JP2011157403A - Vla−1に対するブロッキングモノクローナル抗体および炎症性障害の処置のためのその使用 - Google Patents
Vla−1に対するブロッキングモノクローナル抗体および炎症性障害の処置のためのその使用 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】関節炎に罹患している被験体の処置のための組成物であって、ここで該組成
物は、コントロール抗体処置した被験体と比較して約65%以上の関節炎スコアの減少を
提供するに有効な量で機能ブロッキング抗体または該抗体のフラグメントを含み、ここで
該機能ブロッキング抗体または該抗体のフラグメントは、VLA−1のエピトープと結合
し得、ここで該エピトープは、図15のアミノ酸残基92〜97を含む、組成物。
【選択図】なし
Description
インテグリンは、細胞相互のおよび細胞の周囲への接着を仲介する細胞表面分子の大き
いクラスを形成する細胞表面タンパク複合体である。細胞類は多くの発達過程および生理
的過程において互いに、およびその環境内のその他分子に、接着する必要がある。その例
は組織および器官の形成およびそれらの統合維持を含む。これらの生理的過程には炎症性
障害が含まれる。
かって遊出する段階を含む。この過程における接着分子の役割はしばしば以下を含む三段
階モデルに分けられる;最初、白血球が炎症中の内皮に運搬され、次の段階でこれにしっ
かりと付着し、そして白血球の炎症組織への経内皮的移動を生じる(非特許文献1;非特
許文献2)。炎症カスケードにおけるさらなる重要な段階で、そしてこれまで広くは研究
されていない段階は、末梢組織内に起こる;ここでは既存の細胞と同様侵潤細胞もエフェ
クター機能を果たすために感染部位に移動し、異種抗原を識別し、そして細胞活性化を受
ける必要がある。接着性相互作用が白血球の補充のために果たす役割とは別に、炎症にお
ける間隙の(interstitial)接着性相互作用の重要性を直接評価するために
、本発明者らはインテグリンファミリーの接着分子およびそのフラグメントの重要性、お
よび動物炎症(特に関節炎)モデル、におけるそれらの役割に焦点を当てた。
Hynes,R.O.、1992、Cell 69:11−25 Springer,T.A.、1992、Cell 76:301−314
本発明は被験体の炎症性障害の治療法を提供する。特に本発明は関節炎の治療法を提供
する。
体のフラグメントを含んでいる薬学的組成物を被験体に投与することを含む、被験体にお
ける炎症性障害の処置法を提供する。ここで、α1β1機能ブロッキング抗体またはフラ
グメントはアミノ酸残基92−97、Val−Glu−Arg−Gly−Gly−Arg
を含むVLA−1のエピトープに結合することができる。
からなる群から選択され得る。抗インテグリン抗体はモノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体であり得る。
。
細書に援用される。
(項目1)
被験体における炎症性障害の処置のための方法であって、その方法は、その被験体に薬学
的組成物を投与する工程を包含し、その薬学的組成物は、その炎症性障害を処置するのに
有効な量のα1β1機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントを含み、ここで
そのα1β1機能ブロッキング抗体またはそのフラグメントは、VLA−1のエピトープ
と結合し得、そしてここでそのエピトープは、図15のアミノ酸残基92〜97を含む、
方法。
(項目2)
関節炎の処置のための方法であって、その方法は、関節炎に罹患している被験体に、コン
トロール抗体処置した被験体と比較して約65%以上の関節炎スコアの減少を提供するに
有効な量で、機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントを含む組成物を投与す
る工程を包含し、ここでその機能ブロッキング抗体またはその抗体のフラグメントは、V
LA−1のエピトープと結合し得、ここでそのエピトープは、図15のアミノ酸残基92
〜97を含む、方法。
(項目3)
前記関節炎スコアの減少が約79%以上である、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記関節炎スコアの減少が約85%以上である、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記関節炎スコアの減少が約90%以上である、項目2に記載の方法。
(項目6)
前記抗体がモノクローナルである、項目1〜5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記被験体がヒトである、項目1〜6のいずれかに記載の方法。
(項目8)
前記被験体が、慢性関節リウマチに罹患している、項目2〜7のいずれかに記載の組成物
。
(項目9)
モノクローナル抗体AJH10(ATCC番号 )。
インテグリンおよびそのフラグメント、特にα1−インテグリンサブユニットに対する
抗体が前炎症性白血球と細胞外基質の諸成分(限定しないが、コラーゲン、ラミニンおよ
びフィブロネクチンを含む)との相互作用をブロックし得ることが本発明の発見である。
本発明は任意の単一の作用機構に制限することを意図しないが、インテグリンおよびその
フラグメントと、周囲のマトリックスとの相互作用の崩壊が前炎症性サイトカイン類の発
現を減少させ得ることが提起される。さらに、インテグリンおよびそのフラグメントに対
する抗体は、抗原特異的T−細胞のレベルに作用することによって、炎症反応のエフェク
ター相を調節し得ることが提起される。さらに、インテグリンおよびそのフラグメントに
対する抗体は、組織内の細胞移動および組織内の細胞性プライミングおよび/または活性
化を中断することによって作用し得ることが提起される。
β1)が、末梢組織環境において重要であることを例示する。この発見はまた、免疫反応
に対するマトリックス富化(matrix−rich)末梢組織環境の重要性を強調する
ことによって、インテグリンファミリーおよびそのフラグメントの炎症における役割を白
血球の内皮境界面における付着および遊出を超えてさらに広げ、そしてこのことは、接着
を基礎とする療法のインターベンションの新しい観点として、末梢組織を明らかにする。
テグリンは、α鎖(α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、
αV、αL、αM、αX、αD、αE、αIIbを含むがこれらに限定されない)と非共
役結合されるのβ鎖(β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7、β8を含むがこれら
に限定されない)を含む分子を含む。本発明に使用するために意図される種々のインテグ
リンの例には、以下を含むがこれらに限定されない:
α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1
、α9β1、α10β1、αVβ1、αLβ1、αMβ1、αXβ1、αDβ1、αII
bβ1、αEβ1;
α1β2、α2β2、α3β2、α4β2、α5β2、α6β2、α7β2、α8β2
、α9β2、α10β2、αVβ2、αLβ2、αMβ2、αXβ2、αDβ2、αII
bβ2、αEβ2;
α1β3、α2β3、α3β3、α4β3、α5β3、α6β3、α7β3、α8β3
、α9β3、α10β3、αVβ3、αLβ3、αMβ3、αXβ3、αDβ3、αII
bβ3、αEβ3;
α1β4、α2β4、α3β4、α4β4、α5β4、α6β4、α7β4、α8β4
、α9β4、α10β4、αVβ4、αLβ4、αMβ4、αXβ4、αDβ4、αII
bβ4、αEβ4;
α1β5、α2β5、α3β5、α4β5、α5β5、α6β5、α7β5、α8β5
、α9β5、α10β5、αVβ5、αLβ5、αMβ5、αXβ5、αDβ5、αII
bβ5、αEβ5;
α1β6、α2β6、α3β6、α4β6、α5β6、α6β6、α7β6、α8β6
、α9β6、α10β6、αVβ6、αLβ6、αMβ6、αXβ6、αDβ6、αII
bβ6、αEβ6;
α1β7、α2β7、α3β7、α4β7、α5β7、α6β7、α7β7、α8β7
、α9β7、α10β7、αVβ7、αLβ7、αMβ7、αXβ7、αDβ7、αII
bβ7、αEβ7;
α1β8、α2β8、α3β8、α4β8、α5β8、α6β8、α7β8、α8β8
、α9β8、α10β8、αVβ8、αLβ8、αMβ8、αXβ8、αDβ8、αII
bβ8、αEβ8。
β鎖単独(β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7、β8を含むがこれらに限定され
ない)に対する抗体、ならびにα鎖単独(α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、
α8、α9、α10、αV、αL、αM、αX、αD、αE、αIIbを含むがこれらに
限定されない)に対する抗体。加えて、本発明の方法はさらに、例えば以下を含むがそれ
らに限定されないα鎖のIドメインに対する抗体を含む、インテグリンフラグメントに対
する抗体の使用を意図する:α1β1由来のIドメイン(Briesewitzら、19
93、J.Biol.Chem.268:2989);α2β1由来のIドメイン(Ta
kadaおよびHemler、1989 J.Cell.Biol.109:397)、
αLβ2由来のIドメイン(Larsonら、1989 J.Cell.Biol.10
8:703)、αMβ2由来のIドメイン(Corbiら、1988 J.Biol.C
hem.263:12403)、αXβ2由来のIドメイン(Corbiら、1987
EMBO J 6:4023)、αDβ2由来のIドメイン(Graysonら、198
8 J Exp Med 188:2187)、αEβ7由来のIドメイン(Shawら
、1944 J Biol Chem 269:6016)。好ましい実施形態において
、α1−Iドメイン抗原決定基は少なくとも6個の隣接アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ここで上記隣接配列は図15の配列内に見いだされる。さらに、好ましい実施形態におい
て、上記隣接配列はVal−Gln−Arg−Gly−Gly−Argである。
Springerら、1990、Nature 346:425−434頁を参照のこと
)。
モノクローナル抗体を含む。本発明の好ましい実施形態は、抗−α1モノクローナル抗体
のようなモノクローナル抗体を含む。
特に、図15の残基92−97)に結合し、かつ例えば、コラーゲンIVに対するK56
2−α1依存性接着を阻害する能力によって試験されたようにα1β1機能をブロックす
る抗体をいう(実施例15を参照のこと)。
グ、ヒト化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Fab、Fab’、F(ab’)2およ
びF(v)抗体フラグメント、ならびに抗体重鎖または軽鎖のモノマーまたはダイマー、
またはこれらの混合物が挙げられる。従って、インテグリン分子およびそのフラグメント
に対するモノクローナル抗体は、本発明の方法における好ましい結合剤である。
結される結合した免疫グロブリン軽鎖および重鎖からなるインタクトな抗体を含む。用語
「抗体ホモログ」はまた、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖およびそれらの抗原
結合性フラグメント(それらは一つ以上の抗原(すなわち、α1、α2、α6またはα−
Iドメインを含むインテグリンサブユニット)に結合可能である)から選択される一つ以
上のポリペプチドを含むタンパク質を含むことが意図される。一つより多いポリペプチド
から構成される抗体ホモログの成分のポリペプチドは必要に応じてジスルフィド結合して
いてもよいし、さもなくば共有結合で架橋していてもよい。
並びにそのサブタイプ)のインタクトな免疫グロブリンを含む。ここで、免疫グロブリン
の軽鎖は、κ型またはλ型であり得る。
、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、F(v)
フラグメント、重鎖モノマーまたはダイマー、軽鎖モノマーまたはダイマー、1本の重鎖
と1本の軽鎖とからなるダイマーなど)も含む。従って、上記の抗体由来の抗原結合性フ
ラグメント、ならびに全長ダイマーポリペプチドまたはトリマーポリペプチドもそれ自体
有用である。
産生される抗体ホモログである。この抗体ホモログにおいて、抗原結合のためには必要と
されないヒト化免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸のいくつかまたは全てが、非ヒ
ト哺乳動物免疫グロブリン軽鎖または重鎖由来のその対応するアミノ酸の代わりに置換さ
れている。
産生される抗体ホモログであり、このホモログにおいて免疫グロブリン軽鎖、重鎖、また
はその両方のヒンジ領域および定常領域の全てまたは一部分が、別の免疫グロブリン軽鎖
または重鎖からの対応領域の代わりに置換されている。別の局面において、本発明は、(
1)インテグリン標的化部分;(2)必要に応じて、第2のペプチド、例えばインテグリ
ン標的化部分の溶解度またはインビボでの寿命を増加するもの、例えば、免疫グロブリン
スーパーファミリーのメンバーまたはそのフラグメントまたはその一部、例えばIgGの
一部またはフラグメント、例えばヒトIgG1重鎖定常部、例えばCH2およびCH3ヒ
ンジ領域;およびトキシン部分を含むキメラ分子の改変体を特徴とする。キメラ分子を用
いて、毛包などの上皮細胞の増殖に関連する疾患の危険のある被験体(例えば、ヒト)を
処置し得る。
て産生された抗体ホモログであり、免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸の全ては、
供給源がヒトに由来する。
炎などの皮膚関連の状態のような障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の
方法による処置において意図される他の炎症性障害としては、喘息、気管支炎、月経性痙
攣、腱炎、滑液包炎の処置、ならびに痛みおよび頭痛の処置、または高熱を処置する解熱
薬としての使用が含まれる。本発明の方法はまた、炎症性腸疾患、クローン病、胃炎、過
敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎などのような胃腸障害および直腸結腸癌の予防にも有用
である。本発明の方法は血管性疾患(vascular disease)、片頭痛、結
節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、リウマチ熱、I型糖尿病、重
症筋無力症、多発性硬化症、サルコイドーシス、ネフローゼ症候群、ベーチェット症候群
、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、結膜炎、外傷後腫脹、心筋虚血などの疾患における炎症
性障害の処置に有用である。本発明の方法は、アレルギー性鼻炎、呼吸困難症候群、内毒
素ショック症候群、およびアテローム性硬化症の処置にも有用である。
関節炎の治療に有用である。
量は1回または数回に投与できる。炎症性疾患の治療のためには、抗インテグリン抗体の
“有効量”は、治療すべき障害に対して、または美容的目的のために臨床的に容認できる
基準にしたがって、炎症関連性状態の進行を和らげ、軽くし、安定させ、逆転させ、緩徐
にし、または遅らせるために十分な量である。効果のインジケータの検出および測定は、
多数の利用可能な診断ツール、例えば非制限的に血液検査、肺機能試験、および胸部X線
;CTスキャン;気管支鏡;気管支肺胞洗浄法;肺生検およびCTスキャン等を含む身体
検査によって測定され得る。
公知である。例えばMendrickら、1995、Lab.Invest.72巻:3
67−375頁(マウス抗α1β1および抗α2β1 mAb);Sonnenberg
ら、1987 J.Biol.Chem.262巻:10376−10383頁(マウス
抗α6β1 mAb);Yaoら、1996、J Cell Sci 1996 109
巻:3139−50頁(マウス抗α7β1 mAb);Hemlerら、1984、J
Immunol 132巻:3011−8頁(ヒトα1β1に対するmAb);Pisc
helら、 1987 J Immunol 138巻:226−33頁(ヒトα2β1
に対するmAb);Waynerら、1988、J Cell Biol 107巻:1
881−91頁(ヒトα3β1に対するmAb);Hemlerら、1987 J.Bi
ol.Chem.262巻:11478−85頁(ヒトα4β1に対するmAb);Wa
ynerら 1988 J Cell Biol 107巻:1881−91頁(ヒトα
5β1に対するmAb);Sonnenbergら、1987、 J.Biol.Che
m.262巻:10376−10383頁(ヒトα6β1に対するmAb);A.Wan
gら、 1996 Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.15巻:6
64−672頁(ヒトα9β1に対するmAb);Davisら、1989 J Cel
l Biol 109巻:1817−26頁(ヒトαVβ1に対するmAb);Sanc
hez−Madridら、 1982、Proc Natl Acad Sci USA
79巻:7489−93頁(ヒトαLβ2に対するmAb);Diamondら、19
93:J Cell Biol 120巻:1031−43頁(ヒトαMβ2に対するm
Ab);Stackerら、1991 J Immunol 146巻:648−55頁
(ヒトαXβ2に対するmAb);Van der Vierenら、1995、Imm
unity 3巻:683−90頁(ヒトαDβ2に対するmAb);Bennettら
、 1983 Proc Natl Acad Sci USA 80巻:2417−2
1頁(ヒトαIIβ3に対するmAb);Hessleら、1984、Differen
tiation 26巻:49−54頁(ヒトα6β4に対するmAb);Weinac
kerら、1994 J.Biol.Chem.269巻:6940−8頁(ヒトαVβ
5に対するmAb);Weinackerら、1994 J.Biol.Chem.26
9巻:6940−8頁(ヒトαVβ6に対するmAb);Cerf−Bensussan
ら、1992、Eur J Immunol 22巻:273−7頁(ヒトαEβ7に対
するmAb);Nishimuraら、1994 J.Biol.Chem.269巻:
28708−15頁(ヒトαVβ8に対するmAb);Bossyら、 1991 EM
BO J 10巻:2375−85頁(ヒトα8β1に対するポリクローナル抗血清);
Camperら、 1998 J.Biol.Chem.273巻:20383−203
89頁(ヒトα10β1に対するポリクローナル抗血清)を参照されたい。
を発現する全細胞で免疫した哺乳動物から得たリンパ球(典型的には脾細胞)に融合する
。そして、生成したハイブリドーマ細胞の培養上清液を上記抗原に対する抗体についてス
クリーニングする。一般的にはKohlerら、 1975、Nature 265巻:
295−497頁“所定の特異性の抗体を分泌する融合細胞の連続培養”を参照されたい
。
の種、その免疫状態、哺乳動物の体重などに依存する。典型的には、免疫した哺乳動物を
繁殖させ、そして適切なスクリーニングアッセイを用いて各血液サンプルからの血清を特
定の抗体についてアッセイする。例えば抗インテグリン抗体はインテグリン発現細胞から
の125I標識細胞溶解液の免疫沈殿によって同定され得る。例えば、抗インテグリン抗
体が挙げられる抗体を、フローサイトメトリーによって例えばインテグリン分子を認識す
ると考えられる抗体とインキュベートした抗体発現細胞の蛍光染色を測定することによっ
て同定し得る。ハイブリドーマ細胞の生産に用いるリンパ球は、典型的には免疫哺乳動物
から単離され得る。この哺乳動物の血清は、このようなスクリーニングアッセイを使用し
て、抗インテグリン抗体の存在が陽性であることがすでに試験ずみである。
に由来する。好ましい不死細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン
(“HAT培地”)を含む培養培地に大して感受性であるマウス骨髄腫細胞系統である。
一般的には、HAT感受性マウス骨髄腫細胞を1500分子量のポリエチレングリコール
(“PEG1500”)を用いてマウス脾細胞に融合する。次いで、融合により生成した
ハイブリドーマ細胞をHAT培地を用いて選択する。HAT培地は未融合骨髄腫細胞や非
生産的融合骨髄腫細胞を殺す(未融合脾細胞は形質転換されないことから、数日後には死
滅する)。ハイブリドーマ培養上清液をスクリーニングすることによって、所望抗体を産
生するハイブリドーマを検出する。例えば抗インテグリン抗体を産生するために調製され
たハイブリドーマは、そのハイブリドーマ培養上清液に、組み換えインテグリン発現細胞
系統に結合する能力を有する分泌抗体を検査することによってスクリーニングされ得る。
ンである)を産生するために、このようなスクリーニングアッセイで陽性の検査結果の出
たハイブリドーマ細胞を、栄養培地中で上記ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を
上記培養培地中に分泌できる十分な条件下でかつ十分な時間培養した。ハイブリドーマ細
胞に適した組織培養技術および培養培地は周知である。馴化ハイブリドーマ培養上清液を
集め、そして抗インテグリン抗体を必要に応じて周知の方法によってさらに精製してもよ
い。
によって、所望抗体を産生してもよい。ハイブリドーマ細胞は腹腔内で増殖し、抗体を分
泌する。それは腹水として蓄積する。上記腹水をで腹腔から吸い出すことによって抗体を
採取できる。
において抗原類をブロックし得る別の好ましい結合剤である。これらは、Boerner
ら、1991、J.Immunol.147巻:86−95頁、“インビトロでプライム
されたヒト脾細胞から抗原特異的ヒトモノクローナル抗体の産生”に記載されているよう
に、インビトロでプライムされたヒト脾細胞を用いてインタクトな形態で調製される。
i.USA 88巻:2432−2436頁“レパートリークローニングによる多様な高
親和性ヒトモノクローナル抗体の生成”およびHuangおよびStollar、199
1、J.Immunol.Method 141巻:227−236頁、“インビトロ刺
激を行わずにヒト末梢血リンパ球から典型的免疫グロブリン可変領域CDNAライブラリ
ーの構成”により記載されているように、レパートリークローニングによって調製するこ
ともできる。米国特許第5,798,230号(1998年8月25日“ヒトモノクロー
ナル抗体の製法およびその使用”)はヒトB細胞からヒトモノクローナル抗体の調製を記
載している。このプロセスに従って、ヒト抗体産生B細胞を、エプスタイン−バーウィル
ス核抗原2(EBNA2)を発現するエプスタイン−バーウィルス、またはその誘導体で
の感染によって不死化する。不死化のために必要なEBNA2機能は引き続いて停止し、
その結果、抗体産生の増加を生じる。
998年8月4日“異種抗体産生のためのトランスジェニック非ヒト動物”)は、異種抗
体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物および不活性化内因性免疫グロ
ブリン遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を記載している。内因性免疫グロブ
リン遺伝子は、内因性免疫グロブリンに対するアンチセンス ポリヌクレオチド類および
/または抗血清によって抑制される。異種抗体は、非ヒト動物の種のゲノムには普通は見
いだされない免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。非再配列異種ヒト免疫グロブ
リン重鎖の配列を含む1つ以上の導入遺伝子が非ヒト動物に導入され、それによって、ト
ランスジェニック免疫グロブリン配列を機能的に再配列することができ、ヒト免疫グロブ
リン遺伝子によってコードされる種々のアイソタイプの抗体レパートリーを産生すること
ができるトランスジェニック動物を生成する。このような異種ヒト抗体はB細胞において
産生される。B細胞は、その後例えば骨髄腫のような不死化細胞系統と融合するとか、ま
たはこのようなB細胞を他の技術によって操作して、モノクローナルの異種完全ヒト抗体
ホモログを産生できる細胞系統を不朽化するという方法で、不死化される。
ましい結合剤は、インテグリンタンパク質またはそのフラグメントに結合する能力を有す
るヒト化抗体ホモログである。キメラ抗体を調製する初期の方法にしたがって、新しいア
プローチがEP0239400(Winterら)において記載された。それによると或
る種の相補的決定部領域(determining regions)(CDR)を別の
種からのCDRで置き換えることによって、抗体を変化させる。このプロセスを用いて、
例えばヒト重鎖および軽鎖Ig可変領域ドメインからのCDRをマウス可変領域ドメイン
からの代替のに置き換えることができる。これらの変化したIg可変領域を引き続きヒト
Ig定常部と組み合わせて、置換されたマウスCDRを除く組成が総合的にヒトである抗
体を作り出すことができる。このようなCDR−置換抗体は、キメラ抗体に比較してヒト
では免疫反応を誘起しそうもないと推定される。なぜならばCDR−置換抗体は明らかに
より少ない非ヒト成分を含むからである。CDR“グラフティング(grafting)
”を介してモノクローナル抗体をヒト化するプロセスは“再形成(reshaping)
”と呼ばれる。(Riechmannら、1988 Nature 332巻:323−
327頁、“治療のためのヒト抗体のリシェイピング”;Verhoeyenら、198
8、Science 239巻:1534−1536頁、“モノクローナル抗体にCDR
グラフティングを用いるヒト抗体のリシェイピング”)。
植される。なぜならば特異抗原に結合するマウス抗体の領域がCDRだからである(抗体
重鎖に3つ、軽鎖に3つ)。CDRの移植は遺伝子工学によって達成される。これにより
CDR DNA配列はマウス重鎖および軽鎖可変(V)領域遺伝子セグメントのクローニ
ングによって決定され、その後対応するヒトV領域に部位指向変異誘発によって移される
。このプロセスの最後の段階では、所望アイソタイプのヒト定常領域遺伝子セグメント(
通常、CHではγI、CLではκ)が付加され、ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子が哺乳動物
細胞に同時発現し、可溶性ヒト化抗体を生成する。
伝える。マウス抗体における6つのCDRが構造的にV領域“フレームワーク”領域に取
り付けられる。CDR−グラフティングが成功する理由は、マウスとヒト抗体との間のフ
レームワーク領域が、類似のCDR付着点を有する非常に似た三次元構造を有し得、その
結果CDRが交換可能だからである。このようなヒト化抗体ホモログは、Jonesら、
1986 Nature 321:522−525頁、“ヒト抗体の相補的決定領域の
、マウスのそれらによる置換”;Riechmann、1988、Nature 332
巻:323−327頁、“治療のためのヒト抗体のリシェイピング”;Queenら、1
989、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86巻:10029頁、“イン
ターロイキン2レセプターに結合するヒト化抗体”およびOrlandiら、1989、
Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86巻:3833頁“ポリメラーゼ連鎖
反応法によって発現するための免疫グロブリン可変ドメインのクローニング”に例示され
るようにして調製することができる。
抗原結合親和性全体に影響を与えると考えられている。いかなるヒトV領域フレームワー
クの改変を伴わずにヒト化抗体を作るためにマウス抗体からのCDRを直接移すと、しば
しば結合親和性の部分的または完全な損失を生じる。多くの場合、結合活性を得るために
はアクセプター抗体のフレームワーク領域による残基を変えることが重要であるようであ
る。
0029−10033頁、“インターロイキン2レセプターに結合するヒト化抗体”およ
びWO 90/07861(Protein Design Labs Inc.)は、
マウスmAb(抗Tac)のCDRとヒト免疫グロブリンのフレームワークおよび定常部
とを組み合わせることによって、アクセプター抗体のフレームワーク領域ににおける改変
された残基を含むヒト化抗体を調製する方法を記載している。彼らは、ヒトV領域フレー
ムワーク残基のいかなる改変をも伴わずに直接的なCDR移動からしばしば生じる結合親
和性の喪失の問題に対する一つの解決策を示した;彼らの解決策は二つの重要な段階を含
む。第一に、本来のマウス抗体(この場合は抗Tac MAb)のV領域フレームワーク
に対する最適タンパク配列ホモログに対してヒトVフレームワーク領域をコンピューター
分析によって選び出す。第二段階では、マウスCDRと相互作用しそうなフレームワーク
アミノ酸残基を可視化し、次いで、これらのマウスアミノ酸残基を相同ヒトフレームワー
クに重ねるために、マウスV領域の三次構造をコンピューターによってモデル化する。推
定的マウス接触残基を有する相同ヒトフレームワークを用いるこれらのアプローチは、イ
ンターロイキン2レセプターに特異的な抗体類(Queenら、1989[前出])およ
びまた、単純ヘルペスウィルス(HSV)に特異的な抗体類(Co.ら 1991、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA 88巻:2869−2873頁、“抗ウィル
ス治療のためのヒト化抗体”)に関して、本来のマウス抗体に対する同様な結合親和性を
有するヒト化抗体を生成する。
疫グロブリンを設計するための幾つかの基準を概説した。第一の基準はヒトアクセプター
として、通常は、ヒト化すべき非ヒトドナー免疫グロブリンに普通は相同である特定のヒ
ト免疫グロブリンからのフレームワークを用いるか、または多くのヒト抗体からのコンセ
ンサスフレームワークを用いることである。第二の基準は、もしもヒトアクセプター残基
が異常であり、そしてドナー残基がフレームワークの特定残基においてヒト配列に典型的
である場合、上記アクセプターよりもむしろ上記ドナーアミノ酸を使用することである。
第三の基準は、CDRSに直に隣接する部分ではアクセプターよりもむしろドナーフレー
ムワークアミノ酸残基を使用することである。
st、 1991、Biotechnology 9巻:266−271頁、“インビボ
でのヒトRSウィルス感染を阻止するためにヒトモノクローナル抗体の再形成”)を使用
し得、そして標準として、NEWMおよびREI重鎖および軽鎖からそれぞれ誘導される
V領域フレームワークを使用し得る。Tempestらの1991年のアプローチを用い
てNEWMおよびREIベースのヒト化抗体を構築する利点は、x線結晶学からNEWM
およびREI可変領域の三次元構造が知られており、そのためCDRとV領域フレームワ
ーク残基との間の特異的相互作用がモデル化できることである。
用できる動物被験体は、ペットとしても商業的目的のためにも飼育される家畜および牧畜
の両方にわたる。例としてはイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギが挙げら
れる。
明細書中で用いる用語“非経口”として、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑膜内、胸骨
内、クモ膜下、肝内、損傷内および頭蓋内注射または注入技術が挙げられる。
誘導体を、薬物学的に受容可能なキャリアと共に含む。本明細書中で用いられる用語“キ
ャリア”は公知の受容可能なアジュバントおよびビヒクルを含む。
性懸濁液)の形態であり得る。この懸濁液は適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を用い
、当業者に公知の技術に従って処方される。
限的に、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液等の経口的に受容可能な投与型で投与で
きる。
溶解して含む適切な軟膏に処方することができる。
内噴霧または吸入によってもまた投与することもできる。
被験体のサイズ、治療の目標、治療すべき病態の性質、使用する特定の医薬組成物、およ
び治療医師の判断等、種々の要因に依存する。1日あたり約0.001と約100mg/
kgとの間の体重、好ましくは1日あたり約0.1と約50mg/kgとの間の体重の活
性成分化合物という投与レベルが有用である。最も好ましいのは、抗体ホモログが、約0
.1mg/kg体重/日と約20mg/kg体重/日との間の投与量範囲、好ましくは約
0.1mg/kg体重/日と約10mg/kg体重/日との間の範囲で、かつ1−14日
間毎の間隔で投与される。別の好ましい実施形態では、腹腔内投与の際には上記抗体は約
0.3〜1mg/kgの用量で投与される。別の好ましい実施形態では抗体は静脈内投与
の際に約5〜12.5mg/kgの投与量で投与される。少なくとも1μg/mlの抗体
の血漿レベルを提供するのに効果的な量の抗体組成物を投与するのが好ましい。
ることができる。例えば、個体の上皮のサンプルに含まれる細胞について、投与された上
記作用物質を検出する第二の試薬を用いて、インビトロで(またはエキソビボで)上記作
用物質の存在を検査する。これは例えば、投与された作用物質に特異的な蛍光色素標識抗
体(これは、次いでその後標準FACS(蛍光活性化細胞選別機)分析によって測定され
る)でもよい。あるいは、投与された作用物質の存在をインビトロ(エキソビボ)で、個
々の細胞の、それ自体標識された(例えば蛍光色素で)同じ作用物質との結合能力の消失
または低下によって検出する。好ましい投与量はハリマウスポジティブ細胞の大部分の検
出可能コーティングをもたらすべきである。コーティングは抗体ホモログの場合、1−1
4日間持続するのが好ましい。
学、組み換えDNA、タンパク質化学、および免疫学の従来技術を利用する。これらは当
業者の範囲内である。このような技術は文献に記載されている。例えば、下記を参照され
たい。分子クローニング:実験室マニュアル、第2版(Sambrook、Fritsc
hおよびManiatis編集)、Cold Spring Harbor Labor
atory Press、1989;DNAクローニング、IおよびII巻(D.N.G
lover編)、1985;オリゴヌクレオチド合成(M.J.Gait編)、1984
:米国特許第4,683,195号(Mullisら);核酸ハイブリダイゼーション(
B.D.HamesおよびS.J.Higgins編)、1984;転写と翻訳(Ham
esおよびS.J.Higgins編)、1984;動物細胞の培養(R.I.Fres
hney編)、Alan R.Liss社、1987;固定細胞および酵素、IRL P
ress、1986;分子クローニングの実際的指針B.Perbal)、1984;酵
素学における方法、154および155巻(Wuら、編)、Academic Pres
s、ニューヨーク;哺乳動物細胞の遺伝子伝達ベクター(J.H.MillerおよびM
.P.Calos編)、1987、Cold Spring Harbor Labor
atory Press;細胞および分子生物学における免疫化学的方法(Mayerお
よびWalker編)、Academic Press、ロンドン、1987;実験免疫
学ハンドブック、I−IV 巻D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編)
、 1986;マウス胚の操作、Cold Spring Harbor Labora
tory PressPress、1986。
きではない。
(化学的試薬)
蛍光イソチオシアネート(FITC)はSigma Chemical社(セントルイ
ス、MO)から購入した。クロトン油はICNBiochmicals(オーロラ、OH
)から購入した。Alsevers溶液中の全ヒツジ血液はEast Acres Bi
ologicals(サウスブリッジ、MA)から得た。I型ラット尾コラーゲンおよび
IV型マウスコラーゲンはそれぞCollaborative Research In
s.(ベドフォード、MA)およびGibco(ゲイザースバーグ、 MD)から購入し
た。
、 NY)から購入し、そしてBalb/cバックグラウンドのα1β1インテグリン−
欠乏マウスは前述のようであった(3)。
(モノクローナル抗体)マウス抗原に対する機能ブロッキングmAbをアジドを含まな
い形式および低エンドトキシン形式で作製した:Ha31/8(ハムスター抗CD49a
;インテグリンα1)(Mendrickら、1995 Lab.Invest.72巻
:367−375頁)、Hal/29(ハムスター抗CD49b;インテグリンα2)(
β1)(Mendrick,D.L.ら、1995、Lab.Invest.72巻36
7−375頁;MendrickおよびD.M.Kelly1993 Lab.Inve
st.69巻:690−702頁)、ハムスターII群コントロールmAb Ha4/8
(ハムスター抗KLH)(Mendrick,D.L.およびD.M.Kelly 19
93 Lab.Invest.69巻:690−702頁)、およびPS/2(ラット抗
CD49d;インテグリンα4β1鎖)(Miyakeら、1991 J.Exp.Me
d. 173巻:599−607頁)。さらに、下記のマウス抗原に対する機能ブロッキ
ングmAbをアジドなし/低エンドトキシン調製物としてPharmingen(サンデ
ィエゴ、CA)から購入した:HMβ1−1(ハムスター抗CD29;インテグリンβ1
鎖)(Notoら、1995 Int.Immunol. 7巻:835−842頁)、
Ha2/5(ハムスター抗CD29;インテグリンβ1鎖)(Mendrick,D.L
およびD.M.Kelly 1993 Lab.Invest.69巻:690−702
頁)、3E2(ハムスター抗CD54、ICAM−1)Scheyniusら、1993
J.Immunol.150巻:655−663頁)、5H10−27(ラット抗CD
49e;インテグリンα5)(Kinashi,T.およびT.A.Springer、
1994、Blood Cells 20巻:25−44頁)、GoH3(ラット抗CD
49f;インテグリンα6)(Sonnenbergら、1987 J.Biol.Ch
em.262巻:10376−10383頁)およびラット アイソタイプコントロール
mAb R35−95(ラットIgG2a)およびR35−38(ラットIgG2b)。
7−12日間培養した。I型およびIV型コラーゲンに対する細胞の接着は既述のようで
あった(Gotwal)ら、1996 J.Clin.Invest.97巻:2469
−2477頁)。つまり、96ウェルのMaxisorpプレート(Nunc、Napi
ervill、IL)に10μg/mlのIV型または5μg/mlのI型コラーゲンの
いすれかをコーティングし、そして非特異的部位を1%BSAでブロックした。IL−2
活性化脾細胞を2μM BCECF[2’,7’−ビス(カルボキシエチル)−5(6)
カルボキシル フルオレセイン ペンタ アセトキシメチルエステル](Molecul
ar Probes、ユーゲン、OR)で標識化し、示したmAb10μg/mlと共に
15分間インキュベートした。次いで、コーティングしたウェルにRPMI中0.25%
BSA中105細胞を加え、そして37℃で60分間インキュベートした。RPMI中0
.25%BSAで3回洗って未結合細胞を除去した。CytoFluor2350蛍光プ
レート・リーダー(Millipore、ベドフォード、MA)を用いて接着を定量した
。入力した細胞に対する結合細胞の割合を測定し、コントロールmAb処理細胞(100
%に正規化した)に対するパーセント接着を計算した。BSAのみでコーティングしたウ
ェルに起因する細胞接着によるバックグラウンド値を差し引いた。
球が重要な役割を演ずると仮定して、本発明者は抗α1および抗α2mAbが白血球のコ
ラーゲンへの接着をブロックすることができるかどうかを試験した。α1およびα2の両
方の高レベルを発現する白血球を得るために、マウスT細胞をインビトロでIL−2で7
−12日間刺激した。これらの細胞はα1もα2も高レベルに発現し(図1A)、コラー
ゲンIV型およびI型をコーティングした両方の表面にも良好に結合した(図1B)。I
V型コラーゲンへの接着は抗α1 mAb単独によって一部分阻止され、抗α2 mAb
単独では阻止されなかった。対照的に、I型コラーゲンへの接着は抗α2 mAbによっ
て完全に阻止され、抗α1 mAb単独では部分的阻止のみを示した。抗β1mAbおよ
び抗α1と抗α2との組み合わせの両方は、I型およびIV型コラーゲンへの接着を完全
に阻止した。α1β1およびα2β1インテグリンが活性化T細胞に発現され、抗α1お
よびα2 mAbがコラーゲンへの白血球接着を機能的にブロックし得ることが証明され
たので、本発明者はこれらのmAbを用いて炎症性疾患の動物モデルにおけるこれらイン
テグリンのインビボでの役割を研究した。
(抗インテグリンmAbによるDTH応答の阻止)以前刊行されたプロトコル((Hu
rtrelら、1992、Cell.Immunol.142巻:252−263頁)を
若干変えて、SRBC誘起性遅延型過敏症(DTH)応答を起こした。つまり、0日目に
マウスの背中に100μl PBS中2×107SRBCを皮下注射することによってマ
ウスを免疫した。そのマウスを、5日目に、右後肢の足蹠に25μlPBS中1×108
SRBCを皮下注射することによってチャレンジした。足蹠の厚さを抗原チャレンジの2
0時間後に工学的ノギス(engineer’s caliper)(Mitutoyo
/MTI,Paramus,NJ)で測定し、足蹠の腫脹程度を計算した。結果を足蹠厚
さの平均増加パーセント±SEMとして報告し、%増加=[1−(抗原チャレンジの20
時間後の右足蹠厚さ/抗原チャレンジの20時間後の注射しなかった左足蹠厚さ)]×1
00として計算した。SRBC誘起性DTH応答のエフェクター相をブロックするために
、治療的またはコントロールmAb(100μg)(実施例1に記載の方法で作製された
)を、5日目に抗原チャレンジする1時間前に腹腔内投与した。
これは炎症における種々のサイトカインおよび接着分子の重要性を示すために用いられて
いる(Tedderら、1995 J.Exp.Med.181巻:2259−2264
頁、Terashitaら、1996 J.Immuno.156巻:4638−464
3頁)。SRBC感作マウスに足蹠抗原チャレンジの1時間前に抗インテグリンmAbを
受けさせ、20時間後に増加した足蹠厚によって炎症を測定し、評価した。PBSおよび
コントロールハムスターIg処理マウスは抗原チャレンジの20時間後に足蹠厚さの60
−70%の増加を示した(図2)。コントロールハムスターIg処理に比較して、抗α1
または抗α2 mAbは足蹠厚において68%および60%阻止をそれぞれ生じた。抗α
1およびα2 mAbの組み合わせは71%阻止し、抗α1または抗α2 mAb単独を
超える付加的効果はほとんど示さなかった。他の抗インテグリンmAbでの処置もDTH
エフェクター応答を有効に阻止した。種々のmAb処理でみられる阻止程度は49%(抗
α4)、23%(抗α5)、および57%(抗α6)であった。最後に、一般的β1インテグリン・サブユニットのmAb遮断(mAb HMBI−1)はエフェクターDTH応答を67%阻止した。
(抗インテグリンmAbによるCHSエフェクター応答の阻止)FITCに対する接触
過敏症(CHS)を前述のようにアッセイした(Gaspariら、 1991“免疫学
における最新プロトコル”、J.E.Coligan、A.M.Kruisbeek、D
.H.Margulies、E.M.Shevach、W.Strober編。John
Wiley & Sons,New York、ニューヨーク。章4.2:1)。つま
り、マウスの毛を剃った背中に0日目に1:1アセトン/ジブチルフタレート中0.5%
FITC 100μlを塗ることによりマウスを感作させた。10日後、動物を各耳の両
側に0.5%FITC5μlを塗布することによりチャレンジした。耳の腫脹応答を工学
的ノギス(Mitutoyo/MTI,Paramus,NJ)で、抗原チャレンジ時(
10日目)および24時間後に測定した耳の厚さにより決定し、そして結果をベースライ
ンの耳の厚さの平均増加パーセント±SEMとして報告した。耳の厚さの増加は、%増加
=[1−(抗原チャレンジの24時間後の耳の厚さ/抗原チャレンジ時の耳の厚さ)]×
100として計算した。CHS応答のエフェクター相をブロックするために、治療的また
はコントロールmAb(250μg)を10日目の抗原チャレンジの4時間前に腹腔内に
与えた。抗原に感作し、そしてビヒクルのみを耳にチャレンジしたマウス(ビヒクルコン
トロール)、またはあらかじめ感作させずに耳をチャレンジしたマウス(刺激性コントロ
ール)をネガティブコントロールとした(耳の厚さは2%以上増加することはなかった)
。
、本発明者はCHS応答のエフェクター相に対して抗インテグリンmAbがどんな影響を
有するかを研究した。マウスの毛を剃った背中へのFITC塗布を用いてマウスをハプテ
ン感作した。10日後に耳にFITCチャレンジすると翌日炎症性応答が起きた。FIT
C感作マウスは抗原チャレンジの24時間後には厚さの60−70%の増加を示した(図
3)。公開されている結果(Scheyniusら、J.Immunol. 150巻:
655−663頁)と一致して、抗ICAM−1 mAb処置は耳の腫脹の51%阻止を
起こした。コントロールハムスターmAbと比較して、抗α1または抗α2mAbを抗原チャレンジの4時間前のマウスの処置は、耳の腫脹のそれぞれ37%および57%の阻止を起こした(図3)。抗α1および抗α2 mAbの組み合わせは耳の腫脹の若干大きい阻止を起こした(65%)。β1インテグリンに対する他のmAbでの処置は、抗α4および抗5mAbがコントロールラットmAbに比較する場合、FITC誘起性CHSエフェクター応答を阻止しなかったのに対し、抗α6 mAbでの投与はエフェクター応答を86%阻止することが明らかになった。最後に、一般的β1インテグリンサブユニットのmAb遮断はCHSエフェクター応答を74%阻止した。異なる種のマウス(C57/BL6、129/Sv)および異なる感作剤(オキサゾロン)を用いて同様のCHS結果が得られた(データは示されず)。SRBC誘起性DTHモデルにみられる結果と同様に、炎症耳の組織学的分析は、浮腫形成も白血球浸潤も両方とも抗α1および抗α2 mAb処置によって阻止されることを明らかにした。
、抗原感作マウス(FITCまたはオキサゾロン)からのリンパ節の分析は、α1β1お
よびα2β1が専らCD44hiLFA−1hi活性化CD4+およびCD8+ T細胞に発
現されることを明らかにした(データは示されず)。抗α1および抗α2 mAbを用いるマウスの処置は、これら細胞の消失を生じなかった;CHSモデルにおいて抗原感作に対して見られる脾臓およびリンパ節の両方の活性化T細胞の数が影響を受けなかったからである。それに加えて、抗原感作マウスに抗α1および抗α2 mAbで長期処置した際(10−16日)、20日目に抗原でチャレンジしたマウスの炎症性応答には影響がなかったように、エフェクター細胞は機能的には欠失していなかった(データは示されず)。
(CHSエフェクター応答はα1β1欠乏マウスでは減少する)FITC仲介性CHS
のエフェクター応答においてα1β1の阻止的役割がmAb仲介性である可能性を排除す
るために、野生型およびα1β1インテグリン欠乏マウスで実験を行った(図4)。野生
型マウスにおけるエフェクター相のmAb阻止はこれまでの結果と一致し、抗α1では耳
の厚さの56%阻止を伴い、抗α2では56%阻止が、抗α1と抗α2との組み合わせでは62%の阻止を伴った。CHSのエフェクター相は未処置α1β1欠乏マウスでは未処置野生型マウスと比較して有意に減少した(耳の厚さの増加においてそれぞれ30% 対 71%)。予想通り、未処置α1β1欠乏マウスにおける耳の腫脹レベルは抗α1 mAb処置−野生型マウスに見られる耳の腫脹レベルに匹敵した。最後に、α1β1欠乏マウスにおけるα2β1のmAb遮断は、抗α1と抗α2 mAbとの組み合わせで処置した野生型マウスに見られる結果と一致して、耳の腫脹の阻止をごくわずか高めたに過ぎなかった。
炎症のDTHおよびCHSモデル両方に見られる抗インテグリンmAbの阻止効果が抗
α1および抗α2 mAbによって仲介される一般的抗α1炎症効果によって引き起こされる可能性もさらに排除するために、これらmAbの刺激性皮膚炎に対する効果を研究した。
5μlを塗った。治療的またはコントロール抗体を刺激適用の4時間前に与えた。24時
間後に耳の腫脹を前記のように測定し、そしてクロトン油塗布前の耳の厚さと比較した。
結果は上記のようにベースラインの耳の厚さの平均増加パーセント±SEMとして報告す
る。アセトンのみを塗布したマウス(ビヒクルコントロール)をネガティブコントロール
とした。
たマウスに比較する場合、耳の厚さの有意な増加を示した(48%)。クロトン油によっ
て誘起される毒性耳腫脹は、抗α1または抗α2 mAbで前処置したマウスでは、PBSまたはコントロールmAb処置動物のいずれかと比較して有意な影響を受けなかった(図5)。クロトン油処置した耳の組織検査は、抗α1または抗α2 mAb処置マウスと、コントロールmAb処置マウスまたはPBS処置マウスとを比較して、浸潤細胞の数またはタイプ、または浮腫生成において何ら差を示さなかった(データは示されず)。
(α1β1およびα2β1による関節炎の阻止)α1β1は関節炎患者の滑液中の浸潤
細胞によく発現することから、本発明者は以前に記載された加速性関節炎モデル(Ter
atoら、1992 J.Immunol. 148巻:2103−2108頁;Ter
atoら、1995 Autoimmunity. 22巻:137−147頁)におい
て抗α1または抗α2 mAbが阻止的に作用するかどうかを試験することにした。
し、そして十分確立されたプロトコルを用いて関節炎を誘発した(Teratoら、19
92 J.Immunol. 148巻:2103−2108頁;Teratoら、19
95 Autoimmunity. 22巻:137−147頁)。つまり、4種類の抗
コラーゲン II型mAb(各1mgづつ)の混合物を0日目に腹腔内注射し、続いて3
日目に50μgLPSを腹腔内注射することによって関節炎を誘発した。次の3−4日間
にマウスは、腫脹した手首、足首およびを発生した。治療的またはコントロールmAb(
250μg)の腹腔内注射を、0日目の抗コラーゲンmAbの注射4時間前および3日目
のLPS投与の4時間前に再度行われ、続いて実験期間中、3日目ごとに続けられた。3
日目からマウスの関節炎発生を評価した。各肢の関節炎の重症度を4ポイント系を用いて
スコア付けした。0=正常;1=足首または手首に軽度の赤み、またはわずかの腫脹;2
=足首または手首の中程度の腫脹;3=いくつかの指、足首および足を含む重度の腫脹:
4=最大炎症。
えて持続した。抗コラーゲンmAb単独注射もLPS単独注射も、関節炎を誘発しなかっ
た。コントロールmAb処置を受けたマウスはPBS処置マウスにみられるものと同程度
の関節炎を示した(図6)。対照的に、抗α1 mAb単独での処置は関節炎の実験期間
中持続する顕著な減少(78%)を示した。抗α2mAb単独での処置は有益な効果を示
し、コントロールmAb処置マウスと比較して関節炎スコアの32%の減少を生じた。抗
α1と抗α2 mAbとの組み合わせは抗α1 mAb単独でみられるのと同様な程度の阻止を生じた。
(抗α1および抗α2 mAb処置の炎症性細胞浸潤に与える影響の組織学的分析)SRBC誘起性DTH応答のさらなる組織学的分析は、抗α1および抗α2 mAb治療の、誘起された炎症性応答を調節する能力を確認した(図7)。SRBC感作マウスからの非チャレンジ足蹠(図7パネルA)は、同じマウスからのSRBCチャレンジ足蹠(図7パネルB)に比較して炎症性細胞性浸潤物を実質的には示さなかった。抗α1および抗α2を単独または組み合わせでのSRBC感作マウスの処置は、SRBCチャレンジ足蹠に見いだされるこれら浸潤細胞の数を、コントロールmAb−処置マウスと比較する場合、著しく減少した(図7パネルC−F)。浸潤細胞をより綿密に試験は、大部分の細胞が好中球からなり、若干の単球とリンパ球が存在していることを明らかにし、そして抗α1および抗α2 mAb処置がこれらの細胞数を著しく減らすことが確認された(図7パネルG−H)。
(炎症性細胞浸潤物中のα1発現細胞の免疫組織化学的証明)浸潤細胞の性質をより精
細に決定し、それらがコラーゲン結合インテグリンを発現するかどうかを決定するために
免疫組織化学を行った(図8)。非処置マウスの炎症足蹠からの浸潤細胞についてα1β
1インテグリンおよび細胞系統マーカーの発現について試験した(図8)。α1β1イン
テグリンは多くの浸潤白血球上に発現することが見出された(図8A)。二重免疫組織化
学を用いて浸潤細胞の性質およびα1β1発現の分布を同定した(図8B)。細胞系統マ
ーカーを用いて、浸潤物がほとんど顆粒球/単球(Mac−1+)からなり、これら細胞
の多くが好中球(Gr1+)であり、加えて、少数がTリンパ球(CD3+)であること
を見いだした(図8B)。α1β1インテグリンの発現は細胞の3サブセット全ての間に
見いだされ、α1はMac−1+顆粒球/単球のサブセット、Gr1+好中球のサブセッ
ト、および浸潤CD3+ Tリンパ球の大部分に発現した(図8B)。詳細な免疫組織化
学分析は、抗α1および抗α2 mAb処置が浸潤細胞数を減らすとはいえ、浸潤物中の細胞組成には変化が見られないことを明らかにした(データは示されず)。FITC抗ハムスターmAbでの免疫組成化学的染色は、抗α1および抗α2 mAbが炎症足蹠に局在化する能力を確認した(データは示されず)。
(α1β1およびα2β1に対するmAbによる関節炎の阻止およびα1欠乏マウスにおける関節炎の阻止)α1β1は関節炎患者の滑液中に浸潤する細胞に良好に発現されることから、本発明者は抗α1または抗α2 mAbがこれまで記載された(Teratoら、1992 J.Immunol. 148巻:2103−2108頁;Teratoら、1995 Autoimmunity. 22巻:137−147頁)加速性関節炎モデルにおいて阻止的であるかを試験することにした。このモデルは、抗コラーゲンII型mAbの混合物をマウスに注射し、続いて、LPSを投与し、次の3−7日間に関節炎を発生させることを含む。マウスに0日から始めて、3日目ごとにmAbを投与し、3日目ごとに関節炎の発生をスコア付けした。LPS注射後72時間以内に全てのマウスに重症な関節炎が発生し、3週間以上持続した。抗コラーゲンmAb単独の注射も、LPS単独の注射も関節炎を引き起こさなかった。コントロールmAb処置を受けたマウスはPBS処置マウスに見られるのと同様にひどい関節炎を示した。これに対し、抗α1mAb単独での処置は関節炎の顕著な減少(79%以上)を示し、それは実験期間中持続した。抗α2 mAb単独での処置もまた有益な効果を有し、コントロールmAb処置マウスに比較して関節炎スコアの37%の減少を起こした。抗α1および抗α2mAbの組み合わせは抗α1mAb単独で見られるものと同様程度の阻止を生じた。抗α1mAb処置での関節炎スコアの減少は全てのマウスに見られ、そして以下のようないくつかの他のmAbベースの関節炎治療に好都合に匹敵する:可溶性TNFレセプターIg融合タンパク質(Moriら、1996、J.Immunol.157巻:3178−3182頁)、抗Mac−1(Taylorら、1996 Immunology 88巻:315−321頁)、抗α4(Seiffge 1996 J.Rheumatol.23巻:2086−2091頁)、および抗ICAM−1(カキモトら、1992 Cell Immunol.142巻:326−337頁)(図9A)。関節炎におけるα1β1の重要な役割を示すmAbベースのデータと一致して、非処置α1欠乏マウスは野生型マウスに比較して関節炎スコアの顕著な減少を示した(図9B)。
(関節炎関節の免疫病態学に与える抗α1mAb処置の影響)コントロールmAbまた
は抗α1mAbのどちらかの投与を受けた野生型関節炎マウス(8日目)からの関節を視
覚的に、および組織学的に、正常非投与マウスからの関節と比較した(図10)。視覚的
に、コントロールmAb処置マウスからの関節は、指を含む足全体の赤さおよび腫脹を示
したが、抗α1 mAb処置マウスは関節または指のいずれかに炎症の兆候をほとんどま
たは全く示さなかった。組織検査はコントロールmAb処置した関節炎関節に重度の変化
を示し、それは炎症細胞を含む滑膜下組織の広範な浸潤、細胞の関節表面への付着、およ
びプロテオグリカン消失によって証明される著しい軟骨破壊を伴った(図10)。これま
での報告(Teratoら、1992 J.Immunol 148巻:2103−21
08頁;Teratoら、1995 Autoimmunity 22巻:137−14
7頁)と一致して、このモデルにおける浸潤細胞の大部分は好中球である。マウスの抗α
1 mAb投与は炎症性浸潤物の量および軟骨破壊の程度を劇的に減らした(図10)。
(関節炎の発生はリンパ球の非存在下では遅れ、そして抗α1 mAbによる関節炎の
阻止はリンパ球の非存在下で起きる)コラーゲンmAb−誘起性関節炎モデルにおいて重
要な細胞型を確認するために、野生型B6−129マウスおよびRAG−1−欠乏B6−
129マウスの関節炎発生能力を比較した(図11)。RAG−1(組み換え活性遺伝子
−1)の遺伝子欠失は成熟TおよびBリンパ球の完全な消失を起こす(Mombaert
sら、1992 Cell 68巻:869−877頁)。野生型およびRAG−1−欠
乏マウスの両方に関節炎が発生したが、RAG−1−欠乏マウスにおける誘発速度の方が
有意により遅い(図11)。これらの結果は、リンパ球がこの関節炎モデルに関係はして
いるが、それらはこの疾患の発生および進行のためには必要ないことを示唆する。他の関
節炎モデルでRAG−1欠乏マウスの効果を試験した公表された報告も、TおよびBリン
パ球の喪失が関節炎の発生を遅らせることを見いだした(Plowsら、1999 J.
Immunol.162巻:1018−1023頁)。抗α1 mAbでの野生型またはRAG−1−欠乏マウスのいずれの処置も関節炎を完全に阻止した(図11)。これらの結果は、このモデルでは抗α1 mAbの有効性はリンパ球の存在には依存せず、前の実験が示唆したように(図9)、抗α1 mAbの疾患防止効果は他のα1発現細胞(例えばマクロファージおよび好中球)に対するその作用を介し得ることを示している。
(関節炎の抗α1 mAb阻止の用量応答)抗α1 mAb処置が関節炎予防に対して明らかな効果を有すると仮定して、本発明者はこれらの研究を用量応答分析にまでひろげた(図12)。異なる用量のmAbを0日目から始めて3日目ごとに腹腔内投与した。以前のデータと一致して、抗α1 mAb250μg用量はほぼ完全に関節炎を予防した。100μgのより少量の抗α1mAbはこのモデルにおいて関節炎予防に一部有効であったが、これより少い用量は関節炎スコアにいかなる認め得る効果を与えなかった(図12)。
(抗α1 mAbでの治療的処置は関節炎スコアを減らすことができる)関節炎予防に
おける抗α1 mAbの効果を仮定して、本発明者は、この疾患を発生しつつあるマウス
を治療することを試みた。0日目に抗コラーゲン II型mAbの混合物を注射し、続い
て、3日目にLPSを投与することによってマウスに関節炎を誘発させた。次いで4日目
から開始して、マウスに抗α1mAbまたは可溶性TNFレセプターIg融合タンパク質
のどちらかを投与した。4日目から抗α1 mAbを受けたマウスでは、4日目から開始
して、コントロールハムスターmAbを受けたマウスに比較する場合、関節炎の進行は完
全に阻止された(図13)。抗α1mAbの治療的投与で見られる阻止の程度は完全であ
り、抗α1 mAbの予防的投与(0日目に開始)で見られるものに匹敵した(図13)
。比較して、4日目からのTNFレセプターIg融合タンパクでの処置は、コントロール
Ig融合タンパクに比較する場合、関節炎スコアの60−70%の抑制しか生じなかった
(図13)。抗α1 mAbとTNFレセプターIg融合との一緒の組み合わせは、関節
炎スコアの完全阻止に有効であった。これは、関節炎の抑制による抗α1 mAb処置単
独での完全な効果を考慮すると、驚くにあたらない。以上をまとめると、これらの結果は
、抗α1 mAbでの治療的処置が関節炎スコアの抑制に効果的であり、TNFアンタゴ
ニストの治療的処置に好都合に匹敵することを示す。
(α1−Iドメインのクローニングおよび変異誘発)ヒトおよびラットα1β1インテ
グリンIドメイン配列を、全長cDNAsから(Kernら(1994)J.Biol.
Chem.269巻、22811−22816頁;Ignatiusら、(1990)J
.Cell Biol.111巻、709−720頁)ポリメラーゼ連鎖応答法(PCR
)(PCR COREキット;Boehringer Mannheim GmbH、ド
イツ)によって、下記のヒト特異的(5’−CAGGATCCGTCAGCCCCACA
TTTCAA−3’[順方向];5’−TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAA
ATAT−3’[逆方向])またはラット特異的(5’−CAGGATCCGTCAGT
CCTACATTTCAA−3’[順方向];5’−TCCTCGAGCGCTTCCA
AAGCGAATAT−3’[逆方向])プライマーを用いて増幅した。生成したPCR
増幅生成物を精製し、pGEX4t−i(Pharmacia)に結合し、コンピテント
なDH5α細胞(Life Techbologies)に形質転換した。アンピシリン
耐性コロニーを、約45kDaグルタチオンS−トランスフェラーゼ−Iドメイン融合タ
ンパク質の発現に関してスクリーニングした。さらに特徴づけるために選択したクローン
のプラスミドDNAの挿入物からの配列をDNA配列決定によって確認した。
ト;5プライム−3プライム)、ラット残基G92、R93、Q94、およびL97(図
14)を対応するヒト残基、V、Q、R、およびRにそれぞれ交換した。上記RΔHIド
メインを有するクローンは、診断的Stu1制限酵素部位の欠失によって同定され、挿入
物はDNA配列決定によって確認された。ヒトα1−Iドメインのアミノ酸配列は図15
に示される。
(α1Iドメインに特異的なmAbの生成)モノクローナル抗体はインテグリンサブユ
ニットの構造と機能との関連性の研究において非常に有用なプローブであることが証明さ
れた。例えばmAbを広く用いて、活性化コンホメーションと関連するβ1サブユニット
の領域が研究された(Qu,AおよびLeahy,D.J.(1996)Structu
re 4巻、931−942頁)。従って、α1−Iドメインのコンホメーション変化の
ための潜在的プローブを同定するために、本発明者はヒトα1−Iドメインに対するmA
bのパネルを作成した。
研究所)を完全フロイントアジュバント(Life Techbologies)で乳濁
化した25μg精製ヒトα1β1(エドワーズら(1995)J.Biol.Chem.
270巻:12635−12640頁)で腹腔内(i.p.)に免疫した。これらを、不
完全フロイントアジュバント(Life Techbologies)で乳濁化した25
μgα1β1を3回腹腔内ブーストした。最も高い抗α1−Iドメイン力価を有するマウ
スに、融合の3日前に100μgのα1β1を腹腔内ブーストし、そして融合の前日に5
0μgのα1β1を静脈内注射した。脾細胞をFL653骨髄腫細胞と1:6の比率で融
合し、96ウェル組織培養プレートに1ウェルあたり100,000および33,000
で培養した。
た。FACS分析の前に、上清液を非トランスフェクトしたK562細胞と共にインキュ
ベートして、βサブユニットに単に結合しているIgGを除去した。続いて、FACS緩
衝液(0.5%NaN3を含むPBS中1%ウシ胎児血清(FCS))に懸濁したα1イ
ンテグリンサブユニット(K562−α1)でトランスフェクトした3−5×104個の
K562細胞を上清液と共に4℃で45分間インキュベートし、洗浄し、そしてフィコエ
リスリンに結合した抗α1マウスIgGと共にインキュベートした。FACS緩衝液で2
回洗った後、細胞をBecton Dickinson Flow Cytometer
で分析した。
ーニングした。つまり、PBS中30μg/mlヒトα1−Iドメイン−GST融合体5
0μlを96ウェルプレート(Nunk)のウェル上に4℃で一晩コーティングした。プ
レートをPBSで洗い、PBS中1%BSAでブロックし、そしてハイブリドーマ上清液
をIドメインと共に室温で1時間インキュベートした。0.03%Tween−20を含
むPBSでよく洗った後、アルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG(Jakson
ImmunoResearch)を加え、さらに1時間インキュベートした。最後の洗浄
後、0.1Mグリシン、1mM ZnCl2、および1mM MgCl2中1mg/ml
p−ニトロフェニルリン酸(pNPP)を室温で30分間加え、プレートをO.D.40
5で読み取った。
れらの能力を試験した。K562−α1細胞を、0.25%BSAを含むDMEM中2m
Mの2’,7’(ビス−2−カルボキシエチル−5および6)(bis−2−carbo
xyethyl−5 and 6)カルボキシフルオレッセイン ペンタアセトキシメチ
ルエステル(BCECF;Molecular Probes)で37℃で30分間標識
化した。標識細胞を結合緩衝液(10mM Hepes、 pH7.4;0.9%NaC
l;および2%グルコース)で洗い、結合緩衝液プラス5mM MgCl2中に最終濃度
1×106細胞/mlになるように再懸濁した。上清液50μlを、96ウェルプレート
で1ウェルあたり、等容量の2×105個のK562−α1細胞と共にインキュベートし
た。次いで、そのプレートを遠心分離し、上清液を除去した。細胞を結合緩衝液に再懸濁
し、コラーゲンコーティングプレートのウェルに移し、37℃で1時間インキュベートし
た。インキュベーション後、結合緩衝液で3回洗うことにより未接着細胞を除去した。接
着した細胞をCytofluor(Millipore)で分析した。
(K562−α1)を発現するヒト白血病K562細胞に、そしてα1−Iドメインに結
合した。これらのハイブリドーマの各々から免疫グロブリンを精製し、コラーゲンIVに
結合するK562−α1またはα1−Iドメインのいずれかをブロックする能力について
試験した。mAbは2クラスに分けられた:α1β1機能をブロックするクラスとブロッ
クしないクラス。例えばクローンAEF3、BGC5およびAJH10によって産生する
mAbはα1−Iドメインに結合するが(図16A、BGC5に関してはデータは示され
ず)、mAb AJH10だけがコラーゲンIVに対するα1−Iドメイン−依存性(図
16B)またはK562−α1(図16C)接着を阻止する。
発明者はPCRによって増幅し、そして19抗体のうち12抗体からのCDRを配列決定
した(データは示されず)。
en)から分離したmRNA2μgを、下記のプライマーそれぞれ25pMを用いて逆転
写した(Ready−To−Go You Prime First Strand K
it、 Pharmacia Biothech):重鎖VH1FOR−2(Midhi
shitaら(1993)Cell 72巻、857−867頁);軽鎖、VK4FOR
(これは4個の別々のオリゴを決める)(Kernら(1994)J.Biol.Che
m.269巻:22811−22816頁)。各ハイブリドーマで、重鎖および軽鎖を下
記のオリゴの種々の組み合わせを用いて4つの別個のPCR応答で増幅した:1)重鎖:
VH1FR1K(Kamataら(1995)J.of Biol.Chem.270巻
:12531−12535頁)、VH1BACK(Baldwinら(1998)Str
ucture 6巻:923−935頁)、VHfr1a、VHfr1b、VHfr1e、
VHfr1f、VHfr1g(Ignatiusら、(1990)J.Cell Biol
.111巻:709−720頁)、またはVH1FOR−2(Michisita,M.
、Videm,V.、およびアルノート(Arnaout,M.A.)ら(1993)C
ell 72巻、857−867頁);2)軽鎖:VK1BACK(Baldwinら(
1998)Structure 6巻:923−935頁)、VK4FOR、VK2BA
CKオリゴ(ケルンら、(1994)J.Biol.Chem.269巻:22811−
22816頁)またはVkfr1a、VHfr1c、VHfr1e、VHfr1f(イグナチ
ウスら(1990)J.Cell Chem.111巻:709−720頁)。生成物を
増幅し(95℃で5分、94℃で1分を50サイクル、55℃で2分、72℃で2分、最
終サイクルは72℃で10分)、ゲル精製し(QIAquick、Qiagen)、列挙
せる種々のオリゴを用いてABI377 Aequencerで直接配列決定した。
R)および介在フレームワーク領域にわたりほぼ一致し、これらのハイブリドーマがクロ
ーン的(Clonally)に関連があることを示唆する。
(免疫ブロッテイングおよびFACS分析)非ブロッキング抗体(non−block
ing antibody)の可変領域の配列は、阻止抗体で見いだされるクローン的に
関連がある配列のファミリーとは著しく異なっていた。阻止抗体が単一クローンに由来す
るようにみえることから、本発明者は一つ(AJH10)を選択し、さらに詳しく特徴づ
ける。
1細胞を50mM Hepes(pH7.5)中1%TritonX−100、150m
M NaCl、10mM フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)20μg/m
lアプロチニン、10μg/mlロイペプチン、10mMエチレンジアミン四酢酸(ED
TA)で抽出した。サンプルを4−20%勾配SDS−PAGEに供し、ニトロセルロー
ス膜にエレクトロブロッテイング(electroblotting)した。それらのブ
ロットをTBS中5%ドライミルクでブロックした;0.03%Tween−20を含む
TBS中で洗い、0.05%NaN3を含むブロッキング緩衝液中の抗体と2時間共にイ
ンキュベートした。次いで、ブロットを前のように洗い、セイヨウワサビペルオキシダー
ゼ結合抗マウスIgGと共に1時間インキュベートし、再び洗い、次いで、ECL試薬(
Amersham)で処理した。次いで、ブロットをフィルム(Kodak)に30〜6
0秒間曝し、現像した。
ト、ウサギ、およびヒツジα1β1インテグリンとは応答するが、ラットα1β1インテグリンとは応答しないことを示し、これは、ブロッキングmAbが進化的に保存された線状エピトープに結合することを示唆する。非ブロッキングmAbは免疫ブロッテイングにおいても効率的でなく、またヒト以外の種とも応答しなかった。
(α1−Iドメインのコラーゲンへの結合は二価カチオン依存性である)
(A.α1−Iドメインの精製)
α1−IドメインはE.coliにおいて配列の結合部にトロンビン切断部位を含むG
ST(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)融合タンパク質として発現される。PB
S中で溶解した細胞からの清澄な上清液を、PBSでよく洗ったグルタチオンSepha
rose4Bカラム(Pharmacia)にロードした。α1−Iドメイン−GST融
合タンパク質を50mM Tris−HCl(pH8.0)5mMグルタチオン(還元型
)で溶出した。変性研究では、Iドメインは50mM Tris(pH7.5)中のトロ
ンビンで切断され、GST融合パートナーから精製された。DTTを2mMになるように
付加し、そのサンプルをグルタチオンSepharose4Bカラムにロードした。フロ
ースルーおよび洗浄フラクションをプールし、QセファロースFFカラム(Pharma
cia)にロードした。α1−Iドメインを50mM TrisHCl(pH7.5)1
0mM 2−メルカプトエタノール、75mM NaClで溶出した。精製Iドメインは
エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI−MS)によって、その予想質量(Lee
ら、(1995)Structure 3巻、1333−1340頁、871Da)を示
し、SDS−PAGEによって単一バンドとして移動し、そして上記タンパク質はSup
erose6FPLCカラム(Pharmacia)上のサイズ排除クロマトグラフィー
によって、 適切なサイズの単一ピークとして溶出した。
96ウェルプレートを1μg/mlコラーゲンIV(Sigma)またはコラーゲンI
型(Collaborative Biomedical)で4℃で一晩コーティングし
、Triton緩衝液(0.1%TritonX−100;1mM MnCl2;25m
M Tris−HCl;150mM NaCl)で洗い、そして25mMTris−HC
l中3%ウシ血清アルブミン(BSA):150mM NaCl(TBS)でブロックし
た。1mM MnCl2および3%BSAを含むTBS中のα1−Iドメイン−GST融
合タンパク質の一連の希釈物を、ものを、コーティングプレート上で室温で1時間インキ
ュベートし、Tris緩衝液で洗った。結合α1−Iドメインを10μg/mlビオチン
化抗GSTポリクローナル抗体(Pharmacia);1mM MnCl2および3%
BSAを含むTBSで1:3000に希釈したExtraAvidin−セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ(Sigma)、および1−Step ABTS(2、2’−アジン−
ジ[3−エチルベンズチアゾリン スルホネート];Pierce)の連続添加によって
検出した。プレートをマイクロプレートリーダー(Molecular Device)
でO.D.405で読み取った。
ヒトおよびラット(ヒトに95%同一)α1−IドメインをE.coliでGST−融
合タンパクとして発現させ、そしてグルタチオン セファロース上で精製した。両タンパ
クについて、以前に記載されたELISAベースのアッセイのバリエーションを用いてコ
ラーゲンIおよびIVへの結合を試験した(Qu,A.およびLeahy,D.J.(1
995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92巻、10277−102
81頁)。ヒトα1−IドメインはコラーゲンIよりもコラーゲンIVにより効率的に結
合する(図18A)。α1−Iドメインに特異的な抗体は両リガンドに対する結合を排除
したが、α2−Iドメインに特異的な抗体は排除しなかった(図18B)(コラーゲンI
のデータは示されず)。Mn2+もMg2+も結合を刺激し、EDTAはバックグラウンドレ
ベルへの結合を減らした(図18C)。ヒトおよびラットα1−Iドメインの間で、リガ
ンド結合の顕著な差は検出されなかった。これは種間の配列の差は機能的に関係しないこ
とを示唆する(データは示されず)。このように、 α1−Iドメインは特異的に、効率
的リガンド結合のためのカチオンを必要とする。
(MIDASモチーフ近くのカチオン依存性エピトープ残基)本発明者はAJH10が
ヒトのα1−Iドメイン配列を識別するが、ラットのα1−Iドメイン配列は識別せず、
α1β1機能ブロッキングmAbのためのエピトープをマッピング(位置解析)するとい
う知見を活用した。ヒトおよびラット配列は12アミノ酸だけ異なり、そのうち4アミノ
酸はMIDASモチーフ内の重要なスレオニン(図14A、aa98)に隣接した6アミ
ノ酸(aa92−97、図14A)の範囲にある。この6アミノ酸残基、Val−Glu
−Arg−Gly−Gly−ArgがブロッキングmAbのためのエピトープを含む、と
いう仮定を試験するために、ラット残基G92,R93、Q94、およびL97を、対応
するヒト残基、V、Q、R、およびRにそれぞれ交換して、キメラIドメイン(RΔH)
を構成した。AJH10は、全ての機能ブロッキングmAbと共に、キメラIドメインを
認識する(RΔH;図14B)。
けるために、本発明者はα2−Iドメインの結晶構造の座標(coordinate)を
用いてα1−Iドメインをモデル化した。
作製した(Wardら(1989)Nature 341巻、544−546頁)。その
モデルはInsight II のホモログモデル化モジュール(バージョン2.3.5
;Biosym Technologies)を用いて作製された。プログラムCHAR
MM(Clacksonら(1991)Nature 352巻:624−628頁)を
、全水素パラメーターセット22において原子間距離(atom separation
distance)の2倍の距離依存性誘電率と共に用いた。本発明者は先ず最初に、
α1−Iドメインの全ての原子に1kcal/(molÅ2)の質量調和位置制約を用い
て、1000段階の最急降下法による最小化を行った。この最小化の後に、さらに100
0段階の最急降下法および、5000段階のAdopted−Basis Newton
Raphson法による計算を行い、α1−IドメインのC−α原子を0.1kcal
/(molÅ2)に制約し、α2−IドメインX線結晶構造からの有意な偏差を避けた。
示さなかった。これは2つのIドメインの全体的構造が類似していることを示唆する。金
属配位部位はα1−Iドメイン内の、α2−Iドメインの場合と同じ場所にあると予想さ
れる。そしてブロッキングmAbのためのエピトープを含む残基類はヘリックスα3とヘ
リックスα4との間のループ(ここにはカチオン結合のために重要なMIDASモチーフ
内のスレオニンが含まれる)上に位置する。上記のα1−Iドメインモデルは、Q92(
図14A)のアミド窒素が、I33(S32に隣接する残基)のカルボニル基と水素結合
することを予想する。従って、このエピトープを含む上記ループはMIDAS領域の安定
化において機能的役割を果たし得る。
変化および変更がなされることは当業者には明らかである。従って、上記説明および実施
例は発明の範囲を制限すると解釈されるべきでなく、本発明は添付のクレームによって輪
郭づけられるものとする。
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- 本明細書に記載される発明。
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