离子水打散的金黄色葡萄球菌溶液至该培养基中，快速摇匀并倒平板。平板中的培养基凝固后，挑取实施例1中筛选出的较优菌株的单菌落，接种于平板中央，37℃培养12h后，便可观察抑菌圈大小，检测其拮抗作用，如图8，结果显示，本发明菌株对金黄色葡萄球菌有明显抑菌圈。

文中提及的培养基配方如下：

无机盐羽毛培养液为：NaCl 0.5g/L、KH₂PO₄ 0.4g/L、K₂HPO₄ 0.3g/L、羽毛粉10g/L(或羽毛60-70根/L)，pH 8.0；固态无机盐羽毛培养基则加琼脂15g/L。

明胶培养基为：蛋白胨1.5g、牛肉浸粉0.3g、磷酸氢二钠0.2g、琼脂粉1.5g、水100ml、明胶1.0g，Ph8.0。

LB液体培养基(LB培养液)：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH 7.2。LB固态培养基则加琼脂15g/L。

羽毛粉培养基为：NaCl 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，K₂HPO₄ 0.3g/L，羽毛粉10g/L(或羽毛60-70根/L)，pH 8.0，固态培养基则加琼脂15g/L。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉浸膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH7.2-7.4，固态培养基则加琼脂15g/L。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：该菌株为枯草芽孢杆菌

2.如权利要求1所述的菌株在拮抗金黄色葡萄球菌中的应用。

3.一种发酵制备枯草芽孢杆菌发酵液的方法，其特征在于：发酵所用菌株为权利要求1所述的菌株，发酵所用培养基为无机盐羽毛培养液，发酵条件为：摇瓶至OD₆₀₀为0.5，按0.1-0.5%接种发酵，温度35-41℃，转速160r/min，发酵时间为12-36h，pH 7.0-8.0；该无机盐羽毛培养液配方为：NaCl 0.5g/L、KH₂PO₄ 0.4g/L、K₂HPO₄ 0.3g/L、羽毛粉10g/L，pH8.0。

4.如权利要求3所述的发酵制备枯草芽孢杆菌发酵液的方法，其特征在于：发酵条件为：摇瓶至OD₆₀₀为0.5，按0.1%接种发酵，温度37℃，转速160r/min，发酵时间为24h，pH 8.0。

5.如权利要求3或4所述的方法得到的发酵液。

6.如权利要求5所述的发酵液在降解角蛋白中的应用。

7.如权利要求5所述的发酵液在降解胶原蛋白中的应用。