KR102030891B1 - 항-재기드1 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 항-재기드1 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-재기드1 항체 및 사용 방법 {ANTI-JAGGED1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 항-재기드 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
Notch 신호전달 경로는 다양한 세포 기능을 조절한다 (Kopan et al., Cell 137, 216-233 (2009)). 포유동물에서 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함하는 기본적인 구조적 요소를 공유하는 4종의 Notch 수용체, 즉 Notch 1-4가 확인된 바 있다. 유사하게, Notch의 정규 리간드는 특정 구조적 유사성을 공유하지만, Notch의 다수의 비-정규 리간드가 또한 확인된 바 있다 (Kopan et al., Cell 137, 216-233 (2009)). 포유동물에서의 5종의 정규 리간드는 델타-유사 1, 델타-유사 3, 델타-유사 4, 재기드1 및 재기드2이다. Notch 리간드의 Notch 수용체의 세포외 도메인에의 결합은 ADAM (디스인테그린 및 메탈로프로테아제) 패밀리의 알파 세크레타제에 의한 세포외 S2 부위에서의 단백질분해적 절단과 함께 시작되는 신호전달 캐스케이드를 가동시킨다. S2에서의 절단에 이어 세포내 S3 부위에서 감마 세크레타제에 의한 단백질분해적 절단이 이루어지고, 이는 세포내 도메인의 방출, 및 궁극적으로 Hes1 및 Hey와 같은 Notch-의존성 전사 인자를 활성화시키는 하류 사건을 발생시킨다.
이상 Notch 발현 및 신호전달은 암을 비롯한 다수의 질환에 연루되어 왔다 (Koch et al., Cell. Mol. Life Sci. 64, 2746-2762 (2007)). 치료제로서 개발하기 위해 최적인 임상 속성을 갖는 작용제에 대한 필요가 계속 존재함은 분명하다. 본원에 기재된 본 발명은 이러한 필요를 충족시키고, 다른 이익을 제공한다.
본 발명은 항-재기드1 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.
본 발명자들은 예상외로, 항-재기드1 항체 A-1 (도 4 및 PCT 공개 번호 2014/028446 참조)이 열 처리 및/또는 동결-해동 조건 후에 중쇄 내에서 절단된다는 것을 발견하였다. 항체의 불량한 안정성은 치료제로서 그의 가치를 잠재적으로 감소시킨다. 절단 부위의 분석은 어떠한 공지된 프로테아제 절단 모티프도 밝혀내지 못하였다. 따라서, 항체 서열에 대한 변화가 관찰된 절단을 감소시킬 수 있는지 여부는 공지되어 있지 않았다. 또한, 절단 부위가 중쇄 HVR 내이기 때문에, 아미노산 변화(들)가 절단을 감소시키더라도, 재기드1에 대한 항체의 친화도를 유의하게 감소시키지 않으면서 이러한 변화가 이루어질 수 있는지 여부는 공지되어 있지 않았다. 본 발명자들은 놀랍게도, HVR-H3 내의 위치 101에서의 아미노산의 돌연변이가 친화도를 단지 약간만 상실시키면서 절단을 감소시킨다는 것을 밝혀내었다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호(SEQ ID NO): 55 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하며, 여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산인, 인간 재기드1에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 28 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 16 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 5개의 HVR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는 (b) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 또는 (c) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (b) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (c) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 재기드1에 결합하는 단리된 항체는 (a) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (b) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (c) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재기드1에 결합하는 단리된 항체는 서열식별번호: 54, 58 또는 62의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재기드1에 결합하는 단리된 항체는 서열식별번호: 10, 26 또는 34의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 서열 및 서열식별번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (b) 서열식별번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 서열 및 서열식별번호: 10의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VL 서열; 또는 (c) 서열식별번호: 62의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 서열 및 서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 재기드1에 결합하는 단리된 항체는 (a) 서열식별번호: 54 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 VH 서열, 및 서열식별번호: 34의 VL 서열; 또는 (b) 서열식별번호: 58 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 VH 서열, 및 서열식별번호: 10의 VL 서열; 또는 (c) 서열식별번호: 62 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 VH 서열, 및 서열식별번호: 26의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 54의 VH 서열 및 서열식별번호: 34의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 56의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 57의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시양태에서, X는 T일 수 있다.
일부 실시양태에서, (a) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (b) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 또는 (c) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 인간 재기드1에 결합하는 단리된 항체가 제공된다.
일부 실시양태에서, (a) 서열식별번호: 33의 VH 서열 및 서열식별번호: 34의 VL 서열; 또는 (b) 서열식별번호: 65의 VH 서열 및 서열식별번호: 10의 VL 서열; 또는 (c) 서열식별번호: 66의 VH 서열 및 서열식별번호: 26의 VL 서열을 포함하는, 인간 재기드1에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 33의 VH 서열 및 서열식별번호: 34의 VL 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 상기 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 본원에 기재된 임의의 상기 실시양태에서, 항체는 항체 단편일 수 있다.
임의의 상기 실시양태는 전장 IgG1 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 이펙터 기능이 결여된 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 N297G 또는 N297A 돌연변이를 포함하는 IgG1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 N297G 돌연변이를 포함하는 IgG1 항체이다.
일부 실시양태에서, 중쇄가 서열식별번호: 51의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄가 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는, 재기드1에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는 (b) 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는 (c) 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는 (d) 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 항체는 재기드1-매개 신호전달의 길항제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 뮤린, 래트, 및 시노몰구스 원숭이 재기드1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 재기드1에 결합하지만, 재기드2에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 결합하지만, 인간 재기드2에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합하지만, 인간 또는 뮤린 재기드2에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 뮤린, 래트 및 시노몰구스 원숭이 재기드1에 결합하지만, 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 뮤린 재기드2에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 재기드1에 결합하지만, 재기드2 또는 DLL1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 결합하지만, 인간 재기드2 또는 인간 DLL1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합하지만, 인간 또는 뮤린 재기드2 또는 인간 또는 뮤린 DLL1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 뮤린 및 시노몰구스 원숭이 재기드1에 결합하지만, 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 재기드2 또는 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 DLL1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 재기드1에 결합하지만, 재기드2, DLL1 또는 DLL4에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 결합하지만, 인간 재기드2, 인간 DLL1 또는 인간 DLL4에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합하지만, 인간 또는 뮤린 재기드2, 인간 또는 뮤린 DLL1, 또는 인간 또는 뮤린 DLL4에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 뮤린, 래트 및 시노몰구스 원숭이 재기드1에 결합하지만, 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 재기드2, 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 DLL1, 또는 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 DLL4에는 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 2 nM 또는 더 강한 (즉, 2 nM 미만) 친화도 (Kd)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 1.5 nM 또는 더 강한, 또는 1 nM 또는 더 강한, 또는 0.9 nM 또는 더 강한, 0.8 nM 또는 더 강한, 또는 0.7 nM 또는 더 강한 (즉, 1.5 nM 미만, 1 nM 미만, 0.9 nM 미만, 0.8 nM 미만, 또는 0.7 nM 미만) 친화도 (Kd)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 뮤린 재기드1에 2 nM 또는 더 강한 (즉, 2 nM 미만) 친화도 (Kd)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 뮤린 재기드1에 1.5 nM 또는 더 강한, 또는 1 nM 또는 더 강한, 또는 0.9 nM 또는 더 강한, 0.8 nM 또는 더 강한, 0.7 nM 또는 더 강한, 또는 0.6 nM 또는 더 강한, 또는 0.5 nM 또는 더 강한 (즉, 1.5 nM 미만, 1 nM 미만, 0.9 nM 미만, 0.8 nM 미만, 0.7 nM 미만, 0.6 nM 미만, 또는 0.5 nM 미만) 친화도 (Kd)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 친화도 (Kd)는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정된다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 적어도 1.0E+04/Ms, 또는 적어도 1.5E+04/Ms, 또는 적어도 2.0E+04/Ms의 회합 상수 (kon)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 10.0E-04/s 미만, 또는 9.0E-04/s 미만, 또는 8.0E-04/s 미만, 또는 7.0E-04/s 미만의 해리 상수 (koff)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 뮤린 재기드1에 적어도 1.0E+04/Ms, 또는 적어도 1.5E+04/Ms, 또는 적어도 2.0E+04/Ms, 또는 적어도 3.0E+04/Ms, 또는 적어도 4.0E+04/Ms, 또는 적어도 5.0E+04/Ms, 또는 적어도 6.0E+04/Ms, 또는 적어도 7.0E+04/Ms의 회합 상수 (kon)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 뮤린 재기드1에 10.0E-04/s 미만, 또는 9.0E-04/s 미만, 또는 8.0E-04/s 미만, 또는 7.0E-04/s 미만의 해리 상수 (koff)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 회합 및 해리 상수는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정된다.
일부 실시양태에서, 항체는 천연, 폴딩된 재기드1에 결합하지만, 변성 재기드1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에서 재기드1에 결합하지만, 웨스턴 블롯 상의 재기드1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에서 폴딩된 재기드1에 결합하지만, 웨스턴 블롯 상의 변성 재기드1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 생리학적 조건 하에 폴딩된 재기드1에 결합하지만, 변성 재기드1에는 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 항체는 마우스 이종이식편 모델에서 체중 감소를 유발하지 않으면서 종양 성장을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 마우스 이종이식편 모델은 간암 이종이식편 모델이다. 일부 실시양태에서, 종양 성장은 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 또는 적어도 90 AUC/일 TGI%만큼 감소된다.
일부 실시양태에서, 재기드1 항체의 사용은 기도 과민반응의 마우스 모델에서 폐내 배상 세포 화생을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여는 폐내 배상 세포의 수를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%만큼 감소시킨다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 재기드1에의 특이적 결합에 대해 임의의 상기 실시양태와 경쟁하는 단리된 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 33의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 34의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 인간 재기드1에의 결합에 대해 경쟁하는 것이고, 여기서 항체는 항체 A, 항체 A-1, 또는 항체 A-2가 아니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 실시양태의 단리된 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 추가 측면에서, 본 발명은 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 추가 측면에서, 본 발명은 항체가 생산되도록 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 실시양태의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 실시양태의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제를 제공한다.
또 다른 측면에서, 임의의 상기 실시양태의 항체는 의약으로 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 항체는 암을 치료하는데 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 임의의 상기 실시양태의 항체는 암 세포 성장을 감소시키는데 사용하기 위해 제공된다.
또 다른 측면에서, 재기드1-매개 신호전달을 억제하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 시험관내 재기드1-매개 신호전달을 억제하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 생체내 재기드1-매개 신호전달을 억제하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 암에 걸린 개체에게 유효량의 임의의 상기 실시양태의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 암은 유방암, 폐암, 뇌암, 자궁경부암, 결장암, 간암, 담관암, 췌장암, 피부암, B-세포 악성종양 및 T-세포 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명자들은 재기드1-항체를 사용한 치료가 기도 내 세포 운명을 분비 세포 (배상 세포 포함) 운명에서 벗어나서, 섬모 세포 운명으로 편향시킨다는 것을 발견하였다. 재기드1 신호전달은 분비 세포 운명을 유지하는데 중요하고, 재기드1 신호전달의 억제는 배상 세포 화생을 방지하였다. 본 발명자들은 또한 곤봉 세포-에서-섬모 세포로의 전환이 직접적이고, 세포 분열을 수반하지 않음을 밝혀내었다 (데이터는 제시되지 않음). 하나의 세포 유형에서 또 다른 것으로의 이러한 전환분화는 성체 폐에서 발생하였고, 예컨대 손상 후 또는 발생 동안의 전구 세포 분열을 수반하는 세포 운명 선택과 구분된다. 배상 세포 화생 또는 과다 점액은 여러 기도 질환, 예컨대 천식, 낭성 섬유증, COPD 및 바렛 식도의 특징이다. 이들 재기드 억제 결과는 배상 세포 화생의 예방 또는 역전 및 기도 질환 (예를 들어, 천식, COPD, 낭성 섬유증) 및 바렛 식도에서와 같이 과다 점액을 특징으로 하는 상태의 치료를 위한 재기드1 또는 재기드2 억제제의 사용을 수반하는 치료 용도에 대한 근거를 제공한다.
일부 실시양태에서, 인간 재기드1에 결합하는 길항제 항체 (본원에 기재된 임의의 항-재기드1 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 곤봉 세포를 섬모 세포로 전환시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 인간 재기드1에 결합하는 길항제 항체 (본원에 기재된 임의의 항-재기드1 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 곤봉 세포의 섬모 세포로의 전환을 증가시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 곤봉 세포는 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 전환은 곤봉 세포 분열의 부재 하에 발생한다. 일부 실시양태에서, 개체는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 인간 재기드1에 결합하는 길항제 항체 (본원에 기재된 임의의 항-재기드1 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 배상 세포의 수를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 인간 재기드1에 결합하는 길항제 항체 (본원에 기재된 임의의 항-재기드1 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 곤봉 세포의 배상 세포로의 전환을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 배상 세포(들)는 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 개체는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 인간 재기드1에 결합하는 길항제 항체 (본원에 기재된 임의의 항-재기드1 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 배상 세포의 형성을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내 배상 세포의 형성은 감소된다. 일부 실시양태에서, 개체는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 인간 재기드1에 결합하는 길항제 항체 (본원에 기재된 임의의 항-재기드1 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 점액을 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 점액은 기도 점액이다. 일부 실시양태에서, 점액은 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 개체는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 인간 재기드1에 결합하는 길항제 항체 (본원에 기재된 임의의 항-재기드1 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 섬모 세포 수를 증가시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 인간 재기드1에 결합하는 길항제 항체 (본원에 기재된 임의의 항-재기드1 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 섬모 세포의 형성을 증가시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 섬모 세포는 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 개체는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암에 걸린 개체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시양태의 항체를 투여하는 것을 포함하는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 인간 재기드1에 결합하는 항체 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체 포함)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암에 걸린 개체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시양태의 항체를 투여하는 것을 포함하는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 인간 재기드1에 결합하는 항체 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체 포함)가 제공되며, 여기서 인간 재기드1에 결합하는 항체는 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내에서 곤봉 세포의 섬모 세포로의 전환을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암에 걸린 개체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시양태의 항체를 투여하는 것을 포함하는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 인간 재기드1에 결합하는 항체 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체 포함)가 제공되며, 여기서 인간 재기드1에 결합하는 항체는 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내 배상 세포의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암에 걸린 개체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시양태의 항체를 투여하는 것을 포함하는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 인간 재기드1에 결합하는 항체 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체 포함)가 제공되며, 여기서 인간 재기드1에 결합하는 항체는 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내 배상 세포의 형성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암에 걸린 개체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시양태의 항체를 투여하는 것을 포함하는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 인간 재기드1에 결합하는 항체 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체 포함)가 제공되며, 여기서 인간 재기드1에 결합하는 항체는 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내 점액을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암에 걸린 개체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시양태의 항체를 투여하는 것을 포함하는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 인간 재기드1에 결합하는 항체 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체 포함)가 제공되며, 여기서 인간 재기드1에 결합하는 항체는 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내 섬모 세포 수를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 암에 걸린 개체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 실시양태의 항체를 투여하는 것을 포함하는 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 인간 재기드1에 결합하는 항체 (예를 들어, 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체 포함)가 제공되며, 여기서 인간 재기드1에 결합하는 항체는 성인 기도 (예를 들어, 폐) 내 섬모 세포의 형성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 재기드 신호전달의 효능제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, (a) 섬모 세포를 곤봉 세포로 전환시키는 방법 (예를 들어, 여기서 섬모 세포는 성인 기도, 예를 들어 폐에서 발견됨), (b) 점액 (예를 들어, 기도 점액)을 증가시키는 방법, (c) 섬모 세포 수 (예를 들어, 인간 기도 섬모 세포)를 감소시키는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 암에 걸린 개체에게 유효량의 인간 재기드1에 결합하는 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 인간 재기드1에 결합하는 임의의 항체 포함)를 투여하는 것을 포함하는, 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및 과다 점액과 연관된 질환으로부터 선택된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환은 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된다. 일부 실시양태에서, 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증, 및 바렛 식도로부터 선택된다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 재기드1 항체는 마우스 이종이식편 모델에서 체중 감소를 유발하지 않으면서 종양 성장을 감소시킨다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 표지에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 양전자 방출체이다. 일부 실시양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플을 본원에 기재된 항체와, 항체가 자연 발생 인간 재기드1에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 생물학적 샘플에서 항체와 자연 발생 인간 재기드1 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 인간 재기드1을 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 유방암, 폐암, 뇌암, 자궁경부암, 결장암, 간암, 담관암, 췌장암, 피부암, B-세포 악성종양 및 T-세포 악성종양으로부터 선택된다.
도 1은 인간 및 뮤린 재기드1 단백질의 예시적인 아미노산 서열을 보여준다.
도 2는 인간 및 뮤린 재기드2 단백질의 예시적인 아미노산 서열을 보여준다.
도 3a-d는 파지 항체 라이브러리 스크리닝 및 선택에 사용된 펩티드의 아미노산 서열을 보여준다. 모든 단백질을 BEVS 세포 내에서 분비된 단백질로서 발현시켰고, 그의 서열은 N-말단에서 C-말단 방향으로 열거된다. (a) 발현된 단백질 뮤린 재기드1-DSL-EGF1-4 (Q34-D377)의 아미노산 서열. N-말단의 볼드체는 짧은 링커 서열 (ADLGS) (서열식별번호: 82)을 나타낸다. C-말단의 볼드체는 짧은 링커 서열 (EFG), 트롬빈 절단 부위 (LVPRGS) (서열식별번호: 83), G 스페이서 및 6-His 태그를 나타낸다. (b) 발현된 단백질 인간 Jag1-DSL-EGF1-4의 아미노산 서열. 항원은 또한 C-말단에 TEV 프로테아제 절단 부위 및 6-His 태그를 함유하기는 하지만, Jag1 서열만을 나타낸다. (c) 발현된 단백질 뮤린 Jag2-DSL-EGF1-4 (M27-E388)의 아미노산 서열. N-말단의 볼드체는 짧은 링커 서열 (ADLGS) (서열식별번호: 82)을 나타낸다. C-말단의 볼드체는 짧은 링커 서열 (EFG), 트롬빈 절단 부위 (LVPRGS) (서열식별번호: 83), G 스페이서 및 6-His 태그를 나타낸다. (d) 발현된 단백질 인간 Jag2-DSL-EGF1-4 (R2-E388)의 아미노산 서열. C-말단의 볼드체는 짧은 링커 서열 (EFG), 트롬빈 절단 부위 (LVPRGS) (서열식별번호: 83), G 스페이서 및 6-His 태그를 나타낸다.
도 4aa-bb는 항-재기드1 (A, A-1, A-2), 항-재기드2 (B, B-1, B-2, B-3), 및 항-재기드1/2 항체 (C, C-1, D, D-1, D-2, D-3, D-4, D-5)의 중쇄 (도 4aa 및 도 4ab) 및 경쇄 (도 4ba 및 도 4bb) 가변 도메인에 대한 아미노산 서열의 정렬을 보여준다. 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 위치를 표시한다.
도 5a-b는 실시예에 기재된 바와 같은 항-재기드1 항체의 H1, H2, 및 H3 중쇄 초가변 영역 (HVR) 서열을 보여준다. 아미노산 위치는 본원 및 다른 곳에 기재된 바와 같은 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
도 6은 실시예에 기재된 항-재기드1 항체의 L1, L2, 및 L3 경쇄 HVR 서열을 보여준다. 아미노산 위치는 하기 기재된 바와 같은 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
도 7은 실시예에 기재된 항-재기드1 항체의 경쇄 및 중쇄 프레임워크 서열을 보여준다. 위첨자의 숫자는 카바트에 따른 아미노산 위치를 표시한다.
도 8은 스크리닝으로부터 수득된 항체의 결합 특이성을 보여준다. 항체 A의 경우에 인간 Jag1-DSL-EGF1-4 (도 3b)를 사용하여, 및 항체 B의 경우에 뮤린 및 인간 Jag2-DSL-EGF1-4 (도 3c 및 d)를 사용하여 스크리닝하는 동안 확인된, 항체 A 및 B의 결합 특이성을 측정한 ELISA 검정의 결과. 흑색 칼럼 = 인간 재기드1에 대한 결합; 회색 칼럼 = 인간 재기드2에 대한 결합. C-1은 재기드1 및 재기드2 둘 다에 결합하는 항체이다.
도 9a-b는 친화도 성숙 항-재기드 항체에 의한 Notch 신호전달의 억제를 보여준다. 공동-배양 검정을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 표시된 농도의 파지 항체를 x-축에 표시한다. 표시된 농도의 DAPT를 Notch 신호전달의 억제에 대한 양성 대조군으로서 제공하고; DMSO를 비히클 대조군으로서 제공하였다. 신호전달은 재기드1 (진회색 칼럼) 또는 재기드2 (담회색 칼럼)에 의해 유도되었다. 비처리 = 리간드로 자극되지 않고 항체로 처리되지 않은 배양물; 무 자극 = 리간드로 자극되지 않은 배양물; agD = 이소형 대조군 항체; Stim/무 AB = 리간드로 자극되었지만 항체로 처리되지 않은 배양물; 감마-세크레타제 억제제 DAPT 또는 DMSO의 DAPT 비히클 대조군.
도 10a-b는 재기드1 및 재기드2의 조합 억제가 신속한 체중 감소를 유발함을 보여준다. (a) 마우스에게 항-재기드1/2 항체 C-1 (항-J1/2; 5-10 mpk), 항-재기드1 항체 A-2 (항-J1; 5-20mpk), 항-재기드2 항체 B-3 (항-J2; 5-20mpk), 항체 A-2 및 B-3을 함께 (항-J1 & -2; 각각 5mpk) 또는 이소형 대조군 항체 (20mpk)를 1주에 2회 투여하였다. 각각의 투여의 총 항체 농도는, 필요한 경우에, 이소형 대조군 항체를 사용하여 20mpk로 만들었다. 평균 체중 변화 (y-축)를 시간의 경과에 따른 (x-축) 시작 체중의 백분율로서 그래프화하였다. (b) Balb/c 마우스 (군당 10마리, 개별 수용됨)에게 30 mpk의 항-gD 이소형 대조군 항체 또는 15 mpk 항체 A-2 플러스 15 mpk 항체 B-3의 조합으로 8일 동안 1주에 2회 IP 주사하였다. 전달되는 음식물 및 각 케이지에 남아있는 것을 매일 칭량하여 음식물 섭취를 평가하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다 (n = 10).
도 11aa-bb는 생체내 항-재기드1 길항제 항체에 의한 인간 폐암 세포 성장의 억제를 보여준다. 인간 폐암 이종이식편을 보유하는 마우스에게 20mpk 항-gD 이소형 대조군 항체 (이소형 대조군 Ab) 또는 항-재기드1 항체 A-2 (항-Jag1)를 복강내로 (IP) 1주에 2회 주사하였고, 주사는 평균 종양 부피 (캘리퍼로 측정됨)가 대략 180 mm3에 도달한 후에 시작하였다. 이어서 19일 동안 종양 부피 (y-축)를 측정하였다. 도 11aa 및 도 11ab: 선형 혼합 효과 모델을 사용하여 각각의 군 (n=10)에 대한 평균 종양 부피를 시간의 경과 (x-축)에 따라 플롯팅하였다 (도 11aa). 각각의 군 내 각각의 마우스에 대한 종양 부피를 도 11ab에서 2개의 패널로 도시한다. 도 11ba 및 도 11bb: 각각의 마우스의 총 체중을 측정하고, 각각의 군에 대해 (도 11ba) 또는 각각의 군 내 각각의 마우스에 대해 (도 11bb) 평균화된 백분율 변화로서 그래프화하였다.
도 12a-b는 생체내 항-재기드1 및 항-재기드2 길항제 항체에 의한 인간 유방암 세포 성장의 억제를 보여준다. 인간 유방암 이종이식편을 갖는 C.B-17 SCID.bg 마우스에게 제0일, 제4일, 제7일, 제12일, 제15일, 제18일, 제22일, 제25일, 제29일, 제32일, 제36일, 제43일, 제50일, 및 제57일에 항-gD 이소형 대조군 항체 (항-gD), 항-돼지풀 이소형 대조군 항체 (항-돼지풀), 인간 IgG1 백본의 항-재기드1 항체 A-2 (항-Jag1 A-2 (hIgG1)), 뮤린 IgG2a 백본의 항-재기드1 항체 A-2 (항-Jag1 A-2 (mIgG2a)), 또는 인간 IgG1 백본의 항-재기드2 항체 B-3 (항-Jag2 B-3 (hIgG1))을 주사하였다. 처리군 (a) 또는 개별 동물 (b)의 종양 부피 (y-축)를 선형 혼합 효과 모델을 사용하여 시간의 경과 (x-축)에 따라 플롯팅하였다.
도 13A-C는 중쇄 내에서의 항-재기드1 항체의 절단을 보여준다. (A) 항체 A, A-1 및 A-2를 표준 SDS-PAGE 및 단백질 염색 방법에 의해 표시된 바와 같이 환원제 DTT의 부재 (-) 또는 존재 (+) 하에 분석하였다. 분자 질량 표준물 (kD 단위)이 또한 제시된다. 패널 (B)는 A-1의 질량 분광측정 (MS) 분석 (LC-MS/TOF, 환원 조건)의 대표적인 스캔을 나타낸다. 관련 단편의 위치 (피크)에 주석을 달고, 분자 질량을 피크 위에 나타낸다. 이러한 분석은 패널 (C)의 HC 아미노산 서열에서 절단 위치를 화살표로 표시하여 도식화된 바와 같이, 절단 부위가 CDR3 내의 HC 아미노산 G100과 S101 사이임을 보여주었다.
도 14A-C는 항-재기드1 항체 중쇄 절단 부위의 N-말단 펩티드 서열분석을 보여준다. 환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 대한 표준 방법 및 단백질 염색에 따라, 표시된 항체 제제의 전장 및 절단된 단편을 분리하고 확인하였다 (A). C-말단 (B) 및 N-말단 (C) 절단된 펩티드 단편을 겔에서 잘라내고, 펩티드 N-말단 서열분석을 위한 표준 방법을 사용하여 서열분석하여 절단 부위를 정확하게 확인하였다. 패널 (B) 및 (C)에서 적색 폰트로 강조표시된 서열은 서열분석된 각각의 펩티드의 N-말단 서열을 나타내고, 패널 (B)의 서열은 절단 부위를 표시하고 패널 (C)의 서열은 HC의 N-말단을 표시한다.
도 15는 중쇄 절단에 대한 항-재기드1 항체의 중쇄 S101에서의 아미노산 변화의 효과를 보여준다.
도 16a-b는 (a) 70℃에서 인큐베이션된 항-재기드1 항체의 절단의 SDS-PAGE 분석; 및 (b) 70℃ 및 95℃에서의 각각의 항체 제제에 대해 관찰된 퍼센트 중쇄 절단의 요약을 보여준다.
도 17a-b는 (a) 다양한 수의 동결-해동 주기 후의 항-재기드1 항체 A-1의 절단의 SDS-PAGE 분석, 및 (b) 각각의 조건 하에 관찰된 퍼센트 중쇄 절단을 보여준다.
도 18a-c는 (a) 다양한 농도에서의 항-재기드1 항체 A-1 (좌측 바) 및 A-1(S101T) (우측 바)에 의한 재기드1-유도된 활성화의 억제를 보여준다. 패널 (b) 및 (c)는 실시예 10에 기재된 바와 같이 (a)의 데이터를 계산하는데 사용된 평균 반딧불이 루시페라제 값 및 평균 레닐라 루시페라제 값을 각각 보여준다.
도 19는 실시예 11에 기재된 바와 같이 항-재기드2 항체가 항-재기드1 항체 A-1 또는 A-1(S101T) 또는 이소형 대조군과 조합되어 투여된 마우스의 세기관지 상피 내 섬모 세포 (알파-튜불린의 면역형광 검출에 의해 적색으로 표시된 바와 같음) 및 곤봉 세포 (CC10의 면역형광 검출에 의해 녹색으로 표시된 바와 같음)의 면역형광 염색을 보여준다.
도 20A-B는 (A) 항-재기드1 항체 A-1 또는 A-1(S101T)로 처리된 간암 이종이식편 모델 마우스에서의 종양 부피의 LME (선형 혼합 효과) 그래프, 및 (B) (A)에 제시된 처리군 및 용량, 연구의 최종일 (제44일)에서의 종양 부피, AUC/일 %TGI (대조군 대비 일 백분율 종양 성장 억제 (TGI)당 곡선하 면적, 여기서 하한 및 상한은 각각의 군 내 개별 동물에 대한 최저 및 최고 %TGI 값을 각각 지칭함), 일 단위의 종양 배가 시간 (TTP 2X), 및 실험 동안 부분 반응 (PR)을 나타내는 마우스의 수를 보여준다.
도 21A-B는 (A) 도 20에 제시된 마우스에 대한 시간의 경과에 따른 마우스 체중의 LME (선형 혼합 효과) 그래프, 및 (B) (A)에 제시된 처리군 및 용량, 연구의 최종일에서의 체중의 % 변화 (% BW 최종일), 체중의 최대 % 변화 (최대 %BW), 및 체중의 최대 변화가 발생한 날 (최대 %BW 일), 및 (AUC/일 (하한,상한))을 보여준다.
도 22A-B는 항-재기드1 항체 A-1(S101T)의 (a) 중쇄 및 (b) 경쇄 가변 도메인에 대한 아미노산 서열을 보여준다. 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 위치가 표시된다.
도 23a-c는 (a) 대조군, 항-재기드1, 항-재기드2 또는 항-재기드1 + 항-재기드2 조합 처리된 마우스에서의 폐 기도의 과아이오딘산-쉬프 염색, (b) 상이한 처리군의 기도에서의 배상 세포의 수의 정량화, 및 (c) H&E 염색에 의해 평가된 바와 같은 염증 인덱스를 보여준다.
도 24는 (좌) 항-재기드1 항체 A-2 및 (우) 항-재기드1/2 항체 C-1의 인간 재기드1, 뮤린 재기드1, 인간 재기드2, 뮤린 재기드2, 인간 DLL1, 뮤린 DLL1, 인간 DLL4 및 뮤린 DLL4에 대한 결합을 보여준다.
도 25는 마우스에서의 항체의 3종의 상이한 용량의 단일 정맥내 투여 후 항-재기드1 A-1-S101T 항체의 클리어런스를 보여준다.
I. 정의
본원의 목적상 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같은, 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도의 측정을 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시양태가 하기 기재된다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도에서의 개선을 생성하는 변경을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 1개 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 1개 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-재기드 항체" 및 "재기드에 결합하는 항체"는 재기드를 표적화하는데 있어서 항체가 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 재기드1, 재기드2, 또는 재기드1 및 2 (재기드1/2)에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 비관련 비-재기드 단백질에 대한 항-재기드 항체의 결합의 정도는, 예를 들어 방사선면역검정 (RIA)에 의한 측정 시 재기드에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 재기드에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-재기드 항체는 상이한 종으로부터의 재기드 사이에 보존된 재기드의 에피토프에 결합한다. 용어 "항-재기드1 항체" 및 "재기드1에 결합하는 항체"는 재기드1을 표적화하는데 있어서 항체가 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 재기드1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
본원에 사용된 "천식"은 가변성 및 재발성 증상, 가역성 기류 폐쇄 (예를 들어, 기관지확장제에 의함) 및 기저 염증과 연관될 수 있거나 연관되지 않을 수 있는 기관지 과민반응을 특징으로 하는 복합 장애를 지칭한다. 천식의 예는 아스피린 감수성/악화된 천식, 아토피성 천식, 중증 천식, 경도 천식, 중등도 내지 중증 천식, 코르티코스테로이드 나이브 천식, 만성 천식, 코르티코스테로이드 저항성 천식, 코르티코스테로이드 불응성 천식, 새로이 진단된 비치료 천식, 흡연으로 인한 천식, 코르티코스테로이드 비제어 천식, 및 문헌 [J Allergy Clin Immunol (2010) 126(5):926-938]에서 언급된 바와 같은 다른 천식을 포함한다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그가 결합하는 항원의 생물학적 활성을 유의하게 (부분적으로 또는 완전히) 억제하는 것이다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면에, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉘어질 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 본원에 개시되어 있는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에서 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은, EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 구체적으로 제외된다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택 시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 그것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 그것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변적 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고/거나 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR: VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 본원의 예시적인 HVR은:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))에서 발생한 초가변 루프;
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))에서 발생한 CDR;
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))에서 발생한 항원 접촉; 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)를 포함하는 (a), (b), 및/또는 (c)의 조합
을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 본원에서 넘버링된다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-재기드 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 1개 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포 내 1개 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 상기 집단을 구성하는 개개의 항체는, 일반적으로 소량으로 존재하는 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고, 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH)에 이어서 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VL)에 이어서 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중 1가지로 할당될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보가 담긴, 이러한 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 지침을 지칭하는 것으로 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우에 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환은 서열 동일성 부분으로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야 기술 내의 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 통상의 기술자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로부터 공개적으로 입수가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 시스템에서의 사용을 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우에, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B 대비 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B 대비 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)은 하기와 같이 계산되며:
X/Y 분율 x 100
여기서 X는 A 및 B의 프로그램 정렬 시 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 인식할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 직전 단락에 기재된 바와 같이 수득한다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "재기드" 또는 "Jag"는 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 재기드를 지칭한다. 상기 용어는 "전장" 비프로세싱 재기드 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 재기드를 포괄한다. 상기 용어는 또한 재기드의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 예시적인 인간 및 뮤린 재기드1 및 재기드2의 아미노산 서열이 각각 도 1 및 2 (서열식별번호: 1-4)에 제시된다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키기 위한 시도로의 임상 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발을 방지하는 것, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이를 방지하는 것, 질환 진행의 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 발달을 지연시키는데 또는 질환 진행을 느리게 하는데 사용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는, 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
한 측면에서, 본 발명은 부분적으로 항-재기드 항체 및 그의 단편의 확인을 기초로 한다. 특정 실시양태에서, 적어도 1종의 재기드에 결합하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 암의 진단 또는 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 항-재기드 항체와 관련된 방법, 조성물, 키트 및 제조 물품을 제공한다.
A. 예시적인 항-재기드1 항체
한 측면에서, 본 발명은 재기드1에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 항체는 재기드1-매개 신호전달의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 뮤린, 및 시노몰구스 원숭이 재기드1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 재기드1에 결합하지만, 재기드2에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 결합하고, 인간 재기드2에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합하지만, 인간 또는 뮤린 재기드2에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 뮤린, 및 시노몰구스 원숭이 재기드1에 결합하지만, 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 뮤린 재기드2에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 재기드1에 결합하지만, 재기드2 또는 DLL1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 결합하지만, 인간 재기드2 또는 인간 DLL1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합하지만, 인간 또는 뮤린 재기드2 또는 인간 또는 뮤린 DLL1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 뮤린 및 시노몰구스 원숭이 재기드1에 결합하지만, 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 재기드2 또는 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 DLL1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 재기드1에 결합하지만, 재기드2, DLL1 또는 DLL4에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 결합하지만, 인간 재기드2, 인간 DLL1 또는 인간 DLL4에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합하지만, 인간 또는 뮤린 재기드2, 인간 또는 뮤린 DLL1, 또는 인간 또는 뮤린 DLL4에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간, 뮤린, 및 시노몰구스 원숭이 재기드1에 결합하지만, 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 재기드2, 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 DLL1, 또는 인간, 뮤린 또는 시노몰구스 원숭이 DLL4에는 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 2 nM 또는 더 강한 (즉, 2 nM 미만) 친화도 (Kd)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 재기드1에 1.5 nM 또는 더 강한, 또는 1 nM 또는 더 강한, 또는 0.9 nM 또는 더 강한, 0.8 nM 또는 더 강한, 또는 0.7 nM 또는 더 강한 (즉, 1.5 nM 미만, 1 nM 미만, 0.9 nM 미만, 0.8 nM 미만, 또는 0.7 nM 미만) 친화도 (Kd)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 뮤린 재기드1에 2 nM 또는 더 강한 (즉, 2 nM 미만) 친화도 (Kd)로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 뮤린 재기드1에 1.5 nM 또는 더 강한, 또는 1 nM 또는 더 강한, 또는 0.9 nM 또는 더 강한, 0.8 nM 또는 더 강한, 0.7 nM 또는 더 강한, 또는 0.6 nM 또는 더 강한, 또는 0.5 nM 또는 더 강한 (즉, 1.5 nM 미만, 1 nM 미만, 0.9 nM 미만, 0.8 nM 미만, 0.7 nM 미만, 0.6 nM 미만, 또는 0.5 nM 미만) 친화도 (Kd)로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체는 천연, 폴딩된 재기드1에 결합하지만, 변성 재기드1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에서 재기드1에 결합하지만, 웨스턴 블롯 상의 재기드1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에서 폴딩된 재기드1에 결합하지만, 웨스턴 블롯 상의 변성 재기드1에는 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 생리학적 조건 하에 폴딩된 재기드1에 결합하지만, 변성 재기드1에는 결합하지 않는다. "천연, 폴딩된" 재기드1은 생리학적 조건 하에 단백질 폴딩을 거치고, 폴딩된 상태로 유지되는 재기드1을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 재기드1은 용액 중에서 폴딩된 상태로 유지된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 28 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 16 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-재기드1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 55 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-재기드1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-재기드1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-재기드1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 T이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-재기드1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-재기드1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-재기드1 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 28 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열식별번호: 16 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열식별번호: 16 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열식별번호: 28 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 28 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 T이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 55 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 55 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 55 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 55 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 55 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 T이다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 T이다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 T이다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열식별번호: 16 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열식별번호: 16 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 28 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 55 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 28 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 55 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 37로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 64로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 64로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 적어도 2, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 37로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 64로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열식별번호: 64로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 (a) (i) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열식별번호: 71 (여기서 X1은 P 및 G로부터 선택되고, X2는 D 및 N으로부터 선택되고, X3은 T 및 S로부터 선택됨)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2 및 (iii) 서열식별번호: 72 (여기서 X1은 S 이외의 임의의 아미노산이고, X2는 W 또는 L임)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 74 (여기서 X1은 S 또는 Y이고, X2는 P 또는 A이고, X3은 P 또는 T임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 72에서 X1은 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 72에서 X1은 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 72에서 X1은 T이다.
한 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 FR1; 서열식별번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열식별번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열식별번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 FR4로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 FR을 포함하는 VH를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 서열식별번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 FR1; 서열식별번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 FR2; 서열식별번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 FR3; 및 서열식별번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 FR4로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 또는 4개의 FR을 포함하는 VL을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 54, 58, 또는 62 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, VH 서열은 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 55 또는 59 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열식별번호: 37 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 T이다. 또 다른 측면에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 33, 65, 또는 66의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, VH 서열은 서열식별번호: 37 또는 64의 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 28 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열식별번호: 37 또는 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열 대비 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-재기드1 항체는 적어도 1종의 재기드1에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 특정 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 33의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, VH 서열은 서열식별번호: 37의 HVR-H3을 포함한다. 일부 실시양태에서, VH는 (a) 서열식별번호: 35 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 33, 65, 또는 66의 VH 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 33의 VH 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 65의 VH 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 66의 VH 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열식별번호: 10, 26, 또는 34의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-재기드1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열 대비 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그러한 서열을 포함하는 항-재기드1 항체는 재기드1에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시양태에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열식별번호: 10, 26, 또는 34에서 치환, 삽입 및/또는 결실된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 밖의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 일부 실시양태에서, VL은 (a) 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열식별번호: 16 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 10, 26, 또는 34의 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 34의 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 10의 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 26의 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-재기드1 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열식별번호: 54 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임); 및 서열식별번호: 34의 VH 및 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열식별번호: 58 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임); 및 서열식별번호: 10의 VH 및 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열식별번호: 62 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임); 및 서열식별번호: 26의 VH 및 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 T이다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-재기드1 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열식별번호: 33 및 서열식별번호: 34의 VH 및 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열식별번호: 65 및 서열식별번호: 10의 VH 및 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 26의 VH 및 VL 서열 (그러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 57 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 53의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 67 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 75의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 68 (여기서 X는 S 이외의 임의의 아미노산임)의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 76의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, X는 S 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 S 또는 H 이외의 임의의 아미노산이다. 일부 실시양태에서, X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 T이다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 51의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 53의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 52의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 53의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 69의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 75의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 서열식별번호: 70의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 76의 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-재기드1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열식별번호: 33의 VH 서열 및 서열식별번호: 34의 VL 서열을 포함하는 항-재기드1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 임의의 항체와 결합에 대해 경쟁하는 항체를 제공한다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-재기드1 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 인간 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-재기드1 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특색을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 한 실시양태에서, RIA는 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단한다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈-20®)으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조된 경우에, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁적 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 비아코어® 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 예를 들어, 비아코어®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)를 사용하는 검정은 ~10 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 수행된다. 한 실시양태에서, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주입한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합 및 해리 센소그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M- 1 s-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 설비 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코™ 분광광도계 (써모스펙트로닉)에서 측정되는 바와 같은, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS, pH 7.2 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하는 것에 의해 결정될 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해서는, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 교체된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유하면서 인간에 대한 면역원성이 감소되도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; 문헌 [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 그라프팅 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("재표면화" 기재); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법 기재)]에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은, "최적-피트" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 챌린지에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하는 것에 의해 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술을 기재하는 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; 휴맙(HuMab)® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 5,770,429; K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 7,041,870, 및 벨로시마우스(VelociMouse)® 기술을 기재하는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시키는 것에 의해 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하는 것에 의해 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 하기 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 목적 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 목적하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 비재배열 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도의 가변 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공개는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 재기드1에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 재기드1의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 세포독성제를 재기드1을 발현하는 세포에 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하는 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다중-특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기적 스티어링 효과를 조작하는 것 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생성하기 위해 류신 지퍼를 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조하는 것에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 비롯하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 재기드1 뿐만 아니라 또 다른, 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하는 것에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있고, 단 최종 구축물은 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 표 1에서 "바람직한 치환"의 표제 하에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 표 1에서 "예시적인 치환"의 표제 하에 제공되고, 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기에 추가로 기재된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입될 수 있고, 산물은 목적 활성, 예를 들어 보유/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
<표 1>
Figure 112016087173816-pct00001
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 항원에 접촉하는 잔기에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL는 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터 구축 및 재선택하는 것에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리를 스크리닝하여 목적 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 수반하며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 HVR 내의 항원 접촉 잔기의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)이 확인되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 항체와 항원의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성이 입증된 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조가 사용된다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 목적하는 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접적 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의한 측정 시, Asn297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조물)의 합계에 관하여 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산하는 것에 의해 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 부차적 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 및 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. 일부 실시양태에서, N297G 또는 N297A 돌연변이를 포함하는 IgG1 불변 영역은 이펙터 기능이 실질적으로 결여된다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 공개 문헌의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11에서), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되며, 예를 들어 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어, 그에 의해 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 1개 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 적용에 대해 바람직한 후보가 되게 하는, 모든 이펙터 기능은 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유하는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서 ADCC 활성이 결여될 수 있음), FcRn 결합 능력은 보유함을 확실하게 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같이 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정은 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 1개 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는, 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 생성하는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 1개 이상의 치환을 그 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 1개 이상에서 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826). Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 생성된다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 그에 의해 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 이것을 사용하여 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 본원에 추가로 기재되는 바와 같은 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 어느 1개 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1개 초과의 중합체가 부착되는 경우에 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선시킬 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 요법에서 규정된 조건 하에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장의 것일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-재기드1 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 1개 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 항-재기드1 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는, 상기에 제공된 바와 같은 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-재기드1 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 1개 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우에, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서 항체 단편의 발현을 기재하는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체가 생산되게 하는 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합화된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977))]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
C. 검정
본원에 제공된 항-재기드1 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 스크리닝되거나 특징화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 다른 검정
한 측면에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 측면에서, 경쟁 검정은 인간 또는 뮤린 재기드1에의 결합에 대해 항체 A, A-1, A-2, 또는 A-1(S101T)과 경쟁하는 항체를 확인하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 A, A-1, A-2, 또는 A-1(S101T)이 결합하는 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다.
항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 상세한 예시적인 방법이 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에서 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 재기드1은 재기드1에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, A, A-1, A-2, 또는 A-1(S101T)) 및 재기드1에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험될 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 재기드1은 제1 표지된 항체를 포함하나 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이션된다. 재기드1에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후에, 잉여량의 미결합 항체를 제거하고, 고정된 재기드1과 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 재기드1과 회합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이는 제2 항체가 재기드1에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
2. 활성 검정
한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 그의 항-재기드1 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성은 예를 들어 Notch1을 통한 재기드1-유도된 신호전달의 억제를 포함할 수 있다. 특정의 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 재기드1-유도된 Notch 신호전달에 반응성인 리포터 유전자의 발현을 억제하는 그의 능력에 대해 시험된다. 비제한적인 예시적 검정이 실시예에 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다.
D. 면역접합체
본 발명은 또한 1종 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-재기드 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 약물에 접합된, 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소적 활성 독소 또는 그의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체가 검출을 위해 사용되는 경우에, 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 마찬가지로 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.), 미국 일리노이주 록포드로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 가교 시약을 사용하여 제조된 이러한 접합체를 명백하게 고려하나, 이에 제한되지는 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체는 생물학적 샘플에서 재기드1의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 암성 조직을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-재기드1 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 재기드1의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-재기드1 항체와, 항-재기드1 항체가 재기드1에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 단계, 및 항-재기드1 항체와 재기드1 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-재기드1 항체는 항-재기드1 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하기 위해 사용되고, 예를 들어 여기서 재기드1은 환자의 선택을 위한 바이오마커이다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는 암, 예를 들어 유방암, 폐암, 뇌암, 자궁경부암, 결장암, 간암, 담관암, 췌장암, 피부암, B-세포 악성종양 및 T-세포 악성종양을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-재기드1 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지) 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
F. 제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 항-재기드1 항체의 제약 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 이러한 항체를 1종 이상의 임의적인 제약상 허용되는 담체와 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 혼합하는 것에 의해 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 제약상 허용되는 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 비롯한, 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 1개 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제제는 또한 치료되는 특정한 적응증에의 필요에 따라 1종 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포독성제, 예를 들어 화학요법제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균성이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
G. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체가 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 항-재기드1 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 이상 Notch 신호전달과 연관된 질환 또는 장애, 예를 들어 암을 치료하는데 사용하기 위한 항-재기드1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-재기드1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 항-재기드1 항체를 암에 걸린 개체에게 투여하는 것을 포함하는 상기 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 항-재기드1 항체를 제공한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 방법은 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 것과 같은 적어도 1종의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 방법은 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 것과 같은 적어도 1종의 추가의 치료제를 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 폐암 성장을 억제하는데 사용하기 위한 항-재기드1 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-재기드1 항체를 투여하여 폐암 성장을 감소시키는 것을 포함하는 개체에서 폐암 성장을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 항-재기드1 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-재기드1 항체를 투여하여 유방암 성장을 감소시키는 것을 포함하는 개체에서 유방암 성장을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 항-재기드1 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
일부 실시양태에서, 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및/또는 과다 점액을 치료하기 위한 항-재기드1 항체가 제공된다. 본원에 제공된 항-재기드1 항체로 치료될 수 있는 다른 알레르기성 질환은 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 식품 과민성 및 두드러기; 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염을 비롯한 면역-매개 피부 질환; 건선, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염을 비롯한 자가면역 질환; 염증성 장 질환 (즉, 궤양성 결장염, 크론병); 특발성 간질성 폐렴, 배상 세포 화생과 연관된 질환 (예컨대, 천식, COPD, 낭성 섬유증 및 바렛 식도), 폐 질환, 예컨대 낭성 섬유증, 글루텐-감수성 장병증 및 휘플병; 폐의 면역 질환, 예컨대 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐장염; 만성 폐쇄성 폐 질환, RSV 감염, 포도막염, 경피증, 골다공증 및 호지킨 림프종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제작 또는 제조에서의 항-재기드1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 이상 Notch 신호전달과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위한 것이다. 한 실시양태에서, 의약은 암의 치료를 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 암에 걸린 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 이상 Notch 신호전달과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 이러한 질환 또는 장애에 걸린 개체에게 유효량의 항-재기드1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 암에 걸린 개체에게 유효량의 항-재기드1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 1종의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 암 세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 항-재기드1 항체를 투여하여 암 세포 성장을 억제하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 배상 세포 화생 (예를 들어, 폐내)과 연관된 질환 및/또는 과다 점액을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 식품 과민성 및 두드러기; 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염을 비롯한 면역-매개 피부 질환; 건선, 류마티스 관절염, 소아 만성 관절염을 비롯한 자가면역 질환; 염증성 장 질환 (즉, 궤양성 결장염, 크론병); 특발성 간질성 폐렴, 배상 세포 화생과 연관된 질환 (예컨대, 천식, COPD, 낭성 섬유증 및 바렛 식도), 폐 질환, 예컨대 낭성 섬유증, 글루텐-감수성 장병증 및 휘플병; 폐의 면역 질환, 예컨대 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증 및 과민성 폐장염; 만성 폐쇄성 폐 질환, RSV 감염, 포도막염, 경피증, 골다공증 및/또는 호지킨 림프종을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의 본원에 제공된 항-재기드1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-재기드1 항체, 및 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 적어도 1종의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 적어도 1종의 추가의 치료제와 공-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 세포독성제이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 항체이다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일 또는 개별 제제에 포함됨) 및 개별 투여를 포괄하고, 이러한 경우에 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 또는 치료제들의 투여 전에, 그와 동시에, 및/또는 그 후에 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 항-재기드1 항체의 투여 및 추가의 치료제의 투여는 서로 약 1개월 내, 또는 약 1, 2 또는 3주 내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 내에 이루어진다. 또한, 본 발명의 항체는 방사선 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 또는 만성인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 우수한 의료 행위에 부합하는 방식으로 제제화, 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개개의 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는, 그러할 필요는 없지만, 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 1종 이상의 작용제와 함께 임의로 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 1종 이상의 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 다를 것이다. 항체는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 관계없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1mg/kg-10mg/kg)의 항체가 환자에의 투여를 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위 내일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 1종 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록). 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서, 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투여 요법은 항체를 약 4 mg/kg의 초기 부하 용량에 이어서 매주 약 2 mg/kg의 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 항-재기드1 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
H. 제조 물품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 조성물을 그 자체로 수용하거나 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 내부에 본 발명의 항체를 포함하는 조성물이 수용된 제1 용기; 및 (b) 내부에 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 수용된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서 제조 물품은 조성물이 특정한 상태를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 항-재기드1 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 설명을 고려하여 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1. 항-재기드 항체의 생성.
a. 항-재기드1 항체를 확인하기 위한 라이브러리 분류 및 스크리닝
M13 박테리오파지 입자의 표면 상에 디스플레이되는 Fab 단편을 패닝하기 위해, 선택된 상보성 결정 영역 내에 인간 IgG 레퍼토리의 천연 다양성을 모방한 합성적 다양성을 갖는 인간 파지 항체 라이브러리를 사용하였다. 인간 Jag1-DSL-EGF1-4 (서열식별번호: 6) 또는 인간 Jag2-DSL-EGF1-4 (서열식별번호: 8)를 라이브러리 분류를 위한 항원으로서 사용하였다. 눈크 96 웰 맥시소르프(Maxisorp) 이뮤노플레이트를 밤새 4℃에서 표적 항원 (10μg/ml)으로 코팅하고, 1시간 동안 실온에서 파지 차단 완충제 PBST (포스페이트-완충 염수 (PBS) 및 1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.05% (v/v) 트윈-20)로 차단하였다. 항체 파지 라이브러리 VH (예를 들어, 문헌 [Lee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132 (2004)] 참조) 및 VH/VL (문헌 [Liang et al., JMB. 366: 815-829 (2007)] 참조)을 항원 플레이트에 개별적으로 첨가하고, 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. 다음 날 항원-코팅된 플레이트를 PBT (0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS)로 10회 세척하고, 결합된 파지를 50mM HCl 및 500mM NaCl로 30분 동안 용리시키고, 동등 부피의 1 M 트리스 염기 (pH7.5)로 중화시켰다. 회수된 파지를 이. 콜라이 XL-1 블루 세포에서 증폭시켰다. 후속 선택 라운드 동안, 항체 파지와 항원-코팅된 플레이트의 인큐베이션을 2-3시간으로 줄이고, 플레이트 세척의 엄격도를 서서히 증가시켰다.
4개 라운드의 패닝 후에, 유의한 풍부화가 관찰되었다. 96개의 클론을 각각 VH 및 VH/VL 라이브러리 분류로부터 골라내어 이것이 인간 재기드1 또는 재기드2에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하였다. 이들 클론의 가변 영역을 PCR 서열분석하여 특유의 서열 클론을 확인하였다. 스팟 경쟁 ELISA를 사용하여 파지 항체의 친화도를 등급화하였다. 추가로, 경쟁적 파지-결합 ELISA를 사용하여 파지 항체 IC50 값을 결정하였다. 인간 재기드1 (재기드2는 아님), 재기드2 (재기드1은 아님), 또는 재기드1 및 재기드2 둘 다에 특이적으로 결합하는 특유의 파지 항체를 선택하고, 시험관내 세포 검정에서의 평가를 위해 전장 IgG로 재포맷하였다.
개개의 클론의 VL 및 VH 영역을, 인간 카파 불변 도메인을 함유하는 pRK 포유동물 세포 발현 벡터 (pRK.LPG3.HumanKappa) 및 전장 인간 IgG1 불변 도메인을 코딩하는 발현 벡터 (pRK.LPG4.HumanHC)에 각각 클로닝하여 (Shields et al., J Biol Chem 2000; 276: 6591-6604) 관심 클론을 IgG로 재포맷하였다. 이어서 항체를 포유동물 CHO 세포에서 일시적으로 발현시키고, 단백질 A 칼럼으로 정제하였다.
b. VH 또는 VHVL 라이브러리로부터 유래된 클론의 친화도 개선을 위한 라이브러리의 구축
파지미드 pV0350-2b로부터 유래된 파지미드 pW0703 (문헌 [Lee et al., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004)], 모든 CDR-L3 위치에 정지 코돈 (TAA)을 함유하고, M13 박테리오파지의 표면 상에 1가 Fab를 디스플레이함)을 친화도 성숙을 위해 중쇄 가변 도메인 (VH) 라이브러리로부터의 관심 클론의 VH 그라프팅을 위한 라이브러리 주형으로서 제공하였다. 친화도 성숙을 위해 하드 및 소프트 무작위화 전략 둘 다를 사용하였다. 하드 무작위화의 경우에, 3개의 경쇄 CDR의 선택된 위치를 갖는 1개의 경쇄 라이브러리를 천연 인간 항체를 모방하도록 설계된 아미노산을 사용하여 무작위화하고, 설계된 DNA 축중성은 문헌 [Lee et al. (J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004))]에 기재된 바와 같았다. 선택된 위치에서 대략 50%의 돌연변이율을 도입하는 소프트 무작위화 조건을 달성하기 위해, 돌연변이유발 DNA를 야생형 뉴클레오티드를 선호하는 염기의 70-10-10-10 혼합물을 사용하여 합성하였다 (Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)). 소프트 무작위화를 위해, CDR-L3의 위치 91-96, CDR-H1의 30-33, 35, CDR-H2의 50, 52, 53-54, 및 56, CDR-H3의 95-98에서의 잔기를 표적화하고; CDR 루프의 3개의 상이한 조합, H1/L3, H2/L3, 및 H3/L3을 무작위화를 위해 선택하였다.
VHVL 라이브러리 기원의 클론의 경우에, 각각의 CDR에 4개의 정지 코돈 (TAA)을 함유하고 M13 박테리오파지의 표면 상에 1가 Fab를 디스플레이하는 파지미드를 개별적으로 생성하고, 친화도 성숙 라이브러리의 구축을 위한 쿤켈 돌연변이유발을 위한 주형으로서 제공하였다. CDR-L3의 다양성이 나이브 라이브러리로 구축되었기 때문에, VHVL 라이브러리로부터 유래된 클론의 경우에는 오직 소프트 무작위화 전략만을 사용하였다. 소프트 무작위화 조건을 달성하기 위해, CDR-L1의 위치 28-31, CDR-L2의 50, 53-55, CDR-L3의 91-96, CDR-H1의 30-35, CDR-H2의 50-56, CDR-H3의 95-100에서의 잔기를 표적화하고; CDR 루프의 4개의 상이한 조합, H1/L3*, H2/L3*, 및 H3/L3* 및 L1/L2/L3* (여기서 *는 주형 상의 정지 코돈의 위치를 표시함)을 무작위화를 위해 선택하였다.
c. 친화도 개선을 생성하기 위한 파지 분류 전략
친화도 개선 선택을 위해, Jag1 또는 Jag2 항원을 한계 시약 조건 하에 먼저 비오티닐화하였다. 파지 라이브러리에 대해 1 라운드의 플레이트 분류를 행하고, 증가하는 엄격도로 5 라운드의 용액 분류를 행하였다. 제1 라운드의 플레이트 분류를 위해, 10ug/ml 항원을 먼저 맥시소르프 플레이트에 코팅하고, 차단 완충제 (PBS 중 1% BSA 및 0.05% 트윈20)로 사전차단시켰다. 차단 완충제 중 3 O.D./ml의 파지 유입물을 항원 플레이트에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS-0.05% 트윈20으로 10회 세척하였다. 결합된 파지를 150μl/웰 50mM HCl, 500mM KCl로 30분 동안 용리하고, 후속적으로 50μl/웰의 1M 트리스 pH8에 의해 중화시키고, 적정하고, 다음 라운드를 위해 증식시켰다. 후속 라운드에서, 파지 라이브러리의 패닝을 용액 상에서 수행하였으며, 여기서 파지 라이브러리를 1% 슈퍼블록(Superblock) (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology)) 및 0.05% 트윈20을 함유하는 100μl 완충제 중 100 nM 비오티닐화 표적 단백질 (농도는 모 클론 파지 IC50 값에 기초함)과 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 혼합물을 1% 슈퍼블록으로 추가로 10X 희석하고, 100μl/웰을 30분 동안 실온에서 부드럽게 진탕시키면서 뉴트라비딘-코팅된 웰 (10μg/ml)에 적용하였다. 배경 결합을 결정하기 위해, 파지를 함유하는 대조 웰을 뉴트라비딘-코팅된 플레이트 상에 포획시켰다. 이어서, 결합된 파지를 세척하고, 용리시키고, 제1 라운드에 대해 기재된 바와 같이 증식시켰다. 추가의 5개 라운드의 용액 분류를 증가하는 선택 엄격도로 함께 수행하였다. 이들 중 제1 커플 라운드는 비오티닐화 표적 단백질 농도를 100nM로부터 0.1nM까지 감소시킴으로써 온-레이트 선택을 위한 것이고, 이들 중 마지막 2개의 라운드는 과량의 비-비오티닐화 표적 단백질 (300 내지 1000배 초과)을 첨가하여 실온에서 보다 약한 결합제와 경쟁시킴으로써 오프-레이트 선택을 위한 것이다.
d. 고처리량 친화도 스크리닝 ELISA (단일 스팟 경쟁)
콜로니를 제6 라운드의 스크리닝으로부터 골라내었다. 콜로니를 96-웰 플레이트 (팔콘(Falcon))에서 50μg/ml 카르베니실린 및 1x 1010/ml M13KO7을 갖는 150μl/웰의 2YT 배지 중에서 밤새 37℃에서 성장시켰다. 동일한 플레이트로부터, XL-1 감염된 모 파지의 콜로니를 대조군으로서 골라내었다. 96-웰 눈크 맥시소르프 플레이트를 PBS 중 100μl/웰의 Jag1 또는 Jag2 (0.5μg/ml)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS 20 중 1% BSA 및 0.05% 트윈20 150μl로 1시간 동안 차단시켰다.
35μl의 파지 상청액을 5nM Jag1 또는 Jag2의 존재 또는 부재 하의 75μl의 ELISA (효소 연결 면역흡착 검정) 완충제 (0.5% BSA, 0.05% 트윈20을 함유하는 PBS)로 희석하고, 1시간 동안 실온에서 F 플레이트 (눈크)에서 인큐베이션되게 하였다. 95μl의 혼합물을 항원 코팅된 플레이트로 나란히 옮겼다. 플레이트를 15분 동안 부드럽게 진탕시키고, PBS-0.05% 트윈 20으로 10회 세척하였다. 결합을 ELISA 완충제 중 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-접합된 항-M13 항체 (1:2500)를 첨가함으로써 정량화하고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈 20으로 10회 세척하였다. 이어서, 100μl/웰의 퍼옥시다제 기질을 웰에 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 100μl 0.1M 인산 (H3PO4)을 각각의 웰에 첨가하여 반응을 정지시키고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션되게 하였다. 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 각 웰의 황색의 O.D. (광학 밀도)를 결정하였다. 모 파지의 웰의 OD450nm 감소 (%) (100%)와 비교하여, 50%보다 낮은 OD450nm 감소 (%)를 갖는 클론을 서열 분석을 위해 골라내었다. 특유의 클론을 파지 제조를 위해 선택하여, 각각의 모 클론과 비교하여 Jag1 또는 Jag2에 대한 결합 친화도 (파지 IC50)를 결정하였다. 이어서, 가장 친화도-개선된 클론을 항체 생산 및 추가의 비아코어 결합 동역학적 분석 및 다른 시험관내 또는 생체내 검정을 위해 인간 IgG1로 재포맷하였다.
추가의 스크리닝 라운드로 ELISA에 의해 결정된 바와 같이, 재기드 패밀리 구성원 중 단지 1종에 대해서만 특이적인 항체를 확인하였다. 항체 A는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합하였지만, 재기드2에는 결합하지 않았다 (도 8; 서열식별번호: 9에 제시된 중쇄 가변 영역 서열, 서열식별번호: 10에 제시된 경쇄 가변 영역 서열). 반대로, 항체 B (항체 B-3의 모 항체)는 인간 및 뮤린 재기드2에 결합하였지만, 재기드1에는 결합하지 않았다 (도 8). C-1은 재기드1 및 재기드2 둘 다에 결합하고, 대조군으로서 제공되었다. 항체 C-1에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 도 4에 제시한다.
실시예 2. 항체 결합 친화도 및 에피토프 맵핑.
항-재기드1 파지 항체의 결합 친화도를 비아코어™-3000 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SRP)에 의해 측정하였다. 항-재기드1/2 파지 인간 IgG를 CM5 센서 칩 상에 코팅된 마우스 항-인간 IgG로 포획시켜 대략 150 반응 단위 (RU)를 달성하였다. 동역학적 측정을 위해, 인간 또는 마우스 Jag1/2 DSL_EGF1-4의 2-배 연속 희석물 (1.95nM에서 250nM)을 25℃에서 30ml/분의 유량으로 PBT 완충제 (0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS) 중에 주입하였다. 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산하였다. 평형 해리 상수 (kd)를 koff/kon의 비로서 계산하였다.
표 2는 정제된 인간 재기드1, 인간 재기드2, 및 마우스 재기드2에의 항체 A, A-1, A-2, B, 및 B-3 결합에 대한 결합 상수를 요약한다. 모 항체 A는 인간 및 뮤린 재기드1에 특이적으로 결합하였다. 친화도 성숙 항체 A-1 및 A-2는 인간 및 뮤린 재기드1 둘 다에 높은 친화도로 결합하였다. 항체 A, A-1 및 A-2는 인간 또는 뮤린 재기드2에 결합하지 않았다. 반대로, 항체 B 및 B-3은 인간 또는 뮤린 재기드1에 결합하지 않았다. B-3은 인간 및 마우스 재기드2에 특이적으로 결합하였다.
<표 2> 비아코어 요약표
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항체 A에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 서열식별번호: 9 및 10에 각각 제시한다. 항체 A-1에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 서열식별번호: 17 및 18에 각각 제시한다. 항체 A-2에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 서열식별번호: 25 및 26에 각각 제시한다. 항체 B-3에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 서열식별번호: 41 및 42에 각각 제시한다. 항체 B에 대한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 도 4에 제시한다.
실시예 3. 항-재기드 길항제 항체는 시험관내에서 재기드1-유도된 신호전달을 억제한다.
항-재기드 항체가 재기드-유도된 Notch 신호전달의 길항제로서 작용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 특히 문헌 [Wu et al., Nature 464, 1052-1057 (15 April 2010)]에 기재된 바와 같이 공동-배양 실험을 수행하였다. Notch 리간드로서 재기드1을 발현하도록 조작한 NIH-3T3 세포를, Notch1을 안정적으로 발현하고 Notch-반응성 TP-1 (12X CSL) 반딧불이 루시페라제 리포터 및 구성적으로 발현되는 레닐라 루시페라제 리포터 (pRL-CMV, 프로메가(Promega))를 발현하도록 일시적으로 형질감염시킨 NIH 3T3 세포와 공동-배양하였다. 공동-배양에서 강력한 Notch 리포터 신호 (반딧불이 루시페라제)가 관찰되었다 (도 12, J1 유도된-양성 대조군). 리포터 발현은 γ-세크레타제 억제제를 공동-배양에 첨가했을 때 배경 수준으로 감소되었고, 이는 리포터 구축물의 Notch-의존성 발현을 입증한다. 데이터는 제시되지 않는다.
증가하는 양 (0.016-50 μg/ml)의 항-재기드 항체 A-2 (각각 서열식별번호: 25 및 26의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열) 또는 B-3 (각각 서열식별번호: 41 및 42의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)의 첨가는 리포터 발현의 용량-의존성 억제를 발생시켰다 (도 9). 신호전달이 재기드1 (도 9a, 진회색 칼럼) 또는 재기드2 (도 9b, 연회색 칼럼)에 의해 유도되었고, 억제가 상기 기재된 바와 같이 결정되었다. 대조군은 리간드로 자극되지 않고 항체로 처리되지 않은 배양물 (도 9a 및 b, 비처리), 리간드로 자극되지 않은 배양물 (도 9a 및 b, 무 자극), 5-10 μg/ml 이소형 대조군 항체로 처리된 배양물 (도 9a 및 b, agD), 리간드로 자극되었지만 항체로 처리되지 않은 배양물 (도 9a 및 b, Stim/무 AB), 5 μM의 감마-세크레타제 억제제 DAPT 또는 DMSO의 DAPT 비히클 대조군으로 처리된 배양물을 포함하였다.
항체 A-2는 용량-의존성 방식으로 재기드1-유도된 신호전달을 억제하였지만, 재기드2-유도된 신호전달은 억제하지 못했다 (도 9a). A-2에 대한 IC50은 재기드1 억제의 경우에 2 내지 10 μg/ml였지만, 50 μg/ml의 최고 농도에서도 재기드2 억제는 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. 결과는 항체 A-2가 재기드1-선택적 길항제이고, 즉 항체 A-2는 재기드1-매개 신호전달을 억제하지만, 재기드2-매개 신호전달은 억제하지 못함을 입증한다. 대조적으로, 항체 B-3은 시험된 최저 농도에서 재기드2-유도된 신호전달을 강력하게 억제하였지만, 시험된 최고 농도에서 재기드1-유도된 신호전달은 억제하지 못했고, 이에 따라 B-3은 재기드1-선택적 길항제로서 확립되었다 (도 9b).
실시예 4. 체중에 대한 항-재기드 항체 처리의 효과.
상기 기재된 바와 같이, 감마-세크레타제 억제제 및 다중 Notch 수용체의 다른 억제제는 임상 투여를 위해 바람직하지 않은 체중 감소 및 장 배상 세포 화생을 유발한다. 본원에 기재된 항체가 체중 및 장 건강에 어떻게 영향을 미치는지 결정하기 위해, 마우스에게 항-재기드1 항체 A-2 (5-20mpk; 각각 서열식별번호: 25 및 26의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열), 항-재기드2 항체 B-3 (5-20mpk; 각각 서열식별번호: 41 및 42의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열), 항체 A-2 및 B-3을 함께 (각각 5mpk), 재기드1 및 재기드2 둘 다에 결합하는 항-재기드1/2 항체 (C-1; kg 마우스 체중 (mpk)당 5-10 mg 항체; 도 4에 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열), 또는 이소형 대조군 항-gD 항체 (20mpk)를 1주에 2회 투여하였다. 이소형 대조군 항체를 또한 각 투여의 총 항체 농도를 20 mpk로 만드는데 사용하였다. 각각의 마우스의 총 체중을 항체의 제1 투여 전에 결정하고, 연구 제12일까지 모니터링하였다. 평균 체중 변화를 도 10에 도시하고, 시작 체중의 백분율로서 그래프화하였다. 항-재기드1/2 항체 C-1 또는 재기드1-특이적 항체 A-2 및 재기드2-특이적 항체 B-3을 함께 조합하여 사용한 재기드1 및 재기드2의 이중 억제는 신속하고 실질적인 체중 감소를 유발하였다 (도 10a). 제4일까지, 항-재기드1/2 항체 C-1을 제공받은 일부 마우스는 그의 체중이 5%를 초과하여 감소되었고, 이는 제7일까지 체중의 거의 8-10% 감소로 진행되었다 (도 10a). A-2 및 B-3 둘 다를 제공받은 마우스도 또한 체중이 신속하게 감소되었고, 일부 경우에 제11일까지 17%까지 감소되었다 (도 10a). 대조적으로, 어떠한 재기드1-특이적 또는 재기드2-특이적 항체 단독도 5 또는 20mpk에서 연구 과정에 걸쳐 체중 감소를 유발하지 않았다 (도 10a). 항-재기드1 플러스 항-재기드2 항체의 조합 처리는 감소된 음식물 섭취를 발생시켰고 (도 10b), 이는 관찰된 체중 감소와 상관되었고 (도 10a), 감소된 음식물 섭취가 부분적으로 또는 전체적으로 상관된 체중 감소의 원인이 될 수 있음을 시사하였다.
실시예 5. 항-재기드1 길항제 항체는 생체내 인간 폐암 세포 성장을 억제한다.
하를란 무흉선 누드 마우스에게 인간 비소세포 폐암 세포주인 Calu-6 세포를 피하로 접종하였다. 종양 부피가 대략 200 세제곱 mm에 달한 후에, 마우스에게 20 mpk의 항-gD 이소형 대조군 항체 (n=10) 또는 항-재기드1 항체 A-2 (n=10; 각각 서열식별번호: 25 및 26의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)를 1주에 2회 (제0일, 제4일, 제7일, 제11일, 제14일 및 제18일) 복강내로 (IP) 주사하였다. 또 다른 19일 동안 캘리퍼를 사용하여 각각의 마우스에서 종양 부피를 측정하였다. 각각의 마우스의 총 체중을 연구 과정에 걸쳐 모니터링하였다.
항-재기드1로 처리된 마우스 내 종양은 대조군 내 종양에 비해 종양 부피에서 유의한 감소를 나타내었다 (도 11a). 항-재기드1 항체 처리의 효과는 처리 후 제7일만큼 이르게 검출할 수 있었다 (도 11a). 제18일에, 항-재기드1 항체를 제공받은 마우스에서의 평균 종양 부피는 대략 500mm3에 달한 반면에, 대조 동물에서의 평균 종양 부피는 제18일에 대략 750 mm3에 달하였다. 처리군 및 대조군 사이에 체중에서의 어떠한 유의한 변화도 관찰할 수 없었다 (도 11b).
실시예 6. 항-재기드1 및 항-재기드2 항체는 생체내에서 인간 유방암 세포 성장을 억제한다.
C.B-17 SCID.bg 마우스의 유방 지방 패드에 인간 기저 유방암 세포주인 MDA-MD-468 세포를 접종하였다. 종양 부피가 대략 200 세제곱 mm에 달한 후에, 마우스에게 30 mpk의 항-gD 이소형 대조군 항체 (인간 IgG1 이소형), 항-돼지풀 이소형 대조군 항체 (뮤린 IgG2a 이소형), 인간 IgG1 백본의 항-재기드1 항체 A-2 (각각 서열식별번호: 25 및 26의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열), 뮤린 IgG2a 백본의 항-재기드1 항체 A-2, 또는 인간 IgG1 백본의 항-재기드2 항체 B-3 (각각 서열식별번호: 41 및 42의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)을 제0일, 제4일, 제7일, 제12일, 제15일, 제18일, 제22일, 제25일, 제29일, 제32일, 제36일, 제43일, 제50일, 및 제57일에 IP로 투여하였다. 제1 주사 후 60일 동안 캘리퍼를 사용하여 종양 부피 (y-축)를 측정하였다. 각각의 군 (군당 n=9)에 대한 종양 부피를 선형 혼합 효과 모델을 사용하여 플롯팅하였다 (도 12a). 각각의 군 내 각각의 마우스에 대한 종양 부피를 도 12b에 도시한다.
실시예 7: 항-재기드1 항체는 중쇄 내에서 절단된다.
항체 A (각각 서열식별번호: 9 및 10의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열), A-1 (각각 서열식별번호: 17 및 18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열), 및 A-2 (각각 서열식별번호: 25 및 26의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)를 중쇄 및 경쇄의 완전성에 대해 SDS-PAGE 및 질량 분광측정법에 의해 분석하였다. SDS-PAGE 분석을 위해, 각각의 항체 샘플을 10mM DTT의 존재 및 부재 하의 2x 트리스-글리신 SDS 샘플 완충제 (노벡스(Novex) LC2676)와 함께 1:1 v/v 비로 혼합하였다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하고, 각각의 샘플 2μg을 노벡스 4-20% SDS-PAGE, 1.0mm 겔 (노벡스 EC6025) 상에 로딩하였다. 10μL의 마크 12 분자량 표준물 (인비트로젠(Invitrogen) 100006637)을 또한 겔 상에 로딩하였다. 전기영동을 1x 트리스-글리신 SDS 구동 완충제 (인비트로젠 LC2675-5) 중에서, 추적 염료가 겔의 바닥에 도달할 때까지 일정한 250V에서 구동시켰다. 이어서 겔을 쿠마시-계 염색 (엑스페데온 인스탄트블루(Expedeon InstantBlue) #ISB1L)으로 염색하였다.
질량 분광측정 분석을 위해, 각각의 항체를 PBS 중에서 최종 농도 1mg/mL로 희석하였다. 1:10 v/v의 1.0M 트리스, pH 8.0을 첨가하여 항체의 pH를 8.0으로 증가시켰다. DTT를 용액 중 10mM의 최종 농도로 첨가하여 항체를 환원시켰다. 이어서 샘플을 37℃에서 15분 동안 가열하였다. 이어서 샘플을 애질런트(Agilent) 1200 HPLC 시스템을 사용하여 80℃로 가열한 PLRP-S 1000Å, 8μm, 2.1 x 50mm 칼럼 (애질런트, PL1912-1802) 상에 주입한 다음, 애질런트 6210 TOF LC/MS 시스템 상에서 전기분무 이온화를 행하였다.
이들 분석의 결과를 도 13에 제시한다. SDS-PAGE 분석 (도 13A)은 중쇄 (HC)의 단편이 각각의 항체에서 절단되었음을 밝혀내었다. 무손상 HC 및 경쇄 (LC), 뿐만 아니라 HC의 카르복시 (C)-말단 및 아미노 (N)-말단 절단된 단편에 상응하는 밴드가 겔의 우측에 표시되었다. 항체 A-1에 대한 대표적인 질량 분광측정 분석을 도 13B에 제시한다. 이러한 분석은 도 13C의 HC 아미노산 서열에서 절단 위치를 화살표로 표시하여 도식화된 바와 같이, 절단 부위가 CDR3 내의 HC 아미노산 G100과 S101 사이 (순차적 넘버링, 카바트 넘버링에 따른 G96 및 S97에 상응함)임을 보여주었다. 유사한 분석은 HC 절단이 이들 항체의 모든 시험된 제제에서 발생하였고 (2종의 상이한 세포 유형, CHO 및 293에서의 발현 후 포함), 절단이 항체 Fc 영역의 유형 (인간 IgG1 또는 뮤린 IgG2a)과 독립적으로 발생하였음을 밝혀내었다.
항-재기드1 항체의 SDS-PAGE 겔을 상기 기재된 바와 같이 실질적으로 구동시켰다. 쿠마시-계 염색으로 염색하기 보다는, 엑스셀 블롯 모듈(XCell Blot Module) (인비트로젠 EI9051)을 사용하여 일정한 0.35A에서 항체를 PVDF 막 (인비트로젠 LC2002) 상으로 옮겼다. 막을 쿠마시 블루 R-250으로 염색하였다. 막 상의 샘플에 대해 문헌 [Niall, 1973, Meth. Enzymol. 27: 942-1010]에 기재된 서열분석 원리에 따라 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 프로시스 시퀀서(Procise Sequencer) 494를 사용하여 N-말단 서열 분석을 행하였다.
서열분석 결과를 도 14에 제시한다. 이러한 방법은 절단 부위가 HC 서열의 G100과 S101 사이 (순차적 넘버링, 카바트 넘버링에 따른 G96 및 S97에 상응함)로, 질량 분광측정법 결과로부터 예측되는 것과 동일함을 확인시켜주었다.
항-재기드1 항체 A, A-1, 및 A-2의 중쇄 절단은 예상외의 것이었다. 절단 부위 주위의 아미노산 서열의 분석은 어떠한 공지된 프로테아제 절단 부위도 확인시켜주지 않았다. 절단의 메카니즘은 불명확하고, 항체의 서열로부터 용이하게 명백하지 않다.
실시예 8: 중쇄 S101의 돌연변이는 항-재기드1 항체 중쇄의 절단을 감소시킨다
항-재기드1 항체의 관찰된 절단은 예상외의 것이고, 메카니즘은 불명확하기 때문에, 항체 서열에 대한 변화가 항체의 친화도 및 효능을 유지시키면서 절단을 방지할 수 있는지 여부는 공지되어 있지 않았다. 또한, 항체 서열 내 어떤 위치(들)가 절단을 방지하기 위해 변화되어야 하는지 공지되어 있지 않았다. 항체 절단이 중쇄 서열을 변화시키는 것에 의해 방지될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 일련의 아미노산 변화를 중쇄 위치 S101 (서열식별번호: 17의 중쇄 가변 영역 서열의 순차적 넘버링, 카바트 넘버링에 따라 S97에 상응함)에 만들었다. 항체를 포유동물 세포에서 발현시키고, 표준 절차에 따라 정제하였다. 절단을 실시예 7에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 결과를 도 15에 제시한다. S101H 돌연변이에 의해 일부 절단이 검출되기는 하였지만 (도 15, 레인 5), 위치 S101에서의 아미노산 변화는 HC 절단을 유의하게 감소시키거나 제거하였다. 이들 결과는 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행한 질량 분광측정법에 의해 확인되었다.
정제된 Jag1 세포외 도메인 단백질 단편에의 결합에 대한 변화의 효과를 결정하기 위해, 비아코어를 사용하여 돌연변이체 A-1 항체 결합 친화도를 측정하였다. 표 3은 단편화 및 각각의 돌연변이체 A-1 항체에 대한 재기드1 결합 친화도의 요약을 보여준다.
<표 3> 돌연변이체 A-1 항체의 단편화 및 재기드1 결합 친화도
Figure 112016087173816-pct00003
표 3에 제시된 바와 같이, 위치 101에서 아미노산 잔기에 대한 변화는, S101H의 경우를 제외하고, 절단을 검출가능하지 않은 수준으로 감소시켰다. 또한, 절단의 메카니즘이 공지되어 있지 않기 때문에, 위치 100에 대한 변화, G100A도 또한 시험하였다. G100A 돌연변이체는 여전히 절단되었다. 표 3을 참조한다. 놀랍게도, HVR-H3에서 돌연변이가 이루어지면, S101 돌연변이체 항체는 재기드1에 결합하는 능력을 유지하였다.
실시예 9: 항-재기드1 항체 중쇄의 절단에 대한 온도 및 동결-해동 주기의 효과
항-재기드1 항체 절단이 증가하는 온도에서의 인큐베이션에 의해 증가되는지 여부를 평가하기 위해, 항-재기드1 항체 A-1 (각각 서열식별번호: 17 및 18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열) 및 A-2 (각각 서열식별번호: 25 및 26의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열), 뿐만 아니라 이소형 대조군 항체 (항-재기드1이 아님)의 다양한 독립적 제제를 70℃ 또는 95℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 표준 SDS-PAGE 및 단백질 염색을 사용하여 절단의 정도를 평가하였다. 결과를 도 16에 제시한다. 각각의 항-재기드1 항체 제제는 70℃에서 절단되었지만, 대조군 항체는 그렇지 않았다 (도 16a). 표 (도 16b)에 요약된 바와 같이, 항-재기드1 절단의 정도는 95℃ 대 70℃에서의 인큐베이션에 의해 유의하거나 일관되게 변경되지 않았다.
절단이 항-재기드1 항체 제제의 동결-해동 주기로부터 발생하는지 여부를 평가하기 위해, 항체 A-1 (각각 서열식별번호: 17 및 18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)에 대해 다중 라운드의 -80℃에서의 동결에 이은 해동을 행하였다. 이어서 각각의 샘플 2 μg을 제시된 바와 같이 비-환원 (-DTT) 또는 환원 (+DTT) 조건 하에 SDS-PAGE 및 단백질 염색에 의해 분석하였다. 염색된 겔을 바이오라드 겔독 이지 이미저(Biorad GelDoc Easy Imager) 기기를 사용하여 영상화하고, 바이오라드 이미지 랩 소프트웨어를 사용하여 밀도측정 분석을 수행하였다. 그러한 실험의 결과를 도 17에 제시한다. F/T 1은 원래의 샘플을 지칭하고, 증가하는 수는 추가의 라운드의 동결-해동 주기의 수를 나타낸다. 각각의 주기의 경우에, A-1 항체를 -80℃에서 동결시킨 다음, 실온에서 해동시켰다. SDS-PAGE를 위해 분취물을 제거하였다. 각각의 해동 단계 후에 분취물을 제거하면서, 총 3회 동결/해동 주기를 위해 동결/해동을 2회 더 반복하였다. 표 (도 17b)는 각각의 조건 하에서의 절단의 백분율을 요약한다. 실험은 추가의 라운드의 동결-해동이 절단의 백분율에 거의 영향을 미치지 않음을 밝혀내었다.
실시예 10: 시험관내 A-1 및 A-1(S101T)의 재기드1 차단 활성
Jag1-유도된 Notch 리포터 활성의 시험관내 공동-배양 검정을 수행하여 A-1 (각각 서열식별번호: 17 및 18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열) 및 A-1(S101T) (각각 서열식별번호: 33 및 34의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)의 Jag1 차단 활성을 측정하였다. 높은 수준의 Notch2를 발현하는 U87MG 세포를 Notch-반응성 TP-1 (12X CSL) 반딧불이 (FF) 루시페라제 리포터 및 구성적으로 발현되는 레닐라 루시페라제 리포터 (pRL-CMV, 프로메가)로 공동-형질감염시켜 형질감염 효율을 제어하였다. 문헌 [Wu et al., 2010, Nature 464: 1052-1057]을 참조한다. 항-재기드1 항체 A-1 또는 A-1(S101T), 이소형 대조군 항체, 5 μM DAPT (칼바이오켐(Calbiochem)), 또는 DMSO 비히클 대조군을 리간드-발현 세포 (인간 Jag1로 안정적으로 형질감염되거나 또는 어떠한 리간드 대조군으로도 형질감염되지 않은 NIH-3T3 세포)와 함께 형질감염 6시간 후에 첨가하였다. 공동-배양 20시간 후에 루시페라제 활성을 측정하였다 (프로메가, 이중 글로 루시페라제). 전형적으로, 각각의 조건에 대해 4개의 복제물을 분석하였고, 값을 상대적 루시페라제 단위 (레닐라 신호로 나눈 반딧불이 신호)로 표현하고, 항-돼지풀 대조군당 Jag1-유도된 활성의 백분율로서 그래프화하였다.
그러한 실험의 결과를 도 18에 제시한다. FF 및 레닐라 루시페라제 측정치를 표준 방법에 따라 취하고 (각각 도 18b 및 c), FF 대 레닐라 루시페라제 비를 Jag1-유도된 Notch 활성의 정규화된 측정치로서 그래프화하였다 (도 18a). 결과는 A-1 및 A-1(S101T) 둘 다 Jag1-유도된 Notch 신호전달을 용량-의존성 방식으로 억제함을 보여준다. 도 18a 및 b를 참조한다. 따라서, A-1(S101T)은 모 항체 A-1의 항-재기드1 차단 활성을 유지한다.
실시예 11: 생체내 A-1 및 A-1(S101T)의 재기드1 차단 활성
생체내 항-재기드1 항체의 재기드1 차단 활성을 평가하기 위해, 마우스에게 대조군 또는 항-재기드1 항체를 투여한 후에 마우스 폐 세기관지 상피의 곤봉 및 섬모 세포 조성을 측정하였다. 야생형, 8주령 BALB/c 암컷 마우스 (군당 3마리의 마우스)에게 제0일에 하기와 같이 투여하였다 (모든 군은 항-재기드1 활성의 명백하게 측정가능한 효과를 밝히기 위해 세기관지 상피를 감작화시키는 항-재기드2 항체 (B-3)를 함유함):
1. 대조군 1X - 이소형 대조군 (kg 마우스 체중당 15 mg 항체) + 항-Jag2 B-3 (15mg/kg; 각각 서열식별번호: 41 및 42의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)
2. A-1 1X - 항-Jag1 A-1 (15 mg/kg; 각각 서열식별번호: 17 및 18의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)+ 항-Jag2 B-3 (15mg/kg)
3. A-1 .5X - 항-Jag1 A-1 (7.5mg/kg) + 항-Jag2 B-3 (15mg/kg)
4. A-1 .25X - 항-Jag1 A-1 (3.75mg/kg) + 항-Jag2 B-3 (15mg/kg)
5. A-1-S101T 2X - 항-Jag1 A-1(S101T) (30mg/kg; 각각 서열식별번호: 33 및 34의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열) + 항-Jag2 B-3 (15mg/kg)
6. A-1-S101T 1X - 항-Jag1 A-1(S101T) (15mg/kg) + 항-Jag2 B-3 (15mg/kg)
7. A-1-S101T .5X - 항-Jag1 A-1(S101T) (7.5mg/kg) + 항-Jag2 B-3 (15mg/kg)
8. A-1-S101T .25X - 항-Jag1 A-1(S101T) (3.75mg/kg) + 항-Jag2 B-3 (15mg/kg)
제5일에, 폐를 수거하고, 하기와 같이 팽창시키고, 고정하고, 면역형광 (IF) 염색하였다. 폐를 PBS 중 4% PFA로 팽창시켰다. 전체 폐를 10% 중성 완충 포르말린 (NBF)으로 옮기고, 실온에서 밤새 고정시켰다. 고정된 폐를 적어도 24시간 동안 70% 에탄올로 옮겼다. 폐를 파라핀 포매하고, 5 μm로 절편화하였다. 섬모 및 클라라(Clara) 세포에 대한 면역형광 염색은 다음과 같이 하였다. 슬라이드를 탈-파라핀화하고, 슬라이드를 압력 쿠커 내의 시트레이트 완충제 (다코(Dako) S1700) 중에서 125℃에서 15분 동안 비등시켜 항원을 회수하였다. 슬라이드를 2X PBS 중에서 간단히 세정한 다음, PBS 중 0.2% 트리톤-X100로 45분 또는 3 x 15분 동안 투과화하였다. 절편을 5% FBS/2% BSA로 1시간 동안 차단시켰다. 이어서 슬라이드를 차단 완충제 중 염소 항-CC10 (1:1000) 및 마우스 항-아세틸화 알파 튜불린 (1:200)과 함께 2 내지 3시간 또는 밤새 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 15분 동안 3회 세척하였다. 슬라이드를 2차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 다음 (1:1000으로 희석된 인비트로젠 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 2차 항체), PBS로 15분 동안 2회 세정하였다. DAPI (0.5ug/ml)로 15분 동안 핵을 염색하였다. 이어서 슬라이드를 PBS로 15분 동안 2회 세정하고, 커버슬립으로 덮었다.
그러한 실험의 결과를 도 19에 제시한다. 재기드1 및 재기드2 신호전달을 차단하는 것은 마우스 세기관지 상피에서 섬모 세포 수의 증가 (알파-튜불린의 면역형광 검출에 의해 적색으로 표시된 바와 같음) 및 곤봉 세포 수의 감소 (CC10의 면역형광 검출에 의해 녹색으로 표시된 바와 같음)를 유발하였다. 재기드1 플러스 재기드2 둘 다를 차단하는 것은 곤봉 세포의 거의 완전한 상실을 발생시켰고, 결과적으로 상피가 주로 섬모 세포로 이루어졌다 (적색; 도 19의 "A-1, 1X" 및 "A-1-S101T, 2X" 참조). A-1 및 A-1(S101T) 둘 다는 생체내 재기드1-유도된 Notch 신호전달을 용량-의존성 방식으로 억제하였다. 따라서, A-1(S101T)은 생체내에서 모 항체 A-1의 항-재기드1 차단 활성을 유지하였다.
실시예 12: 항-재기드1 항체 A-1 및 A-1(S101T)은 생체내 간암 종양의 성장을 억제한다.
인간 환자-유래 간암 종양, LIV#78 (제넨디자인(Genendesign), 중국)을 BALB-c 누드 면역손상 마우스 내에서 피하 이종이식편으로서 성장시켰다. 종양이 150 내지 200 mm3로 성장했을 때, 마우스를 군당 10마리의 마우스의 7개의 처리군으로 분류하고, 제시된 항체 (A-1(S101T) 항체는 각각 서열식별번호: 51 및 53의 중쇄 및 경쇄 서열을 가짐; "A-1-DANG(무이펙터)"은 각각 서열식별번호: 52 및 53의 중쇄 및 경쇄 서열을 가짐; 및 A-1 항체는 각각 서열식별번호: 81 및 53의 중쇄 및 경쇄 서열을 가짐)를 제시된 용량 (마우스 체중 kg당 항체 mg 단위)으로 1주에 1회 투여하였다 (군 5는 제외, 이는 3주마다 1회 투여함). 도 20B를 참조한다. 종양 부피를 캘리퍼 측정에 의해 평가하였다 (길이 x 너비 x 높이/2).
도 20A는 연구 과정에 걸쳐 각각의 처리군에서의 종양 부피의 LME (선형 혼합 효과) 그래프를 보여준다. 도 20B는 성장 통계, 군 정체, 및 투여 요법을 요약한다. 항-재기드1 A-1 및 A-1(S101T) 항체는 생체내에서 간암 성장을 유의하게 억제하였고; 각각의 항-재기드1 항체에 의해 다중 PR (부분 반응)이 관찰되었다. 마찬가지로, 어떠한 항-재기드1 처리된 군도 44일의 연구 동안 종양 부피의 배가를 나타내지 않은 반면에, 대조군은 18.5일의 종양 배가 진행까지의 시간 (TTP 2X)을 나타내었다. 도 20B를 참조한다. 일당 곡선하 면적 (AUC/일)의 함수로서 종양 성장 억제의 백분율 (%TGI, 여기서 "하한" 및 "상한"은 각각의 군 내 개별 동물에 대한 최저 및 최고 %TGI 측정치를 각각 지칭함)은 대조군과 비교하여 항-재기드1 A-1-S101T의 용량에 의존하였고, 재기드1 억제의 정도를 반영하는 종양 성장 억제와 일치하였다. 마찬가지로, 종양 성장의 억제는 A-1 또는 A-1(S101T)을 사용한 경우에 유사하였다. 예를 들어, 도 20B의 군 3 및 7을 비교한다. 이펙터 기능이 결여된 A-1의 중쇄 N297G 돌연변이체 형태가 A-1만큼 효율적으로 종양 성장을 억제하였기 때문에, 종양 성장 억제는 항체 이펙터 기능에 의존하지 않았다. 도 20B의 군 6 및 7을 비교한다.
도 21A는 도 20에 제시된 마우스에 대한 시간의 경과에 따른 마우스 체중의 LME (선형 혼합 효과) 그래프를 보여준다. 도 20B는 연구의 최종일에서의 체중의 % 변화 (% BW 최종일), 체중의 최대 % 변화 (최대 %BW), 및 체중의 최대 변화가 발생한 날 (최대 %BW 일), 및 (AUC/일 (하한,상한))을 비롯한, 처리군에 대한 다양한 체중 파라미터를 보여준다. 대조군을 비롯하여 처리군에 대한 체중 그래프는 통계적으로 구별가능하지 않았고, 이는 항-재기드1 처리가 잘-허용됨을 나타낸다.
실시예 13: 재기드1을 차단하는 것은 생체내 배상 세포 화생을 억제한다
복강내로 주사된 오브알부민에 대한 35일의 감작화 기간 후에, 마우스에게 7 연속일 동안 에어로졸화된 오브알부민을 챌린지하고, 그 후에 이를 희생시켜 배상 세포의 수에 대해 분석하였다. 마우스를 대조군, 항-재기드1 A-2 항체 (뮤린 IgG2a Fc를 가짐), 항-재기드2 B-3 항체 (뮤린 IgG2a Fc를 가짐) 또는 항-재기드1 + 항-재기드2 항체의 조합으로 제1 에어로졸 챌린지 24시간 및 96시간 후에 처리하였다.
도 23a는 항-재기드1, 항-재기드2, 항-재기드1 + 항-재기드2, 또는 대조군 항체로 처리된 마우스에서의 폐 기도의 과아이오딘산-쉬프 염색을 보여준다. 도 23b는 상이한 처리군의 기도에서의 배상 세포의 정량화를 보여준다. 풍부한 배상 세포가 대조군 및 항-재기드2 군에서 분명하였다. 항-재기드1 군에서는 배상 세포가 거의 존재하지 않았고, 실제로 항-재기드1 + 항-재기드2 군에서 어떠한 배상 세포도 검출되지 않았다. 도 23c는 헤마톡실린 에오신 (H&E) 염색에 의해 평가된 바와 같은 염증 인덱스를 보여준다. 재기드1 또는 -2 차단 항체를 사용한 처리는 폐내 염증에 영향을 미치지 않았다.
재기드1-유도된 Notch 신호전달은 기도 내 세포 운명을 분비 세포 (배상 세포 포함) 운명으로, 및 섬모 세포 운명에서 벗어나도록 편향시켰다. 재기드1 신호전달은 분비 세포 운명을 유지하는데 중요하고, 재기드1 신호전달의 억제는 배상 세포 화생을 방지하였다. 본 발명자들은 또한 곤봉 세포-에서-섬모 세포로의 전환이 직접적이고, 세포 분열을 수반하지 않음을 밝혀내었다 (데이터는 제시되지 않음). 곤봉 세포는 폐에서 배상 세포가 생기게 하였다. 하나의 세포 유형에서 또 다른 것으로의 이러한 전환분화는 성체 폐에서 발생하였고, 예컨대 손상 후 또는 발생 동안의 전구 세포 분열을 수반하는 세포 운명 선택과 구분된다. 배상 세포 화생 또는 과다 점액은 여러 기도 질환, 예컨대 천식, 낭성 섬유증, COPD 및 바렛 식도의 특징이다. 이들 재기드 억제 결과는 배상 세포 화생의 예방 또는 역전 및 기도 질환 (예를 들어, 천식, COPD, 낭성 섬유증) 및 바렛 식도에서와 같이 과다 점액을 특징으로 하는 상태의 치료를 위한 재기드1 또는 재기드2 억제제의 사용을 수반하는 치료 용도에 대한 근거를 제공한다.
실시예 14: 항-재기드1 및 항-재기드2 항체의 특이적 결합
표준 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 항체 A-2 (도 24, 좌측 패널) 및 C-1 (도 24, 우측 패널)에 대해 재조합 정제된 Notch 리간드 인간 재기드1 (hJag-1), 인간 재기드2 (hJag-2), 뮤린 재기드2 (mJag-2), 인간 델타-유사 1 (hDLL1), 뮤린 델타-유사 1 (mDLL1), 및 인간 델타-유사 4 (hDLL4)에 대한 결합을 시험하였다. PBS, pH7.4 중 1μg/ml의 Notch 리간드 단백질 (제시된 바와 같음)을 ELISA 플레이트 (눈크 맥시소르프) 상에 40℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS (피어스) 중 카세인 차단제로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. PBST 완충제 (0.5% (w/v) BSA를 함유하는 PBT 완충제 (PBS + 0.05% (v/v) 트윈 20)) 중 항체 IgG의 연속 3-배 희석물 (제시된 바와 같음)을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 PBST로 세척하고, 결합된 항체를 퍼옥시다제-접합된 염소 항-인간 Fab 특이적 IgG (시그마(Sigma))로 검출하였다. TMB 기질 (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 사용하였고, 630nM에서의 흡광도를 표준 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 칼레이다그래프 (시너지 소프트웨어)를 사용하여 흡광도를 IgG의 농도에 대해 플롯팅하였다. 도 24는 결과를 결합의 정도를 나타내는 y-축 상의 A630으로 보여준다.
항체 A2는 인간 및 뮤린 재기드1에 결합하지만, 인간 재기드2, 뮤린 재기드2, 인간 DLL1, 뮤린 DLL1, 인간 DLL4, 또는 뮤린 DLL4에는 결합하지 않았다 (도 24, 좌측 패널). 항체 C1은 인간 및 뮤린 재기드1, 인간 및 뮤린 DLL1, 인간 및 뮤린 재기드2에 결합하지만, 인간 또는 뮤린 DLL4에는 결합하지 않았다 (도 24, 우측 패널).
항체 결합 친화도 및 속도 상수를 비아코어™-T200 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. 인간 IgG1 항체를 CM5 센서 칩 상에 코팅된 마우스 항-인간 IgG로 포획시켜 대략 150 반응 단위 (RU)를 달성하였다. 동역학적 또는 친화도 측정을 위해, 인간 재기드1, 뮤린 재기드1, 인간 재기드2, 뮤린 재기드2, 인간 DLL1, 뮤린 DLL1, 인간 DLL4, 뮤린 DLL4, 및 래트 재기드1의 4-배 연속 희석물을 25℃에서 30ml/분의 유량으로 HBS-T 완충제 (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% v/v 계면활성제 P20, 지이 헬스케어(GE Healthcare)) 중에 주입하였다. 리간드 단편은, 래트 재기드1을 제외하고, R&D 시스템즈(R&D Systems)로부터 구입한 DSL-EGF1-4 단편이었다. 동역학적 분석을 위해, 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 T200 평가 소프트웨어 버전 2.0)을 사용하여 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산하였다. 평형 해리 상수 (kd)를 koff/kon의 비로서 계산하였다. 친화도 분석을 위해, 정상 상태 친화도 모델 (비아코어 T200 평가 소프트웨어 버전 2.0)을 사용하여 Kd를 계산하였다.
표 3은 정제된 인간 재기드1, 뮤린 재기드1, 인간 재기드2, 뮤린 재기드2, 인간 DLL1, 뮤린 DLL1, 인간 DLL4, 뮤린 DLL4, 및/또는 래트 재기드1에 대한 항체 A-2, B-3, C-1, A-1, 및 A-1 S101T 결합에 대한 결합 상수를 요약한다. n.d. = 검출되지 않음, n.t. = 시험되지 않음. 항체 A-2, A-1, 및 A-1-S101T.NG (N297G 돌연변이를 갖는 항체 A-1S101T)는 인간 및 뮤린 재기드1에 높은 친화도로 특이적으로 결합하였다. 항체 A-1 및 A-1-S101T.NG는 또한 래트 재기드1에 높은 친화도로 결합하였다. 항체 B-3은 인간 및 뮤린 재기드2에 높은 친화도로 특이적으로 결합하였다. 항체 C-1은 인간 및 뮤린 재기드1 및 재기드2에 특이적으로 결합하였다. 항체 B-3 및 C-1은 인간 및 마우스 DLL1에 대해 약간의 결합을 나타내었지만, 항체 A-2는 그렇지 않았다. 시험된 어떠한 항체도 인간 또는 마우스 DLL4에는 결합하지 않았다.
<표 3> 항-재기드 항체에 대한 결합 상수
Figure 112016087173816-pct00004
<표 3 (계속)> 항-재기드 항체에 대한 결합 상수
Figure 112016087173816-pct00005
실시예 15: 항-재기드1 A-1-S101T 항체의 약동학
항-재기드1 A-1-S101T 항체의 1, 10, 및 100 mg/kg으로의 단일 정맥내 주사 후의 약동학적 프로파일을 암컷 Balb/c 누드 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories), 캘리포니아주 홀리스터)에서 평가하였다. 마우스는 5-8주령이었고, 대략 17.3-21.8 g으로 칭량되었다. 혈청 샘플을 수집하고, 특정 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 항체 농도를 분석하였다. 특정 ELISA를 JAG1 세포외 도메인-히스티딘으로 코딩하고, 염소 항-인간 Fc로 검출하였다. 검정 감수성은 표준 값 6.25 ng/mL보다 낮았다. 약동학적 파라미터를 포에닉스(Phoenix)™ 윈논린(WinNonlin)® (v.6.3; 파르사이트 코포레이션(Pharsight Corporation); 캘리포니아주 마운틴 뷰)을 사용하여 비-구획화 모델을 사용하여 추정하였다. 모든 PK 분석은 개별 동물 데이터의 나이브 풀을 기초로 하였다.
노출 중 용량 비례 증가보다 더 큰 증가가 항-재기드1 A-1-S101T 항체의 1 및 100 mg/kg 용량 범위 내로의 IV 투여 후에 관찰되었고, 이는 항체의 표적-매개 클리어런스 메카니즘을 시사한다 (도 25 및 표 4). 클리어런스 값은 대략 13 내지 75 mL/일/kg 범위였다.
<표 4> 항-재기드1 A-1-S101T 항체의 약동학적 특성
Figure 112016087173816-pct00006
상기 본 발명은 이해의 명료함을 위해 예시 및 예의 방식으로 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
<서열의 표>
Figure 112016087173816-pct00007
Figure 112016087173816-pct00008
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SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. SIEBEL, Christian W. WU, Yan HANG, Julie Q. CHINN, Yvonne <120> ANTI-JAGGED1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> GENE-33748/US-1/PRO <140> PCT/US15/15456 <141> 2015-02-11 <150> US 61/939,110 <151> 2014-02-12 <160> 111 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1218 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> Human Jag1 <400> 1 Met Arg Ser Pro Arg Thr Arg Gly Arg Ser Gly Arg Pro Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Leu Leu Cys Ala Leu Arg Ala Lys Val Cys Gly Ala Ser 20 25 30 Gly Gln Phe Glu Leu Glu Ile Leu Ser Met Gln Asn Val Asn Gly Glu 35 40 45 Leu Gln Asn Gly Asn Cys Cys Gly Gly Ala Arg Asn Pro Gly Asp Arg 50 55 60 Lys Cys Thr Arg Asp Glu Cys Asp Thr Tyr Phe Lys Val Cys Leu Lys 65 70 75 80 Glu Tyr Gln Ser Arg Val Thr Ala Gly Gly Pro Cys Ser Phe Gly Ser 85 90 95 Gly Ser Thr Pro Val Ile Gly Gly Asn Thr Phe Asn Leu Lys Ala Ser 100 105 110 Arg Gly Asn Asp Arg Asn Arg Ile Val Leu Pro Phe Ser Phe Ala Trp 115 120 125 Pro Arg Ser Tyr Thr Leu Leu Val Glu Ala Trp Asp Ser Ser Asn Asp 130 135 140 Thr Val Gln Pro Asp Ser Ile Ile 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Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Trp Tyr Gln Ser Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Pro Trp Pro Ser Lys Gly Phe Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 88 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Asp Tyr Asp Val Arg Ser Val Gly Ser Gly Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 89 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Gly Ile Ser Pro Ala Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Asp Tyr Asp Val Arg Thr Val Gly Ser Gly Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 90 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 90 Glu Val Gln 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Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 97 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 97 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ile Ser Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 98 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 98 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 99 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 99 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Ser Ser Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 100 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 100 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 101 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 101 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Ala Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 102 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 102 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Thr Ala Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 103 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 103 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Thr Ala Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 104 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 104 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 105 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 105 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 106 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 106 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 107 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 107 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 108 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 108 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Thr Gly Asn Gly Gly Tyr Ser Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 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Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Tyr 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 195 200 205 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 210 215 220 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys 225 230 235 240 Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser 260 265 270 Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp 275 280 285 Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr 290 295 300 Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu 325 330 335 Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val 355 360 365 Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr 370 375 380 Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr 385 390 395 400 Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys 420 425 430 Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu 435 440 445 Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly 450 455 460 Lys Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr 465 470 475 480 Gly Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 485 490 495 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 500 505 510 Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 515 520 525 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 530 535 540 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 545 550 555 560 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 565 570 575 Thr Thr Ala Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 580 585 590 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 595 600 605 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 610 615 620 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 625 630 635 640 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 645 650 655 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 660 665 670 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 675 680 685 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 690 695 <210> 111 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 111 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15

Claims (57)

  1. a) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열식별번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (여기서 X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택됨),
    서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
    b) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (여기서 X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택됨),
    서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
    c) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 (여기서 X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택됨),
    서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는, 인간 재기드1에 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    a) 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 서열 및
    서열식별번호: 34의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VL 서열, 또는
    b) 서열식별번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 서열 및
    서열식별번호: 10의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VL 서열, 또는
    c) 서열식별번호: 62의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VH 서열 및
    서열식별번호: 26의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체.
  3. a) 서열식별번호: 54 (여기서 X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택됨)의 VH 서열, 및
    서열식별번호: 34의 VL 서열, 또는
    b) 서열식별번호: 58 (여기서 X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택됨)의 VH 서열, 및
    서열식별번호: 10의 VL 서열, 또는
    c) 서열식별번호: 62 (여기서 X는 A, D, E, G, I, K, L, N, Q, R, T, 및 V로부터 선택됨)의 VH 서열, 및
    서열식별번호: 26의 VL 서열
    을 포함하는, 인간 재기드1에 결합하는 단리된 항체.
  4. 제3항에 있어서,
    서열식별번호: 54의 VH 서열 및
    서열식별번호: 34의 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체.
  5. 제4항에 있어서,
    중쇄가 서열식별번호: 56의 아미노산 서열을 포함하고,
    경쇄가 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체.
  6. 제4항에 있어서,
    중쇄가 서열식별번호: 57의 아미노산 서열을 포함하고,
    경쇄가 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, X가 T인 단리된 항체.
  8. a) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
    b) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열식별번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 또는
    c) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1,
    서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2,
    서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3,
    서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1,
    서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및
    서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는, 인간 재기드1에 결합하는 단리된 항체.
  9. 제8항에 있어서,
    a) 서열식별번호: 33의 VH 서열 및
    서열식별번호: 34의 VL 서열, 또는
    b) 서열식별번호: 65의 VH 서열 및
    서열식별번호: 10의 VL 서열, 또는
    c) 서열식별번호: 66의 VH 서열 및
    서열식별번호: 26의 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체.
  10. 서열식별번호: 33의 VH 서열 및
    서열식별번호: 34의 VL 서열
    을 포함하는, 인간 재기드1에 결합하는 단리된 항체.
  11. 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 IgG1 항체인 단리된 항체.
  12. 제11항에 있어서, 이펙터 기능이 실질적으로 결여된 단리된 항체.
  13. 제11항에 있어서, 중쇄가 N297G 또는 N297A 돌연변이를 포함하는 것인 단리된 항체.
  14. 제10항에 있어서,
    중쇄가 서열식별번호: 51의 아미노산 서열을 포함하고,
    경쇄가 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체.
  15. 제10항에 있어서,
    중쇄가 서열식별번호: 52의 아미노산 서열을 포함하고,
    경쇄가 서열식별번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    단리된 항체.
  16. 제9항에 있어서,
    a) 서열식별번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및
    서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
    b) 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및
    서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
    c) 서열식별번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및
    서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는
    d) 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및
    서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 단리된 항체.
  17. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 재기드1-매개 신호전달의 길항제인 단리된 항체.
  18. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 재기드2에 결합하지 않는 단리된 항체.
  19. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 DLL4에 결합하지 않는 단리된 항체.
  20. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 DLL1에 결합하지 않는 단리된 항체.
  21. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤린 재기드2, 뮤린 DLL4 및/또는 뮤린 DLL1에 결합하지 않는 단리된 항체.
  22. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 이종이식편 모델에서 체중 감소를 유발하지 않으면서 종양 성장을 감소시키는 단리된 항체.
  23. 제22항에 있어서, 마우스 이종이식편 모델이 간암 이종이식편 모델인 단리된 항체.
  24. 제23항에 있어서, 종양 성장을 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 또는 적어도 90 AUC/일 TGI%만큼 감소시키는 단리된 항체.
  25. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 단리된 핵산.
  26. 제25항의 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  27. 항체가 생산되도록 제26항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  28. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  29. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체, 또는
    제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체
    를 포함하는, 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  30. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체, 또는
    제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체
    를 포함하는, 암 세포 성장을 감소시키기 위한 제약 조성물.
  31. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체, 또는
    제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체
    를 포함하는, 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 낭성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 또는 바렛 식도를 치료하기 위한 제약 조성물.
  32. 제29항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 뇌암, 자궁경부암, 결장암, 간암, 담관암, 췌장암, 피부암, B-세포 악성종양 및 T-세포 악성종양으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  33. 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 표지에 접합된 단리된 항체.
  34. 제33항에 있어서, 표지가 양전자 방출체인 단리된 항체.
  35. 제34항에 있어서, 양전자 방출체가 89Zr인 단리된 항체.
  36. 생물학적 샘플을 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 표지에 접합된 제1항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체와, 상기 항체가 자연 발생 인간 재기드1에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에 접촉시키는 단계, 및
    생물학적 샘플에서 항체와 자연 발생 인간 재기드1 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플에서 인간 재기드1을 검출하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 생물학적 샘플이 유방암, 폐암, 뇌암, 자궁경부암, 결장암, 간암, 담관암, 췌장암, 피부암, B-세포 악성종양 및 T-세포 악성종양으로부터 선택된 것인 방법.
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