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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur Durchführung von quantitativen affinitätschromatographischen
Schnelltests durch photometrische Auswertung, mit porösen
Füllmaterial das eine reflektierende innere Oberfläche
aufweist und auf dem Rezeptoren immobilisiert sind und das in einem
Behälter mit Einlass und Auslass angeordnet ist.
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Affinitätschromatographische
Schnelltests basieren auf biospezifischen Wechselwirkungen von Liganden
und Rezeptoren. Typischerweise liegt der Rezeptor immobilisiert
auf einer Festkörperoberfläche vor, während
der zu bestimmende Ligand über eine Flüssigphase
zugeführt und an der Oberfläche spezifisch gebunden
wird. Eine bei Schnelltests gängige Bauform ist in dem
US Patent 4,943,522 beschrieben.
Derartige Schnelltests werden z. B. als Schwangerschaftsteststreifen
eingesetzt. Sie werden auf Basis von Nitrozellulosestreifen hergestellt, über
die im oberen Teil eine Glasfasermembran gesetzt wird. Die Probe
wird am oberen Teil der Glasfasermembran aufgetragen und reagiert
während der Wanderung durch das Flies mit dem dort eingebrachten
Konjugat. In der Regel sind dies Antikörper-Goldpartikel.
Der gebildete Immunokomplex migriert weiter durch die Nitrozellulosemembran
und wird an dort immobiliserten „capture" Antikörpern
gebunden. Im Resultat entsteht eine gefärbte Bande. Es
hat in der Vergangenheit vielfältige Versuche gegeben diese
Teststreifen quantitativ, entweder reflektometrisch oder durch Transmissionsmessung
auszulesen. Die damit ereichbare Sensitivität, Präzision
ist jedoch relativ schlecht und der dynamische Bereich dieser Messungen
ist auf 2–2,5 Größenordnungen begrenzt.
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Ein
weiteres Schnelltestverfahren, wird in
EP-A-0 557 288 ,
EP-0 634 015 oder
PCT/EP94/00086 beschrieben. Es basiert
auf einer Durchflusssäule in der sich poröses
Material mit immobilisiertem Rezeptor befindet. Die Bindung eines Analyten
erfolgt im Durchfluss. Der gebundene Analyt kann nachfolgend durch
Zugabe eines zweiten markierten Rezeptors sichtbar gemacht. werden.
Vorteilhaft hat sich der Einsatz eines Enzym-Antikörperkonjugates
und anschließender Zugabe von präzipitierendem
Tetramethylbenzidin erwiesen. In diesem Falle bildet sich ein blauer
Niederschlag, der quantitativ durch Analyse des transmittierten
Lichtes direkt durch Transmissionsmessung auf dem porösem
Material detektiert werden kann. Besonders gute Sensitivität
und Nachweisgrenzen werden damit erreicht, wenn dazu eine Messküvette
entsprechend der
DE
10 2004 006 470 A1 eingesetzt wird. Eine derartige Vorgehensweise
ist in Gessler et al 2005 beschrieben. Dieses Verfahren ist dem
oben beschriebenen Membranverfahren bezüglich Sensitivität
deutlich überlegen, zeigt aber wie dieses nur einen sehr
engen dynamischen Bereich von maximal 2,5 Größenordnungen.
Streulichtmessungen zeigen bei der beschriebenen Methode ein prinzipiell
vergleichbares Verhalten.
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Alternative
Auslesetechniken, wie Fluorometrie und Luminometrie weisen einen
besseren dynamischen Bereich von bis zu 4 Größenordnungen
auf. Generell gilt für diese Verfahren aber, dass die notwendige Messtechnik
relativ aufwendig und damit teuer ist. Durch Quenching- und Bleaching
Effekte können ausserdem Störungen auftreten.
Diese Techniken sind daher im Gegensatz zur Photometrie zur Herstellung
von einfachen preiswerten Messsystemen nicht geeignet.
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Der
enge dynamische Bereich der photometrischen Verfahren wiederum führt
bei Analyten die in einem breiteren Konzentrationsgebiet auftreten,
dazu dass bei einer Analyse mehrere Verdünnungen der Analyselösung
hergestellt und untersucht werden müssten. Diese Vorgehensweise
ist nicht anwenderfreundlich und führt in der Konsequenz
dazu, dass das Schnelltestverfahren nicht eingesetzt werden kann.
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Ein
der Erfindung zu Grunde liegendes technisches Problem bestand darin,
ein Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung bereitzustellen,
die auf Basis einer einfachen, preiswerten, optischen Transmissionsmesstechnik
die schnelle und präzise affinitätschromatographische
Bestimmung von Analyten in einem breiten dynamischen Bereich zulässt.
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Gelöst
wird das genannte technische Problem mit einer Vorrichtung nach
Anspruch 1 und einem Verfahren nach Anspruch 10. Die Unteransprüche
betreffen besondere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen
Vorrichtung.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung ist zur Durchführung
von quantitativen affinitätschromatographischen Schnelltests
durch photometrische Auswertung geeignet. In der Vorrichtung ist
mindestens ein Filterelement 2, gebildet aus in einem Behälter 1 mit
Einlass 3 und Auslass 4 angeordnetem porösen
Füllmaterial 5 vorhanden, auf dem Rezeptoren immobilisiert
sind. Das Filterelement 2 weist eine reflektierende innere
Oberfläche auf. Die erfindungsgemäße
Vorrichtung ist gekennzeichnet dadurch, dass
- – das
poröse Füllmaterial 5 zwischen zwei flüssigkeitsdurchlässigen
Trennelementen 6 angeordnet ist, unter Ausbildung eines
säulenförmigen Segmentes 8,
- – mindestens zwei säulenförmige Segmente 8 in
der Vorrichtung angeordnet sind,
- – die Rezeptoren in einer spezifischen Konzentration
im Bereich von 1 ng/ml bis 200 g/ml Filtervolumen vorliegen,
- – die Trennelemente 6 auf der zum porösen
Füllmaterial angrenzenden Oberfläche reflektierende
Eigenschaften aufweisen
- – die Vorrichtung so ausgestaltet ist, dass die Vorrichtung
für eine Analyten, die an der Oberfläche der porösen
Füllmaterialien immobilisierten Rezeptoren bindbar sind,
enthaltende Lösung mit einer Geschwindigkeit im Bereich
von 1,5 ml/min bis 0,01 ml/min durchströmbar ist,
- – die Vorrichtung eine Einrichtung 10 aufweist,
mit an der Oberfläche der porösen Füllmaterialien
immobilisierten Rezeptoren gebundenen Analyten, die auf einem oder
mehreren Segmenten 8 durch Lichttransmissionsmessung oder/und
Lichtstreumessung in einem Winkel zwischen 180° und 90°,
entweder direkt oder nach Zugabe von einem oder mehreren Sekundärreagenzien,
die eine spezifische Bindung mit dem Analyten eingehen und dadurch
direkt oder indirekt eine Färbung erzeugen, quantifiziert
wird,
- – wobei die Vorrichtung eine Auswertungseinheit aufweist,
die mittels einer Kalbrationskurve, die die Transmission oder davon
abgeleitete Werte von mindestens zwei Segmenten berücksichtigt,
die Menge des Analyten bestimmbar macht.
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In
einer Ausführungsform weisen die das poröse Füllmaterial
enthaltenden Segmente 8 eine Länge von 0.5–10
mm und einen Durchmesser von 0,5 bis 5 mm auf.
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Die 1 zeigt
eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen
Vorrichtung.
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Es
kann vorteilhaft sein, dass mindestens zwei Behälter miteinander
verbunden werden (2). Dabei kann der Auslass des
einen in den Einlass des mindestens zweiten Behälter lösbar,
z. B. durch stecken, miteinander verbunden werden.
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Das
Trennelement 6 in der erfindungsgemäßen
Vorrichtung ist insbesondere ein poröses Filterelement 2 mit
einem mittleren Porendurchmesser von 1 bis 100 µm und einem
Porenvolumenanteil von 20% bis 80% ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung weist die Auswertungseinheit zur Ermittlung der Transmission
eine Photodioden-/Leuchtdiodenanordnung auf, die als eine Anordnung
aus Leuchtdiodendioden und CCD Zeile oder CCD Array ausgestaltbar
ist.
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Eine
spektrometrische Auswertung der Transmission ist ebenfalls durchführbar.
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Zur
Detektion des Analyten kann eine Färbung durch ein Rezeptor-Partikelkonjugat
und/oder ein Rezeptor-Enzymkonjugat und anschließender
Zugabe eines Enzymsubstrates bewirkt erfolgen.
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In
einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung kann die Rezeptorkonzentration in den Segmenten vom
Einlass 3 zum Auslass 4 hin zunehmen.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Durchführung
von quantitativen affinitätschromatographischen Schnelltests
auf das Vorhandensein von Analyten, unter Verwendung einer photometrischen
Auswertung, wobei eine Lösung enthaltend einen Analyten
oder in der ein Analyt vermutet wird, durch den Einlass 3 des
Behälters 1 der erfindungsgemäßen
Vorrichtung mit dem Füllmaterial in den Segmenten 8 in
Kontakt gebracht wird und nach Adsorption des Analyten an Rezeptoren,
die eine Affinität zu dem Analyten aufweisen, die Anwesenheit
des an die Rezeptoren gebundenen Analyten quantitativ und/oder qualitativ bestimmt
wird.
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Die
Erfindung wird im Folgenden detailierter beschrieben.
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Dabei
wird explizit von dem oben beschriebenen Verfahren auf Basis einer
photometrischen Messküvette mit heterogenen porösen
Füllmaterial ausgegangen. Als poröses Füllmaterial
wird vorzugsweise in Form von Filtersegmenten eingesetzt, auf dessen
innerer Oberfläche Rezeptoren immobilisiert sind. Erfindungsgemäß können
mindestens zwei dieser Elemente in einem Röhrchen hintereinander
angeordnet und dabei durch flüssigkeitsdurchlässige
Trennelemente separiert sein, die auf der Grenzfläche zum
Filterelement reflektierende Eigenschaften aufweisen (1).
Die lineare Anordnung wird nacheinander von der den zu bestimmenden Analyten
(Liganden) enthaltenden Lösung durchströmt.
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Die
Figur zeigt eine Trennscheibe 6, die eine oder zwei reflektierende
Hauptoberflächen aufweist.
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Die
eingesetzten Filterelemente (1) 2 weisen
insbesondere eine reflektierende innere Oberfläche auf.
Die mittleren Porendurchmesser sollten im Bereich von 1 µm
bis 100 µm liegen und der Porenvolumenanteil soll 20% bis
80% betragen.
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Erfindungsgemäß werden
in einer Ausführungsform säulenförmige
rezeptorhaltige Filterelemente 2 mit einer Länge
im Bereich von 0.5–5 mm und einem Durchmesser im Bereich
von 0,5 bis 5 mm eingesetzt. Die Trennelemente 6 weisen
gleiche Durchmesser, jedoch geringere Dicken im Bereich von 10 µm
bis 2,5 mm auf. Generell wird jeweils ein rezeptorhaliges Filterelement 2 von
zwei Trennelementen 6 oben und unten begrenzt. In einer
einfachen erfindungsgemäßen Ausführungsform
ergibt sich die Abfolge:
Trennelement 6/aktives Filterelement 2/Trennelement 6/aktives
Filterelement 2/Trennelement 6.
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In
einer weitergebildeten erfindungsgemäßen Vorrichtung
in Form eines Analyseröhrchens können auch wesentlich
mehr Filterelemente 2 und Trennelemente 6 hintereinander
angeordnet werden. Durch die durchströmbare lineare Anordnung
kann mit einer entsprechend dimensionierten Dosiervorrichtung oder
durch hydrostatischen Druck allein, die den zu bestimmenden Liganden
enthaltenden Lösung mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/min
bis 0,01 ml/min strömen, wobei die spezifische Konzentration
des Rezeptors auf den aktiven rezeporhaltigen Filterelementen im
Bereich von 2 µg/ml bis 200 mg/ml Filtervolumen gewählt
werden sollte.
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Die
Quantifizierung des gebunden Liganden erfolgt separat auf den hintereinander
geschalteten Filterelementen 2 in an sich bekannter Weise.
Dazu können in der Regel zusätzlich vor der Messung
ein oder mehrere an sich bekannte Markierungsreagenzien wie Immun,
Gold-, Antikörper-Farbstoffkonjugate, Antikörper-Enzymkonjugate
etc. zugegeben werden, die mit dem Liganden reagieren und einen
insbesondere optisch gut detektierbaren Komplex bilden bzw. die
Bildung eines detektierbaren Farbstoffes katalysieren. Erfindungsgemäß wird
die Änderung der Transmission oder das in einem definierten
Winkel gestreute Licht der einzelnen Filterlemente registriert.
Daraus können auf Basis des Lambert Beerschen Gesetzes
optische Dichten berechnet werden. Es gilt: Ig(Io/I)
= OD = εdeffcmit:
- OD
- = optische Dichte
- ε
- = Extinktionskoeffizient
- d
- eff =
effektive Schichtdicke, hängt von den lichtstreuenden Eigenschaften
der Filter ab
- c
- = Konzentration des
zu bestimmenden Analyten
- I
- o =
Transmission vor der Anfärbung des Filterelementes mit
der Markierungssubstanz
- I
- = Transmission nach
Anfärbung des Filterelementes mit der Markierungssubstanz
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Erfindungsgemäß werden
zur Kalibration die Intensitätswerte der Transmission oder
des gestreuten Lichtes oder davon abgeleitete Werte insbesondere
die nach der angegebenen Gleichung berechneten optischen Dichten
von mindestens zwei hintereinander liegenden Filtersegmenten 2 bestimmt.
Nachfolgend werden durch Verknüpfung dieser Werte auf Basis
einer geeigneten mathematischen Funktion abgeleitete Messwerte erzeugt,
die zur Erstellung der Kalibration eingesetzt werden. Eine einfache
Form der Verknüpfung stellt die Summenbildung oder Mittelwertbildung
der OD-Werte der beiden Filter dar.
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Es
wurde gefunden dass sich durch Auftragung dieser abgeleiteten Werte über
die Konzentration eine Eichfunktion generieren lässt, die
einen breiteren dynamischen Bereich aufweist, als der der auf Basis
der Auswertung eines einzelnen Filters, unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen
erhalten wird.
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So
lässt sich eine Messbereichserweiterung von bis zu 4 log
Stufen, d. h. dynamische Bereiche von bis zu 6 log Stufen in der
Konzentration realisieren. Dazu sollten in der Regel mehr als zwei
Filtersegmente 2 hintereinander geschaltet werden, wobei
diese sehr dünn ausgelegt werden können. Typische
Messanordnungen zur Quantifizierung des transmittierten oder gestreuten
Lichtes sind Photodioden/Leuchtdioden Anordnungen oder Leuchtdiodenzellen
in Kombination mit CCD Zellen oder CCD Arrays.
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Die
beschriebene Vorgehensweise ist in 4 am Beispiel
einer 3-lagigen Filteranordnung im Vergleich zu einer 1-lagigen
konventionellen Anordnung illustriert. In dem gezeigten Beispiel
entspricht das Volumen des einzelnen Referenzfilters der Summe der
Filtervolumina der drei kleineren Filter in der Multifilteranordnung.
Die Figur basiert auf den Daten, aus dem Ausführungsbeispiel
1.
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Das
Ausführungsbeispiel 2 zeigt an einem analogen 3-lagigen
Aufbau, dass mit dem Verfahren auch sehr gute Variationskoeffizienten
und sich damit eine Präzision erreichen lässt,
welche die des konventionellen Aufbaus deutlich übertrifft.
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Im
Falle des Ausführungsbeispiel 3 erfolgte die optische Detektion
mit einem CCD Array. Das Beispiel zeigt gleichzeitig, dass es möglich
ist, mehrere Segmentanordnungen mit unterschiedlicher Spezifität
hintereinander anzuordnen und damit Multiplexanalysen durchzuführen.
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Im
Ausführungsbeispiel 4 ist eine
Anordnung gezeigt, bei der die Rezeptorkonzentration auf den Filtersegmenten
vom Einlauf zum Auslauf hin zunimmt. In diesem Falle ist eine relativ
gleichmäßige Färbung entlang der Segmentsäule
zu verzeichnen, deren Länge mit der Analytkonzentration
korreliert.
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4:
Photometrische Eichkurven für die immunologische Bestimmung
von F.tularensis auf einem porösen Filterelement mit immobilisiertem
anti- F.tularensis und Peroxidase/TMB Detektion (heterogener Immunoassay
entsprechend Ausführungsbeispiel 1)
- Oben: Eichkurve
und optischer Aufbau einer konventionellen Messanordnung auf Basis
eines 5 × 5 mm Polyethylenfilterelement und einem Einstrahlphotometer
- Mitte: Eichkurven und optischer Aufbau für die erfindungsgemäß vorgeschlagene
Anordnung von drei durch Trennelemente separierte Filterelemente
1,6 × 5 mm und die entsprechende photometrische Dreistrahlanordnung;
die Eichkurven wurden jeweils auf den Filterelementen ermittelt
und können einzeln oder auf Basis von geeigneten mathematischen
Verknüpfungen zur Auswertung der Messung verwendet werden.
- Unten: Aus den 3 Eichkurven berechnete Summeneichkurve für
die F.tularensis Bestimmung auf der erfindungsgemäß vorgeschlagenen
Anordnung
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Beispiel 1 Nachweis von LPS aus Franciscella
tularensis:
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Es
wurden Sinterkörper bestehend aus HDPE mit einem mittleren
Porendurchmesser von 40 um und einem Porenvolumenanteil von 50%
in den Dimensionen (Durchmesser × Länge) 5 × 5
mm (Typ1), 5 × 1,65 mm (Typ 2) eingesetzt auf denen jeweils
9 µg bzw. 3 µg monoklonale anti Francescella tularensis
Antikörper immobilisiert waren. Als porösen Trennelementen
wurden analoge Filterelemente in den Dimensionen 5 × 0,5 mm
(Typ 3) ohne Bindungsaktivität (Blockfilter) eingesetzt.
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Durch
Einstecken eines Filterelementes Typ 1 in Mikrosäulen (Di
= 5 mm, V = 750 µl) wurde eine Anordnung entsprechend Schema 2 Oben
hergestellt. Diese einlagige Anordnung entspricht dem oben beschriebenen
Stand der Technik und diente als Referenzsystem.
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Die
Herstellung der erfindungsgemäß vorgeschlagenen
mehrlagigen Anordnung entsprechend 2 Mitte
und Unten erfolgte durch sequenzielles Einstecken nach dem Schema:
Filter
Typ3/Typ2/Typ3/Typ2/Typ3/Typ2/Typ3.
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Als
Kontrollmaterial wurde F.tularensis extrahiertes Lipopolysccarid
verwendet. Die Konzentrationsangabe erfolgte auf Basis der vor der
Extraktion vorliegenden Keimzahlen in CFU/ml. Die Assays wurden
in Pipetierständern mit eine Nullkontrolle und jeweils
6 Eichproben in Doppelbestimmung durchgeführt. Die Zugabe der
Probe und aller nachfolgenden Reagenzien erfolgte direkt in den
Einlauf der Mikrosäule. Die Flussraten lagen dabei im Bereich
von 250–300 µl/min. Nach Bindung der Probe (500 µl)
wurde durch Zugabe von anti-F.tularensis-POD Konjugat auf der Säule
ein Immunkomplex gebildet, der mit präzipitierenden TMB
nachgewiesen und anschließend durch Transmissionsmessung
quantifiziert wurde. Das Assayschema stellt sich wie folgt dar:
- • 500 µl Probe in PBS Puffer
- • Inkubation 4 min
- • 500 µl anti F.tularensis-Poly HRP Konjugat
(8 µg/ml)
- • Inkubation 4 min
- • 2 × 750 µl PBS Buffer
- • Bestimmung der Transmission Io
- • 500 µl TMB Substratlösung präzipitierend
- • Inkubation 6 min
- • 500 µl PBS-Puffer
- • Bestimmung der Transmission I
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Das
optische Auslesen der Referenzsäulen erfolgte mit einem
Miniphotometer (SENOVA Kat No 30010001RDR). Mit diesem können
Transmissionsmessungen an einlagigen Säulen bei einer Wellenlänge von
532 nm und einem Blendendurchmesser von 3,6 mm realisiert werden.
Die Multischichtsäulen wurden mit einem modifizierten Photometer
gleicher Grundbauart durchgeführt. Dieses wies einen modifizierten
Messkopf mit 3Strahlengängen (Blendendurchmesser 1,2 mm)
jeweils auf der Höhe der aktiven Filterelemente auf.
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Aus
den gemessenen Transmissionen wurde auf Basis von Formel 1 die OD
Werte berechnet. Diese und die daraus berechneten OD Mittelwerte
sind in Abhängigkeit von der LPS Konzentration in 4 dargestellt.
Dabei ist im oberen Teil die Kalibationskurve des einlagigen Systems,
im mittleren Teil die Kalibration der einzelnen Filterschichten
und im unteren Teil die Kalibration auf Basis der summierten OD
Werte wiedergegeben.
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Ausführungsbeispiel 2: Nachweis
von Streptoccus Mutans
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Es
wurden Sinterkörper bestehend aus HDPE mit einem mittleren
Porendurchmesser von 40 µm und einem Porenvolumenanteil
von 50% in den Dimensionen (Durchmesser × Länge)
5 × 5 mm (Typ1), 5 × 1,65 mm (Typ 2') eingesetzt
auf denen jeweils 15 µg bzw. 5 µg polyklonales
affinitätsgereinigtes Serum aus Kaninchen gegen Streptococcus
mutans immobilisiert wurde.
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Als
Trennelementen wurden Scheiben aus entsprechend 3 eingesetzt.
Diese wiesen eine Metallic-Oberfläche mit teilreflektierenden
Eigenschaften auf. Zusätzlich wurden Blockfilter entsprechend
Typ 3 in Anwendungsbeispiel 1 eingesetzt.
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Durch
Einstecken eines Filterelementes Typ 1 in Mikrosäulen (d
= 5 mm, V = 750 µl) wurde eine Anordnung entsprechend Schema 4 (oben)
hergestellt. Diese einlagige Anordnung entspricht dem oben beschriebenen
Stand der Technik und diente als Referenzsystem. Die Herstellung
der erfindungsgemäß vorgeschlagene mehrlagigen
Anordnung entsprechend 4 Mitte und Unten erfolgt durch
sequenzielles Einstecken nach dem Schema:
Typ 3/Typ 2/Scheibe/Typ
2'/Scheibe/Typ 2/Typ 3'.
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Als
Kontrollmaterial wurde Zellkulturmaterial von S. mutans verwendet.
Die Konzentration in CFU/m wurde durch Ausplattieren bestimmt. Die
Assays wurden in Pipettierständern mit eine Nullkontrolle
und jeweils 6 Eichproben in Doppelbestimmung durchgeführt.
Die Zugabe der Probe und aller nachfolgenden Reagenzien erfolgte
direkt in den Einlauf der Mikrosäule. Die Flussraten lagen
dabei im Bereich von 180–200 µl/min. Nach Bindung
der Probe (500 µl) wurde durch Zugabe von affinitätsgereinigten
biotinyliertem anti S-mutans Serum (Kaninchen) auf der Säule
ein Immunkomplex gebildet. Anschließend wurden zur optischen
Detektion Strepatavidin-Magnetpartikel (0,5–1 µm,
Chemagen GmbH, Baesweiler Deutschland) zugegeben. Die Magnetpartikel
können auf den Filtern durch Transmissionsmessung bei 525
nm photometrisch gut detektiert werden. Das Assayschema stellt sich
wie folgt dar:
- • 500 µl Probe
- • Inkubation 4 min
- • 500 µl anti-S.-mutans-Biotin (IgG Fraktion
8 µg/ml)
- • Inkubation 4 Minuten
- • Bestimmung der Transmission I0
- • 500 µl Streptavidin-Magnetpartikel (Chemagen)
- • 750 µl PBS Puffer
- • Bestimmung der Transmission I*
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Die
Bestimmung der Transmissionen erfolgte wie in Ausführungsbeispiel
1 beschrieben. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die erhaltenen Kalibrationsdaten
als Mittelwerte.
| CFU/ml | OD
einlagig | OD
Filter 1 | OD
Filter 2 | OD
Filter 3 | Summe | MW |
| 0 | 0,53 | 0,036 | 0,037 | 0,033 | 0,106 | 0,035 |
| 1,00E
+ 03 | 0,097 | 0,088 | 0,061 | 0,039 | 0,188 | 0,063 |
| 1,00E
+ 04 | 0,177 | 0,184 | 0,11 | 0,42 | 0,714 | 0,238 |
| 1,00E
+ 05 | 0,586 | 0,552 | 0,411 | 0,214 | 1,177 | 0,392 |
| 1,00E
+ 06 | 1,129 | 1,022 | 0,673 | 0,341 | 2,036 | 0,679 |
| 1,00E
+ 07 | 1,86 | 1,682 | 1,249 | 0,663 | 3,594 | 1,198 |
| 1,00E
+ 08 | 2,0025 | 1,806 | 1,601 | 1,002 | 4,409 | 1,470 |
| 1,00E
+ 09 | 2,0965 | 1,917 | 1,722 | 1,239 | 4,878 | 1,626 |
Tabelle
1: Kalibrationswerte (Mittelwerte aus Doppelbestimmungen) für
den S.mutans Test auf einem 1-lagigen Filter und (Typ 1) und der
3-lagigen Filteranordnung, sowie die daraus berechneten Summen und
Mittelwerte
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Ausführungseispiel 3: Simultanbestimmung
von F.tularensis und Y.pestis
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Es
wurden Sinterkörper bestehend aus HDPE mit einem mittleren
Porendurchmesser von 12 µm und einem Porenvolumenanteil
von 40% in den Dimensionen (Durchmesser × Länge)
2,5 × 1,6 mm eingesetzt. Ein Teil der Filter wurden mit
2 µg monoklonalem Antikörper gegen – F.tularensis
(Typ 1'') und und ein Zweiter mit 2 µg monoklonalen Antikörper
gegen das F1 Antigen von Y.pestis (Typ 2'') beschichtet. Die Trennelemente wurden
aus 0,15 mm dicker Alufolie hergestellt, die mit jeweils 3 Löchern
(d = 0,2 mm) versehen wurden. Zusätzlich wurden Blockfilter
in den Dimensionen 2,5 mm × 1,6 mm eingesetzt.
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Es
wurde eine Multischichtanordnung entsprechend 5 auf
Basis von 2 parallelen Röhrchen, die über einen
Kanal verbunden wurden, hergestellt. Die Probe (500 µl)
wurde mit 4 µg anti-F.tularensis-POD Konjugat und 3 µg
anti-Y.pestsis-POD Konjugat 6 Minuten vorinkubiert. Anschließend
erfolgte die Dosierung mit einer Spritzenpumpe bei einer Flussrate
von 1,2 ml/min Anschließend wurde über einen zweiten
Kanal der Spritzenpumpe in 5 Sekunden 1,5 ml PBS Puffer, nachfolgend über
einen dritten Kanal in 3 Sekunden 500 µl präzipitierendes
TMB dosiert. Nach einer Inkubationszeit von 4 Minuten wurde wiederum über
Kanal 2 PBS Puffer (500 μl) dosiert. Anschließend
erfolgte die optische Auswertung in der in 5 gezeigten
CCD Arrayanordnung.
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Die 5 zeigt
beispielhaft das Ergebnis in schematischer Form für eine
Analyse mit hoher (5000 CFU/ml) F.tularensis Konzentration und niedriger
Y.pestis Konzentration (0,2 ng/ml) sowie den umgekehrten Fall niedriger
F.tularensis (425 CFU/ml) und hoher Y.pestsis Konzentration (10
ng/ml). Die erhaltenen Kalibrationen für die beiden Analyten
auf Basis der Summen der berechneten OD-Werte der 6 Filter zeigt
die 6.
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Ausführungsbeispiel 4: Quantifizierung
von Botulinus Toxin A über die Anzahl der verfärbten
Segmente
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Es
wurden 11 Sinterkörper bestehend aus HDPE mit einem mittleren
Porendurchmesser von 12 µm und einem Porenvolumenanteil
von 40% in den Dimensionen (Durchmesser × Länge)
1 × 1,6 mm eingesetzt.
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Die
Filter wurden mit 7,5 µg monoklonalem Antikörper
gegen Botulinus Toxin A beschichtet. Die Trennelemente wurden aus
0,15 mm dicker Alufolie hergestellt, die mit jeweils 3 Löchern
(d = 0,2 mm) versehen wurden.
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Es
wurde eine Multischichtanordnung entsprechend 6 auf
hergestellt.
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Die
Probe (900 µl) wurde mit 4 µg biotinyliertem Anti-BotA
Antikörper 6 Minuten vorinkubiert. Anschließend
erfolgte die Dosierung durch Aufgabe auf die Säule bei
einer Flussrate von ca. 0,4 ml/min. Anschließend wurde
500 µl SA-PolyHRP pipettiert und nach 6 Minuten zwei mal
mit 1,5 ml PBS Puffer gewaschen, nachfolgend in ca. 1,25 Minuten
500 µl präzipitierendes TMBN dosiert. Nach einer
Inkubationszeit von 6 Minuten wurde erneut 1 ml PBS Puffer dosiert.
Anschließend erfolgte die optische Auswertung mittels CCD
Arrayanordnung.
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Die 6 zeigt
beispielhaft das Ergebnis in schematischer Form für eine
Analyse mit niedriger (0,5 ng/ml) und hoher (5 ng/ml) Konzentration.
Die Anzahl der verfärbten Filter gibt direkt Aufschluss über
die detektierte Konzentration in der Probe.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - US 4943522 [0002]
- - EP 0557288 A [0003]
- - EP 0634015 [0003]
- - EP 94/00086 [0003]
- - DE 102004006470 A1 [0003]