TW201443081A - 抗－ｍｃｓｐ抗體 - Google Patents

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TW201443081A
TW201443081A TW103106352A TW103106352A TW201443081A TW 201443081 A TW201443081 A TW 201443081A TW 103106352 A TW103106352 A TW 103106352A TW 103106352 A TW103106352 A TW 103106352A TW 201443081 A TW201443081 A TW 201443081A
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Ralf Hosse
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Abstract

本發明提供抗-MCSP抗體及使用其之方法。

Description

抗-MCSP抗體
本發明係關於抗-MCSP抗體及在疾病之治療及診斷中使用該等抗-MCSP抗體之方法。
MCSP
黑素瘤硫酸軟骨素蛋白多糖(MCSP)為於大多數黑素瘤癌症中表現之大跨膜蛋白多糖。MCSP亦於包括神經膠質母細胞瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、一些類型之ALL及AML、及基底細胞癌之其他癌症上表現。其充作早期細胞表面黑素瘤進展標誌物及涉及刺激腫瘤細胞增生、轉移、遷移、入侵、及血管生成。Staube,E.等人，FEBS Letters，527：114-118(2002)；Campoli,M.等人，Crit.Rev.Immun.24：267-296(2004)；Vergilis,I.J.,J Invest Dermatol，125：526-531(2005)；Yang,J.,JCB,165：881-891(2004)；Luo,W.,J.Immuno.，176：6046-6054(2006)。
抗體糖基化
寡糖組分會明顯地影響與治療性糖蛋白之效力相關之性質，包括物理穩定性、針對蛋白酶攻擊之抗性、與免疫系統之相互作用、藥物動力學、及特異性生物活性。該等性質不僅可取決於存在或不存在寡糖而且可取決於寡糖之特定結構。可在寡糖結構及糖蛋白功能之間進行一些一般化。例如，某些寡糖結構介導透過與特定碳水化合物結 合蛋白相互作用從血液快速清除糖蛋白，而其他寡糖結構可經抗體結合及觸發非所欲之免疫反應(Jenkins等人，Nat Biotechnol 14,975-81(1996))。
IgG1型抗體(用於癌症免疫治療中之最常見抗體)為在各CH2域中之Asn 297處具有保留N-連接糖基化位點之糖蛋白。這兩種附接至Asn 297之複合雙觸寡糖埋藏在CH2域之間，形成與多肽主鏈之廣泛接觸，及其之存在為抗體介導諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之效應功能所必需的(Lifely等人，Glycobiology 5，813-822(1995)；Jefferis等人，Immunol Rev 163，59-76(1998)；Wright and Morrison，Trends Biotechnol 15，26-32(1997))。
單株抗體之細胞介導之效應功能可藉由工程化其寡糖組分而增強，如Umana等人，Nat Biotechnol 17，176-180(1999)及美國專利案第6,602,684號(WO 99/54342)中所述。Umana等人證實β-(1,4)-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)(一種催化形成平分寡糖之糖基轉移酶)於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之過度表現明顯地增強產生於其等細胞中之抗體的活體外ADCC活性。Asn 297碳水化合物之組成改變或其之消除亦會影響抗體Fc域至Fc.γ.R及C1q蛋白之結合(Umana等人，Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Davies等人，Biotechnol Bioeng 74,288-294(2001)；Mimura等人，J Biol Chem 276,45539-45547(2001)；Radaev等人，J Biol Chem 276,16478-16483(2001)；Shields等人，J Biol Chem 276,6591-6604(2001)；Shields等人，J Biol Chem 277,26733-26740(2002)；Simmons等人，J Immunol Methods 263,133-147(2002))。
本發明提供抗-MCSP抗體及使用其之方法。本發明之一個態樣提供一種結合至包含含CSPG重複域之人MCSP之近膜端抗原決定基之單 離抗體，其中該抗體以5×10-9M或更小之Kd結合至MCSP。於一個實施例中，抗體以2×10-9M或更小之Kd結合至MCSP。
本發明之另一個態樣提供一種結合至包含含CSPG重複域之人MCSP之近膜端抗原決定基之單離抗體，其中該抗體以相較抗-MCSP抗體M4-3/ML2增加至少2倍的親和力結合至MCSP。於一個實施例中，該抗體以相較抗-MCSP抗體M4-3/ML2增加至少4倍之親和力結合至MCSP。
於一個實施例中，含CSPG重複域包括CSPG重複14(SEQ ID NO：3)。於一個實施例中，該抗體為雙特異性抗體。於一個實施例中，該抗體為scFv片段、Fv片段、或F(ab')2片段。於一個實施例中，該抗體為人、人源化、或嵌合抗體。於一個實施例中，該抗體包括Fc區。於一個實施例中，該抗體為全長IgG類抗體。於一個實施例中，該抗體經過糖基工程化以修飾Fc區中之寡糖。於一個實施例中，該Fc區具有相較於非糖基工程化抗體減小數目的岩藻糖殘基。於一個實施例中，該抗體具有相較於非糖基工程化抗體增加之Fc區GlcNAc殘基相對岩藻糖殘基比值。於一個實施例中，該Fc區具有相較於非糖基工程化抗體增加比例的平分寡糖。於一個實施例中，該Fc區具有相較於非糖基工程化抗體增加比例的平分寡糖。於一個實施例中，該抗體具有相較於非糖基工程化抗體增加之效應功能。於一個實施例中，該效應功能為增加之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性。於一個實施例中，該效應功能為增加之結合至Fc受體之親和力。
於一個實施例中，該抗-MCSP抗體包括(a)包含選自SEQ ID NO：48及SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：59、及SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含選自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：64、及SEQ ID NO：68之胺基酸 序列之HVR-L1；(e)包含選自SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-L2；(f)包含選自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：65、及SEQ ID NO：70之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，該抗-MCSP抗體包括(a)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。於一個實施例中，該抗-MCSP抗體包括(a)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L3。於一個實施例中，該抗-MCSP抗體包括(a)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3及(d)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，該抗-MCSP抗體包括(a)具有相對SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少95%序列一致性之VH序列；(b)具有相對SEQ ID NO：51之胺基酸序列至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。於一個實施例中，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：47之VH序列。於一個實施例中，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：51之VL序列。於一個實施例中，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：47之VH序列及SEQ ID NO：51之VL序列。
本發明之另一個態樣提供一種編碼如上所述之抗-MCSP抗體之單離核酸。本發明之另一個態樣提供一種包含該種核酸之宿主細胞。本發明之另一個態樣提供一種產生抗體之方法，該方法包括培養該宿主細胞使得產生抗體。
本發明之另一個態樣提供一種包含如上所述之抗-MCSP抗體及細 胞毒性劑之免疫偶聯物。本發明之另一個態樣提供一種包含如上所述之抗-MCSP抗體及醫藥上可接受之載劑之免疫偶聯物。
本發明之另一個態樣提供一種如上所述之抗-MCSP抗體或其免疫偶聯物，其係用作藥物。本發明之另一個態樣提供一種如上所述之抗-MCSP抗體或其免疫偶聯物，其係用於治療癌症，特別是表現MCSP之其等癌症，包括皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠瘤(包括神經膠質母細胞瘤)、骨癌(諸如骨肉瘤)、及白血病(包括ALL及AML)。
本發明之另一個態樣提供一種如上所述之抗-MCSP抗體於誘導細胞裂解之用途。本發明之另一個態樣提供一種如上所述之抗-MCSP抗體或其免疫偶聯物於製造藥物諸如用於治療癌症、或用於誘導細胞裂解之藥物之用途。
本發明之另一個態樣提供一種治療患有癌症之個體之方法，該方法包括投與該個體有效量之如上所述之抗-MCSP抗體或其免疫偶聯物。癌症為例如表現MCSP之癌症，諸如皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠瘤(包括神經膠質母細胞瘤)、骨癌(諸如骨肉瘤)、及白血病(包括ALL及AML)。
本發明之另一個態樣提供一種誘導個體之細胞裂解之方法，該方法包括投與該個體有效量之如本文所述之抗-MCSP抗體或其免疫偶聯物以誘導細胞裂解。
圖1為繪示FAC試驗之結果之圖，該圖顯示嵌合抗體LC007針對Colo38細胞中之表面MCSP之結合親和力。
圖2為繪示FAC試驗之結果之圖，該圖顯示嵌合抗體LC007針對A2058及A375癌細胞中之表面MCSP之結合親和力。
圖3為MCSP之含CSPG重複結構之示意圖。
圖4為顯示LC007針對MCSP CSPG重複結構之結合特異性之圖。
圖5為繪示FAC試驗之結果之圖，該圖顯示抗體LC007以與結合至對應人表現結構類似的親和力結合至馬來猴結構。
圖6為顯示影響非糖基工程化及糖基工程化LC007抗體二者之ADCC效應之圖。
圖7為顯示在人U86MG神經膠質母細胞瘤細胞系中觀察到糖基工程化LC007抗體之ADCC效應之圖。
圖8為顯示LC007抗體之若干種人源化變異體之結合性質之圖。
圖9為顯示LC007之人源化變異體保留親本糖基工程化LC007抗體之ADCC活性之圖。
圖10為顯示LC007之人源化變異體保留親本糖基工程化LC007抗體之ADCC活性之圖。
圖11繪示顯示相較於媒劑對照組在隱藏有MV3腫瘤細胞系之FcgR3A轉基因SCID小鼠中人源化糖基工程化抗-MCSP抗體明顯地增加存活時間之存活曲線。
圖12繪示顯示相較於媒劑對照組在隱藏有MDA-MB-435腫瘤細胞系之FcgR3A轉基因SCID小鼠中嵌合糖基工程化抗-MCSP抗體明顯地增加存活時間之存活曲線。
圖13繪示顯示相較於媒劑對照組在隱藏有MDA-MB-435腫瘤細胞系之FcgR3A轉基因SCID小鼠中嵌合糖基工程化抗-MCSP抗體及其人源化變異體M4-3ML2二者均明顯地增加存活時間之存活曲線。
圖14繪示成熟抗-MCSP純系相較於未成熟親本純系(M4-3 ML2)之親和力的比對。
I.定義
用於本文目的之「人受體架構」為包括衍生自如下文定義之人 免疫球蛋白架構或人一致架構之輕鏈可變域(VL)架構或重鏈可變域(VH)架構之胺基酸序列之架構。「衍生自」人免疫球蛋白架構或人一致架構之人受體架構可包含其相同胺基酸序列，或其可包含胺基酸序列改變。於一些實施例中，胺基酸改變之數量為10處或更少、9處或更少、8處或更少、7處或更少、6處或更少、5處或更少、4處或更少、3處或更少、或2處或更少。於一些實施例中，人VL受體架構之序列與VL人免疫球蛋白架構序列或人一致架構序列相同。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如，抗原)之間之非共價相互作用之總體強度。除非另作指明，否則如本文所用「結合親和力」係指反映結合對成員(例如，抗體與抗原)之間之1：1相互作用之固有結合親和力。分子X針對於其搭配物Y之親和力一般可以解離常數(Kd)表示。可藉由相關技藝中已知之常用方法(包括本文所述之其等方法)測定親和力。下文描述用於測定結合親和力之具體說明性及示例性實施例。
「親和力成熟」抗體係指在一或多個超變區(HVR)中具有一或多處改變之抗體，相較之親本抗體不具有該等改變，該等改變會導致抗體針對於抗原之親和力之提高。
「血管生成病症」係指血管生成之任何失調，包括非腫瘤性及腫瘤性病況二者。腫瘤性病況包括(但不限於)下文所述之其等。非腫瘤性病症包括(但不限於)非所欲或異常性過度生長、關節炎、類風濕關節炎(RA)、銀屑病、斑塊狀銀屑病、類肉瘤病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑、糖尿病性視網膜病及包括早產兒視網膜病之其他增生性視網膜病、眼晶狀體後纖維組織增生、新生血管性青光眼、與老化相關之黃斑病變、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、角(虹膜)之新血管生成、眼新生血管性疾病、血管性再狹窄症、動靜脈畸形 (AVM)、腦膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格拉夫氏病(Grave's disease))、角膜及其他組織移植、慢性發炎、肺發炎、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺高血壓、惡性肺積水、大腦水腫(例如，與急性中風/閉合性頭部損傷/創傷相關聯者)、滑膜發炎、在RA中之血管翳形成、骨化性肌炎、肥大骨骼形成、骨關節炎(OA)、難治性腹水、多囊性卵巢疾病、子宮內膜異位症、第3空間體液疾病(胰腺炎、房室症候群、燒傷、腸疾病)、子宮纖維瘤、早產、諸如IBD(克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)之慢性發炎、腎同種異體移植排斥、發炎性腸疾病、腎病症候群、非所欲或異常性組織質量增長(非癌症)、血友病性關節、肥厚性疤痕、毛髮生長之抑制、奧斯勒-惠脖症候群(Osler-Weber syndrome)、化膿性肉芽腫眼晶狀體後纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管黏著、滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心包積水(諸如與心包膜炎相關聯者)、及胸腔積液。
術語「抗-MCSP抗體」及「結合至MCSP之抗體」係指可以足夠使得抗體適用作靶向MCSP之診斷性及/或治療性藥劑之親和力來結合MCSP之抗體。於一個實施例中，如例如藉由放射免疫測定法(RIA)測得，抗-MCSP抗體與無相關、非-MCSP蛋白之結合程度小於抗體與MCSP之結合之約10%。於某些實施例中，結合至MCSP之抗體具有1μM、100nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、或0.001nM(例如，10-8M或更小，例如自10-8M至10-13M，例如自10-9M至10-13M)之解離常數(Kd)。於某些實施例中，抗-MCSP抗體係結合至在不同物種之MCSP中為保守之MCSP抗原決定基。
本文術語「抗體」是在最寬廣意義上使用及涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、及抗體片段，只要其展現期望的抗原結合活性。
「抗體片段」係指包括結合完整抗體結合之抗原的完整抗體之一部分之非完整抗體之分子。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
作為參照抗體之「結合至相同抗原決定基之抗體」係指競爭性檢定中阻斷參照抗體結合至其抗原達50%或更大之抗體，反之，在競爭性檢定中參照抗體阻斷抗體結合至其抗原達50%或更大。一示例性競爭檢定提供於本文中。
術語「癌症」及「惡性腫瘤」係指或描述哺乳動物中通常特徵為不受調節之細胞生長/增生之生理病況。癌症之實例包括(但不限於)癌、淋巴瘤(例如，霍奇金氏(Hodgkin’s)及非霍奇金氏淋巴瘤)、胚細胞瘤、肉瘤、及白血病。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌、骨癌(例如，骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma))、胃腸癌、胰癌、神經膠瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、***癌、皮膚癌(例如，黑素瘤及基底細胞癌)、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病及其他淋巴增生病症、及各種類型之頭部及頸部癌症。
術語「細胞增生性病症」及「增生性病症」係指與某種程度之異常性細胞增生相關聯之病症。於一個實施例中，該細胞增生性病症為癌症。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分係衍生自特定來源或物種而該重鏈及/或輕鏈之其餘部分係衍生自不同來源或物種之抗體。
抗體之「類型」係指其重鏈所包含之恆定域或恆定區之類型。存在五種主要類型的抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，及其中該等類型中之若干種可進一步細分為子類型(同型物)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。對應於不同類型之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ、及μ。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或導致細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、及Lu之放射性同位素)；化療劑或藥物(例如，甲胺喋呤、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物源性之酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；及揭示於下文之各種抗腫瘤或抗癌藥。
「效應功能」係指其等可歸因於抗體Fc區之生物活性，抗體同型物之該等生物活性不同。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指有效地在劑量下且持續所需時段以達成期望的治療性或預防性結果之量。
術語「Fc區」於本文中用以定義免疫球蛋白重鏈之包含恆定區之至少一部分之C-端區。該術語包括天然序列Fc區及可變Fc區。於一個實施例中，人IgG重鏈Fc區自Cys226、或自Pro230延伸至重鏈之羧 基末端。然而，Fc區之C-端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文中另作指明，否則依照EU編號系統(亦稱為EU索引)來進行Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda,MD,1991中所述。
「架構」或「FR」係指除了超變區(HVR)殘基以外之可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域：FR1、FR2、FR3、及FR4組成。因此，HVR及FR序列一般呈以下序列存在於VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」、及「全抗體」在本文中可互換使用以指具有實質上類似於天然抗體結構之結構或具有包含如本文所定義Fc區之重鏈之抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」、及「宿主細胞培養物」可互換使用及係指其中已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉形細胞」，其包括初代轉形細胞及衍生自其之子代(不考慮繼代的數量)。子代之核酸含量可不完全與親本細胞相同，但可包含突變。本文中包括經篩選或選擇具有如在最初轉形細胞中之相同功能或生物活性之突變子代。
「人抗體」為具有與由人或人細胞產生或衍生自利用人抗體譜系或其他編碼人抗體序列之非人來源之抗體之胺基酸序列對應之胺基酸序列者。人抗體之該定義明確不包括包含非人抗原-結合殘基之人源化抗體。
「人一致架構」為代表在人免疫球蛋白VL或VH架構序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基之架構。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列選自可變域序列之子群。一般而言，該序列子群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1至3卷中之子群。於一個實施例中，對於VL，子群為如Kabat等人(前述)之子群κ I。於一個實施例中，對於VH，子群為如Kabat等人(前述)之子群III。
「人源化」抗體係指包含來自非人HVR之胺基酸殘基及來自人FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。於某些實施例中，人源化抗體將包含實質上所有或至少一個(及通常兩個)可變域，其中所有或實質上所有HVR(例如，CDR)對應於非人抗體之其等HVR，及所有或實質上所有FR對應於人抗體之其等FR。人源化抗體可視需要包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如，非人抗體)之「人源化形式」係指已經歷人源化之抗體。
如本文所用，術語「超變區」或「HVR」係指序列為超變及/或形成結構上界定之迴路(「超變迴路」)之抗體可變域之各個區。一般而言，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，及三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自超變迴路及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或涉及抗原識別。示例性超變迴路出現在胺基酸殘基第26至32位(L1)、第50至52位(L2)、第91至96位(L3)、第26至32位(H1)、第53至55位(H2)、及第96至101位(H3)之處。(Chothia與Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、及CDR-H3)出現在胺基酸殘基第24至34位(L1)、第50至56位(L2)、第89至97位(L3)、第31至35B位(H1)、第50至65位(H2)、及第95至102位(H3)之處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda,MD(1991))。除了VH中之CDR1以外，CDR一般包含形成該超變迴路之胺基酸殘基。CDR亦包含為接觸抗原之殘基之「特異性決定基」或「SDR」。SDR包含於稱為簡化-CDR或 a-CDR的CDR之區中。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、及a-CDR-H3)出現在胺基酸殘基第31至34位(L1)、第50至55位(L2)、第89至96位(L3)、第31至35B位(H1)、第50至58位(H2)、及第95至102位(H3)之處。(參見Almagro與Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另作指明，否則於本文中依照Kabat等人(前述)來進行可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)編號。
「免疫偶聯物」為偶聯至一或多個異種分子，包括(但不限於)細胞毒性劑之抗體。
「個體(individual/subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如，牛、羊、貓、狗、及馬)、靈長類動物(例如，人及諸如猴之非人靈長類動物)、兔、及齲齒動物(例如，小鼠及大鼠)。於某些實施例中，個體為人。
「單離」抗體為自其自然環境之組分分離得者。於一些實施例中，抗體係經純化達成大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或逆相HPLC)測得。關於用於評估抗體純度之方法的評審，請參見(例如)Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「單離」核酸係指已自其自然環境之組分分離得的核酸分子。單離核酸包括包含於通常包含核酸分子之細胞中之該核酸分子，但該核酸分子存於染色體外或存於不同於其天然染色體位置之染色體位置之處。
「編碼抗-MCSP抗體之單離核酸」係指一或多個編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之核酸分子，包括在單一載體或分開載體中之該(等)核酸分子、及存於宿主細胞中一或多個位置之處之該(等)核酸分子。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群組 獲得的抗體，亦即，包含個別抗體之該群組相同及/或結合相同抗原決定基，但不包括(例如)包含自然生成之突變體或產生於製備單株抗體製劑期間之可能的變異體抗體，該等變異體一般係以少量存在。與通常包含針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之多株抗體製劑不同，單株抗體製劑之各單株抗體針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示如自實質上均質抗體之群組獲得之抗體之特徵，而不應被解釋為是需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體呈現法、及利用包含所有或部分人免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，本文中描述該等方法及其他用於產生單株抗體之示例性方法。
「裸抗體」係指未偶聯至異種部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記之抗體。裸抗體可存於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有各種結構之自然生成之免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體為由經二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈所構成之約150,000道耳頓之異源四聚糖蛋白。各重鏈從N端至C端具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域，接著是三個恆定域(CH1、CH2、及CH3)。類似地，各輕鏈從N端至C端具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域，接著是恆定輕(CL)域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列指派為兩種類型(稱為卡帕(kappa，κ)及蘭姆達(lambda，λ))中之一種類型。
術語「包裝插頁」用於指習慣上包含於治療性產品之商業化包裝中之使用說明，其包含關於適應症、用法、劑量、投藥、組合治療、禁忌及/或有關於使用該等治療性產品之警告之資訊。
相對於參照多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為候選序列中與參照多肽序列中之胺基酸殘基相同之胺基酸殘基的百 分比，在比對該等序列及引入空位(若需要)之後以達成最大序列一致性百分比，及不將任何守恆性取代視為序列一致性之部分。基於確定胺基酸序列一致性百分比目的之比對可以在本技藝技術內之多種方法達成，例如，使用公開可用電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技藝者可測得用於比對序列之適宜參數，包括於所比較序列之全長上達成最大比對所需之任何演算法。然而，為達成本文之目的，利用序列比較電腦程式ALIGN-2獲得胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.創造，及原始碼由在美國版權局(U.S.Copyright Office)(華盛頓，20559)中之使用者文件申請，於該處ALIGN-2序列比較電腦程式以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.，加州南聖弗朗西斯科公開取得，或可藉由原始碼編譯。ALIGN-2程式應在包括數位UNIX V4.0D之UNIX操作系統上經編譯供使用。藉由ALIGN-2程式設定所有序列比較參數且不改變。
於其中ALIGN-2用於胺基酸序列比較之情況中，可如下計算得給定胺基酸序列A對、與、或相對給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(其可替代性地稱為具有或包含對、與、或相對給定胺基酸序列B之特定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)：100乘以分數X/Y
其中X為在A及B之程式比對中藉由序列比對程式ALIGN-2評分為相同匹配的胺基酸殘基數，及其中Y為B中胺基酸殘基的總數。應瞭解在胺基酸序列A之長度不與胺基酸序列B之長度相等之情況下，A相對B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對A之胺基酸序列一致性%。除非另作明確敘述，否則用於本文中之所有胺基酸序列一致性%值係 如上一段落中所述利用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈此種容許其中所含活性成分之生物活性為有效之形式且不含對將投與調配物之個體有不可接受的毒性之額外組分之製劑。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除了活性成分以外之成分，其對個體無毒。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑、或防腐劑。
如本文中所用，除非另作指明，否則術語「MCSP」係指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如，人)及齲齒動物(例如，小鼠及大鼠)之任何天然MCSP(黑素瘤硫酸軟骨素蛋白多糖)。術語包含「全長」、未經處理之MCSP以及自細胞中處理產生之任何MCSP形式。術語亦包含自然生成之MCSP變異體，例如，接合變異體或對偶基因變異體。MCSP亦稱為硫酸軟骨素蛋白多糖4(CSPG4)、硫酸軟骨素蛋白多糖NG2、與高分子量黑素瘤相關聯之抗原(HMW-MAA)、及黑素瘤硫酸軟骨素蛋白多糖。示例性人MCSP之胺基酸序列以SEQ ID NO：1表示。亦可參見Pluschke G.等人，Molecular cloning of a human melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：9710-9715(1996)，Staub E.等人，A novel repeat in the melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan defines a new protein family，FEBS Lett.527：114-118(2002)；Genbank寄存編號：NP_001888。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或治療「(treating)」)係指嘗試改變所治療個體之自然病程之臨床干預，及可基於預防性目的或在臨床病理病程期間進行。治療之期望效應包括(但不限於)預防疾病之發生或復發，緩解症狀，消除疾病之任何直接或間接病理結果，預防轉移，減低疾病進展之速率， 改善或減輕疾病狀態，及緩解或改善預後。於一些實施例中，本發明之抗體係用於延遲疾病發展或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中涉及抗體結合至抗原之域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變域(分別為VH及VL)一般具有類似結構，其中各域包含四個守恆性架構區(FR)及三個超變區(HVR)。(參見：例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原-結合特異性。另外，結合特定抗原之抗體可分別利用VH或VL域自結合抗原之抗體單離以篩選互補VL或VH域庫。參見：例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，術語「載體」係指可繁殖其所連接的另一核酸之核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體及併入至已引入載體之宿主細胞基因組中之載體。某些載體可引導其以操作方式所連接的核酸之表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。
II.組合物及方法
本發明提供可用於治療及/或診斷諸如癌症之細胞增生性疾病之抗-MCSP抗體。於某些實施例中，提供結合至MCSP之近膜端抗原決定基之抗體。於某些實施例中，提供結合至MCSP之具有增強之效應功能之抗體。
A.示例性抗-MCSP抗體
於一個態樣中，本發明提供結合至MCSP之單離抗體。特定言之，本發明中提供之抗-MCSP抗體結合至人MCSP之近膜端抗原決定基。如Staub E.等人，FEBS Lett.527：114-118(2002)中論述，MCSP之近膜端區係由多個新穎重複域(稱為CSPG重複域)所組成(圖3)。本發明之抗-MCSP抗體結合至存於人MCSP之近膜端域中之包括含CSPG重 複域之抗原決定基。於一個實施例中，含CSPG重複域包括對應於人MCSP之胺基酸第1937至2043位之CSPG重複14。於一個實施例中，CSPG重複14域具有以SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列。於另一個實施例中，含CSPG重複域包括CSPG重複14以及CSPG重複15之至少一部分。CSPG重複15域對應於人MCSP之胺基酸第2044至2246位。於一個實施例中，CSPG重複-15域具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列。於一個實施例中，含CSPG重複域包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列。於一個實施例中，含CSPG重複域包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列而不包括天然跨膜域。於一個實施例，含CSPG重複域包括CSPG重複13至15。於一個實施例中，含CSPG重複域包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。於一個實施例中，含CSPG重複域包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列而不包括天然跨膜域。於一個實施例中，含CSPG重複域包括CSPG重複12至15。於一個實施例中，含CSPG重複域包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列。於一個實施例中，含CSPG重複域包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列而不包括天然跨膜域。於某些實施例中，天然跨膜域為VIIPMC LVLLLLALIL PLLFY(UniProt進入號Q6UVK1)(SEQ ID NO：44)。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體誘導表現MCSP之細胞的裂解。可藉由任何機制誘導裂解，諸如藉由介導效應功能，諸如C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調；及B細胞活化，或藉由直接誘導細胞之細胞凋亡。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體經糖基工程化以具有相較非糖基工程化親本抗-MCSP抗體至少一種效應功能之增強。效應功能之增強為與Fc受體之結合親和力之增強、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之增強；與NK細胞結合之增強；與巨噬細胞結合之增強；與多形核細胞結合之增強；與單核細胞結合之增強；直接發訊號誘導細胞凋亡；樹 突細胞成熟作用之增強；或T細胞啟始之增強。糖基工程化抗-MCSP抗體相較針對於MCSP之相同抗原決定基之非糖基工程化抗體在罹患表現MCSP之癌症之個體中提供存活效益。
於一個態樣中，本發明提供一種包括至少一種、兩種、三種、四種、五種、或六種選自以下之HVR之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個態樣中，本發明提供一種包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3。於另一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個態樣中，本發明提供一種包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2及(c)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。於一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，本發明之抗-MCSP抗體包括(a)包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列之VH域：(i)包括 SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列之VL域：(i)包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，本發明提供一種包括以下之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個態樣中，本發明提供一種包括至少一種、兩種、三種、四種、五種、或六種HVR選自以下之HVR之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個態樣中，本發明提供一種包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3。於另一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個態樣中，本發明提供一種包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。於一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，本發明之抗-MCSP抗體包括(a)包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列之VH域：(i)包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列之VL域：(i)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，本發明提供一種包括以下之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，本發明提供一種包括以下之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：12 之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，本發明提供一種包括以下之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，本發明提供一種包括以下之抗-MCSP抗體：(a)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個態樣中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：27之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VH序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：27中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區(亦即，FR中)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：27之VH序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VH包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3。
於另一個態樣中，提供一種抗-MCSP抗體，其中該抗體包括具有相對SEQ ID NO：26之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：26中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR中)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：26之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VL包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，提供一種抗-MCSP抗體，其中該抗體包括如上文所提供任何實施例中之VH、及如上文所提供任何實施例中之VL。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VH及SEQ ID NO：26中之VL序列，其包括該等序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：32之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VH序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：32中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在 HVR外部區域(即，FR中)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：32之VH序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VH包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3。
於另一個態樣中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：31之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VL序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：31中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR中)中。視情況，抗-MCSP抗體包括呈SEQ ID NO：31之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VL包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-L1，(b)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，提供一種抗-MCSP抗體，其中該抗體包括如上文所提供任何實施例中之VH、及上文所提供任何實施例中之VL。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：32之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：31之胺基酸序列之VL，其包括該等序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VH序列。於某些實施例中，具有 至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：29中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR中)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：29之VH序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VH包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包括SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包括SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-H3。
於另一個態樣中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：28之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VL序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：28中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR中)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括呈SEQ ID NO：28之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VL包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L1，(b)包括SEQ ID NO：11之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包括SEQ ID NO：12之胺基酸序列之HVR-L3。
於另一個態樣中，提供一種抗-MCSP抗體，其中該抗體包括如上文所提供任何實施例中之VH、及如上文所提供任何實施例中之VL。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：29之胺基酸序列之VH 及包括SEQ ID NO：28之胺基酸序列之VL，其包括該等序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：35之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之重鏈序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之重鏈序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：35中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR中)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：35之重鏈序列，其包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，提供一種抗-MCSP抗體，其中該抗體包括具有相對SEQ ID NO：34之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之輕鏈。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之輕鏈序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：34中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR中)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：34之輕鏈序列，其包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，提供一種抗-MCSP抗體，其中該抗體包括如上文所提供任何實施例中之重鏈、及如上文所提供任何實施例中之輕鏈。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：35之胺基酸序列之重鏈序列及包括SEQ ID NO：34之胺基酸序列之輕鏈序列，其包括 該等序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：37之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之重鏈序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之重鏈序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：37中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR中)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：37之重鏈序列，其包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，提供一種抗-MCSP抗體，其中該抗體包括具有相對SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之輕鏈。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之輕鏈序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：36中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：36之輕鏈序列，其包括該序列之轉譯後修飾。
於另一個態樣中，提供一種抗-MCSP抗體，其中該抗體包括如上文所提供任何實施例中之重鏈、及如上文所提供任何實施例中之輕鏈。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：37之胺基酸序列之重鏈序列及包括SEQ ID NO：36之胺基酸序列之輕鏈序列，其包括該等序列之轉譯後修飾。於另一個態樣中，本發明提供一種結合至與 本文所提抗-MCSP抗體相同之抗原決定基之抗體
於一個實施例中，提供一種結合至與具有包括SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：26之胺基酸序列之VL之抗-MCSP抗體相同之抗原決定基之抗體。於另一個實施例中，提供一種結合至與具有包括SEQ ID NO：32之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：31之胺基酸序列之VL之抗-MCSP抗體相同之抗原決定基之抗體。
本發明之另一個態樣提供一種具有增強之對其MCSP目標之親和力之抗-MCSP抗體，例如，述於實例10中之親和力成熟抗-MCSP抗體。該等抗體以5×10-9M、2×10-9M、1×10-9M、5×10-10M、2×10-9M、1×10-10M、5×10-11M、1×10-11M、5×10-12M、1×10-12M、或更小之Kd結合至MCSP。
於一個實施例中，本發明提供一種具有比抗-MCSP抗體M4-3/ML2(SEQ ID NO：37及36/SEQ ID NO：32及31)增強至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或更多倍親和力之抗-MCSP抗體。
於此態樣之一個實施例中，本發明提供一種包括以下之抗-MCSP抗體：(a)包括選自SEQ ID NO：48及SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括選自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：59、及SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包括選自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：64、及SEQ ID NO：68之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包括選自SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-L2；(f)包括選自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：65、及SEQ ID NO：70之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列 之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：49之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。於另一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：49之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2及(c)包括SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L3。於一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括(a)包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列之VH域：(i)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包括SEQ ID NO：49之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包括選自SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列之VL域：(i)包括SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包括SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：49之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包括SEQ ID NO：52胺基酸序列之HVR-L1；(e)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包括選自SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：47之 胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VH序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：47中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：47之VH序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VH包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包括SEQ ID NO：49之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：51之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之輕鏈可變域(VL)。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：51中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：51之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VL包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括如上文所提供任何實施例中 之VH、及如上文所提供任何實施例中之VL。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：47之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：51之胺基酸序列之VL，其包括該等序列之轉譯後修飾。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之重鏈序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之重鏈序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：45中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：45之重鏈序列，其包括該序列之轉譯後修飾。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：46之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之輕鏈。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之輕鏈序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留與MCSP結合之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：46中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：46之輕鏈序列，其包括該序列之轉譯後修飾。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括如上文所提供任何實施例中之重鏈、及如上文所提供任何實施例中之輕鏈。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：45之胺基酸序列之重鏈序列及包括SEQ ID NO：46之胺基酸序列之輕鏈序列，其包括該等序列之轉譯後修飾。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：56之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。於另一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：56之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：55之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VH序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：55中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：55之VH序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VH包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包括SEQ ID NO：56之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。於另一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VH序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：57中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：57之VH序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VH包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包括SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。於另一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：60之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VH序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99% 一致性之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：60中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：60之VH序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VH包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包括SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VH HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。於另一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包括SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：62之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VH序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VH序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：62總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：62之VH序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VH包 括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包括SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：64之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2及(c)包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-L3。於一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：64之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VL序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：63中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：63之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VL包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：64之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：68之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-L2及(c)包括 SEQ ID NO：70之胺基酸序列之HVR-L3。於一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：68之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：70之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：67之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VL序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：67中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：67之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VL包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：68之胺基酸序列之HVR-L1，(b)包括SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包括SEQ ID NO：70之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：64之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2及(c)包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-L3。於一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：64之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、或100%序列一致性之VL序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列包含相對於參照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包括該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：66中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在HVR外部區域(即，FR)中。視情況，該抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：66之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VL包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：64之胺基酸序列之HVR-L1，(b)包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括至少一種、至少兩種、或所有三種選自以下之VL HVR序列：(a)包括SEQ ID NO：68之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-L2及(c)包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-L3。於一個實施例中，該抗體包括(a)包括SEQ ID NO：68之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包括SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括具有相對SEQ ID NO：71之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性之VL序列。於某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之VL序列包含相對於對照序列之取代(例如，守恆性取代)、***、或缺失，但包含該序列之抗-MCSP抗體保留結合至MCSP之能力。於某些實施例中，SEQ ID NO：71中總計1至10個胺基酸發生取代、***及/或缺失。於某些實施例中，取代、***、或缺失發生在 HVR外部區域(即，FR)中。視情況，抗-MCSP抗體包括SEQ ID NO：71之VL序列，其包括該序列之轉譯後修飾。於一特定實施例中，該VL包括一種、兩種或三種選自以下之HVR：(a)包括SEQ ID NO：68之胺基酸序列之HVR-L1，(b)包括SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列之HVR-L3。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體包括如上文所提供任何實施例中之VH、及如上文所提供任何實施例中之VL。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：47之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：63之胺基酸序列之VL，其包括該等序列之轉譯後修飾。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：57之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：51之胺基酸序列之VL，其包括該等序列之轉譯後修飾。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：57之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：63之胺基酸序列之VL，其包括該等序列之轉譯後修飾。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：47之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：67之胺基酸序列之VL，其包括該等序列之轉譯後修飾。於一個實施例中，該抗體包括包括SEQ ID NO：57之胺基酸序列之VH及包括SEQ ID NO：67之胺基酸序列之VL，其包括該等序列之轉譯後修飾。
於其他實施例中，提供一種競爭結合至與如本文所述之抗-MCSP抗體相同之抗原決定基之抗體。
於一個實施例中，結合至與抗-MCSP抗體相同之抗原決定基、及/或競爭結合至與其相同之抗原決定基之抗體展現效應功能活性，諸如(例如)Fc介導細胞毒性，包括ADCC活性。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體結合至人MCSP之近膜端抗原決定基。於一個實施例中，該抗-MCSP抗體結合至包括含CSPG重複域之人MCSP近膜端抗原決定基。於一個實施例中，抗-MCSP抗體結合 至來自SEQ ID NO：5之胺基酸序列、於SEQ ID NO：5之胺基酸序列中、或與SEQ ID NO：5之胺基酸序列重疊之人MCSP近膜端抗原決定基。於一個實施例中，抗-MCSP抗體係結合至來自SEQ ID NO：4之胺基酸序列、於SEQ ID NO：4之胺基酸序列中、或與SEQ ID NO：4之胺基酸序列重疊之人MCSP近膜端抗原決定基。於一個實施例中，抗-MCSP抗體係結合至來自SEQ ID NO：3之胺基酸序列、於SEQ ID NO：3之胺基酸序列之中、或與SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重疊之人MCSP近膜端抗原決定基。
於本發明之另一個態樣中，根據上述任何實施例之抗-MCSP抗體為單株抗體，包括嵌合、人源化或人抗體。於一個實施例中，抗-MCSP抗體為抗體片段，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體、或F(ab’)2片段。於另一個實施例中，該抗體為全長抗體，例如，完整IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類型或同型物。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體為小鼠單株抗體LC007。該抗體之重鏈及輕鏈之核酸序列分別以SEQ ID NO：37及36呈現。於一個實施例中，抗-MSCP抗體為衍生自小鼠單株抗體LC007之嵌合抗體。於一個實施例中，抗-MSCP抗體為衍生自小鼠單株抗體LC007之人源化抗體。於一個實施例中，抗-MSCP抗體為衍生自小鼠單株抗體LC007之人抗體。
於另一個態樣中，根據上述任何實施例之抗-MCSP抗體可單獨或以組合方式併入如以下部分1至7中所述之任何特徵：
1.抗體親和力
於某些實施例中，本文提供之抗體具有1μM、100nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、或0.001nM(例如，10-8M或更小，例如自10-8M10-13M，例如自10-9M至10-13M)之解離常數(Kd)。
於一個實施例中，藉由使用如以下檢定所述之受關注抗體之Fab版及其抗原進行之放射性標記抗原結合檢定(RIA)來測定Kd。藉由在未經標記之抗原滴定系列的存在下以最小濃度之經(125I)-標記之抗原平衡Fab，接著利用抗-Fab抗體塗覆板捕獲結合抗原來測定Fab針對於抗原之溶液結合親和力(參見：例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立用於檢定之條件，利用含於50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕獲性抗-Fab抗體(Cappel Labs)塗覆MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)過夜，及於隨後在室溫(約23℃)下利用含於PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷兩至五小時。於非吸附性板(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與受關注Fab之連續稀釋液混合(例如，與Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中抗-VEGF抗體(Fab-12)之評估一致)。接著培養受關注Fab過夜；然而，該培養可持續更長的時段(例如，約65小時)以確保達成平衡。此後，將該等混合物轉移至捕獲板以進行室溫下培養(例如，一小時)。接著移除溶液及利用含於PBS中之0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)洗滌該板八次。在該等板已經乾燥時，添加150μl/孔之閃爍劑(MICROSCINT-20TM；Packard)，及該等板係於TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上計數十分鐘。選擇可提供小於或等於最大結合之20%之各Fab的濃度以用於競爭性結合檢定中。
根據另一個實施例，採用表面電漿共振試驗於25℃下使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.，新澤西州皮斯卡塔威)與~10個反應單元(RU)之固定抗原CM5晶片來測定Kd。簡言之，依照供應商使用說明，利用N-乙基-N’-(3-二甲胺基丙基)-碳二亞胺基鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE,Inc.)。於流速為5μl/分鐘之注射之前利用10mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋抗原達成5μg/ml(~0.2μM)以獲得約10 個反應單元(RU)之偶聯蛋白。於注射抗原之後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應群組。就動力學測量而言，Fab之兩倍連續稀釋(0.78nM至500nM)係含於具有0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑(PBST)之PBS中於25℃下以約25μl/min之流速進行注射。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)，同時藉由擬合締合及解離感應曲線圖計算得締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)係計算為比值koff/kon。參見：例如，Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上述表面電漿共振試驗發現締合速率超過106M-1s-1，則可藉由利用螢光淬滅技術來測定締合速率，螢光淬滅技術測量含於PBS(pH 7.2)中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)在25℃於存在漸增濃度之抗原下之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之增強或減弱，如在諸如配備停流之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌透光管之8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic)之光譜儀中所測得。
2.抗體片段
於某些實施例中，提供於本文中之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、及scFv片段、及述於下文之其他片段。關於某些抗體片段之評審，請參見Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之評審，請參見(例如)Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg與Moore編輯(Springer-Verlag，紐約)，第269至315頁(1994)；亦可參見WO 93/16185；及美國專利案第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合抗原決定基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段之論述，請參見美國專利案第5,869,046號。
雙抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體 片段。參見：例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三抗體及四抗體亦述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單域抗體為包括抗體之所有或部分重鏈可變域或所有或部分輕鏈可變域之抗體片段。於某些實施例中，單域抗體為人單域抗體(Domantis,Inc.，麻塞諸塞州沃爾瑟姆；參見(例如)美國專利案第6,248,516號B1)。
可藉由多種技術製得抗體片段，包括(但不限於)如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及由重組宿主細胞(例如，大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生。
3.嵌合及人源化抗體
於某些實施例中，提供於本文中之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體述於例如美國專利案第4,816,567號；及Morrison等人之Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。於一個實例中，嵌合抗體包括非人可變區(例如，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔、或諸如猴之非人靈長類動物之可變區)及人恆定區。於另一個實例中，嵌合抗體為其中類型或子類型已自親本抗體之類型或子類型發生改變之「類型轉換」抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
於某些實施例中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人抗體係經人源化以減低對人之免疫原性，同時保留親本非人抗體之特異性及親和力。一般而言，人源化抗體包括一或多個其中HVR(例如CDR)(或其部分)係衍生自非人抗體、及FR(或其部分)係衍生自人抗體序列之可變域。人源化抗體亦可視需要包括人恆定區之至少一部分。於一些實施例中，人源化抗體中有些FR殘基經來自非人抗體(例如，HVR殘基自其衍生之抗體)之對應殘基取代，(例如)以恢復或改良抗體特異性 或親和力。
人源化抗體及其產生方法係評審於例如Almagro與Fransson之Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步論述於例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利案第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號、及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(闡述SDR(a-CDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(闡述「表面重塑」)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(闡述FR改組之「導引選擇」方法)中。
可用於人源化之人架構區包括(但不限於)：利用「最佳適配(best-fit)」法選擇之架構區(參見(例如)Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；衍生自輕或重鏈可變區特定子群之人抗體之一致序列之架構區(參見：例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.，151：2623(1993))；人成熟(體細胞突變)架構區或人生殖細胞架構區(參見(例如)Almagro與Fransson之Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及衍生自篩選FR庫之架構區(參見(例如)Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4.人抗體
於某些實施例中，提供於本文中之抗體為人抗體。人抗體可利用相關技藝中已知的各種技術產生。人抗體一般述於van Dijk與van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
人抗體可藉由投與免疫原給經過改造之轉基因動物以產生完整 人抗體或具有回應於抗原挑戰之人可變區之完整抗體而製得。該等動物通常包含所有或部分人免疫球蛋白基因座，其可替代內源性免疫球蛋白基因座，或其係存於染色體外或係隨機整合於動物染色體中。於該等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般係經過減活。針對用於從轉基因動物獲得人抗體之方法之評審，請參見Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦可參見(例如)美國專利案第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM技術；美國專利案第5,770,429號，其闡述HUMAB®技術；美國專利案第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術，及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術。來自由該等動物產生之完整抗體之人可變區可進一步例如藉由與不同人恆定區組合進行改造。
人抗體亦可藉由以融合瘤為基礎之方法獲得。已描述用於產生人單株抗體之人骨髓瘤及小鼠-人異源骨髓瘤細胞系。(參見(例如)Kozbor J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51至63頁(Marcel Dekker,Inc.，紐約，1987)；及Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991))。經由人B-細胞融合瘤技術產生的人抗體亦述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括彼等述於例如美國專利案第7,189,826號(闡述從融合瘤細胞系產生單株人IgM抗體)及Ni，Xiandai Mianyixue，26(4)：265-268(2006)(闡述人-人融合瘤)者。人融合瘤技術(Trioma技術)亦述於Vollmers與Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)及Vollmers與Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology，27(3)：185-91(2005)中。
人抗體亦可藉由單離從人衍生之噬菌體呈現庫選擇的Fv純系可變域序列產生。可接著將該等可變域序列與所欲人恆定域組合。下文 描述用於從抗體庫選擇人抗體之技術。
5.庫衍生之抗體
本發明之抗體可藉由篩選具有所欲活性之抗體之組合庫單離。例如，相關技藝中已知用於產生噬菌體呈現庫及篩選具有所欲結合特性之抗體之該等庫的多種方法。該等方法評審於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編輯，Human Press，新澤西州托托瓦，2001)中且進一步述於例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks與Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press，新澤西州托托瓦，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)中。
於某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系係分開藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖及隨機地再組合於噬菌體庫中，其可接著進行抗原-結合噬菌體之篩選，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常呈現抗體片段，呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段。源自免疫化來源之庫可針對免疫原提供高親和力抗體而不需要構築融合瘤。或者，可選殖(例如，自人)天然譜系以提供抗體之單一來源至非自體以及自體抗原之寬廣範圍而不需要任何免疫接種，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述。最後，亦可藉由從干細胞選殖未經重排之V-基因片段，及使用包含隨機序列之PCR引物以編碼高度可變CDR3區及達成活體外重排，合成地製得天然庫，如Hoogenboom與Winter，J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所 述。闡述人抗體噬菌體庫之專利公開案包括(例如)：美國專利案第5,750,373號、及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號、及第2009/0002360號。
自人抗體庫單離得的抗體或抗體片段在本文被視為人抗體或人抗體片段。
6.多特異性抗體
於某些實施例中，提供於本文中之抗體為多特異性抗體，例如，雙特異性抗體。多特異性抗體為具有針對至少兩個不同位點之結合特異性之單株抗體。於某些實施例中，一種結合特異性係針對於MCSP及另一種結合特異性係針對於任何其他抗原。於某些實施例中，雙特異性抗體可結合至MCSP之兩種不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒性劑局部化至表現MCSP之細胞。雙特異性抗體呈全長抗體或抗體片段製得。
用於產生多特異性抗體之技術包括(但不限於)兩條具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein與Cuello，Nature 305：537(1983))，WO 93/08829，及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及「結至孔中(knob-in-hole)」工程化(參見(例如)美國專利案第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下製得：對靜電控制效應工程化以產生抗體Fc-雜二聚分子(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(參見(例如)美國專利案第4,676,980號，及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用亮胺酸拉鏈以產生雙特異性抗體(參見(例如)Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙抗體」技術以產生雙特異性抗體片段(參見(例如)Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚物(參見(例如)Gruber等人，J.Immunol., 152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如(例如)Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述。
本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點之工程化抗體(包括「章魚抗體(Octopus antibody)」)(參見(例如)US 2006/0025576A1)。
本文中之抗體或片段亦包括包含結合至MCSP及另一個不同抗原之抗原結合位點之「雙作用FAb」或「DAF」(參見(例如)US 2008/0069820)。
7.抗體變異體
於某些實施例中，包括提供於本文中之抗體之胺基酸序列變異體。例如，可期望來改善抗體之結合親和力及/或其他生物性質。可藉由引入適宜之修飾至編碼抗體之核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。該等修飾包括(例如)自抗體之胺基酸序列中之殘基缺失、及/或***至其中及/或其之取代。可進行缺失、***、及取代之任何組合以達成最終構築體，其限制條件為該最終構築體具有例如抗原結合性之所欲特性。
a)取代、***、及缺失變異體
於某些實施例中，提供具有一或多處胺基酸取代之抗體變異體。取代突變之受關注位點包括HVR及FR。守恆性取代以標題「守恆性取代」標示於表1中。更多取代改變以標題「示例性取代」提供於表1中，及參照胺基酸側鏈類型如下文進一步論述。胺基酸取代可引入至受關注抗體中及針對於所欲活性(例如，保留/經改善之抗體結合性、經減低之免疫原性、或經改良之ADCC或CDC)篩選得產物。
可依照常見側鏈性質將胺基酸分組：(1)疏水性：正亮胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro； (6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非守恆性取代將必需交換一種該等類別的成員為另一種類別。
取代變異體之一種類型涉及取代親本抗體(例如，人源化或人抗體)之一或多個超變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將具有某些生物學性質之改變(例如，改善)(例如，增強之親和力，減低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物性質。一種示例性取代變異體為親和力成熟抗體，其可簡便地(例如)使用以噬菌體呈現為基礎之親和力成熟技術(諸如，本文所述之其等)產生。簡言之，一或多個HVR殘基發生變異及變異體抗體呈現於噬菌體上及基於特定生物學活性(例如，結合親和力)來進行篩選。
可在HVR中進行變化(例如，取代)(例如)以增強抗體親和力。該等變化可在HVR「熱點(hotspot)」(即，由在體細胞成熟過程中經歷高頻率突變之密碼子編碼之殘基)(參見(例如)Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))、及/或SDR(a-CDR)中進行，且測試所得變異體VH或VL之結合親和力。已(例如)在Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178：1-37中描述藉由構築次級庫及從次級庫再選擇之親和力成熟(O’Brien等人編輯，Human Press，新澤西州托托瓦(2001))。於親和力成熟之一些實施例中，藉由各種方法中之任一種(例如，易錯PCR、鏈改組、或寡核苷酸引導之突變誘發)，將多樣性引入成熟所選擇之可變基因。接著建立次級庫。接著篩選該庫以識別具有所欲親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一種方法涉及HVR-引導方法，其中將若干個HVR殘基(例如，每次4至6個殘基)隨機分組。可例如利用丙胺酸掃描突變誘發或建模特異性地識別抗原結合所涉及之HVR殘基。特定言之，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
於某些實施例中，取代、***、或缺失可在一或多個HVR中發 生，只要該等變化不會實質上降低抗體結合抗原之能力。例如，可在HVR中進行不會實質上減低結合親和力之守恆性變化(例如，如本文提供之守恆性取代)。可在HVR「熱點」或SDR外部進行該等變化。於上文所提供變異體VH及VL序列之某些實施例中，各HVR係未經改變，或包含不大於一處、兩處或三處胺基酸取代。
一種用於識別可成為突變誘發目標之抗體之殘基或區域之適用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham與Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。於此方法中，識別出目標殘基之殘基或基團(例如，帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys、及glu)及改由中性或帶負電荷之胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在證實對初始取代具功能敏感性之胺基酸位置之處引入進一步取代。或者或另外，抗原-抗體複合物之結晶結構以識別抗體與抗原之間之接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基可成為取代之候選之目標或消除作為取代之候選。變異體可經篩選以確定其是否包含所欲性質。
胺基酸序列***包括長度範圍自一個殘基至包含一百或更多個殘基之多肽之胺基-及/或羧基-末端融合、及一個或多個胺基酸殘基之序列內部的***。末端***之實例包括具有N-端甲硫胺醯殘基之抗體。抗體分子之其他***變異體包括與抗體之N-或C-端融合成酶(例如，針對ADEPT)或增加抗體之血清半衰期之多肽。
b)糖基化變異體
於某些實施例中，本文提供之抗體係經改變以增加或降低抗體糖基化之程度。抗體糖基化位點之增加或缺失可簡便地藉由改變胺基酸序列以建立或消除一或多個糖基化位點達成。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變附接至其之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包括一般經N-連接附接至Fc區CH2 域之Asn297的分支鏈雙觸寡糖。參見(例如)Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。該寡糖可包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖、及唾液酸，以及附接至雙觸寡糖結構之「主桿(stem)」中之GlcNAc之岩藻糖。於一些實施例中，可進行本發明抗體中寡糖之修飾以產生具有某些經改良之性質之抗體變異體。
於一個實施例中，提供具有碳水化合物結構之抗體變異體，其缺乏(直接或間接)附接至Fc區之岩藻糖。例如，該抗體中岩藻糖之含量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如(例如)WO 2008/077546中所述，如藉由MALDI-TOF質譜法測得，該岩藻糖含量係藉由計算相對於附接至Asn 297之所有糖基結構(例如，複合、雜合及高甘露糖結構)總和之Asn297處糖鏈中岩藻糖的平均含量來確定。Asn297係指在Fc區中約位置297(Fc區殘基之Eu編號)之處之天冬醯胺酸殘基；然而，Asn297亦可在位置297上游或下游約±3個胺基酸之處，亦即，介於位置294與300之間，此歸因於抗體中微小序列變異。該等岩藻糖基化變異體可具有經改良之ADCC功能。參見(例如)美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。有關於「去岩藻糖基化」或「岩藻糖缺乏」抗體變異體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。可產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包括缺乏蛋白 質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其係實例11)，及基因剔除細胞系，諸如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因，FUT8，基因剔除CHO細胞(參見(例如)Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有平分寡糖之抗體變異體，例如，其中附接至抗體之Fc區之雙觸寡糖被GlcNAc平分。該等抗體變異體可具有經減低之岩藻糖基化及/或經改良之ADCC功能。該等抗體變異體之實例述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利案第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供於附接至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。該等抗體變異體可具有經改良之CDC功能。該等抗體變異體述於例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
因此，本發明進一步關於一種用於修飾由宿主細胞產生之本發明之抗-MCSP抗體之糖基化譜的方法，該方法包括在該宿主細胞中表現編碼本發明抗-MCSP抗體之核酸及編碼具有糖基轉移酶活性之多肽之核酸、或包含該等核酸之載體。具有糖基轉移酶活性之基因包括β(1,4)-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(GnTII)、α-甘露糖苷酶II(ManII)、β(1,4)-半乳糖基轉移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙醯葡糖胺基轉移酶I(GnTI)、及β(1,2)-N-乙醯葡糖胺基轉移酶II(GnTII)。於一個實施例中，在宿主細胞中表現具有糖基轉移酶活性之基因之組合(例如，GnTIII及Man II)。同樣地，該方法亦包括在其中糖基轉移酶基因已被破壞或以其他方式減活化之宿主細胞(例如，其中編碼α1-6核岩藻糖 基轉移酶之基因之活性已被剔除之宿主細胞)中表現一或多個編碼抗-MCSP抗體之多核苷酸。於另一個實施例中，本發明之抗-MCSP抗體可產生於進一步表現編碼具有GnTIII活性之多肽之多核苷酸以改良糖基化圖的宿主細胞中。於一個具體實施例中，具有GnTIII活性之多肽為包含高基體駐留多肽(Golgi resident polypeptide)之高基體定位域的融合多肽。術語高基體定位域係指負責定準多肽位於高基體複合物中之位置之高基體駐留多肽之胺基酸序列。一般而言，定位域包括酶之胺基末端「尾巴」。於另一個較佳實施例中，在表現編碼具有GnTIII活性之多肽的多核苷酸之宿主細胞中本發明抗-MCSP抗體之表現導致具有增強之Fc受體結合親和力及增強之效應功能之抗-MCSP抗體。因此，於一個實施例中，本發明係關於包含以下之宿主細胞：(a)包括編碼具有GnTIII活性之多肽的序列之單離核酸；及(b)編碼本發明抗-MCSP抗體(諸如，結合人MCSP之嵌合、靈長動物化或人源化抗體)之單離多核苷酸。於一個較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽為包含GnTIII之催化域及為甘露糖苷酶II之定位域之高基體定位域的融合多肽。形成該等融合多肽及使用其以產生具有經增強之效應功能之抗體之方法揭示於美國臨時專利申請案第60/495,142號及美國專利申請公開案第2004/0241817號中，其全部內容係以引用方式明確併入本文中。於一特定實施例中，由宿主細胞產生之經修飾之抗-MCSP抗體具有IgG恆定區或其之包含Fc區之片段。於另一特定實施例中，抗-MCSP抗體為人源化抗體或其之包含Fc區之片段。
由本發明宿主細胞所產生經糖基化改變之抗-MCSP抗體通常會因宿主細胞之該修飾(例如，藉由表現糖基轉移酶基因)而展現經增強之Fc受體結合親和力及/或經增強之效應功能。較佳地，經增強之Fc受體結合親和力為經增強之與Fc γ活化受體(諸如Fc γ RIIIa受體)之結合。經增強之效應功能較佳為以下的一或多者之增強：抗體依賴性細 胞毒性之增強，抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之增強，細胞因子分泌之增強，抗原呈現細胞之免疫複合物介導的抗原吸收之增強，Fc介導之細胞毒性之增強，與NK細胞結合之增強，與巨噬細胞結合之增強，與多形核細胞(PMN)結合之增強，與單核細胞結合之增強，靶結合抗體之交聯之增強，誘導細胞凋亡之直接訊號之增強，樹突細胞成熟作用之增強，及T細胞啟始之增強。
於一個態樣中，本發明提供具有相較於未經糖基工程化之抗-MCSP抗體增強之效應功能(包括抗體依賴性細胞毒性)之抗-MCSP抗體(例如，抗體變異體)之糖型。先前已經描述抗體之糖基化工程化。參見(例如)美國專利案第6,602,684號，該案係以其全文引用的方式併入本文中。本文亦詳細地描述從具有糖基化涉及之基因之活性改變的宿主細胞產生抗-MCSP抗體之方法(參見(例如)上一段，標題為「Expression Vectors and Host Cells」)。亦可藉由增強抗體針對於MCSP之親和力，例如，藉由親和力成熟或增強親和力之其他方法，達成本發明抗-MCSP抗體之ADCC之增強(參見Tang等人，J.Immunol.2007,179：2815-2823)。本發明亦包括該等方法之組合。
將非偶聯單株抗體(mAb)用於治療某些類型癌症之臨床試驗最近已產生出鼓舞人的結果。Dillman，Cancer Biother.& Radiopharm.12：223-25(1997)；Deo等人，Immunology Today 18：127(1997)。嵌合、非偶聯IgG1已核准用於低級別或濾泡性B-細胞非霍奇金氏淋巴瘤。Dillman，Cancer Biother.& Radiopharm.12：223-25(1997)，然而，另一種非偶聯mAb(一種靶向實體***腫瘤之人源化IgG1)亦已證實在III期臨床試驗中之有前景的結果。Deo等人，Immunology Today 18：127(1997)。這兩種mAb之抗原在其各自的腫瘤細胞中高度表現及抗體藉由活體外或活體內效應子細胞介導強力腫瘤破壞。相反地，具有細小腫瘤特異性之許多其他非偶聯mAb不能觸發具成為臨床上有用 足夠效力的效應功能。Frost等人，Cancer 80：317-33(1997)；Surfus等人，J.Immunother.19：184-91(1996)。對於某些該等較微弱mAb，目前正測試附加的細胞因子治療。添加細胞因子可藉由增加循環淋巴細胞之活性及數量來刺激抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。Frost等人，Cancer 80：317-33(1997)；Surfus等人，J.Immunother.19：184-91(1996)。在白細胞受體與抗體之恆定區(Fc)結合後會觸發ADCC，一種對靶細胞之裂解攻擊。Deo等人，Immunology Today 18：127(1997)。
一種可增強非偶聯IgG1之ADCC活性的不同卻互補之方法係工程化抗體之Fc區。蛋白質工程化研究已證實Fc γ R與IgG CH2域之較低絞鍵區之相互作用。Lund等人，J.Immunol.157：4963-69(1996)。然而，Fc γ R結合亦需要存在於CH2區中保留之Asn 297之處共價附接之寡糖。Lund等人，J.Immunol.157：4963-69(1996)；Wright與Morrison，Trends Biotech.15：26-31(1997)，提出寡糖及多肽均直接貢獻於相互作用位點，或者需要寡糖以維持活性CH2多肽構形。因此可研究寡糖結構之改變作為增強相互作用之親和力之手段。
IgG分子在其Fc區中帶有兩個N-連接寡糖，每條重鏈上各一個。就任何糖蛋白而言，抗體係經產生為共有相同的多肽主鏈但具有不同的附接至糖基化位點之寡糖之糖型群組。通常於血清IgG之Fc區中發現之寡糖具有複合雙觸類型(Wormald等人，Biochemistry 36：130-38(1997)，其具有低含量之末端唾液酸及平分N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)、及可變程度之末端半乳糖苷化及核岩藻糖基化。一些研究顯示Fc γ R結合所需的最小碳水化合物結構位於寡糖核中。Lund等人，J.Immunol.157：4963-69(1996)。
在工業及學術中用於產生非偶聯治療性mAb之小鼠-或倉鼠-衍生之細胞系通常係將所需寡糖決定子附接至Fc位點。然而，在該等細胞 系中表現之IgG缺乏以低含量於血清IgG中發現之平分GlcNAc。Lifely等人，Glycobiology 318：813-22(1995)。相反地，最近觀察到大鼠骨髓瘤產生之人源化IgG1(CAMPATH-1H)在其一些糖型中帶有平分GlcNAc。Lifely等人，Glycobiology 318：813-22(1995)。大鼠細胞衍生之抗體達成與標準細胞系中產生之CAMPATH-1H抗體類似的最大活體外ADCC活性，但以明顯更低的抗體濃度。
CAMPATH抗原通常以高含量存於淋巴瘤細胞上，及該嵌合mAb在平分GlcNAc不存在下具有高ADCC活性。Lifely等人，Glycobiology 318：813-22(1995)。於N-連接糖基化路徑中，藉由GnTIII添加平分GlcNAc。Schachter，Biochem.Cell Biol.64：163-81(1986)。
先前研究使用事先經工程化以外部調節方式表現不同含量之選殖GnTIII酶基因之產生單一抗體之CHO細胞系(Umaa,P.等人，Nature Biotechnol.17：176-180(1999))。該方法首次確定糖基轉移酶(例如，GnTIII)之表現與經修飾之抗體之ADCC活性間的嚴格關聯性。因此，本發明涵蓋抗-MCSP抗體，其包括因產生抗體之宿主細胞中糖基轉移酶基因之表現水平之改變所致之具有改變之糖基化之Fc區或與Fc區相當之區域。於一個具體實施例中，基因表現水平之改變為GnTIII活性之增強。經增強之GnTIII活性導致抗體Fc區中平分寡糖百分比之增加、以及岩藻糖殘基百分比之降低。該抗體或其片段具有經增強之Fc受體結合親和力及經增強之效應功能。
本發明亦關於一種用於產生本發明之具有修飾寡糖之抗-MCSP抗體的方法，該方法包括(a)培養經工程化以在允許產生根據本發明之抗-MCSP抗體的條件下表現至少一種編碼具有糖基轉移酶活性之多肽之核酸之宿主細胞，其中具有糖基轉移酶活性之該多肽係以足可修飾由該宿主細胞產生之該抗-MCSP抗體之Fc區中的寡糖之量表現；及(b)將該抗-MCSP抗體單離。於一個實施例中，具有糖基轉移酶活性 之多肽為GnTIII。於另一個實施例中，存在兩種具有糖基轉移酶活性之多肽。於一特定實施例中，具有糖基轉移酶活性之這兩種肽為GnTIII及ManII。於另一個實施例中，具有糖基轉移酶活性之多肽為包含GnTIII之催化域之融合多肽。於一個較具體的實施例中，該融合多肽進一步包括高基體駐留多肽之高基體定位域。較佳地，該高基體定位域為甘露糖苷酶II或GnTI之定位域。或者，該高基體定位域係選自由以下組成之群：甘露糖苷酶I之定位域、GnTII之定位域、及α 1-6核岩藻糖基轉移酶之定位域。由本發明方法產生之抗-MCSP抗體具有經增強之Fc受體結合親和力及/或經增強之效應功能。一般而言，經增強之效應功能為以下的一或多者：Fc介導細胞毒性之增強(包括抗體依賴性細胞毒性之增強)，抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之增強，細胞因子分泌之增強，抗原呈現細胞之免疫複合物介導的抗原吸收之增強，與NK細胞結合之增強，與巨噬細胞結合之增強，與單核細胞結合之增強，與多形核細胞結合之增強，誘導細胞凋亡之直接訊號之增強，靶結合抗體之交聯之增強，樹突細胞成熟之增強，或T細胞啟始之增強。經增強之Fc受體結合親和力較佳為經增強之與Fc活化受體(諸如Fc γ RIIIa)之結合。於一尤佳實施例中，ABM為人源化抗體或其片段。
於一個實施例中，抗-MCSP抗體之Fc區中平分N-連接寡糖之百分比為總寡糖之至少約10%至約100%，特定言之至少約50%，更特定言之至少約60%，至少約70%，至少約80%，或至少約90至95%。於又一個實施例中，由本發明方法產生之抗體因藉由本發明方法修飾其寡糖所致具有於Fc區中增強比例的非岩藻糖基化寡糖。於一個實施例中，非岩藻糖基化寡糖之百分比為至少約20%至約100%，特定言之至少約50%，至少約60%至約70%，及更特定言之至少約75%。該等非岩藻糖基化寡糖可屬於雜合或複合類型。於又一個實施例中，由本發 明方法產生之抗體因藉由本發明方法修飾其寡糖所致具有在Fc區中增加比例的平分寡糖。於一個實施例中，平分寡糖之百分比為至少約20%至約100%，特定言之至少約50%，至少約60%至約70%，及更特定言之至少約75%。於一尤佳實施例中，由宿主細胞及本發明方法產生之抗-MCSP抗體具有在Fc區中增強比例的平分、非岩藻糖基化寡糖。該等平分、非岩藻糖基化寡糖可為雜合或複合。明確言之，本發明之方法可用於產生抗體Fc區中至少約10%至約100%，特定言之至少約15%，更特定言之至少約20%至約50%，更特定言之至少約20%至約25%，及更特定言之至少約30%至約35%之寡糖為平分、非岩藻糖基化之抗體。本發明之抗-MCSP抗體亦可包括其中抗-MCSP抗體Fc區中至少約10%至約100%，特定言之至少約15%，更特定言之至少約20%至約25%，及更特定言之至少約30%至約35%之寡糖為平分雜合非岩藻糖基化之Fc區。
於另一個實施例中，本發明係關於一種由本發明方法產生之經工程化以具有經增強之效應功能及/或經增強之Fc受體結合親和力之抗-MCSP抗體。經增強之效應功能可包括(但不限於)以下的一或多者：Fc介導細胞毒性之增強(包括抗體依賴性細胞毒性之增強)，抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之增強，細胞因子分泌之增強，抗原呈現細胞之免疫複合物介導的抗原吸收之增強，與NK細胞結合之增強，與巨噬細胞結合之增強，與單核細胞結合之增強，與多形核細胞結合之增強，誘導細胞凋亡之直接訊號之增強，靶結合抗體之交聯之增強，樹突細胞成熟之增強，或T細胞啟始之增強。於一較佳實施例中，經增強之Fc受體結合親和力為經增強之與Fc活化受體(更佳係Fc γ RIIIa)之結合。於一個實施例中，該抗體為完整抗體。於一個實施例中，該抗體為包含Fc區之抗體片段、或包括與免疫球蛋白Fc區相當之區域之融合蛋白。
本發明進一步提供產生及使用用於產生具有經增強之Fc受體結合親和力(較佳係經增強之與Fc活化受體之結合)、及/或具有經增強之效應功能(包括抗體依賴性細胞毒性)之本發明抗體之糖型之宿主細胞系統的方法。可併與本發明之抗體使用的糖基工程化方法已較詳細地述於美國專利案第6,602,684號、美國專利申請公開案第2004/0241817 A1號、美國專利申請公開案第2003/0175884 A1號、美國臨時專利申請案第60/441,307號及WO 2004/065540，各案之全部內容係以其全文引用的方式併入本文中。本發明之抗體或者可根據揭示於美國專利申請公開案第2003/0157108號(Genentech)、或EP 1 176 195 A1、WO 03/084570、WO 03/085119及美國專利申請公開案第2003/0115614號、第2004/093621號、第2004/110282號、第2004/110704號、第2004/132140號(Kyowa)中之技術進行糖基工程化以具有在Fc區中經減少之岩藻糖殘基。該等文獻各者的內容係以其全文引用的方式併入本文中。本發明之糖基工程化抗體亦可產生於可產生修飾糖蛋白之表現系統，諸如，述於美國專利申請公開案第60/344,169號及WO 03/056914(GlycoFi,Inc.)或WO 2004/057002及WO 2004/024927(Greenovation)中之其等，其中各案之內容係以其全文引用的方式併入本文中。
於另一個態樣中，本發明提供用於產生具有經修飾之糖基化圖之本發明抗體的宿主細胞表現系統。特定言之，本發明提供用於產生具有經提高之治療價值之本發明抗體之糖型的宿主細胞系統。因此，本發明提供經選擇或工程化以表現具有糖基轉移酶活性之多肽的宿主細胞表現系統。於一個具體實施例中，糖基轉移酶活性為GnTIII活性。於一個實施例中，具有GnTIII活性之多肽為包括異種高基體殘基多肽之高基體定位域之融合多肽。明確言之，該等宿主細胞表現系統可經工程化以包括可以操作方式連接至組成性或受調節啟動子系統之 編碼具有GnTIII之多肽之重組核酸分子。
於一個具體實施例中，本發明提供經過工程化以表現至少一種編碼具有GnTIII活性且包含異種高基體駐留多肽之高基體定位域之融合多肽之核酸的宿主細胞。於一個態樣中，該宿主細胞係利用包含至少一個編碼具有GnTIII活性且包含異種高基體駐留多肽之高基體定位域之融合多肽之基因之核酸分子工程化。
一般而言，可使用任何類型之培養細胞系(包括上述細胞系)作為工程化本發明之宿主細胞系之背景。於一較佳實施例中，使用CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、或植物細胞作為產生本發明之工程化宿主細胞之背景細胞系。
設想本發明包括表現具有糖基轉移酶活性(例如，GnTIII活性)之多肽，包括包含如本文定義之異種高基體駐留多肽之高基體定位域之融合多肽之任何工程化宿主細胞。
一或數個編碼具有糖基轉移酶活性(例如，GnTIII活性)之多肽之核酸可在組成性啟動子或者受調節表現系統之控制下進行表現。該等系統為相關技藝所熟知，及包括上文所述之系統。若數個不同的編碼具有糖基轉移酶活性(例如，GnTIII活性)、及包含異種高基體駐留多肽之高基體定位域之融合多肽之核酸係包含於宿主系統中，其中一些該核苷酸可在組成性啟動子之控制下進行表現，而其他核苷酸係在受調節啟動子之控制下進行表現。藉由相關技藝中一般所知的方法確定具有糖基轉移酶活性(例如，GnTIII活性)之融合多肽之表現水平，該等方法包括西方墨點分析法(Western blot analysis)、北方墨點分析法(Northern blot analysis)、報導子基因表現分析或糖基轉移酶活性(例如，GnTIII活性)之測量。或者，可使用結合至GnTIII之生物合成產物 之凝集素，例如，E4-PHA凝集素。或者，可使用一種功能性檢定，其測量由抗體介導之經增強之Fc受體結合或經增強之效應功能，該等抗體藉由經編碼具有糖基轉移酶活性(例如，GnTIII活性)之多肽之核酸工程化之細胞產生。
包含本發明抗體之編碼序列及表現生物活性基因產物之宿主細胞可由至少四種一般方法識別：(a)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(b)存在或不存在「標誌」基因功能；(c)評估轉綠水平，藉由宿主細胞中各自的mRNA轉綠本之表現測得；及(d)偵測基因產物，藉由免疫測定或其生物活性測得。
於該第一方法中，可藉由DNA-DNA或DNA-RNA雜交，使用包括分別與各自的編碼序列同源之核苷酸序列、或其部分或衍生物之探針偵測抗-MCSP抗體之編碼序列及/或具有糖基轉移酶(例如，GnTIII)活性之多肽之編碼序列之存在。
於該第二方法中，可基於存在或不存在特定「標誌」基因功能(例如，胸苷激酶活性、抗生素抗性、甲胺喋呤抗性、轉型表型、桿狀病毒中之包涵體形成等等)來識別及選擇重組表現載體/宿主系統。例如，若本發明抗體之編碼序列或其片段、及/或具有糖基轉移酶(例如，GnTIII)活性之多肽之編碼序列係***於載體之標誌基因序列中，則可藉由不存在標誌基因功能來識別包含各自編碼序列之重組體。或者，標誌基因可在用於控制編碼序列之表現的相同或不同啟動子之控制下配置成與編碼序列串接。回應於誘導或篩選之標誌物之表現指示本發明抗體之編碼序列及/或具有糖基轉移酶(例如，GnTIII)活性之多肽之編碼序列之表現。
於該第三方法中，可藉由雜交檢定來評估本發明抗體之編碼區或其片段、及/或具有糖基轉移酶(例如，GnTIII)活性之多肽之編碼序列之轉綠活性。例如，RNA可經單離及藉由北方墨點法使用與本發明 抗體之編碼序列或其片段、及/或具有糖基轉移酶(例如，GnTIII)活性之多肽之編碼序列或其特定部分同源之探針進行分析。或者，宿主細胞之總核酸可經提取及分析與該等探針之雜交。
於該第四方法中，可以免疫學方式例如藉由西方墨點法、免疫測定法，諸如放射免疫-沉澱之、酶聯免疫測定法等等評估蛋白質產物之表現。然而，表現系統之成功之極限試驗涉及偵測生物活性基因產物。
c)Fc區變異體
於某些實施例中，一或多個胺基酸修飾可引入至提供於本文中之抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如，取代)之人Fc區序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
於某些實施例中，本發明設想具有某些但非全部效應功能之抗體變異體，此使得其為用於其中抗體活體內半衰期具重要性而某些效應功能(諸如補體及ADCC)係非必需或有害之應用之理想候選。可實施活體外及/或活體內細胞毒性試驗以證實CDC及/或ADCC活性之減低/損耗。例如，可實施Fc受體(FcR)結合試驗以確保抗體缺乏FcγR結合(因此極有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初代細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。於造血細胞上之FcR表現概述於Ravetch與Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464頁之表3中。評估受關注分子之ADCC活性之活體外試驗的非限制性實例述於美國專利案第5,500,362號(參見(例如)Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可使用非放射性檢定方法(參 見：例如，ACTITM非放射性細胞毒性分析，基於流式細胞儀(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢定(Promega，Madison，WI))。用於該等檢定之有用效應子細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，受關注分子之ADCC活性可在活體內例如於動物模型(諸如，Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示者)中進行評估。亦可進行C1q結合試驗以證實抗體不能結合C1q及因此缺乏CDC活性。參見：例如，WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC試驗(參見：例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.與M.J.Glennie，Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用相關技藝中已知的方法進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(參見(例如)Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
一種已接受活體外ADCC試驗如下：1)該試驗使用已知可表現由抗體之抗原結合區識別之靶抗原之靶細胞；2)該試驗使用自隨機選擇之健康施體之血液單離的人周邊血液單核細胞(PBMC)作為效應細胞；3)該試驗係依照以下方案進行：i)使用標準密度離心程序單離PBMC及以5×106個細胞/ml將其懸浮於RPMI細胞培養基中；ii)依標準組織培養方法生長該等靶細胞，從具有高於90%活率之指數生長階段收穫，在RPMI細胞培養基中洗滌，利用100微居里之51Cr標記，利用細胞培養基洗滌兩次，及以105個細胞/ml之密度再懸浮於細胞培養基中； iii)取100微升上述最終靶細胞懸浮液轉移至96-孔微量滴定板之各孔；iv)在細胞培養基中將該抗體從4000ng/ml連續稀釋至0.04ng/ml及取50微升所得抗體溶液添加至96-孔微量滴定板中之靶細胞，重複三次進行涵蓋以上全濃度範圍之各種抗體濃度之測試；v)對於最大釋放(MR)對照組，該板中含有經標記靶細胞之3個其他孔改為接收50微升非離子洗滌劑(Nonidet，Sigma，聖路易斯)之2%(V/V)水溶液替代抗體溶液(以上第iv點)；vi)對於自發釋放(SR)對照組，該板中含有經標記靶細胞之3個其他孔改為接收50微升RPMI細胞培養基替代抗體溶液(以上第iv點)；vii)該96孔微量滴定板接著以50×g離心1分鐘及於40℃下培養1小時；viii)取50微升PBMC懸浮液(以上第i點)添加至各孔以達成25：1之效應子：靶細胞比及將該等板置於5% CO2氛圍37℃下之培養箱中持續4小時；ix)收穫各孔之無細胞懸浮液及使用γ計數器量化實驗上釋放之放射性(ER)；x)依照式(ER-MR)/(MR-SR)×100計算各抗體濃度之特異性裂解百分比，其中ER為針對於該抗體濃度之平均放射性量化值(參見以上第ix點)，MR為針對於MR對照組(參見以上第v點)之平均放射性量化值(參見以上第ix點)，及SR為針對於SR對照組(參見以上第vi點)之平均放射性量化值(參見以上第ix點)；4)「經增強之ADCC」係經定義為在以上測試的抗體濃度範圍內所觀測到最大特異性裂解百分比之增加、及/或達成在以上測試的抗體濃度範圍內所觀測到最大特異性裂解百分比一半所需之抗體濃度之減低。ADCC之增強係相對於利用上述試驗測得、藉由相同抗體介導 之ADCC，該相同抗體使用熟習相關技藝者已知的相同標準製造、純化、調配及貯藏方法由相同類型之宿主細胞產生，然不係由經工程化以過度表現GnTIII之宿主細胞產生。
具有減低之效應功能之抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者之取代之其等(美國專利案第6,737,056號)。該等Fc突變體包括具有在胺基酸位置265、269、270、297及327之兩處或更多處之取代之Fc突變體，其包括具有殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利案第7,332,581號)。
描述具有增強或變弱之與FcR之結合之特定抗體變異體。(參見：例如，美國專利案第6,737,056號；WO 2004/056312，及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
於某些實施例中，抗體變異體包括具有一或多個增強ADCC之胺基酸取代(例如，在Fc區位置298、333、及/或334(殘基之EU編號)之處之取代)之Fc區。
於一些實施例中，在Fc區中進行導致C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即，增強或變弱)之改變，例如，如美國專利案第6,194,551號、WO 99/51642、及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
半衰期延長及與新生兒Fc受體(FcRn)(其負責將母體IgG轉移至胎兒)之結合增強之抗體(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))述於US 2005/0014934A1(Hinton等人)中。該等抗體包括其中具有一或多處可增強Fc區與FcRn結合之取代之Fc區。該等Fc變異體包括在Fc區殘基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434之一或多處具有取代(例如，Fc區殘 基434之取代)之其等(美國專利案第7,371,826號)。
關於Fc區變異體之其他實例，亦可參見Duncan & Winter，Nature 322：738-40(1988)；美國專利案第5,648,260號；美國專利案第5,624,821號；及WO 94/29351。
d)半胱胺酸工程化抗體變異體
於某些實施例中，可期望產生其中抗體之一或多個殘基由半胱胺酸殘基取代之半胱胺酸工程化抗體，例如，「thioMAb」。於特定之實施例中，經取代之殘基出現在抗體之可及位點。藉由半胱胺酸取代該等殘基，藉此反應性硫醇基定位於抗體之可及位點之處及可用於使抗體與諸如藥物部分或連接子-藥物部分之其他部分偶聯以建立免疫偶聯物，如本文進一步論述。於某些實施例中，任何一或多個下述殘基可由半胱胺酸取代：輕鏈之V205(卡巴(Kabat)編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如(例如)美國專利案第7,521,541號中所述產生半胱胺酸工程化抗體。
e)抗體衍生物
於某些實施例中，提供於本文中之抗體可經進一步修飾以包含為相關技藝中所熟知且可輕易取得之其他非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、多胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。聚乙二醇丙醛可在加工製造中具有優勢，此歸因於其在水中之穩定性。該聚合物可具有任何分子量，及可為分支鏈或直鏈。附接至抗體之聚合物的數量可改變，及若附接一種以上聚 合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，可基於包括(但不限於)欲增強之抗體特定性質或功能、該抗體衍生物是否將用於在限定條件下之治療中等等考量，來確定用於衍生化之聚合物的數量及/或類型。
於另一個實施例中，提供抗體與可選擇性地藉由暴露於輻射受熱之非蛋白質部分之偶聯物。於一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。該輻射可為任何波長，及包括(但不限於)不損害正常細胞之波長，但該等波長可將非蛋白質部分加熱達到將接近抗體-非蛋白質部分之細胞被殺死之溫度。
B.重組方法及組合物
可使用如(例如)美國專利案第4,816,567號中所述之重組方法及組合物產生抗體。於一個實施例中，提供編碼本文所述抗-MCSP抗體之單離核酸。該核酸編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。於另一個實施例中，提供一或多種包含該核酸之載體(例如，表現載體)。於另一個實施例中，提供包含該核酸之宿主細胞。於一此實施例中，宿主細胞包括以下(例如，已藉由以下轉形)：(1)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸之載體，或(2)包含編碼包括抗體之VL之胺基酸序列之核酸之第一載體及包含編碼包括抗體之VH之胺基酸序列之核酸之第二載體。於一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。於一個實施例中，提供一種產生抗-MCSP抗體之方法，其中該方法包括在適用於表現抗體之條件下培養包含編碼如上所提供抗體之核酸之宿主細胞，及視需要從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
就抗-MCSP抗體之重組產生而言，將編碼抗體之核酸(例如如上所述之核酸)單離並***至一或多個用於宿主細胞之進一步選殖及/或表現之載體中。可使用習知程序(例如，藉由使用可特異性結合編碼抗體之重及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)輕易地單離及測序該核酸。
用於選殖或表現編碼抗體之載體之適宜宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，尤其在不需要糖基化及Fc效應功能之情況下，抗體可於細菌中產生。關於細菌中抗體片段及多肽之表現，請參見(例如)美國專利案第5,648,237號、第5,789,199號、及第5,840,523號。(亦可參見Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press，新澤西州托托瓦，2003)，第245至254頁，闡述抗體片段於大腸桿菌中之表現)。於表現之後，抗體可從細菌細胞漿呈可溶性部分單離及可進一步純化。
除原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為用於編碼抗體之載體之適宜選殖或表現宿主，其包括其糖基化路徑經過「人源化」，導致產生具有部分或全部人糖基化圖之抗體之真菌及酵母菌株。參見Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦可衍生自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已識別可與昆蟲細胞結合使用的許多桿狀病毒菌株，特定言之，用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可使用植物細胞培養物作為宿主。參見：例如，美國專利案第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號、及第6,417,429號(闡述用於在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，適於在懸浮液中生長 之哺乳動物細胞系可係有用的。有用的哺乳動物宿主細胞系之其他實例為藉由SV40轉形之猴腎CV1細胞系(COS-7)；人胚腎細胞系(如(例如)Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))中所述之293或293細胞；乳倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏(sertoli)細胞(如(例如)Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A)；人肺細胞(W138)；人肝細胞(Hep G2)；小鼠***腫瘤細胞(MMT 060562)；如(例如)Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適用於產生抗體之特定哺乳動物宿主細胞系之評審，請參見(例如)Yazaki與Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press，新澤西州托托瓦)，第255至268頁(2003)。
C.檢定
本文提供之抗-MCSP抗體可基於其物理/化學性質及/或生物活性藉由相關技藝中已知的多種檢定來進行識別、篩選、或特徵分析。
1.結合檢定及其他檢定
於一個態樣中，例如藉由已知的方法諸如ELISA、西方墨點法等等，測試本發明之抗體的其抗原結合活性。
於另一個態樣中，競爭性檢定可用於識別與本文所述抗-MCSP抗體競爭以結合至MCSP之抗體。於某些實施例中，此競爭性抗體結合至與本文所述抗-MCSP抗體所結合之相同抗原決定基(例如，線性或構形抗原決定基)。用於圖譜分析抗體所結合之抗原決定基之詳述示例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」，Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press，新澤西州托托瓦)中。
於一示例性競爭性檢定中，在包含結合至MCSP之第一經標記抗體及正測試其與該第一抗體競爭結合至MCSP之能力之第二未經標記抗體之溶液中培養固定MCSP。該第二抗體可存於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體然不含第二未經標記抗體之溶液中培養固定MCSP。於允許第一抗體結合至MCSP之條件下進行培養之後，移去過量的未結合抗體，及測量與固定MCSP相關聯之標記的量。若測試樣本中相對於對照組樣本中與固定MCSP相關聯之標記的量實質上減低，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合至MCSP。參見Harlow與Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory，紐約冷泉港)。
2.活性檢定
於一個態樣中，提供用於識別具有生物活性之其抗-MCSP抗體之檢定。亦提供具有活體內及/或活體外該生物活性之抗體。
於某些實施例中，測試本發明之抗體的生物活性。
D.免疫偶聯物
本發明亦提供包含偶聯至一或多種細胞毒性劑，諸如化療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物、或動物來源之蛋白質毒素、酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素之本文抗-MCSP抗體之免疫偶聯物。
於一個實施例中，免疫偶聯物為其中抗體係偶聯至一或多種藥物之抗體-藥物偶聯物(ADC)，該一或多種藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見美國專利案第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利案EP 0 425 235 B1)；奧瑞司他汀(auristatin)，諸如單甲基奧瑞司他汀(monomethylauristatin)藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利案第5,635,483號及第5,780,588號、及第7,498,298號)；多 拉司他汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利案第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環黴素(anthracycline)，諸如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利案第6,630,579號)；甲胺喋呤；長春地辛(vindesine)；紫衫烷，諸如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫衫醇(paclitaxel)、拉羅他賽(larotaxel)、特西他賽(tesetaxel)、及歐塔他賽(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；及CC1065。
於另一個實施例中，免疫偶聯物包含如本文所述偶聯至酶活性毒素或其片段之抗體，該酶活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合性活性片段、外毒素A鏈(源自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚曲菌素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、香石竹毒(dianthin)蛋白質、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII、及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻風樹毒蛋白(curcin)、巴豆素蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、多花白素毒蛋白(gelonin)、線菌毒素(mitogellin)、局限曲黴素(restrictocin)、酚黴素、新黴素、及單端孢黴烯族毒素(tricothecene)。
於另一個實施例中，免疫偶聯物包含偶聯至放射性原子之如本 文所述抗體以形成放射性偶聯物。多種放射性同位素可獲得用於產生放射性偶聯物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當將放射性偶聯物用於偵測時，放射性偶聯物可包含用於閃爍照相研究之放射性原子(例如tc99m或I123)、或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記(諸如碘-123再次、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵)。
可使用諸如以下之各種雙官能基蛋白質偶聯劑製得抗體及細胞毒性劑之偶聯物：N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能基衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙-活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所述製得蓖麻毒素免疫毒素。碳-14-標記之1-異硫氰酸根基苄基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於放射性核苷酸與抗體之偶聯之示例性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有利於細胞中細胞毒性藥物之釋放之「可裂解連接子」。例如，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利案第5,208,020號)。
本文中免疫偶聯物或ADC明確包括(但不限於)利用包括(但不限於)以下之交聯試劑製得之該等偶聯物：可自市面購得(例如，購自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford,IL.，U.S.A)之BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、 SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、及磺基-SMPB、及SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。
E.用於診斷及偵測之方法及組合物
於某些實施例中，本文提供之任何抗-MCSP抗體適用於偵測生物樣本中MCSP之存在。如本文中所用，術語「偵測」包括定量或定性偵測。
於一個實施例中，提供用於診斷或偵測方法中之抗-MCSP抗體。於另一個態樣中，提供一種偵測生物樣本中MCSP之存在之方法。於某些實施例中，該方法包括在允許抗-MCSP抗體結合至MCSP之條件下使生物樣本與本文所述抗-MCSP抗體接觸，及偵測在抗-MCSP抗體與MCSP之間是否形成複合物。該方法可為活體外或活體內方法。於一個實施例中，抗-MCSP抗體係用於選擇符合利用抗-MCSP抗體之治療之個體，例如，在MCSP為用於選擇患者之生物標誌之情況下。
可使用本發明抗體診斷之示例性病症包括特徵係MCSP之表現之病症，包括細胞增生性病症或血管生成病症。於一個實施例中，該病症為癌症，諸如皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠瘤(包括神經膠質母細胞瘤)、骨癌(諸如骨肉瘤)、及白血病(包括ALL及AML)。
於某些實施例中，提供經標記之抗-MCSP抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光、及放射性標記)、以及例如經由酶反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配體)。示例性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H、及131I、螢光團(諸如稀土螯合物)或螢光素及其衍生物、玫瑰紅及其衍生物、丹磺醯(dansyl)、繖形銅(umbelliferone)、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(美國專利案第4,737,456號)、蟲螢光素、2,3-二氫呔嗪二酮、辣根過氧化物酶 (HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣類氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、及葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶)、與利用過氧化氫以氧化染料前驅物之酶(諸如HRP、乳過氧化酶、或微過氧化酶)偶聯之雜環氧化酶(諸如尿酸酶及磺嘌呤氧化酶)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基、及類似者。
F.醫藥調配物
本文所述抗-MCSP抗體之醫藥調配物係藉由使具有所需純度之該抗體與一或多種可選醫藥上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980))混合呈凍乾調配物或水溶液形式製得。醫藥上可接受之載劑一般於所使用的劑量及濃度下對接受者無毒，及包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄銨；氯化己烷雙胺；氯化苄二甲羥銨；氯化苄乙氧銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、或離胺酸；單醣、二醣、及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬複合物(例如，Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子表面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文之示例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。特定示例 性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。於一個態樣中，將sHASEGP與一或多種諸如軟骨素酶之其他葡糖胺聚糖酶組合。
示例性凍乾抗體調配物述於美國專利案第6,267,958號中。水性抗體調配物包括述於美國專利案第6,171,586號及WO2006/044908中之其等，水性抗體調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文調配物亦可包含多於一種的視所治療特定適應症需要之活性成分，較佳係不彼此不利影響之具有互補活性之其等。該等活性成分適宜地以可有效用於所欲目的之量呈組合形式存在。
活性成分可分別包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製得之微膠囊中，例如，羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，呈膠態藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或粗乳液形式。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
可製得持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括包含抗體之固態疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質係呈成型物件(例如膜、或微膠囊)之形式。
用於活體內投與之調配物一般無菌。可例如藉由通過無菌過濾膜過濾輕易地達成滅菌。
G.治療方法及組合物
本文提供之任何抗-MCSP抗體可用於治療方法中。
於一個態樣中，提供用作藥物之抗-MCSP抗體。於其他態樣中，提供用於治療癌症之抗-MCSP抗體。於某些實施例中，提供用於治療方法中之抗-MCSP抗體。於某些實施例中，本發明提供一種用於治療患有癌症之個體的方法中之抗-MCSP抗體，該方法包括投與該個體有 效量之抗-MCSP抗體。於一此實施例中，該方法進一步包括投與該個體有效量之至少一種例如如下所述之其他治療劑。於其他實施例中，本發明提供用於治療黑素瘤之抗-MCSP抗體。根據任何上述實施例之「個體」較佳為人。
於另一個態樣中，本發明提供一種以抗-MCSP抗體於製造或製備藥物中之用途。於一個實施例中，該藥物係用於治療癌症。於另一個實施例中，該藥物係用於治療癌症之方法中，該方法包括投與患有癌症之個體有效量之該藥物。於一此實施例中，該方法進一步包括投與該個體有效量之至少一種例如如下所述之其他治療劑。根據任何上述實施例之「個體」可為人。
於另一個態樣中，本發明提供一種用於治療癌症之方法。於一個實施例中，該方法包括投與患有該癌症之個體有效量之抗-MCSP抗體。於一此實施例中，該方法進一步包括投與該個體有效量之至少一種如下所述之其他治療劑。根據任何上述實施例之「個體」可為人。
於一個實施例中，上述態樣中之癌症於其構成細胞之表面上表現MCSP。於一個實施例中，上述態樣中之癌症係選自皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠瘤(包括神經膠質母細胞瘤)、骨癌(諸如骨肉瘤)、及白血病(包括ALL及AML)。於一個實施例中，上述態樣中之癌症為黑素瘤。
於另一個態樣中，本發明提供包含提供於本文中之任何抗-MCSP抗體之醫藥調配物，其(例如)用於任何上述治療方法中。於一個實施例中，醫藥調配物包含提供於本文中之任何抗-MCSP抗體及醫藥上可接受之載劑。於另一個實施例中，醫藥調配物包含提供於本文中之任何抗-MCSP抗體及至少一種例如如下所述之其他治療劑。
本發明之抗體可單獨地或以與其他試劑組合方式用於治療中。例如，本發明之抗體可與至少一種其他治療劑共同投與。
以上所述之該等組合療法包括組合投與(其中兩種或更多種治療劑包含於相同或單獨的調配物中)、及分開投與，於此情況中，本發明抗體之投與可在其他治療劑及/或佐劑之投與之前、同時、及/或之後進行。本發明之抗體亦可與放射療法組合使用。
本發明之抗體(及任何其他治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包括非經腸、肺內、及鼻內投與，及若需要，針對局部治療之病竈內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內、或皮下投與。給藥可藉由任何適宜途徑，例如，藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，這部分取決於投藥為短期性還是長期性。本文中涵蓋包括(但不限於)於不同時間點上之單次或多次投與、大量注射投與、及脈動輸注之多種給藥時間表。
本發明之抗體將以與良好醫療實務一致之方式調配、定劑量、及投與。本文中的考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症之病因、藥物之遞送位點、投藥方法、投藥時間表、及醫療實務者熟知之其他因素。該抗體不需要但可視需要與一或多種目前用於預防或治療所述病症之藥劑一起進行調配。該等其他藥劑之有效量取決於存於調配物中之抗體之量、病症或治療之類型、及以上所述之其他因素。此等一般以相同劑量及利用如本文所述之投藥途徑、或本文所述劑量之約1至99%、或以任何劑量及藉由經驗上/臨床上判定為適宜之任何途徑使用。
就預防或治療疾病而言，本發明抗體之適宜劑量(在單獨地或以與一或多種其他額外治療劑組合之方式使用時)將取決於欲治療之疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重度及病程、抗體是否係基於預防或治療目的而投與、接受過的治療、患者的臨床病史及對抗體之反應、及主治醫師的判斷。該抗體適宜以一次性或分一系列治療投與給患者。根據疾病之類型及嚴重度，約1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1 mg/kg至10mg/kg)之抗體可為不論(例如)藉由一或多次分開投與、或藉由連續輸注投與給患者之初始候選劑量。一種典型日劑量可自約1μg/kg至100mg/kg或更大改變，取決於上述因素。對於數天或更長時間期內之重複投與，治療一般將根據病況持續直到疾病症狀之所欲抑制發生。抗體之一種示例性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。因此，可對患者投與約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)之一或多種劑量。該等劑量可間斷地進行投與，例如，每週或每三週(例如，使得患者接受約二至約二十劑、或例如約六劑抗體)。可投與初始較高負載劑量，接著投與一或多次較低劑量。此療法之進步性在於容易藉由習知技術及檢定監測。
應明瞭任何上述調配物或治療方法可改用本發明之免疫偶聯物替代抗-MCSP抗體或除抗-MCSP抗體外可使用本發明之免疫偶聯物來進行。
H.產品之物件
於本發明之另一個態樣中，提供一種包含適用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之物質的產品之物件。該產品之物件包括容器及於該容器上或隨附其之標籤或包裝插頁。適宜之容器包括(例如)瓶、小瓶、針筒、IV溶液袋等等。該等容器可自諸如玻璃或塑料之多種材料形成。該容器裝納單獨或與另一種可有效用於治療、預防及/或診斷病況之組合物組合之組合物及可具有消毒進入口(例如，該容器可為具有可藉由皮下注射針頭刺穿之瓶塞之靜脈內輸注用溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝插頁指示組合物係用於治療特定病況。此外，該產品之物件可包括(a)其中裝納組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體；及(b)其中裝納組合物之第二容器，其中該組合物包含其他細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之該實施例中之產品之物件可進一步包括指示組合 物可用於治療特定病況之包裝插頁。或者或另外，該產品之物件可進一步包括包含諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液之醫藥上可接受之緩衝劑之第二(或第三)容器。該產品之物件可進一步包括自商業及使用者立場期望之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、及針筒。
應明瞭任何上述產品之物件可改為包含本發明之免疫偶聯物替代抗-MCSP抗體或除抗-MCSP抗體外可包含本發明之免疫偶聯物。
實例
下述為本發明方法及組合物之實例。應明瞭可根據提供於上文之一般陳述實施多種其他實施例。
實例1-產生抗-MCSP抗體
免疫接種及融合瘤之產生
每4週利用與偶聯至KLH之人MCSP序列之aa 2177-2221對應之合成肽(SVPE AARTEAGKPE SSTPTGEPGPMASSPEPAVA KGGFLSFLEAN(SEQ ID NO：2))免疫接種(i.p.)Balb/c小鼠4次接著利用表現MCSP之Colo38細胞(Giacomini P，Natali P，Ferrone S J Immunol.1985 Jul；135(1)：696-702)免疫接種兩次。初始的免疫接種在CFA中進行，所有之後的加強係在IFA中。
採集血清測試用血液及使用偶聯至生物素且塗覆至鏈黴親和素ELISA微量滴定板上之MCSP肽aa2177-2221確定半最高血清效價。選擇具有1：50,000之半最高效價之小鼠用於i.v.加強。在融合前第4天使用20μgMCSP肽及Colo38細胞進行i.v.加強。在i.v.加強後三天期間，收獲脾細胞，及將其與Ag8骨髓瘤細胞融合。
篩選及融合瘤表徵
MCSP特異性抗體之篩選始於識別結合塗覆至鏈黴親和素微量滴定板上之MCSP-生物素肽aa 2177-2221(SEQ ID NO：2)之抗體。接著在 無血清培養基(Hyclone ADCF-Mab-Thermo Scientific，目錄號SH30349.02)中使結合固定MCSP肽之陽性純系擴展。
由FACS分析在自然過度表現高水平之人MCSP之Colo38細胞上進行與天然形式之MCSP之結合。使用不表現可偵測水平之MCSP之***癌細胞系PC3作為陰性對照組。為進一步表徵主抗體之特異性，於Colo38細胞上使用確立的市售抗-MCSP抗體(Invitrogen Corp.，目錄號41-2000，純系LHM2)結合嵌合主抗體(表現人Fc)達成二重染色，進行雙重免疫細胞化學分析。如免疫螢光標記所顯示，一種抗體(LC007)強烈地染色Colo38細胞中之表面MCSP，但在PC3細胞上係陰性的。
實例2：嵌合
使用市售套組自表現抗體純系LC007之融合瘤細胞系單離得mRNA及轉化成cDNA。將用於重鏈(SEQ ID NO：39)及輕鏈(SEQ ID NO：38)之cDNA單離物測序及使各片段融合至人IgG1及κ之恆定區。
在HEK-EBNA細胞中利用來自人免疫球蛋白之信號肽表現該等序列，及使用習知蛋白質A及尺寸排除層析(SEC)純化。
由隨後之方法測定結合活性。從具有細胞解離緩衝液之培養瓶分離得靶細胞，計數及檢測活率。將該等細胞再懸浮及調整為1.111×106個(活)細胞/ml含於PBS-0.1% BSA中。取180μl該懸浮液轉移至圓底96-孔板中之各孔(200,000個細胞/孔)，以400g離心4min，然後再懸浮。將20μl含於PBS-0.1% BSA中之抗體稀釋液(10μg/ml至0.002μg/ml)添加至各孔。以400g將該等樣本離心4min，然後再懸浮。添加二次抗體(FITC偶聯之AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人IgG Fcg片段特異性(Jackson Immuno Research Lab # 109-096-098)))及以400g將該樣本離心4min，然後再懸浮。在流式細胞儀(例如，FACS Canto II)中測定螢光。滴定結果顯示於圖1及2中。述於Morgan AC Jr、Galloway DR、Reisfeld RA.Hybridoma.1981；1(1)：27-36中之抗體9.2.27；分別針對輕及重鏈之GenBank寄存編號：GI：20797193及GI：20797189，係使用作為參照(圖2)。使用人黑素瘤細胞系Colo38、A2058、及A375。Giacomini等人，1985(就Colo38而言)。Marquardt H，Todaro GJ.J Biol Chem.1982年5月10日；257(9)：5220-5(就A2058而言)。Geiser M、Schultz D、Le Cardinal A、Voshol H、García-Echeverría C.Cancer Res.1999年2月15日；59(4)：905-10(就A375而言)。
實例3：MCSP抗原上LC007抗體之結合抗原決定基之確定
LC007抗體顯示於黑素瘤細胞上良好結合，但於初始免疫原上僅微弱地結合。因此，進行抗體LC007之抗原決定基圖譜分析以確定抗原上之確切結合位點。為此，產生MCSP抗原之若干種截短型版，各者包含不同數目之人MCSP近膜端重複區(稱為CSPG重複)。Staub E.等人，FEBS Lett.527：114-118(2002)。
結構1包含CSPG重複15(SEQ ID NO：4)，結構2包含CSPG重複14至15(SEQ ID NO：5)，結構3包含CSPG重複13至15(SEQ ID NO：6)，及結構4包含CSPG重複12至15(SEQ ID NO：7)。圖3提供MCSP之包含CSPG重複之結構之示意圖。該等結構包含初始跨膜區及於HEK-EBNA細胞上表現供藉由FACS偵測LC007結合。圖4顯示本實驗之結果。僅包括MCSP重複15及天然跨膜域之結構不顯示任何顯著結合。相對地，包括域14及15之所有結構顯示顯著結合。此指示結合抗原決定基係在重複14中，或僅於存在重複14之情況下再構成及可能亦包括重複15之部分或在CSPG重複及跨膜域之間之非結構化區域。
實例4：與人及食蟹猴(cynomolgus)抗原之交叉反應性之測定
產生包含食蟹猴MCSP蛋白質(一種用於分泌之單肽)之C端部分、及N端FLAG標籤(SEQ ID NO：8)之表現結構以測試對食蟹猴抗原之交 叉反應性。該域稱為D3域，Tillet,F.等人，J.Biol.Chem.272：10769-10776(1997)。針對人同源物形成一類似結構(SEQ ID NO：9)。編碼這兩種結構之表現質體係經電穿孔進入HEK-EBNA細胞中，及利用抗-FLAG抗體證實表現。接著藉由流式細胞儀測試LC007抗體之結合。圖5顯示抗體LC007以與結合至對應人表現結構類似之親和力結合至食蟹猴結構。
實例5：糖基工程化LC007抗體
LC007抗體之糖基工程化變異體係藉由使抗體表現載體與GnT-III糖基轉移酶表現載體一起、或與GnT-III表現載體加上高基體甘露糖苷酶II表現載體一起之共轉染產生。
實例6 糖基工程化LC007抗體之ADCC
ADCC試驗
在37℃於存在不同濃度之糖基工程化LC007抗體及對照組抗體樣本下，於16h培養期間，以1：19之靶：效應子比藉由人淋巴細胞(效應子)裂解Colo38人惡性黑素瘤細胞(靶)，該裂解係經由螢光染料之保留來測定。Kolber等人，1988,J.Immunol.Methods 108：255-264。以螢光染料鈣黃綠素AM(Calcein AM)標記IMR-32細胞持續20min(最終濃度為3.3μM)。利用不同濃度之糖基工程化LC007抗體及對照組抗體樣本培養經標記之細胞(80,000個細胞/孔)1h。接著，添加單核球耗乏之單核細胞(1,500,000個細胞/孔)及於37℃在5% CO2氛圍中培養該細胞混合物16h。棄置上清液及利用HBSS洗滌該等細胞一次及於Triton X-100(0.1%)中裂解。利用螢光計(Perkin Elmer，Luminscence Spectrometer LS 50B(加利福尼亞州福斯特市)測定Colo38細胞中螢光染料之保留，及相對於由改使靶暴露於洗滌劑替代暴露於抗體所得之總體裂解對照組，計算特異性裂解。將不存在抗體情況下之信號設為0%細胞毒性。各抗體濃度以重複三份方式進行分析，且獨立重複該 試驗三次。如圖6所顯示，非糖基工程化LC007抗體(LC007 wt)展現ADCC效應。糖基工程化LC007抗體(LC007 g2)顯示相對非糖基工程化LC007增加之ADCC。因此，非糖基工程化LC007抗體本身顯示部分ADCC活性，該活性可進一步藉由糖基工程化增強。相對地，於該試驗中抗-MCSP抗體MHLG KV9 G2不顯示任何顯著ADCC誘導，該抗-MCSP抗體MHLG KV9 G2為述於Buraggi G等人，Int J Biol Markers.1986年1月至4月；1(1)：47-54)中之抗體225.28S之人源化版。確定225.28抗體之結合抗原決定基在MCSP抗原之N端部分(或遠膜端部分)中。包括結合不存於Colo38細胞上之EGF受體之糖基工程化GA201抗體作為對照組。該抗體無ADCC，顯示必須藉由存於腫瘤細胞上之靶進行NK細胞之活化。
圖7顯示亦針對人U86MG神經膠質母細胞瘤細胞系觀測到糖基工程化LC007抗體之ADCC。
實例7 糖基工程化LC007抗體之人源化
遵循傳統的環移植(loop-grafting)程序進行人源化程序(Jones PT、Dear PH、Foote J、Neuberger MS、Winter G。Nature.1986年5月29日至6月4日；321(6069)：522-5.P.Carter等人；Proc.Natl.Acad.Sci.USA；第89卷，第4285至4289頁，1992年5月)。簡言之，將鼠抗體之CDR(SEQ ID NO.10、11、12、14、15、及16)移植至人架構序列：就輕鏈而言，IMGT寄存編號IGKV1D-39*01及IGKJ1，及就重鏈而言，IMGT寄存編號：IGHV4-31*02及IGHJ4，從而獲得具有包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之輕鏈之抗體。
抗體結構係經最佳化以保留結合至靶MCSP抗原之親和力。圖8顯示不同人源化變異體之結合性質。人殘基Val71及Arg94改由其對應的鼠同源物(分別係精胺酸及天冬胺酸)替代，正如可以確定具有人殘 基之抗體結構展現與抗原結合變弱。如圖8所顯示，重鏈中位置94之處(卡巴編號)具有Arg之結構M4-2 ML1(SEQ ID NO：30(對應於該序列中之D98R))及重鏈中位置74之處(卡巴編號)具有Val之M4-6 ML1(SEQ ID NO：33(對應於該序列中之R72V))顯示與MCSP抗原結合變弱，此指示該等殘基與抗體之結合特異性相關。分別在該等位置中具有對應的鼠同源物(精胺酸及天冬胺酸)之該等結構保留結合活性，例如，其等具有M4-1(SEQ ID NO：29)及M4-3(SEQ ID NO：32)之重鏈結構之抗體。
CDR-H1殘基Asn35改由對應的人生殖細胞系絲胺酸殘基取代。如圖8所顯示，包含該取代之結構M4-7 ML1(SEQ ID NO：25)顯示與靶MCSP抗原結合變弱，此指示該殘基亦涉及保留抗原結合強度。
其他結構指示其他殘基與抗-MCSP抗體之結合性質之相關性。在HVR-L1(SEQ ID NO：21)中位置7之處由精胺酸殘基改為絲胺酸，導致針對於MCSP抗原之結合活性減低。在HVR-L2 SEQ ID NO：21之位置1之處由天冬胺酸酪胺酸改為天冬胺酸及在HVR-L2 SEQ ID NO：21之位置2之處由丙胺酸改為蘇胺酸，亦導致針對於MCSP抗原之結合活性之減低。
實例8 糖基工程化LC007抗體之人源化變異體之ADCC
藉由乳酸脫氫酶，使用Colo38細胞作為靶細胞來測定糖基工程化LC007抗體之人源化變異體之ADCC活性。人周邊血液單核細胞(PBMC)係用作效應子細胞及使用Histopaque-1077(Sigma Diagnostics Inc.，聖路易斯，Mo.63178 USA)基本上遵循製造商使用說明製得。簡言之，利用肝素化針筒自健康志願者採集靜脈血。利用PBS(不含Ca++或Mg++)以1：0.75至1.3稀釋血液及於Histopaque-1077上分層。於室溫(RT)下不間斷地以400×g離心該梯度30min。收集包含PBMC之中間相及利用PBS洗滌(來自兩個梯度之細胞各用50ml)及藉由在RT下以300×g離心10分鐘收穫。於以PBS再懸浮細胞小球之後，計數 PBMC及藉由在RT下以200×g離心10分鐘方式進行第二次洗滌。接著將該等細胞再懸浮於用於後續程序之適宜培養基中。
就PBMC及NK細胞而言用於ADCC試驗之效應子相對靶比分別為25：1及10：1。效應子細胞係以適宜濃度於AIM-V培養基中製得以使圓底96孔板每孔添加50μl。靶細胞為Colo30細胞。於PBS中洗滌靶細胞，計數及以0.3百萬個細胞/ml再懸浮於AIM-V中以每個微孔100μl地添加30,000個細胞。於AIM-V中稀釋抗體，以50μl地添加至經預放置之靶細胞及容許於RT下結合至該等靶歷時10分鐘。接著，添加效應子細胞及於37℃下在包含5% CO2之增濕氛圍中培養該板4小時。藉由使用細胞毒性偵測套組(Roche Diagnostics，瑞士羅特科魯茲)測量自受損細胞之乳酸脫氫酶(LDH)釋放來評估靶細胞之殺死。於4小時的培養之後，以800×g離心該等板。自各孔取100μl上清液轉移至新透明平底96孔板。每孔添加自該套組取得的100μl顯色底物緩衝液。使用SOFTmax PRO軟體(Molecular Devices，加利福尼亞森尼韋爾94089，USA)，在ELISA讀取器中於490nm下測定顯色反應之V最大值至少10min。自僅含靶及效應子細胞而不含抗體之孔測得自發LDH釋放。自僅含靶細胞及1% Triton X-100之孔測得最大釋放。可如下計算得特異性抗體介導殺死之百分比：((x-SR)/(MR-SR)*100，其中x為特異性抗體濃度下之V最大平均值，SR為自發釋放之V最大平均值及MR為最大釋放之V最大平均值。
圖9顯示該試驗之結果及證實人源化變異體保留親本糖基工程化LC007抗體之ADCC活性。
存活靶細胞進一步在洗滌及使用包含0.1% Triton X-100之5mM硼酸鹽緩衝液細胞裂解之後利用如實例6中所述之試驗藉由鈣黃綠素測量(Wallac Victor3 1420多標記計數器)量化。該試驗之結果示於圖10中。
實例9 小鼠異種移植分析
9.1 FcgR3轉基因SCID小鼠中之MV3細胞
於具有12h照明/12h黑暗之日週期之IVC(獨立通風籠(Isolated Ventilated Cages))條件下依照定型指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)放養20隻FcgR3A tg SCID小鼠(購自Charles River，法國里昂)。評審實驗研究方案並由當地政府核准(P 2005086)。在到達之後，將動物放養一週以使其習慣於新環境及進行觀測。定期進行連續健康監測。
於37℃在5% CO2下之水飽和氛圍中慣常地培養MV3腫瘤細胞系(van Muijen GN等人，Int J Cancer.48(1)：85-91(1991))於補充10%胎牛血清(Invitrogen，瑞士)之DMEM培養基(GIBCO，瑞士)中。每三天利用胰蛋白酶/EDTA 1×(GIBCO，瑞士)***進行培養繼代。在注射當天，使用胰蛋白酶-EDTA(Gibco，瑞士)從培養瓶(Greiner Bio-One)收穫腫瘤細胞及轉移於50ml培養基中，洗滌一次然後再懸浮於AIM V(Gibco，瑞士)中。於再次利用AIM V洗滌之後，使用細胞計數器測定細胞濃度。將含於200μl Aim V培養基中之0.2×106個細胞注射至各隻FcgR3A tg SCID小鼠之尾靜脈中。
治療
將異種移植小鼠分配給治療組或媒劑對照組中任一組，各組均由九隻小鼠所組成。治療組經靜脈內投與25mg/kg人源化糖基工程化抗-MCSP mAb M4-3 ML2。媒劑對照組僅經靜脈內投與媒劑。兩個組均在第7、第14、及第21天接受三次給藥。
基於從該治療獲得的數據，利用對數秩(Mantel-Cox)檢驗：p=0.0033及Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗：p=0.0039進行統計分析。
結果
如圖11所顯示，相較於媒劑對照組，於此模型中人源化糖基工程化抗-MCSP抗體明顯增加存活時間。
9.2 FcgR3轉基因SCID小鼠中之MDA-MB-435細胞
最初從ATCC獲得MDA-MB435細胞及於擴展後寄存於Glycart內部細胞庫中。於37℃在5% CO2下之水飽和氛圍中慣常地培養MDA-MB435腫瘤細胞系於補充10%胎牛血清(Invitrogen，瑞士)及1% Glutamax之RPMI培養基(GIBCO，瑞士)中。每三天利用胰蛋白酶/EDTA 1×(GIBCO，瑞士)***進行培養繼代。
於具有12h照明/12h黑暗之日週期之IVC(獨立通風籠)條件下依照定型指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)放養FcgR3A tg SCID小鼠(購自Charles River，法國里昂)。評審實驗研究方案並由當地政府核准(P 2005086)。在到達之後將動物放養一週以使其習慣於新環境及進行觀測。定期進行連續健康監測。
在注射當天，使用胰蛋白酶-EDTA(Gibco，瑞士)從培養瓶(Greiner Bio-One)收穫腫瘤細胞及轉移於50ml培養基中，洗滌一次及再懸浮於AIM V(Gibco，瑞士)中。於再次利用AIM V洗滌之後，使用細胞計數器測定細胞濃度。將在200ul Aim V培養基中之0.2×106個細胞注射至各隻FcgR3A tg SCID小鼠之尾靜脈中。
治療
將異種移植小鼠分配給治療組或媒劑對照組中任一組。治療組經靜脈內投與25mg/kg t嵌合糖基工程化抗-MCSP mAb。媒劑對照組僅經靜脈內投與媒劑。兩個組均在第7、第14、及第21天接受三次給藥。
結果
如圖12所顯示，相較於媒劑對照組，於此模型中嵌合糖基工程化抗-MCSP抗體明顯增加存活時間。
9.3 FcgR3轉基因SCID小鼠中之MDA-MB-435細胞
遵循如實例9.2之相同方案，但其中改用人源化抗體M4-3 ML2(包含SEQ ID NO：32之VH及SEQ ID NO：31之VL)替代其親本、嵌合抗體LC007。這兩種抗體均經過糖基工程化。
結果
如圖13所顯示，相較於媒劑對照組，於此模型中親本、嵌合抗體LC007及其人源化糖基工程化變異體均明顯增加存活時間。
實例10 抗-MCSP抗體M4-3/ML2之親和力成熟
經由寡核苷酸引導之突變程序進行親和力成熟。就此程序而言，選殖重鏈變異體M4-3、及輕鏈變異體ML2進入噬菌體載體中，類似於由Hoogenboom所述之其等(Hoogenboom等人，Nucleic Acids Res.1991,19,4133-4137)。藉由首先經由傳統的同源建模產生該抗體之3D模型且接著識別重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)之溶劑可及性殘基來識別出欲隨機分組之殘基。以基於三核苷酸合成隨機分組之寡核苷酸購自Ella-biotech(德國慕尼黑)。經由傳統的PCR產生出三個獨立子庫，及該等子庫包括在CDR-H1與CDR-H2、或CDR-L1與CDR-L2一起中之隨機分組，CDR-L3係以不同方法隨機分組。該等庫之DNA片段係經由限制消化及接合而選殖進入噬菌體中，及於隨後經電穿孔進入TG1細菌中。
庫選擇
經如此產生之該等抗體變異體自絲狀噬菌體顆粒以單價方式呈現為與封裝於各顆粒中之M13之基因III產物之融合。接著基於其生物活性(此處：結合親和力)來篩選該等噬菌體呈現變異體及將具有經改良之活性之候選者用於進一步的開發。用於製造噬菌體呈現庫之方法可參見Lee等人，J.Mol.Biol.(2004)340,1073-1093)。
所有親和力成熟庫之篩選係以溶液方式依照隨後之程序進行：1.分別使各個親和力成熟庫之~1012個噬菌體顆粒與100nM生物素化hu-MCSP(D3域)-avi-his結合持續0.5h，總體積為1ml，2.藉由添加 5.4×107個經鏈黴親和素塗覆之磁珠捕獲生物素化hu-MCSP(D3域)-avi-his及特異結合之噬菌體顆粒持續10min，3.使用5×至10×1ml PBS/吐溫20(Tween20)及5×至10×1ml PBS洗滌該等珠粒，4.藉由添加1ml 100mM TEA(三乙胺)進行噬菌體顆粒之洗脫持續10min及藉由添加500μl 1M Tris/HCl pH 7.4中和及5.再感染指數生長之大腸桿菌TG1細菌，以輔助噬菌體VCSM13感染及於隨後進行欲用於後續選擇輪回中之噬菌粒顆粒之PEG/NaCl沉澱。使用恆定或漸低(自10-7M至2×10-9M)抗原濃度進行篩選3至5個輪回。在第2輪回中，改用中性鏈親和素板替代鏈黴親和素珠粒進行抗原：噬菌體複合物之捕獲。如隨後藉由ELISA識別特異性結合物：每孔各取100μl 10nM生物素化hu-MCSP(D3域)-avi-his塗覆於中性親和素板上。添加含Fab之細菌上清液及可透過其旗標標籤(Flag-tag)藉由使用抗-旗標/HRP二次抗體偵測結合性Fab。ELISA-陽性純系在96孔格式中經細菌表現為可溶性Fab片段及藉由使用ProteOn XPR36(BioRad)之SPR-分析進行上清液之動力學篩選實驗。識別出具有最高親和力常數之表現Fab之純系及將對應噬菌粒測序。
圖14顯示親和力成熟抗-MCSP純系與未成熟親本純系(M4-3 ML2)間的比對。重鏈隨機分組僅在CDR1及2中進行。輕鏈隨機分組在CDR1及2中進行，而在CDR3中係獨立的。於篩選期間，架構中之少數突變係如純系G3中之F71Y或純系E10中之Y87H般發生。
人IgG1之產生及純化
親和力成熟變異體之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區係在具有預***各別接受者哺乳動物表現載體中之恆定重鏈或恆定輕鏈的架構中進行次選殖。藉由MPSV啟動子驅動抗體表現及於CDS之3’端之處載有合成polyA信號序列。此外，各載體均包含EBV OriP序列。
藉由使用聚乙烯亞胺，利用哺乳動物表現載體共轉染HEK293- EBNA細胞，產生分子。利用對應表現載體以1：1比轉染該等細胞。就轉染而言，將HEK293 EBNA細胞培養於在CD CHO培養基中之無血清懸浮液中。就產生而言，在轉染前24小時，將400百萬個HEK293 EBNA細胞接種於500ml搖瓶中。就轉染而言，以210×g將細胞離心5min，上清液改由預先溫熱的20ml CD CHO培養基置換。使表現載體在20ml CD CHO培養基中進行混合達成200μg DNA之最終量。於添加540μl PEI溶液之後，使渦轉15s及隨後於室溫下培養10min。接著，將細胞與該DNA/PEI溶液混合，轉移至500ml搖瓶及在具有5% CO2氛圍之培養箱中以37℃培養3小時。於該段培養期之後，添加160ml F17培養基及培養細胞24小時。在轉染後一天時，添加1mM丙戊酸及7%進料1。於7天後，收集培養上清液，藉以210×g離心15min達成純化，使該溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)且添加以0.01% w/v最終濃度之疊氮化鈉，並維持在4℃。
自細胞培養上清液藉由使用蛋白質A(ProteinA)之親和層析來純化分泌之蛋白質。將上清液加載於經40ml 20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 7.5)達成平衡之HiTrap蛋白質A HP管柱(CV=5mL，GE Healthcare)上。藉以至少10管柱體積之20mM磷酸鈉、20mM檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 7.5)洗滌移除未結合之蛋白質。靶蛋白質於20管柱體積之從20mM檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 7.5)至20mM檸檬酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 2.5)之梯度期間洗脫。藉由添加1/10 0.5M磷酸鈉(pH 8)中和該蛋白質溶液。將靶蛋白質濃縮及過濾，再加載於經pH 6.0的20mM組胺酸、140mM氯化鈉溶液達成平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。
藉由測定280nm下之光學密度(OD)，利用基於胺基酸序列計算得的莫耳消光係數，來確定純化之蛋白質樣本之蛋白質濃度。藉由CE-SDS分析法於在存在及不存在還原劑下分析分子之純度及分子 量。依照製造商使用說明使用Caliper LabChip GXII系統(Caliper lifescience)。使用2μg樣本進行分析。使用TSKgel G3000 SW XL分析型尺寸排除管柱(Tosoh)在25℃下於25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN3(pH 6.7)操作緩衝液中來分析抗體樣本之聚集物含量。數據示於表2中。
藉由使用Biacore T200之表面電漿共振(SPR)進行親和力測定
於25℃下在Biacore T200上以HBS-EP作為操作緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%表面活性劑P20，Biacore，弗萊堡/德國)，進行表面電漿共振(SPR)實驗以測定親和力成熟IgG之親和力。
IgG係捕獲於具有固定抗人Fab之CM5感測晶片表面上。捕獲IgG係藉由於pH 5.0下使用標準胺偶聯套組(Biacore，弗萊堡/德國)直接固定約10,000個共振單位(RU)以偶聯至感測晶片表面。以10μl/min捕獲在30nM下之IgG 60s。人及食蟹猴MCSP D3於0.49至1000nM之濃度下以30μl/min流速歷時180s通過流動細胞。監測解離達210s。藉由減去於參照流動細胞上獲得的反應校正整體折射率差。此處，抗原係於具有固定抗人Fab抗體但已改為注射HBS-EP替代抗MCSP IgG之表面上方流動。
利用Biacore T200評估軟體(vAA，Biacore AB，烏普薩拉/瑞士)導出動力學常數，以藉由數值積分擬合1：1朗繆爾結合之速率方程式。
證實藉由親和力成熟變異體之對人及食蟹猴MCSP D3之較高親和力，數據示於表3中。
雖然已基於清楚理解之目的略為詳細地以示例及實例方式描述上述發明，但該等陳述及實例不應被理解為限制本發明之範疇。本文引述之所有專利案及科學文獻之揭示內容明確地以其全文引用的方式併入本文中。
<110> 瑞士商羅齊克雷雅公司
<120> 抗-MCSP抗體
<130> 31483
<150> EP 13156675.4
<151> 2013-02-26
<160> 71
<170> PalentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2322
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 1
<210> 2
<211> 45
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 2
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<211> 107
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 3
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<212> PRT
<213> 現代人
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<222> (182)..(203)
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<400> 4
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<213> 現代人
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<221> 域
<222> (289)..(310)
<223> 跨膜域
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<212> PRT
<213> 現代人
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<221> 域
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<223> 跨膜域
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<212> PRT
<213> 現代人
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<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 8
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<213> 現代人
<400> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L1
<400> 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L2
<400> 11
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L3
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<210> 13
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L1
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 14
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> HVR-H3
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<212> PRT
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<220>
<223> HVR-H1
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<211> 107
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<220>
<223> LC007人源化抗體M4-1 VH
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> LC007人源化抗體M4-3 VH
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007人源化抗體M4-6 VH
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007嵌合抗體輕鏈
<400> 34
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<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007嵌合抗體重鏈
<400> 35
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007人源化抗體ML2輕鏈
<400> 36
<210> 37
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007人源化抗體M4-3重鏈
<400> 37
<210> 38
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007鼠抗體輕鏈
<400> 38
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<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007鼠抗體重鏈
<400> 39
<210> 40
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007嵌合抗體輕鏈
<400> 40
<210> 41
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007嵌合抗體重鏈
<400> 41
<210> 42
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007人源化抗體ML2輕鏈
<400> 42
<210> 43
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC007人源化抗體M4-3重鏈
<400> 43
<210> 44
<211> 21
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 44
<210> 45
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3(C1)重鏈
<400> 45
<210> 46
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ML2(G3)輕鏈
<400> 46
<210> 47
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3(C1)VH
<400> 47
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-H1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 49
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-H3
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<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ML2(G3)VL
<400> 51
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L1
<400> 52
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L2
<400> 53
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213>
人工序列
<220>
<223> HVR-L3
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<210> 55
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3(D6)VH
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3(A7)VH
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-H1
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-H2
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<211> 112
<212> PRT
<213>
人工序列
<220>
<223> M4-3(B7)VH
<400> 60
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-H2
<400> 61
<210> 62
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M4-3(B8)VH
<400> 62
<210> 63
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ML2(E10)VL
<400> 63
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L1
<400> 64
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L3
<400> 65
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ML2(E10-G3)VL
<400> 66
<210> 67
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ML2(C5)VL
<400> 67
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L1
<400> 68
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<2120>
<223> HVR-L2
<400> 69
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L3
<400> 70
<210> 71
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ML2(C5-G3)VL
<400> 71

Claims (34)

  1. 一種結合至包含含CSPG重複域之人MCSP的近膜端抗原決定基之單離抗體，其中該抗體係以5×10-9M或更小之Kd結合至MCSP。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體係以2×10-9M或更小之Kd結合至MCSP。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該含CSPG重複域包括CSPG重複14(SEQ ID NO：3)。
  4. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為雙特異性抗體。
  5. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為scFv片段、Fv片段、或F(ab')2片段。
  6. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體為人、人源化、或嵌合抗體。
  7. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含Fc區。
  8. 如請求項7之抗體，其中該抗體為全長IgG類型抗體。
  9. 如請求項7之抗體，其中該抗體經過糖基工程化以修飾該Fc區中之寡糖。
  10. 如請求項9之抗體，其中該Fc區具有相較於非糖基工程化抗體減小數目的岩藻糖殘基。
  11. 如請求項9之抗體，其中該抗體具有相較於非糖基工程化抗體增加之Fc區中之GlcNAc殘基相對岩藻糖殘基比值。
  12. 如請求項9之抗體，其中該Fc區具有相較於非糖基工程化抗體增加比例的平分寡糖。
  13. 如請求項9之抗體，其中該Fc區具有相較於非糖基工程化抗體增加比例的平分寡糖。
  14. 如請求項9之抗體，其中該抗體具有相較於非糖基工程化抗體增加之效應功能。
  15. 如請求項14之抗體，其中該效應功能為增加之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性。
  16. 如請求項14之抗體，其中該效應功能為增加之結合至Fc受體之親和力。
  17. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包括(a)包含選自SEQ ID NO：48及SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含選自SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：59、及SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含選自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：64、及SEQ ID NO：68之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含選自SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：69之胺基酸序列之HVR-L2；(f)包含選自SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：65、及SEQ ID NO：70之胺基酸序列之HVR-L3。
  18. 如請求項17之抗體，其中該抗體包括(a)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列之HVR-H3。
  19. 如請求項17之抗體，其中該抗體包括(a)包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之HVR-L3。
  20. 如請求項1或2之抗體，其包括(a)具有相對SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少95%序列一致性之VH序列；(b)具有相對SEQ ID NO：51之胺基酸序列至少95%序列一致性之VL序列；或(c)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
  21. 如請求項20之抗體，其包括SEQ ID NO：47之VH序列。
  22. 如請求項20之抗體，其包括SEQ ID NO：51之VL序列。
  23. 如請求項20之抗體，其包括SEQ ID NO：47之VH序列及SEQ ID NO：51之VL序列。
  24. 一種編碼如請求項1至23中任一項之抗體之單離核酸。
  25. 一種包含如請求項24之核酸之宿主細胞。
  26. 一種產生抗體之方法，該方法包括培養如請求項25之宿主細胞使得產生該抗體。
  27. 一種包含如請求項1至23中任一項之抗體及細胞毒性劑之免疫偶聯物。
  28. 一種包含如請求項1至23中任一項之抗體或如請求項27之免疫偶聯物及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。
  29. 如請求項1或2之抗體、如請求項27之免疫偶聯物、或如請求項28之醫藥調配物，其用作藥物。
  30. 一種如請求項1至23中任一項之抗體、如請求項27之免疫偶聯物、或如請求項28之醫藥調配物於製造藥物之用途。
  31. 如請求項30之用途，其中該藥物係用於治療癌症。
  32. 如請求項31之用途，其中該癌症為表現MCSP之癌症。
  33. 如請求項32之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：皮膚癌(包括黑素瘤及基底細胞癌)、神經膠瘤(包括神經膠質母細胞瘤)、骨癌(諸如骨肉瘤)、及白血病(包括ALL及AML)。
  34. 如請求項30之用途，其中該藥物係用於誘導細胞裂解。
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