SE458643B - Anordning med kolonnelement uppdelat i provparti och referenspatri - Google Patents

Description

458 643 2 10 15 20 25 30 35 tikelformigt, varvid bärarmaterialet är uppdelat i åtminstone ett provparti, i vilket en eller flera receptorer för det eller de ämnen som skall bestämmas är bundna, och åtminstone ett referensparti, som innehåller eller under utförandet av analysen kan bilda en standard för bestämningen, varvid nämnda provparti(er) och referensparti(er) är anordnade antingen som separata över varandra liggande skikt eller som separata parallella segment, och dels en till kolonnelementets andra ände ansluten eller anslutbar sug- och vätskeuppsamlingsanordning inne- fattande en cylindrisk behållare med en axiellt förskjutbar kolv, företrädesvis manuellt manövrerbar, varvid åtminstone delar av kolonnelementet är transpa- renta för att medge jämförande visuell, fotometrisk eller fluorimetrisk bestäm- ning direkt på kolonnen mellan materialet i nämnda prov- och referenspartier.

Med anordningen enligt uppfinningen utförs bestämningen av standard och prov i ett och samma reaktionskärl men i olika zoner' av detsamma. För att utföra de erforderliga reaktionsstegen suger man efter varandra, och vid behov med erforderliga inkubationsintervall, upp de aktuella analyslösningarna, dvs. provlösníngen resp. de nödvändiga tvätt-I och reagenslösningarna, i kolonn- elementet, varvid en efterföljande lösningstillsats får undantränga den föregåen- de, varefter man utförbestämningen av ämnet eller ämnena ifråga direkt på kolonnen genom jämförande mätning på de ovannämnda prov- och referens- partierna.

Uttrycken "kolonn" och "kolonnelement" skall, som de används i föreliggande beskrivning. och patentkrav, uppfattas i vid bemärkelse och avser varje behållar- eller höljeselement som kan användas för uppfinningens syften oberoende av dess form. Förutom cylinderformade element omfattas således t.ex. även fyrkantiga sådana av mätcelltyp, etc.

Det ovannämnda referenspartiet, som är avsett att tjänstgöra som referens eller standard för det eller de ämnen som skall bestämmas, kan antingen innehålla en fast standard, t.ex. en känd mängd indikator eller markör, eller också kan det vara anordnat att bilda denna standard under analysen, t.ex. genom koppling till kolonnmaterialet av en känd mängd av det ämne som skall bestämmas, eller av ett ämne som reagerar på samma sätt med det aktuella reagenset (indikator eller markör). Vid exempelvis en immunologisk analys skall således detta ämne ha minst en determinant eller epitop gemensam med provsubstansen. Om man vill bestämma det inbördes förhållandet mellan två komponenter i ett prov, kan provpartiet av kolonnen vara anordnat att binda den ena komponenten och referenspartiet den andra.

Sug- och vätskeuppsamlingsanordningen kan exempelvis utgöras av kolvdelen av en injektionsspruta av i och för sig känt slag, anordnad att kunna 10 15 20 25 30 35 3 458 64š fästas vid kolonnelementet på något lämpligt sätt, t.ex. med ett snäpplås.

Eventuellt är en spärr för kolven anordnad, som endast tillåter kolven att röra sig i sugriktningen. Ändamålsenliga markeringar för de nödvändiga volymerna av de olika analyslösningarna kan exempelvis vara markerade längs sprutcylindern.

Enligt en utföringsform av anordningen uppbärs åtminstone sprutdelen i ett handtag eller en hållare med något lämpligt manöverorgan, t.ex. åtkomligt för tummen, och med vars hjälp sprutkolven påverkas, som t.ex. en kugghjull- kuggstångsöverföring. Eventuellt är en växellåda anordnad för att minska erhållen slaglängd vid överföringen till kolven. Handtaget eller hållaren kan även vara anordnad att avge ett snäppljud eller liknande, när de erforderliga volymerna av prov, tvättlösning resp. reagens uppnåtts. i stället för den ovannämnda kugghjul/kuggstångsmanövreringen kan man givetvis använda andra drivanordningar, som t.ex. en förspänd fjäderanordning.

Bestämningen eller mätningen på kolonnens prov- och/eller referensparti kan, som ovan nämnts, bl.a. beroende på den använda indikatorsubstansen, ske antingen visuellt, fotometriskt, t.ex. kolorimetriskt, eller fluorimetriskt. För den fotometriska bestämningen kan någon lämplig spektrofotometer eller fluorimeter av i och för sig känt slag användas, som dock är lämpligt anpassad för den aktuella mätningen på kolonnen.

Exempel på tester, som anordningen enligt uppfinningen kan användas för, innefattar sådana baserade på immunologiska reaktioner, såsom reaktion mellan antigen (eller hapten) och antikropp och andra biospecifika affinitets- reaktioner baserade på andra receptor-1igand-interaktioner, t.ex. enzymreak- tioner, såsom enzym-substrat eller enzym-koenzym, lektin-socker, protein A-Fc- del av lgG, biotin-avidin, neurotransmitter/receptor-reaktionen såsom acetyl- kolin-acetylkolinreceptor, etc. Testerna kan på konventionellt sätt utföras såväl icke-kompetitivt som kompetitivt.

Uppfinningen är särskilt väl lämpad för flerstegsanalyssystem, t.ex. av s.k. Sandwich-typ, dvs. där det ämne (ligand) som skall bestämmas binds biospecifikt mellan två reaktanter (receptorer). Detta gäller speciellt olika immunoassays baserade på denna princip. Exempelvis kan en sådan immunoassay enkelt utföras, t.ex. på blodplasma, med en anordning enligt uppfinningen, där kolonnelementet innehåller lämpligt bärarmaterial, som enligt ovan i ett parti därav på i och för sig känt sätt uppbär en receptor för det ämne som skall bestämmas i provet, och i en annan del av kolonnen uppbär en känd kvantitet av detta ämne eller ett ämne med motsvarande reaktionsspecificitet, såsom diskuterats ovan, avsedd att användas som standard vidímätningsmomentet.

Bärarmaterialet i de båda kolonnpartierna, som kan vara samma eller olika 458 643 l l0 l5 20 25 30 35 4 bärarmaterial, är lämpligen åtskilda av något lämpligt filter eller av ett skikt av bärarmaterial utan någon immobiliserad reaktant. Vid användningen suger man upp lämplig provmängd i kolonnen (enligt markering på sprutcylindern eller på annat lämpligt sätt) och låter det hela inkubera lämplig tid. Man suger sedan lämplig mängd tvättlösning i kolonnen för undanträngning av provlösningen, följt av lämplig mängd indikatorlösning, t.ex. innehållande en reaktant med lämplig biospecifik affinitet och försedd med en kromofor, fluorescerande, kemilumi- niscent eller enzymatiskt aktiv grupp, t.ex. ett enzymkonjugat av ett enzym och en antikropp som binder till det ämne som skall bestämmas. Efter eventuell inkubation för att indikatorreagenset i tillräcklig utsträckning skall bindas till den komponent i provet som är bunden till receptorn i kolonnens provparti resp. den kända mängd av ämnet eller analog därtill som immobiliserats i kolonnma- terialets referensparti, uppsugs på nytt lämplig mängd tvättlösning för undan- trängning av indikatorreagenslösningen. l fallet med enzymreagens för fluori- metri uppsugs sedan först en substratlösning som vid inverkan av enzymet ger en fluorescerande produkt, varefter man med en lämpligt anpassad fluorimeter direkt på kolonnen läser av och jämför de värden som erhålls för kolonnens prov- och referenspartier. Om så önskas kan åtminstone för vissa kombinationer av prov och indikatorreagens dessa blandas med varandra före uppsugningen i kolonnen.

Vid många tester är man endast intresserad av att få reda på om koncentrationen av ett visst ämne i ett prov ligger över eller under en viss nivå, och en kvantitet av ämnet eller analog därtill som ger en mot denna nivå svarande signal vid mätningsmomentet väljs då som standardmängd i kolonnens referensparti.

Av det ovanstående framgår att anordningen enligt uppfinningen möjlig- gör ett analysförfarande, som går enkelt och snabbt att utföra med minimal risk för fel och som följaktligen utan vidare kan utföras av en läkare eller sjuksköterska på en vanlig läkarmottagning. Tack vare att alla uppsugna lösningar kvarhålls i sprutcylindern under hela proceduren reduceras även "slaskandet" med lösningar till ett minimum.

Såväl semikvantitativa som kvantitativa analyser låter sig väl utföras.

Den fotometer eller fluorimeter som eventuellt krävs kan dessutom göras relativt enkel och billig. Företrädesvis integreras mätanordningen med en mikrodator för kvantifiering av mätresultaten, som t.ex. kan presenteras på en display. För sådana semikvantitativa analyser där man vill veta om halten av ett ämne ligger över eller under en viss nivå anordnas lämpligtvis en eller flera ljussignalanordningar, som lyser för positivt och/eller negativt svar på analysen. lO 15 20 25 30 35 5 458 643 Om så önskas kan man med anordningen enligt uppfinningen även bestämma flera ämnen samtidigt genom att man delar upp kolonnens provparti i flera delar för olika receptorer, och vid behov delar upp kolonnens referensparti i motsvarande antal partier med olika standarder.

Valet av bärarmaterial i kolonnen är i och för sig inte kritiskt. Det bör dock ge stor kontaktyta, ge låg bakgrundssignal, ha hög kapacitet för kovalent koppling av receptor och goda flödesegenskaper. Lämpliga bärare är i många fall sådana som används för affinitetskromatografi. Företrädesvis är material- egenskaperna sådana att man väsentligen uppnår diffusionsoberoende för de olika reaktionerna. För en närmare diskussion härav hänvisas t.ex. till vår PCT- publikation WO 84/ 03150.

Bärarmaterialet skall vara poröst och/eller partikulärt och kan t.ex. väljas bland sådana baserade på dextran, polyakrylamid, polystyren, glas, etc., t.ex. partikulär agaros. En lämplig partikelstorlek för partikulärt material är 20- 150 p..

Anordnlngen enligt uppfinningen lämpar sig utmärkt för en snabb- eller screentest av allergier. Som bekant ger överkänslighet mot ett visst allergen l blodet upphov till antikroppar av IgE-typ som är specifika mot allergenet. Det välkända testet Phadebas RAS (Pharmacia AB, Sverige) är baserat på detta fenomen. Med detta test kan man direkt ur ett blodprov från en patient fastställa om patienten är allergisk mot olika ämnen. Principen för RAST®-testet är densamma som för en konventionell immunoassay av sandwichtyp. Ett serumprov från patienten förs i kontakt med en papperslapp, till vilken ett allergen är kopplat. Härvid fastnar endast IgE-molekyler som är specifikt riktade mot allergenet ifråga. De övriga IgE-molekylerna i provet avlägsnas genom dekante- ring och tvättning, varefter man till papperslappen tillsätter radioaktivt märkta antikroppar mot lgE. Dessa binds i proportion till serumprovets mängd av det IgE som är specifikt mot allergenet. Genom mätning av papperslappens ra-dioaktivitet får man ett direkt svar på huruvida en patient har specifikt IgE mot det allergen som kopplats på papperslappen. I stället för de radioaktivt märkta antikropparna kan ett enzymkonjugat av ett enzym och en antikropp användas, varvid man "framkallar" med hjälp av ett substrat, där enzymet frigör en kolorimetriskt eller fluorimetriskt påvisbar substans. Detta konventionella test är relativt komplice- rat och tidsödande och kan därför endast utföras på. speciallaboratorier.

Ett motsvarande screentest för att snabbt bestämma om en patient har lgE-medierad allergi kan enkelt 'utföras med anordningen enligt uppfinningen.

För detta ändamål använder man en kolonn, i vars provparti en lämplig allergenblandning, t.ex. innehållande 5-15 olika allergener, är kopplad till 458 643 10 15 20 25 30 35 6 bärarmaterialet, medan en känd mängd IgE är kopplad till bärarmaterialet i kolonnens referensparti. Mängden IgE är härvid vald så att vid sättets utförande den erhållna signalen från referenspartiet svarar mot det s.k. "cut-ofW-värdet, som statistiskt satts för att fånga upp så många allergiker som möjligt utan alltför många falska positiva. Om det testade provet svarar mot allergi skall således den i provpartiet upptagna mängden lgE ge upphov till en signal som är skild från den som uppkommer i referenspartiet. Därefter går man till väga på samma sätt som beskrivits ovan för att utföra en immunoassay med anordningen enligt uppfinningen, dvs. att man successivt suger upp och, vid behov inkuberar med, helblod eller plasma från ett blodprov från patienten, reagenslösning, tvättlösning och, beroende på indikatorn, eventuellt framkallande substrat- lösning, varefter man mäter direkt på kolonnen med någon lämplig fotometer eller fluorimeter för bestämning av indikatorsignalen i kolonnens provdel i förhållande till motsvarande mängd i kolonnens referensdel. Om resultatet är positivt, innebär det att patienten är allergisk mot någon eller några av allergenerna. En närmare bestämning av de speciella allergener som patienten är känslig mot kan ske på motsvarande sätt med annan kolonn eller på special- laboratorium.

För att bestämma huruvida ett tillstånd hos en patient över huvud taget beror på en allergi kan en bestämning av total lgE utföras genom att man går till väga' på samma sätt som ovan men i stället för allergenblandningen kopplar antikroppar mot IgE på bäraren i kolonnens provparti. Eventuellt kan sådan bestämning av total IgE ske samtidigt med testet på allergenspecifik lgE genom användning av en trezonskolonn med en allergenzon, en zon med anti-IgE och en zon med IgE.

Om så önskas kan man givetvis även testa med avseende på flera sådana allergenblandningar samtidigt eller också med avseende på enskilda allergener genom att som nämnts ovan dela upp kolonnens provdel i flera separata delar.

Förutom att åstadkomma sådan uppdelning genom separata skikt kan man även på i och för sig känt sätt dela upp kolonnen i parallella segment.

Som exempel på andra tester på det medicinska och andra områden, som anordningen enligt uppfinningen är utmärkt lämpad för, kan nämnas bestämning av IgG, lgM, IgA, serumproteiner, glykoproteiner och myoglobin. Ytterligare exempel på substanser som kan bestämmas är teofyllin, digoxin och glykosylerat hemoglobin. I det sistnämnda fallet är man vanligtvis intresserad av förhållandet mellan glykosylerat och icke glykosylerat hemoglobin. Sådan bestämning kan tex. ske genom användning av boratgrupphaltigt material i kolonnens provparti för upptagning av glykosylerat hemoglobin och ett jonbytarmaterial i referens- 10 15 20 25 30 35 , 458 645 partiet för upptagning av hemoglobin. kolonnpartier kan det önskade förhållandet erhållas genom exempelvis en Efter upptagningen i respektive kolorimetrisk jämförelse mellan kolonnskikten.

I mikrobiologiska sammanhang kan uppfinningen t.ex. användas för att bestämma förekomst av olika bakteríeantigen i exempelvis prov från olika kroppsvätskor, men även antikroppar riktade mot dessa antigen kan bestämmas. l det följande kommer en speciell utföringsform av anordningen enligt uppfinningen, till vilken den dock inte på något sätt är begränsad, att beskrivas med hänvisning till de bifogade ritningarna, i vilka Fig. l är en sidovy, delvis i sektion, av en utföringsform av en anordning enligt uppfinningen, Fig. 2 är en längdsektionsvy av kolonndelen av anordningen i Fig. 1, Fig. 3 är en sidovy av hållardelen av anordningeni Fig. l, Fig. li är en vy underifrån av hållardelen i Fig. 3, och Fig. 5 är en perspektivvy av en mätanordning för användning med anordningen enligt uppfinningen.

Anordningen i Fig. l, allmänt betecknad med hänvisningssiffran 1, innefattar en kanylförsedd kolonndel 2 förbunden med en sprutdel 3, som uppbärs i en manövrerbar hållare eller “pipett" 4. Kolonndelen 2, som kommer att beskrivas närmare nedan i samband med Fig. 2, är fvlld med ett bärarmaterial (ej visat). Sprutdelen 3 utgörs lämpligen av kolv/cylinderdelen från en konventionell injektionsspruta och är genom presspassning löstagbart fastsnäppt i kolonndelens 2 övre ände eller ändstycke 5. Sprutans 3 övre ände är fixerad i hâllaren 4, via sprutcylinderns stödfläns 6 och kolvstångens 7 manöverfläns 8, såsom kommer att beskrivas närmare i samband med Fig. 3.

I Pig. 2 visas utformningen av kolonndelen 2 i Fig. l mer i detalj. Den består i det visade fallet av ett kolonnrör 9, ivars ena ände ett toppstycke 10 försett med ett kanyirör ll är löstagbart fäst. Toppstycket lO har för den skull ett ändparti l2 med väsentligen samma diameter som kolonnrörets 2 inner- diameter och anordnat att genom presspassning kunna fixeras däri under anliggning av ett ansatsparti 13 mot kolonnrörets 2 ände. I toppstyckets 10 övre del vidgar sig kanylrörets ll borrning kontinuerligt för att ge en jämn övergång till kolonnrörets 9 innervägg. Kolonnrörets 9 andra ändparti har större innerdia- meter än rörets huvuddel för att uppbära ett filter 14, t.ex. av polypropen, och ett nät 15, t.ex. av nylon. Dessa hålls på plats mot det av diameterövergången bildade ansatspartiet 16 med hjälp av det ovannämnda ändstycket 5, vars ytterdiameter i detta parti är avpassad för inpassning i koionnröret. Fixering sker genom insnäppning av den fria rörkanten 9a ovanför ett flänsparti l7 hos 458 643 10 15 20 25 30 35 8 kolonnröret 9 i ett motsvarande spår 5a i ändstyckets 5 flänsförsedda ändparti 18, så att flänsarna anligger mot varandra. Som ovan nämnts är ändstycket 5 avpassat att kunna uppta och fixera sprutan 3 i Fig. l, som Lex. är en vanlig engångsspruta, genom att dess kanylfäste pressas in i den svagt konformiga centrumborrningen 19 och snäpps fast. För att förbättra strömningsbilden i övergången mellan röret ll och kolonnröret 9 vid användning är lämpligtvis en plugg 20 av mycket poröst material, t.ex. Vion, anordnad och avgränsas med hjälp av ett filter 21, t.ex. av polypropen. Mellan filtren 2l och 14 packas det kolonnmaterial som skall användas i anordningen, vilket uppdelas i två skikt åtskilda av ett ytterligare filter 22, t.ex. också av polypropen, såsom kommer att beskrivas närmare nedan. För att medge direkt visuell eller fotometrisk eller fluorimetrisk bestämning på kolonnmaterialet i enlighet med uppfinningen är kolonnröret 9 av transparent material. Sprutans 3 transparenta cylinder är försedd med lämpliga volymmarkeringar (ej visade) för analyslösningarna vid det aktuella analyssystemet, såsom kommer att beskrivas närmare nedan.

Som bäst framgår av Fig. 3 och 4 utgörs hållaren 4 av ett rörformat hölje 23, i vilket ett kolvelement 24 fäst vid en manöverstâng 25 är glidbart lagrade.

Manöverstången 25 är försedd med en längsgående, central kuggstång 26, som i hâllarens 4 övre ände är i ingrepp med ett kugghjul 27, fast anordnat i ett tumhjul 28 (Fig. 4) avsett att manövreras med tummen. Tumhjulet 28, och därmed kugghjulet 27, är roterbart lagrat i två hällarelement 29 på hållarens 4 utsida och sträcker sig genom en övre urtagning eller öppning 30 till ingreppet med kuggstången 26. Som framgår av Fig. 4 utgörs tumhjulet 28 av två hjulpartier 3l, anordnade pâ ömse sidor om kugghjulet 27 och som omgafflar kuggstângen 26 och därigenom samtidigt utgör en styrning för manöverstângen 25. Genom manövrering av tumhjulet 28 kan således kolvelementet 24 förskjutas längs hàllaren. En undre urtagning 32 i hâliarhöljet 23 sträcker sig fram till hållarens 4 undre ände och är avsedd att medge det ovannämnda införandet och fixeringen av sprutans 3 överdel i hâllaren 4, vars hölje för den skull är försedd med ett tvärgâende spår 33, avpassat att kunna uppta sprutcylinderns stödfläns 6.

Ett motsvarande spår 34 för sprutans manöverfläns 8 är anordnat i kolvelemen- tets 24 underdel liksom en urtagning 35 för sprutcylindern. Tack vare denna fixering av sprutans 3 cylinder i hâllarhöljet 23 och dess kolvstâng 7 i hållarens rörliga kolvelement 24 kommer varje rörelse hos tumhiulet 28 att direkt överföras till sprutans 3 kolv 3a. För att öka precisionen vid manövreringen av sprutkolven kan i en sofistikerad variant av hâllaren 4 en kuggväxel vara anordnad, så att den erhållna slaglängden reduceras vid överföringen av tumhjulets 28 rörelse till sprutkolven. Vidare kan om så önskas håliaren 4 förses 10 15 20 25 30 35 9 458 643 med en urkopplingsbar spärr, som endast medger förskjutning av kolvelementet 214 i sprutkolvens insugningsriktning.

Den i Fig. 5 illustrerade mätanordningen, allmänt betecknad med 36, kan vara en spektrofotometer eller fluorimeter beroende på den använda markören och därmed den valda våglängden för mätningen. Den innefattar ett kyvettparti 37 med ett vertikalt cylindriskt mätrum 38 avpassat att kunna uppta kolonnröret 9 hos anordningen 1 (Fig. l). 39 anger en manövrerings- och avläsningsdel.

Mätanordningen 36 kan vara av konventionell typ med exempelvis tvåkanals strålgång för samtidig mätning på kolonnens prov- resp. referensparti. Före- trädesvis ingår en mikrodator för behandling av mätvärdena. Presentationerna kan ske på en display, eller, om man endast önskar få reda på om halten av ett ämne i ett prov ligger över eller under en viss nivå, som i det illustrerade fallet med hjälp av lämpliga lampor eller lysdioder 4D.

För att utföra ett allergitest med den i Fig. l-5 visade anordningen enligt uppfinningen kan man gå till väga på följande sätt: Kolonnröret 9 packas först på i och för sig känt sätt med dels bärar- material, t.ex. SepharoseQ på vilket en allergenblandning, som t.ex. kan innehålla upp till 15 olika aliergener, kopplats, och dels, åtskilt med hjälp av filtret 22 i Fig. 2, samma bärarmaterial på vilket man kopplat lgE. Därefter fixeras kolonndelen 2 i sprutan 3, som t.ex. kan vara en engångsspruta med exempelvis 2,5-5 ml volym, vilken i sin tur inkopplas i hållaren 4, såsom beskrivits ovan med sprutans 3 kolv 3a i utgångsläget, såsom beskrivs nedan.

Anordningen l är sedan färdig för användning.

En för analysen lämpad reagensuppsättning kan exempelvis tillhanda- hållas i en blisterram. Reagenslösningarna kan för den aktuella analysen, i användningsordning, vara transportbuffert, tvättlösning, enzymreagenslösning (förutsatt att enzymmarkör används), tvättlösning och substratlösning.

Ett blodprov tas från patienten, kapillärt eller venöst, t.ex.' 0,3-l cm3, varefter blodet överförs i ett centrifugrör och centrifugeras vid lämplig hastighet under t.ex. ca l minut. Alternativt utförs endast filtrering av blodet före användningen vid analysen.

Sprutan 3 är från början fylld med viss volym transportbuffert, t.ex. ca l ml. Man nollställer därför först anordníngen genom att rotera hållarens 4 tumhjul 28, tills sprutans 3 kolv 3a nått sitt bottenläge. Härigenom “avgasas" systemet före den egentliga testproceduren. Eventuellt kan hållaren ll, såsom ovan nämnts, vara anordnad så att ett snäppljud eller liknande också indikerar uppnâdd vätskevolym. Därefter uppsugs blodplasma ur centrifugröret försiktigt, så att man inte stör skiktet med röda blodkroppar, genom rotation av tumhjulet 28, tills 458 10 l5 20 25 30 35 643 10 sprutkolven kommit till nästa markering på sprutcylindern. Tvättlösning uppsugs sedan genom ytterligare rotation av tumhjulet och därmed förskjutning av sprutkolven till markering som anger korrekt volym. Därefter uppsugs pâ samma sätt volymen reagenslösning, varefter hela anordningen l placerasi hâllarorganen på mätanordningen 36 och får inkubera i lämplig tid, t.ex. ca 30 min.

Efter inkubationen uppsugs ånyo tvättlösning genom rotation av tum- hjulet 28 och därefter substratlösning till korrekt volym. Efter eventuell inkubering placeras anordningen l med kolonnröret 9 i urtagningen 38 i mät- anordningens kyvettparti 37. Därefter aktiveras mätanordningen 36 för mätning, varefter positivt eller negativt resultat kan avläsas på avläsningsdelen 39.

För ett allergitest enligt ovan väljs standardmängden lgE i kolonnen till en lämplig "cut off" , motsvarande en kliniskt väldokumenterad lgE-nivå. för screening.

Lämpligtvis utförs- även ett test med avseende på total IgE, varvid man går till väga på samma sätt som ovan men ersätter den på bäraren kopplade allergenblandningen med antikroppar mot lgE.

För analyser där man arbetar med relativt små koncentrationer av det ämne man önskar bestämma kan man använda en spruta 3 med större volym för att uppnå högre koncentrering vid upptagningen av ämnet ifråga på kolonnen.

Man inser att det ovan beskrivna mätsystemet enkelt kan automatiseras med utnyttjande av den i mätanordníngen ingående mikrodatorn för styrningen, genom att organ anordnas för drivning av sprutans 3 kolv, medelst ett lämpligt slang- analysvätskorna. och kanylröret ll och ventilsystem ansluts till de olika aktuella I det följande belyses uppfinningen närmare med hjälp av ett utförings- exempel, som mer i detalj beskriver utförande av ett allergitest.

EXEMPEL Man använde en anordning enligt Fig. 1-4, där kolonnröret 9 var av polystyren och hade en innerdlameter av ll mm och en väggtjocklek av 1,2 mm.

Den mellan polypropenfiltren lll och Zl lnneslutna volymen för bärarmaterial var ca l20 ul. Sprutan 3 var en konventionell 3 ml injektionsspruta. Detektordelen i mätanordningen innefattade en fluorimeter och UV-lampa. Mätning skedde vid en excitationsvåglängd av 366 nm och en emissionsvâglängd av 1:50 nm.

Framställning av allergenlösning 100 g pollen (Allergon AB, Velinge, Sverige) extraherades med 1 l fosfatbuffert, pH 7,4. Vätskefasen frânseparerades och avsaltades på en Sephade G-25 kolonn jämviktad med 0,1 M Nal-ICOB, pH _8,0. Eluerlng skedde med samma buffert och följdes med en UV-monitor. Fraktioner som gav 10 15 20 25 30 35 U 458 643 absorption vid 280 nm uppsamlades och slogs samman.

Koppling av allergenlösning på kolonnmatrisen 1,143 g torr CNBr-aktiverad Sepharose® 45 Fast Flow torr gel (Pharmacia AB, Sverige) fick svällai 15 min i 50 ml lmM HCl. (1,43 g torr gel krävs för 5 ml svälld gel). Gelen tvättades med lmM l-lCl på glasfilter nr 3 (200 ml/g gel) i små portioner. En del gel och tvâ delar allergenlösning inkuberades i två timmar med vertikal rotation vid rumstemperatur, eller över natten med vertikal rotation vid +4°C. Kopplingsreaktionen avbröts genom centrifugering vid 3-4000 rpm i 15 min, och kopplingslösningen kastades.

Gelen tvättades två gånger med tvâ delar kopplingsbuffert genom blandning och vertikal rotation i 5 min. Efter centrifugering avsögs kopplings- bufferten, och tvättförfarandet upprepades. Efter det andra tvättningssteget inkuberades gelen med tvâ delar 1M etanolamin, pH 8,0 över natten med vertikal rotation vid +8°C. lnaktiveringen avbröts genom tvättning två gånger med fyra delar kopplingsbuffert på glasfilter nr 3. Gelen tvättades tre gånger på följande sätt.

Fyra delar 0,1 M acetatbuffert med 1 M NaCl, pl-l 4,0, och fyra delar 0,1 M NaHCO3 med 1 M NaCl, pH 8,3, sugs genom gelen i en liten portion på glasfilter nr 3. En slutlig tvättning utförs med 0,1 M NaHCO3 med 1 M NaCl, pH 8,3. Gelen kan förvaras i RAS -buffert nr 3 (Pharmacia AB, Sverige) vid +4°C.

Koppling av IgE på kolonnmatrisen Myelomt IgE (framställt enligt det förfarande som beskrivs i US-patentet 3 720 760) kopplades på CNBr-aktiverad Sepharose® 415 Fast Flow på samma sätt som ovan. Den valda mängden lgE motsvarar cut-off-koncentrationen. i Packning av kolonn Al1ergen-Sepharose® och lgE-Sepharose framställda enligt ovan packa- des i varsin zon av kolonnröret 9 mellan filtren 21 och 14 (Fig. 2), varvid de båda zonerna åtskiljs av filtret 22. _ Beredning av prov Ett blodprov togs från en patient och centrifugerades i ett 400 pl centrifugrör i ca 60 sek vid 10 000 rpm, varefter plasman uttogs.

Analxslösningar a) Tvättlösning NaCl 58,5 g 1,0 M Tween® 20 10 ml 1,096 Bakteriostat t.ex. Kathon 0,15% H20 tillsatt till 1 000 ml. b) Enzymkonjugat: Anti-lgE-B-galaktosidas-konjugat från Phadezym® RAST (Pharmacia AB, .la 458 643 1D 15 20 25 30 35 12 Sverige) och löst i bufferten: ï NazHPOq x 2 H20 16,57 g } 0 IM NaH2P04 x H20 1,89 g , MgClz x 6 H20 0,48 g 2 mM HSA 2,11 g 0,296 NaCl 6,16 g 0,lM Bakteriostat, t.ex. Kathon 0,15% Sackaros 52,6 g 596 H20 tillsatt till 1 000 ml c) Substrat: 0,3 mM ß-metylumbelliferyl-B-D-galaktosid i P-buffert, pH 7,4, framställt genom tillsats av 0,010 g ll-metylumbelliferyl-B-D-galaktosid till 100 ml P-buffert: NazHPOu x 2 H20 7,6 g 0,05M KH2PO4 1,0 g NaCl 9,0 g 0,996 Mgclz x s H20 0,2 g 0,02% Bakteriostat, t.ex. Kathon 0,15% H20 tillsatt till 1 000 ml Testföriarande Test för allergenspeciflka IgE l. 100 pl patientserum sugs upp i kolonnen. 2. Efter l minut sugs l ml av tvättlösningen genom kolonnen. 3. 100 pl enzymkonjugat sugs upp i kolonnen och man inkuberar i 25 minuter. ll. 2 ml av tvättlösningen sugs genom kolonnen. 5. 200 pl substrat sugs upp i kolonnen. 6. Kolonnen placeras i mätanordningen, som indikerar om provet är positivt eller negativt.

Total IgE Kolonnen iordningställs på samma sätt som ovan med undantag av att sätter det allergenkopplade materialet med CNBr-aktiverad Sepharose®- 143 Fast Flow, till vilket man kopplat anti-IgE på samma sätt som ovan. Därefter går man tillväga på samma sätt som i punkt l-6 ovan. ma!! el' Pâ det ovan beskrivna sättet får man på ett betydligt enklare och snabbare sätt lika tillförlitliga resultat som vid det konventionella RAS'I®- testet, som bl.a. kräver inkubering över natten.

Claims (10)

10 15 20 25 30 13 4 5 8 6 4 3 PATENTKRAV

1. l. Anordning för att utföra analyser av ett eller flera ämnen l ett vätske- prov, kännetecknad avattdeninnefattar ett kolonnelement (9) med en inloppsöppning (11) i ena änden och innehållande bärarmaterial, varvid bärarmaterlalet är uppdelat i åtminstone ett provparti, i vilket en eller flera receptorer för det eller de ämnen som skall bestämmas är bundna, och åtminstone ett referensparti, som innehåller eller under utförandet av analysen kan bilda en standard för bestämningen, varvid nämnda provparti(er) och referenspartfler) är anordnade antingen som separata över varandra liggande skikt eller som separata parallella segment, och en till kolonnelementets (9) andra ände ansluten eller anslutbar sug- och vätske- uppsamlingsanordning (3, ll) innefattande en cylindrisk behållare med en axiellt förskjutbar kolv, varvid åtminstone delar av kolonnelementet (9) är transparenta för att medge jämförande visuell, fotometrisk eller fluorimetrisk bestämning direkt på kolonnen mellan materialet i nämnda prov- och referenspartier.

2. k ä n n e t e c k n a d av att suganordningen (3, ll) är manuellt manövrerbar. Anordning enligt patentkravet 1,*

3. Anordning enligt patentkravet l eller 2, k ä n n e t e c k n a d av att suganordningen innefattar kolv/cylinder-delen av en injektionsspruta (3). 11-. kännetecknad kugghjul/kuggstângsaggregat (26, 27).

4. Anordning enligt något av patentkraven 1-3, av att den för manövrering av kolven innefattar ett

5. Anordning enligt något av patentkraven l, 3 och ä, k ä n n e t e c k n a d av att den innefattar drivorgan för drivning av nämnda kolv.

6. Anordning enligt något av patentkraven 1-5, k ä n n e t e c k n a d av att den innefattar ett till kolonnelementets (9) inloppsöppning (ll) kopplat ventil- och slangsystem för anslutning till behållare med analysvätskor.

7. k ä n n e t e c k n a d av att nämnda referensparti innehåller en känd mängd av Anordning enligt något av patentkraven 1-6, 458det6 lO 15 lll âler de ämnen som skall bestämmas, eller av ett ämne med motsvarande reaktionsspecificitet.

8. Anordning enligt något av patentkraven l-7, k ä n n e t e c k n a d av att nämnda prov- och reíerenspartier av kolonnelemen- tet är överlagrade skikt av bärarmaterialet, som eventuellt är åtskilda av ett íilterelement eller av ett rent skikt av bärarmaterial.

9. Anordning enligt något av patentkraven 1-8, k ä n n e t e c k n a d av att bärarmaterialet för nämnda prov- och referens- partier i kolonnen är partikelíormig agaros, företrädesvis med en partikelstorlek av 20-150 p.

10. Anordning enligt något av patentkraven l-9, för testning med avseende på allergi genom bestämning av immunoglobulin E, k ä n n e t e c k n a d av att bärarmaterialet i nämnda provparti av kolonn- elementet uppbär en eller flera olika allergener och nämnda reíerensparti av kolonnelementet uppbär en känd mängd immunoglobulin E.