SK17232001A3 - Použitie blokujúcej monoklonálnej protilátky proti VLA-1 na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie zápalových ochorení - Google Patents

Použitie blokujúcej monoklonálnej protilátky proti VLA-1 na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie zápalových ochorení Download PDF

Info

Publication number
SK17232001A3
SK17232001A3 SK1723-2001A SK17232001A SK17232001A3 SK 17232001 A3 SK17232001 A3 SK 17232001A3 SK 17232001 A SK17232001 A SK 17232001A SK 17232001 A3 SK17232001 A3 SK 17232001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
monoclonal antibodies
integrin
mice
human
Prior art date
Application number
SK1723-2001A
Other languages
English (en)
Inventor
Fougerolles Antonin De
Philip Gotwals
Roy Lobb
Victor Koteliansky
Original Assignee
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen, Inc. filed Critical Biogen, Inc.
Publication of SK17232001A3 publication Critical patent/SK17232001A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Description

Použitie blokujúcej monoklonálnej protilátky proti VLA-1 na
výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie zápalových ochorení
Oblasť techniky
Vynález sa týka liečenia zápalových procesov, konkrétne
artritídy (zápalového ochorenia kĺbov). Toto liečenie spočíva
v podávaní liečiva obsahujúceho účinné množstvo protilátky blokujúcej integrín αϊβΐ, poprípade obsahujúceho fragment takejto protilátky. K zablokovaniu dochádza tak, že protilátka (alebo jej fragment) sa naviažu na epitop (povrchovú štruktúru integrínu) VLA-1. Epitop VLA-1 je tvorený aminokyselinovými zvyškami 92 až 97 (Val-Gln-Arq-Gly-Gly-Arg).
Protilátka proti integrínu môže byť buď priamo ľudská protilátka, chimérická protilátka, alebo humanizovaná protilátka, prípadne je možné použiť fragment niektorej z týchto protilátok. Môže byť použitá ako monoklonálna, tak aj polyklonálna protilátka .
Vynález sa týka liečenia zápalových ochorení nielen u ludí, ale aj u zvierat.
Doterajší stav techniky
Integríny sú komplexy povrchových bunkových proteínov, ktoré tvoria celú rozsiahlu triedu povrchových molekúl sprostredkovávajúcich adhéziu buniek k sebe navzájom a k ich okoliu. Vzájomná adhézia buniek ako aj adhézia k okoliu je nutná pri celom rade vývojových a fyziologických procesov. Ako príklad možno uviesť tvorbu tkanív a orgánov a udržiavanie ich celistvosti. Jedným z dôležitých fyziologických procesov, v ktorého priebehu hrajú integríny významnú úlohu je aj zápalový proces.
Jedným z kľúčových momentov zápalového procesu je prestupovanie buniek z cievneho riečišťa do okolitého tkaniva a ich pohyb smerom na miesto infekcie. Uplatnenie adhézie pri tomto procese je možné nájsť a opísať v troch krokoch a síce pri iniciačnej fáze, keď sa leukocyty pomaly pohybujú („roiiing) v mieste zápalom postihnutej cievnej výstelky (endotelu), ďalej pri ich pevnom pripojení na cievnu výstelku a nasledujúcim prestupovaní cez cievnu výstelku do zápalom postihnutého tkaniva (Hynes, R.O. 1992 Celí 69: strana 11 až 25; Springer, T.A. 1992 Celí 76: strana 30í až 314). Ďalšou dôležitou súčasťou zápalového procesu, doteraz nie celkom preskúmanou a opísanou, je putovanie buniek imunitného systému z okolitých tkanív smerom na miesto infekcie. Tu nasleduje rozpoznanie telu cudzej látky antigénu, čo spôsobuje aktiváciu týchto obranných buniek, ktoré tým získavajú· schopnosť vykonávať svoju tzv. efektorovú funkciu. V nasledujúcom texte je na modelových príkladoch zápalových ochorení kĺbov (ďalej „artritídy”) u pokusných zvierat ukázaný význam adhezívnych interakcií v medzibunkovom priestore v mieste zápalového procesu, najmä potom na pôsobení adhezívnych molekúl proteínových komplexov - integrínov a ich fragmentov, ktorý je testovaný nezávisle od adhezívnych interakcií pri aktivácii leukocytov,
Opis obrázkov
Obrázok 1: Kolagén viažuce integríny al a α2β1 na aktivovaných leukocytoch.
(A) Expresia integrínov al a α2βί na IL-2-aktivovaných splenocytoch analyzovaná pomocou prietokovej cytometrie (d 11) . Bunky boli označené buď monoklonálnou protilátkou anti-αΐ alebo anti-a2, alebo kontrolnou neviažucou sa monoklonálnou protilátkou (šedé čiary), a následne boli zvýraznené imunoglobulínom proti protilátkam zo škrečka konjugovaným s FITC (fluoresceínizotiokyanát).
(B) Účinok monoklonálnych protilátok proti al a a2 na adhéziu leukocytov na kolagén. 105 IL-2 aktivovaných splenocytov sa inkubovalo s uvedenými monoklonálnymi protilátkami počas 15 minút a potom sa vysialo do jamiek potiahnutých kolagénom typu IV alebo typu I, v ktorých sa bunky inkubovali 1 h pri teplote 37°C. Adhézia sa vypočítala postupom podlá príkladu 1 a vyjadrila v % adhézie vzhladom na bunky ošetrené kontrolnou protilátkou. Tieto testy sa vždy uskutočnili aspoň v troch opakovaniach na jednu mikrotitračnú doštičku a uskutočnili sa aspoň tri nezávislé experimenty. Na obrázku je znázornený výsledok jedného typického experimentu.
Obrázok 2: Účinok monoklonálnych protilátok proti integrinu na efektorovú fázu hypersenzitivity neskorého typu.
Myšiam senzibilizovaným podaním ovčích červených krviniek (SRBC-sheep red blooc cells) sa intraperitcneálne (i.p.) aplikovala uvedená monoklonálne protilátka 1 hodinu pred provokačným očkovaním pomocou ovčích krviniek SRBC. 20 hodín po tomto očkovaní sa zmerala hrúbka labky a výsledky vyjadrené ako percentuálny nárast hrúbky labky ± SEM (stredná chyba), pozri príklad 2. Tieto dáta reprezentujú prehľad ôsmich experimentov, v ktorých bolo n = 79 (fosfátom pufrovaný fyziologický roztok, PBS), n - 68 (kontrolný škrečí Ig) , n = 68 (anti-al), n=29 (anti-a2), n=18 (anti-al + anti-a2), n=45 (anti-a4), n=18 (anti-a5), n=20 (anti-αβ) a n=10 (anti-βΐ). Použili sa nasledujúce monoklonálne protilátky: Ha4/8 (kontrolný škrečí Ig, skupina 2), Ha31/8 (anti-al), Hal/29 (anti-a2), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-a5), GoH3 (anti-a6) a ΗΜβ-1 (anti-βΐ).
Obrázok 3: Účinok monoklonálnych protilátok proti integrínu na efektorovú fázu kontaktnej hypersenzitivity
FITC- senzibilizovaným myšiam sa intraperitoneálne aplikovala uvedená monoklonálna protilátka 4 hodiny pred provokačným očkovaním pomocou FITC. 24 hodín po tomto očkovaní sa zmerala hrúbka základne ušného boltca a výsledky sa vyjadrili ako percentuálny nárast hrúbky ušného boltca ± SEM, pozri príklad 3. Tieto dáta reprezentujú výsledok z deviatich experimentov, v ktorých sa použili nasledujúce počty zvierat: n=74 (PBS), n=60 (kontrolný škrečí Ig), n=26 (anti-ICAM-1), n=44 (anti-al), n=44 (anti-a2), n=38 (anti-al + anti-a2), n=36 (anti-a4), n=16 (anti-a5), n=26 (anti-a4 + anti-a5), n=24 (anti-αβ) a konečne n=22 + (anti-βΐ). V pokuse sa použili nasledujúce škrečie monoklonálne protilátky:Ha4/8 (kontrolný škrečí Ig, skupina 2), Ha31/8 (anti-al), Hal/29 (anti-a2), ΗΜβ-1 (anti-βί) , 3E2 (anti-ICAM-1) a krysie monoklonálne protilátky: R35-95 a R35-38 (kontrolná krysia IgG2a respektíve IgG2b), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-a5) a GoH3 (anti-αβ).
Obrázok 4: Kontaktná hypersenzitívna odozva al-deficientnych myší oproti normálnym myšiam.
FITC- senzibilizovaným myšiam sa intraperitoneálne aplikovala uvedené monoklonálna protilátka 4 hodiny pred provokačným očkovaním pomocou FITC. 24 hodín po tomto očkovaní sa zmerala hrúbka základne ušného boltca a výsledky sa vyjadrili ako percentuálny nárast hrúbky ušného boltca + SEM, pozri príklad
4. V experimente sa použili skupiny po štyroch až piatich myšiach na variant, pričom všetky experimenty sa uskutočnili aspoň trikrát. Je znázornený výsledok jedného typického experimentu.
Obrázok 5: Účinok monoklonálnych protilátok proti al a proti a2 integrínom na nešpecifickú zápalovú reakciu vyvolanú krotónovým olejom hodiny pred potrením ušných boltcov krotónovým olejom sa myšiam intraperitoneálne aplikovala uvedená monoklonálna protilátka. 24 hodín po tomto očkovaní sa zmerala hrúbka základne ušného boltca a výsledky vyjadrili ako percentuálny nárast hrúbky ušného boltca ± SEM, pozri príklad 5. V experimente sa použili skupiny po štyroch až piatich myšiach na variant, pričom všetky experimenty sa uskutočnili aspoň trikrát. Je znázornený výsledok jedného typického experimentu.
Obrázok 6: Účinok monoklonálnych protilátok proti al a proti a2 integrínu na artritídu vyvolanú pomocou monoklonálnej protilátky proti kolagénu
Prvý deň (d 0) sa myšiam intraperitoneálne aplikovala monoklonálna protilátka proti kolagénu a tretí deň sa aplikoval LPS. Myšiam sa ďalej každý tretí deň intraperitoneálne aplikovala uvedená monoklonálna protilátka začínajúc prvým dňom. Klinická artritída bola zjavná na druhý až tretí deň po aplikácii LPS a pokračovala niekolko týždňov. Všetky končatiny boli bodovo ohodnotené na päťstupňovej škále (0-4) každý tretí deň, pozri príklad 6 a výsledky boli vyjadrené ako priemerné artritické skóre medzi dňami d9 a dl5 ( + SEM) na všetkých štyroch končatinách. .Uvedené dáta reprezentujú výsledky zo štyroch experimentov pričom v každom experimente sa použili skupiny po štyroch až piatich myšiach na variant.
Obrázok 7: Aplikácia monoklonálnej protilátky proti al alebo a2 integrínu inhibuje infiltráciu leukocytov do labky v priebehu DTH odozvy
Experiment sa uskutočnil rovnako, ako je opísané na obrázku
2. Labky sa vyrezali 20 hodín po aplikácii antigénu a tkanivové rezy sa zafarbili hematoxylínom a eozínom. Rezy sú z labiek myši buď bez provokačného očkovania (A) alebo myší senzibilizovaných pomocou ovčích krviniek SRBC a potom provokačne očkovaných ďalšou dávkou SRBC (B-H). Myši sa ošetrili hodinu pred provokačným očkovaním buď len PBS (B) , kontrolným škrečím Ig (C, G) , protilátkou anti-αΐ (D), protilátkou anti-a2 (E) alebo kombináciou monoklonálnych protilátok anti-αΐ a anti-a2 (F, H). Zväčšenie: 100 x (A až F), 400 x (G až H).
Obrázok 8: αϊβΐ antigén je exprimovaný na infiltrujúcich leukocytoch v'labke počas DTH odozvy
Imunohistochemické farbenie prenikajúcich leukocytov zo zapálenej labky nevakcinovaného zvieraťa 20 h po expozícii antigénom. (A) . Sériové rezy zafarbené priamo konjugárom kontrolnej monoklonálnej protilátky respektíve protilátky proti al integrínu farbivom Alexa488. (B). Dvojité imunofluorescenčné farbenie konjugátom monoklonálnej protilátky proti al integrínu farbivom Alexa488 a konjugátom monoklonálnej protilátky proti bunkovej línii s fykoerytrínom (PE). Použité monoklonálne protilátky konjugované s PE boli špecifické pre granulocyty/monocytv (anti-CDllb), neutrofily (anti-Ly6G/Gr-l) a T-lymfocyty (anti-CD3). Bolo použité 400-násobné zväčšenie.
Obrázok 9: Účinok monoklonálnej protilátky proti al a a2 integrínu pri artritíde vyvolanej monoklonálnou protilátkou proti kolagénu (A) Preventívne ošetrenie myší monoklonálnymi protilátkami buď proti al alebo a2 integrínu znižuje artritické skóre. Prvý deň sa myšiam aplikovala monoklonálna protilátka proti kolagénu a tretí deň sa aplikoval LPS. Klinická artritída sa objavila
Ί šiesty deň po aplikácii protilátky proti kolagénu (d=6) a potom bola zjavná niekoľko týždňov. Myšiam sa ďalej každý tretí deň intraperitoneálne aplikovala uvedená monoklonálna protilátka začínajúc prvým dňom. Všetky končatiny sa bodovo ohodnotili na päťstupňovej škále (0-4) každý tretí deň a výsledky sa vyjadrili ako priemerné artritické skóre, medzi dňami d9 a dl5 (± SEM) na všetkých štyroch končatinách (maximálne skóre 16) . Uvedené dáta reprezentujú výsledky z 12 experimentov pričom v každom experimente sa použili skupiny po štyroch myšiach na variant. (B) αΐ-deficietne myši majú znížené artritické skóre porovnateľné ' s myšami divého typu ošetrenými monokionálnou protilátkou proti al integrínu. Experimentálne podmienky bolí rovnaké ako v už uvedenom pokuse. Opäť boli použité skupiny po 4 zvieratách na variant, znázornený je priemer z 2 experimentov.
Obrázok 10: Účinok liečby monokionálnou protilátkou proti al integrínu na imunopatológiu artritických kĺbov
Aplikácia monoklonálnej protilátky proti al integrínu zredukuje infiltráciu leukocytov, adhéziu buniek na kĺbový povrch a následné poškodenie chrupavky, ktoré sa prejavuje stratou proteoglykánu. Na obrázkoch sú vyhodnotené zadné končatiny z normálnych (A až D) alebo artritických myší (d8), ktoré dostávali buď kontrolné škrečie Ig (E až H) alebo monoklonálnu protilátku proti al integrínu. (I až L). Končatiny boli vyfotografované (A, E, I), odrezané a tkanivové rezy zafarbené buď hematoxylínom/eozínom (B-C, F-G, J-K) alebo toluidínovou modrou tak, aby sa zafarbil proteoglykán (D, H, L) . Zväčšenie: 16x (obrázky B, F, J); 160x (obrázky C, G, K); 200 x (obrázky D, H, L) .
Obrázok 11: Vývoj artritídy je oneskorený v neprítomnosti lymfocytov a zároveň v neprítomnosti lymfocytov dochádza k inhibícii artritídy pomocou monoklonálnej protilátky proti al integrínu
Bežné myši alebo B6,129 alebo RAG-l-deficientné myši B6, 129 sa ošetrili monoklonálnou protilátkou proti kolagénu v deň 0. Potom nasledovala aplikácia LPS 3. deň. Artritída bola zjavná 6. deň a vydržala niekoľko týždňov. Myšiam sa ďalej každý tretí deň aplikovala uvedená monoklonálna protilátka začínajúc prvým dňom. Všetky končatiny sa bodovo ohodnotili na päťstupňovej škále (0-4), každý tretí deň a výsledky sa vyjadrili ako priemerné artritické skóre medzi dňami d9 a dl5 (± SEM) na pripadajúcu jednu končatinu (maximálne skóre 4). V experimente sa použili skupiny po štyroch myšiach na variant.
Obrázok 12: Dávková citlivosť pri použití monoklonálnej protilátky proti al integrínu na inhibíciu artritídy
Bežné myši Balb/c sa v deň 0 ošetrili monoklonálnou protilátkou proti kolagénu. Potom nasledovala aplikácia LPS 3. deň. Artritída bola zjavná 6. deň a vydržala niekoľko týždňov. Myšiam sa ďalej každý tretí deň, začínajúc prvým dňom i.p. aplikovala uvedená dávka buď kontrolnej monoklonálnej protilátky Ha4/8 rovnakého izotypu alebo protilátky Ha31/8 proti al. Všetky končatiny sa bodovo ohodnotili na päťstupňovej škále (0-4) každý tretí deň a výsledky sa vyjadrili ako priemerné artritické skóre medzi dňami d9 a dl5 (± SEM) na pripadajúcu jednu končatinu (maximálne skóre 4). V experimente sa použili skupiny po štyroch myšiach na variant.
Obrázok 13: Liečba pomocou monoklonálnej protilátky proti al môže znížiť artritické skóre
Bežné myši Balb/c sa v deň 0 ošetrili monoklonálnou protilátkou proti kolagénu. Potom nasledovala aplikácia LPS 3. deň. Artritída bola zjavná 6. deň a vydržala niekoľko týždňov. Myšiam sa ďalej každý tretí deň, začínajúc prvým dňom i.p. podalo 250 μα uvedenej monoklonálnej protilátky alebo 200 μα fúzneho proteinu. Aplikovala sa buď kontrolná monoklonálna protilátka Ha4/8 rovnakého izotypu alebo protilátka Ha31/8 proti al alebo fúzny proteín s imunoglobulínom (ízotypový kontrolný Ig alebo fúzia TNF-R55-Ig) alebo kombinácia oboch (250 μg Ha31/8 a 200 μg TNF-R55-Ig). Všetky končatiny sa bodovo ohodnotili na päťstupňovej škále (0-4) každý tretí deň a výsledky sa vyjadrili ako priemerné artritické skóre medzí dňami d9 a dl5 (± SEM) na pripadajúcu jednu končatinu (maximálne skóre 4). V experimente sa použili skupiny po štyroch myšiach na variant.
Obrázok 14: Lokalizácia epitopu blokujúcej monoklonálnej protilátky proti al I doméne integrínu
A) Aminokyselinové sekvencia krysej (hore) a ludskej (dole) al-I domény. Aminokyselinové zvyšky predstavujúce motív MIDAS (metal ión dependent adhesion site, miesto pre adhéziu závislú od kovových iónov) je znázornené hrubým písmom.
Ľudské aminokyselinové zvyšky, ktorými boli nahradené pôvodné krysie aminokyseliny (RAB.) sú uvedené pod krysou sekvenciou v rámiku. Na lepšie porozumenie sú aminokyselinové zvyšky v ďalšom texte číslované podlá tohto obrázku.
B) Zvyšujúce sa koncentrácie monoklonálnej protilátky AJH10 (ATCC č:_) sa naviazali na doštičku potiahnutú ľudskou (krúžky), krysou (trojuholníky) alebo RAH (štvorce) al-I doménou s koncentráciou 30 μς/ιηΐ. Uvedené údaje vychádzajú z troch experimentov.
Obrázok 15: Aminokyselinové sekvencia ludskej αΐ-ϊ domény
Obrázok 16: Identifikácia blokujúcej monoklonálnej protilátky proti al-I doméne
A) Zvyšujúce sa koncentrácie monoklonálnej protilátky AEF3 (trojuholníky) alebo AJH10 (ATCC č: ) (krúžky) sa naviazali na platne potiahnuté al-I doménou o koncentrácii 30 gg/ml.
B) Al-I doména sa inkubovala so zvyšujúcimi sa koncentráciami monoklonálnej protilátky AJH10 (ATCC č: ) (kosoštvorce) alebo monoklonálne protilátky BGCS (štvorce) a naviazala sa na platne pokryté kolagénom IV (2 pg/ml).
inkubovali so protilátok AEF3 a naviazali sa na
C) K562-al bunky sa koncentráciou monoklonálnych alebo AJH10 (ATCC č:, krúžky) kolagénom IV . (5 pg/ml) . 45-50% doske sa naviazalo na kolagén z troch nezávislých experimentov.
zvyšujúcou sa (troj uholníky) platne pokryté buniek pridaných do jamiek na IV. Uvedené údaje vychádzajú
Obrázok 17: Medzidruhová krížové reaktivita blokujúcich monoklonálnych protilátok
A) Pôsobením detergentu pripravené lyzáty z (1) vaskulárneho hladkého svalu ovce, (2) z ľudských leukemických buniek K562-al alebo (3) purifikovaná ΡΔΗ GST-I doména; (4) krysia GST-alI doména; a (5) ľudská GST-al I doména sa rozdelili na 10 až 20% SDS-PAGE za ' neredukujúcich podmienok. Potom sa uskutočnil imunoblot s blokujúcou monoklonálnou protilátkou AJH10 (ATCC č:
) . Štandardy relatívnej molekulovej hmotnosti sú celkom vľavo; neredukovaný αϊβΐ integrín putuje v oblasti cca 180 kDa, GST-I doména putuje v oblasti cca 45 kDa.
B) Bunky z vaskulárneho hladkého svalu králika sa inkubovali buď s monoklonálnou protilátkou AJH10 (ATCC č: , dole) alebo s kontrolnou myšou IgG (hore) a analyzovali pomocou FACS (fluorescence activated celí sorter, prístroj triediaci bunky pomocou fluorescenčnej značky).
Obrázok 18: αΐ-ΐ doména viaže kolagén
A) Zvyšujúce sa koncentrácie ludskej al-I domény sa naviazali na platne potiahnuté 1 pg/ml kolagénu I (štvorce) alebo kolagénu IV (krúžky). Uvedené hodnoty sa korigovali odpočítaním nešpecifickej väzby v jamkách potiahnutých hovädzím albumínom (BSA).
B) 2 pg/ml ludskej al-I domény sa zmiešalo so zvyšujúcimi sa koncentráciami protilátky SE8D9 proti ľudskému al integrínu (štvorčeky) alebo so zvyšujúcimi sa koncentráciami protilátky A2IIE proti ľudskému integrínu a2 (krúžky) a potom naviazalo na platne potiahnuté 1 pg/ml kolagénu IV.
C) Platne boli 1 μς/ml alebo 3% BSA doména al-I (2 μς/ml) 5 mM EDTA. , Uvedené experimentov.
potiahnuté kolagénom IV s koncentráciou Na potiahnuté platne sa potom pridala v prítomnosti 1 mM Mn2+, 1 mM Mg'” alebo údaje vychádzajú z troch nezávislých
Podstata vynálezu
Vynález opisuje, že protilátka proti integrínu najmä potom proti al podjednotke integrínu, môže zablokovať interakciu leukocytov aktivovaných v priebehu zápalu, so zložkami medzibunkového prostredia ako sú okrem iného kolagén, laminín a fibronektín. Možno predpokladať, že použitím protilátky proti integrínu a teda zamedzením interakcie integrínu a jeho poajednotky s okolitou medzibunkovou hmotou sa znižuje výskyt zápal podporujúcich cytokínov.
Protilátky blokujúce integríny a ich fragmenty môžu rovnako tlmiť efektorovú fázu zápalových procesov pôsobením na úrovni antigénšpecifických T lymfocytov. Ďalej sa uvažuje, že proti12 látky blokujúce integríny (a ich fragmenty) môžu zabraňovať migrácii buniek tkanivami a/alebo zabraňovať aktivácii buniek v okolitých tkanivách.
Vynález opisuje význam, ktorý majú adhezívne molekuly zo skupiny integrínov, zvlášť integrín αϊβΐ, v periférnych tkanivách v priebehu zápalového procesu. Vynález ďalej opisuje významnú úlohu integrínov a ich fragmentov nie len v procese pripájania leukocytov na cievnu výstelku a prestupovaním touto výstelkou, ale najmä podčiarkuje ich význam v okolitých tkanivách v priebehu zápalového procesu a privádza pozornosť práve na okolité tkanivá ako na možné prostredie aplikácie terapií založených na ovplyvnení adhézie.
Vynález opisuje použitie protilátok blokujúcich integríny, v ktorých štruktúre je obsiahnutý β reťazec, okrem iného napríklad reťazce βΐ, β2, β5, β4, β5, β6, β“, βδ, viazané nekovalentnou väzbou na a reťazec, okrem iného napríklad na reťazec al, a2, a3, a4, a5, αβ, a7, αδ, a9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Ako príklad cieľových integrínov vhodných na použitie protilátky podľa vynálezu je možné uviesť okrem iného napríklad integríny:
αϊβΐ, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, α6β1, α7βΐ, αδβΐ, α9β1, αΙΟβΙ, ανβΐ, αίβΐ, αΜβΙ, αΧβΙ, αϋβΐ, αΐ^βΐ, αΕβΙ;
α1β2, α2β2, α3β2, α4β2, α5β2, α6β2, α7β2, α8β2, α9β2, α10β2, ανβ2, αΣβ2, αΜβ2, αΧβ2, αϋβ2, αΙΙΡβ2, αΕβ2;
α1β3, α2β3, α3β3, α4β3, α5β3, α6β3, α7β3, α8β3, α9β3, α10β3, ανβ3, αΕβ3, αΜβ3, αΧβ3, αϋβ3, αΙ1^β3, αΕβ3;
α1β4, α2β4, α3β4, α4β4, α5β4, αββ4, α7β4, α8β4, α9β4, α10β4, ανβ4, αΣβ4, αΜβ4, αΧβ4, αΩβ4, αΙΙόβ4, αΕβ4;
α1β5, α2β5, α3β5, α4β5, α5β5, α6β5, α7β5, α8β5, α9β5, α10β5, ανβ5, αΕβ5, αΜβ5, αΧβ5, αϋβ5, αΙΙόβδ, αΕβ5;
α1β6, α2β6, α3β6, α4β6, α5β6, α6β6, α7β6, α8β6, α9β6, αΙΟββ, ανββ, αΣββ, αΜβ6, αΧββ, αϋβ6, αΙΙόβ6, αΕβδ;
α1β7, α2β7, α3β7, α4β7, α5β7, α6β7, α7β7, α8β7, α9β7, α10β7, ανβ7, αΣβ7, αΜβ7, αΧβ7, αϋβ7, αΙΙΕβ7, αΕβ7;
α1β8, α2βδ, α3β8, α4β8, α5β8, α6β8, α7β8, α8β8, α9β8, αΙΟβδ, ανβ8, αΣβδ, αΜβ8, αΧβδ, αθβ8, αΙΙόβδ, αΕβ8;
Vynález ďalej opisuje použitie protilátok proti integrínovým fragmentom, vrátane protilátok napríklad proti samotnému β reťazcu ako sú napríklad (okrem iného) protilátky proti βΐ, β2, β3, β4, β5, βό, β7, β8 reťazcu alebo protilátky iba proti reťazcu a ako napríklad (ale nielen) proti reťazcom al, a2, a3, a4, a5 a6, a7, a8, a9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Ďalej sa počíta s použitím protilátok na integrínové fragmenty, ako je napríklad protilátka na samotnú I doménu reťazca a, napríklad I doménu αϊβΐ (Briesewitz a ďalší, 1993 J. Biol. Chem. 268: strana 2989); α2β1 (Takada a Hemler, 1989 J. Celí. Biol. 109: strana 397), αΕβ2 (Larson a ďalší, 1989 J. Celí. Biol. 108: strana 703), αΜβ2 (Corbi a ďalší; 1988 J. Biol. Chem. 263: strana 12403), αΧβ2 (Corbi a ďalší, 1987 EMBO J. 6: strana 4023), αϋβ2 (Grayson a ďalší, 1988 J. Exp. Med. 188: strana 2187), αΕβ7 (Shaw a ďalší, 1994 J. Biol. Chem. 269: strana 6016). Vo výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje antigénny determinant al-I domény kontinuálny úsek 6 aminokyselín, pričom sa tento kontinuálny úsek vyskytuje rovnako v sekvencií na obrázku 15. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je touto súvislou sekvenciou sekvencia
Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg.
Spôsob prípravy integrínov na účely vynálezu sú známe zo stavu techniky, pozri napríklad Springer a ďalší 1990. Náture 346: strana 425 až 434.
Vynález ďalej opisuje monoklonálne a polyklonálne protilátky proti integrínom. Výhodným uskutočnením vynálezu je monoklonálna protilátka, napríklad monoklonálna protilátka proti al podjednotke integrínu.
Protilátka blokujúca integrín αϊβΐ podľa vynálezu predstavuje protilátku, ktorá sa viaže na al-I doménu tohto integrínu a to výhodne na aminokyselinové zvyšky 92 až 97 podľa sekvencie uvedenej na obrázku 15 a blokuje tak jej funkciu. Takto napríklad dochádza k inhibícii K526-al dependentnou adhéziou na kolagén typu IV (pozri príklad 15).
Výhodné protilátky podľa vynálezu a ich homológy určené na humánnu liečbu zahŕňajú napríklad ľudské homológy protilátok z iných druhov a ich humanizované, chimérické homológy, protilátkové fragmenty Fab, Fab', F(ab')2 a F (v) a monoméry a diméry ťažkých alebo ľahkých reťazcov protilátok, prípadne ich kombinácia. Monoklonálne protilátky proti molekule integrínu a proti jej fragmentom sú najdôležitejšou a najvýhodnejšou väzbovou látkou v spôsoboch podľa vynálezu.
Termínom „homológ protilátky sa rozumie intaktná protilátka skladajúca sa z ťažkých a ľahkých imunoglobulínových reťazcov spojených disulfidovou väzbou. Týmto termínom sa rovnako rozumie proteín obsahujúci jeden alebo viac polypeptidových reťazcov zložený z ľahkých alebo ťažkých imunoglobulínových reťazcov a ich fragmentov, ktoré majú schopnosť viazať sa na najmenej jeden antigén (to znamená na integrínovú doménu obsahujúcu al, a2, a6 alebo a-I podjednotku). Jednotlivé polypeptidy protilátkového homológu, ktorý sa skladá z viac ako jedného polypeptidu, môžu byť spolu viazané buď disulfidovou väzbou alebo môžu byť akokoľvek kovalentne prepojené.
Z toho vyplýva, že termín „homológy protilátky zahŕňa intaktné imunoglobulíny typu IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (ako aj ich podtypy), obsahujúce ľahké reťazce typu kapa alebo lambda.
Termínom „homológy protilátok sa tiež rozumejú časti majú zachovanú schopnosť napríklad Fab fragmenty, intaktných protilátok, špecifickej väzby na ktoré antigén,
Fab'fragmenty, F(ab')2 fragmenty, F(v) fragmenty, monoméry či diméry ťažkých reťazcov, monoméry či diméry ľahkých reťazcov, atď. Na použitie podľa vynálezu sú teda vhodné akékolvek fragmenty schopné viazať antigén, ako aj polypeptidy celej dĺžky (full-lenght) ' odvodené od uvedených protilátok a ich diméry alebo triméry.
Termínom „humanizovaný homológ protilátky” sa rozumie homológ protilátky, pripravený metódami génového inžinierstva, v ktorom je jedna alebo viac z aminokyselín ľahkého alebo ťažkého imunoglobulínového reťazca, ktoré na seba naviažu antigén, nahradená zodpovedajúcou aminokyselinou ľahkého alebo ťažkého imunoglobulínového reťazca z protilátky iného cicavčieho druhu.
Termínom „chimérický homológ protilátky sa rozumie protilátkový homológ, pripravený metódami génového inžinierstva, v ktorom je pántová oblasť (hinge región) alebo jej časť alebo konštantná oblasť alebo jej časť ľahkého alebo ťažkého imunoglobulínového reťazca, prípadne oboch, nahradené zodpovedajúcou časťou iného ľahkého alebo ťažkého imunoglobulínového reťazca.
Vynález ďalej opisuje variant chimérickej molekuly, ktorá obsahuje nasledujúce súčasti: (1) zložku so schopnosťou naviazať sa na integrín; (2) tá môže byť niekedy doplnená o peptid, ktorý zvyšuje rozpustnosť tejto zložky alebo jej životnosť v živom organizme; môže to byť napríklad niektorý zo širokej skupiny imunoglobulínov alebo ich fragmentov a častí, časť alebo fragment imunoglobulínu IgG, napríklad pevná oblasť ťažkého reťazca ludského IgG alebo napríklad CH2 a CH3 segment pántovej oblasti; (3) toxínovú zložku. Chimérická molekula podľa vynálezu sa môže použiť pri liečbe porúch, ktoré súvisia s proliferáciou epitelových buniek, ako sú napríklad vlasové folikuly.
Ďalej sa v texte stretneme s termínom „homológ ľudskej protilátky, ktorým sa rozumie homológ protilátky pripravený pomocou techník génového inžinierstva, v ktorom sú všetky aminokyseliny jedného z imunoglobulínových reťazcov (ľahkého alebo ťažkého) nahradené príslušnou časťou získanou z ludského zdroja.
„Zápalovými ochoreniami sa rozumie predovšetkým kožné ochorenie ako sú lupienka, ekzémy, popáleniny a zápaly kože. Spôsoby podlá vynálezu zahŕňajú rovnako liečbu iných ochorení ako je napríklad astma, zápaly priedušiek, menštruačné kŕče, zápaly šliach. Spôsoby podľa vynálezu sa ďalej dajú využiť ako úlava od bolesti rôzneho pôvodu a ako antipyretikum pri výskyte horúčok. Ďalej vynález opisuje liečbu gastrointestinálnych ochorení ako sú zápalové ochorenia čriev, Crohnov syndróm, zápal žalúdka, dráždivý syndróm čreva a vredové ochorenie hrubého čreva a ďalej preventívne opatrenia pri podozrení na vznik nádorového ochorenia hrubého čreva a konečníka. Ďalšou skupinou, ktorá indikuje použitie spôsobu podľa vynálezu sú zápalové ochorenia ciev, migrenózne stavy, tyreoyditída, zápal štítnej žlazy, aplastická anémia, Hodgkinova choroba, reumatická horúčka, cukrovka I. typu, myasténia gravis, roztrúsená skleróza, sarkoidóza, nefrotický syndróm, Behcetov syndróm, polymyozitída, zápal ďasien, zvýšená citlivosť, zápal spojiviek, opuchnutia po zraneniach, ischémia srdcového svalu, atď. V neposlednom rade vynález opisuje liečbu alergickej nádchy, problémov s dýchaním, anafylaktického šoku a aterosklerózy.
Vo výhodnom uskutočnení je vynález použitý pri liečbe zápalového ochorenia kĺbu, vrátane napríklad reumatoidnej artritídy a osteoartritídy.
Za účinnú dávku sa považuje také množstvo preparátu, ktoré má preukázateľne zlepšujúci účinok, prípadne množstvo, ktorého účinkom sa dosiahnu požadované klinické výsledky. Účinné množstvo preparátu je možné podať naraz alebo v niekolkých dávkach. V terminológii liečby zápalového ochorenia nazývame „účinným množstvom preparátu také množstvo, ktoré zmierni, zlepší, stabilizuje, zvráti, spomalí postup zápalového procesu, všetko v súlade s klinicky akceptovateľnými štandardmi pre liečené ochorenia, alebo štandardy na kozmetické účely. Detekcia a meranie účinnosti liečby sa uskutočňuje bežne dostupnými diagnostickými prostriedkami ako je krvný rozbor, testovanie funkcie dýchacieho aparátu, rôntgen hrudníka, CT tomografia, bronchoskopia, bronchoalveolárny výplach, pľúcna biopsia a CT snímkovanie.
Spôsoby prípravy monoklonálnych protilátok, vrátane napríklad monoklonálnych protilátok proti integrínom, sú dobre známe zo stavu techniky, pozri napríklad Mendrik a ďalší, 1955, Lab. Invest. 72: strana 367 až 375 (monoklonálnej protilátky proti myším αϊβΐ a proti α2β1 integrínom); Sonnenberg a ďalší, 1987, J. Biol. Chem. 262: strana 10376 až 10383 (monoklonálne protilátky proti myším αββΐ integrínom); Yao a ďalší, 1996, J. Celí. Sci. 1996, 109: strana 3139 až 3150 (monoklonálne protilátky proti myším α7β1 integrínom); Hemler a ďalší, 1984, J. Immuncl. 132: strana 3011 až 3018 (monoklonálne protilátky proti myším αϊβΐ integrínom); Pischel a ďalší, 1987, J. Immunol. 138: strana 226 až 233 (monoklonálne protilátky proti myším α.2β1 integrínom); Wayner a ďalší, 1988, J. Celí. Biol. 107: strana 1881 až 1891 (monoklonálne protilátky proti myším α3β1 integrinom); Hemler a ďalší, 1987, J. Biol. Chem. 262: strana 11478 až 11485 (monoklonále protilátky proti ľudským α4β1 integrinom); Wayner a ďalší, 1988, J. Celí. (monoklonálne protilátky
107: strana 1881 až 1891 ľudskými α5β! integrinom);
Biol.
proti
Sonnenberg a ďalší, 1987, J. Biol. Chem. 262: strana 10376 až 10383 (monoklonálne protilátky proti ľudským α6β1 integrinom); Wang a ďalší, 1996, Am. J. Respir. Celí Mol. Biol. 15: strana 664 až 672 (monoklonálne protilátky proti ľudským α9β1 integrinom); Davies a ďalší, 1989, J. Celí. Biol. 109: strana 1817 až 1826 (monoklonálne protilátky proti ľudským aV βΐ integrinom); Sanchez-Madrid a ďalší, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: strana 7489 až 74 93 (monoklonálne protilátky proti ľudským αΣβ2 integrinom); Diamond a ďalší, 1993, J. Celí Biol. 120: strana 1031 až 1043 (monoklonálne protilátky proti ľudským αΜβ2 integrinom); Stacker a ďalší, 1991, J. Immunol. 146: strana 648 až 655 (monoklonálne protilátky proti ľudským αΧβ2 integrinom); Van der Vieren a ďalší, 1995, Immunity 3: strana 683 až 690 (monoklonálne protilátky proti ľudským αϋβ2 integrinom); Bennet a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80: strana 2417 až 2421 (monoklonálne protilátky proti αΙ^β3 integrinom); Hessle a ďalší, 1984, Differentiation 26: strana 49 až 54 (monoklonálne protilátky proti ľudským α6β4 integrinom); Weinacker a ďalší, 1994, J. Biol. Chem. 269: strana 6940 až 6948 (monoklonálne protilátky proti ľudským ανβ5 integrinom)
Weinacker a ďalší, 1994, J. Biol Chem 269: strana 6940 až 6948 (monoklonálne protilátky proti ľudským ανβ6 integrinom) ; Cerf-Bensussan a ďalší, 1992 Eur. J. Immunol. 22: strana 273 až 277 (monoklonálne protilátky proti ľudským αΕβ7 integrinom); Nishimura a ďalší, 1994, J. Biol. Chem. 269: strana 28708 až 28715 (monoklonálne protilátky proti ľudským ανβ8 integrinom); Bossy a ďalší, 1991, EMBO J. 10: strana 2375 až 2385 (polyklonálne antisérum proti ľudským αδβΐ integrínom); Camper a ďalší, 1998, J. Biol. Chem. 273: strana 20383 až 20389 (polyklonálne antisérum proti ľudským αΙΟβΙ integrínom).
Uskutočňuje sa fúzia nesmrteľnej bunkovej línie (typickým príkladom sú bunky myelómu) s lymfocytmi (typickým príkladom sú slezinné bunky pokusného zvieraťa - cicavca, ktorý bol predtým imunizovaný celými bunkami obsahujúcimi daný antigén, v našom prípade integrín). Následne sa uskutočňuje testovanie vypestovanej hybridnej kultúry a sleduje sa výskyt protilátok naviazaných na antigény hybridných buniek (pozri Kohler a ďalší, 1975, Náture 265: strana 295 až 497, „Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity).
Imunizáciu je možné uskutočňovať štandardnými postupmi. Jednotkové dávka a imunizačný režim závisí na druhu imunizovaného cicavca, stavu jeho imunity, telesnej hmotnosti atď. Väčšinou je imunizovaným zvieratám odoberaná krv a je uskutočňovaná kvantitatívna analýza odobratých krvných vzoriek. Príkladom je testovanie prítomnosti protilátok proti integrínom, keď sa využíva imunoprecipitácia lyzátov z integrín exprimujúcich buniek označených pomocou I.
Prítomnosť protilátok, ako sú napríklad protilátky proti integrínu môže byť tiež zisťovaná prietokovou cytometriou, t.j. meraním fluorescencie buniek exprimujúcich antigén, inkubovaných s testovanou protilátkou proti tomuto antigénu, v našom prípade integrínu. Lymfocyty, ktoré sa používajú na prípravu hybridómov, sa spravidla izolujú z imunizovaných cicavcov, v ktorých sére sa opísanými skríningovými metódami dokázala prítomnosť protilátok proti integrínu.
Na izoláciu nesmrteľnej bunkovej línie (napr. línie buniek myelómu) sa spravidla používa rovnaký zvierací druh (cicavčí), ako na izoláciu lymfocytov. Pri výbere nesmrteľnej bunkovej línie sa uprednostňujú myelómové bunkové línie myší, ktoré sú citlivé na kultivačné médium obsahujúce hypoxantín, arninopterín a tymidín (médium HAT). Najčastejšie sa uskutočňuje fúzia tak, že sa HAT senzitívne myšie myelómové bunky spoja s myšími splenocytmi pomocou polyetylénglykolu s molekulovou hmotnosťou 1500 („PEG 1500). Vzniknuté hybridómy sú následne triedené pomocou HAT média, ktoré ničí nefúzované a nesprávne fúzované myelómové bunky (nefúzované splenocyty po niekoľkých dňoch hynú, pretože bez transformácie nie sú nesmrteľné). Hybridómy produkujúce dané protilátky sú identifikované na základe prítomnosti požadovaných protilátok v supernatante kultivačného média. Tak napríklad prítomnosť protilátok proti integrínom v supernatante kultivačného média z jednotlivých hybridómov, môže byť testovaná pomocou rekombinantných bunkových línií exprimujúcich integrín.
Tie hybridómy, ktoré sa opísanými skríningovými metódami pozitívne testovali ako produkujúce požadované protilátky alebo napríklad homológy protilátok proti integrínom, sa potom kultivujú v takom živnom médiu a v čase a za takých podmienok, ktoré sú nutné na sekréciu monoklonálnych protilátok do daného kultivačného média. Spôsoby kultivácie tkanivových kultúr a zodpovedajúce živné média sú dobre známe zo stavu techniky. Supernatanty z hybridómov sa môžu následne odobrať a protilátky proti integrínom ďalej purifikovať pomocou známych techník.
Iným spôsobom získania monoklonálnych protilátok je injekcia buniek hybridómov do peritoneálnej dutiny neimunizovanej myši. Tu dochádza k proliferácii hybridómových buniek a k následnej sekrécii protilátok a ich hromadeniu v podobe ascitickej tekutiny. Protilátky sa potom odoberajú opäť pomocou injekčnej striekačky .
Ďalšou skupinou protilátkových homológov podľa vynálezu používaných ako „väzobné látky, schopné blokovať integríny, sú homológy čisto humánnych protilátok. Tieto protilátky je možné pripraviť in vitro z ľudských splenocytov, ako je opísané napríklad v práci Boerner a ďalší, 1991, J. Immunol. 147: strana 86 až 95, „Production of Antigen-specific Human Monoclonal
Antibodies from In Vitro-Primed Human Splenocytes.
Alternatívnym spôsobom prípravy týchto „homológov čisto humánnych protilátok je „repertoárové klonovanie, opísané v práci Persson a ďalší, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: strana 2432 až 2436, „Generation of diverse high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning a v práci Huang a Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: strana 227 až 236, „Construction of representative immunoglobulin variable región cDNA libraries from human peripheral blood lymphocytes without in vitro stimulation. V americkom patente č. 5, 798, 230 „Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use (Spôsob prípravy monoklonálnych protilátok a ich použitie, vydaný 25. augusta 1998) je opísaná príprava ľudských monoklonálnych protilátok z ľudských B-lymfocytov. V tomto spôsobe sú ludské B-lymfocyty produkujúce protilátky imortalizované infekciou vírusom Epsteina a Barrovej (EBV) alebo jeho derivátom, ktorý exprimuje EBV nukleárny antigén 2 (EBNA 2). Pôsobenie antigénu EBNA2, ktoré je podmienkou procesu imortalizácie je následne prerušené, čím dôjde k zvýšeniu produkcie protilátky.
V inom spôsobe prípravy čisto humánnych protilátok, opísanom v americkom patente č. „Transgenetic non-human (vydaný 4. augusta, 1998) for producing heterologous
5,789,650 animals antibodies) je opísaná schopnosť transgénnych zvierat produkovať heterológne protilátky a možnosť inaktivácie ich vlastných génov kódujúcich imunoglobulíny. Gény kódujúce imunoglobulíny sú potlačené príslušnými antisense polynukleotidmi a/alebo pomocou antiséra proti týmto ednogénnym imunoglobulínom. Heterológne protilátky sú kódované génmi, ktoré nie sú normálne obsiahnuté v genóme týchto živočíchov.
Jeden alebo viac transgénov obsahujúcich sekvencie nepreskupených heterológnych ľudských ťažkých imunoglobulínových reťazcov je vpravený do tela iného živočícha. Vznikne tak transgénny živočích, schopný funkčného preskupenia imunoglobulínových sekvencií a produkcie repertoáru protilátok rôznych izotypov, kódovaných ľudskými génmi pre imunoglobulíny. Tieto heterológne humánne protilátky sú produkované B-lymfocytmi, ktoré sú následne imortalizované, t.j. fúzované s nesmrteľnou bunkovou líniou, napríklad s bunkami myelómu, alebo pomocou iných techník, umožňujúcich neobmedzenú produkciu heterológnych monoklonálnych, čisto humánnych protilátkových homológov.
Ďalšou výhodnou väzbovou látkou, ktorá môže blokovať integrínové antigény alebo ich fragmenty v spôsobe podľa vynálezu sú humanizované homológy protilátok, ktoré majú schopnosť viazať sa na integriny alebo ich fragmenty. Okrem raných spôsobov prípravy chimérických protilátok bol opísaný aj nový spôsob ich prípravy Winterom a ďalšími v patente EP 0239400. V tomto spôsobe sú komplementaritu určujúce oblasti (CDRs) protilátky jedného druhu nahradené zodpovedajúcimi oblasťami iného druhu. Tento spôsob môže byť napríklad použitý na nahradenie CDR z variabilných domén ľudského ťažkého a ľahkého reťazca Ig za inú CDR z myších variabilných domén. Tieto pozmenené variabilné oblasti imunoglobulínov môžu byť postupne ďalej spojené s ľudskými konštantnými oblasťami za vzniku protilátky, ktorá takmer úplne zodpovedá svojim ľudským protilátkam s výnimkou substituovaných myších CDR. Vzhľadom k tomu, že tieto protilátky s prenesenými CDR oblasťami obsahujú podstatne menší podiel z iného druhu, predpokladá sa pri nich pri použití v humánnej medicíne nižšia pravdepodobnosť vyvolania zamietavej imunitnej odpovede oproti chimérickým protilátkam. Spôsob humanizácie monoklonálnych protilátok pomocou „štepovania CDR oblasti (CDR-grafting) bol nazvaný pretváranie protilátok (reshaping), (pozri Riechmann a ďalší, 1988 Náture 332: strana
323 až 327, „Reshaping human antibodies for therapy; Verhoeyen a ďalší, 1988, Science 239: strana 1534 až 1536, „Reshaping of human antibodies using CDR-grafting in Monoclonal Antibodies.
V opísanom spôsobe sa typicky prenesú na zodpovedajúcu oblasť v ľudskej protilátke komplementaritu určujúce oblasti (CDR) myšej protilátky. Oblasti CDR sú v použitej myšej protilátke zodpovedané za špecifickú väzbu antigénu a je ich spolu 6 (tri v ťažkom reťazci a tri v ľahkom reťazci protilátky) . Prenesenie oblasti CDR sa uskutočňuje pomocou techník genetického inžinierstva, pričom sekvencia DNA kódujúca CDR oblasti je určená kolonovaním génových segmentov variabilnej oblasti (V) myšieho ťažkého a lahkého reťazca. V ďalšom kroku sa takto zistené sekvencie DNA cielenou mutagenézou prenesú do zodpovedajúcich génových segmentov v ľudských variabilných oblastiach. V poslednej fáze sa na gény humanizovaného ťažkého a ľahkého reťazca pripoja génové segmenty ľudskej konštantnej oblasti požadovaného izotypu (obvykle gama I pre Ch a kapa pre CL) a výsledné ľahké a ťažké reťazce sa spoločne exprimujú v cicavčích bunkách za vzniku rozpustnej humanizovanej protilátky.
Prenos myších CDR oblastí na ludskú protilátku dáva tejto protilátke antigén-väzbové vlastnosti pôvodnej myšej protilátky. Šesť CDR slučiek v myšej protilátke sa udržiava v správnej priestorovej orientácii pomocou časti variabilných oblastí známych ako úseky základnej štruktúry („framework región). Štepovanie CDR-oblasti je spravidla úspešné vďaka tomu, že úseky základnej štruktúry myší a ludskej protilátky môžu mať veľmi podobné priestorové usporiadanie s podobnými miestami, na ktorých sú pripojené CDR oblasti, takže zámena CDR oblasti nevedie k zásadnej zmene ich priestorovej štruktúry. Znamená to, že v princípe je možné uvedeným spôsobom pripraviť humanizované homológy monoklonálnych protilátok, ako opisujú napríklad Jones a ďalší, 1986, Náture 321: strana 522 až 525 „Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse; Riechmann, 1988, Náture 332: strana 323 až 327, „Reshaping human antibodies for therapy; Queen a ďalší., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: strana 10029, „A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor” a Orlandi a ďalší, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: strana 3833 „Cloning Immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction.
Predpokladá sa, že určité aminokyseliny v úsekoch základnej štruktúry protilátky interagujú s CDR oblasťami a ovplyvňujú celkovú väzbovú afinitu k antigénu. Priamy prenos CDR oblasti z myšej protilátky do humanizovanéj protilátky bez akýchkoľvek úprav ľudských variabilných oblastí často vedie k čiastočnej alebo úplnej strate väzbovej afinity. Mnohokrát sa ukázalo, že zmeny aminokyselinových zvyškov v úsekoch základnej štruktúry (framework) akceptorovej protilátky môžu byť kritické na zachovanie väzbovej aktivity.
Queen a ďalší, 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: strana 10029 až 10033, „A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor” a dokument WO 90/07861 (Proteín Design Labs Inc) opisujú prípravu humanizovanéj protilátky obsahujúcej zmenené aminokyselinové zvyšky v úsekoch základnej štruktúry akceptorovej protilátky kombinovaním CDR oblastí myšej monoklonálnej protilátky (anti-Tac) s rámcom ľudskej protilátky s ľudskou konštantnou oblasťou. Demonštrujú tu jedno riešenie problému straty väzbovej afinity, ku ktorej často dochádza pri priamej transplantácii CDR oblastí bez akéhokoľvek uspôsobenia akceptorového miesta v ľudskej V oblasti. Ich riešenie zhŕňa dva kľúčové kroky. V prvom kroku sa pomocou počítačovej analýzy vyberú také ľudské úseky základnej štruktúry variabilnej oblasti, ktoré vykazujú optimálnu sekvenčnú homológiu s variabilnými oblasťami pôvodnej myšej protilátky, v uvedenom prípade s monoklonálnou protilátkou proti Tac. V druhom kroku sa vytvorí počítačový model terciárnej štruktúry myších V oblastí a určia sa aminokyselinové zvyšky v úseku základnej štruktúry, ktoré sa pravdepodobne podieľajú na interakcii s CDR oblasťami. Tieto aminokyselinové zvyšky sa potom superponujú do štruktúry ludskej protilátky. Tento prístup využitia homologických ľudských úsekov základnej štruktúry s pravdepodobnými kontaktmi s myšími CDR oblasťami viedol k úspešnému humanizovaniu protilátky s podobnými väzbovými afinitami, ako mala pôvodná myšia protilátka, t.j. k vzniku protilátky špecifickej na receptor pre interieukín 2 (Queen a ďalší., 1989 (pozri vyššie) a ďalej k vzniku protilátky špecifickej pre herpes simplex vírus (HSV) (Co a ďalší., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: strana 2869 až 2873, „Humanised antibodies for antiviral therapy).
Na základe už opísaného dvojstupňového postupu opísaného v dokumente WO 90/07861, navrhli Queen (a ďalší) niekoľko kritérií na humanizáciu protilátok. Prvým kritériom je, že sa použije taká ľudská akceptorová variabilná oblasť z konkrétnej ludskej protilátky, ktorá je obvykle homologická s dor.orovou protilátkou z iného druhu určenou na humanizáciu, alebo sa použije consensus úsek základnej štruktúry odvodený od väčšieho počtu ľudských protilátok. Druhým kritériom je, že v prípade, keď je zvyšok na akceptorovej ludskej protilátke neobvyklý a zvyšok na donorovej naopak typický pre ľudskú sekvenciu v danom mieste variabilnej oblasti sa použije aminokyselinový zvyšok z donorovej protilátky skôr než z akceptorovej. Tretím kritériom je, že sa v pozíciách priamo priliehajúcich na CDR oblasti použijú aminokyselinové zvyšky z donorového úseku základnej štruktúry variabilnej oblasti miesto zvyškov akceptorovej variabilnej oblasti.
Je možné tiež použiť odlišný prístup (pozri Tempest, 1991, Biotechnology 9: strana 266 až 271, „Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respirátory syncytial virus infection in vivo), v ktorom sa na štepovaní CDR oblasti štandardne používajú úseky základnej štruktúry variabilnej oblasti odvodenej od ťažkého a ľahkého reťazca NEWM respektíve REI bez rozsiahlejšieho pridávania myších aminokyselinových zvyškov do výslednej protilátky. Výhodou použitia spôsobu podľa Tempesta a ďalších (1991) založeného na konštruovaní humanizovaných protilátok odvodených od NEWM a REI je, že na základe rôntgenovej kryštalografie sa vyriešila priestorová 3-rozmerná štruktúra variabilných oblasti NEWM a REI a môžu sa tak modelovať špecifické vzájomné interakcie medzi aminokyselinovými zvyškami CDR oblasti a variabilných oblastí.
Vynález je účinný na liečenie ludí aj zvierat, ktoré trpia uvedenými chorobami. Medzi zvieratá, na ktorých je možné použiť spôsob liečby· podľa vynálezu patria domáce zvieratá a dobytok, ktoré sú chované ako na domáce potešenie, tak aj na komerčné účely. Ide napríklad o psy, mačky, hovädzí dobytok, kone, ovce, prasatá a kozy.
V spôsobe pódia vynálezu môžu byť protilátky vrátane napríklad protilátky anti-VLA-1, podávané parenterálne. Termínom parenterálne podanie sa rozumie subkutánne, intravenózne, intramuskulárne, intraartikulárne, intrasynoviálne, intrasternálne, intratekálne, intrahepatické, intraléziové a intrakraniálne injekcie alebo infúzie.
Farmaceutické kompozície podlá vynálezu obsahujú akúkoľvek zlúčeninu podľa vynálezu, alebo jej farmaceutický prijateľný derivát spolu s ľubovoľným farmaceutický prijateľným nosičom. Termínom „nosič sa rozumejú známe a prijateľné látky zvyšujúce účinok antigénu (adjuvans) a prísady (vehikulá).
Farmaceutické kompozície podlá vynálezu môžu mať formu sterilného prípravku vhodného na injekčnú aplikáciu, napríklad sterilné injekčné vodné alebo olejovité suspenzie. Táto suspenzia môže byť pripravená spôsobmi známymi zo stavu techniky s použi27 tím vhodných disperzných, prostriedkov, zmáčacích a suspenzných činidiel.
Farmaceutické kompozície podlá vynálezu môžu byť podané rovnako orálne. Pri orálnej aplikácii môžu byť podávané v ľubovoľnom prijateľnom dávkovaní a forme, okrem iného napríklad vo forme toboliek, tabliet, vodnej suspenzie alebo roztoku.
Na miestnu aplikáciu môžu mať farmaceutické kompozície podlá vynálezu formu masti obsahujúcej účinnú zložku suspendovanú alebo rozpustenú v jednom alebo viacerých nosičoch.
Farmaceutické kompozície podľa vynálezu môžu byť tiež podávané ako nosový aerosól alebo inhalačné pomocou rozprašovača, inhalačné vo forme suchého prášku alebo pomocou inhalátora s dávkovačom.
stavu, ktorý je liečený, a rozhodnutie ošetrujúceho
Efektívne dávkovanie dostatočné na vyvolanie žiaducich účinkov respektíve intenzita dávky zlúčenín podľa vynálezu, závisí od rôznych faktorov, ako je napríklad druh inhibítora, telesnej hmotnosti pacienta, ciel liečby, povaha patologického použitá farmaceutická kompozícia lekára. Je vhodné dávkovanie v rozmedzí medzi 0,001 až 100 mg účinnej látky na 1 kg telesnej hmotnosti a deň, výhodné je dávkovanie medzi 0,1 až 50 mg/kg telesnej hmotnosti a deň. V najvýhodnejšom uskutočnení budú homológy protilátok podávané v dávke medzi 0,1 mg/kg telesnej hmotnosti a deň a 20 mg/kg telesnej hmotnosti a deň, a ešte výhodnejšie v rozmedzí od 0,1 mg/kg až 10 mg/kg telesnej hmotnosti a deň a v intervaloch po v rozmedzí 1 až 14 dní. V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka podávaná v dávke asi 0,3 až 1 mg/kg. Pričom je podávaná intraperitoneálne. _ V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátka podávaná v dávke asi 0,5 až 12,5 mg/kg a je aplikovaná intravenózne. Vo výhodnom uskutočnení sú farmaceutické kompozície podľa vynálezu obsahujúce protilátkové homológy podávané tak, aby sa zaistila plazmatická úroveň podanej protilátky aspoň pri koncentrácii aspoň 1 μς/πιΐ.
Odborníci môžu lahko zistiť, či má antigonista podlá vynálezu zamýšľaný účinok. Napríklad bunky obsiahnuté vo vzorke epitelu pacienta sa testujú na prítomnosť podanej látky in vitro (alebo ex vivo) pomocou ďalšej reagencie, ktorá je schopná špecificky určiť podanú látku. Napríklad môže ísť o fluorescenčné označenú protilátku proti podanej látke, pričom je ďalej meraná štandardnou FACS analýzou (triedením buniek na základe fluorescencie). Poprípade je prítomnosť podanej látky stanovená in vitro (alebo ex vivo) neschopnosťou alebo zníženou schopnosťou pacientových buniek viazať podanú látku, ktorá bola označená (napríklad fluorochrómom). Po výhodnom dávkovaní by malo dôjsť k pozorovanému obsadeniu prevažnej väčšiny antigén-pozitívnych buniek. Vo výhodnom uskutočnení pri použití homológu protilátky by mali byť príslušné väzbové miesta obsadené počas 1 až 14 dní.
Ak nie je uvedené inak, je na uskutočnenie vynálezu potrebné ovládať konvenčné techniky bunkovej biológie, kultiváciu bunkových kultúr, molekulárno biologické postupy, mikrobiologické postupy, techniky rekombinantnéj DNA, proteínovú chémiu a imunológiu a to na úrovni odborníkov v daných odboroch. Takéto techniky sú opísané v literatúre, pozri napríklad: Molecular Cloning: A laboratory Manual (Laboratórny manuál pre molekulárne klonovanie), druhé vydanie, editorov Sambrooka, Fritscha a Maniatisa, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning (Klonovanie DNA), zväzky I a II (editor D.N. Glover) , 1985; Oligonucletide Synthesis (Syntéza oligonukleotidov), (M.J. Gait), 1984;' patent U.S.A číslo 4,683,195 (Mullis a ďalší); Nucleic Acid Hybridization (Hybridizácia nukleových kyselín) (editori B.D.Hames a S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (Transkripcia a translácía) (editori B.D. Hames a S.J. Higgins,) 1984; Culture of Animal Cells (Kultivácia zvieracích buniek) (editor R.I. Freshney). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes (Imobilizované bunky a enzýmy), IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (Praktický úvod do molekulárneho klonovania), (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology (Enzymatologické metódy), zväzky 154 a 155 (Wu a ďalší) , Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Vektory na transformáciu cicavčích buniek (editori J.H. Miller a M.P Calos), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (Imunochemické metódy v bunkovej a molekulárnej biológii) (editori Mayer a Walker), Academic Press, Londýn, 1987; Handbook of Experimental Immunology (Príručka experimentálnej imunológie), zväzky I až IV (editori D.M.Weir a C.C. Blackwell), 1986; Manipulating the Mouse Embryo (Manipulácia myších embryí), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Nasledujúce príklady slúžia predovšetkým na lepší opis a objasnenie podstaty vynálezu a nie je možné ich v žiadnom prípade považovať za obmedzujúce rozsah vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Použité chemikálie
Fluoresceínizotiokyanát (FITC) bol zakúpený od firmy Sigma (St. Louis, Missouri). Protónový olej bol zakúpený od firmy ICN Biochemicals . (Aurora, Ohio). Celá ovčia krv v Alsevérsovom roztoku sa získala od firmy East Acres Biologicals (Southbridge, Massachusetts). Kolagén typu I z krysích chvostov a myší kolagén typu IV boli zakúpené od spoločnosti Collaborative Research (Bedford, Massachusetts) respektíve Gibco (Gaithesburg, Maryland).
Samice myší Balb/c staré 6 až 8 týždňov boli zakúpené od firmy Taconic (Germantown, New York) a myši Balb/c deficitné v αϊβΐ integrínoch boli už opísané (pozri referencia 3).
Príklad 1: Monoklonálne protilátky
Blokujúce monoklonálne protilátky proti myším antigénom sa pripravili tak, aby neobsahovali žiadne azidy a s nízkym obsahom endotoxínov. Použili sa nasledujúce protilátky: Ha31/8 (škrečia protilátka proti CD49A; integrínu al, Mendrick a ďalší, 1995, Lab. Invest. 72: strana 367 až 375, Hal/29 (škrečia protilátka proti CD49B; integrínu α2) (βΐ, Mendrick a ďalší, 1995, Lab. Invest. 69: strana 690 až 702), škrečie kontrolné monoklonálne protilátky II skupiny Ha4/8 (škrečia protilátka proti hemocyanínu z morských prílipiek (KLH), (Mendrick, D.L. a D.M. Kelly, 1993 Lab. Invest. 69: strana 690 až 702), a PS/2 (krysia protilátka proti CD49D; reťazca integrínu α4β1, pozri Miyake a ďalší, 1991, J. Exp. Med. 173: strana 599 až 607) . Okrem toho boli od firmy Pharmingen (San Diego, California) vo formáte bez azidu a s nízkym obsahom endotoxínov zakúpené nasledujúce blokujúce monoklonálne protilátky proti myším antigénom: ΗΜβΙ-1 (škrečia protilátka proti CD29; reťazca βΐ integrínu, pozri Noto a ďalší, 1995, Int. Immunol. 7: strana 835 až 842), Ha2/5 (škrečia protilátka proti CD29; reťazca βΐ integrínu, pozri Mendrick, D.L. a D.M. Kelly, 1993 Lab. Invest. 69: strana 690 až 702), 3E2 (škrečia protilátka proti CD54, ICAM-1, pozri Scheynius a ďalší, 1993, J. Immunol. 150: strana 655 až 663), protilátka 5H10-27 (krysia protilátka proti CD49E; integrínu a5, pozri Kinashi, T. a T.A. Springer, 1994, Blood Cells 20: strana 25 až 44), GoH3 (krysia protilátka proti CD49F; integrínu a6, pozri Sonnenberg a ďalší, 1987, J. Biol. Chem. 262: strana 10376 až 10383) a krysia monoklonálna izotypová kontrolná protilátka R35-95 (krysia IgG2a) a R35-38 (krysia IgG2b).
Test adhézie: Splenocyty z myší Balb/c sa kultivovali v prítomnosti20 ng/ml IL2 počas 1 až 12 dní. Adhézia buniek na kolagén I a IV typu zodpovedala opísanej publikácii (Gotwals a ďalší, 1996 J. Clin. Invest. 97: strana 2469 až 2477). Podstata testu spočíva v tom, že sa platne Maxisorp s 96 jamkami (Nunc, Napierville, Illinois) potiahnu buď 10 pg/ml kolagénu typu IV alebo 5 pg/ml kolagénu typu I a nešpecifické väzbové miesta sa zablokujú 1% hovädzím sérovým albumínom (BSA). Slezinné bunky aktivované pomocou IL-2 sa označia 2 pM BCECF [2', 7'-bis (karboxyetyl)-5(6)karboxyl fluoresceín penta acetoxymetylester, Molecular Probes, Eugene Oregon] a potom sa inkubujú s 10. pg/ml uvedenej monoklonálnej protilátky počas 15 minút. 105 buniek v médiu RPMI s prídavkom 0,25% BSA sa potom pridá do potiahnutých jamiek v mikrotitračných doskách a inkubujú sa 60 minút pri teplote 37°C. Nenaviazané bunky sa odstránia tromi premytiami médiom RPMI s 0,25% BSA. Adhézia sa kvantífikuje pomocou fluorescenčnej čítačky platní CytoFluor 2350 (Milipore, Bedford, Massachusetts). Zmeria sa tak pomer naviazaných buniek vzhľadom na počiatočný počet a stanoví sa percento adhézie vzhľadom na bunky, ktoré sa ošetrili kontrolnou monoklonálnou protilátkou (štandardizované na 100%). Od hodnôt sa odpočítali hodnoty pozadia zmerané ako množstvo buniek, ktoré adherujú na jamky potiahnuté iba BSA.
Expresia a zablokovanie funkcie integrínov αϊβΐ a α2β1 na aktivovaných leukocytoch
Vzhladom na kľúčovú úlohu, ktorú hrajú leukocyty počas zápalu, sme sa rozhodli otestovať či monoklonálne protilátky proti al a a2 integrínom sú schopné zablokovať adhéziu leukocytov na kolagén. Leukocyty exprimujúce vysoké koncentrácie ako al tak aj a2 integrínov sa získali in vitro stimuláciou myších T-buniek pomocou IL-2 počas 7 až 12 dní. Tieto bunky exprimovali vysoké koncentrácie ako al tak aj a2 integrínov (obrázok 1) a dobre sa viazali na povrchy potiahnuté ako kolagénom typu IV tak aj kolagénom typu I (pozri obrázok 1B) . Adhézia na kolagén typu IV sa čiastočne inhibovala samotnou monoklonálnou protilátkou proti al integrínu a naopak nebola inhibovaná samotnou monoklonálnou protilátkou proti a2. Naproti tomu adhézia na kolagén typu I bola kompletne inhibovaná monoklonálnou protilátkou proti a2 integrínu zatial čo samotná monoklonálna protilátka proti al integrínu vykazovala iba čiastočnú inhibíciu. Ako monoklonálna protilátka proti βΐ integrínu, tak zmes monoklonálnych protilátok proti al a a2 integrínu kompletne inhibujú adhéziu na kolagén typov I a IV. Potom ako sa dokázalo, že αϊβΐ a α2β1 integríny sa exprimujú na povrchu aktivovaných T-lymfocytov a že monoklonálne protilátky proti al a a2 integrínu sú schopné funkčne zablokovať adhéziu leukocytov na kolagén, ďalej sa používali tieto monoklonálne protilátky na štúdium in vivo úlohy týchto integrínov pri zvieracích modeloch zápalových ochorení.
Príklad 2: Inhibícia DTH odozvy pomocou monoklonálnych protilátok proti integrínu
Zo skôr publikovaných prác (Hurtrel a ďalší, 1992 Celí. Immunol. 142: strana 252 až 263) sa prevzal a mierne upravil protokol na navodenie hypersenzitívnej odozvy oneskoreného typu (DTH-delayed type hypersenzitivity) indukovaný pomocou ovčích červených krviniek. Postup spočíva v subkutánnej imunizácii myší, ktorým sa do chrbta aplikovalo 2 x 107 ovčích červených krviniek v 100 μΐ PBS dňa 0. V deň 5 sa uskutočnilo provokačné očkovanie injekciou 1 x 10: ovčích červených krviniek v 25 μΐ PBS subkutánne do pravej prednej labky. Hrúbka labiek sa potom merala posuvným meradlom (Mitutové/MTI, Paramus, New Jersey) 20 hodín po podaní antigénu a z nameraných hodnôt sa vypočítal stupeň opuchu. Výsledky sú uvedené ako priemerné percentuálne zväčšenie hrúbky labky ± štandardná chyba (SEM) a na ich výpočet sa použil nasledujúci vzorec: % zväčšenia labky = [1-(hrúbka pravej labky 20 h po podaní antigénu/hrúbka neošetrenej ľavej labky 20 h po podaní antigénu)] x 100. Na zablokovanie efektorovej fázy DTH odozvy vyvolanej pomocou ovčích krviniek, sa intraperitoneálne podala terapeutická alebo kontrolná monoklonálna protilátka (100 μς), pripravená podlá spôsobov opísaných v Príklade 1. Protilátka sa podala 1 hodinu pred podaním antigénu dňa d=5.
Oneskorená odpoveď DTH vyvolaná pomocou ovčích červených krviniek je dobre opísaná in vivo modelom zápalu a zvlášť potom lupienky, ktorý sa používa na demonštráciu významu rôznych cytokínov a adhéznych molekúl počas zápalu (Tedder a ďalší, 1995 J. Exp. Med. 181: strana 2259 až 2264, Terashita a ďalší, 1996,
J. Immunol. 156: strana 4638 až 4643). Myšiam senzibilizovaným červených krviniek sa podala monoklonálna 1 h predtým ako sa im do labiek pomocou ovčích protilátka proti integrinu aplikoval antigén a miera zápalu bola odhadnutá o 20 hodín
Myši ošetrení
PBS neskôr zmeraním zmeny hrúbky labky, a kontrolným škrečím imunoglobulínom 20 hodín po podaní antigénu vykazovali 60 až 70% nárast hrúbky labky (pozri obrázok 2). Myši ošetrené monoklonálnymi protilátkami proti al alebo proti a2 integrinu vykazovali oproti kontrolnému škrečiemu imuneglcbulínu 68% respektíve 60% inhibíciu nárastu hrúbky labky. Kombinácia monoklonálnych protilátok proti al a a2 integrinu mala za následok 71% inhibíciu nárastu hrúbky, z čoho vyplýva malý pridaný efekt zmesi protilátok oproti samotným monoklonálnym protilátkam proti al alebo a2 integrinu. Ošetrenie myší monoklonálnymi protilátkami proti ďalším integrínom malo tiež účinok na inhibíciu DTH odpovedi. Stupeň inhibície pozorovaný pri rôznych monoklonálnych protilátkach bol 49% (anti-a4), 23% (anti-a5) a konečne 57 % (anti-a6). Monoklonálna protilátka blokujúca bežnú βΐ podjednotku integrínu (monoklonálna protilátka HMBI-1) inhibovala DTH odpoveď na 67%.
Príklad 3: Inhibícia CHS efektorovej odpovede pomocou monoklonálnych protilátok proti integrínu
Kontaktná hypersenzitivita spôsobom podlá návodu 1991, v kinhe Current A.M. Kruisbeek, D.H. vydavateľ John senzibilizovali FITC v zmesi
0. Desiateho 5 μΐ 0,5% zmeral ušného podaním (CHS) na FITC sa testovala v práci Gaspariho a ďalších,
in Immunology, J.E. Coligan,
E.M. Shevach a W. Strober,
York, kapitola 4.2:1) . . Myši sa
uvedeného
Protocols Margulies,
Wiley & Sons, New potretím oholeného chrbta 100 μΐ 0,5% roztoku acetón/dibutyl ftalát (1:1). FITC sa aplikoval dňa dňa sa zvieratá provokačne exponovali ďalšou dávkou
FITC na obe strany oboch uší. Vzniknutý opuch sa pomocou posuvného meradla a vyjadril ako nárast hrúbky boltca (Mitutoyo/MTI, Paramus, New Jersey) v čase medzi antigénu (d 10) a o 24 h neskôr.
Výsledky sú uvedené ako priemerné percentuálne zvýšenie hrúbky ušného· boltca v koreni ± SEM a na ich výpočet sa použil nasledujúci vzorec: % zväčšenia hrúbky ušného boltca v koreni = [1- (hrúbka ucha 24 hodín po podaní antigénu/ hrúbka ucha počas podania antigénu)] x 100. Na zablokovanie efektorovej fázy CHS odozvy sa v deň d=10 a 4 hodiny pred podaním antigénu intraperitoneálne podala terapeutická alebo kontrolná monoklonálna protilátka (250 μς).
Vzhľadom na to, že odpoveď CHS je principiálne odlišná od odpovede DTH a podieľajú sa na nej iné efektorové bunky, pokúsili sme sa zistiť účinok monoklonálnych protilátok proti integrínu nä efektorovú fázu CHS odpovede. Myši sa senzibilizovali hapténom FITC aplikovaným na oholený chrbát. Po 10 dňoch nasledovala provokačná aplikácia FITC na ušné boltce, ktoré vyvolali do druhého dňa zápalovú odpoveď. Myši senzibili35 zované pomocou FITC vykazovali 24 h po podaní antigénu 60 až 70% nárast hrúbky koreňa ušného boltca (pozri obrázok 3) . V súlade so skôr opublikovanými výsledkami (pozri Scheynius a ďalší, J. Immunol. 150: strana 655 až 663) mala aplikácia monoklonálnej protilátky proti ICAM-1 za následok 51% inhibíciu opuchu ušného boltca.
Myši ošetrené monoklonálnymi protilátkami proti al alebo proti a2 integrínu 4 hodiny pred aplikáciou antigénu, vykazovali oproti kontrolnému škrečiemu Ig 37% a 57% inhibíciu opuchu ušného boltca, tak ako je uvedené (pozri obrázok 3) . Kombinácia monoklonálnych protilátok proti al a a2 inregrínu mala za následok mierne vyššiu (65%) inhibíciu opuchu (nárastu hrúbky) boltca. Ošetrenie myší ďalšími monoklonálnymi protilátkami proti βΐ integrínom odhalilo, že zatiaľ čo monoklonálne protilátky proti a4 a a5 integrínu nemali na CHS efektorovú odpoveď žiadny vplyv vzhladom na kontrolné krysie Ig, po aplikácii monoklonálnej protilátky proti a6 integrínu došlo k 86% inhibícii efektorovej odpovede. Zablokovanie bežného βΐ integrínu monoklonálnou protilátkou inhibovalo efektorovú CHS odpoveď zo 74%.
K podobným výsledkom viecii aj experimenty s CHS odpoveďou uskutočňované na myšiach C57/BL6 a 129/SV a s rôznymi senzibilizačnými látkami (oxazolon, údaje nie sú uvedené) . Histologické analýzy zapálených ušných boltcov potvrdili, že ako vznik opuchu tak aj prenikanie leukocytov bolo inhibované monoklonálnou protilátkou proti al a proti a2, podobne ako pri modeli DTH so zvieratami, ktoré boli senzibilizované ovčími červenými krvinkami .
Analýza lymfatických uzlín z myší senzibilizovaných oxazolonom alebo FITC odhalila, že integríny αϊβΐ a α2β1 sa exprimujú výlučne na CD44hl LFA-lhi aktivovaných CD4+ a CD8+ T-lymfocytoch (údaje nie sú uvedené), čo je v súlade s poznatkom, že αϊβΐ a α2β1 integríny sa môžu exprimovať na IL-2 aktivovaných splenocytoch. Ošetrenie myší monoklonálnymi protilátkami proti al a a2 integrínu nemalo za následok zníženie počtu týchto buniek ako dokazujú nezmenené počty aktivovaných T-lymfocytov ako v slezine tak aj v lymfatických uzlinách, pozorované po senzibilizácii antigénom pri štúdiu CHS odpovedi. Okrem toho neboli efektorové bunky funkčne poškodené, čo potvrdzuje ďalšie ošetrenie senzibilizovaných myší monoklonálnou protilátkou proti al a proti a2 (v dňoch dlO až 16) , ktoré nijako neovplyvnilo zápalovú odpoveď myší, ktorým bol aplikovaný antigén 20 deň (údaje nie sú uvedené).
Príklad 4: CHS efektorová odpoveď je oslabená u myší deficietných v αϊβΐ integríne
Bolo potrebné vylúčiť možnosť, že inhibičná úloha pripisovaná zablokovaniu αϊβΐ integrínov pri efektorovej CHS odpovedi vzhľadom na FITC je spôsobená priamo monoklonálnou protilátkou. Preto sa uskutočnil experiment s bežnou myšou a s myšou, ktorá bola deficientna v αϊβΐ. integrínoch (pozri obrázok 4). U bežnej myši sa inhibícia zápalu v efektorovej fáze spôsobená monoklonálnou protilátkou zhodovala s predchádzajúcimi výsledkami, pričom monoklonálna protilátka proti al vykazovala 56% inhibíciu opuchu boltca, protilátka proti a2 tiež >6% inhibíciu a kombinácia oboch protilátok 62%. Efektorová fáza CHS bola významne slabšia u neošetrených αΐβΐ-deficientnych v porovnaní s neošetrenými bežnými myšami (30% oproti myši
71% nárastu hrúbky ušného boltca). Podľa očakávania opuch ušného boltca neošetrenej αϊβΐ deficientnej myši bol ekvivalentný s opuchom ušného boltca bežnej myši ošetrenej monoklonálnou protilátkou proti al. Ďalej zablokovanie α2β1 a αϊβΐ deficitných myší príslušnými monoklonálnymi protilátkami vyústilo do len mierne zvýšenej inhibície opuchu ušného boltca, čo je v zhode s výsledkom dosiahnutým pri bežných myšiach ošetrených kombináciou monoklonálnych protilátok proti al a a2.
Príklad 5
Ďalej bolo potrebné vylúčiť možnosť, že inhibičný účinok monoklonálnych protilátok proti integrínom ako pri DTH, tak pri CHS modeli zápalu je spôsobený všeobecným protizápalovým účinkom sprostredkovaným monoklonálnymi protilátkami proti al a a2. Z toho dôvodu sa študoval vplyv týchto protilátok na zápalové ochorenie kože spôsobené podráždením chemickou látkou.
Zápal kože sa vyvolal aplikáciou 5 μΐ 0,8% krotónového oleja v acetóne na obe strany oboch uší. Terapeutické a kontrolné protilátky sa podali 4 hodiny pred aplikáciou dráždivej látky. Po 24 hodinách sa uvedeným spôsobom meral opuch uší a porovnal sa s hrúbkou uší meranou pred aplikáciou krotónového oleja. Výsledky sú uvedené ako priemerné percentuálne zväčšenie hrúbky ušného boltca v koreni ± SEM, ako už bolo opísané. Ako negatívne kontroly slúžili myši ošetrené iba acetónom (vehicle control).
U myší ošetrených krotónovým olejom došlo po 24 hodinách k dokázanému zvýšeniu hrúbky uší (48%) v porovnaní s tými, ktoré boli ošetrené iba samotným nosičom (acetónom). U myší, ktoré boli vopred ošetrené monoklonálnymi protilátkami proti al a a2 nedošlo, v porovnaní so zvieratami ošetrenými buď PBS alebo kontrolnými monoklonálnymi protilátkami, k dokázateľnému ovplyvneniu opuchu ' uší spôsobeného krotónovým olejom (pozri obrázok 5). Histologické vyšetrenia uší ošetrených krotónovým olejom odhalili, že nie je žiadny rozdiel ako v počte a type infiltrujúcich buniek, tak v tvorbe opuchu u myší ošetrených monoklonálnymi protilátkami proti al a a2 v porovnaní s kontrolnými zvieratami, ktorým boli podané buď kontrolné monoklonálne protilátky alebo PBS (údaje nie sú uvedené).
Príklad 6: Inhibícia artritídy pomocou αϊβΐ a α2β1.
U pacientov s artritídou je na povrchu infiltrujúcich buniek vnútornej blany kĺbu (synovium) vo veľkej miere exprimovaný αϊβΐ. Autori vynálezu sa preto rozhodli zistiť, či by monoklonálne protilátky proti al a monoklonálne protilátky proti a2 mohli vykazovať inhibičný účinok na už opísanú progresívnu artritídu (Terato a ďalší, 1992 J. Immunol. 148: strana 2103 až 2108; Terato a ďalší, 1995 Autoimmunity 22: strana 137 až 147).
Artrogén-CIA protilátkové kity boli zakúpené vo firme Stratagene (La Jolla, CA) . Artritída sa indukovala zavedeným protokolom (pozri Terato a ďalší, 1992, J. Immunol. 148: strana 2103 až 2108;. Terato a ďalší 1995, Autoimmunity 22: strana 137 až 147). V tomto spôsobe sa artritída vyvoláva injekciou zmesi 4 monoklonálnych protilátok proti kolagénu typu II (1 mg každej z nich) v deň 0. Nasleduje intraperitoneálna injekcia 50 μg LPS v deň 3. Počas nasledujúcich troch až štyroch dní sa u myší objavili opuchy zápästí, členkov a prstov. Liečené či kontrolné protilátky (250 pg) sa podali intraperitoneálne 4 hodiny pred injekciou monoklonálnych protilátok proti kolagénu v deň 0 a ďalej 4 hodiny pred podaním LPS v deň 3 a ďalej každý tretí deň počas trvania experimentu. Začínajúc dňom 3 sa u myší pozoroval vznik artritídy. Závažnosť artritídy na každej končatine sa hodnotila pomocou päťbodového skóre. 0 = normálne; 1 = slabé začervenanie, slabý opuch členka či zápästia; 2 = nie príliš veľký opuch členka či zápästia; 3 = vážny opuch zasahujúci niektoré prsty, členky a chodidlá; 4 = maximálny zápal.
Ťažká artritída sa u myší Balb/c vyvinula 72 hodín po injekcii LPS a pretrvávala viac než tri týždne. Ako samotná injekcia monoklonálnych protilátok proti kolagénu, tak podanie samotného LPS nevyvolali artritídu. Myši, ktorým sa podala kontrolná monoklonálna protilátka, vykazovali rovnako silnú artritídu ako tie, ktorým sa injikoval PBS (pozri obrázok 6). Na rozdiel od toho u myší, ktorým sa vopred podala monoklonálna protilátka proti al, došlo k výraznému zníženiu artritídy (78%), pretrvávajúcemu počas trvania experimentu. Podávanie samotných monoklonálnych protilátok proti a2 integrínu malo na myši tiež pozitívny účinok prejavujúci sa 32% znížením artritídy (hodnotené pomocou uvedeného päťbodového artritického skóre) v porovnaní s kontrolnými myšami, ktorým sa podala kontrolná monoklonálna protilátka. Kombinácia monoklonálnych protilátok proti al a a2 viedla k podobnému zníženiu artritídy ako v prípade podania samotnej protilátky proti al.
Príklad 7: Histologická analýza účinku podávania monoklonálnych protilátok proti al a a2 na zápalové prenikanie buniek
Ďalšia histologická analýza DTH odozvy vyvolanej imunizáciou červenými krvinkami potvrdila schopnosť monoklonálnych protilátok proti al a a2 modelovať vyvolanú zápalovú odpoveď (pozri obrázok 7) . Kontrolná labka myši senzibilizovanej ovčími krvinkami (pozri obrázok 7 panel A) neobsahovala fakticky žiadny bunkový infil.trát v porovnaní s labkou z toho istého zvieraťa, do ktorého sa vpravili ovčie krvinky (pozri obrázok 7 panel B) . Bližšie skúmanie infiltrujúcich buniek ukázalo, že väčšina z nich sú neutrofily s občasným výskytom monocytov a lymfocytov. Ďalej sa potvrdilo, že podávanie monoklonálnych protilátok proti al a a2 výrazne znížilo počet prenikajúcich buniek (pozri obrázok 7 panel G až H).
Príklad 8: Imunohistochemická detekcia buniek exprimujúcich al v zápalovom infiltráte buniek.
Imunohistochemická analýza sa uskutočňovala na presnejšie určenie charakteru infiltrujúcich buniek a zistenie, či tieto bunky exprimujú integríny, ktoré sú schopné viazať kolagén (pozri obrázok 8). V infiltrujúcich bunkách zo zapálenej labky neovplyvnených myši sa zisťovala expresia αϊβΐ integrínov a markerov bunkových typov (pozri obrázok 8). Expresia αϊβΐ integrínov sa zistila vo väčšine infiltrujúcich leukocytov (pozri obrázok 8A). Na súčasné určenie typu infiltrujúcich buniek a distribúcie αϊβΐ expresie sa použila imunohistochémia s dvojitým značením (pozri obrázok 8B) . Pomocou bunkových markerov sa zistilo, že infiltrát je zložený prevažne z granuloctytov/monocytov (Mac-1+), pričom väčšina z týchto buniek sú neutrofily (Grll+), malú časť infiltrátu tvoria T-lymfocyty (CD3+) (pozri obrázok 8B). Expresia αϊβΐ integrínu sa zistila na všetkých troch uvedených typoch buniek, pričom al sa exprimoval na Mac-1+ podtype granulocytov/monocytov, Grl+ na podtype neutrofilov a na väčšine infiltrujúcich CD3+ T-lymfocytov (pozri obrázok 8B).
Detailná imunohistochemická analýza odhalila, že hoci podávanie monoklonálnych protilátok proti al a a2 znížilo počet infiltrujúcich buniek, nedošlo k zmene bunkového zloženia infiltrátu (údaje nie sú uvedené). Imunohistochemické farbenie protilátkami proti škrečím monoklonálnym protilátkam označeným EITC potvrdilo schopnosť monoklonálnych protilátok proti al a a2 sústrediť sa v zapálenej labke (údaje nie sú uvedené).
Príklad 9: Inhibícia artritídy pomocou monoklonálnych protilátok proti αϊβΐ u myší deficitných v al.
Skutočnosť, že αϊβΐ integrín sa dosť exprimuje v infiltrujúcich bunkách vo vnútornej blane kĺbu artritických pacientov, viedla k myšlienke vyskúšať, či by monoklonálne protilátky proti al a a2 pôsobili inhibičné pri skôr opísanom modeli progresívnej artritídy (Terato a ďalší, 1992 J. Immunol. 148: strana 2103 až 2108; Terato a ďalší, 1995 Autoimmunity 22:
strana 137 až 147). Tento model zahŕňa injikovanie zmesi monoklonálnych protilátok proti kolagénu typu II do myší a neskôr podanie LPS, následkom čoho za 3 až 7 dní dôjde k vyvolaniu artritídy. Monoklonálne protilátky sa myšiam podávali každé tri dni začínajúc dňom 0, každé tri dni sa zaznamenával vývoj artritídy. Ťažká artritída sa u myší vyvinula 72 hodín po podaní LPS a pretrvávala viac ako tri týždne. Ako samotná injekcia monoklonálnych protilátok proti kolagénu, tak aj podanie samotného LPS nevyvolali artritídu. Myši, ktorým sa podala kontrolná monoklonálna protilátka, vykazovali rovnako silnú artritídu ako tie, ktorým sa injikoval PBS (pozri obrázok 9A). Na rozdiel od toho u myší, ktorým sa vopred podala monoklonálna protilátka proti al, došlo k výraznému zníženiu artritídy (o 79% a viac) , pretrvávajúcemu počas trvania experimentu. Podávanie samotných monoklonálnych protilátok proti a2 malo na myši tiež pozitívny účinok prejavujúci sa 37% znížením artritídy (hodnotené pomocou uvedeného päťbodového artritického skóre) v porovnaní s kontrolnými myšami, ktorým sa podala kontrolná monoklonálna protilátka. Kombinácia monoklonálnych protilátok proti al a a2 viedla k podobnému zníženiu artritídy ako v prípade podania samotnej protilátky proti al. Zníženie artritického skóre spôsobené podávaním monoklonálnych protilátok proti al sa pozorovalo u všetkých myší. V porovnaní s inými liečebnými postupmi využívajúcimi monoklonálne protilátky je úspešnosť tohto spôsobu liečby artritídy väčšia. Medzi takéto postupy patrí použitie rozpustného fúzneho proteínu medzi lg a receptorom pre TNF (Mori a ďalší 1996, J. Immunol. 157: strana 3178 až 3182), protilátky proti Mac-1 (Taylor a ďalší, 1996, Immunology. 88: strana 315 až 321), protilátky proti a4 (Seiffge, 1996, J. Rheumatol. 23: strana 2086 až 2091) a protilátky proti ICAM-1 (Kakimoto a ďalší, 1992 Celí Immunol. 142: strana 326 až 337, pozri obrázok 9A). V súlade s údajmi založenými na metódach používajúcich monoklonálne protilátky, ktoré ukazujú dôležitosť αϊβΐ pri rozvoji artritídy, ničím neliečené myši deficientne v antigéne al vykazovali v porovnaní s bežnými myšami dokázateľné zníženie artritického skóre (pozri obrázok 9B).
Príklad 10: Účinok podávania monoklonálnej protilátky proti al na imunopatológiu artritických kĺbov
Kĺby bežných artritických myší (deň 8), ktoré dostávali buď kontrolné monoklonálne protilátky alebo monoklonálne protilátky proti al, sa vizuálne a histologický porovnávali s kĺbmi normálnymi, ničím neliečenej myši (pozri obrázok 10). Bolo zjavné, že myši, ktorým sa podala kontrolná monoklonálne protilátka, mali kĺby červené a opuchnuté, pričom opuch zasahoval celú nohu vrátane prstov, zatial čo u myší ošetrených monoklonálnou protilátkou proti al sa pozorovali malé opuchy alebo dokonca neboli zistené žiadne známky zápalu kĺbov či prstov. Histologické štúdie ukázali, že u myší ošetrených kontrolnou monoklonálnou protilátkou došlo k vážnym zmenám v artritických kĺboch. Bolo pozorované rozsiahle prenikanie buniek zápalu do subsynoviálneho tkaniva, priľnavosť buniek na povrch kĺbu a značná deštrukcia chrupavky spôsobená stratou proteoglykánu (pozri obrázok 10). Väčšina z prenikajúcich buniek sú v tomto modeli neutrofily, čo zodpovedá predchádzajúcim pozorovaniam (Terato a ďalší, 1992 J. Immunol. 148: strana 2103 až 2108; Terato a ďalší, 1995 Autoimmunity 22: strana 137 až 147). Podávanie monoklonálnych protilátok proti al viedlo u myší k dramatickému poklesu množstva zápalového infiltrátu a zároveň k nižšiemu stupňu deštrukcie chrupavky (pozri obrázok 10).
Príklad 11: Absencia lymfocytov vedie k pomalšiemu vývoju artritídy a ďalej k inhibícii artritídy v dôsledku podávania monoklonálnych protilátok proti al
Ďalej bolo potrebné zistiť, ktoré typy buniek by mohli byť významné v takom modeli artritídy, keď je zápal vyvolaný monoklonálnymi protilátkami proti kolagénu. Autori vynálezu preto porovnávali schopnosť vývoja artritídy u bežných laboratórnych myší B6-129 a myší B6-129 deficientnych v géne RAG-1 (pozri obrázok 11). Delécia v géne RAG-1 (recombination activating gene-1) viedla k úplnej strate zrelých T a B lymfocytov (Mombaerts a ďalší, 1992, Celí 68: strana 869 až 877). K rozvoju artritídy došlo ako u myší divého typu, tak u myší deficitných v géne RAG-1, rýchlosť vzniku artritídy však bola u myší deficitných v RAG-1 géne dokázateľne nižšia (pozri obrázok 11). Tieto výsledky naznačujú, že aj keď sú lymfocyty zapojené do rozvoja tohto typu artritídy, ich prítomnosť nie je nevyhnutná na rozvoj tohto ochorenia. Publikované experimenty zaoberajúce sa vplyvom RAG-1 deficiencie u myší pri iných typoch artritídy ukázali, že strata T a B lymfocytov spomaľuje nástup artritídy (Plows a ďalší, 1999 J. Immunol. 162: strana 1018 až 1023). Podávanie monoklonálnych protilátok proti al integrínu viedlo ako u bežných myší, tak aj u myší deficietných v RAG-1 géne k inhibícii artritídy (pozri obrázok 11). Tieto výsledky sú dôkazom toho·, že v tomto type artritídy nie je účinnosť monoklonálnych protilátok proti al závislá od prítomnosti lymfocytov. Účinnosť monoklonálnych protilátok proti al integrínu pri prevencii artritídy môže byť založená na ich pôsobení na iné typy al exprimujúcich buniek, ako sú napríklad makrofágy a 'neutrofily, ako sa predpokladalo na základe predchádzajúcich experimentov (pozri obrázok 9).
Príklad 12: Dávková citlivosť inhibície artritídy na monoklonálnych protilátkach proti al
Na základe výrazného účinku monoklonálnych protilátok proti al v prevencii artritídy sa autori vynálezu rozhodli uvedené štúdie rozšíriť o analýzy dávkovej citlivosti (dose response analysis, pozri obrázok 12) . Pokusným zvieratám sa každé tri dni (začínajúc dňom 0) podávala určitá dávka monoklonálnych protilátok. V súlade s predchádzajúcimi výsledkami dávka 250 pg monoklonálnych protilátok proti al integrínu viedla k takmer úplnému zabráneniu vzniku artritídy. Zatiaľ čo dávka 100 μς monoklonálnych protilátok proti al bola v prevencii artritídy v tomto mode'li čiastočne účinná, nižšie dávky nemali na artritické skóre žiadny pozorovateľný účinok (pozri obrázok 12).
Príklad 13: Terapeutické podávanie monoklonálnych protilátok proti al môže viesť k zníženiu artritického skóre
Vzhladom na vysokú účinnosť monoklonálnych protilátok proti al pri prevencii artritídy sa autori vynálezu rozhodli, že sa pokúsia liečiť myši s už rozvíjajúcou sa artritídou.
Artritída sa u myší vyvolala injekciou, zmesou monoklonálnych protilátok proti kolagénu typu II dňa 0 a 3 dni potom nasledovala aplikácia LPS. Myšiam sa potom 4. deň podala buď monoklonálna protilátka proti al alebo rozpustný fúzny protein TNF receptora s imunoglobulínom. Rozvoj artritídy sa kompletne zastavil u myší, ktoré dostávali od 4. dňa monoklonálne protilátky proti a.l. Tento efekt sa nepozoroval u myší, ktoré 4. deň dostali kontrolné škrečie monoklonálne protilátky (pozri obrázok 13). Inhibícia rozvoja artritídy pozorovaná po terapeutickej dávke monoklonálnej protilátky proti al bola kompletná a bola rovnaká, ako pri preventívnej aplikácii monoklonálnej protilátky proti al (dávka protilátky dňa 0, pozri obrázok 13). Na porovnanie u myší, ktorým sa začínajúc 4. dňom podával fúzny protein TNF receptora s lg, došlo len k 60 až 70% inhibícii podlá artritického skóre, oproti kontrolným myšiam, ktorým sa podal fúzny protein indiferentného proteínu s lg (pozri obrázok 13) . Kombinovaným pôsobením monoklonálnej protilátky proti al a fúzneho proteínu TNF receptora s Ig sa rovnako dosiahla úplná inhibícia rozvoja artritídy, čo však nie je tak prekvapujúce, ak vezmeme do úvahy úplnú inhibíciu vyvolanú samotnou monoklonálnou protilátkou proti al. Ak zhrnieme tieto výsledky, ukazuje sa na liečbu artritídy ako vhodnejšie a účinnejšie použitie monoklonálnej protilátky proti al integrínu než použitie antagonistu TNF.
Príklad 14: Klonovanie a mutagenéza al-I domény
Sekvencie kódujúce ľudské a krysie αϊβΐ I domény integrínu sa amplifikovali z úplnej cDNA (full lenght) (Kern, a ďalší, (1994) J. Biol. Chem. 26), strana 22811 až 22816; Ignatius a ďalší, (1990) J. Celí Biol. 111, strana 709 až 720) polymerázovou reťazovou reakciou (PCR CORE Kit; Boehringer Mannheim, GmbH Nemecko) . Pri PCR sa použili buď priméry špecifické na ludskú DNA:
5'CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3'(priamy);
5'TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3'(reverzný) alebo pre krysiu DNA
5'CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3'(priamy);
5'TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3'(reverzný).
Výsledné PCR. produkty sa prečistili a vložili do plazmidu pGEX4T-l (Pharmacia). Ligačné zmesi sa potom transformovali do kompetentných buniek DH5a (Life Technologies). Kolónie rezistentné na ampicilín sa testovali na produkciu cca 45 kDa fúzneho proteínu domény I s glutatión-S-transferázou. Sekvencia inzertov z týchto klonov, ktoré sa vybrali na ďalšiu prácu sa overila sekvenovaním.
Pomocou kitu „MORPH mutagenesis kit (5'prime - 3'prime), na cielenú mutagenézu sa z krysej a ľudskej pripravila chimérická al-I doména (RAH), pričom došlo k zámene aminokyselinových zvyškov G92, R93, Q94 a L97 v krysej sekvencií za zodpovedajúce ľudské zvyšky V, Q, R respektíve R (pozri obrázok 14).
Klony, obsahujúce zmutovanú RAH I doménu sa identifikovali na základe straty diagnostického reštrikčného miesta Stul a inzerty boli overené sekvenovaním. Aminokyselinová sekvencia ľudskej al-I domény je uvedená na obrázku 15.
Príklad 15: Príprava monoklonálnych protilátok špecifických na al-I doménu
Monoklonálne protilátky sú veľmi užitočné na štúdium vzťahu medzi usporiadaním a funkciou integrínových podjednotiek. Tak boli napríklad veľkou mierou využité monoklonálne protilátky na štúdium tých oblastí na βΐ podjednotke, ktoré súvisia s aktivovanou konformáciou (Qu a Leahy, D.J. (1996) Structure 4, strana 931 až 942). Vynález tak opisuje skupinu monoklonálnych protilátok proti ľudskej al-I doméne integrínu, pričom tieto protilátky sú použiteľné na štúdium konformačných zmien al-I domény.
Príprava monoklonálnych protilátok proti al-I doméne:
Samice Robertsonových myší (Jacksonové laboratóriá) sa intraperitoneálne imunizovali 25 μg prečisteného ľudského αϊβΐ integrínu (pozri Edwards a ďalší, (1995) J. Biol. Chem. 270, strana 12635. až 12640), ktorý bol emulgovaný v kompletnom Freundovom adjuvans (Life Technologies). Myšiam sa ďalej podali tri i.p. provokačné imunizačné dávky po 25 μς all emulgovaného v neúplnom Freundovom adjuvans (Life Technologies). Myš s najvyšším titrom protilátok proti al-I doméne sa ešte raz i.p. imunizovala 100 μς al-I tri dni pred fúziou a intravenózne 50 μς αϊβΐ jeden deň pred fúziou. Slezinné bunky sa fúzovali s myelomatickými bunkami FL653 v pomere 1:6 a vysiali sa po
100.000 a 33.000 bunkách na jamku do 96 jamkových doštičiek pre tkanivové kultúry.
Supernatanty sa testovali na schopnosť viazať αϊβΐ integríny pomocou FACS s jedným fluorescenčným farbivom. Pred FACS analýzou sa supernatanty inkubovali s netransfekovanými bunkami K562, aby sa eliminovali IgG viažuce sa iba na β podjednotku. Potom sa 3 až 5 x 104 buniek K562 transfekovalo al podjednotkou integrínu (K562-al) a suspendovalo vo FACS pufri (1% fetálnym telacie sérum, FCS) v PBS s obsahom 0,5% NaN3) , 45 minút inkubovalo so supernatantom pri teplote 4°C, premylo a ďalej inkubovalo s konjugátom protilátky proti myším IgG s fytoerytrínom. Po dvojnásobnom prepláchnutí vo FACS pufri sa bunky analyzovali na prietokovom cytometri Becton Dickinson.
Supernatanty vybratých hybridómov sa testovali na schopnosť viazať al-I doménu. 96-jamkové platne (Nunc) sa potiahli 50 μΐ rozotoku fúzneho proteinu ludskej al-I domény s glutatión-S-transferázou (GST) v PBS o výslednej koncentrácii 30 μρ/πιΐ. Inkubácia trvala cez noc pri teplote 4°C. Platne sa potom premyli pufrom PBS, zablokovali 1% roztokom BSA v PBS a supernatant z hybridómov sa počas jednej hodiny inkuboval pri teplote miestnosti s doménou I. Po extenzívnom premytí v pufri PBS s obsahom 0,03% Tweenu 20, sa na ďalšiu hodinu pridal konjugát anti-myšej protilátky s alkalickou fosfatázou (Jackson ImmunoResearch). Po záverečnom premytí sa pridal roztok substrátu obsahujúci p-nitrofenylfosfát (pNPP, 1 mg/ml), glycín (0,1 M), ZnCl2 (lmM) a MgCl2 (lmM). Substrát sa v jamkách ponechal 30 minút pri teplote miestnosti a potom sa odpočítala absorbancia pri vlnovej dĺžke 405.
Vybrané supernatanty sa testovali na schopnosť inhibovať al dependentnú adhéziu na kolagén typu IV v bunkách K562-al.
Bunky K562-al sa označili 30 minútovou inkubáciou s 2 mM 2', 7'(bis-2-karboxyetyl-5,6) karboxyfluoresceín penta acetoxymetylesterom (BCECF; Molecular Probes) v médiu DMEM s prídavkom 0,25% BSA pri teplote 37°C. Označené bunky sa premyli väzbovým pufrom (10 mM HEPES, pH 7,4; 0,9% NaCl a 2% glukóza) a resuspendovali vo väzbovom pufri s prídavkom 5 mM MgCÍ2 tak, aby výsledná koncentrácia bola 1 x 106 buniek/mi. 50 μΐ supernatantu sa inkubovalo v 96 jamkových mikrotitračných doskách s rovnakým objemom obsahujúcim 2 x 105 buniek K562-al. Mikrotitračné dosky sa potom centrifugovali a supernatanty sa odstránili. Bunky sa resuspendovali vo väzbovom pufri a preniesli do jamiek platne potiahnutej kolagénom a inkubovali počas jednej hodiny pri teplote 37°C. Po tejto inkubácii sa bunky, ktoré neprilahli na mikrotitračnú dosku, odstránili trojnásobným premytím väzbovým pufrom. Adsorpcia buniek sa analyzovala na prístroji Cytofluor (Millipore).
Spočiatku sa identifikovalo 19 hybridómov, ktorých supernatanty boli schopné viazať ludské leukemické bunky K562 exprimujúce al-1 integríny (K562-al) a viazať sa rovnako na al-I doménu. Z každého z týchto hybridómov sa purifikovali imunoglobulíny a testovali na schopnosť blokovať buď väzbu K562-al alebo al-I domény na kolagénu typu IV. Tieto monoklonálne protilátky je možné rozdeliť do dvoch skupín: jednak sú to tie, ktoré blokujú a jednak tie, ktoré neblokujú funkciu αϊβΐ. Tak napríklad zatiaľ čo monoklonálne protilátky produkované klonmi AEF3, BGC5 a AJH10 viažu al-I doménu (pozri obrázok 16A, pre BGC5 nie sú uvedené údaje), len monoklonálna protilátka AJH10 inhibuje adhéziu na kolagén typu IV závislú od al-I domény (obrázok 16B) alebo na K562-al (obrázok 16C).
Sekvenovanie komplementaritu určujúcich oblastí protilátok (CDR)
Klonálny pôvod tejto skupiny monoklonálnych protilátok bol bližšie charakterizovaný sekvenovaním CDR oblasti protilátok. Pomocou PCR sa najskôr amplifikovala cDNA a potom sa sekvenovali CDR oblasti 12 z celkom 19 protilátok (údaje nie sú uvedené).
Z cca 107 buniek hybridómov sa izolovali 2 pg mRNA, (pomocou kitu FastTrack mRNA isolation kit, Invitorgen). Pomocou reverznej transkripcie sa vytvorila cDNA (pomocou kitu Ready-To-Go Prime First Strand Kit, Pharmacia Biotech) použitím 25 pM každého z nasledujúcich primérov: pre ťažký reťazec VH1FOR-2 (Michishita a ďalší, (1993) Celí 72, strana 857 až 867); pre ľahký reťazec VK4FOR, pre ktorý existujú štyri jednotlivé oligonukleotidy (Kern a ďalší, (1994) J. Biol. Chem. 269, strana' 22811 až 22816). Z každého hybridómu sa amplifikovali ťažké a lahké reťazce v štyroch samostatných PCR reakciách použitím rôznych kombinácii nasledujúcich oligonukleotidov: 1) priméry pre ťažký reťazec: VH1FR1K (Kamata a ďalší, (1995) J. Biol. Chem. 270, strana 12531 až 12535), VH1BACK (Baldwin a ďalší, (1998) Structure 6, strana 923 až 935), VHfrla, VHfrlb, VHfrle, VHfrlf, VHfrlg (Ignatius a ďalší,
(1990) J. Celí Biol. 111, strana 709 až 720 ) alebo VH1FOR-2
(Michishita, M. , Videm, V. , , a Arnaout, M. A. (1993) Celí 72,
strana 857 až 867); 2) priméry pre ľahký reťazec: VK1BACK
(Baldwin a ďalší., (1998) Strucutre 6, strana 923 až 935), oligonukleotidy VK4FOR, VK2BACK (Kern a ďalší, (1994) J. Biol. Chem. 269, strana 22811 až 22816) alebo VKFRLA, VHFRLC, VHFRLE, VHFRLF (Ignatius a ďalší, (1990) J. Celí Biol. 111, strana 709 až 720). Produkty sa amplifikovali (5 minút pri 95°C, 50 cyklov po 1 minúte pri 94°C, 2 minúty pri 55°C, 2 minúty pri 72°C a finálny cyklus trvajúci 10 minút pri 72°C), DNA sa potom vyizolovala z gélu pomocou kitu QIAQUICK (Qiagen) a priamo sekvenovala na sekvenátore ABI 377 použitím uvedených oligonukleotidov.
Sekvencie získané z klonov produkujúcich blokujúce monoklonálne protilátky boli takmer zhodné vo všetkých komplementaritu určujúcich oblastiach (CDR) a rovnako v prilahlých úsekoch základnej štruktúry z čoho je možné usúdiť, že ide o klonálne príbuzné hybridómy.
Príklad 16: Imunobloting a analýza FACS
Sekvencie z rôznych oblastí neblokujúcich protilátok boli výrazne odlišné od klonálne príbuzných sekvencií nájdených v blokujúcich protilátkach. Na základe zistení, že blokujúce protilátky majú pôvod v jednom klone, sme na ďalšiu charkterizáciu vybrali iba jednu z nich (AJH10).
Imunobloting
Vrstva buniek hladkého svalu izolovaných z ovčej aorty a K562-ccl bunky sa lyžovali 1% Tritonom X-100 v nasledujúcom pufri: 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCI, 10 mM fenylmetylsulfonyl fluorid (PMSF), 20 μς/πιΐ aprotinín, 10 μς/πιΐ leupeptín a 10 mM kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA). Vzorky sa rozdelili na .SDS elektroforéze v gradiente 4 až 20% polyakrylamidového gélu (SDS-PAGE) a preniesli (elektroblotovali) na nitrocelulózové membrány. Bloty sa blokovali 5% sušeným mliekom v TBS; premyli v TBS obsahujúcom 0,03% Tween-20 a počas 2 hodín inkubovali s protilátkami v blokovacom pufri, ktorý obsahoval 0,05% NaN3· Bloty sa potom opäť premyli (v TBS obsahujúcom 0,03% Tween-20) a inkubovali jednu hodinu s protilátkami proti myším imunoglogulínom IgG konjugovanými s chrenovou peroxidázou. Potom sa bloty opäť premyli a po premytí sa k nim pridal substrátový roztok na ECL (Amersham) . Potom sa bloty na 30 až 60 sekúnd exponovali na film (Kodak) a vyvolali.
Imunoblot (pozri obrázok 17A) a analýza pomocou FACSu (pozri obrázok 17B) ukázali, že protilátka AJH10 reaguje s ľudským králičím a ovčím αϊβΐ integrínom, avšak nereaguje s krysím αϊβΐ integrínom. Z toho je možné vyvodiť, že sa blokujúca monoklonálna protilátka viaže na evolučné konzervovaný lineárny (spojitý) epitop. Neblokujúce monoklonálne protilátky jednak neboli účinné na imunoblote a ani nereagovali s inými než ľudskými druhmi integrínov.
Príklad 17: ' Väzba al-I domény na kolagén je závislá od dvojmocných katiónov
A. Purifikácia al-I domén al-I domény sa exprimovali v baktériách E.coli ako fúzne proteíny s GST (glutation-S-transferáza) s tým, že na mieste spoja oboch sekvencií sa nachádzalo cieľové miesto na štiepenie trombínom. Prečistený supernatant z buniek lyzovaných v PBS sa nanášal na kolónu glutathione Sepharóse 4B (Pharmacia), ktorá sa dôkladne premyla PBS. Fúzny proteín medzi al-I doménou a GST sa eluoval pomocou 50 mM Tris-HCI, pH 8.0, s 0,5 mM redukovaným glutatiónorn. Na ďalšie denanturačné štúdie sa doména I odštiepila trombínom v 50 mM Tris-HCi, pH 7,5 a oddelila od GST domény. Pridalo sa DTT (konečná koncentrácia 2 mM) a vzorky sa naniesli na kolóny Sefarózy 4B. Spojili sa frakcie flow-through a wash a navrstvili na kolónu Q Sepharóse FF (Pharmacia). al-I doména sa eluovala pomocou 50 mM Tris-HCi, pH 7,5, lOmM 2-merkaptoetanolu, 75 mM NaCl. Purifikovaná I doména mala predpokladanú molekulovú hmotnosť 871 Da (Lee a ďalší (1995), Structure 3, strana 1333 až 1340), čo sa určilo pomocou hmotnostnej spektrometrie s ionizáciou pomocou elektrospraye (ESI-MS) a migrovala ako jeden prúžok na SDS PAGE. Proteín bol rozdelený tiež pomocou chromatografie s exkluzným limitom na kolóne Superózy 6 FPLC (Pharmácia) a potom eluovaný ako jeden pík zodpovedajúcej velkosti.
B. Funkčná analýza jamkové mikrotitračné doštičky sa cez noc pri 4°C potiahli 1 ng/ml kolagénom typu IV (Sigma) alebo kolagénom typu I (Collaborative Biomedical), premyli Tritónovým pufrom (0,1% Triton X-100, 1 mM MgCl2, 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCI) a blokované 3% hovädzím sérovým albumínom (BSA) v 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCI (TBS). Takto potiahnuté doštičky sa pri teplote miestnosti počas jednej hodiny inkubovali so vzorkami postupne riedeného fúzneho proteínu al-I-GST v TSB obsahujúcom 1 mM MnCl2 a 3% BSA. Po inkubácii sa doštičky premyli Tritónovým pufrom. Naviazaná al-I doména sa detegovala postupným pridávaním nasledujúcich roztokov 10 μς/πιΐ biotinylovane j polyklonálne j protilátky proti GST (Pharmacia), konjugátu chrenovej peroxidázy s ExtrAvidínom (Sigma) riedenom 1:30000 v pufri TBS obsahujúcom 1 mM MnCl2 a 3% BSA a farbivá 1-Step ABST (2, 2'-azín-di[3-etylbenztiazolín sulfonát]; Pierce). Doštičky sa vyhodnotili odpočítaním absorbancie pri vlnovej dĺžke 405 nm čítačkou mikrotitračných doštičiek (Molecular Devices).
Výsledky
V bunkách E.coli sa exprimovali ludská a krysia al-I doména (z 95% identická s ludskou) vo forme fúzneho proteínu s GST. Fúzne proteíny sa purifikovali na glutatión-sefaróze. Oba proteíny sa testovali na schopnosť viazať kolagén typu I a IV pomocou mierne modifikovaného ELISA testu, ktorý bol už opísaný (Qu, A. a Leahy, D.J. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, strana 10277 až 10281). Ľudská al-I doména viaže kolagén typu IV lepšie ako kolagén typu IV (pozri obrázok 18A). Špecifická protilátka proti al-I doméne inhibuje väzbu na oba ligandy, zatial čo špecifická protilátka proti a2-I doméne nie (pozri obrázok 18B, údaje pre kolagén typu I nie sú uvedené).
Dvojmccné ióny Mn2+ a Mg2+ schopnosť väzby na kolagén zvyšovali, zatial čo prídavok EDTA znížil väzbu až na úroveň pozadia (pozri obrázok 18 C) . Vo väzbe na ligand neboli nájdené žiadne meratelné rozdiely medzi ľudskou a krysou al-I doménou, z čoho môžeme usudzovať, že sekvenčné rozdiely medzi oboma druhmi nemajú funkčný význam (údaje nie sú uvedené). Ďalším záverom je, že al-I doména vyžaduje pre väzbu na ligand kladné ióny.
Príklad 18: Epitop závislý na katiónoch sa nachádza v blízkosti motívu MIDAS
Na nájdenie epitopu monoklonálnej protilátky blokujúcej funkciu αϊβΐ domény sa využila skutočnosť, že monoklonálna protilátka AJH10 rozpoznáva ľudskú al-I doménu, ale nerozpozná už krysiu sekvenciu. Ľudská a krysia sekvencia sa líšia len v 12 aminokyselinách, z ktorých 4 ležia v krátkom 6 aminokyselinovom epitope (aa 92 až 97, pozri obrázok 14A), ktorý sa nachádza blízko kritického treonínu (pozri obrázok 14A, aa 98) v motíve MIDAS (metal ion dependent adhesion site, miesto pre adhéziu závislú na kovových iónoch). Hypotéza, že 6 aminokyselinových zvyškov (Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg) predstavuje cieľový epitop blokujúci monoklonálne protilátky, sa testovala na chimérickej I doméne (RAH), v ktorej boli zamenené krysie aminokyselinové zvyšky G92, R93, Q94 a L97 za im zodpovedajúce ľudské aminokyselinové zvyšky V, Q, R, respektíve R. Monoklonálna protilátka AJH10, rovnako tak ako všetky ďalšie blokujúce monoklonálne protilátky, bola schopná rozpoznať chimérickú I doménu (RAH; pozri obrázok 143).
Ďalej sa skonštruoval homologický model al-I domény použitím kryštálových súradníc pre a2-I doménu. Na základe tohto modelu sa určila priestorová orientácia uvedených aminokyselinových zvyškov vzhladom na motív MIDAS.
Homologický model ludskej al I-domény bol založený na rôntgenovej kryštálovej štruktúre ludskej a2-I domény (Ward a ďalší, (1989) Náture 341, strana 544 až 546). Na skonštruovanie tohto modelu sa použil špecializovaný modul na homologické modelovanie v programe Insight II (verzia 2.3.5, Biosym Technologies). Bol použitý program CHARMM (Clackson a ďalší, (1991) Náture 352, strana 624 až 628) so sadou parametrov č. 22 (so zahrnutím všetkých vodíkových atómov) a s dielektrickou konštantou závislou na vzdialenosti ako l/2r, kde r je vzdialenosť atómov. Prvých 1000 minimalizačných krokov sa uskutočnilo metódou najväčšieho spádu s hmotnostné váženou harmonickou pozičnou väzbovou podmienkou na všetky atómy a-I domény s velkosťou 1 kcal/(molA2) . Po tejto minimalizácii nasledovalo ďalších 1000 krokov metódou najväčšieho spádu a 5000 Newton Rawsonovou metódou (s adaptovanou bázou) a väzbovou podmienkou 0,1 kcal/(molÄ2) na C-α atómoch al-I domény, tak aby sa zamedzilo výraznej odchýlke od rôntgenovej štruktúry a2-I domény.
Sekvencie αϊβΐ a α2β1 integrínov zdieľajú 51% identických aminokyselinových zvyškov, pričom v jednotlivých doménach nie sú žiadne inzercie alebo delécie. Z toho je možné usúdiť, že celková štruktúra oboch I domén bude podobná. Predpokladané miesto, v ktorom dochádza ku koordinačnej väzbe kovových iónov je rovnaké v al-I doméne ako v a2-I doméne a aminokyseiinové zvyšky epitopu blokujúcej monoklonálnej protilátky ležia na slučke medzi helixom a3 a helixom a4 obsahujúcim aj treonín, ktorý patrí do motívu MIDAS, a ktorý je rozhodujúci pre väzbu katiónov. Z modelu al-I vyplýva, že amidový dusík v glutamíne Q92 (pozri obrázok 14A) vytvára vodíkovú väzbu s karbonylovou skupinou izoleucínom 133, ktorý je vedia serínu S32. Vyplýva z toho, že slučka obsahujúca uvedený epitop môže mať význam na stabilizáciu motívu MIDAS.
Hoci bol vynález do určitej miery opísaný prostredníctvom obrázkov a príkladov, ktoré slúžia predovšetkým na j-eho objasnenie a na lepšie porozumenie podstaty vynálezu, je iste odborníkom zrejmé, že pri použití vynálezu môže dochádzať k drobným zmenám a adaptáciám. Preto by opis a príklady použitia vynálezu nemali byť považované za obmedzenie rozsahu vynálezu. Vynález je ďalej presnejšie vymedzený nasledujúcimi nárokmi.
Zoznam sekvencií
<210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Homo Sapiens
<400> 1 caggatccgt 26 cagccccaca tttcaa
<210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Homo Sapiens
<400> 2 tcctcgaggg 26 cttgcagggc aaatat
<210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Rattus norwegicus
<400> 3 caggatccgt 26 cagtcctaca tttcaa
<210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Rattus norwegicus
<400> 4
tcctcgagcg cttccaaagc gaatat 26 <210> 5 <211> 212 <212> PRT <213> Rattus norwegicus <400> 5
Val Ser Pro Thr Phe Gin Val Val Asn Ser Phe Ala Pro Val Gin Glu
1 5 10 15
Cys Ser Thr Gin Leu Asp íle Val íle Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser
20 25 30
íle Tyr Pro Trp Glu Ser Val íle Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys
35 40 45
Arg Met Asp íle Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly íle Val Gin Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr
65 70 75 80
Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys íle Gly Arg Gin Gly Gly Leu
85 90 95
Gin Thr Met Thr Ala Leu Gly íle Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe
100 105 110
Thr Glu Arg Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val íle Val Thr
115 120 125
Asp Gly Glu Ser His Asp Asn Tyr Arg Leu Lys Gin Val íle Gin Asp
130 135 140
Cys Glu Asp Glu Asn íle Gin Arg Phe Ser •íle Ala íle Leu Gly His
145 150 155 160
Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu íle Lys
165 170 175
Ser íle Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp
ISO 185 190
Glu Leu Ala Leu Val Thr íle Val Lys Ala Leu Gly Glu Arg íle Phe
195 200 205
Ala Le.u Glu Ala
210 <210> 6 <211> 212 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6
Val Ser Pro Thr Phe Gin Val Val Asn Ser íle Ala Pro Val Gin Glu
1 5 10 15
Cys Ser Thr Gin Leu Asp íle Val íle Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser
20 25 30
íle Tyr Pro Trp Asp Ser Val Thr Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys
35 40 45
Arg Met Asp íle Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly íle Val Gin Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr
65 70 75 80
Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys íle Val Gin Arg Gly Gly Arg
85 90 95
Gin Thr Met Thr Ala Leu Gly Thr Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe
100 105 110
Thr Glu Arg Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val íle Val Thr
115 120 125
Asp Gly Glu Ser His Asp Asn His Arg Leu Lys Lys Val íle Gin Asp
130 135 140
Cys Glu Asp Glu Asn íle Gin Arg Phe Ser íle Ala íle Leu Gly Ser
145 150 155 160
Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu íle Lys
165 170 175
Ser íle Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp
180 185 190
Glu Leu Ala Leu Val Thr íle Val Lys Thr Leu Gly Glu Arg íle Phe
195 200 205
Ala Leu Glu Ala
210 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Rattus norwegicus <400> 7
Gly Arg Gin Gly Gly Leu 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 8
Val Gin Arg Gly Gly Arg 1 5 <210> 9<211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9
Val Gin Arg Gly Gly Arg

Claims (4)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použitie funkčnej blokujúcej protilátky alebo fragmentu tejto protilátky, ktoré sa viažu na epitop VLA-1, obsahujúci aminokyselinové zvyšky 92 až 97 zo sekvencie na obrázku 15, na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie artritídy.
  2. 2. Použitie podľa nároku 1, kde protilátka.
    protilátka je monoklonálna
  3. 3. Použitie podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 2, kde farmaceutická kompozícia je určená na liečenie ludí.
  4. 4. Použite podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde farmaceutická kompozícia je určená na liečenie reumatoidnej artritídy.
SK1723-2001A 1999-06-01 2000-06-01 Použitie blokujúcej monoklonálnej protilátky proti VLA-1 na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie zápalových ochorení SK17232001A3 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13703899P 1999-06-01 1999-06-01
US18533600P 2000-02-29 2000-02-29
PCT/US2000/015004 WO2000072881A1 (en) 1999-06-01 2000-06-01 A blocking monoclonal antibody to vla-1 and its use for the treatment of inflammatory disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK17232001A3 true SK17232001A3 (sk) 2002-09-10

Family

ID=26834850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1723-2001A SK17232001A3 (sk) 1999-06-01 2000-06-01 Použitie blokujúcej monoklonálnej protilátky proti VLA-1 na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie zápalových ochorení

Country Status (28)

Country Link
US (5) US6955810B2 (sk)
EP (3) EP1181054A1 (sk)
JP (6) JP4817503B2 (sk)
CN (1) CN1309419C (sk)
AU (2) AU783989B2 (sk)
BG (1) BG65579B1 (sk)
BR (1) BR0011250A (sk)
CA (1) CA2375827C (sk)
CY (1) CY1116042T1 (sk)
CZ (1) CZ300710B6 (sk)
DK (2) DK1488806T3 (sk)
EA (1) EA011384B1 (sk)
EE (1) EE200100651A (sk)
ES (2) ES2557768T3 (sk)
GE (1) GEP20063774B (sk)
HK (2) HK1043320A1 (sk)
HU (1) HUP0202568A3 (sk)
IL (2) IL146508A0 (sk)
IS (1) IS6179A (sk)
MX (1) MXPA01012388A (sk)
NO (1) NO20015864L (sk)
NZ (1) NZ515686A (sk)
PT (2) PT1488806E (sk)
SI (2) SI1488806T1 (sk)
SK (1) SK17232001A3 (sk)
TR (1) TR200103432T2 (sk)
WO (1) WO2000072881A1 (sk)
YU (1) YU85501A (sk)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2557768T3 (es) 1999-06-01 2016-01-28 Biogen Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante frente a VLA-1 y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
IL158376A0 (en) 2001-04-13 2004-05-12 Biogen Inc Antibodies to vla-1
AU2003215298A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Biogen, Inc. Alpha1beta1 antagonists for treatment of atherosclerosis
AU2003287435A1 (en) * 2002-11-01 2004-06-07 Boys Town Nat Res Hospital INDUCIBLE LIGAND FOR Alpha1Beta1 INTEGRIN AND USES
WO2005004800A2 (en) * 2003-06-20 2005-01-20 Morehouse School Of Medicine Trypanosome derived apoptotic factors (taf)
US20080093950A1 (en) * 2003-12-09 2008-04-24 Electrotechnologies Selem. Inc Polyphase Claw-Pole Machines With a Segmented Magnetic Circuit
US20050136055A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Pfizer Inc CD40 antibody formulation and methods
WO2006124269A2 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) * 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
PL2034830T3 (pl) * 2006-05-25 2015-04-30 Biogen Ma Inc Przeciwciało anty-VLA-1 do leczenia udaru
WO2009135953A2 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against integrins and uses thereof
KR102167261B1 (ko) * 2010-06-18 2020-10-20 엑스바이오테크, 인크. 관절염 치료
US10316095B2 (en) 2012-02-16 2019-06-11 Santarus, Inc. Antibody formulations
US11312775B2 (en) 2017-07-20 2022-04-26 University Of Virginia Patent Foundation Methods for treatment or prevention of a neurological immunity disorder

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
WO1988007089A1 (en) * 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) * 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5391481A (en) * 1990-08-31 1995-02-21 The Trustees Of Columbia University Antibody which is directed against and inhibits collagen binding to a VLA-1 epitope and uses thereof
US5871907A (en) * 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5565332A (en) * 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
DK0626861T4 (da) 1992-01-13 2004-08-16 Biogen Inc Behandling af astma.
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6307026B1 (en) * 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
SG44845A1 (en) 1993-01-12 1997-12-19 Biogen Inc Recombitant anti-vla4 antibody molecules
ES2114183T5 (es) 1993-02-09 2006-06-16 Biogen Idec Ma, Inc. Anticuerpo para el tratamiento de la diabetes dependiente de la insulina.
US6111598A (en) * 1993-11-12 2000-08-29 Peveo, Inc. System and method for producing and displaying spectrally-multiplexed images of three-dimensional imagery for use in flicker-free stereoscopic viewing thereof
US5827690A (en) * 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
ES2270425T3 (es) 1994-01-25 2007-04-01 Elan Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos humanizados contra la molecula de adhesion leucocitaria vla-4.
US5840299A (en) * 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
ES2151054T3 (es) * 1994-04-26 2000-12-16 Kanebo Ltd Farmaco para el tratamiento de la artritis reumatoide.
JPH08131185A (ja) * 1994-11-14 1996-05-28 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体
JPH08160972A (ja) 1994-12-01 1996-06-21 Sega Enterp Ltd エフェクト制御方法、制御装置およびこれを利用したカラオケ装置
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
GB9516399D0 (en) 1995-08-10 1995-10-11 Camelot Superabsorbents Ltd Process for the production of water-absorbing compositions
WO1997008320A1 (en) * 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
DK0843961T3 (da) 1995-08-29 2007-05-21 Kirin Brewery Kimærisk mus og fremgangsmåde til at producere samme
DE19534177A1 (de) * 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
GB9519667D0 (en) 1995-09-27 1995-11-29 Univ Manchester Pharmaceutical composition
DE19541844C1 (de) 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
FR2745912B1 (fr) * 1996-03-08 1998-05-29 Lorraine Laminage Procede et dispositif de controle de la soudabilite de toles sandwich
US6127524A (en) * 1996-10-18 2000-10-03 Dade Behring Inc. Binding molecules and computer-based methods of increasing the binding affinity thereof
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
DE69810481T2 (de) 1997-06-13 2003-09-25 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
PL345946A1 (en) 1998-05-22 2002-01-14 Boys Town Nat Res Hospital Use of α1β1 integrin receptor inhibitors and tgf-β1 inhibitors in the treatment of kidney disease
DE19831710A1 (de) * 1998-07-15 2000-01-20 Merck Patent Gmbh Diacylhydrazinderivate
CA2340333A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 Biogen, Inc. Crystals of the alpha 1 beta 1 integrin i-domain and their use
IL145898A0 (en) * 1999-04-22 2002-07-25 Biogen Inc Method for the treatment of fibrosis using an antagonist of the integrin alpha-4 subunit
ES2557768T3 (es) 1999-06-01 2016-01-28 Biogen Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante frente a VLA-1 y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
WO2000078221A1 (de) 1999-06-17 2000-12-28 Kai Desinger Chirurgische sonde zur minimal invasiven gewebeentnahme
WO2001073444A2 (en) 2000-03-28 2001-10-04 Cambridge University Technical Services Limited Receptor/peptide crystal structure for identification of inhibitors
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
DE10028402A1 (de) 2000-06-13 2001-12-20 Merck Patent Gmbh Pyridin-2-yl-aminoalkycarbonylglycyl-beta-alanin und Derivate
US7153944B2 (en) 2000-07-31 2006-12-26 The General Hospital Corporation High affinity integrin polypeptides and uses thereof
IL158376A0 (en) 2001-04-13 2004-05-12 Biogen Inc Antibodies to vla-1
AU2003215298A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Biogen, Inc. Alpha1beta1 antagonists for treatment of atherosclerosis
CA2494310A1 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US20040208870A1 (en) 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Stabilized high concentration anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
WO2005016883A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Icos Corporation Acrylamide derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
WO2005019200A2 (en) 2003-08-14 2005-03-03 Icos Corporation Aryl piperidine derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
US7285530B2 (en) 2004-10-21 2007-10-23 Viron Therapeutics, Inc. Use of SERP-1 as an antiplatelet agent
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
US20080118496A1 (en) 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
PL2034830T3 (pl) 2006-05-25 2015-04-30 Biogen Ma Inc Przeciwciało anty-VLA-1 do leczenia udaru
JP4951596B2 (ja) 2008-07-31 2012-06-13 株式会社日立製作所 冷却システム及び電子装置
CA2754528A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Genetech, Inc. Antibody formulation
CN107095846A (zh) 2009-12-21 2017-08-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗体配制剂
US20140017261A1 (en) 2011-02-03 2014-01-16 Mark Totoritis Selection and treatment of subjects
CN103380495B (zh) 2012-01-11 2016-05-18 松下知识产权经营株式会社 压接型半导体装置及其制造方法
US10316095B2 (en) 2012-02-16 2019-06-11 Santarus, Inc. Antibody formulations

Also Published As

Publication number Publication date
NZ515686A (en) 2005-01-28
YU85501A (sh) 2004-07-15
US6955810B2 (en) 2005-10-18
ES2529706T3 (es) 2015-02-24
IS6179A (is) 2001-11-28
US20050226877A1 (en) 2005-10-13
EP2314315B1 (en) 2015-01-21
JP2012176983A (ja) 2012-09-13
BR0011250A (pt) 2002-03-05
JP4817503B2 (ja) 2011-11-16
EA200400930A1 (ru) 2004-12-30
HK1154352A1 (en) 2012-04-20
PT2314315E (pt) 2015-03-17
US9902774B2 (en) 2018-02-27
ES2557768T3 (es) 2016-01-28
JP2011157403A (ja) 2011-08-18
US8084031B2 (en) 2011-12-27
SI2314315T1 (sl) 2015-04-30
US20090324598A1 (en) 2009-12-31
US20140154259A1 (en) 2014-06-05
BG106226A (en) 2002-08-30
NO20015864D0 (no) 2001-11-30
EP1488806B1 (en) 2015-12-09
US8557240B2 (en) 2013-10-15
BG65579B1 (bg) 2009-01-30
CY1116042T1 (el) 2017-01-25
AU2006201540A1 (en) 2006-05-11
EE200100651A (et) 2003-02-17
JP2004500328A (ja) 2004-01-08
CZ20014249A3 (cs) 2002-06-12
US20020146417A1 (en) 2002-10-10
WO2000072881A1 (en) 2000-12-07
IL146508A0 (en) 2002-07-25
HUP0202568A3 (en) 2009-11-30
GEP20063774B (en) 2006-03-27
EP1488806A3 (en) 2011-03-30
CA2375827A1 (en) 2000-12-07
US20120087925A1 (en) 2012-04-12
JP2007277253A (ja) 2007-10-25
EA011384B1 (ru) 2009-02-27
EP1488806A2 (en) 2004-12-22
AU783989B2 (en) 2006-01-12
CN1309419C (zh) 2007-04-11
US7462353B2 (en) 2008-12-09
EP2314315A1 (en) 2011-04-27
CN1390137A (zh) 2003-01-08
NO20015864L (no) 2002-02-01
EP1181054A1 (en) 2002-02-27
IL146508A (en) 2007-08-19
SI1488806T1 (sl) 2016-02-29
HUP0202568A2 (hu) 2002-11-28
MXPA01012388A (es) 2002-07-30
CA2375827C (en) 2017-01-10
JP5960762B2 (ja) 2016-08-02
DK1488806T3 (en) 2016-02-08
CZ300710B6 (cs) 2009-07-22
AU5724800A (en) 2000-12-18
JP2014210818A (ja) 2014-11-13
JP5623335B2 (ja) 2014-11-12
HK1043320A1 (zh) 2002-09-13
PT1488806E (pt) 2016-02-26
TR200103432T2 (tr) 2002-10-21
DK2314315T3 (en) 2015-02-02
JP2016121184A (ja) 2016-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8557240B2 (en) Method for the treatment of inflammatory disorders
US7723073B2 (en) Antibodies to VLA-1

Legal Events

Date Code Title Description
FB9A Suspension of patent application procedure