RU2115122C1 - Одноразовый реактор для твердофазного иммуноанализа и способ твердофазного иммуноанализа - Google Patents

Abstract

Одноразовый реактор предназначен для иммуноанализа в твердой фазе биологических объектов. Реактор содержит проточный корпус. Корпус заполнен носителем с активной или активированной поверхностью. На поверхность носителя нанесен иммунологический реагент. Объем носителя составляет до 600 мкл. При иммунологическом анализе исследуемый раствор пропускают через реактор. Иммунологический реагент взаимодействует с анализируемым веществом. Затем анализируемое вещество определяют. Использование изобретения позволяет ускорить и упростить процедуру анализа. 30 з.п. ф-лы, 2 ил.

Description

Изобретение относится к твердофазному иммуноанализу биологических объектов и может быть использовано при хроматографическом анализе биологических молекул, а также их очистке хроматографическими методами.

Метод хроматографии при очистке и анализе биологических молекул основан на специфическом взаимодействии выделяемой молекулы с дополняющим ее партнером по связи. Для практического выполнения таких методов, как правило, пробу, содержащую очищаемую биомолекулу, помещают в хроматографическую колонку, где на твердом носителе содержится в связанном виде один из дополняющих ее партнеров по связи. Такой парой дополняющих партнеров служат, например, ферменты и их подложки, антитело и гаптен или антиген, а также отдельные ветви ДНК или РНК.

При иммунологической хроматографии по сродству для определения используется взаимодействие между антигеном или гаптеном и соответствующим антителом.

До настоящего времени при иммунном анализе с применением хроматографии по сродству применяли, в основном, многоразовые колонки, заполненные антителом или антигеном (в дальнейшем называемые лигандами), связанными с твердым носителем. Для непрерывного проведения хроматографического процесса анализируемую пробу продавливают под высоким давлением через хроматографическую колонку (Elvis W.U., Wilson G.S. "Analytical Chemistry", 1985, vol.57, 2754- 2756, Sportsman J.R. et al. "Analitical Chemistry", 1983, vol.55, 771- 775).

Применение этого метода для проведения иммунного анализа обладает рядом недостатков. Так, например, эта технология требует, с одной стороны, использования дорогой аппаратуры, а с другой стороны, предъявляет высокие технологические требования к хроматографическим колонкам. Они должны выдерживать высокое давление, развиваемое при такой технологии, и обладать способностью к повторному использованию для оптимизации работы по этой методике. Повторное использование колонок требует, дополнительных мер при анализе новой пробы на той же колонке. Как следует из заявки ФРГ 3711894, колонки подвергаются регенерации перед каждым анализом для исключения влияния захваченных и недостаточно вымытых веществ из предыдущего анализа.

Из заявки ФРГ 2448411 известен реактор для иммунного анализа в твердой фазе. Этот реактор, рассчитывающий на многократное применение, требует перед каждым качественным определением тарировки на стандарты определяемого компонента. Кроме этого, в известном реакторе необходимо длительное время инкубации от 6 ч. до 2 суток, в течение которого поток через колонку останавливают, для обеспечения достаточного соединения определяемого компонента с нанесенным на носитель иммунологическим реактивом.

Однако для обеспечения рациональной работы реакцию сцепления всегда прерывают до установления равновесия связей, на которые необходимо 1 - 2 дня. Следствием преждевременного прерывания также является необходимость сравнительного анализа со стандартными растворками для тарировки.

В связи с предпочтительностью на практике одноразовых колонок в патенте ФРГ 2626823 описан способ изготовления встраиваемой одноразовой абсорбционной колонки, в частности, для радиоиммунного анализа с применением анализаторов, использующих центробежные силы. Эти колонки не служат реакторами, а предназначены лишь для разделения после иммунной реакции. Для исключения помех при разделении на слое геля сопротивление потоку пористых составляющих стока поддерживается как можно более низким.

Задачей настоящего изобретения является создание одноразового реактора для иммунологического анализа, который позволял бы осуществлять быстрое и непосредственное проведение анализа, был прост в обращении и мог использоваться сразу, без предварительной калибровки и регенерации, а также создание способа эксплуатации такого реактора.

Эта задача в отношении устройства решена использованием открытого сверху и снизу одноразового реактора для иммунологического анализа в твердой фазе, содержащего не менее одного иммунологического реактива, нанесенного на носитель, причем объем слоя носителя составляет не более 600 мкл, а скорость протекания жидкостей определяется материалом носителя. Этот материал имеет форму твердой фритты, мембраны и тому подобное и ограничен верхней и нижней пористой перегородкой.

В отношении способа эта задача решается способом определения компонентов, определяемых иммунной реакцией, при котором в одноразовый реактор подают анализируемую пробу, задерживают определяемый компонент пробы дополняющим иммунологическим реагентом в одноразовом реакторе в ходе непосредственного протекания и затем определяемый компонент
вымывают и определяют или
маркируют в одноразовом реакторе посредством усилительных реакций с иммунологическими маркерами с последующим определением, или
определяют посредством маркированного соединения, конкурентного по отношению к определяемому компоненту.

На фиг. 1,а приведен пример выполнения одноразового реактора 2 с материалом носителя с иммунологическим реагентом 3, продольный разрез, в случае необходимости с двумя перегородками 2а и 2б; на фиг. 1,б - одноразовый реактор 1, вид сверху; на фиг. 2 - схема автоматического устройства для контроля производства антител.

Одноразовый реактор 1 и способ его эксплуатации обладают существенными преимуществами по сравнению с известными реакторами или способами.

Одноразовый реактор 1 позволяет быстро осуществлять количественное определение компонентов, определяемых иммунными реакциями. Реактор прост в обращении и не требует использования дорогостоящей аппаратуры, например жидкостных хроматографов высокого давления. Отличные результаты достигаются при использовании такого одноразового реактора с весьма малым объемом материала носителя и, соответственно, низким расходом нанесенного на него иммунологического реагента (носителя). Одноразовый реактор предпочтительно используют с объемом 8 слоя носителя, составляющего 50 мкл. Такой малый объем позволяет использовать малые количества промывной жидкости, что, в свою очередь, имеет следствием крайне малое разбавление при промывке и, тем самым, стабильность предела обнаружения относительно других способов с увеличенными объемами промывки.

Помимо этого, реактор позволяет выполнять количественное определение при равновесии связей (определение в конечной точке) между определяемым компонентом и иммунологическим реагентом, причем равновесие связей при использовании одноразового реактора устанавливается уже в пределах времени инкубации в течение одной минуты.

Быстрое установление равновесия связей объясняется малым объемом 8 слоя носителя, его малым сопротивлением потоку и высоким содержание иммунологического реагента в материале носителя. Контролируемый поток и высокая плотность загрузки материала носителя реагентом обусловливают установление количественной связи (равновесие связей) определяемого компонента с реагентом в течение примерно 1 мин до выделения протекающей жидкости из объема носителя. Благодаря этому отпадает необходимость в стандартных приборах сравнительного анализа.

Быстрый анализ проб объясняется также тем, что одноразовый реактор позволяет мгновенное использование, поскольку содержащийся в нем материал носителя 3 стандартизован с иммунологическим реагентом и, следовательно, одноразовый реактор 1 не должен калиброваться перед использованием.

Поскольку одноразовый реактор 1 дает возможность быстрого анализа проб без использования жидкостных хроматографических колонок высокого давления, материал носителя 3 не должен обладать устойчивостью к давлению. В качестве материала носителя 3 могут применяться все материалы, пригодные для хроматографии по сродству. Предпочтительны среди них полисахариды, синтетические материалы, органические или неорганические носители, модифицированные синтетические материалами или оксиды металлов, а также пористые металлы и сплавы, стекло, силикаты или керамические материалы. Наиболее предпочтительно использовать в качестве носителя модифицированные полиэтилен, полистирол, полиакрилат, полиамид, целлюлоза, а также их сополимеры, в качестве металла предпочтительно использовать алюминий, а в качестве оксидов металлов - оксид алюминия, оксид титана или оксид циркония. Носитель может быть выполнен в форме фритты или пористой мембраны. Все указанные материалы имеют структуру поверхности с высокой концентрацией мест активной связи для иммунологического реагента. Для определения очень больших объектов, например вирусов, которые не могут попасть в поры таких материалов-носителей, предпочтительны привитые сополимеры с боковыми цепями, содержащими активные группы, предпочтительно при таком соотношении размера частиц носителя и длины боковых цепей сополимера, которое определяет скорость протекания потока анализируемой жидкости. Нанесенные на материал носителя 3 иммунологические реагенты могут иметь ковалентную связь с материалом или адсорбционную. Иммунологические реагенты могут быть выбраны из группы, состоящей из гаптенов, антигенов, антител и протеинов, имеющих иммунологическое сродство. В качестве антител можно использовать поликлональные и моноклональные антитела.

Предпочтительно материал носителя содержит поры размером от 0,2 до 100 мкм при толщине слоя 0,1 - 20 мм. В случае использования полистирола с привитым полиэтиленгликолем размер частиц носителя составляет от 10 до 15 мкм. Сам реактор предпочтительно выполнен из группы материалов, содержащей синтетические материалы, стекло, металлы и природные соединения. В качестве синтетических материалов преимущественно использованы полиэтилен, полипропилен и/или полистирол. Предпочтительно объем слоя носителя составляет 50 мкл.

Одноразовый реактор 1 предпочтительно имеет на конце утолщение 5, позволяющее удерживать реактор в фиксаторах и приспособлениях для транспортировки, позволяющих автоматически перемещать его. Это необходимо в устройствах автоматической обработки проб. Целесообразно также, чтобы реактор имел на конце, противоположном утолщению, патрубок меньшего диаметра, чем у реактора, для вставки в другой одноразовый реактор. Это облегчает, в частности, соединение нескольких одноразовых реакторов 1 ярусами, при котором слив 6 первого реактора соединен с впускным отверстием второго реактора простым втыканием одного реактора в другой по типу пуансона - матрицы. Одноразовый реактор 1 может закрываться крышками 7 и 9. Наряду с ручным способом усовершенствований используется автоматический способ эксплуатации реактора 1. В этом способе размещение пробы и дальнейшие операции выполняются автоматическим устройством для обработки проб. Такое устройство применяется, например, при производственном контроле антител, получаемых в ферментере непрерывным процессом. При выполнении этого способа автоматическая подача проб происходит с интервалом примерно 6 - 8 ч, а концентрацию антител в ферментативной среде можно быстро определять непрерывно в течение длительного времени с помощью одноразового реактора 1. Схематическое изображение системы контроля производства антител, в которой использован предложенный одноразовый реактор 1, приведено на фиг. 2. Одноразовый реактор 1 расположен здесь в автоматическом устройстве для обработки проб.

При реализации способа в одноразовый реактор указанной конструкции подают пробу, фиксируют ее в реакторе дополнительным иммунологическим реагентом и определяют анализируемый компонент. При этом определяемый компонент может быть перед определением вымыт из одноразового реактора или промаркирован непосредственно в реакторе посредством реакций с иммунологическими маркерами. Определение может быть проведено посредством маркированного соединения, конкурентного по отношению к определяемому. Обычно не требуется проводить предварительную калибровку или регенерацию материала носителя и нанесенного на него реагента. Преимущественно пробу и другие растворы наносят известными лабораторными средствами или пипеточным автоматом. Способ может быть реализован в автоматическом режиме, преимущественно по системе поточного производственного контроля.

Способ можно осуществлять быстро, не подвергая одноразовый реактор 1 высокому давлению после введения пробы. Однако для ускорения процесса можно прикладывать небольшое давление или разрежение, например, с помощью центрифуги или насоса.

При необходимости в предложенном способе можно подключать последовательно или параллельно несколько одноразовых реакторов 1. Это позволяет, например, одновременно отделять несколько параметров в одной пробе или выполнять анализ нескольких проб.

Подключение нескольких одноразовых реакторов особенно предпочтительно при проведении аллергических тестов. В этом случае на различные колонки подают различный антиген (аллерген), затем колонки подключают последовательно и подают пробу, содержащую антитело класса lgE, вызывающее аллергическую реакцию, на первый реактор. Проба последовательно проходит через различные одноразовые реакторы 1, заряженные разными аллергенами.

В том реакторе, где находится антиген, вызывающий аллергию, антитело, содержащееся в пробе, связывается и может быть определено флуоресцентной индикацией. Таким образом, одну и ту же пробу можно испытать на множество потенциальных аллергенов.

Claims (31)

1. Одноразовый реактор для твердофазного иммуноанализа, содержащий открытый сверху и снизу корпус, внутри которого расположен нанесенный на носитель иммунологический реагент, отличающийся тем, что носитель имеет активную или активированную поверхность, причем заполнение носителем корпуса выполнено таким образом, чтобы определяемый компонент был полностью задержан носителем, при этом объем слоя носителя составляет не более 600 мкл.

2. Реактор по п.1, отличающийся тем, что материал носителя с нанесенным иммунологическим реагентом стандартизован.

3. Реактор по п.1 или 2, отличающийся тем, что материал носителя выбран из группы, содержащей полисахариды, синтетические вещества, органические или неорганические носители, модифицированные синтетическими веществами, пористые металлы или сплавы, оксиды металлов, стекло, силикаты или керамические материалы.

4. Реактор по п.3, отличающийся тем, что использован твердый носитель, имеющий форму фритты или пористой мембраны.

5. Реактор по п.3 или 4, отличающийся тем, что в качестве синтетического материала использованы модифицированные полиэтилен, полистирол, полиакрилат, полиамид, целлюлоза или их сополимер, в качестве металла использован алюминий, а в качестве оксида металла - оксид алюминия, оксид титана или оксид циркония.

6. Реактор по п.1 или 2, отличающийся тем, что использован материал носителя с высокой концентрацией мест активной связи для иммунологического реагента.

7. Реактор по п.6, отличающийся тем, что в качестве материала носителя использован привитой сополимер, причем соотношение размера частиц носителя и длины боковых цепей сополимера выбрано таким образом, что оно определяет скорость протекания потока анализируемой жидкости.

8. Реактор по п.7, отличающийся тем, что использован полистирол с привитым полиэтиленгликолем, причем размер частиц составляет 10 - 15 мкм.

9. Реактор по п.1, отличающийся тем, что иммунологический реагент связан с материалом носителя ковалентной или адсорбционной связью.

10. Реактор по п.9, отличающийся тем, что иммунологический реагент выбран из группы, содержащей гаптен, антиген, антитело и имеющие иммунологическое средство протеины.

11. Реактор по п.10, отличающийся тем, что использовано поликлональное антитело.

12. Реактор по п.10, отличающийся тем, что использовано моноклональное антитело.

13. Реактор по п.4, отличающийся тем, что размер пор в материале носителя составляет 0,2 - 100 мкм.

14. Реактор по п.4, отличающийся тем, что толщина слоя носителя составляет 0,1 - 20 мм.

15. Реактор по любому из пп.1 - 14, отличающийся тем, что материал корпуса выбран из группы, содержащей синтетические материалы, стекло, металлы и природные соединения.

16. Реактор по п. 15, отличающийся тем, что синтетический материал представляет собой полиэтилен, полипропилен и/или полистирол.

17. Реактор по любому из пп.1 - 16, отличающийся тем, что реактор на одном конце имеет утолщение, позволяющее устанавливать реактор в фиксирующее и транспортирующее приспособление для автоматического перемещения.

18. Реактор по любому из пп.1 - 17, отличающийся тем, что реактор на противоположном от утолщения конце имеет патрубок, диаметр которого меньше диаметра корпуса реактора.

19. Реактор по п.18, отличающийся тем, что противоположные концы реактора выполнены таким образом, чтобы обеспечивать совмещение нескольких реакторов друг над другом по типу пуансон-матрица.

20. Реактор по любому из пп.1 - 19, отличающийся тем, что объем слоя носителя составляет 50 мкл.

21. Способ твердофазного иммуноанализа, включающий подачу в реактор анализируемой пробы, задерживание определяемого компонента пробы в реакторе и определение компонента, отличающийся тем, что используют одноразовый реактор по любому из пп.1 - 20, а удерживание определенного реагента проводят дополняющим иммунологическим реагентом.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что перед определением компонент вымывают из одноразового реактора.

23. Способ по п.21, отличающийся тем, что определяемый компонент маркируют в реакторе посредством реакций с иммунологическими маркерами.

24. Способ по п. 21, отличающийся тем, что определение проводят посредством маркированного соединения, конкурентного по отношению к определяемому компоненту.

25. Способ по любому из пп.21 - 24, отличающийся тем, что определение проводят при отсутствии предварительной калибровки или регенерации материала носителя и нанесенного на него реагента.

26. Способ по любому из пп.21 - 25, отличающийся тем, что пробу и другие реагенты наносят обычными лабораторными средствами или пипеточным автоматом.

27. Способ по любому из пп.21 - 25, отличающийся тем, что пробу и другие реагенты наносят посредством автоматического устройства для обработки проб.

28. Способ по п.27, отличающийся тем, что автоматическое нанесение пробы проводят в системе поточного производственного контроля.

29. Способ по любому из пп.21 - 28, отличающийся тем, что после нанесения пробы к реактору прикладывают внешнее давление или разрежение.

30. Способ по любому из пп.21 - 29, отличающийся тем, что используют несколько подключенных последовательно или параллельно реакторов.

31. Способ по любому из пп.21 - 30, отличающийся тем, что определяют аллергены.

Images