RU2587634C2 - Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека - Google Patents
Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2587634C2 RU2587634C2 RU2012153676/10A RU2012153676A RU2587634C2 RU 2587634 C2 RU2587634 C2 RU 2587634C2 RU 2012153676/10 A RU2012153676/10 A RU 2012153676/10A RU 2012153676 A RU2012153676 A RU 2012153676A RU 2587634 C2 RU2587634 C2 RU 2587634C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- population
- cell
- markers characteristic
- expressing markers
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0613—Cells from endocrine organs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
- C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factors [FGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
Abstract
Изобретение относится к клеточным технологиям. Описана клеточная популяция клеток человека, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где указанная изолированная популяция клеток человека получена путем культивирования линии эмбриональных стволовых клеток человека, выбранной из группы, включающей H1 (код NIH: WA01), Н7 (код NIH: WA07) и Н9 (код NIH: WA09) (WiCell Research Institute (WiCell)) в среде, дополненной активатором протеинкиназы С, причем более 60% клеток в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1, и где клетки в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, экспрессируют CDX2. Изобретение расширяет арсенал клеточных линий человека. 1 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка истребует приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным номером 61/333831, поданной 12 мая 2010 г., которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки для любых целей.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение представляет способы стимулирования дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки. В частности, настоящее изобретение представляет способ получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка доступных для трансплантации островков Лангерганса стимулировали интерес к разработке источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и энтодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из энтодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией в данном процессе является образование дефинитивной энтодермы. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF3 бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX 17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании дефинитивной энтодермы в панкреатическую энтодерму. Клетки панкреатической энтодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, PDX1. При отсутствии PDX1 развитие поджелудочной железы не происходит дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической энтодермы.
По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, в работе Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) сообщается о дифференцировании мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулин-секретирующие структуры, аналогичные островкам поджелудочной железы. В работе Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) сообщается, что полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток инсулин-секретирующие клетки нормализуют гликемию у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином.
В одном примере в работе Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) раскрывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.
В другом примере в работе Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) сообщается о получении инсулин-продуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.
В работе Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать PDX1-положительную панкреатическую энтодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуры на 4 день дифференцирования эмбриональной стволовой клетки в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).
В работе Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией PDX1. Результаты авторов показывают, что экспрессия экзогенного PDX1 явно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В работе Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (PDX1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдали при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Авторы также отмечали, что уровень экспрессии инсулина и PDX1 mRNA не зависел от наличия ретиноевой кислоты. Однако обработка с использованием 3 нМ FGF7 привела к повышению уровня транскрипта для PDX1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучены эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцирование эмбриональных стволовых клеток в PDX1-положительные клетки. Авторы отмечали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли PDX1-положительных клеток (Genes Cells, июнь 2005 г.; 10(6): 503-16).
В работе Gordon et al. продемонстрирована индукция образования брахиурических [положительных]/HNF3 бета [положительных] энтодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального каскада Wnt (патент США № 2006/0003446A1).
В работе Gordon et al. (PNAS, т. 103, стр. 16806, 2006) говорится: «Для образования передней первичной полоски требовались одновременно сигнальные каскады Wnt и TGF-бета/Nodal/активин».
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах не может в точности имитировать программу развития у высших млекопитающих, например у человека.
В работе Thomson et al. выделяли эмбриональные стволовые клетки из бластоцист человека (Science 282:114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцированию которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека необходимо культивировать в крайне специфических условиях (патент США № 6200806; международные заявки на патент №№ 99/20741, 01/51616).
В работе D'Amour et al. описывается производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, производной от эмбриональных стволовых клеток человека, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцированию в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых энтодермальных органов. Клетки дефинитивной энтодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, можно далее дифференцировать в PDX1-положительные клетки после добавления FGF-10 (патент США № 2005/0266554A1).
В работе D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) говорится: «Мы разработали способ дифференцирования, преобразующий эмбриональные стволовые клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный способ имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через стадии, напоминающие образование дефинитивной энтодермы, энтодермы кишечной трубки, панкреатической энтодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны».
В другом примере в работе Fisk et al. сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (патент США № 2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Сначала эмбриональные стволовые клетки человека были дифференцированы до энтодермы с помощью комбинации бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировали с антагонистами TGF-β, такими как Ноггин, в комбинации с EGF или бетацеллюлином с получением PDX1-положительных клеток. Окончательное дифференцирование индуцировали никотинамидом.
В одном примере в работе Benvenistry et al. сообщается: «Мы делаем вывод, что сверхэкспрессия PDX1 повышала экспрессию панкреатических обогащенных генов, а для индукции экспрессии инсулина могут требоваться дополнительные сигналы, присутствующие только in vivo» (Benvenistry et al., Stem Cells 2006; 24:1923-1930).
В другом примере в работе Grapin-Botton et al. сообщается: «Ранняя активация Ngn3 почти во всех случаях индуцировала глюкагон-положительные клетки, уменьшая при этом количество клеток-предшественников поджелудочной железы. Как и в случае E11.5, предшественники PDX-1 могут дифференцироваться в инсулин-[положительные] и PP-[положительные] клетки» (Johansson KA et al., Developmental Cell 12, 457-465, март 2007 г.).
Например, в работе Diez et al. сообщается: «После 9 и 10 недель большинство глюкагон-положительных клеток одновременно экспрессировали инсулин, хотя на этих стадиях явно обнаруживались и отдельные клетки, экспрессирующие только инсулин. Клетки, одновременно экспрессирующие инсулин и глюкагон, наблюдали в течение всего периода исследования (от 9 до 21 недели), но они представляли лишь небольшую часть от общего количества экспрессирующих инсулин и глюкагон клеток» (J Histochem Cytochem., сентябрь 2009 г.; 57(9):811-24, 13 апреля 2009 г.).
В одном примере в работе Chen et al. сообщается: «(-)-индолактам V [(ILV)] активирует сигнальный каскад протеинкиназы С и задает поджелудочную спецификацию эмбриональных стволовых клеток человека, которые уже были определены для дифференцирования в линии энтодермы...ILV и ретиноевая кислота воздействуют через связанный механизм...ILV демонстрирует более сильную индукцию экспрессирующих PDX-1 клеток (большую процентную долю экспрессирующих PDX-1 клеток), чем ретиноевая кислота» (Nature Chemical Biology 5, 195-196 (апрель 2009 г.) doi:10.1038/nchembio0409-195).
В работе Lyttle et al. сообщается: «NKX6-1 со-локализованы только с инсулиновыми клетками, что указывает на то, что NKX6-1 участвует только в развитии бета-клеток человека» (Diabetologia, июль 2008 г.: 51(7):1169-80, 2008).
Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке лабораторных способов создания функциональной экспрессирующей инсулин клетки, более близкой к β-клетке. Настоящее изобретение представляет альтернативный подход к повышению эффективности дифференцирования эмбриональных стволовых клеток человека в экспрессирующие инсулин клетки путем генерирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ дифференцирования популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, содержащий следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; и
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.
В одном варианте осуществления более 50% клеток в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые получены способами, составляющими предмет настоящего изобретения, одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигурах 1A и 1B приведены данные по экспрессии PDX1, NKX6.1 и ISL-1 на стадии 4, день 4, протокола дифференцирования, приведенного в примере 1. На фиг. 1A приведены данные по экспрессии PDX1 и NKX6.1. На фиг. 1B приведены данные по экспрессии NKX6.1 и ISL-1.
На фигурах 2A и 2B показан эффект обработки активатором протеинкиназы С (PKC) на долю клеток, экспрессирующих PDX1, NKX6.1 и CDX2, анализируемый с помощью анализатора IN Cell Analyzer 1000 (фиг. 2A), а также сравнение различных активаторов PKC и эффектов их воздействия на долю клеток, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, по данным, полученным на анализаторе IN Cell Analyzer (фиг. 2B).
На фигурах 3A, 3B и 3C приведены уровни циркулирующего C-пептида у мышей линии SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров, которым вводили клетки, составляющие предмет настоящего изобретения, под почечную капсулу (фиг. 3A) и через имплантированное под кожу устройство Theracyte (фиг. 3B). Уровни C-пептида регистрировали в указанные моменты времени. На фиг. 3C показано сравнение уровней С-пептида, наблюдаемых в группе, получавшей клетки под почечную капсулу, и группе, получавшей клетки через подкожное устройство Theracyte, через 12 недель после трансплантации.
На фигурах 4A, 4B, 4C и 4D показан эффект обработки активатором PKC на экспрессию PDX1, NKX6.1, NGN3 и PTF1 альфа в клетках, обработанных в соответствии со способами, описанными в примере 3.
На фигурах 5A, 5B, 5C и 5D показан эффект FGF7 на экспрессию NKX6.1, PDX1, PTF1 альфа и CDX2 в клетках, обработанных в соответствии со способами, описанными в примере 4.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание настоящего изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцировать с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от множества зародышевых листков, и по существу способствовать формированию большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития следующим образом: (1) тотипотентные, способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементы (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или множества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которую можно использовать для оценки дифференцирования некоммитированной клетки данную линию дифференцирования.
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксный белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, включают в себя клетки-предшественники клеток первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезоэнтодермы и клетки дефинитивной энтодермы.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HNF4 альфа, SOX9, HB9 или PROX1. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, включают в себя клетки панкреатической энтодермы, клетки первичной кишечной трубки и поздние клетки передней кишки.
Используемый в настоящей заявке термин «дефинитивная энтодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 бета, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет выявлять интересующую клетку и отличать ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
Используемые в настоящей заявке термины «панкреатическая эндокринная клетка», или «клетка, экспрессирующая гормон поджелудочной железы», или «клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток», относятся к клетке, способной экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Выделение, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадиеспецифических эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначаемыми как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998 г.). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и к повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которую можно обнаружить путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, г. Берлингейм, штат Калифорния). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ОТ-ПЦР.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в энтодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентность можно определить по образованию эмбриоидных тел и их анализа на предмет присутствия маркеров, которые ассоциируются с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», то есть эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из ткани, формируемой после вынашивания плода, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в период вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Неограничивающими примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека или эмбриональных зародышевых клеток человека, например, линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке композиций во время первоначального установления или стабилизации таких клеток. В этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Целям настоящего изобретения также соответствуют клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Целям настоящего изобретения также соответствуют линии мутантных эмбриональных стволовых клеток человека, такие как BG01v (BresaGen, г. Афины, штат Джорджия).
В одном варианте осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовят, как описано в работе Thomson et al. (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные стволовые клетки в различных отношениях. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенного дифференцирования. Рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной предварительным культивированием клеток иного типа. В альтернативном варианте осуществления рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Thompson et al. (Science 6, ноябрь 1998 г.: т. 282, № 5391, стр. 1145-1147). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на любом из слоев питающих клеток, раскрытых в работе Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека в соответствии со способами, изложенными в работе Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20020072117. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6642048. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в международном патенте WO2005014799. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в работе Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20070010011. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050233446. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6800480. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в международном патенте WO2005065354.
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod. 105.046870, 19 октября 2005 г.). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050148070. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050244962. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в международной заявке на патент № WO2005086845.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном варианте осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном варианте осуществления соответствующим культуральным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, последние могут включать в себя ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных комбинациях.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживаемость, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.
Соответствующая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco № 10829-018, основная среда Хэма F12/50% DMEM, 200 мМ L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; рекомбинантный основной фактор роста фибробластов человека (bFGF), Gibco № 13256-029.
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы из плюрипотентных стволовых клеток, содержащий следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; и
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 60% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 70% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 80% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 90% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
В одном аспекте настоящего изобретения популяция клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, можно дополнительно обрабатывать для получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для желательного вида клеток.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (под ред. Ausubel et al., 2001, доп.)), а также способы иммунологического анализа, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или более из следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть очищены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например, CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы.
К плюрипотентным стволовым клеткам, допустимым для использования в целях настоящего изобретения, относятся, например, эмбриональные стволовые клетки человека линии H9 (код NIH: WA09), эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 (код NIH: WA01), эмбриональные стволовые клетки человека линии H7 (код NIH: WA07) и эмбриональные стволовые клетки человека линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также целям настоящего изобретения соответствуют клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, CRIPTO, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81.
Маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, выбраны из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобного гомеобоксного белка, FGF4, CD48, эомезодермина (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Целям настоящего изобретения соответствует клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии дефинитивной энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой мезэнтодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку дефинитивной энтодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, выбраны из группы, состоящей из PDX1, NKX6.1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HNF4 альфа, SOX9, HB9 и PROX1. Целям настоящего изобретения соответствует клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, представляет собой клетку панкреатической энтодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбраны из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, PAX4 и PAX6. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида. Целям настоящего изобретения соответствует клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для линии дифференцирования β-клеток. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования β-клеток, представляет собой β-клетку.
Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцирование плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/736908.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/779311.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 60/990529.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076889.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076900.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076908.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076915.
Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы из плюрипотентных стволовых клеток, содержащий следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; и
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 60% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 70% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 80% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 90% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
В одном варианте осуществления активатор протеинкиназы С выбран из группы, состоящей из (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама, индолактама V (ILV), форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA) и форбол-12,13-дибутирата (PDBu). В одном варианте осуществления активатор протеинкиназы С представляет собой (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам можно использовать в концентрации от приблизительно 20 нМ до приблизительно 500 нМ. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам в настоящем документе называется «TPB».
В одном варианте осуществления в среду, в которую добавлен активатор протеинкиназы С, дополнительно добавлен по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, ингибитора сигнального каскада рецепторов TGFβ, а также фактора роста фибробластов.
В одном варианте осуществления фактор, способный ингибировать BMP, представляет собой Ноггин. Ноггин можно использовать в концентрации от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 500 нг/мл. В одном варианте осуществления Ноггин используют в концентрации 100 нг/мл.
В одном варианте осуществления ингибитор сигнального каскада рецептора TGFβ представляет собой ингибитор ALK5. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II. Ингибитор ALK5 II можно использовать в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 10 мкМ. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 II используют в концентрации 1 мкМ.
В одном варианте осуществления фактор роста фибробластов представляет собой FGF7. В альтернативном варианте осуществления фактор роста фибробласта представляет собой FGF10.
В одном варианте осуществления фактор роста фибробластов можно использовать в концентрации от приблизительно 50 пг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. В одном варианте осуществления фактор роста фибробластов используют в концентрации 50 нг/мл.
Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
В одном варианте осуществления популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, дополнительно дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, с использования любого способа, известного специалистам в данной области.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D' Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D' Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 11/736908.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 11/779311.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 60/953178.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 60/990529.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 61/289671.
Настоящее изобретение далее без ограничений иллюстрируется следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Формирование популяции клеток, составляющих предмет настоящего изобретения
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; № по кат. 356231) чашках со средой RPMI (Invitrogen, № по кат. 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по кат. 120-14) + 20 нг/мл WNT-3a (R&D Systems; № по кат. 1324-WN/CF) в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI, дополненной 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем либо
c. обработка 1: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 в течение четырех дней (стадия 4 - основная среда - BM), либо
d. обработка 2: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II в течение четырех дней (стадия 4), либо
e. обработка 3: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нм форбол-12,13-дибутирата (PDBu) (Calbiochem, № по кат. 524390) в течение четырех дней (стадия 4).
Образцы культур отбирали в дублях на стадии 4, день 4, и получали их изображения с помощью анализатора IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания для каждой лунки снимали по 100 проекций. Для каждой лунки с использованием программного обеспечения IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare) измеряли общее количество клеток, общее количество клеток, экспрессирующих PDX1, общее количество клеток, экспрессирующих NKX6.1, и общее количество клеток, экспрессирующих CDX-2. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общие количества клеток, экспрессирующих PDX 1, NKX6.1 и CDX-2, приведены в процентах от общей популяции клеток.
Как показано на фиг. 2A, во всех экспериментальных популяциях в конце стадии 4, день 4, приблизительно 92%±4% клеток в популяции экспрессировали PDX 1. При этом обработка PDBu (активатор протеинкиназы C) вызвала значительное увеличение доли клеток, экспрессирующих NKX6.1, в популяции, экспрессирующей PDX1 (фиг. 2A), по сравнению с популяциями клеток, обработанных либо основной средой (обработка 1), либо ингибитором ALK5 II в присутствии Ноггина (обработка 2). В группе, обработанной PDBu, 88%±4,2% от всей популяции экспрессировали NKX6.1, тогда как при обработке 2 NKX6.1 экспрессировали 62%±8% клеток, а при обработке 1 NKX6.1 экспрессировали 46,7%±0,2% клеток. Большинство экспрессирующих NKX6.1 клеток на стадии 4 также экспрессировали PDX1. Эти наблюдения подтверждаются наложением изображений экспрессии PDX1 и NKX6.1, полученных для конкретной популяции клеток (фиг. 1A). Приведенные данные показывают, что обработка клеток средой с добавлением активатора протеинкиназы С увеличила процент клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, в популяции клеток, которые экспрессируют маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы.
В популяции клеток, прошедших обработку 1, 10% клеток экспрессировали CDX2 (маркер ткани кишечника) (фиг. 2A). В популяциях клеток, прошедших обработку 2 или 3, CDX2 экспрессировали менее 5% клеток. Во всех случаях большинство клеток, экспрессировавших CDX2, не экспрессировали одновременно PDX1 и NKX6.1.
Параллельные популяции клеток стадии 3 также обрабатывали следующими активаторами протеинкиназы С: форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) с концентрацией 20 нМ (Calbiochem № 524400) или [(2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламино)бензолактам] (TPB) с концентрацией 50 нМ (Calbiochem № 565740), которые были использованы вместо PDBu при указанной выше обработке 3. В конце стадии 4, день 4, 91% клеток в популяции, обрабатываемой PMA, и 90% клеток в популяции, обрабатываемой TPB, экспрессировали NKX6.1. Для общего количества клеток, экспрессировавших PDX1, при всех вариантах обработки значительных различий не наблюдали. См. фиг. 2B.
Приведенный пример показывает, что активаторы протеинкиназы C можно использовать при сравнительно низких концентрациях, чтобы стимулировать повышение экспрессии NKX6.1 и увеличить процент клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы.
Пример 2
Имплантация клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, мышам с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID-Bg)
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) чашках со средой RPMI + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A + 20 нг/мл WNT-3a в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI + 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем
c. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 50 нМ TPB в течение четырех дней (стадия 4).
Мышей линии SCID-Bg (С.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7) возрастом от пяти до шести недель приобрели в компании Taconic Farms. Мышей содержали в клетках-микроизоляторах со свободным доступом к стерилизованной пище и воде. В ходе подготовки к хирургической операции мыши были помечены нанесенной на ухо идентификационной меткой, у них была измерена масса тела, а также содержание глюкозы в крови с помощью ручного глюкометра (LifeScan, One Touch).
Мышей анестезировали смесью изофлурана и кислорода и на операционном поле выстригли шерсть малыми ножницами для животных. Перед операцией мышам подкожно ввели 0,1 мг/кг Buprenex. Операционное поле подготовили последовательным промыванием 70% раствором изопропилового спирта и 10% повидон-йодидом.
Находящиеся в конце четвертой стадии клетки механически собирали стеклянной пипеткой на 1 мл и далее переносили на не допускающие прикрепления планшеты и культивировали в течение ночи. В ходе предоперационной подготовки мышей клетки отцентрифугировали в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке, большую часть супернатанта удалили, оставив количество среды, достаточное лишь для отбора осажденных клеток. Клетки отобрали с помощью пипетки с объемным вытеснением Rainin Pos-D, после чего пипетку перевернули, чтобы клетки могли осесть под собственным весом. Излишки среды вытеснили, оставив компактный препарат клеток для трансплантации.
При трансплантации для проникновения в почечную капсулу использовали катетер для внутривенных введений 24G × 1,9 см (3/4 дюйма), после чего иглу извлекли. Затем катетер продвинули под почечной капсулой к дистальному краю почки. Наконечник пипетки Pos-D плотно вставили во втулку катетера и ввели 5 миллионов клеток через катетер под почечную капсулу, к дистальному краю почки. Почечную капсулу загерметизировали, используя низкотемпературное прижигание, после чего почку вернули в первоначальное анатомическое положение. Одновременно агрегаты по 5 миллионов клеток загрузили в устройство для имплантации на 50 мкл при помощи наконечника пипетки Post-D. Устройства на 50 мкл приобрели в компании TheraCyte, Inc (г. Ирвайн, штат Калифорния). Устройство после загрузки клеток герметизировали медицинским клейким силиконом типа А (Dow Corning, № по каталогу 129109) и имплантировали под кожу мышам линии SICD-Bg (животные №№ 3 и 4). Мышцы сшили непрерывным швом с помощью викриловой нити 5-0, а кожу стянули скобами для ран. После операции мышам подкожно ввели 1,0 мг/кг Metacam. Мышей вывели из наркоза и дали им возможность полностью восстановиться.
После трансплантации мышей взвешивали раз в неделю и дважды в неделю брали анализ крови для определения уровня глюкозы. На разных сроках после трансплантации мышам интраперитонеально ввели 3 г/кг глюкозы. Через 60 минут после введения глюкозы через ретроорбитальный синус отобрали кровь, поместив ее в микроцентрифужные пробирки, содержащие небольшое количество гепарина. Кровь центрифугировали, плазму собирали во вторую микроцентрифужную пробирку, замораживали на сухом льду и хранили при -80°C до проведения анализа на С-пептид человека. Уровни человеческого С-пептида измеряли с помощью комплекта Mercodia/ALPCO Diagnotics Ultrasensitive C-peptide ELISA (№ по каталогу 80-CPTHU-E01, Alpco Diagnostics, г. Нью-Гемпшир) в соответствии с инструкциями производителя.
С-пептид человека обнаруживали в сыворотке крови животных и в группе почечной капсулы, и в группе с имплантированным устройством Theracyte, уже через 4-6 недель после трансплантации, и его концентрация нарастала во времени (фиг. 3A и 3B). По истечении трех месяцев в ответ на введение глюкозы регистрировались значительное количество циркулирующего С-пептида человека как у 100% животных с почечной капсулой, так и в группе с имплантированным устройством Theracyte. Через три месяца уровень стимулированного глюкозой С-пептида человека в сыворотке в группе почечной капсулы составил 1,7±0,5 нг/мл (n=4), а концентрация человеческого С-пептида у мышей с имплантированным устройством Theracyte составила 1±0,5 нг/мл (n=2) (фиг. 3C).
Данный пример показывает, что популяция клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, которую получили под действием активаторов протеинкиназы С, способна к дальнейшему дифференцированию в инсулин-секретирующие клетки in vivo. Способность к дальнейшему дифференцированию в инсулин-секретирующие клетки не зависит от локального окружения. Авторы показали, что клетки, одновременно экспрессирующие PDX1 и NKX6.1, способны к дальнейшему дифференцированию в инсулин-секретирующие клетки как в почечной капсуле, так и в иммуннопротекторном устройстве при его подкожной имплантации.
Пример 3
Альтернативный способ формирования популяции клеток, составляющих предмет настоящего изобретения
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; № по кат. 356231) чашках со средой RPMI (Invitrogen, № по кат. 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по кат. 120-14) + 20 нг/мл WNT-3a (R&D Systems; № по кат. 1324-WN/CF) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI, дополненной 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем либо
c. обработка 4: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 20 нМ PDBu + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 4), или
d. обработка 5: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4), или
e. обработка 6: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF10 + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4).
Исследовали воздействие дополнительных факторов на опосредованное активатором протеинкиназы С увеличение процента клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1. Образцы культур отбирали в дублях на стадии 4, день 4, и анализ изображений проводили, как описано в примере 1 выше. Также регистрировали экспрессию ISL1 и NEUROD1.
В данном исследовании большинство клеток из популяции, экспрессирующей маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, демонстрировали положительную экспрессию PDX 1. Большинство клеток, экспрессирующих PDX1, также одновременно демонстрировали положительную экспрессию NKX6.1. Как показано в таблице 1, добавление одного только активатора PKC способствовало появлению клеток, экспрессирующих NKX6.1, в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы (обработка 4). На день 4 стадии 4 93% всей популяции были положительны по NKX6.1, и почти все клетки, экспрессирующие NKX6.1, демонстрировали положительную экспрессию PDX1.
Добавление ингибитора ALK5 II к среде, содержащей активатор протеинкиназы C (обработка 5), не оказывало никакого воздействия на наблюдаемое увеличение экспрессии NKX6.1. 57,1% клеток популяции экспрессировали NEUROD1, и 52,4% клеток популяции экспрессировали ISL1, что указывает на увеличение доли эндокринных клеток-предшественников в популяции после такой обработки. См. таблицу 1.
ПЦР-анализ взятых в этом примере образцов показал, что экспрессия PDX 1, NKX6.1 и PTF1 альфа возрастала в популяции клеток, прошедших обработку 4, по сравнению с клетками, прошедшими обработку 5. См. фиг. 4A-4D. С другой стороны, в клетках, получавших ингибитор ALK5 II и PDBu (обработка 5), наблюдали значительное увеличение экспрессии NGN3. См. фиг. 4A-4D.
Также исследовали эффект добавления FGF10 к среде, содержащей активатор протеинкиназы С (обработка 6). Добавление FGF10 в концентрации 50 нг/мл в сочетании с PDBu (обработка 6) привело к формированию популяции клеток, экспрессирующих маркер, характерный для линии панкреатической энтодермы, где 90% клеток в популяции экспрессируют NKX6.1, однако многие из экспрессирующих NKX6.1 клеток также демонстрировали положительную экспрессию CDX2. См. таблицу 1. Уровень мРНК для PDX1, NKX6.1 и PTF1 альфа не возрастал по сравнению с уровнем, наблюдаемым для клеток, обработанных PDBu и Ноггином. См. фиг. 4A-4D.
Данный пример показывает, что активатор протеинкиназы С в относительно низкой концентрации (примерно 20 нМ) в сочетании с ингибитором BMP можно использовать для формирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, при этом более 90% клеток одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
Таблица 1 | |||||
Доля общей популяции, % | |||||
PDX-1 | NKX6.1 | ISL-1 | CDX-2 | NeuroD1 | |
PDBu+NG (обработка 4) | 94,2 | 91,5 | 32,2 | 8,9 | 22,3 |
Alk5i+NG+PDBu (обработка 5) | 90,7 | 80,3 | 52,4 | 15 | 57,1 |
FGF10+PDBu (обработка 6) | 98,3 | 95 | 10,1 | 51,1 | 12,2 |
Пример 4
Альтернативный способ формирования популяции клеток, составляющих предмет настоящего изобретения
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; № по кат. 356231) чашках со средой RPMI (Invitrogen, № по кат. 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по кат. 120-14) + 20 нг/мл WNT-3a (R&D Systems; № по кат. 1324-WN/CF) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI, дополненной 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем либо
b. обработка 7 (T7): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), либо
c. обработка 8 (T8): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина + 50 нг/мл FGF7 в течение четырех дней (стадия 3), затем либо
d. обработка 9 (T9): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4), или
e. обработка 10 (T10): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF10 + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4), или
f. обработка 11 (T11): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 20 нМ PDBu + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 4).
Образцы культур отбирали в дублях на стадии 4, день 4, и получали их изображения с помощью анализатора IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания для каждой лунки снимали по 100 проекций. Для каждой лунки с использованием программного обеспечения IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare) измеряли общее количество клеток, общее количество клеток, экспрессирующих PDX1, общее количество клеток, экспрессирующих NKX6.1, и общее количество клеток, экспрессирующих CDX2. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общие количества клеток, экспрессирующих PDX 1, NKX6.1 и CDX-2, приведены в процентах от общей популяции клеток.
В популяциях клеток, обработанных T7 с последующим добавлением среды T9, приблизительно 80% клеток в популяции экспрессировали NKX6.1. См. таблицу 2. В популяциях клеток, обработанных T7 с последующим добавлением среды T10, приблизительно 90% клеток экспрессировали NKX6.1, при этом в данном варианте обработки отмечали больше клеток, экспрессирующих CDX2. См. таблицу 2. Обработка популяций клеток T7 с последующей обработкой средой T11 приводила к популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 93% клеток в популяции экспрессировали NKX6.1. Большинство клеток популяций, экспрессирующих NKX6.1, также экспрессировали PDX1.
Культуры, обработанные T8 с последующей обработкой средой T9, формировали популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 56,7% клеток популяции экспрессировали NKX6.1. См. таблицу 2. Культуры, обработанные T8 с последующей обработкой средой T10, формировали популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 63,5% клеток популяции экспрессировали NKX6.1, после обработки отмечалось возрастание числа клеток, экспрессирующих CDX2. См. таблицу 2. Культуры, обработанные T8 с последующей обработкой средой Т11, формировали популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 74% клеток популяции экспрессировали NKX6.1. См. таблицу 2. Большинство экспрессирующих NKX6.1 клеток также экспрессировали PDX 1.
ПЦР-анализ также подтвердил результаты, полученные на анализаторе IN Cell, в том что обработка ретиноевой кислотой, циклопамином и Ноггином на стадии 3 с последующим добавлением активатора PKC на стадии 4 на день 4 стадии 4 приводила к повышению уровней мРНК для NKX6.1 и PTF1 альфа (фиг. 5A-5D).
Таблица 2 | ||||||
Обработка 7 (RA+Ноггин+циклопамин) | Обработка 8 (RA+Ноггин+циклопамин+FGF7) | |||||
PDX-1 | NKX6.1 | CDX2 | PDX-1 | NKX6.1 | CDX2 | |
Обработка 9 | 95,6 | 80,5 | 3,1 | 93,6 | 56,7 | 3,2 |
Обработка 10 | 98,3 | 90,1 | 32 | 92,8 | 63,5 | 12 |
Обработка 11 | 96,6 | 93,1 | 12,9 | 94,2 | 74,6 | 5,5 |
Все цитируемые в настоящем документе публикации полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Хотя различные аспекты настоящего изобретения проиллюстрированы выше путем ссылки на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что сущность настоящего изобретения ограничивается не указанным выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.
Claims (6)
1. Изолированная популяция клеток человека, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где указанная изолированная популяция клеток человека получена путем культивирования линии эмбриональных стволовых клеток человека, выбранной из группы, включающей H1 (код NIH: WA01), Н7 (код NIH: WA07) и Н9 (код NIH: WA09) (WiCell Research Institute (WiCell)) в среде, дополненной активатором протеинкиназы С, причем более 60% клеток в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1, и где клетки в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, экспрессируют CDX2.
2. Популяция клеток по п. 1, в которой более 70% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
3. Популяция клеток по п. 1, в которой более 80% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
4. Популяция клеток по п. 1, в которой более 90% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
5. Выделенная популяция клеток по п. 1, в которой клетки в популяции клеток экспрессируют ISLS1 и/или NEUORD1.
6. Выделенная популяция клеток по п. 1, в которой активатор протеинкиназы С выбран из группы, состоящей из (2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама (ТРВ), форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА) и форбол-12,13-дибутирата (PDBu).
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33383110P | 2010-05-12 | 2010-05-12 | |
US61/333,831 | 2010-05-12 | ||
PCT/US2011/036043 WO2011143299A2 (en) | 2010-05-12 | 2011-05-11 | Differentiation of human embryonic stem cells |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016118225A Division RU2663339C1 (ru) | 2010-05-12 | 2011-05-11 | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012153676A RU2012153676A (ru) | 2014-06-20 |
RU2587634C2 true RU2587634C2 (ru) | 2016-06-20 |
Family
ID=44912123
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016118225A RU2663339C1 (ru) | 2010-05-12 | 2011-05-11 | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека |
RU2012153676/10A RU2587634C2 (ru) | 2010-05-12 | 2011-05-11 | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016118225A RU2663339C1 (ru) | 2010-05-12 | 2011-05-11 | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9752125B2 (ru) |
EP (2) | EP2569419B1 (ru) |
JP (4) | JP6050225B2 (ru) |
KR (2) | KR101903562B1 (ru) |
CN (2) | CN107338217B (ru) |
AR (1) | AR081040A1 (ru) |
AU (1) | AU2011250912A1 (ru) |
BR (1) | BR112012028855A2 (ru) |
CA (1) | CA2800610C (ru) |
DK (1) | DK2569419T3 (ru) |
ES (1) | ES2728900T3 (ru) |
MX (1) | MX351515B (ru) |
PH (1) | PH12018500672A1 (ru) |
RU (2) | RU2663339C1 (ru) |
SG (2) | SG185511A1 (ru) |
WO (1) | WO2011143299A2 (ru) |
ZA (1) | ZA201209383B (ru) |
Families Citing this family (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
EP2185693B1 (en) | 2007-07-31 | 2019-07-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US9062290B2 (en) | 2007-11-27 | 2015-06-23 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
MX2010009251A (es) | 2008-02-21 | 2010-11-25 | Centocor Ortho Biotech Inc | Metodos, placas de superficie modificada y composiciones para la fijacion, el cultivo y el desprendimiento celular. |
ES2697798T3 (es) | 2008-06-30 | 2019-01-28 | Janssen Biotech Inc | Diferenciación de células madre pluripotentes |
CA2742268C (en) | 2008-10-31 | 2020-02-18 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
CN102333862B (zh) | 2008-10-31 | 2018-04-27 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化 |
JP2012508584A (ja) | 2008-11-14 | 2012-04-12 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | ヒト多能性幹細胞由来膵臓細胞のカプセル化 |
CA2744227C (en) | 2008-11-20 | 2018-10-02 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates |
AU2009316580B2 (en) | 2008-11-20 | 2016-04-14 | Janssen Biotech, Inc. | Pluripotent stem cell culture on micro-carriers |
KR20170118969A (ko) | 2009-07-20 | 2017-10-25 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
WO2011079017A2 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
SG10201501503VA (en) | 2010-03-01 | 2015-04-29 | Janssen Biotech Inc | Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells |
RU2663339C1 (ru) | 2010-05-12 | 2018-08-03 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека |
EP2611910B1 (en) | 2010-08-31 | 2018-01-17 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
EP3372672A1 (en) | 2010-08-31 | 2018-09-12 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
CN108220224A (zh) | 2011-06-21 | 2018-06-29 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 自多潜能干细胞有效诱导定形内胚层 |
JP6441080B2 (ja) * | 2011-12-22 | 2018-12-19 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化 |
CA2866590A1 (en) | 2012-03-07 | 2013-09-12 | Janssen Biotech, Inc. | Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells |
EP2859091B1 (en) | 2012-06-08 | 2018-08-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells |
WO2014004341A1 (en) * | 2012-06-26 | 2014-01-03 | Seraxis, Inc. | Stem cells and pancreatic cells useful for the treatment of insulin-dependent diabetes mellitus |
JP6470687B2 (ja) | 2012-09-03 | 2019-02-13 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製 |
GB201216796D0 (en) * | 2012-09-20 | 2012-11-07 | Cambridge Entpr Ltd | In vitro pancreatic differentiation |
RU2684215C2 (ru) * | 2012-12-31 | 2019-04-04 | Янссен Байотек, Инк. | Способ получения панкреатических эндокринных клеток (варианты) и способ увеличения выхода бета-клеток |
WO2014105543A1 (en) * | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Janssen Biotech, Inc. | Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells |
US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
MX2015008619A (es) | 2012-12-31 | 2016-01-12 | Janssen Biotech Inc | Suspension y agrupamiento de celulas humanas pluripotentes para la diferenciacion a celulas endocrinas pancreaticas. |
DE202014011287U1 (de) | 2013-06-11 | 2019-02-06 | The President And Fellows Of Harvard College | SC-ß Zellen und Zusammensetzungen zur Erzeugung der Zellen |
EP2896688A1 (en) * | 2014-01-20 | 2015-07-22 | Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | A method of producing beta pancreatic cells from progenitor cells through the use of hydrogen peroxide |
JP6588969B2 (ja) | 2014-05-16 | 2019-10-09 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 膵内分泌細胞内のmafa発現を強化するための小分子の使用 |
WO2016038038A1 (en) * | 2014-09-08 | 2016-03-17 | Fundacion Publica Andaluza Progreso Y Salud | Method for obtaining pancreatic beta cell surrogates by increasing pancreatic and duodenal homeobox 1 (pdx-1) expression |
US20160175363A1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof |
EP3234110B1 (en) | 2014-12-18 | 2024-02-28 | President and Fellows of Harvard College | METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED ß CELLS AND USES THEREOF |
WO2016100898A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | President And Fellows Of Harvard College | Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof |
CN107614678B (zh) | 2014-12-18 | 2021-04-30 | 哈佛学院校长同事会 | 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法 |
US10392598B2 (en) | 2015-06-19 | 2019-08-27 | Emory University | Methods of measuring cell purity for making quality control determinations and related compositions |
CN108699515A (zh) | 2016-02-24 | 2018-10-23 | 诺和诺德股份有限公司 | 由人多能干细胞衍生的内分泌祖细胞生成功能性β细胞 |
MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
US20190390169A1 (en) * | 2017-03-03 | 2019-12-26 | Kyoto University | Pancreatic progenitor cell production method |
AU2018370029A1 (en) * | 2017-11-15 | 2020-07-02 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Islet cell manufacturing compositions and methods of use |
WO2020033879A1 (en) | 2018-08-10 | 2020-02-13 | Semma Therapeutics, Inc. | Stem cell derived islet differentiation |
EP3976237A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates Inc. | Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances |
EP3975926A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
EP3976236A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-04-06 | W.L. Gore & Associates Inc. | A biocompatible membrane composite |
WO2020243665A1 (en) | 2019-05-31 | 2020-12-03 | W. L. Gore & Associates, Inc. | A biocompatible membrane composite |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2009123458A (ru) * | 2006-11-20 | 2010-12-27 | Октагене Гмбх (De) | Генетическая абляция клеток, несущих ген prp, с использованием стратегии направленной промоторной ловушки для получения бессывороточных рекомбинантных белков в качестве терапевтических препаратов |
Family Cites Families (241)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US709392A (en) | 1902-05-06 | 1902-09-16 | Haydn Brown | Suture-clamp. |
US2232142A (en) | 1940-09-27 | 1941-02-18 | Schumann Seymour | Wound clip |
US2814296A (en) | 1954-04-15 | 1957-11-26 | S & R J Everett & Co Ltd | Surgical needles |
US3209652A (en) | 1961-03-30 | 1965-10-05 | Burgsmueller Karl | Thread whirling method |
AT326803B (de) | 1968-08-26 | 1975-12-29 | Binder Fa G | Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben |
US3935067A (en) | 1974-11-22 | 1976-01-27 | Wyo-Ben Products, Inc. | Inorganic support for culture media |
CA1201400A (en) | 1982-04-16 | 1986-03-04 | Joel L. Williams | Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture |
US4499802A (en) | 1982-09-29 | 1985-02-19 | Container Graphics Corporation | Rotary cutting die with scrap ejection |
US4537773A (en) | 1983-12-05 | 1985-08-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | α-Aminoboronic acid derivatives |
US4557264A (en) | 1984-04-09 | 1985-12-10 | Ethicon Inc. | Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene |
US5215893A (en) | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US5089396A (en) | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5863531A (en) | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
CA1340581C (en) | 1986-11-20 | 1999-06-08 | Joseph P. Vacanti | Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices |
US5759830A (en) | 1986-11-20 | 1998-06-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo |
US5567612A (en) | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
US4898156A (en) | 1987-05-18 | 1990-02-06 | Mitek Surgical Products, Inc. | Suture anchor |
NZ229354A (en) | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
EP0363125A3 (en) | 1988-10-03 | 1990-08-16 | Hana Biologics Inc. | Proliferated pancreatic endocrine cell product and process |
US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
KR100249937B1 (ko) | 1991-04-25 | 2000-04-01 | 나가야마 오사무 | 인간 인터루킨-6 수용체에 대한 재구성 인간 항체 |
US5449383A (en) | 1992-03-18 | 1995-09-12 | Chatelier; Ronald C. | Cell growth substrates |
GB9206861D0 (en) | 1992-03-28 | 1992-05-13 | Univ Manchester | Wound healing and treatment of fibrotic disorders |
CA2114282A1 (en) | 1993-01-28 | 1994-07-29 | Lothar Schilder | Multi-layered implant |
JP3525221B2 (ja) | 1993-02-17 | 2004-05-10 | 味の素株式会社 | 免疫抑制剤 |
US5341922A (en) | 1993-02-24 | 1994-08-30 | Ethicon, Inc. | Peelable foil suture packaging |
WO1994023572A1 (en) | 1993-04-08 | 1994-10-27 | Human Cell Cultures, Inc. | Cell culturing method and medium |
US5523226A (en) | 1993-05-14 | 1996-06-04 | Biotechnology Research And Development Corp. | Transgenic swine compositions and methods |
GB9310557D0 (en) | 1993-05-21 | 1993-07-07 | Smithkline Beecham Plc | Novel process and apparatus |
TW257671B (ru) | 1993-11-19 | 1995-09-21 | Ciba Geigy | |
US6703017B1 (en) | 1994-04-28 | 2004-03-09 | Ixion Biotechnology, Inc. | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6001647A (en) | 1994-04-28 | 1999-12-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof |
US5834308A (en) | 1994-04-28 | 1998-11-10 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | In vitro growth of functional islets of Langerhans |
US6083903A (en) | 1994-10-28 | 2000-07-04 | Leukosite, Inc. | Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses |
WO1996020728A1 (fr) | 1994-12-29 | 1996-07-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Potentialisateur d'agent antitumoral comprenant un antagoniste de l'interleukine 6 |
US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
US5718922A (en) | 1995-05-31 | 1998-02-17 | Schepens Eye Research Institute, Inc. | Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation |
US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
KR100568438B1 (ko) | 1997-04-24 | 2006-04-07 | 오르토-맥네일 파마슈티칼, 인코퍼레이티드 | 염증성 질환의 치료에 유용한 치환된 이미다졸, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 |
AU8476698A (en) | 1997-07-03 | 1999-01-25 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human mesenchymal stem cells from peripheral blood |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
EP1538206B1 (en) | 1997-09-16 | 2010-03-24 | Centocor, Inc. | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
AU1197699A (en) | 1997-10-23 | 1999-05-10 | Geron Corporation | Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells |
US6372779B1 (en) | 1997-12-29 | 2002-04-16 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Anti-inflammatory compounds |
ATE316795T1 (de) | 1998-03-18 | 2006-02-15 | Osiris Therapeutics Inc | Mesenchymale stammzellen für die prävention und behandlung von immunantworten bei transplantationen |
MY132496A (en) | 1998-05-11 | 2007-10-31 | Vertex Pharma | Inhibitors of p38 |
US6413773B1 (en) | 1998-06-01 | 2002-07-02 | The Regents Of The University Of California | Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation |
US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
US7410798B2 (en) | 2001-01-10 | 2008-08-12 | Geron Corporation | Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells |
US6610540B1 (en) | 1998-11-18 | 2003-08-26 | California Institute Of Technology | Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells |
US6413556B1 (en) | 1999-01-08 | 2002-07-02 | Sky High, Llc | Aqueous anti-apoptotic compositions |
CA2359159A1 (en) | 1999-01-21 | 2000-07-27 | Vitro Diagnostics, Inc. | Immortalized cell lines and methods of making the same |
US6815203B1 (en) | 1999-06-23 | 2004-11-09 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods of making pancreatic islet cells |
US6306424B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-10-23 | Ethicon, Inc. | Foam composite for the repair or regeneration of tissue |
US6333029B1 (en) | 1999-06-30 | 2001-12-25 | Ethicon, Inc. | Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue |
WO2001023528A1 (en) | 1999-09-27 | 2001-04-05 | University Of Florida Research Foundation | Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures |
US6685936B2 (en) | 1999-10-12 | 2004-02-03 | Osiris Therapeutics, Inc. | Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation |
US20030082155A1 (en) | 1999-12-06 | 2003-05-01 | Habener Joel F. | Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus |
US6753153B2 (en) | 1999-12-13 | 2004-06-22 | The Scripps Research Institute | Markers for identification and isolation of pancreatic islet α and β progenitors |
US7439064B2 (en) | 2000-03-09 | 2008-10-21 | Wicell Research Institute, Inc. | Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium |
US7005252B1 (en) | 2000-03-09 | 2006-02-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Serum free cultivation of primate embryonic stem cells |
US6436704B1 (en) | 2000-04-10 | 2002-08-20 | Raven Biotechnologies, Inc. | Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof |
US6458589B1 (en) | 2000-04-27 | 2002-10-01 | Geron Corporation | Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells |
CN1449439A (zh) | 2000-06-26 | 2003-10-15 | 株式会社雷诺再生医学研究所 | 细胞级分包括能分化为神经细胞的细胞 |
KR100850812B1 (ko) | 2000-10-23 | 2008-08-06 | 스미스클라인 비참 코포레이션 | 신규 화합물 |
DK1362047T3 (da) | 2000-12-08 | 2006-09-04 | Ortho Mcneil Pharm Inc | Indazolylsubstituerede pyrrolinforbindelser som kinaseinhibitorer |
JP2004526676A (ja) | 2000-12-08 | 2004-09-02 | オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド | キナーゼ阻害剤として有用な大員複素環式化合物 |
US6599323B2 (en) | 2000-12-21 | 2003-07-29 | Ethicon, Inc. | Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use |
JP2005503759A (ja) | 2001-01-24 | 2005-02-10 | アメリカ合衆国 | 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法 |
DK1355910T3 (da) | 2001-01-25 | 2011-06-27 | Us Of America Represented By The Secretary Dept Of Health And Human Services | Formulering af borsyreforbindelser |
US6656488B2 (en) | 2001-04-11 | 2003-12-02 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering |
EP1379626A2 (en) | 2001-04-19 | 2004-01-14 | DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung | A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells |
JP4296781B2 (ja) | 2001-04-24 | 2009-07-15 | 味の素株式会社 | 幹細胞及びその分離方法 |
CA2447015A1 (en) | 2001-05-15 | 2002-11-21 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells |
US6626950B2 (en) | 2001-06-28 | 2003-09-30 | Ethicon, Inc. | Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue |
KR100418195B1 (ko) | 2001-07-05 | 2004-02-11 | 주식회사 우리기술 | 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법 |
GB0117583D0 (en) | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Astrazeneca Ab | Novel compounds |
WO2003014313A2 (en) | 2001-08-06 | 2003-02-20 | Bresagen, Ltd. | Alternative compositions and methods for the culture of stem cells |
US6617152B2 (en) | 2001-09-04 | 2003-09-09 | Corning Inc | Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate |
EP1298201A1 (en) | 2001-09-27 | 2003-04-02 | Cardion AG | Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state |
WO2003033697A1 (en) | 2001-10-18 | 2003-04-24 | Ixion Biotechnology, Inc. | Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells |
EP1442115B9 (en) | 2001-11-15 | 2009-12-16 | Children's Medical Center Corporation | Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof |
EP2264146A1 (en) | 2001-12-07 | 2010-12-22 | Geron Corporation | Islet cells from human embryonic stem cells |
KR20120003961A (ko) | 2001-12-07 | 2012-01-11 | 사이토리 테라퓨틱스, 인크. | 처리된 리포애스퍼레이트 세포로 환자를 치료하기 위한 시스템 및 방법 |
AU2002218893A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-09 | Thromb-X Nv | Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability |
JP2005512593A (ja) | 2001-12-28 | 2005-05-12 | セルアーティス アーベー | 多能性のヒト胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法 |
US20030162290A1 (en) | 2002-01-25 | 2003-08-28 | Kazutomo Inoue | Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells |
JPWO2003087349A1 (ja) | 2002-04-17 | 2005-08-18 | 大塚製薬株式会社 | 間葉系細胞から膵β細胞を形成する方法 |
US20040161419A1 (en) | 2002-04-19 | 2004-08-19 | Strom Stephen C. | Placental stem cells and uses thereof |
DE60319364T2 (de) | 2002-05-08 | 2009-02-19 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Substituierte pyrroline als kinase inhibitoren |
US20060003446A1 (en) | 2002-05-17 | 2006-01-05 | Gordon Keller | Mesoderm and definitive endoderm cell populations |
JP2006512046A (ja) | 2002-05-28 | 2006-04-13 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | invitroにおけるヒト膵臓腺房細胞の増殖およびインスリン産生細胞への分化転換のための方法 |
BR0311821A (pt) | 2002-06-05 | 2005-04-05 | Janssen Pharmaceutica Nv | Derivados de bisindolil-maleimid como inibidores de cinase |
GB0212976D0 (en) | 2002-06-06 | 2002-07-17 | Tonejet Corp Pty Ltd | Ejection method and apparatus |
CN1171991C (zh) | 2002-07-08 | 2004-10-20 | 徐如祥 | 人神经干细胞的培养方法 |
US6877147B2 (en) | 2002-07-22 | 2005-04-05 | Broadcom Corporation | Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison |
US7838290B2 (en) | 2002-07-25 | 2010-11-23 | The Scripps Research Institute | Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith |
EP1539930A4 (en) | 2002-07-29 | 2006-08-09 | Es Cell Int Pte Ltd | METHOD IN MULTIPLE STAGES OF DIFFERENTIATION OF POSITIVE INSULIN-SENSITIVE CELLS, GLUCOSE |
US20040063204A1 (en) | 2002-08-14 | 2004-04-01 | Lijun Yang | Bone marrow cell differentiation |
EP1539928A4 (en) | 2002-09-06 | 2006-09-06 | Amcyte Inc | POSIOTIVE PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS CD56 IN ADULT HUMAN BEINGS |
US9969977B2 (en) | 2002-09-20 | 2018-05-15 | Garnet Biotherapeutics | Cell populations which co-express CD49c and CD90 |
US20040062753A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-04-01 | Alireza Rezania | Composite scaffolds seeded with mammalian cells |
AU2003285172A1 (en) | 2002-11-08 | 2004-06-03 | The Johns Hopkins University | Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same |
US7144999B2 (en) | 2002-11-23 | 2006-12-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression |
EP1567639A4 (en) | 2002-12-05 | 2005-12-21 | Technion Res & Dev Foundation | CULTURE OF HUMAN PANCREATIC ISLANDS AND USES THEREOF |
JP4613069B2 (ja) | 2002-12-16 | 2011-01-12 | テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド | 支持細胞非含有、異種非含有のヒト胚性幹細胞の調製方法およびこれらを使用して調製された幹細胞培養物 |
KR101114808B1 (ko) | 2003-01-29 | 2012-02-15 | 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 | 피복 제제의 제조법 |
RU2359671C2 (ru) | 2003-01-29 | 2009-06-27 | Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед | Способ получения препарата с покрытием |
US20070154981A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Insulin-producing cells derived from stem cells |
US20070155661A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-07-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University | Methods and compositions for modulating the development of stem cells |
CA2520861A1 (en) | 2003-03-27 | 2004-10-14 | Ixion Biotechnology, Inc. | Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway |
WO2004090110A2 (en) | 2003-03-31 | 2004-10-21 | Bresagen Inc. | Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway |
US20090203141A1 (en) | 2003-05-15 | 2009-08-13 | Shi-Lung Lin | Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents |
EP1641914B1 (en) | 2003-06-27 | 2016-07-20 | DePuy Synthes Products, Inc. | Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making and using the same |
IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
ITRM20030395A1 (it) | 2003-08-12 | 2005-02-13 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero. |
US7569385B2 (en) | 2003-08-14 | 2009-08-04 | The Regents Of The University Of California | Multipotent amniotic fetal stem cells |
US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
AU2004269395A1 (en) | 2003-08-27 | 2005-03-10 | Stemcells California, Inc. | Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations |
US6939633B2 (en) | 2003-09-17 | 2005-09-06 | General Motors Corporation | Fuel cell shutdown and startup using a cathode recycle loop |
JP2007515433A (ja) | 2003-12-17 | 2007-06-14 | アラーガン インコーポレイテッド | Cyp26aおよびcyp26bの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法 |
US20060030042A1 (en) | 2003-12-19 | 2006-02-09 | Ali Brivanlou | Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime |
US7704738B2 (en) | 2003-12-23 | 2010-04-27 | Cythera, Inc. | Definitive endoderm |
US7625753B2 (en) | 2003-12-23 | 2009-12-01 | Cythera, Inc. | Expansion of definitive endoderm cells |
CN112813019A (zh) | 2003-12-23 | 2021-05-18 | 维亚希特公司 | 定形内胚层 |
US20050266554A1 (en) | 2004-04-27 | 2005-12-01 | D Amour Kevin A | PDX1 expressing endoderm |
TWI334443B (en) | 2003-12-31 | 2010-12-11 | Ind Tech Res Inst | Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells |
WO2005065354A2 (en) | 2003-12-31 | 2005-07-21 | The Burnham Institute | Defined media for pluripotent stem cell culture |
US7794704B2 (en) | 2004-01-23 | 2010-09-14 | Advanced Cell Technology, Inc. | Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration |
WO2005071066A1 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells |
GB2441530B (en) | 2004-02-12 | 2009-09-23 | Univ Newcastle | Stem Cells |
WO2005080598A1 (ja) | 2004-02-19 | 2005-09-01 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法 |
AU2005221095A1 (en) | 2004-03-09 | 2005-09-22 | John J. O'neil | Methods for generating insulin-producing cells |
CN1950498A (zh) | 2004-03-10 | 2007-04-18 | 加利福尼亚大学董事会 | 培养胚胎干细胞的组合物和方法 |
WO2005097980A2 (en) | 2004-03-26 | 2005-10-20 | Geron Corporation | New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells |
WO2005097977A2 (en) | 2004-04-01 | 2005-10-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage |
JP4926946B2 (ja) | 2004-04-27 | 2012-05-09 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | Pdx1発現性内胚葉 |
GB0410011D0 (en) * | 2004-05-05 | 2004-06-09 | Novartis Forschungsstiftung | Neural cell differentiation method |
JP5687816B2 (ja) | 2004-07-09 | 2015-03-25 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | 胚体内胚葉を分化させるための因子を同定する方法 |
JP5102030B2 (ja) | 2004-08-13 | 2012-12-19 | ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド | ヒト胚性幹細胞における自己再生および分化のための組成物および方法 |
US20080268533A1 (en) | 2004-08-25 | 2008-10-30 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods and Compositions Utilizing Myc and Gsk3Beta to Manipulate the Pluripotency of Embryonic Stem Cells |
DE102004043256B4 (de) | 2004-09-07 | 2013-09-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension |
MX2007002389A (es) | 2004-09-08 | 2009-02-12 | Wisconsin Alumni Res Found | Cultivo de celulas progenitoras embrionarias humanas. |
ES2383813T3 (es) | 2004-09-08 | 2012-06-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Método de cultivo y cultivo de células madre embrionarias |
AU2006210955A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
ES2627419T3 (es) | 2005-03-04 | 2017-07-28 | Lifescan, Inc. | Células estromales adultas derivadas del páncreas |
GB0505970D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof |
CA2602684C (en) | 2005-03-31 | 2014-07-22 | Stemnion, Inc. | Amnion-derived cell compositions, methods of making and uses thereof |
CN100425694C (zh) | 2005-04-15 | 2008-10-15 | 北京大学 | 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法 |
EP1876893B1 (en) | 2005-04-15 | 2012-04-11 | Geron Corporation | Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities |
EP1874367B1 (en) | 2005-04-26 | 2011-07-06 | Arhus Universitet | Biocompatible material for surgical implants and cell guiding tissue culture surfaces |
JP4557797B2 (ja) | 2005-05-20 | 2010-10-06 | 株式会社日立製作所 | 光ディスク装置 |
MX2007015610A (es) | 2005-06-10 | 2008-02-21 | Irm Llc | Compuestos que mantienen la fluripotencia de las celulas totipotentes embrionarias. |
WO2006138433A2 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | The Regents Of The University Of California | Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides |
EP1931764A1 (en) | 2005-06-21 | 2008-06-18 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | Method for cell culture |
AU2006262369B2 (en) | 2005-06-22 | 2012-07-05 | Asterias Biotherapeutics, Inc. | Suspension culture of human embryonic stem cells |
NZ564179A (en) | 2005-06-30 | 2010-09-30 | Janssen Pharmaceutica Nv | Cyclic anilino - pyridinotriazines as GSK-3 inhibitors |
US20080194021A1 (en) | 2005-07-29 | 2008-08-14 | Mays Robert W | Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells |
CA2616863A1 (en) | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Australian Stem Cell Centre Limited | Compositions and methods for growth of pluripotent cells |
WO2007025234A2 (en) | 2005-08-26 | 2007-03-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes |
KR20080056181A (ko) | 2005-09-02 | 2008-06-20 | 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 | 전구세포주의 유도 방법 |
GB2444686B (en) | 2005-09-12 | 2010-08-25 | Es Cell Int Pte Ltd | Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins |
CN101310012B (zh) | 2005-10-14 | 2012-05-09 | 明尼苏达大学董事会 | 非胚胎干细胞分化成具有胰腺表型的细胞 |
US20070122905A1 (en) | 2005-10-27 | 2007-05-31 | D Amour Kevin A | PDX1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm |
EP2206724A1 (en) | 2005-12-13 | 2010-07-14 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
WO2007082963A1 (es) | 2006-01-18 | 2007-07-26 | Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad | Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas |
EP1994141B1 (en) | 2006-02-23 | 2017-11-15 | ViaCyte, Inc. | Compositions and methods useful for culturing differentiable cells |
US7695965B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-04-13 | Cythera, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
WO2007103282A2 (en) | 2006-03-02 | 2007-09-13 | Cythera, Inc. | Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production |
US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
CA2650812C (en) | 2006-04-28 | 2017-12-12 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
US8685730B2 (en) | 2006-05-02 | 2014-04-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage |
US20070259423A1 (en) | 2006-05-02 | 2007-11-08 | Jon Odorico | Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage |
WO2007139929A2 (en) | 2006-05-25 | 2007-12-06 | The Burnham Institute For Medical Research | Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells |
AU2007254766A1 (en) | 2006-06-02 | 2007-12-13 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems |
CN101541953A (zh) | 2006-06-02 | 2009-09-23 | 佐治亚大学研究基金会 | 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织 |
US8415153B2 (en) | 2006-06-19 | 2013-04-09 | Geron Corporation | Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells |
CN100494359C (zh) | 2006-06-23 | 2009-06-03 | 中日友好医院 | 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法 |
EP2046946B8 (en) | 2006-06-26 | 2017-01-25 | Lifescan, Inc. | Pluripotent stem cell culture |
US20080003676A1 (en) | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Millipore Corporation | Growth of embryonic stem cells |
US8968994B2 (en) | 2006-07-06 | 2015-03-03 | Jeremy Micah Crook | Method for stem cell culture and cells derived therefrom |
AU2007277364B2 (en) | 2006-07-26 | 2010-08-12 | Viacyte, Inc. | Methods of producing pancreatic hormones |
KR101331510B1 (ko) | 2006-08-30 | 2013-11-20 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴 |
JP2008099662A (ja) | 2006-09-22 | 2008-05-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 幹細胞の培養方法 |
US20080091234A1 (en) | 2006-09-26 | 2008-04-17 | Kladakis Stephanie M | Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth |
US20100323442A1 (en) | 2006-10-17 | 2010-12-23 | Emmanuel Edward Baetge | Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells |
MX2009004096A (es) | 2006-10-17 | 2009-06-16 | Stiefel Laboratories | Metabolitos de talarozol. |
CA2666789C (en) | 2006-10-18 | 2016-11-22 | Yong Zhao | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
US20110151554A1 (en) | 2006-11-09 | 2011-06-23 | Akira Yuo | Method for culturing and subculturing primate embryonic stem cell, as well as method for inducing differentiation thereof |
TW200836749A (en) | 2007-01-09 | 2008-09-16 | Vioquest Pharmaceuticals Inc | Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof |
CN103627671A (zh) | 2007-01-30 | 2014-03-12 | 佐治亚大学研究基金会 | 产生中内胚层细胞及多能游走细胞的方法与细胞群及用途 |
GB0703188D0 (en) | 2007-02-19 | 2007-03-28 | Roger Land Building | Large scale production of stem cells |
US7688908B2 (en) | 2007-03-12 | 2010-03-30 | Samsung Electronics Co., Ltd. | System and method for processing wireless high definition video data using a shortened last codeword |
US20090053182A1 (en) | 2007-05-25 | 2009-02-26 | Medistem Laboratories, Inc. | Endometrial stem cells and methods of making and using same |
EP3957716A1 (en) | 2007-07-18 | 2022-02-23 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
EP2185693B1 (en) | 2007-07-31 | 2019-07-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
EP2185691B1 (en) | 2007-07-31 | 2018-03-14 | Lifescan, Inc. | Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells |
KR101544498B1 (ko) | 2007-08-24 | 2015-08-17 | 스티칭 허트 네덜란드 칸커 인스티튜트 | 종양성 질환의 치료를 위한 조성물 |
US20110151447A1 (en) | 2007-11-06 | 2011-06-23 | Children's Medical Center Corporation | Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells |
US9062290B2 (en) | 2007-11-27 | 2015-06-23 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
SG154367A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-08-28 | Es Cell Int Pte Ltd | Method of differentiating stem cells |
WO2009096049A1 (ja) | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Kyoto University | 人工多能性幹細胞由来分化細胞 |
EP2250252A2 (en) | 2008-02-11 | 2010-11-17 | Cambridge Enterprise Limited | Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained |
MX2010009251A (es) | 2008-02-21 | 2010-11-25 | Centocor Ortho Biotech Inc | Metodos, placas de superficie modificada y composiciones para la fijacion, el cultivo y el desprendimiento celular. |
JPWO2009110215A1 (ja) | 2008-03-03 | 2011-07-14 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 繊毛細胞の分化誘導方法 |
EP2479260B1 (en) | 2008-03-17 | 2016-01-06 | Agency For Science, Technology And Research | Microcarriers for stem cell culture |
DK2283117T3 (da) | 2008-04-21 | 2014-01-20 | Viacyte Inc | Fremgangsmåde til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller |
US8338170B2 (en) * | 2008-04-21 | 2012-12-25 | Viacyte, Inc. | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
WO2009132083A2 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells |
US7939322B2 (en) | 2008-04-24 | 2011-05-10 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm |
US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
WO2009154606A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-23 | Cythera, Inc. | Growth factors for production of definitive endoderm |
US20090298178A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-03 | D Amour Kevin Allen | Growth factors for production of definitive endoderm |
DE102008032236A1 (de) | 2008-06-30 | 2010-04-01 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen | Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential |
ES2697798T3 (es) | 2008-06-30 | 2019-01-28 | Janssen Biotech Inc | Diferenciación de células madre pluripotentes |
US20100028307A1 (en) | 2008-07-31 | 2010-02-04 | O'neil John J | Pluripotent stem cell differentiation |
CN102333862B (zh) | 2008-10-31 | 2018-04-27 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化 |
CA2742268C (en) | 2008-10-31 | 2020-02-18 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
CA2742583C (en) | 2008-11-04 | 2022-09-27 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof |
US8008075B2 (en) | 2008-11-04 | 2011-08-30 | Viacyte, Inc. | Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof |
JP2012508584A (ja) | 2008-11-14 | 2012-04-12 | ヴィアサイト,インコーポレイテッド | ヒト多能性幹細胞由来膵臓細胞のカプセル化 |
AU2009316580B2 (en) | 2008-11-20 | 2016-04-14 | Janssen Biotech, Inc. | Pluripotent stem cell culture on micro-carriers |
WO2010063848A1 (en) | 2008-12-05 | 2010-06-10 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells |
US8507274B2 (en) * | 2009-02-06 | 2013-08-13 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for promoting the generation of definitive endoderm |
KR20170118969A (ko) | 2009-07-20 | 2017-10-25 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
GB2485113B (en) | 2009-07-20 | 2016-12-28 | Janssen Biotech Inc | Differentiation of human embryonic stem cells into cells of the pancreatic endoderm lineage |
FI20096288A0 (fi) | 2009-12-04 | 2009-12-04 | Kristiina Rajala | Formulations and methods for culturing stem cells |
WO2011079017A2 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
SG10201501513TA (en) | 2010-03-02 | 2015-04-29 | Univ Singapore | Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response |
JP5909482B2 (ja) | 2010-03-31 | 2016-04-26 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 細胞の再プログラム |
JP2013524836A (ja) | 2010-04-25 | 2013-06-20 | マウント・シナイ・スクール・オブ・メディスン | 多能性細胞からの前部前腸内胚葉の生成 |
RU2663339C1 (ru) | 2010-05-12 | 2018-08-03 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека |
KR101829488B1 (ko) | 2010-08-05 | 2018-02-14 | 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 | 인간 다분화능 세포 배양을 위한 단순화된 기본 배지 |
BR112013004614A2 (pt) | 2010-08-31 | 2024-01-16 | Janssen Biotech Inc | Diferenciação de células-tronco pluripotentes |
MY177150A (en) | 2011-02-28 | 2020-09-08 | Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd | Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof |
US20130274184A1 (en) | 2011-10-11 | 2013-10-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Er stress relievers in beta cell protection |
JP6441080B2 (ja) | 2011-12-22 | 2018-12-19 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化 |
US10519422B2 (en) | 2012-02-29 | 2019-12-31 | Riken | Method of producing human retinal pigment epithelial cells |
EP2859091B1 (en) | 2012-06-08 | 2018-08-29 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells |
AU2014239954B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-07-16 | The Jackson Laboratory | Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof |
-
2011
- 2011-05-11 RU RU2016118225A patent/RU2663339C1/ru active
- 2011-05-11 CN CN201710695469.5A patent/CN107338217B/zh active Active
- 2011-05-11 JP JP2013510273A patent/JP6050225B2/ja active Active
- 2011-05-11 AU AU2011250912A patent/AU2011250912A1/en not_active Abandoned
- 2011-05-11 RU RU2012153676/10A patent/RU2587634C2/ru active
- 2011-05-11 KR KR1020127031872A patent/KR101903562B1/ko active IP Right Grant
- 2011-05-11 CA CA2800610A patent/CA2800610C/en active Active
- 2011-05-11 WO PCT/US2011/036043 patent/WO2011143299A2/en active Application Filing
- 2011-05-11 BR BR112012028855A patent/BR112012028855A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-05-11 DK DK11781200.8T patent/DK2569419T3/da active
- 2011-05-11 CN CN201180023585.3A patent/CN102884176B/zh active Active
- 2011-05-11 EP EP11781200.8A patent/EP2569419B1/en active Active
- 2011-05-11 ES ES11781200T patent/ES2728900T3/es active Active
- 2011-05-11 MX MX2012013156A patent/MX351515B/es active IP Right Grant
- 2011-05-11 SG SG2012082855A patent/SG185511A1/en unknown
- 2011-05-11 SG SG10201503652WA patent/SG10201503652WA/en unknown
- 2011-05-11 EP EP19155795.8A patent/EP3498825A1/en active Pending
- 2011-05-11 KR KR1020187027613A patent/KR101986176B1/ko active IP Right Grant
- 2011-05-11 US US13/105,285 patent/US9752125B2/en active Active
- 2011-05-12 AR ARP110101645A patent/AR081040A1/es unknown
-
2012
- 2012-12-11 ZA ZA2012/09383A patent/ZA201209383B/en unknown
-
2016
- 2016-07-29 JP JP2016149481A patent/JP6469047B2/ja active Active
-
2017
- 2017-08-04 US US15/669,461 patent/US20170327793A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-03-26 PH PH12018500672A patent/PH12018500672A1/en unknown
-
2019
- 2019-01-15 JP JP2019004483A patent/JP7149190B2/ja active Active
-
2022
- 2022-07-06 JP JP2022109280A patent/JP2022133411A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2009123458A (ru) * | 2006-11-20 | 2010-12-27 | Октагене Гмбх (De) | Генетическая абляция клеток, несущих ген prp, с использованием стратегии направленной промоторной ловушки для получения бессывороточных рекомбинантных белков в качестве терапевтических препаратов |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Nelson SB1, Schaffer AE, Sander M., The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells, Development. 2007 Jul;134(13):2491-500. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2587634C2 (ru) | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека | |
AU2016202260B2 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
RU2599420C2 (ru) | Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток | |
RU2627168C2 (ru) | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека | |
RU2579278C2 (ru) | Популяция панкреатических эндокринных клеток-предшественников для снижения концентрации глюкозы в крови и способ дифференцировки панкреатических эндодермальных клеток | |
EP2456858B1 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
KR20120037986A (ko) | 인간 배아 줄기 세포의 분화 | |
RU2805433C1 (ru) | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека | |
RU2782271C2 (ru) | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека | |
AU2018202016B2 (en) | Differentiation of human embryonic stem cells | |
US20230151332A1 (en) | Methods for making insulin in vivo |