DE3717211A1

DE3717211A1 - Vorrichtung und verfahren zur trennung und reinigung von molekuelen

Info

Publication number: DE3717211A1
Application number: DE19873717211
Authority: DE
Inventors: Metin Dr Colpan; Ralf Dr Piotrowiak
Original assignee: DIAGEN INST MOLEKULARBIO
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1987-05-22
Publication date: 1988-12-01
Also published as: WO1988009201A1; DE3717211C2

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfah ren zur Trennung und Reinigung von Molekülen aus einer Lösung durch Adsorption der Moleküle an eine in der Vorrichtung angeordneten Matrix.

Zur Probenaufbereitung in chemisch, biochemisch und molekularbiologisch orientierten Laboratorien werden Chromatographiematerialen unterschiedlichster Art seit langem in bewährter Weise verwendet. Häufig fallen da bei die Proben in Mikromaßstab an, insbesondere im bio chemischen und molekularbiologischen, aber auch im ana lytisch-chemischen Laboratorium. Die chromatographi schen Materialien werden auch zur Extraktion von be stimmten Bestandteilen aus den Proben eingesetzt. Die als Festphasenextraktion zu bezeichnende Verfahrenswei se kann man sich auch zur Reinigung und Trennung von Substanzgemischen in Lösung zunutze machen. Bislang wurden neben den Chromatographiesäulen, insbesondere in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie, auch Kartu schen, Einwegspritzen oder kleine Plastikchromatogra phiesäulen, die jeweils mit dem gewünschten Chromato graphiematerial gefüllt sind, verwendet.

Diese Hilfsmittel, die im Niederdruckbereich Verwendung finden, zeichnen sich unvorteilhaft dadurch aus, daß sie nicht mit etablierten Laboratoriumsgerätschaften kompatibel sind. Ein weiterer Nachteil dieser Hilfsmit tel besteht darin, daß sie nur eine Flußrichtung der die zu trennenden und reinigenden Moleküle enthaltenden Lösung zulassen. Man muß also bei der Verfahrensweise gemäß dem Stand der Technik die Probe zunächst in ein Vorratsgefäß, beispielsweise eine Einwegspritze, brin gen, um sie dann durch das Flußmittel, insbesondere Kartuschen oder Extraktionssäulen, zu drücken.

Daher bedient man sich in der Praxis dieser Hilfsmittel überwiegend dann, wenn man die unerwünschten Produkte adsorbieren will. Ansonsten muß man das Vorratsgefäß, beispielsweise die Einwegspritze, entfernen, mit einem die adsorbierte Substanz eluierenden Lösung erneut be schicken und anschließend durch das Hilfsmittel drücken, um die gewünschten Produkte zu erhalten. Durch das Ab nehmen und Aufsetzen eines Vorratsgefäßes besteht je doch eine Kontaminationsgefahr für den Mitarbeiter, die Umwelt und die Probe selbst. Die Gefahr besteht gerade im medizinisch-technischen Bereich, wenn insbesondere mit infektiösem Material gearbeitet wird, oder auch in biochemisch-molekularbiologischen Laboratorien, wenn insbesondere mit radioaktiven Substanzen hantiert wird.

In der Praxis besteht ein erheblicher Bedarf an einer Vorrichtung, die es in einfacher Weise ermöglicht, ein Verfahren zur Reinigung und Trennung von Molekülen aus einer Lösung durchzuführen.

Aufgabe der Erfindung ist es also, eine Vorrichtung bereitzustellen, die es ermöglicht,

- Moleküle aus einer Lösung zu extrahieren,
- keine bevorzugte Extraktions- oder Elutionsrichtung zu verlangen,
- eine Abtrennung und Wiederhinzufügung eines Vorrats gefäßes zu vermeiden,
- die Trennungs- und Reinigungsoperationen in einem geschlossenen System durchzuführen,
- die Kontaminationsgefahr für Personal, Umwelt und Probe zu vermeiden, und
- gleichzeitig die Arbeitsweise insgesamt zu erleich tern.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Vor richtung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Ma trix 2 in einem an beiden Enden 4 a, 4 b offenen, kegel stumpfförmigen Hohlkörper 1, an den gegebenenfalls an der weiteren Öffnung 4 a ein zylindrischer Hohlkörper anschließt, zwischen zwei für die Lösung durchlässigen Einrichtungen 3 a, 3 b angeordnet ist, wobei die Matrix 2 und die Einrichtungen 3 a, 3 b zusammen 5 bis 50% des Hohlkörpervolumens ausfüllen und die weitere Öffnung 4 a des kegelstumpfförmigen Hohlkörpers 1 an eine Pipette anschließbar ist.

Die Fig. 1 und 2 zeigen schematisch den Aufbau einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vor richtung. Die Matrix 2 wird von zwei Einrichtungen 3 a, 3 b begrenzt, die gleichzeitig dafür sorgen, daß die Matrix 2 in der gewählten Position fixiert ist. Die Einrichtungen 3 a, 3 b werden vorzugsweise an der Wandung des Hohlkörpers 1 festgeklemmt. Es kann jedoch neben der Befestigung durch Spannung auch eine Befestigung durch Festkleben der Einrichtungen erreicht werden. Beide Methoden führen zu einem Abdichtungseffekt zwi schen den Einrichtungen 3 a, 3 b und der Wand des Hohl körpers 1. Vorzugsweise findet sich zwischen der unte ren Einrichtung 3 b und der engeren öffnung 4 b ein frei er Raum, wobei dieser freie Raum klein sein soll gegen über dem Gesamtvolumen des Hohlkörpers. Die weitere Öffnung 4 a der beiden Öffnungen 4 a und 4 b ist so ausge staltet, daß sie auf eine handelsübliche Pipette pas sen. Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsge mäßen Vorrichtung besteht darin, daß der Hohlkörper 1 in Form einer kommerziell im Fachhandel erhältlichen Pipettenspitze (Firma Brand, Gilson, Eppendorf) ausge staltet ist. Die Matrix 2 der erfindungsgemäßen Vorrich tung besteht vorzugsweise aus einem porösen Chromato graphiematerial, insbesondere auf der Basis von Silica gel, Aluminiumoxid, Titandioxid, Hydroxylapatit, Dex tran, Agarose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copolymeren der oben genannten Trägermaterialien. Das die Matrix 2 bildende Material kann auch ein oberfläch lich modifiziertes, poröses Chromatographiematerial auf der Basis von Silicagel, Aluminiumoxid, Titandioxid, Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Acrylamid, Polysty rol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polyme ren, Derivaten oder aus Copolymeren der oben genannten Trägermaterialien sein.

Die Wahl des entsprechenden Chromatographiematerials ist abhängig von den jeweiligen zu trennenden und rei nigenden Molekülen und ist dem Fachmann aufgrund der Regeln in der Chromatographie bekannt. So wird bei spielsweise ein polares Molekül, wenn es an der Matrix 2 adsorbiert werden soll, nur dann an der Oberfläche der Matrix 2 adsorbiert, wenn entsprechende Wechselwir kungen vorliegen, die beispielsweise ebenfalls durch polare Gruppen an der Oberfläche der Matrix 2, jedoch mit entgegengesetzter Polarität, vermittelt werden. So können beispielsweise Ionenaustauschermaterialien als Matrix 2 der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Trennung und Reinigung von polaren Molekülen eingesetzt werden. Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der erfindungsgemä ßen Vorrichtung können als Matrix 2 ein Reversed-Phase- und/oder oder ein Affinitätschromatographiematerial beinhalten. Die Porengröße der porösen Chromatographie materialien beträgt vorzugsweise 20 bis 1000 nm, und die Korngröße der Materialien insbesondere 10 bis 2000 µm, vorzugsweise 75 µm bis 125 µm.

Die die Matrix 2 fixierenden Einrichtungen 3 a, 3 b sind vorzugsweise poröse Fritten mit Porengrößen von 10 µm bis 1 mm, vorzugsweise 70 µm bis 2000 µm.

Die porösen Fritten können aus Kunststoffen, insbeson dere aus Teflon (PTFE), Polyethylen, Polypropylen, Po lystyrol, Polyurethan etc. bestehen. Aber auch anorga nische Werkstoffe, wie Glas und/oder gesintertes Metall sind geeignete Materialien zur Herstellung der porösen Fritten.

Der Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt in der praktischen Handhabung und der Art der Packung der Matrix 2, die einen Fluß der die Moleküle enthaltenden Lösung in Hin- und Rückrichtung zuläßt. Ist der kegel stumpfförmige Hohlkörper 1 beispielsweise als Pipet tenspitze ausgebildet, so wird die Pikettenspitze in die Probe eingetaucht, die Probe in der Pipettenspitze durch die Matrix 2 hindurch hochgesaugt und anschlie ßend herausgedrückt. Dadurch wird eine höhere Effizienz der Adsorption erzielt, da die Probe das Chromatogra phiematerial zweimal passiert. Da man mit einem ge schlossenen System arbeiten kann, wird eine Kontaminie rung der Probe oder eine Gefährdung der Umwelt vermie den. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erleichtert die Arbeitsweise insgesamt, die bei der Trennung und Reini gung von Molekülen anzuwenden ist. Insbesondere können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch Biopo lymere, insbesondere Nucleinsäuren und Proteine, schnell, einfach und sicher fraktioniert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einer besonderen Ausführungsform durchgeführt mit einem als Pipettenspit ze ausgestalteten Hohlkörper 1. Die die Moleküle ent haltenden, zu trennenden und reinigenden Moleküle kön nen dann mittels einer Pipette durch die Matrix 2 be fördert werden. Soll die Pipettenspitze als Säulener satz in herkömmlichen Verfahren eingesetzt werden, so kann mittels eines Silikonschlauches die Pipettenspitze auch mit einer Einwegspritze verbunden werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, insbeson dere Biopolymere wie Nukleinsäuren und Proteine zu tren nen und zu reinigen, indem als Matrix 2 Ionenaustau scherchromatographiematerialien, wie sie in der deut schen Patentanmeldung P 36 39 949.3 vorgeschlagen wer den, verwendet werden. Es handelt sich dabei um mit Anionenaustauschergruppen oberflächlich modifiziertes Chromatographiematerial auf Silicagelbasis. Befindet sich beispielsweise die Matrix 2 in einer Pipettenspit ze, so saugt man die Nukleinsäure mit der Pipette durch die Matrix 2. Dabei werden unter Verwendung von Puffern niedriger Ionenstärke die langkettigen Nukleinsäuren adsorbiert. Will man die kurzkettigen Nukleinsäuren anschließend verwerten, drückt man die Lösung wieder durch die Matrix 2 hindurch und fängt sie auf. Dann können weitere Verfahrensschritte folgen. Ist man je doch an der Analyse der langkettigen Nukleinsäuren in teressiert, kann man nach einigen Waschschritten die langkettigen Nukleinsäuren durch Elution mit Puffern hoher Salzkonzentration (hohe Ionenstärke) wieder eluie ren und entsprechend weiterverarbeiten.

Die Fig. 3 zeigt ein Elutionsprofil, das bei Verwen dung von Anionenaustauschermaterialien bei der Verwen dung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhalten werden kann. Es zeigt sich, daß bei Verwendung des in der deut schen Patentanmeldung P 36 39 949.3 vorgeschlagenen Materials zur Trennung von Nukleinsäuren ein Elutions profil erhalten wird, durch das mit steigender Ionen stärke Nukleinsäuren mit steigender Kettenlänge eluier bar werden. So wird doppelsträngige DNS mit Basenpaaren < 500 erst bei einer Ionenstärke von 1,3 M Natriumchlo rid erhalten, während einzelsträngige DNS des Phagen M 13 schon bei 1,1 M Natriumchlorid eluiert wird. Die Elutionspeaks sind so scharf, daß sogar "baseline"- Trennungen möglich sind.

Bei einer mittleren Ionenstärke zwischen 0,5 und 1 M Natriumchlorid eluieren Nukleinsäuren wie tRNS, 5S RNS und mRNS. Bei niedrigen Ionenstärken von 0,1 bis 0,5 werden bereits Polysaccharide, Proteine, Metaboliten, Farbstoffe, einzelne Nukleotide, Proteine wie BSA (bo vine serum albumin) und kleinere Nukleotide wie bei spielsweise ein Nukleotid Decamer, das als "linker" verwendet wird, eluiert.

Eine Verfahrensvariante besteht darin, als Matrix 2 ein Affinitätsadsorbens, wie es beispielsweise in der deut schen Patentanmeldung P 36 27 063 vorgeschlagen wird, zu verwenden. Die Durchführung des Verfahrens erfolgt analog zur oben beschriebenen Verfahrensweise.

Das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet die fol genden Vorteile, insbesondere bei molekularbiologischen Operationen:

- Durchführung von DNS-Präparationen in sogenannten "minikreps",
- Reinigung von mRNS, rRNS, viraler RNS und RNS-Tran skripten,
- Reinigung von Proben, die nach Nicktranslation, End markierung oder Oligonukleotid-induzierter Markie rung (Oligolabeling) erhalten werden,
- Entfernung der DNS-linker in Klonierungsexperimen ten,
- Reinigung von Nukleinsäuren nach Gelextraktion sowie
- schnelle Reinigung von Nukleinsäuren nach Abdauung mit Restriktionsenzymen, Phosphatasebehandlungen, Polymerasereaktionen usw. anstelle einer zeitaufwen digen Phenolbehandlung.

Die bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhältliche Reinheit in Routinepräparationen ist zumin dest mit durch Caesiumchlorid-Dichtegradienten-Zentri fugation erhaltenen Proben vergleichbar. Die isolierten Nukleinsäuren sind befreit von Proteinen, Polysacchari den und anderen Zellmetaboliten und zeigen keinerlei Inhibierung von Enzymen bei enzymatischen Reaktionen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren aus Oligonukleotiden bis hin zu Plasmiden verwendet werden, wobei der Zeit aufwand auf Bruchteile im Vergleich zu anderen Verfah ren eingeschränkt wird.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist geeignet zur Ver wendung in einem Trennungs- und Reinigungsverfahren für Moleküle, vorzugsweise Biopolymere wie Proteine und/ oder Nukleinsäuren, insbesondere von anderen Zellbe standteilen.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in verschiedenen Verfahren wird in den folgenden Beispie len näher erläutert. Dabei wird die erfindungsgemäße Vorrichtung in einer bevorzugten Ausführungsform, der Pipettenspitze, eingesetzt.

Beispiel 1

In eine 1 ml Pipettenspitze, passend für Gilson Pipet man, wird eine 70 µm Polyethylen-Fritte mit 4 mm Durch messer, Dicke 1,6 mm, eingeführt und durch Drücken festgeklemmt. Danach werden ca. 70 mg des Chromatogra phiematerials, vorgeschlagen in der deutschen Patentan meldung P 36 39 949, trocken eingefüllt. Das Chromato graphiematerial wird mit einer wie oben beschriebenen Fritte mit 5,7 mm Durchmesser verschlossen und die Frit te durch Festdrücken an ihrem Platz fixiert.

Analog verfährt man bei 200 µl fassenden Pipettenspit zen bzw. 5000 µl fassenden Pipettenspitzen.

Beispiel 2

Die allgemeine Handhabung der in Beispiel 1 hergestell ten Pipettenspitze geschieht wie folgt:

Zunächst wird die Pipettenspitze einmal mit 100 µl ei nes geeigneten Adsorptionspuffers äquilibriert. Bei einem zu verarbeitenden Probenvolumen von 100 bis 200 µl reicht es aus, die Probe etwa fünfmal durch das Chro matographiematerial zu drücken. Soll jedoch eine größe re Flüssigkeitsmenge verarbeitet werden, wie sie bei spielsweise nach Gelelution anfällt, kann die Probe mittels eines Silikonschlauches, der die Pipettenspitze und eine Einwegspritze verbindet, durch die Matrix hin durchgezogen werden. Es ist dann ausreichend, daß die Probe nur zweimal das Chromatographiematerial passiert.

Dabei sollte die Fließgeschwindigkeit der Lösung nicht höher als 1 ml pro Minute sein.

Als Äquilibrierungs- und Adsorptionspuffer kann der Puffer A verwendet werden.

Puffer A:
400 mM Natriumchlorid
15% Ethanol
50 mM MOPS (3-N-Morpholinopropansulfonsäure)
1 mM EDTA (Ethylendiamintetraacetat)
pH 7,0

Analog zum oben beschriebenen Adsorptionsvorgang werden die Waschschritte durchgeführt. Als Waschpuffer dienen bei Nukleinsäurepräparationen typischerweise die Puffer B, C und D.

Puffer B:
750 mM Natriumchlorid
15% Ethanol
50 mM MOPS
1 mM EDTA
pH 7,0

Puffer C:
1000 mM Natriumchlorid
15% Ethanol
50 mM MOPS
1 mM EDTA
pH 7,0

Puffer D:
1000 mM Natriumchlorid
50 mM MOPS
pH 7,0

Man füllt ein Eppendorf-Gefäß mit 1 ml Waschpuffer und spült dreimal 150 µl durch das Chromatographiematerial, um Verunreinigungen zu entfernen. Dieser Schritt wird wiederholt.

Die Elution der adsorbierten Nukleinsäuren erfolgt wie in beiden vorangegangenen Schritten entweder mit einer Eppendorf- oder Gilson-Pipette oder mit einer Einweg spritze, wobei darauf zu achten ist, daß die Pipetten spitze mittels eines Silikonschlauches mit der Einweg spritze verbunden ist. Es wird einfach der Elutionspuf fer E oder F

Puffer E:
1100 mM Natriumchlorid
15% Ethanol
4 M Urea
50 mM MOPS
1 mM EDTA
pH 7.0

Puffer F:
1500 mM Natriumchlorid
15% Ethanol
50 mM MOPS
1 mM EDTA
pH 7.50

durch die Pipettenspitze gesaugt bzw. gedrückt. Dieser Schritt wird einmal wiederholt. Die Eluate werden ver einigt und die Nukleinsäure daraus gefällt.

Beispiel 3

Eine Pipettenspitze, hergestellt nach Beispiel 1, wird mit 50 mM Natriumphosphatpuffer hydratisiert und äqui libriert, indem man 750 µl Puffer mehrmals durch die Pipette saugt. Eine Probe, die 20 µg Plasmid pBR322 DNS in 500 µl 0,5 M Natriumchlorid und 50 mM Natriumphos phat, pH 7, enthält, wird an das Chromatographiemate rial durch fünfmaliges Hochsaugen und Ausdrücken adsor biert. Nicht gebundene Bestandteile und Verunreinigun gen werden durch fünfmaliges Hochsaugen und Ausdrücken von jeweils 1 ml frischem 0,5 M Natriumchlorid und 50 mM Natriumphosphat, pH 7, ausgewaschen. Die Plasmid-DNS wird anschließend mit 1,5 M Natriumchlorid und 50 mM Natriumphosphat, pH 7, eluiert, indem man 1 ml des Elu tionspuffers dreimal hochsaugt und ausdrückt.

Beispiel 4

Eine Plasmid-DNS-Probe wird in einer sogenannten Mini präparation typischerweise durch folgende Schritte ge wonnen:

Die Bakterienzellen werden über Nacht inkubiert und am nächsten Tag durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wird in 85 µl einer eiskalten Lösung von 50 mM Tris- HCl, pH 7.4, mit 2 mg/ml Lysozym (frisch zubereitet) aufgeschlossen und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Danach werden 20 µl einer 0.5 M EDTA-Lösung hinzugefügt und weitere 10 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 4 µl 2% igem Triton X′ 100 inkubiert man auf Eis für eine wei tere Stunde. Die Probe wird in einer Laborzentrifuge 30 Minuten bei maximaler Drehzahl zentrifugiert, und 100 µl des von Zelltrümmern befreiten Zell-Lysates werden in ein anderes Eppendorf-Gefäß überführt, wonach 1 Vo lumen 2 M Natriumchlorid, 100 mM MOPS, pH 7, und 5 µl Isoamylalkohol zugegeben werden. Eine erfindungsgemäße Pipettenspitze der Firma Gilson, Brand, Eppendorf, her gestellt nach Beispiel 1, wird mit 100 µl Puffer C äqui libriert. Danach adsorbiert man 100 µl einer E. coli- Plasmid-DNS-Probe an dem Chromatographiematerial, indem man die Probe fünfmal auf- und abpipettiert. Nach der Adsorption wird mit insgesamt 2 bis 5 ml des Puffers C gewaschen, woraufhin die Plasmid-DNS mittels 300 µl des Puffers F eluiert wird. Anschließend fällt man die DNS mit 300 µl Isopropanol, läßt 15 Minuten stehen und zen trifugiert dann die Probe dann in einer Eppendorf-Labor zentrifuge 30 Minuten lang.

Beispiel 5

Die Isolierung von mRNS, rRNS und viraler RNS von Roh extrakten geschieht wie folgt:

Der RNS-Extrakt wird mit Ethanol gefällt und das erhal tene Pellet in TE-Puffer (10 mM Tris/l mM EDTA, pH 7.5) resuspendiert. Man stellt die Adsorptionsbedingungen durch Zugabe von 0.1 Volumenteil (bezogen auf die re suspendierte Lösung) 5 M Natriumchlorid und 0,2 Volu menteile 250 mM MOPS, pH 7.0 ein. Die Pipettenspitze wird mit 1 µl Puffer A äquilibriert. Danach wird die Probe durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren an das Chromatographiematerial adsorbiert. Man spült mit Puf fer A, um Verunreinigungen zu eliminieren. Die Elution erfolgt mit 300 µl des Puffers C. Die RNS wird durch Zugabe von 2,5 Volumenteilen Ethanol gefällt. Nach Ste henlassen bei -20°C, 30 Minuten, wird in einer Eppen dorf-Zentrifuge insgesamt 30 Minuten bei höchster Dreh zahl zentrifugiert. Das Pellet wird vor der Weiterver arbeitung sorgfältig mit Ethanol gewaschen. Die Probe soll einen Nukleinsäuregehalt von höchstens 15 µg ha ben.

Beispiel 6

Reinigung von mRNS zur Synthese der entsprechenden cDNS wird wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.

Beispiel 7

Nicht verbrauchte Triphosphate in Markierungsreaktionen wie Nicktranslationen, Endmarkierungen und Oligonukleo tid-abhängigen Markierungen (Oligolabeling) von DNS werden wie folgt entfernt:

Die Markierungsreaktion der DNS wird durch Zugabe von 2 µl 0,5 M EDTA pro 20 µl Probenvolumen beendet, und man stellt die Adsorptionsbedingungen durch Zugabe von 1 Volumenteil des Puffers C ein. Die Gesamtsalz-Endkon zentration soll in etwa 500 mM betragen. Die Pipetten spitze gemäß der Erfindung wird mit 100 µl Puffer B äquilibriert. Die Probe wird durch fünfmaliges Hochsau gen und Ausdrücken an das Chromatographiematerial adsor biert und insgesamt mit 10 ml des Puffers B gewaschen, um die nicht reagierten Nukleotide abzutrennen. Die Fließgeschwindigkeit des Waschpuffers soll vorzugsweise ca. 5 ml pro Minute betragen. Die markierte DNS wird anschließend mit insgesamt 300 µl des Puffers F elu iert. Die Probe kann direkt weiterverwendet werden, wenn sie mit dem zur Hybridisierung vorgesehenen Puffer mindestens 1 : 20 verdünnt wird. Anderenfalls wird die Probe ausgefällt und in TE-Puffer gelöst.

Beispiel 8

Die Entfernung eines DNS-linkers von einer DNS mit mehr als ca. 400 Basenpaaren in einem Klonierungsexperiment wird wie folgt durchgeführt:

Die zu reinigende Probe wird mit 1 Volumenteil des Puf fers C verdünnt, damit die Endkonzentration an Salz ungefähr 500 mM beträgt. Die erfindungsgemäße Pipetten spitze wird mit 100 µl des Puffers A äquilibriert. Die Probe wird wie in den vorhergehenden Beispielen adsor biert. Die erfindungsgemäße Pipettenspitze wird mit Puffer B gespült, um die Verunreinigungen zu entfernen. Die DNS wird desorbiert und eluiert mit insgesamt 300 µl des Puffers F. Anschließend isoliert man die DNS durch Isopropanolfällung (Zugabe von 1 Volumenteil) und läßt 15 Minuten auf Eis stehen, wonach sich eine Zen trifugation der Probe in einer Eppendorf-Zentrifuge für die Dauer von 30 Minuten anschließt. Danach wäscht man sorgfältig mit 70%igem Ethanol.

Beispiel 9

Die Schnellreinigung einer DNS-Probe nach enzymatischer Modifizierung (zum Beispiel durch Phosphatase, Restrik tionsendonuklease, Polymerasen usw. sowie Cofaktoren) erreicht man gemäß folgender Verfahrensweise:

Das zugrunde liegende Reaktionsvolumen beträgt 50 µl und enthält nicht mehr als 100 mM Natriumchlorid. 5 µl 0,5 M EDTA, pH 8.0, werden zum Reaktionsvolumen hinzu gefügt, um die Modifizierungsreaktion abzubrechen. Ein Volumenteil des Puffers C wird zugegeben, um die Adsorp tionsbedingungen einzustellen mit einer Salzkonzentra tion von etwa 500 mM. Die erfindungsgemäße Pipetten spitze wird äquilibriert, die Probe wird adsorbiert und anschließend eluiert wie in Beispiel 8 beschrieben. Auch die weitere Behandlung der Probe geschieht wie in Beispiel 8 beschrieben.

Beispiel 10

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch dazu benutzt werden, um Agarose- und Acrylamid-Verunreinigungen ef fizient abzutrennen. Dies ist insbesondere dann erfor derlich, wenn Gelelutionen der Probe stattgefunden ha ben. Bei Anwendung der im folgenden beschriebenen Ver fahrensweise wird die DNS gleichzeitig konzentriert, selbst wenn das Startvolumen einige ml beträgt. Die DNS hat eine Größe von < 400 Basenpaaren und kann in einer Menge von 5 ng bis 15 µg vorliegen. Die Probenvorberei tung und die Äquilibrierung der erfindungsgemäßen Pi pettenspitze wird wie in Beispiel 8 beschrieben durch geführt. Dann überführt man die Probe in eine Einweg spritze und drückt sie zweimal durch die erfindungsge mäße Pipettenspitze. Dabei soll die Fließgeschwindig keit bei etwa 250 µl/min liegen. Die erfindungsgemäße Pipettenspitze wird anschließend mit 5 ml des Puffers B gewaschen bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 ml/min. Die Weiterbehandlung der DNS-Probe geschieht wie in Beispiel 8 beschrieben.

Claims

1. Vorrichtung zur Trennung und Reinigung von Molekülen aus einer Lösung durch Adsorption der Moleküle an einer Matrix, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (2) in einem an beiden Enden (4 a, 4 b) offenen, kegelstumpfför migen Hohlkörper (1), an den gegebenenfalls an der wei teren Öffnung (4 a) ein zylindrischer Hohlkörper an schließt, zwischen zwei für die Lösung durchlässigen Einrichtungen (3 a, 3 b) angeordnet ist, wobei die Matrix (2) und die Einrichtungen (3 a, 3 b) zusammen 5 bis 50% des Hohlkörpervolumens ausfüllen und die weitere Öff nung (4 a) des kegelstumpfförmigen Hohlkörpers (1) an eine Pipette anschließbar ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Hohlkörper (1) eine Pipettenspitze ist.

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtungen (3 a, 3 b) die Ma trix (2) im Hohlkörper (1) fixieren.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der engeren Öffnung (4 b) und der unteren Einrichtung (3 b) ein freier Raum ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix aus porösem Chromatogra phiematerial auf der Basis von Silicagel, Aluminium oxid, Titandioxid, Hydroxylapatit, Dextran, Agarose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol oder anderen organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copolymeren der oben genannten Trägermaterialien besteht.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix ein oberflächlich modi fiziertes Chromatographiematerial aus Silicagel, Alumi niumdioxid, Titandioxid, Hydroxylapatit, Dextran, Aga rose, Acrylamid, Polystyrol, Polyvinylalkohol oder an deren organischen Polymeren, Derivaten oder aus Copoly meren der oben genannten Trägermaterialien ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächlich modifizierte Chromatographiemate rial ein Ionenaustauscher, ein Reversed-Phase- und/oder ein Affinitätschromatographiematerial ist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße der porösen Chroma tographiematerialien 20 bis 1000 nm und die Korngröße der Materialien 10 bis 2000 µm, vorzugsweise 75 bis 125 µm beträgt.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die die Matrix fixierenden Einrich tungen (3 a, 3 b) poröse Fritten sind mit Porengrößen von 10 µm bis 1 mm, vorzugsweise 70 bis 200 µm.

10. Verfahren zur Trennung und Reinigung von Molekülen aus einer Lösung durch Adsorption der Moleküle an eine Ma trix mittels einer Vorrichtung, in der die die zu tren nenden Moleküle enthaltende Lösung durch eine in einem Hohlkörper angeordnete Matrix hindurchgedrückt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (2) von einer oberen und einer unteren Einrichtung (3 a, 3 b) fixiert wird und daß die Lösung durch die Matrix (2) hindurch in einen oberhalb der oberen Einrichtung (3 a) vorhande nen freien Raum gesogen wird und anschließend durch die Matrix (2) hindurch aus dem Hohlkörper (1) gedrückt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß Biopolymere getrennt und gereinigt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleinsäuren und/oder Proteine getrennt und gereinigt werden.

13. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Trennung und Reinigung von Molekülen, vorzugs weise Biopolymeren.

14. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 13 zur Tren nung und Reinigung von Proteinen und/oder Nukleinsäu ren.