CZ300710B6 - Použití blokující monoklonální protilátky proti VLA-1 pro výrobu farmaceutického prípravku k lécení zánetlivých onemocnení - Google Patents

Použití blokující monoklonální protilátky proti VLA-1 pro výrobu farmaceutického prípravku k lécení zánetlivých onemocnení Download PDF

Info

Publication number
CZ300710B6
CZ300710B6 CZ20014249A CZ20014249A CZ300710B6 CZ 300710 B6 CZ300710 B6 CZ 300710B6 CZ 20014249 A CZ20014249 A CZ 20014249A CZ 20014249 A CZ20014249 A CZ 20014249A CZ 300710 B6 CZ300710 B6 CZ 300710B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
integrin
monoclonal antibodies
mice
human
Prior art date
Application number
CZ20014249A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20014249A3 (cs
Inventor
Fougerolles@Antonin De
Gotwals@Philip
Lobb@Roy
Koteliansky@Victor
Original Assignee
Biogen Idec Ma Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Idec Ma Inc. filed Critical Biogen Idec Ma Inc.
Publication of CZ20014249A3 publication Critical patent/CZ20014249A3/cs
Publication of CZ300710B6 publication Critical patent/CZ300710B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/06—Antimigraine agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

Rešení se týká lécení zánetlivých procesu nejen u lidí, ale i u zvírat, specificky lécení artritidy (zánetlivého onemocnení kloubu). Konkrétne se týká použití funkcní blokující protilátky nebo fragmentu této protilátky, které se váží na epitop VLA-1, pro výrobu farmaceutického prípravku k lécení artritidy. Jedná se o protilátky blokující integrin .alfa.1.beta.1, poprípade fragment takové protilátky. K zablokování dochází tak, že protilátka nebo její fragment se naváže na epitop VLA-1. Epitop VLA-1 je tvoren aminokyselinovými zbytky 91 až 96 (Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg). Protilátka proti podle vynálezu je humánní protilátka, chimerická protilátka, nebo humanizovaná protilátka, a to jak monoklonální, tak i polyklonální protilátka.

Description

Použití blokující monoklonální protilátky proti VLA-1 pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení zánětlivých onemocnění
Oblast techniky
Vynález se týká léčení zánětlivých procesů, konkrétně artritidy (zánětlivého onemocnění kloubů). Toto léčení spočívá v podávání léčiva obsahujícího účinné množství protilátky blokující integrin αϊβΐ, popřípadě obsahujícího fragment takové protilátky, K zablokování dochází tak, že protiio látka (nebo její fragment) se navážou na epitop (povrchovou strukturu integrinu) VLA-1. Epitop
VLA-1 je tvořen aminokyselinovými zbytky 91 až 96 (Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg).
Protilátka proti integrinu může být buď přímo lidská protilátka, chimérická protilátka, nebo humanizovaná protilátka, případně lze použít fragment některé z těchto protilátek. Může být poui5 žita jak monoklonální, tak i polyklonální protilátka.
Vynález se týká léčení zánětlivých onemocnění nejen u lidí, ale i u zvířat.
Dosavadní stav techniky
Integriny jsou komplexy povrchových buněčných proteinů, které tvoří celou rozsáhlou třídu povrchových molekul zprostředkovávajících adhezi buněk k sobě navzájem a k jejich okolí. Vzájemná adheze buněk, jakož i adhezi k okolí je nutná při celé řadě vývojových a fyziotogic25 kých procesů. Jako příklad lze uvést tvorbu tkání a orgánů a udržování jejich celistvosti. Jedním z důležitých fyziologických procesů, v jehož průběhu hrají integriny významnou úlohu, je i zánětlivý proces.
Jedním z klíčových momentů zánětlivého procesu je prostupování buněk z cévního řečiště do okolní tkáně a jejich pohyb směrem k místu infekce. Uplatnění adheze při tomto procesu lze nalézt a popsat ve třech krocích, a sice při iniciační fázi, kdy se leukocyty pomalu pohybují („rokling“) v místě zánětem postižené cévní výstelky (endotelu), dále při jejich pevném připojení k cévní výstelce a následujícím prostupování skrz cévní výstelku do zánětem postižené tkáně (Hyneš, R.O. 1992 Cell 69: strana 11 až 25; Springer, T.A. 1992 Cell 76: strana 301 až 314).
Další důležitou součástí zánětlivého procesu, dosud ne zcela prozkoumanou a popsanou, je putování buněk imunitního systému z okolních tkání směrem k místu infekce. Zde následuje rozpoznání tělu cizí látky -antigenu, což způsobuje aktivaci těchto obranných buněk, které tím získávají schopnost vykonávat svoji tzv. efektorovou funkci. V následujícím textuje na modelových příkladech zánětlivých onemocnění kloubů (dále „artritidy“) u pokusných zvířat ukázán význam adhezivních interakcí v mezibuněčném prostoru v místě zánětlivého procesu, zejména pak na působení adhezivních molekul proteinových komplexů - integrinu ajejich fragmentů, který je testován nezávisle na adhezivních interakcích při aktivaci leukocytů.
Popis obrázků
Obrázek 1: Kolagen-vázající integriny al a α2β1 na aktivovaných leukocytech.
(A) Exprese integrinu al a α2β! na IL-2-aktivovaných splenocytech analyzovaná pomocí průto50 kové cytometrie (d 11). Buňky byly značené monoklonální protilátkou proti al, nebo proti a2, nebo kontrolní nevázající se monoklonální protilátkou (šedé čáry), které, byly zvýrazněny protilátkou proti křeččím protilátkám konjugovanou s FITC (fluorescein-sothiokyanát).
(B) Účinek monoklonálních protilátek proti al a a2 na adhezi leukocytů ke kolagenu. 105 IL—2 aktivovaných splenocytů bylo inkubováno s uvedenými monoklonálními protilátkami po dobu 15 minut a poté vyseto do jamek potažených kolagenem typu IV nebo typ I, ve kterých byly buňky inkubovány ] h při teplotě 37 °C. Adheze byla vypočítána postupem podle příkladu 1 a vyjádřena v % adheze vzhledem k buňkám ošetřeným kontrolní protilátkou. V těchto testech byly vždy provedeny alespoň ve třech opakováních na jednu mikrotitrační desku a byly provedeny alespoň tři nezávislé experimenty. Na obrázku je znázorněn výsledek jednoho typického experimentu.
Obrázek 2: Účinek monoklonálních protilátek proti integrinům na efektorovou fázi hypersenzitivity pozdního typu io Myším senzitizovaným podáním ovčích červených krvinek (SRBC-sheep red blood celíš) byla intraperitoneálně (i.p.) aplikována uvedená monoklonální protilátka 1 hodinu před provokačním očkováním pomocí ovčích krvinek SRBC. 20 hodin po tomto očkování byla změřena tloušťka tlapky a výsledky vyjádřeny jako percentuální nárůst tloušťky tlapky ± SEM (střední chyba), viz příklad 2. Tato data reprezentují přehled osmi experimentů ve kterých bylo n-79 (fosfátem puf15 rovaný fyziologický roztok, PBS), n=68 (kontrolní křeččí lg), n=68 (anti-αΐ), n=29 (anti-a2), n= 18 (anti-al + anti-a2), n=45 (anti-a4), n-18 (anti-a5), n=20 (anti-a6) a konečně n=10 (antiβΐ). Byly použity následující monoklonální protilátky: Ha4/8 (kontrolní křeččí Ig, skupina 2), Ha31/8 (anti-al), Hal/29 (anti-a2), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (antí-a5), GoH3 (anti-αό) a konečně ΗΜβ-1 (anti-βΐ).
Obrázek 3: Účinek monoklonálních protilátek proti integrinu na efektorovou fázi kontaktní hypersenzity
FITC-senzitizovaným myším byla intraperitoneálně aplikována uvedená monoklonální protilátka
4 hodiny před provokačním očkováním pomocí FITC. 24 hodin po tomto očkování byla změřena tloušťka základny ušního boltce a výsledky vyjádřeny jako percentuální nárůst tloušťky ušního boltce ± SEM, viz příklad 3.Tato data reprezentují výsledek z devíti experimentů, ve kteiých byly použity následující počty zvířat: n=74 (PBS), n=60 (kontrolní křeččí Ig), n=26 (anti-ICAM-1), n=44 (anti-al), n-44 (anti-a2), n-38 (anti-al + anti-a2), n=36 (anti-a4), n= 16 (anti-a5), n=26 (anti-a4 + anti-a5), n=24 (anti-a6), a konečně n=22 (anti-βΐ). V pokusu byly použity následující křeččí monoklonální protilátky: Ha4/8 (kontrolní křeččí Ig, skupina 2), Ha3l/8 (anti-al), Hal/29 (anti-a2), ΗΜβ-1 (anti-βΐ), 3E2 (anti-ICAM-1), a krysí monoklonální protilátky: R3595 a R35-38 (kontrolní krysí IgG2a respektive IgG2b,), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti-a5) a konečně GoH3 (anti-a6).
Obrázek 4: Kontaktní hypersenzitivní odezva αΐ-defícientních myší proti normálním myším.
FITC-senzitizovaným myším byla intraperitoneálně aplikována uvedená monoklonální protilátka 4 hodiny před provokačním očkováním pomocí FITC. 24 hodin po tomto očkování byla změřena tloušťka základny ušního boltce a výsledky vyjádřeny jako percentuální nárůst tloušťky ušního boltce ± SEM, viz příklad 4. V experimentu byly použity skupiny po čtyřech az pěti myších na variantu, přičemž všechny experimenty byly provedené alespoň třikrát. Je znázorněn výsledek jednoho typického experimentu.
Obrázek 5: Účinek monoklonálních protilátek proti al a proti a2 integrinům na nespecifickou zánětlivou reakci vyvolanou krotonovým olejem hodiny před potřením ušních boltců krotonovým olejem byla myším intraperitoneálně aplikována uvedená monoklonální protilátka. 24 hodin po tomto očkování byla změřena tloušťka základny ušního boltce a výsledky vyjádřeny jako percentuální nárůst tloušťky ušního boltce ± SEM, viz přiklad 5. V experimentu byly použity skupiny po čtyřech až pěti myších na variantu, přičemž všechny experimenty byly provedené alespoň třikrát. Je znázorněn výsledek jednoho typického experimentu.
Obrázek 6: Účinek monoklonálních protilátek proti al a proti a2 integrinu na artritidu vyvolanou pomocí monoklonální protilátky proti kolagenu
Prvního dne (d 0) byla myším intraperitoneálně aplikována monoklonální protilátka proti kolage5 nu a třetího dne byl aplikován LPS. Myším byla dále každý třetí den intraperitoneálně aplikována uvedená monoklonální protilátka počínaje prvním dnem. Klinická artritida byla zjevná druhého až třetího dne po aplikaci LPS a pokračovala několik týdnů. Všechny končetiny byly bodově ohodnoceny na pětistupňové škále ((M) každý třetí den, viz příklad 6, a výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre mezi dny d9 a dl5 (± SEM) na všech čtyřech končetinách. Uvede10 ná data reprezentují výsledky ze čtyř experimentů přičemž v každém experimentu byly použity skupiny po čtyřech až pěti myších na variantu.
Obrázek 7: Aplikace monoklonální protilátky proti al nebo a2 integrinu inhibuje infiltraci leukocytů do tlapky v průběhu DTH odezvy
Experiment byl proveden stejně, jak je popsáno u obrázku 2, Tlapky byly vyříznuty 20 hodin po aplikaci antigenů a tkáňové řezy byly obarveny hematoxylinem a eosinem. Řezy jsou z tlapek myší buď bez provokačního očkování (A), nebo myší senzitizovaných pomocí ovčích krvinek SRBC a poté provokačně očkovaných další dávkou SRBC (B-H). Myši byly ošetřeny hodinu před provokačním očkováním buď jenom PBS (B), kontrolní křečci Ig (C, G), protilátkou anti-al (D), protilátkou anti-a2 (E) nebo kombinací monoklonálních protilátek anti-αΐ a anti-a2 (F, H). Zvětšení: 100 x (A až F), 400 x (G až H).
Obrázek 8: α 1 β 1 antigen je exprimován na infiltruj ících leukocytech v tlapce během DTH odez25 vy
Imunohistochemické barvení pronikajících leukocytů ze zanícené tlapky nevakcinovaného zvířete 20 h po expozici antigenem. (A). Sériové řezy obarvené přímo konjugátem kontrolní monoklonální protilátky respektive protilátky proti al integrinu s barvivém Alexa488. (B). Dvojité imunofluorescenční barvení s konjugátem monoklonální protilátky proti al integrinu s barvivém Alexa488 a konjugátem monoklonální protilátky proti buněčné linii s fykoerytrinem (PE). Použité monoklonální protilátky konjugované s PE byly specifické pro granulocyty/monocyty (antiCDllb), neutrofily (anti-Ly6G/Gr-l) a T-lymfocyty (anti-CD3). Bylo použito 400-násobné zvětšení.
35
Obrázek 9: Účinek monoklonální protilátky proti al a a2 integrinu při artritidě vyvolané monoklonální protilátkou proti kolagenu (A) Preventivní ošetření myší monoklonálními protilátkami proti al nebo a2 integrinu snižuje artritické skóre. Prvního dne byla myším aplikována monoklonální protilátka proti kolagenu a třetího dne byl aplikován LPS. Klinická artritida se objevila šestý den po aplikaci protilátky proti kolagenu (d=ó) a poté byla zjevná po několik týdnů. Myším byla dále každý třetí den intraperitoneálně aplikována uvedená monoklonální protilátka počínaje prvním dnem. Všechny končetiny byly bodově ohodnoceny na pětistupňové škále (0-4) každý třetí den a výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre mezi dny d9 a dl5 (± SEM) na všech čtyřech končetinách (maximální skóre 16). Uvedená data reprezentují výsledky ze 12 experimentů přičemž v každém experimentu byly použity skupiny po čtyřech myších na variantu. (B) αΐ-deficientní myši mají snížené artritické skóre srovnatelné s normálními (wild type) myšmi ošetřenými monoklonální protilátkou proti al integrinu. Experimentální podmínky byly stejné jako ve výše uvedeném pokuse.
Opět byly použity skupiny po 4 zvířatech na variantu, znázorněn je průměr ze 2 experimentů.
Obrázek 10: Účinek léčby monoklonální protilátkou proti al integrinu na imunopatologii artritických kloubů
- 1 .
Aplikace monoklonální protilátky proti al integrinu zredukuje infiltraci leukocytů, adhezi buněk na kloubní povrch a následné poškození chrupavky, které se projevuje ztrátou proteoglykanu. Na obrázcích jsou vyhodnoceny zadní končetiny z normálních (A až D) nebo artritických myší (d8), které dostávaly buď kontrolní křečci Ig (E až H) nebo monoklonální protilátku proti al integrinu.
(I až L). Končetiny byly vyfotografovány (A, Ε, I), odříznuty a tkáňové řezy obarveny buď hematoxylinem/eosinem (B-C, F-G, J-K), nebo toluidinovou modří tak, aby se obarvil proteoglykan (D, H, L). Zvětšení: 16x (obrázky B, F, J); 160x (obrázky C, G, K); 200 x (obrázky D, H, L)io Obrázek 11: Vývoj artritidy je opožděn v nepřítomnosti lymfocytů a zároveň v nepřítomnosti lymfocytů dochází k inhibici artritidy pomocí monoklonální protilátky proti al integrinu
Běžné myši B6,129 nebo RAG-l-deficientní myši B6,129 byly ošetřeny monoklonální protilát15 kou proti kolagenu dne 0. Poté následovala aplikace LPS 3, dne. Artritida byla zjevná 6. dne a vydržela několik týdnů. Myším byla dále každý třetí den aplikována uvedená monoklonální protilátka počínaje prvním dnem. Všechny končetiny byly bodově ohodnoceny na pětistupňové Škále (0—4) každý třetí den a výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre mezi dny d9 a dl 5 (± SEM) na připadající na jednu končetinu (maximální skóre 4). V experimentu byly použity
2o skupiny po čtyřech myších na variantu.
Obrázek 12: Dávková citlivost při použití monoklonální protilátky proti al integrinu na inhibici artritidy
Běžné myši Balb/c byly dne 0 ošetřeny monoklonální protilátkou proti kolagenu. Poté následovala aplikace LPS 3. dne. Artritida byla zjevná 6. dne a vydržela několik týdnů. Myším byla dále každý třetí den počínaje prvním dnem i.p. aplikována uvedená dávka buď kontrolní monoklonální protilátky Ha4/8 stejného isotypu nebo protilátky Ha31/8 proti al. Všechny končetiny byly bodově ohodnoceny na pětistupňové škále (0 až 4) každý třetí den a výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre mezi dny d9 a dl 5 (± SEM) na připadající na jednu končetinu (maximální skóre 4). V experimentu byly použity skupiny po čtyřech myších na variantu.
Obrázek 13: Léčba pomocí monoklonální protilátky proti al může snížit artritické skóre
Běžné myši Balb/c byly dne 0 ošetřeny monoklonální protilátkou proti kolagenu. Poté následovala aplikace LPS 3. dne. Artritida byla zjevná 6. dne a vydržela několik týdnů. Myším bylo dále každý třetí den počínaje prvním dnem i.p. podáno 250 pg uvedené monoklonální protilátky nebo 200 pg fúzního proteinu. Byla aplikována buď kontrolní monoklonální protilátka Ha4/8 stejného izotypu, nebo protilátka Ha31/8 proti al, nebo fúzní protein s imunoglobulinem (izotypová kont40 rolní íg nebo fúze TNF-R55-Ig) nebo kombinace obou (250 pg Ha31/8 a 200 pg TNF-R55-Ig). Všechny končetiny byly bodově ohodnoceny na pětistupňové škále (0-4) každý třetí den a výsledky byly vyjádřeny jako průměrné artritické skóre mezi dny d9 a dl 5 (± SEM) na připadající na jednu končetinu (maximální skóre 4). V experimentu byly použity skupiny po čtyřech myších na variantu.
Obrázek 14: Lokalizace epitopu blokující monoklonální protilátky proti al I doméně integrinu
A) Aminokyselinová sekvence krysí (nahoře) a lidské (dole) al -í domény. Aminokyselinové zbytky představující motiv MIDAS (metal ion dependent adhesion site, místo pro adhezi závislou na kovových iontech) je znázorněno tučným písmem.
Lidské aminokyselinové zbytky, kterými byly nahrazeny původní krysí aminokyseliny (RAH) jsou uvedeny pod krysí sekvencí v rámečku. Pro lepší srozumitelnost jsou aminokyselinové zbytky v dalším textu číslovány podle tohoto obrázku.
B) Zvyšující se koncentrace monoklonální protilátky AJH10 (ATCC Č:) byly navázány na desku potaženou lidskou (kolečka), krysí (trojúhelníčky) nebo RAH (čtverečky) αΐ—I doménou o koncentraci 30 pg/ml. Uvedené údaje vycházejí ze tří experimentů.
Obrázek 15: Aminokyselinová sekvence lidské α 1 —I domény
Obrázek 16: Identifikace blokující monoklonální protilátky proti al-I doméně
A) Zvyšující se koncentrace monoklonální protilátky AEF3 (trojúhelníčky) nebo AJH10 (ATCC io č: (kolečka) byly navázány na plotny potažené α 1—I doménou o koncentraci 30 pg/ml.
B) Al—I doména byla inkubována se zvyšujícími se koncentracemi monoklonální protilátky AJH10 (ATCC č:) (kosočtverečky) nebo monoklonální protilátky BGCS (čtverečky) a navázány na plotny pokryté kolagenem IV (2 gg/ml).
C) K562-al buňky byly inkubovány se zvyšující se koncentrací monoklonálních protilátek AEF3 (trojúhelníčky) nebo AJH10 (ATCC č:, kolečka) a navázány na plotny pokryté kolagenem IV (5 pg/ml). 45 až 50 % buněk přidaných do jamek na desce se navázalo na kolagen IV. Uvedené údaje vycházejí ze tří nezávislých experimentů.
Obrázek 17: Mezidruhová křížová reaktivita blokujících monoklonální protilátek
A) Působením detergentu připravené lysáty z (1) vaskulámího hladkého svalu ovce, (2) z lidských leukemických buněk K562-al nebo (3) purifikovaná RAH GST-I doména; (4) krysí GST25 al I doména a konečně (5) lidská GST-al I doména byly rozděleny na 10 až 20% gradientu SDS-PAGE za neredukuj ících podmínek. Poté byl proveden imunoblot s blokující monoklonální protilátkou AJH10 (ATCC č:). Standardy relativní molekulové hmotnosti jsou zcela vlevo; neredukovaný α 1 β 1 integrin putuje v oblasti cca 180 kDa, GST-I doména putuje v oblasti cc 45 kDa,
B) Buňky z vaskulámího hladkého svalu králíka byly inkubovány buď s monoklonální protilátkou AJH10 (ATCC č:, dole), nebo s kontrolní myší IgG (nahoře) a analyzovány pomocí FACS (fluorescence activated cell sorter, přistroj třídící buňky pomocí flourescenční značky).
Obrázek 18: al—ί doména váže kolagen.
A) Zvyšující se koncentrace lidské al—I domény byly navázány na plotny potažené 1 pg/ml kolagenu I (čtverečky) nebo kolagenu IV (kolečka). Uvedené hodnoty byly korigovány odečtením nespecifické vazby v jamkách potažených hovězím albuminem (BSA).
B) 2 pg/ml lidské α 1 -1 domény bylo smíšeno se zvyšujícími se koncentracemi protilátky SE8D9 proti lidskému al integrinu (čtverečky) nebo se zvyšujícími se koncentracemi protilátky A2IIE proti lidskému integrinu a2 (kolečka) a poté navázáno na plotny potažené 1 pg/ml kolagenu IV,
C) Plotny byly potaženy kolagenem IV o koncentraci 1 pg/ml nebo 3% BSA. Na potažené plotny byla poté přidána doména α 1—I (2 pg/ml) v přítomnosti 1 mM Mn2+, 1 mM Mg2+, nebo 5 mM EDTA. Uvedené údaje vycházejí ze tri nezávislých experimentů.
Podstata vynálezu 50
Vynález popisuje, že protilátka proti integrinu zejména pak proti al podjednotce integrinu, může zablokovat interakci leukocytů aktivovaných v průběhu zánětu, se složkami mezibuněčného prostředí jako jsou mimo jiné kolagen, laminin a fibronektin. Lze předpokládat, že použitím protilátky proti integrinu, a tedy zamezením interakce integrinu a jeho pod jednotky s okolní mezi55 buněčnou hmotou, se snižuje výskyt zánět podporujících cytokinů.
Protilátky blokující integriny ajejich fragmenty mohou rovněž tlumit efektorovou fázi zánětlivých procesů působením na úrovni antigen-specifických T lymfocytů. Dále se uvažuje, že protilátky blokující integriny (ajejich fragmenty) mohou zabraňovat migraci buněk tkáněmi a/nebo zabraňovat aktivaci buněk v okolních tkáních.
Vynález popisuje význam, kteiý mají adhezívní molekuly ze skupiny integrinu, zvláště integrin ol pl, v periferních tkáních v průběhu zánětlivého procesu. Vynález dále popisuje významnou úlohu integrinu ajejich fragmentů nejenom v procesu připojování leukocytů k cévní výstelce a io prostupování touto výstelkou, ale zejména podtrhuje jejich význam v okolních tkáních v průběhu zánětlivého procesu a přivádí pozornost právě k okolním tkáním jakožto možnému prostředí aplikace terapií založených na ovlivnění adheze.
Vynález popisuje použití protilátek blokujících integriny, v jejichž struktuře je obsažen β řetězec, 15 mimo jiné například řetězce (βΐ, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, vázaný nekovalentní vazbou k α řetězci, mimo jiné například k řetězci al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, alO, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Jako příklad cílových integrinu vhodných použití protilátky podle vynálezu lze
uvést mimo jiné například integriny:
αϊβΐ, «2β1, α3β1, α4β1, αδβΐ, αββΐ, α7β1, αθβΐ, «9β1,
αΙΟβΙ, ανβΐ, αΣβΙ, αΜβΙ, αΧβΙ, αϋβΐ, allbpl, αΕβΙ;
α1β2, α2β2, α3β2, α4β2, α5β2, α6β2, α7β2, α8β2, α9β2,
α10β2, ανβ2, αίβ2, αΜβ2, αΧβ2, αϋβ2, αΙΏ>β2, αΕβ2;
α1β3, α2β3, α3β3, α4β3, α5β3, α6β3, α7β3, α8β3, α9β3, α10β3, ανβ3, aL£3, αΜβ3, αΧβ3, αΌβ3, αΙΏοβ3, αΕβ3;
«1β4, α2β4, α3β4, α4β4, α5β4, α6β4, α7β4, α8β4, α9β4, α10β4, ανβ4, αίβ4, αΜβ4, αΧβ4 αϋβ4, αΙΐυβ4, 0ίΕβ4;
α1β5, α2β5, α3β5, α4β5, α5β5, <χ6β5, α7β5, α8β5, α9β5, α10β5, ανβ5, αΣβ5, αΜβ5, αΧβ5, αθβ5, αϊΏοβδ, αΕβ5;
α!β6, α2β6, α3β6, α4β6, α5β6, α6β6, ο<7β6, α8β6, α9β6, αΙΟββ, ανβ6, ο±β6, αΜβ6, αΧβ6, αϋβ6, αΙΙΙοββ, αΕββ;
α1β7, α2β7, α3β7, α4β7, α5β7, αββ7, α7β7, α8β7, α9β7, α10β7, ανβ7, αίβ7, αΜβ7, αΧβ7, αϋβ7, allbp7, αΕβ7;
α1β8ζ «2β8, α3β8, α4β8, α5βθ, α6β8, α7β8, α8β8, α9βδ, α!0β8, ανβ8, αΕβ8, αΜβ8, αΧβ8, αΩβδ, alIbpB, αΕβΒ;
Vynález dále popisuje použití protilátek proti integrinovým fragmentům, včetně protilátek například proti samotnému β řetězci jako jsou například (mimo jiné) protilátky proti βΐ, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8 řetězci, anebo protilátky pouze proti řetězci a jako například (ale nejenom) proti řetězcům al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, a 10, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Dále se počítá s použitím protilátek k integrinovým fragmentům jako je například protilátka k pouhé I doméně řetězce a, například 1 doméně αϊβΐ (Briesewitz a další, 1993 J. Biol. Chem. 268; strana 2989); α2β1 (Takada a Hemler, 1989 J. Cell. Biol. 109: strana 397), αίβ2 (Larson a další, 1989 J. Cell. Biol. 108: strana 703), αΜ(β2 (Corbi a další; 1988 J. Biol. Chem. 263: strana 12403), αΧβ2 (Corbi a další, 1987 EMBO J. 6: strana 4023), αϋβ2 (Grayson a další, 1988 J. Exp. Med. 188: strana 2187), αΕβ7 (Shaw a další, 1994 J. Biol. Chem. 269: strana 6016). Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje antigenní determinanta al—I domény kontinuální úsek 6 aminokyselin, přičemž se tento kontinuální vyskytuje rovněž v sekvenci na obrázku 15. Ve výhodném provedení vynálezu je touto souvislou sekvencí sekvence Val-GIn-Arg-Gly-Gly-Arg.
Způsob přípravy integrinu pro účely vynálezu jsou známy ze stavu techniky, viz například Springer a další 1990, Nátuře 346:strana 425 až 434.
Vynález dále popisuje monoklonální a polyklonální protilátky proti íntegrinům. Výhodným pro15 vedením vynálezu je monoklonální protilátka, například monoklonální protilátka proti al podjednotce integrinu.
Protilátka blokující integrin αϊβΐ podle vynálezu představuje protilátku, která se váže k al -1 doméně tohoto integrinu, a to výhodně k aminokyselinovým zbytkům 92 až 97 podle sekvence uvedené na obrázku 15 a blokuje tak její funkci. Takto například dochází k inhibici K562-al dependentní adhezi ke kolagenu typu IV (viz příklad 15).
Výhodné protilátky podle vynálezu ajejích homology určené pro humánní léčbu zahrnují například lidské homology protilátek z jiných druhů, ajejích humanizované, chimérické homology, protilátkové fragmenty Fab, Fab',F(ab')2 a F(v), a monomery a dimeiy těžkých nebo lehkých řetězců protilátek, případně jejich kombinace. Monoklonální protilátky proti molekule integrinu a proti jejím fragmentům jsou nejdůležitější a nej výhodnější vazebnou látkou pro použití podle vynálezu.
Termínem „homolog protilátky“ se rozumí intaktní protilátka skládající se z těžkých a lehkých Í munoglobu línových řetězců spojených d i sulfidovou vazbou. Tímto termínem se rovněž rozumí protein obsahující jeden nebo více polypeptidových řetězců složený z lehkých nebo těžkých imunoglobulinových řetězců a jejich fragmentů, které mají schopnost vázat se na nejméně jeden antigen (to jest na integrinovou doménu obsahující al, a2, aó nebo a-I podjednotku). Jednotlivé polypeptidy proti látkového homologu, který se skládá z více než jednoho polypeptidů, mohou být A, spolu vázány buď disulfídovou vazbou, anebo mohou být jakkoli kovalentné propojeny.
Z toho vyplývá, že termín „homology protilátky“ zahrnuje intaktní imunoglobuliny typu IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (jakož i jejich podtypy), obsahující lehké řetězce typu kappa nebo lambda.
Termínem „homology protilátek“ se také rozumí části intaktních protilátek, které mají zachovánu schopnost specifické vazby na antigen, například Fab fragmenty, Fab'fragmenty, F(ab')2 fragmenty, F(v) fragmenty, monomery či dimery těžkých řetězců, monomery či dimery lehkých řetězců, atd. Pro použití podle vynálezu jsou tedy vhodné jakékoliv fragmenty schopné vázat antigen, jakož i polypeptidy o úplné délce (full-length) odvozené od výše uvedených protilátek a jejich dimery nebo trimery.
Termínem „humanizovaný homolog protilátky“ se rozumí homolog protilátky, připravený metodami genového inženýrství, ve kterém je jedna nebo více z aminokyselin lehkého nebo těžkého imunoglobulinového řetězce, které na sebe neváží antigen, nahrazena odpovídající aminokyselinou lehkého nebo těžkého imunoglobulinového řetězce z protilátky jiného savčího druhu.
Termínem „chimérický homolog protilátky“ se rozumí protilátkový homolog, připravený metodami genového inženýrství, ve kterém je pantová oblast (hinge region) nebo její část nebo kons tantní oblast nebo její část lehkého nebo těžkého imunoglobulínového řetězce, případně obou, nahrazena odpovídající částí jiného lehkého nebo těžkého imunoglobulínového řetězce.
Vynález dále popisuje variantu chimérické molekuly, která obsahuje následující součásti: (1) složku se schopností navázat se na integrin; (2) ta může být někdy doplněna o peptid, který zvyšuje rozpustnost této složky nebo její životnost v živém organismu; může to být například některý z široké skupiny imunoglobulinů nebo jejich fragmentů a Částí, část nebo fragment imunoglobulínu IgG, například pevná oblast těžkého řetězce lidského IgG, nebo například CH2 a CH3 segment pantové oblasti; (3) toxinovou složku. Chimérická molekula podle vynálezu může být pouto žita při léčbě poruch souvisejících s proliferaci epiteliálních buněk, jako jsou například vlasové folikuly.
Dále se v textu setkáme s termínem „homolog lidské protilátky“, kterým se rozumí homolog protilátky připravený pomocí technik genového inženýrství, ve kterém jsou všechny aminokyse15 liny jednoho z imunoglobulinových řetězců (lehkého nebo těžkého) nahrazeny příslušnou částí získanou z lidského zdroje.
„Zánětlivými onemocněními“ se rozumí především kožní onemocnění jako jsou lupénka, ekzémy, popáleniny a záněty kůže. Způsoby podle vynálezu zahrnují rovněž léčbu jiných onemocně20 ní, jako je například astma, záněty průdušek, menstruační křeče, záněty šlach. Způsoby podle vynálezu se dále dají využít při ulevování od bolesti různého původu a jako antipyretikum při výskytu horeček. Dále vynález popisuje léčbu gastrointestinálních onemocnění jako jsou zánětlivá onemocnění střev, Crohnův syndrom, zánět žaludku, dráždivý tračník a vředové onemocnění tlustého střeva, a dále preventivní opatření při podezření na vznik nádorového onemocnění tlus25 tého střeva a konečníku. Další skupinou indikující použití způsobu podle vynálezu jsou zánětlivá onemocnění cév, migrenózní stavy, thyroyditida, zánět štítné žlázy, aplastická anémie, Hodgkinova choroba, revmatická horečka, cukrovka I. typu, myastenia gravis, roztroušená skleróza, sarkoidóza, nefrotický syndrom, Behcetův syndrom, polymyositóza, zánět dásní, zvýšená citlivost, zánět spoj i vek, otoky po zraněních, ischemie srdečního svalu, atd. V neposlední řadě vyná30 lez popisuje léčbu alergické rýmy, dechových potíží, anafylaktického šoku a arteriosklerózy.
Ve výhodném provedení je vynález použit při léčbě zánětlivého onemocnění kloubu, včetně například revmatoidní artritidy a osteoartritidy.
Za účinnou dávku se považuje takové množství preparátu, které má prokazatelný zlepšující účinek, případně množství, jehož účinkem se dosáhne požadovaných klinických výsledků. Účinné množství preparátu lze podat najednou nebo v několika dávkách. V terminologii léčby zánětlivého onemocnění nazýváme „účinným množstvím“ preparátu takové množství, které zmírní, zlepší, stabilizuje, zvrátí, zpomalí postup zánětlivého procesu, vše v souladu s klinickými standardy průběhu léčby stávajícími prostředky, případně standardy při použití v kosmetice. Detekce a měření účinnosti léčby se provádí běžně dostupnými diagnostickými prostředky jako je krevní rozbor, testování funkce dýchacího aparátu, rentgen hrudníku, CT tomografie, bronchoskopie, bronchoalveolámí výplach, plicní biopsie a CT snímkování.
Způsoby přípravy monoklonálních protilátek, včetně například monoklonálních protilátek proti integrinům, jsou dobře známy ze stavu techniky, viz například Mendrick a další, 1995, Lab. Invest. 72: strana 367 až 375 (monoklonální protilátky proti myším al βΐ a proti α2β1 integrinům); Sonnenberg a další, 1987, J. Biol. Chem. 262: strana 10376 až 10383 (monoklonální protilátky proti myším αόβΐ integrinům); Yao a další, 1996, J. Cell. Sci. 1996, 109: strana 3139 až
3150 (monoklonální protilátky proti myším α7β1 integrinům); Hemler a další, 1984, J. lmmunol,
132: strana 3011 až3018 (monoklonální protilátky proti myším αϊβΐ integrinům); Pischel a další, 1987, J. lmmunol. 138: strana 226 až 233 (monoklonální protilátky proti myším α2β1 integrinům); Wayner a další, 1988, J. Cell, Biol. 107: strana 1881 až 1891 (monoklonální protilátky proti myším α3β! integrinům); Hemler a další, 1987, J. Biol, Chem. 262: strana 11478 až
11485 (monoklonální protilátky proti lidským α4β1 integrinům); Wayner a další, 1988, J. Cell. Biot 107: strana 1881 az 1891 (monoklonální protilátky proti lidským α5β1 integrinům); Sonnenberg a další, 1987, J. Biol. Chem. 262: strana 10376 až 10383 (monoklonální protilátky proti lidským α6β1 integrinům); Wang a další, 1996, Am. J. Respir. Cell Mot Biot 15: strana
664 až 672 (monoklonální protilátky proti lidským α9β1 integrinům); Davíes a další, 1989, J.
Celt Biot 109: strana 1817 až 1826 (monoklonální protilátky proti lidským αΫβΙ integrinům); SanchezMadrid a další, 1982, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79: strana 7489 až 7493 (monoklonální protilátky proti lidským αίβ2 integrinům); Diamond a další, 1993, J. Cell Biot 120: strana 1031 až 1043 (monoklonální protilátky proti lidským αΜβ2 integrinům); Stacker a další, 1991, J. io Immunol. 146: strana 648 až 655 (monoklonální protilátky proti lidským αΧβ2 integrinům); Van der Vieren a další, 1995, Immunity 3: strana 683 až 690 (monoklonální protilátky proti lidským αϋβ2 integrinům); Bennett a další, 1983, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 80: strana 2417 až 2421 (monoklonální protilátky proti lidským allb33 integrinům); Hessle a další, 1984, Differentiation 26: strana 49 až 54 (monoklonální protilátky proti lidským α6β4 integrinům); Weinacker a další,
1994, J. Biol. Chem. 269: strana 6940 až 6948 (monoklonální protilátky proti lidským ανβ5 integrinům); Weinacker a další, 1994, J. Biol Chem 269: strana 6940 až 6948 (monoklonální protilátky proti lidským αΫβό integrinům); Cerf-Bensussan a další, 1992 Eur. J. Immunol. 22: strana 273 až 277 (monoklonální protilátky proti lidským αΕβ7 integrinům); Nishimura a další, 1994, J. Biol. Chem. 269: strana 28708 až 28715 (monoklonální protilátky proti lidským ανβ8 integrinům); Bossy a další, 1991, EMBO J. 10: strana 2375až 2385 (polyklonální antisérum proti lidským α8β1 integrinům); Camper a další, 1998, J. Biol. Chem. 273: strana 20383 až 20389 (polyklonální antisérum proti lidským αΙΟβΙ integrinům).
Provádí se fúze nesmrtelné buněčné linie (typickým příkladem jsou buňky myelomu) s lymfocyty (typickým příkladem jsou slezinné buňky pokusného zvířete - savce, který byl předtím imunizován celými buňkami obsahujícími daný antigen, v našem případě integrin). Následně se provádí testování vypěstované hybridní kultury a sleduje se výskyt protilátek navázaných k antigenům hybridních buněk (viz Kohler a další, 1975, NAtuRe 265: strana 295 až 497, „Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefíned Specificity“).
Imunizaci lze provádět standardními postupy. Jednotková dávka a imunizaČní režim závisí na druhu imunizovaného savce, jeho stavu imunity, tělesné hmotnosti atd. Většinou je imunizovaným zvířatům odebírána krev aje prováděna kvantitativní analýza odebraných krevních vzorků. Příkladem je testování přítomnosti protilátek proti integrinům, kdy se využívá imunoprecipitace lyzátů z integrin exprimuj ících buněk označených pomocí l25I.
Přítomnost protilátek, jako jsou například protilátky proti integrinu může být též zjišťována průtokovou cytometrií, tj. měřením fluorescence buněk exprimuj ících antigen, inkubovaných s testovanou protilátkou proti tomuto antigenu, v našem případě integrinu. Lymfocyty, které se pou40 žívají pro přípravu hybridomů, se zpravidla izolují z imunizovaných savců, v jejichž séru byla výše popsanými screeningovými metodami prokázána přítomnost protilátek proti integrinu.
Pro izolaci nesmrtelné buněčné linie (např. linie buněk myelomu) se zpravidla používá stejný zvířecí druh (savčí) jako k izolaci lymfocytů. Při výběru nesmrtelné buněčné linie se uprednost45 ňují myelomové buněčné linie myší, které jsou citlivé na kultivační médium obsahující hypoxantin, aminopterin a thymidin (médium HAT). Nej častěji se provádí fúze tak, že se HAT senzitivní myší myelomové buňky spojí s myšími splenocyty pomocí polyethylenglykolu o molekulové váze 1500 („PEG 1500“). Vzniklé hybridomy jsou následně tříděny pomocí HAT média, které ničí nefúzované a špatně fúzované myelomové buňky (nefúzované splenocyty po několika dnech hynou, protože bez transformace nejsou nesmrtelné). Hybridomy produkující dané protilátky jsou identifikovány na základě přítomnosti požadovaných protilátek v supematantu kultivačního média. Tak například přítomnost protilátek proti integrinům v supematantu kultivačního média z jednotlivých hybridomů, může být testována pomocí rekombinantních buněčných linií exprimuj ících integrin.
_ o
Ty hybridomy, které byly výše popsanými screeningovými metodami pozitivně testovány jako produkující požadované protilátky nebo například homology protilátek proti integrinům, se poté kultivují v takovém živném médiu a po dobu a za takových podmínek a, které jsou nutné k sekre5 ci monoklonálních protilátek do daného kultivačního média. Způsoby kultivace tkáňových kultur a odpovídající živná média jsou dobře známa ze stavu techniky. Supematanty z hybridomů mohou být následně odebrány a protilátky proti integrinům dále purifikovány pomocí známých technik.
io Jiným způsobem získání monoklonálních protilátek je injekce buněk hybridomů do peritoneální dutiny neimunizované myši. Zde dochází k proliferaci hybridomových buněk a k následné sekreci protilátek ajejich hromadění v podobě ascitické tekutiny. Protilátky se poté odebírají opět pomocí injekční stříkačky.
Další skupinou proti látkových homologů podle vynálezu používaných jako „vazebné látky“, schopné blokovat itegriny, jsou homology ryze humánních protilátek. Tyto protilátky lze připravit in vitro z lidských splenocytů, jak je popsáno například v práci Boemer a další, 1991, J. Immunol. 147: strana 86 až 95, „Production of Antigen-specific Human Monoclonal Antibodies from In Vitro-Primed Human Splenocytes“,
Alternativním způsobem přípravy těchto „homologů ryze humánních protilátek“ je „repertoárové“ klonování, popsané v práci Persson a další, 1991 , Proč. Nat. Acad. Sci. USA 88: strana 2432 až 2436, „Generation of diverse high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning“ a v práci Huang a Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: strana 227 až 236, „Construction of representative immunoglobulin variable region cDNA libraries from human peripheral blood lymphocytes without in vitro stimulation“. V americkém patentu US 5 798 230 „Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use“ (Způsob přípravy monoklonálních protilátek ajejich použití, vydán 25. srpna 1998)je popsána příprava lidských monoklonálních protilátek z lidských B- lymfocytů. V tomto způsobu jsou lidské B-lymfocyty produkující protilátky imortalizovány infekcí virem Epsteina a Barrové (EBV) nebo jeho derivátem, který exprimuje EBV nukleární antigen 2 (EBNA2). Působení antigenu EBNA2, které je podmínkou procesu, imortalizace, je následně přerušeno, čímž dojde ke zvýšení produkce protilátky.
V jiném způsobu přípravy ryze humánních protilátek, popsaném v americkém patentu US 5 789 650 (vydán 4. srpna, 1998, „Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies“) je popsána schopnost transgenních zvířat produkovat heterologní protilátky a možnost inaktivace jejich vlastních genů kódujících imunoglobuliny. Geny kódující imunoglobuliny jsou potlačeny příslušnými antisense polynukleotidy a/nebo pomocí antiséra proti těmto ednogenním imunoglobulinům. Heterologní protilátky jsou kódovány geny, které nejsou normálně obsaženy v genomu těchto živočichů.
Jeden nebo více transgenů obsahujících sekvence nepřeskupených heterologních lidských těžkých imunoglobulinových řetězců je vpraven do těla jiného živočicha. Vznikne tak transgenní živočich, schopný funkčního přeskupení imunoglobulinových sekvencí a produkce repertoáru protilátek různých izotypů, kódovaných lidskými geny pro imunoglobuliny. Tyto heterologní humánní protilátky jsou produkovány B-lymfocyty, které jsou následně immortalizovány, tj. fúzovány s nesmrtelnou buněčnou linií, například s buňkami myelomu, nebo pomocí jiných technik, umožňujících neomezenou produkci heterologních monoklonálních, ryze humánních proti50 látkových homologů.
Další výhodnou vazebnou látkou, která může blokovat integrinové antigeny nebo jejich fragmenty ve způsobu podle vynálezu jsou humanizované homology protilátek, které mají schopnost vázat se na integriny nebo jejich fragmenty. Kromě ranných způsobů přípravy chimérických pro55 ti látek byl popsán i nový způsob jejich přípravy Winterem a dalšími v patentu EP 0 239 400. V
CZ 300710 Bó tomto způsobu jsou komplementaritu určující oblasti (CDRs) protilátky jednoho druhu nahrazeny odpovídajícími oblastmi jiného druhu. Tento způsob může být například použit k nahrazení CDR z variabilních domén lidského těžkého a lehkého řetězce Ig za jinou CDR z myších variabilních domén. Tyto pozměněné variabilní oblasti imunoglobulinu mohou postupně být dále spojeny s lidskými konstantními oblastmi za vzniku protilátky, která téměř úplně odpovídá svým složením lidským protilátkám s výjimkou substituovaných myších CDR. vzhledem k tomu, že tyto protilátky s přenesenými CDR oblastmi obsahují podstatně menší podíl z jiného druhu, předpokládá se u nich při použití v humánní medicíně nižší pravděpodobnost vyvolání zamítavé imunitní odpovědi oproti chimérickým protilátkám. Způsob humanizace monoklonálních protilátek pomocí „roubování“ CDR oblasti (CDR-grafting) byl nazván přetváření protilátek (reshaping, viz Riechmann a další, 1988 Nátuře 332: strana 323 až 327, „Reshaping human antibodies for therapy“; Verhoeyen a další, 1988, Science 239: strana 1534 až 1536, „Reshaping of human antibodies using CDR-grafting in Monoclonal Antibodies“.
Ve výše popsaném způsobu se typicky přenesou komplementaritu určující oblasti (CDR) myší protilátky na odpovídající oblasti v lidské protilátce. Oblasti CDR jsou v použité myší protilátce zodpovědné za specifickou vazbu antigenů ajejich celkem 6 (tri v těžkém řetězci a tri v lehkém řetězci protilátky). Přenesení oblastí CDR se provádí pomocí technik genetického inženýrství, přičemž sekvence DNA kódující CDR oblasti je určena klonováním genových segmentů varia20 bilní oblasti (V) myšího těžkého a lehkého řetězce. V dalším kroku se takto zjištěné sekvence DNA cílenou mutagenezí přenesou do odpovídajících genových segmentů v lidských variabilních oblastech. V poslední fázi se ke genům humanizovaného těžkého a lehkého řetězce připojí genové segmenty lidské konstantní oblasti požadovaného izotypu (obvykle gama I pro CH a kappa pro CL) a výsledné lehké a těžké řetězce jsou společně exprimovány v savčích buňkách za vzniku rozpustné humanizované protilátky.
Přenos myších CDR oblastí na lidskou protilátku udělí této protilátce antigen-vazebné vlastnosti původní myší protilátky. Šest CDR smyček v myší protilátce je udržováno ve správné prostorové orientaci pomocí částí variabilních oblastí známých jako úseky základní struktury („framework region“). Roubování CDR-oblastí je zpravidla úspěšné díky tomu, že úseky základní struktury myší a lidské protilátky mohou mít velmi podobné prostorové uspořádání s podobnými místy, na kterých jsou připojeny CDR oblasti, takže záměna CDR oblasti nevede k zásadní změně její prostorové struktury. Znamená to, že v principu lze uvedeným připravit způsobem humanizované homology monoklonálních protilátek, jak popisují například Jones a další, 1986, Nátuře 321:
strana 522 až 525, „Replacing the complementaríty-determining regions in a human antibody with those from a mouše“; Riechmann, 1988, Nátuře 332: strana 323 až 327, „Reshaping human antibodies for therapy“; Queen a další., 1989, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 86: strana 10029, „A humanized antibody that binds to the interleukín 2 receptor“ a Orlandi a další, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: strana 3833 „Cloning Immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reactíon“.
Nicméně předpokládá se, že určité aminokyseliny v úsecích základní struktury protilátky interagují s CDR oblastmi a ovlivňují celkovou vazebnou afinitu k antigenů. Přímý přenos CDR oblastí z myší protilátky do humanizované protilátky bez jakýchkoli úprav lidských variabilních oblastí často vede k částečné nebo úplné ztrátě vazebné afinity. Mnohokrát se ukázalo, že změny aminokyselinových zbytků v úsecích základní struktury (framework) akceptorové protilátky mohou být kritické pro zachovaní vazebné aktivity.
Queen a další, 1989, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 86: strana 10029 až 10033, „A humanized anti50 body that binds to the interleukín 2 receptor“ a dokument WO 90/07861 (Protein Design Labs lne) popisují přípravu humanizované protilátky obsahující změněné aminokyselinové zbytky v úsecích základní struktury akceptorové protilátky kombinováním CDR oblastí myší monoklonální protilátky (anti-Tac) s rámcem lidské protilátky s lidskou konstantní oblastí. Demonstrují zde jedno řešení problému ztráty vazebné afinity, ke které často dochází při přímé transplantaci CDR oblasti bez jakéhokoliv uzpůsobení akceptorového místa v lidské V oblasti. Jejich řešení zahrnuje t 1 dva klíčové kroky. V prvním kroku se pomocí počítačové analýzy vyberou takové lidské úseky základní struktury (framework) variabilní oblasti, které vykazují optimální sekvenční homologii s variabilními oblastmi původní myší protilátky, v uvedeném případě s monoklonální protilátkou proti Tac. Ve druhém kroku se vytvoří počítačový model terciální struktury myších V oblasti a určí se aminokyselinové zbytky v úseku základní struktury, které se pravděpodobně podílejí na interakci s CDR oblastmi. Tyto aminokyselinové zbytky se poté superponuji do struktury lidské protilátky, Tento přístup využití homologických lidských úseků základní struktury s pravděpodobnými kontakty s myšími CDR oblastmi vedl k úspěšnému humanizování protilátky s podobnými vazebnými afinitami, jako měla původní myši protilátka, tj. ke vzniku protilátky spělo cifické pro receptor pro interleukin 2 (Queen a další., 1989 [viz výše]) a dále ke vzniku protilátky specifické pro herpes simplex virus (HSV) (Co a další., 1991, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 88:
strana 2869 až 2873, „Humanised antibodies for antiviral therapy“.
Na základě výše popsaného dvoustupňového postupu pospaného v dokumentu WO 90/07861, navrhli Queen (a další) několik kritérií pro humanizaci protilátek. Prvním kritériem je, že se použije taková lidská akceptorová variabilní oblast z konkrétní lidské protilátky, která je obvykle homologická s donorovou protilátkou zjiného druhu určenou k humanizaci, nebo se použije konsensuální úsek základní struktury odvozený z většího počtu lidských protilátek. Druhým kritériem je, že v případě, když je zbytek na akceptorové lidské protilátce neobvyklý a zbytek na dono20 rové naopak typický pro lidskou sekvenci v daném místě variabilní oblasti se použije aminokyselinový zbytek z donorové protilátky spíše než z akceptorové. Třetím kritériem je, že se v pozicích přímo přiléhajících k CDR oblastem použijí aminokyselinové zbytky z donorového úseku základní struktury (framework) variabilní oblasti místo zbytků akceptorové variabilní oblasti.
Lze rovněž použít odlišný přístup (viz Tempest,1991, Biotechnology 9: strana 266 až 271, „Reshaping a human monocíonal antibody to inhibit human respirátory syncytial virus infection in vivo“) ve kterém se pro roubování CDR oblastí standardně používají úseky základní struktury variabilní oblasti odvozené od těžkého a lehkého řetězce NEWM respektive REI bez rozsáhlejší30 ho přidávání myších aminokyselinových zbytků do výsledné protilátky. Výhodou použití způsobu podle Tempesta a dalších (1991) založeného na zkonstruování humanizovaných protilátek odvozených od NEWM a REI je, že na základě rentgenostruktumí analýzy byla vyřešena prostorová struktura variabilních oblastí NEWM a REÍ a mohou tak být modelovány specifické vzájemné interakce mezi aminokyselinovými zbytky CDR oblastí a variabilních oblastí.
Vynález je účinný k léčbě lidí i zvířat, které trpí uvedenými chorobami. Mezi zvířata, na nichž lze použít způsob léčby podle vynálezu patří domácí zvířata a dobytek, která jsou pěstována ať již pro domácí potěšení, tak i pro komerční účely. Jde například o psy, kočky, hovězí dobytek, koně, ovce, prasata a kozy.
Ve způsobu podle vynálezu mohou být protilátky, včetně například protilátky proti VLA-t, podávány parenterálně. Termínem parenterální podání se rozumí subkutánní (podkožní), intravenózní (nitrožílní), intramuskulámí (nitrosvalový), intraartikulámí, intrasynoviální, íntrastemální, intratekální, intrahepatické, intralezní a intrakraniální injekce nebo infúze.
Farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahují jakoukoliv sloučeninu podle vynálezu, nebo její farmaceuticky přijatelný derivát spolu libovolným farmaceuticky přijatelným nosičem. Termínem „nosič“ se rozumí známé a přijatelné látky zvyšující účinek antigenu (adjuvans) a přísady (vehikula).
Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou mít formu sterilního přípravku vhodného pro injekční aplikaci, například sterilní injekční vodné nebo olejovité suspenze. Tato suspenze může být připravena způsoby známými ze stavu techniky za použití vhodných disperzních prostředků, smáčedel a suspenzních činidel.
Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být podány rovněž orálně. Při orální aplikaci mohou být podávány v libovolném přijatelném dávkování a formě, mimo jiné například ve formě tobolek, tablet, vodní suspenze nebo roztoku.
Pro místní aplikaci mohou mít farmaceutické kompozice podle vynálezu formu masti obsahující účinnou složku suspendovanou nebo rozpuštěnou v jednom nebo více nosičích.
Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být také podávány jako nosní aerosol nebo inhalačně pomocí rozprašovače, inhalaěně ve formě suchého prášku nebo pomocí inhalátoru s io dávkovačem.
Efektivní dávkování dostatečné pro vyvolání žádoucích účinků respektive intenzita dávky sloučenin podle vynálezu, závisí na různých faktorech, jako je například druh inhibitoru, tělesné hmotnosti pacienta, cíl léčby, povaha patologického stavu, který je léčen, použitá farmaceutická kompozice a rozhodnutí ošetřujícího lékaře. Je vhodné dávkování v rozmezích mezi o 0,001 až 100 mg účinné látky na 1 kg tělesné hmotnosti a den, výhodné je dávkování mezi o 0,1 až 50 mg/kg tělesné hmotnosti a den. V nejvýhodnějším provedení budou homology protilátek podávány v dávce mezi 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti a den a 20 mg/kg tělesné hmotnosti a den, a ještě výhodněji v rozmezí od 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti a den a v intervalech po v rozmezí 1 až 14 dnů. V dalším výhodném provedení vynálezu je protilátka podávána v dávce asi 0,3 až 1 mg/kg, přičemž je podávána intraperitoneálně. V dalším výhodném provedení vynálezu je protilátka podávána v dávce así 0,5 až 12,5 mg/kg aje aplikována intravenózně. Ve výhodném provedení jsou farmaceutické kompozice podle vynálezu obsahující protilátkové homology podávány tak, aby byla zajištěna plazmatická u koncentrace podané protilátky alespoň 1 gg/ml.
Odborníci mohou snadno zjistit, zda má antagonista podle vynálezu zamýšlený účinek. Například buňky obsažené ve vzorku pacientova epitelu se otestují na přítomnost podané látky in vitro (nebo ex vivo) pomocí další reagencie, která je schopná specificky určit podanou látku. Například může jít o fluorescenčně značenou protilátku proti podané látce, přičemž je dále měřena standardní FACS analýzou (tříděním buněk na základě fluorescence). Popřípadě je přítomnost podané látky stanovena in vitro (nebo ex vivo) neschopností nebo sníženou schopnost pacientových buňky vázat podanou látku, která byla označena (například fluorochromem). Po výhodném dávkování by mělo dojít k pozorovatelnému obsazení převážné většiny antigen-pozitivních buněk. Ve výhodném provedení při použití homologů protilátky by měla být příslušná vazebná místa obsazena po dobu 1 až 14 dní.
Pokud není uvedeno jinak, je pro provedení vynálezu zapotřebí ovládat konvenční techniky buněčné biologie, kultivaci buněčných kultur, molekulárně biologické postupy, mikrobiologické postupy, techniky rekombinantní'DNA, proteinovou chemii a imunologii, a to na úrovni odbomí40 ků v daných oborech. Takové techniky jsou popsány v literatuře, viz například; Moleeular Cloning: A laboratory Manual (Laboratorní manual pro molekulární klonování), druhé vydání, editorů Sambrooka. Fritsche a Maniatise, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning (Klonování DNA), svazky I a II (editor D.N. Glover), 1985; Oligonucleotide Synthesis (Syntéza oligonukleotidů), (M.J. Gait), 1984; patent U.S.A. číslo 4,683,195 (Mullis a další);
Nucleic Acid Hybridization (Hybridizace nukleových kyselin) (editoři B,D. Hames a S.J. Higgins, eds.), 1984; Transeription and Translation (Transkripce a translace) (editoři B.D. Hames a S.J. Higgins,.), 1984; Culture of Animal Cells (Kultivace zvířecích buněk) (editor R.I. Freshney,). Alan R. Liss, Inc.,1987; Immobilized Cells and Enzymes (Imobilizované buňky a enzymy), ÍRL Press, 1986; A Practical Guide to Moleeular Cloning (Praktický úvod do moleku50 lámího klonování), (B.Perbal), 1984; Methods in Enzymology (Enzymatologické metody), svazky 154 a 155 (Wu a další). Academie Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Vektory pro transformaci savčích buněk (editoři J.H. Miller a M.P. Calos), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Immunochemical Methods in Cell and Moleeular Biology (Imunochemické metody v buněčné a molekulární biologii) (editoři Mayer a Walker),
Academie Press, Londýn, 1987; Handbook of Experimental Immunology (Příručka experimen1 1 tální imunologie), svazky I až IV (editoři D.M. Weir a C.C. Blackwell), 1986; Manipulating the Mouše Embryo (Manipulace myších embrií), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.
Následující příklady slouží především pro lepší popis a objasnění podstaty vynálezu a nelze je v žádném případě považovat za omezující rozsah vynálezu.
Příklady provedení vynálezu io Použité chemikálie
Fluorescein isothiokyanát (FITC) byl zakoupen od firmy Sigma (St. Louis, Missouri). Krotonový olej byl zakoupen od firmy ICN Biochemicals (Aurora, Ohio), Celá ovčí krev v Alseversově roztoku byla získána od firmy East Acres Biologicals (Southbridge, Massachusetts). Kolagen typu 1 z krysích ocasů a myší kolagen typu IV byly zakoupeny od společnosti Collaboratíve Research (Bedford, Massachusetts) respektive Gibco (Gaithersburg, Maryland).
Samičky myší Balb/c staré 6 až 8 byly zakoupeny od firmy Taconic (Germantown, New York) a myši Balb/c deficientní v al βΐ integrinech byly již popsány (viz reference 3),
Příklad 1 Monoklonální protilátky
Blokující monoklonální protilátky proti myším antigenům byly připraveny tak, aby neobsahovaly žádné azidy a s nízkým obsahem endotoxinů. Byly použity následující protilátky: Ha31/8 (křečci protilátka proti CD49A; integrinu al, Mendrick a další, 1995, Lab. Invest. 72: strana 367 až 375), HaI/29 (křeččt protilátka proti CD49B; integrinu α2) (βΐ, Mendrick a další, 1995, Lab. Invest. 72: strana 367 až 375; Mendrick, D.L. a D.M. Kelly 1993, Lab. Invest. 69: strana 690 až 702), křečci kontrolní monoklonální protilátky II skupiny Ha4/8 (křečci protilátka proti hemocyaninu z mořských přílipek (KLH), (Mendrick, D.L. a D.M. Kelly, Lab. Invest. 69: strana 690 až 702), a PS/2 (krysí protilátka proti CD49D; řetězci integrinu α4β1, viz Miyake a další, 1991, J, Exp. Med. 173: strana 599 až 607). Kromě toho byly od firmy Pharmingen (San Diego, California) ve formátu bez azidů a s nízkým obsahem endotoxinů zakoupeny následující blokující monoklonální protilátky proti myším antigenům: ΗΜβΙ-1 (křeččí protilátka proti CD29; řetězci βΐ integrinu, viz Noto a další, 1995, Int. Immunol. 7: strana 835 až 842), Ha2/5 (křeččí protilátka proti CD29; řetězci βΐ integrinu, viz Mendrick, D.L. a D.M, Kelly, 1993 Lab. Invest. 69: strana 690 až 702), 3E2 (křeččí protilátka proti CD54, ICAM-1, viz Scheynius a další, 1993, J. Immunol. 150: strana 655 až 663), protilátka 5H10-27 (krysí protilátka proti CD49E; integrinu a5, viz Kinashi, T., a T.A. Springer, 1994, Blood Cells 20: strana 25 až 44), GoH3 (krysí protilátka proti CD49F;
integrinu a6, viz Sonnenberg a další, 1987, J. Biol. Chem. 262: strana 10376 až 10383), a krysí monoklonální izotypová kontrolní protilátka R35-95 (krysí IgG2a) a R35-38 (krysí ígG2b).
Test adheze: Spíenocyty z myši Balb/c byly kultivovány v přítomnosti 20 ng/ml IL2 po dobu 7 až 12 dní. Adheze buněk ke kolagenu I a IV typu odpovídala výše popsané publikaci (Gotwals a další, 1996 J. Clin. Invest. 97: strana 2469 až 2477). Podstata testu spočívá v tom, že se plotny Maxisorp o 96 jamkách (Nunc, Napierville, Illinois) potáhnou buď 10 pg/ml kolagenu typu IV, nebo 5 pg/ml kolagenu typu I a nespecifická vazebná místa se zablokují 1% hovězím sérovým albuminem (BSA). Slezinné buňky aktivované pomocí IL 2 se označí 2 μΜ BCECF [2',7-bis(karboxyethy 1)-5(6) karboxy 1 fluorescein penta acetoxymethylester, Molecular Probes, Eugene,
Oregon) a poté se inkubují s 10 pg/ml uvedené monoklonální protilátky po dobu 15 minut. 105 buněk v médiu RPMI s přídavkem 0,25% BSA se poté přidá do potažených jamek v mikrotitračních deskách a inkubují se 60 minut při teplotě 37 °C. Nenavázané buňky se odstraní trojím promytím médiem A RPMI s 0,25% BSA. Adheze se kvantifikuje pomocí fluorescenční Čtečky ploten CytoFluor 2350 (Millipore, Bedford, Massachusetts). Změří se tak poměr navázaných buněk vzhledem k počátečnímu počtu a stanoví se procento adheze vzhledem k buňkám
CZ 300710 Bó ošetřeným kontrolní monoklonální protilátkou (standardizováno na 100%). Od hodnot byly odečteny hodnoty pozadí změřené jako množství buněk adherujících na jamky potažené pouze BSA.
Exprese a zablokování funkce integrinu al pl a α2β1 na aktivovaných leukocytech.
Vzhledem ke klíčové roli, kterou hrají leukocyty během zánětu, jsme se rozhodli otestovat zda monoklonální protilátky proti al a a2 integrinům jsou schopny zablokovat adhezi leukoeytů ke kolagenu. Leukocyty exprimující vysoké koncentrace jak al, tak i a2 integrinu byly získány in vitro stimulací myších T-buněk pomocí IL-2 po dobu 7 až 12 dní. Tyto buňky exprimovaly io vysoké koncentrace jak al, tak i a2 integrinu (obrázek 1) a dobře se vázaly na povrchy potažené jak kolagenem typu IV tak i kolagenem typu I (viz obrázek IB). Adheze ke kolagenu typu IV byla Částečně inhibována samotnou monoklonální protilátkou proti al integrinu a naopak nebyla inhibována samotnou monoklonální protilátkou proti a2. Naproti tomu adheze ke kolagenu typu I byla kompletně inhibována monoklonální protilátkou proti a2 integrinu zatímco samotná mono15 klonální protilátka proti al integrinu vykazovala pouze částečnou inhibicí. Jak monoklonální protilátka proti βΐ integrinu, tak směs monoklonálních protilátek proti al a a2 integrinu kompletně inhibují adhezi ke kolagenu typů I a IV. Poté, co bylo prokázáno, že al βΐ a α2β1 integriny jsou exprimovány na povrchu aktivovaných T-lymfocytů, a že monoklonální protilátky proti al a a2 integrinu jsou schopny funkčně zablokovat adhezi leukoeytů ke kolagenu, jsme dále používali tyto monoklonální protilátky ke studiu in vivo úlohy těchto integrinů u zvířecích modelů zánětlivých onemocnění.
Příklad 2 Inhibice DTH odezvy pomocí monoklonálních protilátek proti integrinu
Z dříve publikované práce (Hurtrel a další, 1992 Cell. Immunol. 142: strana 252 až 263) byl převzat a mírně upraven protokol pro navození hypersenzitivní odezvy zpožděného typu (DTHdelayed type hypersensitivity) indukované pomocí ovčích Červených krvinek. Postup spočívá v subkutánní imunizaci myší, kterým bylo do zad aplikováno 2 x 107 ovčích Červených krvinek v 100 μΙ PBS dne 0. Dne 5 bylo provedeno provokační očkování injekcí 1 x 108 ovčích červených krvinek ve 25 μΐ PBS subkutánně do pravé přední tlapky. Tloušťka tlapek byla poté měřena posuvným měřítkem (Mitutoyo/MTI, Paramus, New Jersey) 20 hodin po podání antigenu a z naměřených hodnot byl vypočítán stupeň otoku. Výsledky jsou uvedeny jako průměrné percentuální zvětšení tloušťky tlapky ± standardní chyba (SEM) a k jejich výpočtu byl použit následující vzorec: % zvětšení tlapky = [ 1- (tloušťka pravé tlapky 20 h po podání antigenu/tloušťka neošetrené levé tlapky 20 h po podání antigenu)] x 100. Pro zablokování efektorové fáze DTH odezvy vyvolané pomocí ovčích krvinek, byla intraperitoneálně podána terapeutická nebo kontrolní monoklonální protilátka (100 pg), připravená podle způsobů popsaných v Příkladu 1. Protilátka byla podána 1 hodinu před podáním antigenu dne d=5.
Opožděná odpověď DTH vyvolaná pomocí ovčích červených krvinek je dobře popsaným in vivo modelem zánětu a zvláště pak lupénky, který je používán pro demonstrací významu různých cytokinů a adhezních molekul během zánětu (Tedder a další, 1995 J. Exp. Med. 181: strana 2259 až 2264, Terashita a další, 1996, J. Immunol. 156: strana 4638 až 4643). Myším senzitizo45 váným pomocí ovčích červených krvinek byla podána monoklonální protilátka proti integrinu 1 h předtím než jim byl do tlapek aplikován antigen a míra zánětu byla odhadnuta o 20 hodin později změřením změny v tloušťce tlapky. Myši ošetřené PBS a kontrolním křeččím imunoglobulinem 20 hodin po podání antigenu vykazovaly 60 až 70% nárůst tloušťky tlapky (viz obrázek 2). Myši ošetřené monoklonálními protilátkami proti al nebo proti a2 integrinu vykazovaly oproti kont50 rolnímu křeččímu imunoglobulinu 68% respektive 60% inhibicí nárůstu tloušťky tlapky. Kombinace monoklonálních protilátek proti al a a2 integrinu měla za následek 71% inhibici nárůstu tloušťky, z čehož vyplývá malý přidaný efekt směsi protilátek oproti samotným monoklonálním protilátkám proti al nebo a2 integrinu. Ošetření myší monoklonálními protilátkami proti dalším integrinům mělo rovněž účinek na inhibici DTH odpovědi. Stupeň inhibice pozorovaný u růz55 nýeh monoklonálních protilátek byl 49 % (anti-a4), 23 % (anti-a5) a konečně 57 % (antiaó).
_ Ií _
Monoklonální protilátka blokující běžnou βΐ podjednotku integrinu (monoklonální protilátka HMBI-1) inhibovala DTH odpověď ze 67 %.
Příklad 3 Inhibice CHS efektorové odpovědi pomocí monoklonálních protilátek proti integri5 nu
Kontaktní hypersenzitivita (CHS) k FITC byla testována způsobem podle návodu uvedeného v práci Gaspariho a dalších, 1991, v knize Current Protocois in Immunology, J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach a W. Strober, vydavatel John Wiley & Sons, New ío York, kapitola 4.2:1). Myši byly senzitizovány potřením oholených zad 100 μΐ 0,5% roztoku
FITC ve směsi aceton/dibutyl ftalát (1:1). FITC byl aplikován dne 0. Desátého dne byla zvířata provokaěně exponována další dávce 5 μΐ 0,5% FITC na obě strany obou uší. Vzniklý otok byl změřen pomocí posuvného měřítka a vyjádřen jako nárůst tloušťky ušního boltce {Mitutoyo/MTI, Paramus, New Jersey) v době mezi podáním antigenu (d 10) a o 24 h později.
Výsledky jsou uvedeny jako průměrné percentuální zvětšení tloušťky ušního boltce v kořeni ±
SEM a k jejích výpočtu byl použit následující vzorec: % zvětšení tloušťky ušního boltce v kořeni = [1- (tloušťka ucha 24 hodin po podání antigenu/ tloušťka ucha v době podání antigenu)] x 100.
Pro zablokování efektorové fáze CHS odezvy byla dne d=l0 a 4 hodiny před podáním antigenu 20 intraperitoneálně podána terapeutická nebo kontrolní monoklonální protilátka (250 pg).
Vzhledem k tomu, že odpověď CHS je principiálně odlišná od odpovědi DTH a podílejí se na ní jiné efektorové buňky, pokusili jsme se zjistit účinek monoklonálních protilátek proti integrinu na efektorovou fázi CHS odpovědi. Myši byly senzitizovány haptenem FITC aplikovaným na oho25 lená záda. Po 10 dnech následovala provokaění aplikace FITC na ušní boltce, která vyvolala do druhého dne zánětlivou odpověď. Myši senzitizované pomocí FITC vykazovaly 24 h po podání antigenu 60 až 70% nárůst tloušťky kořene ušního boltce (viz obrázek 3). V souladu s dříve publikovanými výsledky (viz Scheynius a další, J. Immunol. 150: strana 655 až 663) měla aplikace monoklonální protilátky proti ICAM-1 za následek 51% inhibici otoku ušního boltce.
Myší ošetřené monoklonálními protilátkami proti al nebo proti a2 integrinu 4 hodiny před aplikací antigenu, vykazovaly oproti kontrolní křečěí Ig 37% respektive 57% snížení otoku ušního boltce (viz obrázek 3). Kombinace monoklonálních protilátek proti al a a2 integrinu měla za následek mírně vyšší (65%) inhibici otoku (nárůstu tloušťky) boltce. Ošetření myší dalšími monoklonálními protilátkami proti βΐ Íntegrinům odhalilo, že zatímco monoklonální protilátky proti a4 a a5 integrinu neměly na CHS efektorovou odpověď žádný vliv vzhledem ke kontrolní krysí Ig, po aplikaci monoklonální protilátky proti a6 integrinu došlo k 86% inhibici efektorové odpovědi. Zablokování běžného βΐ integrinu monoklonální protilátkou inhibovalo efektorovou CHS odpověď ze 74%.
K podobným výsledkům vedly i experimenty s CHS odpovědí prováděné na myších C57/BL6 a 129/Sv a s různými senzitizačními látkami (oxazolon, údaje nejsou uvedeny). Histologícké analýzy zanícených ušních boltců potvrdily, že jak vznik otoku, tak i pronikání leukocytů byly inhibovány monoklonální protilátkou proti al a proti a2, podobně jako tomu bylo u modelu DTH se zvířaty senzitizovanými ovčími červenými krvinkami.
Analýza lymfatických uzlin z myší senzitizovaných oxazolonem nebo FITC odhalila, že integriny al β 1 a α2β1 jsou exprimovány výlučně na CD44hl LFA-lhl aktivovaných CD4+ a CD8+ T-lymfocytech (údaje nejsou uvedeny), což je v souladu s poznatkem, že al β 1 a α2β1 integriny mohou být exprimovány na IL—2 aktivovaných splenocytech. Ošetření myší monoklonálními protilátkami proti al a a2 integrinu nemělo za následek snížení počtu těchto buněk, jak dokazují nezměněné počty aktivovaných T-lymfocytů jak ve slezině, tak i v lymfatických uzlinách, pozorované po senzitizaci antigenem pri studiu CHS odpovědi. Kromě toho nebyly efektorové buňky funkčně poškozeny, což potvrzuje další ošetření senzitizovaných myší monoklonální protilátkou proti al a proti a2 (ve dnech dlO až 16), které nijak neovlivnilo zánětlivou odpověď myší, jimž byl aplikován antigen 20. dne (údaje nejsou uvedeny).
Příklad 4 CHS efektorová odpověď je oslabena u myší deficientních v α 1 β l integrinu
Bylo zapotřebí vyloučit možnost, že inhibiční úloha připisovaná zablokování αϊβΐ integrinu při efektorové CHS odpovědi vůči FITC byla způsobena přímo monoklonální protilátkou. Byl proto proveden experiment s běžnou myší a s myší defícientní v αϊβΐ integrinech (viz obrázek 4). U io běžné myši se inhibice zánětu v efektorové fázi způsobená monoklonální protilátkou shodovala s předchozími výsledky, přičemž monoklonální protilátka proti al vykazovala 56% inhibici otoku boltce, protilátka proti a2 také 56% inhibici a kombinace obou protilátek 62%. Efektorová fáze
CHS byla významně slabší u neošetřených al βΐ-deficientních myši v porovnání s neošetřenými běžnými myšmi (30% oproti 71% nárůstu tloušťky ušního boltce). Podle očekávání otok ušního is boltce neošetrené αϊβΐ defícientní myši byl ekvivalentní s otokem ušního boltce běžné myši ošetřené monoklonální protilátkou proti al. Dále zablokování α2β1 a αϊβΐ deficientních myší příslušnými monoklonálními protilátkami vyústilo v jen mírně zvýšenou inhibici otoku ušního boltce, což je ve shodě s výsledkem dosaženým u běžných myší ošetřených kombinací monoklonálních protilátek proti al a a2.
Příklad 5
Dále bylo zapotřebí vyloučit možnost, že inhibiční účinek monoklonálních protilátek proti integ25 rínům jak při DTH, tak při CHS modelu zánětu je způsoben obecným protizánětlivým účinkem zprostředkovaným monoklonálními protilátkami proti al a a2. Z tohoto důvodu byl studován vliv těchto protilátek na zánětlivé onemocnění kůže způsobené podrážděním chemickou látkou.
Zánět kůže byl vyvolán aplikací 5 μΐ 0,8% krotonového oleje v acetonu na obě strany obou uší.
Terapeutické a kontrolní protilátky byly podány 4 hodiny před aplikací dráždivě látky. Po 24 hodinách byl výše uvedeným způsobem měřen otok uší a srovnáván s tloušťkou uší měřenou před aplikací krotonového oleje, Výsledky jsou uvedeny jako průměrné percentuální zvětšení tloušťky ušního boltce v kořeni ± SEM, jak to již bylo popsáno výše. Jako negativní kontroly sloužily myši ošetřené pouze acetonem (vehicle control).
U myši ošetřených krotonovým olejem došlo po 24 hodinách k průkaznému zvýšení tloušťky uší (48%) ve srovnání s těmi, jenž byly ošetřeny pouze samotným nosičem (acetonem). U myší, které byly předem ošetřené monoklonálními protilátkami proti al a a2 nedošlo, ve srovnání se zvířaty ošetřenými buď PBS nebo kontrolními monoklonálními protilátkami, k průkaznému ovlivnění otoku uší způsobenému krotonovým olejem (viz obrázek 5). H i sto logická vyšetření uší ošetřených krotonovým olejem odhalila, že není žádný rozdíl jak v počtu a typu infiltruj ících buněk tak ve tvorbě otoku u myší ošetřených monoklonálními protilátkami proti al a a2 ve srovnání s kontrolními zvířaty, kterým byly podány buď kontrolní monoklonální protilátky, nebo PBS (údaje nejsou uvedeny).
Příkladó Inhibice artritidy pomocí al βΐ a α2β1.
U pacientů s artritidou je na povrchu infiltruj ících buněk kloubní nitroblány (synovium) v hojné míře exprimován αϊβΐ. Autoři vynálezu se proto rozhodli zjistit, zda by monoklonální protilátky proti al a monoklonální protilátky proti a2 mohly vykazovat inhibiční účinek na výše popsanou progresivní artritidu (Terato a další, 1992 J.Immunol. 148: strana 2103 až 2108; Terato a další, 1995 Autoimmunity 22: strana 137 až 147).
i -f
Arthrogen-CIA protilátkové kity byly zakoupené u firmy Stratagene (La Jolla, CA). Artritida byla indukována zavedeným protokolem (viz Terato a další, 1992, J. Immunol. 148: strana 2103 až 2108; Terato a další, 1995, Autoimmunity 22: strana 137 až 147). V tomto způsobu se artritida vyvolává injekcí směsi 4 monoklonálních protilátek proti kolagenu typu II (1 mg každé z nich) v den 0. Následuje intraperitoneální injekce 50 pg LPS v den 3. Během následujících tří až Čtyř dní se u myší objevily otoky zápěstí, kotníků a prstů. Léčebné či kontrolní protilátky (250 pg) byly podány intraperitoneálně 4 hodiny před injekcí monoklonálních protilátek proti kolagenu v den 0 a dále 4 hodiny před podáním LPS v den 3 a dále každý třetí den po celou dobu trvání experimentu. Počínaje dnem 3 byl u myší pozorován vznik artritidy. Závažnost artritidy na io každé končetině byla hodnocena pomocí pětibodového skóre. 0 = normální; 1 = slabé zarudnutí, slabý otok kotníku či zápěstí; 2 = nepříliš veliký otok kotníku či zápěstí; 3 - vážný otok zasahující některé prsty, kotníky a chodidla; 4 = maximální zánět.
Těžká artritida se u myší Balb/c vyvinula 72 hodin po injekci LPS a přetrvávala více než tři týdny. Jak samotná injekce monoklonálních protilátek proti kolagenu, tak podání samotného LPS nevyvolaly artritidu. Myši, kterým byla podána kontrolní monoklonální protilátka, vykazovaly stejně silnou artritidu jako ty, jimž byl injikován PBS (viz obrázek 6). Na rozdíl od toho u myší, kterým byla předem podána monoklonální protilátka proti al, došlo k výraznému snížení artritidy (78%), přetrvávajícímu po celou dobu trvání experimentu. Podávání samotných monoklonálních protilátek proti a2 integrinu mělo na myši též pozitivní účinek projevující se 32% snížením artritidy (hodnoceno pomocí výše uvedeného pětibodového artritického skóre) ve srovnání s kontrolními myšmi, kterým byla podána kontrolní monoklonální protilátka. Kombinace monoklonálních protilátek proti al a a2 vedla k podobnému snížení artritidy jako tomu bylo v případě podání samotné protilátky proti al.
Příklad 7 Histologická analýza účinku podávání monoklonálních protilátek proti al a a2 na zánětlivé pronikání buněk
3o Další histologická analýza DTH odezvy vyvolané imunizací ovčími červenými krvinkami potvrdila schopnost monoklonálních protilátek proti al a a2 modulovat vyvolanou zánětlivou odpověď (viz obrázek 7). Kontrolní tlapka myši senzitizované ovčími krvinkami (viz obrázek 7 panel A) neobsahovala fakticky žádný buněčný infiltrát ve srovnání s tlapkou z téhož zvířete, do které byly vpraveny ovčí krvinky (viz obrázek 7 panel B), Bližší zkoumání infiltrujících buněk ukáza35 lo, že většina z nich byly neutrofily s občasným výskytem monocytů a lymfocytů. Dále bylo potvrzeno, že podávání monoklonálních protilátek proti al a a2 výrazně snížilo počet pronikajících buněk (viz obrázek 7 panel G až H).
Příklad 8 Imunohistoehemická detekce buněk exprímuj ících al v zánětlivém infiltrátu buněk.
Imunohistochemická analýza byla prováděna pro přesnější určení charakteru infiltrujících buněk a zjištění, zda tyto buňky exprimují integriny schopné vázat kolagen (viz obrázek 8). V infiltrujících buňkách ze zanícené tlapky neovlivněných myší byla zjišťována exprese αϊβΐ integrinu a markérů buněčných typů (viz obrázek 8). Exprese αϊβΐ integrinu byla zjištěna ve většině infiltruj ících leukocytů (viz obrázek 8A). K současnému určení typu infiltrujících buněk a distribuce αϊβΐ exprese byla použita imunohistochemie s dvojím značením (viz obrázek 8B). Pomocí buněčných markérů bylo zjištěno, že infiltrát je složen převážně z granulocytů/monocytů (Mac1+), přičemž většina z těchto buněk jsou neutrofily (Grll+), malou část infiltrátu tvoří T-lymfo50 cyty (CD3+) (viz obrázek 8B). Exprese alβΐ integrinu byla zjištěna na všech třech uvedených typech buněk, přičemž al byl exprimován na Mac-1+ podtypu granulocytů/monocytů, Grl + podtypu neutrofilů a na většině infiltrujících CD3+ T-lymfocytů (viz obrázek 8B). Detailní imunohistochemická analýza odhalila, že, ačkoliv podávání monoklonálních protilátek proti al a a2 snížilo počet infiltrujících buněk, nedošlo ke změně buněčného složení infiltrátu (údaje nejsou uvedeny). Imunohistochemické barvení protilátkami proti křeččím monoklonálním protilátkám značeným FITC potvrdilo schopnost monoklonálních protilátek proti al a a2 soustředit se v zanícené tlapce (údaje nejsou uvedeny).
Příklad 9 Inhibice artritidy pomocí monoklonálních protilátek proti alβΐ u myši deficientních v al.
Skutečnost, že al βΐ integrin je hojně exprimován v infiltruj ících buňkách v kloubní nitrobláně artritických pacientů, vedla k myšlence vyzkoušet, zda by monoklonální protilátky proti al a a2 io působily inhibičně u dříve popsaného modelu progresivní artritidy (Terato a další, 1992
J.Immunol. 148: strana 2103 až 2108; Terato a další, 1995 Autoimmunity 22: strana 137 až 147).
Tento model zahrnuje injikování směsi monoklonálních protilátek proti kolagenu typu II do myši a později podání LPS, následkem čehož za 3 až 7 dní dojde k vyvolání artritidy. Monoklonální protilátky byly myším podávány každé tři dny počínaje dnem 0, každé tri dny byl zaznamenáván vývoj artritidy. Těžká artritida se u myší vyvinula 72 hodin po podání LPS a přetrvávala déle než tři týdny. Jak samotná injekce monoklonálních protilátek proti kolagenu, tak podání samotného LPS nevyvolaly artritidu. Myši, kterým byla podána kontrolní monoklonální protilátka, vykazovaly stejně silnou artritidu jako ty, jimž byl injikován PBS (viz obrázek 9A). Na rozdíl od toho u myší, kterým byla předem podána monoklonální protilátka proti al, došlo k výraznému snížení artritidy (o 79 % a více), přetrvávajícímu po celou dobu trvání experimentu. Podávání samotných monoklonálních protilátek proti a2 mělo na myši též pozitivní účinek projevující se 37% snížením artritidy (hodnoceno pomocí výše uvedeného pětibodového artritického skóre) ve srovnání s kontrolními myšmi, kterým byla podána kontrolní monoklonální protilátka. Kombinace monoklonálních protilátek proti al a a2 vedla k podobnému snížení artritidy jako tomu bylo v případě podání samotné protilátky proti al. Snížení artritického skóre způsobené podáváním monoklonálních protilátek proti al bylo pozorováno u všech myší. Ve srovnání s jinými léčebnými postupy využívajícími monoklonální protilátky je úspěšnost tohoto způsobu léčby artritidy větší. Mezi takové postupy patří použití rozpustného fúzního proteinu mezi Ig a receptorem pro TNF (Moří a další 1996, J. Immunol. 157: strana 3178 až 3182), protilátky proti Mac-1 (Taylor a další, 1996, Immunology. 88: strana 315až 321), protilátky proti a4 (Seiffge, 1996, J. Rheumatol, 23: strana 2086 až 2091), a protilátky proti ICAM-1 (Kakimoto a další, 1992 Cell Immunol. 142: strana 326 až 337, viz obrázek 9A). V souladu s údaji založenými na metodách používajících monoklonální protilátky, které ukazují důležitost αϊβΐ při rozvoji artritidy, ničím neléčené myši deficientní v antigenu al vykazovaly ve srovnání s běžnými myšmi prokazatelné snížení artritic35 kého skóre (viz obrázek 9B).
Příklad 10 Účinek podávání monoklonální protilátky proti al na imunopatologii artritických kloubů
Klouby běžných artritických myší (den 8), které dostávaly buď kontrolní monoklonální protilátky, nebo monoklonální protilátky proti al, byly visuálně a histologicky srovnávány s klouby normální, ničím neléčené myši (vit obrázek 10). Bylo patrné, že myši, kterým byla podána kontrolní monoklonální protilátka, měly klouby zarudlé a oteklé, přičemž otok zasahoval celou nohu včetně prstů, zatímco u myší ošetřených monoklonální protilátkou proti al byly pozorovány malé otoky nebo dokonce nebyly zjištěny žádné známky zánětu kloubů či prstů. Histologická studie ukázala, že u myší ošetřených kontrolní monoklonální protilátkou došlo k vážným změnám v artritických kloubech. Bylo pozorováno rozsáhlé pronikání buněk zánětu do subsynoviální tkáně, přilnavost buněk ke kloubnímu povrchu a značná destrukce chrupavky způsobená ztrátou proteo50 glykanů (viz obrázek 10). Většina z pronikajících buněk byly v tomto modelu neutrofíly, což odpovídá předchozím pozorováním (Terato a další, 1992 J.Immunol. 148: strana 2103 až 2108; Terato a další, 1995 Autoimmunity 22: strana 137 až 147). Podávání monoklonálních protilátek proti al vedlo u myši k dramatickému poklesu množství zánětlivého infiltrátu a zároveň k nižšímu stupni destrukce chrupavky (viz obrázek 10).
_ IQ _
Příklad 11 Absence lymfocytů vede k pomalejšímu vývoji artritidy a dále k inhibici artritidy v důsledku podávání monoklonálních protilátek proti al
Dále bylo zapotřebí zjistit, které typy buněk by mohly být významné v takovém modelu artritidy, 5 kdy je zánět vyvolán monoklonálntmi protilátkami proti kolagenu. Autoři vynálezu proto srovnávali schopnost vývoje artritidy u běžných laboratorních myší B6-129 a myší B6-129 deficientních v genu RAG-1 (viz obrázek 11). Delece v genu RAG-1 (recombination activating gene-1) vedla k úplné ztrátě zralých T a B lymfocytů (Mombaerts a další, 1992, Cell 68: strana
869 až 877). K rozvoji artritidy došlo jak u běžných (wild-type) myší, tak u myší deficientních v io genu RAG-I, rychlost vzniku artritidy však byla u myši deficientních v RAG-1 genu prokazatelně nižší (viz obrázek 11). Tyto výsledky naznačují, že, přestože jsou lymfocyty zapojeny do rozvoje tohoto typu artritidy, jejich přítomnost není k rozvoji tohoto onemocnění nezbytná. Publikované experimenty zabývající se vlivem RAG-1 deficience u myší při jiných typech artritidy ukázaly, že ztráta T a B lymfocytů zpomaluje nástup artritidy (Plows a další, 1999 J. Immunol. 162:
strana 1018 až 1023). Podávání monoklonálních protilátek proti al integrinu vedlo jak u běžných myší, tak u myší deficientních v RAG-1 genu k inhibici artritidy (viz obrázek 11). Tyto výsledky jsou důkazem toho, že v tomto typu artritidy není účinnost monoklonálních protilátek proti al závislá na přítomnosti lymfocytů. Účinnost monoklonálních protilátek proti al integrinu při prevenci artritidy může být založena na jejich působení na jiné typy al exprimujících buněk, jako jsou například makrofágy a neutrofily, jak bylo předpokládáno na základě předchozích experimentů (viz obrázek 9).
Příklad 12 Dávková citlivost inhibice artritidy na monoklonálních protilátkách proti al
Na základě výrazného účinku monoklonálních protilátek proti al v prevenci artritidy se autoři vynálezu rozhodli uvedené studie rozšířit o analýzy dávkové citlivosti (dose response analysis, viz obrázek 12). Pokusným zvířatům byla každé tři dny (počínaje dnem 0) podávána určitá dávka monoklonálních protilátek. V souladu s předchozími výsledky dávka 250 pg monoklonálních jo protilátek proti al integrinu vedla k téměř úplnému zabránění vzniku artritidy. Zatímco dávka
100pg monoklonálních protilátek proti al byla v prevenci artritidy v tomto modelu částečně účinná, nižší dávky neměly na artritické skóre žádný pozorovatelný účinek (viz obrázek 12).
Příklad 13 Terapeutické podávání monoklonálních protilátek proti al může vést ke snížení artritického skóre
Vzhledem k vysoké účinnosti monoklonálních protilátek proti al při prevenci artritidy se autoři vynálezu rozhodli, že se pokusí léčit myši s již rozvíjející se artritidou.
Artritida byla v myších vyvolána injekcí směsi monoklonálních protilátek proti kolagenu typu II dne 0 a 3 dny poté následovala aplikace LPS. Myším byla poté 4. dne podána buď monoklonální protilátka proti al nebo rozpustný fúzní protein TNF receptorů s ímunoglobulínem. Rozvoj artritidy byl kompletně zastaven u myši, které dostávaly od 4. dne monoklonální protilátky proti al.
Tento efekt nebyl pozorován u myši, které 4. den dostaly kontrolní křečci monoklonální protilátky (viz obrázek 13). Inhibice rozvoje artritidy pozorovaná po terapeutické dávce monoklonální protilátky proti al byla kompletní a byla stejná, jako při s preventivní aplikaci monoklonální protilátky proti al (dávka protilátky dne 0, viz obrázek 13). Pro srovnání u myší, kterým byl počínaje 4. dnem podáván fúzní protein TNF receptorů s lg, došlo jen k 60 až 70% inhibici podle artritického skóre, oproti kontrolním myším, kterým byl podán fúzní protein indiferentního proteinu s lg (viz obrázek 13). Kombinovaným působením monoklonální protilátky proti al a fúzního proteinu TNF receptorů s lg bylo rovněž dosaženo úplné inhibice rozvoje artritidy, což však není tolik překvapivé, vezmeme-li v úvahu úplnou inhibici vyvolanou samotnou monoklonální protilátkou proti al. Shrnemeli tyto výsledky, ukazuje se pro léčbu artritidy jako vhodnější a účinnější použití monoklonální protilátky proti al integrinu než použití antagonisty TNF.
Příklad 14 Klonování a mutageneze α 1 —I domény
Sekvence kódující lidské a krysí al βΐ I domény integrinu byly amplifikovány z úplné (full length) cDNA (Kem, a další, (1994) J. Biol. Chem. 26), strana 22811 až 22816; Ignatius a další, (1990) J. Cell Biol. 111, strana 709 až 720) polymerázovou řetězovou reakci (PCR, (PCR CORE
Kit; Boehringer Mannheim, GmbH Německo). Při PCR byly použity buď primery specifické pro lidskou DNA:
5’CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3’ [přímý];
5’TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3' [reverzní].
io nebo pro krysí DNA
5’CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3' [přímý];
5’TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3’ [reverzní].
Výsledné PCR produkty byly přečištěny a vloženy do plazmidu pGEX4T-l (Pharmacia). Ligační směsí byly poté transformovány kompetentní buňky DH5a (Life Technologies). Kolonie rezistentní k ampicilinu byly otestovány na produkci cca 45 kDa fúzního proteinu domény I s glutathion S-transferázou. Sekvence inzertů z těch klonů, které byly vybrány pro další práci byly ověřeny sekvenován ím.
Pomocí kitu „MORPH mutagenesis kit“ (5' prime - 3' prime), pro cílenou mutagenezí byla z krysí a lidské připravena chimérická α 1-1 doména (RAH), přičemž došlo k záměně aminokyselinových zbytků G92, R93, Q94, a L97 v krysí sekvenci za odpovídající lidské zbytky V, Q, R respektive R (viz obrázek 14).
Klony, obsahující zmutovanou RAH I doménu byly identifikovány na základě ztráty diagnostického restrikčního místa Stul, a inzerty byly ověřeny sekvenován ím. Aminokyselinová sekvence lidské al—I domény je uvedena na obrázku 15.
Příklad 15 Příprava monoklonálních protilátek specifických pro α 1 —Ϊ doménu
Monoklonální protilátky jsou velmi užitečné pro studium vztahu mezi uspořádáním a funkcí integrinových podjednotek. Tak byly například velkou měrou využity monoklonální protilátky ke studiu těch oblastí na βΐ podjednotce, které souvisejí s aktivovanou konformaci (Qu a Leahy, D. J. (1996) Structure 4, strana 931 až 942). Vynález tak popisuje skupinu monoklonálních protilátek proti lidské al—Ϊ doméně integrinu, přičemž tyto protilátky jsou použitelné ke studiu konformačních změn al —1 domény.
Příprava monoklonálních protilátek proti α 1—Ϊ doméně:
Samičky Robertsonových myší (Jacksonovy laboratoře) byly intraperitoneálně imunizovány 25 pg přečištěného lidského al β 1 itegrinu (viz Edwards a další, (1995) J. Biol. Chem. 270, strana 12635 až 12640), který byl emulgován v kompletním Freundově adjuvans (Life Technologies).
Myším byly dále podány tři i.p. provokační imunízaění dávky po 25 pg al 1 emulgovaného v neúplném Freundově adjuvans (Life Technologies). Myš s nejvyšším titrem protilátek proti α 1-1 doméně byla ještě jednou i.p. imunizována 100 pg aM tři dni před fúzi a intravenózně 50 pg αϊβΐ jeden den před fúzí. Slezinné buňky byly sfúzovány s myelomatickými buňkami FL653 v poměru 1:6 a byly vysety po 100.000 a 33.000 buňkách na jamku do 96 jamkových desek pro tkáňové kultury.
T 1
Supematanty byly otestovány na schopnost vázat al β l integriny pomocí FACS s jedním fluorescenčním barvivém. Před FACS analýzou byly supematanty inkubovány s netransfikovanými buňkami K562, aby se eliminovaly IgG vázající se pouze na β podjednotku. Poté bylo 3 až 5 x
104 buněk K562 transfíkováno al podjednotkou íntegrinu (K562-al) a suspendováno ve FACS pufru (1% fetální telecí sérum, FCS) v PBS s obsahem 0,5% NaN3), 45 minut inkubováno se supematantem při teplotě 4 °C, promyto a dále inkubováno s konjugátem protilátky proti myším IgG s fykoerytrinem. Po dvojnásobném propláchnutí ve FACS pufru byly buňky analyzovány na průtokovém cytometru Becton Dickinson.
i o
Supematanty vybraných hybridomů byly testovány na schopnost vázat al-I doménu. 96-jamkové plotny (Nunc) byly potaženy 50 μΙ roztoku fúzního proteinu lidské α 1 —1 domény s glutathionS transferázou (GST) v PBS o výsledné koncentraci 30 pg/ml. Inkubace trvala přes noc při teplotě 4 °C. Plotny byly poté promyty pufrem PBS, zablokovány 1% roztokem BSA v PBS a supernatant z hybridomů byl po dobu jedné hodiny inkubován za pokojové teploty s doménou I, Po extensivním promytí v pufru PBS s obsahem 0,03% Tweenu 20, byl na další hodinu přidán konjugát anti-myší protilátky s alkalickou fosfatázou (Jackson ImmunoResearch). Po závěrečném promytí byl přidán roztok substrátu obsahující p-nitrofenyl fosfát (pNPP, I mg/ml), glycin (0,1 M), ZnCl2 (1 mM) a MgCl2 (1 mM). Substrát byl v jamkách ponechán 30 minut za pokojové teploty a poté byla odečtena absorbance při vlnové délce 405.
Vybrané supematanty byly testovány na schopnost inhibovat al dependentní adhezi ke kolagenu typu IV u buněk K562-al.
Buňky K562-al byly označeny 30 minutovou inkubací s 2mM 2',7'(bis-2-karboxyethyl-5, 6) karboxy-fluorescein penta acetoxy-methylesterem (BCECF; Molecular Probes) v médiu DMEM s přídavkem 0,25% BSA při teplotě 37 °C. Značené buňky byly promyty vazebným pufrem (10 mM HEPES, pH 7,4; 0,9% NaCI a 2% glukóza) a resuspendovány ve vazebném pufru s přídavkem 5 mM MgCl2 tak, aby výsledná koncentrace Činila 1 x IO6 buněk/ml. 50 μΙ supernatantu bylo inkubováno v 96 jamkových mikrotitračních deskách se stejným objemem obsahujícím 2x105 buněk K562hxI . Mikrotitrační desky byly poté zcentrifugovány a supematanty odstraněny. Buňky byly resuspendovány ve vazebném pufru a přeneseny do jamek plotny potažené kolagenem a inkubovány po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Po této inkubaci byly buňky, které nepřilnuly k mikrotitrační desce, odstraněny trojnásobným promytím vazebným pufrem. Adsorpce buněk byla analyzována na přístroji Cytofluor (Millipore).
Zpočátku bylo identifikováno 19 hybridomů, jejichž supematanty byly schopné vázat lidské leukemické buňky K562 exprimující al—1 integriny (K562-al) a vázat se rovněž na α 1-1 doménu. Z každého z těchto hybridomů byly purifikovány imunoglobuliny a testovány na schopnost blo40 kovat bud1 vazbu K562-al, nebo al—I domény ke kolagenu typu IV. Tyto monoklonální protilátky lze rozdělit do dvou skupin: jednak jsou to ty, které blokují a jednak ty, které neblokují funkci α 1 β 1. Tak například zatímco monoklonální protilátky produkované klony AEF3, BGC5 a AJH10 vážou al—I doménu (viz obrázek 16A, pro BGC5 nejsou uvedeny údaje), jen monoklonální protilátka AJH10 inhibuje adhezi ke kolagenu typu IV závislou na al—I doméně (obrázek 16B) nebo naK562-ctl (obrázek 16C).
Sekvenování komplementaritu určujících oblastí protilátek (CDR)
Klonální původ této skupiny monoklonálních protilátek byl blíže charakterizován sekvenací CDR oblastí protilátek. Pomocí PCR byla nejprve amplifikována eDNA a poté byly sekvenovány CDR oblasti 12 z celkem 19 protilátek (údaje nejsou uvedeny),
Z cca 107 buněk hybridomů byly izolovány 2 pg mRNA, (pomocí kitu FastTrack mRNA isolation kit, Invitrogen). Pomocí reverzní transkripce byla vytvořena eDNA (pomocí kitu Ready-To55 Go Prime First Strand Kit, Pharmacia Biotech) za použití 25 pM každého z následujících primeCZ 300710 B6 rů: pro těžký řetězec VH1FOR-2 (Michishita a další, (1993) Cell 72, strana 857 až 867); pro lehký řetězec VK4FOR, pro který existují čtyři jednotlivé oligonukleotidy (Kem a další, (1994) J. Biol. Chem. 269, strana 22811 až 22816). Z každého hybridomu byly amplifíkovány těžké a lehké řetězce ve čtyřech samostatných PCR reakcích za použití různých kombinací následujících oligonukleotidů: 1) primery pro těžký řetězec: VHlFRlK(KamataadalŠí, (1995) J. Biol. Chem. 270, strana 12531 až 12535), VH1BACK, VHIBACK (Baldwin a další, (1998) Structure 6, strana 923 až 935), VHfrla, VHfrlb, VHtrle, VHfrlf, VHfrlg (Ignatius a další, (1990) J. Cell Biol. 111, strana 709 až 720), nebo VH1FOR-2 (Michishita, M., Videm, V., a Amaout, M. A. (1993) Cell 72, strana 857 až 867); 2) primery pro lehký řetězec: VK1BACK (Baldwin a další., (1998) io Structure 6, strana 923 až 935), oligonukleotidy VK4FOR, VK2BACK (Kem a další, (1994) J. Biol.Chem. 269, strana 22811 až 22816), nebo VKFRLA, VHFRLC, VHFRLE, VHFRLF (Ignatius a další, (1990) J. Cell Biol. 111, strana 709 až 720). Produkty byly amplifíkovány (5 minut při 95 °C, 50 cyklů po l minutě při 94 °C, 2 minuty při 55 °C, 2 minuty při 72 °C, a finální cyklus trvající 10 minut při 72 °C), DNA byla poté vyziolována z gelu pomocí kitu QIAQUICK (Qiagen) a přímo sekvenována na sekvenátoru ABI 377 za použití výše uvedených oligonukleotidů.
Sekvence získané z klonů produkujících blokující monoklonální protilátky byly téměř shodné ve všech komplementaritu určujících oblastech (CDR) a rovněž v přilehlých úsecích základní struktury, z čehož lze soudit, že jde o klonálně příbuzné hybridomy.
Příklad 16
Imunobloting a analýza FACS.
Sekvence z různých oblastí neblokujících protilátek byly výrazně odlišné od klonálně příbuzných sekvencí nalezených v blokujících protilátkách. Na základě zjištění, že blokující protilátky mají původ v jednom klonu, jsme k další charakterizaci vybrali pouze jednu z nich (AJH10).
Imunobloting
Vrstva buněk hladkého svalu izolovaných z ovci aorty a K562-al buňky byly lyžovány 1% Tritonem X-100 v následujícím pufru: 50 mM Hepes, pH 7,5; 150 mM NaCI, 10 mM fenylmethyl35 sulfonyl fluorid (PMSF), 20 pg/ml aprotinin, 10 pg/ml leupeptin a 10 mM kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA). Vzorky byly rozděleny na SDS elektroforéze v gradientu 4 až 20 % polyakrylamidého gelu (SDS-PAGE) a přeneseny (elektroblotovány) na nitrocelulózové membrány. Bloty byly blokovány 5% sušeným mlékem v TBS; promyty v TBS obsahujícím 0,03% Tween-20 a po dobu 2 hodin inkubovány s protilátkami v blokovacím pufru, který obsahoval
0,05% NaN3. Bloty byly poté opět promyty (v TBS obsahujícím 0,03% Tween-20) a inkubovány jednu hodinu s protilátkami proti myším imunoglobulinům IgG konjugovanými s křenovou peroxidázou. Poté byly bloty opět promyty a po promytí k nim byl přidán substrátový roztok na ECL (Amersham). Poté byly bloty na 30 až 60 sekund exponovány na film (Kodak) a vyvolány.
Imunoblot (viz obrázek 17A) i analýza pomocí FACSu (viz obrázek 17B) ukázaly, že protilátka AJH10 reaguje s lidským, králičím a ovčím αϊβΐ integrinem, avšak nereaguje s krysím αΐβΐ integrinem. Z toho lze vyvodit, že se blokující monoklonální protilátka váže na evolučně konzervovaný lineární (spojitý) epitop. Neblokující monoklonální protilátky jednak nebyly účinné na ímunoblotu, aaní nereagovaly sjinými než lidskými druhy integrinů.
Příklad 17 Vazba otl-I domény na kolagen je závislá na dvoj mocných kationech
A. Purifikace α 1-1 domén
CZ 300710 Bó al—I domény byly exprimovány v bakteriích E.coli jako fúzní proteiny s GST (glutathion-Stransferáza), s tím, že na místě spoje obou sekvencí se nacházelo cílové místo pro štěpení trombinem, Přečištěný supernatant z buněk lyžovaných v PBS byl nanášen na kolonu Sepharosy 4B (Pharmacia), která byla pečlivě promyta PBS. Fúzní protein mezi al-l doménou a GST byt eluo5 ván pomocí 50mM Tris-HCl, pH 8.0, s 0,5 mM redukovaným glutathionem. Pro další denaturační studie byla doména I odštěpena trombinem v 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 a oddělena od GST domény. Bylo přidáno DTT (konečná koncentrace 2 mM) a vzorky byly naneseny na kolony Sepharosy 4B. Byly spojeny frakce flow-through a wash a navrstveny na kolonu Q Sepharosy FF (Pharmacia). Al-I doména byla eluována pomoci 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM 2io mercaproethanolu, 75 mM NaCI. Purifikovaná I doména měla předpokládanou molekulovou váhu 871 Da (Lee a další (1995), Structure 3, strana 1333 až 1340), což bylo určeno pomocí hmotnostní spektrometrie s ionizací pomocí elektrospraye (ESI-MS) a migrovala jako jeden proužek na SDS-PAGE. Protein byl rozdělen též pomocí chromatografie s exkluzním limitem na koloně Superosy 6 FPLC (Pharmacia) a poté eluován jako jeden peak odpovídající velikosti,
B. Funkční analýza jamkové mikrotitrační destičky byly přes noc při 4 °C potaženy 1 pg/ml kolagenem typu IV (Sigma) nebo kolagenem typu I (Collaborative Biomedical), promyty Tritonovým pufrem (0,1%
Triton X-l 00, ImM MgCl2, 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCI) a blokovány 3% hovězím sérovým albuminem (BSA) v 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCI (TBS). Takto potažené destičky byly za pokojové teploty po dobu jedné hodiny inkubovány se vzorky postupně ředěného fúzního proteinu ttl-I-GST v TBS obsahujícím 1 mM MnCl2 a 3% BSA. Po inkubaci byly destičky promyty Tritonovým pufrem. Navázaná al-I doména byla detekována postupným přidáváním následují25 cích roztoků 10 pg/ml biotinylované polyklonální protilátky proti GST (Pharmacia), konjugátu křenové peroxidázy s ExtrAvidinem (Sigma) ředěném 1:30000 v pufru TBS obsahujícím 1 mM MnCL a 3% BSA a konečně barviva 1-Step ABTS (2,2'-azin-di[3-ethylbenzthiazolin sulfonát]; Pierce). Destičky byly vyhodnoceny odečtením absorbance při vlnové délce 405 nm čtečkou mikrotitračníeh destiček (Molecular Devices).
Výsledky
V buňkách E. coli byly exprimovány lidská a krysí al-I doména(z 95% identická s lidskou) ve formě fúzního proteinu s GST. Fúzní proteiny byly purifikovány na glutathion-sepharóze. Oba proteiny byly testovány na schopnost vázat kolagen typu I a IV pomocí mírně modifikovaného ELISA testu, který byl popsán výše (Qu, A. a Leahy, D. J. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, strana 10277 až 10281). Lidská al-I doména váže kolagen typu IV s lépe než kolagen typu IV (viz obrázek 18A). Specifická protilátka proti al-I doméně inhibuje vazbu na oba ligandy, zatímco specifická protilátka proti a2-I doméně nikoli (viz obrázek 18B, údaje pro kolagen typu
I nejsou uvedeny).
Dvojmocné ionty Mnh a Mg2‘ schopnost vazby ke kolagenu zvyšovaly, zatímco přídavek EDTA snížil vazbu až na úroveň pozadí (viz obrázek I8C). Ve vazbě na ligand nebyly nalezeny žádné měřitelné rozdíly mezi lidskou a krysí al-I doménou, z čehož lze usuzovat, že sekvenční rozdíly mezi oběma druhy nemají funkční význam (údaje nejsou uvedeny). Dalším závěrem je, že al-I doména vyžaduje pro vazbu na ligand kladné ionty.
Příklad 18 Epitop závislý na kationtech se nachází v blízkosti motivu MIDAS.
Pro nalezení epitopu monoklonální protilátky blokující funkci αϊpl domény byla využita skutečnost, že monoklonální protilátka AJH10 rozpoznává lidskou al-I doménu, ale nerozezná již krysí sekvenci. Lidská a krysí sekvence se liší jen ve 12 aminokyselinách z nichž 4 leží v krátkém 6 aminokyselinovém epitopu (aa 92 až 97, viz obrázek 14A), který se nachází poblíž kritického threoninu (viz obrázek 14A, aa 98) v motivu MIDAS (metal ion dependent adhesion site, místo pro adhezi závislou na kovových iontech). Hypotéza, že 6 aminokyselinových zbytků (Val-GInArg-Gly-Gly-Arg) představuje cílový epitop blokující monoklonální protilátky, byla otestována na chimérické l doméně (RAH), ve které byly zaměněny krysí aminokyselinové zbytky G92, R93, Q94, a L97 za jim odpovídající lidské aminokyselinové zbytky V, Q, R, respektive R.
Monoklonální protilátka AJH10, stejně tak jako všechny další blokující monoklonální protilátky, byla schopna rozpoznat chimérickou í doména (RAH; viz obrázek 14B).
Dále byl zkonstruován homologní model al-I domény za použití krystalových souřadnic pro a2I doménu. Na základě tohoto modelu byla určena prostorová orientace uvedených aminokyselilo nových zbytků vzhledem k motivu MIDAS.
Homologní model lidské al I-domény byl založen na rentgenové krystalové struktuře lidské a2I domény (Ward a další, (1989) Nátuře 341, strana 544 až 546). Pro zkonstruování tohoto modelu byl použit specializovaný modul na homologní modelování v programu Insight II (verze 2.3.5,
Biosym Technologies). Byl použit program CHARMM (Clackson a další, (1991) Nátuře 352, strana 624 až 628) se sadou parametrů č. 22 (se zahrnutím všech vodíkových atomů) a s dielektrickou konstantou závislou na vzdáleností jako l/2r, kde r je vzdálenost atomů. Prvních 1000 minimalizačních kroků bylo provedeno metodou největšího spádu s hmotnostně váženou harmonickou poziční vazebnou podmínkou na všechny atomy α-I domény o velikosti 1 kcal/(molA2).
Po této minimalizaci následovalo dalších 1000 kroků metodou největšího spádu a 5000 Newton Rawsonovou metodou (s adaptovanou bází) a vazebnou podmínkou 0,1 kcal/(molÁ2) na C-a atomech al-I domény, tak, aby se zamezilo výrazné odchylce od rentgenové struktury a2-I domény.
Sekvence al βΐ a α2β1 integrinu sdílejí 51 % identických aminokyselinových zbytků, přičemž v jednotlivých doménách nejsou žádné inzerce nebo delece. Z toho lze soudit, že celková struktura obou I domén bude podobná. Předpokládané místo, ve kterém dochází ke koordinační vazbě kovových iontů je stejné v al-I doméně jako v a2-I doméně a aminokyselinové zbytky epitopů blokující monoklonální protilátky leží na smyčce mezi helixem a3 a helíxem a4 obsahujícím i threonin, který patří do motivu MIDAS a který je rozhodující pro vazbu kationů. Z modelu al-I vyplývá, že amidový dusík v glutaminu Q92 (viz obrázek 14A) vytváří vodíkovou vazbu s karbonylovou skupinou isoleoucinu 133, který je vedle šeřinu S32. Vyplývá z toho, že smyčka obsahující uvedený epitop může mít význam pro stabilizaci motivu MIDAS.
Ačkoli byl vynález do určité míry popsán prostřednictvím obrázků a příkladů, které slouží především k jeho objasnění a pro lepší porozumění podstaty vynálezu, je jisté odborníkům zřejmé, že při použití vynálezu může docházet k drobným změnám a adaptacím. Proto by popis a příklady použití vynálezu neměly být považovány za omezení rozsahu vynálezu. Vynález je dále přesněji vymezen následujícími nároky,
Seznam sekvencí <2IO> 1 <21 >26 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400 1 caggatccgt cagccccaca tttcaa 26 <2102 <21 >26 <2I2>DNA
<213> Homo Sapiens <400>
tcctcgaggg cttgcagggc aaatat
26 <210>3 <211> 26 <212>DNA io <213> Rattus norwegicus <400> 3 caggatccgt cagtcctaca tttcaa 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Rattus norwegicus <400>
tcctcgagcg cttccaaagc gaatat 26 <210>5 <211> 212 <212> PRT <213> Rattus norwegicus <400> 5
Val 1 Ser Pro Thr Phe 5 Gin Val Val Asn Ser 10 Phe Ala Pro Val Gin 15 Glu
Cys Ser Thr Gin 20 Leu Asp Ile Val Ile 25 Val Leu ASp Gly Ser 30 Asn Ser
Ile Tyr Pro 35 Trp Glu Ser Val Ile 40 Ala Phe Leu Asn Asp 45 Leu Leu Lys
Arg Met 50 Asp Ile Gly Pro Lys 55 Gin Thr Gin Val Gly 60 Ile Val Gin Tyr
Gly 65 Glu Asn Val Thr His 70 Glu Phe Asn Leu Asn 75 Lys Tyr Ser Ser Thr 80
Glu Glu Val Leu Val 85 Ala Ala Lys Lys Ile 90 Gly Arg Gin Gly Gly 95 Leu
Gin Thr Met Thr 100 Ala Leu Gly Ile Asp 105 Thr Ala Arg Lys Glu 110 Ala Phe
Thr Glu Arg 115 Ala Arg Arg Gly Val 120 Lys Lys Val Met Val 125 Ile Val Thr
Asp Gly 130 Glu Ser His Asp Asn 135 Tyr Arg Leu Lys Gin 140 Val Ile Gin Asp
Cys 145 Glu Asp Glu Asn Ile 150 Gin Arg Phe Ser Ile 155 Ala Ile Leu Gly His 160
Tyr Asn Arg Gly Asn 165 Leu Ser Thr Glu Lys 170 Phe Val Glu Glu Ile 175 Lys
Ser Ile Ala Ser 180 Glu Pro Thr Glu Lys 185 His Phe Phe Asn Val 190 Ser ASp
Glu Ala Leu L£U 210 Ala 195 Glu Leu Ala Val Thr Ile Val 200 Lys Ala Leu Gly Glu 205 Arg Ile Phe
<210> 6 <211> 212 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 6
Val Ser Pro Thr Phe Gin Val Val Asn Ser Ile Ala Pro Val Gin Glu
1 S 10 15
Cys Ser Thr Gin Leu Asp Ile Val Ile Val Leu Asp Gly Ser Asn Ser
20 25 30
Xle Tyr Pro Trp Asp ser Val Thr Ala Phe Leu Asn Asp Leu Leu Lys
35 40 45
Arg Met Asp Ile Gly Pro Lys Gin Thr Gin Val Gly Ile Val Gin Tyr
50 55 60
Gly Glu Asn Val Thr His Glu Phe Asn Leu Asn Lys Tyr Ser Ser Thr
65 70 75 80
Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Lys Lys Ile Val Gin Arg Gly Gly Arg
85 90 95
Gin Thr Met Thr Ala Leu Gly Thr Asp Thr Ala Arg Lys Glu Ala Phe
100 105 110
Thr Glu Arg Ala Arg Arg Gly Val Lys Lys Val Met Val Ile Val Thr
115 120 125
Asp Gly Glu Ser His Asp Asn His Arg Leu Lys Lys Val Ile Gin Asp
130 135 140
Cys Glu Asp Glu Asn Ile Gin Arg Phe Ser Ile Ala Ile Leu Gly Ser
145 150 155 160
Tyr Asn Arg Gly Asn Leu Ser Thr Glu Lys Phe Val Glu Glu Ile Lys
165 170 175
Ser Ile Ala Ser Glu Pro Thr Glu Lys His Phe Phe Asn Val Ser Asp
180 185 190
Glu Leu Ala Leu Val Thr Ile Val Lys Thr Leu Gly Glu Arg Ile Phe
195 200 205
Ala Leu Glu Ala
210 <210>7 to <211>6 <212> PRT <213> Rattus norwegicus <400> 7
Gly Arg Gin Gly Gly Leu <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400>8
Val Gin Arg Gly Gly Arg 1 5 <210>9 <211>6 <2Í2> PRT <213> Homo Sapiens
- 77 CZ 300710 B6 <400> 9
Val Gin Arg Gly Gly Arg

Claims (6)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití funkční blokující protilátky nebo fragmentu této protilátky, které se váží na epitop VLA-1, přičemž tento epitop obsahuje aminokyselinové zbytky Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg (Sekv. id. č. 8), pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení artritidy.
    15
  2. 2. Použití podle nároku 1, kde protilátka je monoklonální protilátka.
  3. 3. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2, kde farmaceutický přípravek je určen pro léčení lidí.
    20
  4. 4. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde farmaceutický přípravek je určen pro léčení revmatoidní artritidy.
  5. 5. Použití podle nároku 1, kdy přípravek je určen pro podávání v dávce protilátky nebo jejího fragmentu 0,1 až 10 mg/kg/den v intervalu 1 až 14 dnů.
  6. 6. Použití podle nároku 1, kdy přípravek je určen pro subkutánní podávání.
CZ20014249A 1999-06-01 2000-06-01 Použití blokující monoklonální protilátky proti VLA-1 pro výrobu farmaceutického prípravku k lécení zánetlivých onemocnení CZ300710B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13703899P 1999-06-01 1999-06-01
US18533600P 2000-02-29 2000-02-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20014249A3 CZ20014249A3 (cs) 2002-06-12
CZ300710B6 true CZ300710B6 (cs) 2009-07-22

Family

ID=26834850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20014249A CZ300710B6 (cs) 1999-06-01 2000-06-01 Použití blokující monoklonální protilátky proti VLA-1 pro výrobu farmaceutického prípravku k lécení zánetlivých onemocnení

Country Status (28)

Country Link
US (5) US6955810B2 (cs)
EP (3) EP1181054A1 (cs)
JP (6) JP4817503B2 (cs)
CN (1) CN1309419C (cs)
AU (2) AU783989B2 (cs)
BG (1) BG65579B1 (cs)
BR (1) BR0011250A (cs)
CA (1) CA2375827C (cs)
CY (1) CY1116042T1 (cs)
CZ (1) CZ300710B6 (cs)
DK (2) DK1488806T3 (cs)
EA (1) EA011384B1 (cs)
EE (1) EE200100651A (cs)
ES (2) ES2557768T3 (cs)
GE (1) GEP20063774B (cs)
HK (2) HK1043320A1 (cs)
HU (1) HUP0202568A3 (cs)
IL (2) IL146508A0 (cs)
IS (1) IS6179A (cs)
MX (1) MXPA01012388A (cs)
NO (1) NO20015864L (cs)
NZ (1) NZ515686A (cs)
PT (2) PT1488806E (cs)
SI (2) SI1488806T1 (cs)
SK (1) SK17232001A3 (cs)
TR (1) TR200103432T2 (cs)
WO (1) WO2000072881A1 (cs)
YU (1) YU85501A (cs)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2557768T3 (es) 1999-06-01 2016-01-28 Biogen Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante frente a VLA-1 y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
IL158376A0 (en) 2001-04-13 2004-05-12 Biogen Inc Antibodies to vla-1
AU2003215298A1 (en) * 2002-02-14 2003-09-04 Biogen, Inc. Alpha1beta1 antagonists for treatment of atherosclerosis
AU2003287435A1 (en) * 2002-11-01 2004-06-07 Boys Town Nat Res Hospital INDUCIBLE LIGAND FOR Alpha1Beta1 INTEGRIN AND USES
WO2005004800A2 (en) * 2003-06-20 2005-01-20 Morehouse School Of Medicine Trypanosome derived apoptotic factors (taf)
US20080093950A1 (en) * 2003-12-09 2008-04-24 Electrotechnologies Selem. Inc Polyphase Claw-Pole Machines With a Segmented Magnetic Circuit
US20050136055A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Pfizer Inc CD40 antibody formulation and methods
WO2006124269A2 (en) * 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) * 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
PL2034830T3 (pl) * 2006-05-25 2015-04-30 Biogen Ma Inc Przeciwciało anty-VLA-1 do leczenia udaru
WO2009135953A2 (en) * 2008-05-09 2009-11-12 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against integrins and uses thereof
KR102167261B1 (ko) * 2010-06-18 2020-10-20 엑스바이오테크, 인크. 관절염 치료
US10316095B2 (en) 2012-02-16 2019-06-11 Santarus, Inc. Antibody formulations
US11312775B2 (en) 2017-07-20 2022-04-26 University Of Virginia Patent Foundation Methods for treatment or prevention of a neurological immunity disorder

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5788966A (en) * 1990-08-31 1998-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibody which is directed against and inhibits collagen binding to a VLA-1 epitope and uses thereof

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
WO1988007089A1 (en) * 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) * 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5871907A (en) * 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5565332A (en) * 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
DK0626861T4 (da) 1992-01-13 2004-08-16 Biogen Inc Behandling af astma.
US5733743A (en) * 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6307026B1 (en) * 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
SG44845A1 (en) 1993-01-12 1997-12-19 Biogen Inc Recombitant anti-vla4 antibody molecules
ES2114183T5 (es) 1993-02-09 2006-06-16 Biogen Idec Ma, Inc. Anticuerpo para el tratamiento de la diabetes dependiente de la insulina.
US6111598A (en) * 1993-11-12 2000-08-29 Peveo, Inc. System and method for producing and displaying spectrally-multiplexed images of three-dimensional imagery for use in flicker-free stereoscopic viewing thereof
US5827690A (en) * 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
ES2270425T3 (es) 1994-01-25 2007-04-01 Elan Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos humanizados contra la molecula de adhesion leucocitaria vla-4.
US5840299A (en) * 1994-01-25 1998-11-24 Athena Neurosciences, Inc. Humanized antibodies against leukocyte adhesion molecule VLA-4
ES2151054T3 (es) * 1994-04-26 2000-12-16 Kanebo Ltd Farmaco para el tratamiento de la artritis reumatoide.
JPH08131185A (ja) * 1994-11-14 1996-05-28 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｖｌａ−１分子に対するモノクローナル抗体
JPH08160972A (ja) 1994-12-01 1996-06-21 Sega Enterp Ltd エフェクト制御方法、制御装置およびこれを利用したカラオケ装置
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
GB9516399D0 (en) 1995-08-10 1995-10-11 Camelot Superabsorbents Ltd Process for the production of water-absorbing compositions
WO1997008320A1 (en) * 1995-08-18 1997-03-06 Morphosys Gesellschaft Für Proteinoptimierung Mbh Protein/(poly)peptide libraries
DK0843961T3 (da) 1995-08-29 2007-05-21 Kirin Brewery Kimærisk mus og fremgangsmåde til at producere samme
DE19534177A1 (de) * 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
GB9519667D0 (en) 1995-09-27 1995-11-29 Univ Manchester Pharmaceutical composition
DE19541844C1 (de) 1995-11-09 1997-07-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von menschlichen Antikörpern und deren Verwendung
FR2745912B1 (fr) * 1996-03-08 1998-05-29 Lorraine Laminage Procede et dispositif de controle de la soudabilite de toles sandwich
US6127524A (en) * 1996-10-18 2000-10-03 Dade Behring Inc. Binding molecules and computer-based methods of increasing the binding affinity thereof
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
DE69810481T2 (de) 1997-06-13 2003-09-25 Genentech Inc Stabilisierte antikörperformulierung
PL345946A1 (en) 1998-05-22 2002-01-14 Boys Town Nat Res Hospital Use of α1β1 integrin receptor inhibitors and tgf-β1 inhibitors in the treatment of kidney disease
DE19831710A1 (de) * 1998-07-15 2000-01-20 Merck Patent Gmbh Diacylhydrazinderivate
CA2340333A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 Biogen, Inc. Crystals of the alpha 1 beta 1 integrin i-domain and their use
IL145898A0 (en) * 1999-04-22 2002-07-25 Biogen Inc Method for the treatment of fibrosis using an antagonist of the integrin alpha-4 subunit
ES2557768T3 (es) 1999-06-01 2016-01-28 Biogen Ma Inc. Un anticuerpo monoclonal bloqueante frente a VLA-1 y su uso para el tratamiento de trastornos inflamatorios
WO2000078221A1 (de) 1999-06-17 2000-12-28 Kai Desinger Chirurgische sonde zur minimal invasiven gewebeentnahme
WO2001073444A2 (en) 2000-03-28 2001-10-04 Cambridge University Technical Services Limited Receptor/peptide crystal structure for identification of inhibitors
US8288322B2 (en) 2000-04-17 2012-10-16 Dyax Corp. Methods of constructing libraries comprising displayed and/or expressed members of a diverse family of peptides, polypeptides or proteins and the novel libraries
DE10028402A1 (de) 2000-06-13 2001-12-20 Merck Patent Gmbh Pyridin-2-yl-aminoalkycarbonylglycyl-beta-alanin und Derivate
US7153944B2 (en) 2000-07-31 2006-12-26 The General Hospital Corporation High affinity integrin polypeptides and uses thereof
IL158376A0 (en) 2001-04-13 2004-05-12 Biogen Inc Antibodies to vla-1
AU2003215298A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Biogen, Inc. Alpha1beta1 antagonists for treatment of atherosclerosis
CA2494310A1 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US20040208870A1 (en) 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Stabilized high concentration anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
WO2005016883A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Icos Corporation Acrylamide derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
WO2005019200A2 (en) 2003-08-14 2005-03-03 Icos Corporation Aryl piperidine derivatives as vla-1 integrin antagonists and uses thereof
US7285530B2 (en) 2004-10-21 2007-10-23 Viron Therapeutics, Inc. Use of SERP-1 as an antiplatelet agent
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
WO2006133286A2 (en) 2005-06-07 2006-12-14 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Treatment of tnf antagonist-resistant inflammatory disorders and related methods
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
US20080118496A1 (en) 2006-04-10 2008-05-22 Medich John R Uses and compositions for treatment of juvenile rheumatoid arthritis
US9283260B2 (en) 2006-04-21 2016-03-15 Amgen Inc. Lyophilized therapeutic peptibody formulations
PL2034830T3 (pl) 2006-05-25 2015-04-30 Biogen Ma Inc Przeciwciało anty-VLA-1 do leczenia udaru
JP4951596B2 (ja) 2008-07-31 2012-06-13 株式会社日立製作所 冷却システム及び電子装置
CA2754528A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Genetech, Inc. Antibody formulation
CN107095846A (zh) 2009-12-21 2017-08-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗体配制剂
US20140017261A1 (en) 2011-02-03 2014-01-16 Mark Totoritis Selection and treatment of subjects
CN103380495B (zh) 2012-01-11 2016-05-18 松下知识产权经营株式会社 压接型半导体装置及其制造方法
US10316095B2 (en) 2012-02-16 2019-06-11 Santarus, Inc. Antibody formulations

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5788966A (en) * 1990-08-31 1998-08-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Antibody which is directed against and inhibits collagen binding to a VLA-1 epitope and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fabbri M. et al.: "A functional monoclonal antibody recognizing the human alpha 1 integrin I-domain", Tissue Antigens, vol. 48(1), 47-51, 1996 *
Laffon A. et al.: "Very late activation antigen on synovial fluid T cells from patients with rheumatoid arthritis and other rheumatic diseases", Arthritis Rheum., Vol. 32(4):386-92, 1989 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ515686A (en) 2005-01-28
YU85501A (sh) 2004-07-15
US6955810B2 (en) 2005-10-18
ES2529706T3 (es) 2015-02-24
IS6179A (is) 2001-11-28
US20050226877A1 (en) 2005-10-13
EP2314315B1 (en) 2015-01-21
JP2012176983A (ja) 2012-09-13
BR0011250A (pt) 2002-03-05
JP4817503B2 (ja) 2011-11-16
EA200400930A1 (ru) 2004-12-30
HK1154352A1 (en) 2012-04-20
PT2314315E (pt) 2015-03-17
US9902774B2 (en) 2018-02-27
ES2557768T3 (es) 2016-01-28
JP2011157403A (ja) 2011-08-18
US8084031B2 (en) 2011-12-27
SI2314315T1 (sl) 2015-04-30
US20090324598A1 (en) 2009-12-31
US20140154259A1 (en) 2014-06-05
BG106226A (en) 2002-08-30
NO20015864D0 (no) 2001-11-30
EP1488806B1 (en) 2015-12-09
US8557240B2 (en) 2013-10-15
BG65579B1 (bg) 2009-01-30
CY1116042T1 (el) 2017-01-25
AU2006201540A1 (en) 2006-05-11
EE200100651A (et) 2003-02-17
JP2004500328A (ja) 2004-01-08
CZ20014249A3 (cs) 2002-06-12
US20020146417A1 (en) 2002-10-10
WO2000072881A1 (en) 2000-12-07
IL146508A0 (en) 2002-07-25
HUP0202568A3 (en) 2009-11-30
GEP20063774B (en) 2006-03-27
EP1488806A3 (en) 2011-03-30
CA2375827A1 (en) 2000-12-07
US20120087925A1 (en) 2012-04-12
JP2007277253A (ja) 2007-10-25
EA011384B1 (ru) 2009-02-27
EP1488806A2 (en) 2004-12-22
AU783989B2 (en) 2006-01-12
CN1309419C (zh) 2007-04-11
US7462353B2 (en) 2008-12-09
EP2314315A1 (en) 2011-04-27
SK17232001A3 (sk) 2002-09-10
CN1390137A (zh) 2003-01-08
NO20015864L (no) 2002-02-01
EP1181054A1 (en) 2002-02-27
IL146508A (en) 2007-08-19
SI1488806T1 (sl) 2016-02-29
HUP0202568A2 (hu) 2002-11-28
MXPA01012388A (es) 2002-07-30
CA2375827C (en) 2017-01-10
JP5960762B2 (ja) 2016-08-02
DK1488806T3 (en) 2016-02-08
AU5724800A (en) 2000-12-18
JP2014210818A (ja) 2014-11-13
JP5623335B2 (ja) 2014-11-12
HK1043320A1 (zh) 2002-09-13
PT1488806E (pt) 2016-02-26
TR200103432T2 (tr) 2002-10-21
DK2314315T3 (en) 2015-02-02
JP2016121184A (ja) 2016-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7462353B2 (en) Method for the treatment of inflammatory disorders
AU2002258778C1 (en) Antibodies to VLA-1
JP2013241441A (ja) インテグリンアンタゴニストを用いて多発性骨髄腫および骨髄腫誘導骨吸収を治療する方法
EA005242B1 (ru) Способ лечения артрита при использовании блокирующего моноклонального антитела к интегрину vla-1 или его фрагмента
ZA200308568B (en) Antibodies to VLA-1.

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20000601