DE10247430A1

DE10247430A1 - Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten

Info

Publication number: DE10247430A1
Application number: DE2002147430
Authority: DE
Inventors: Veit Dr. Otto; Michael Dr. Zimmermann; Andrea Dr. Schön; Frank Dr. Hacket; Thomas Dr. Hartung
Original assignee: Fresenius Hemocare GmbH
Current assignee: Fresenius Medical Care Deutschland GmbH
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2004-04-29
Also published as: WO2004036212A2; WO2004036212A3; AU2003293601A8; AU2003293601A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten, einen Durchströmbehälter zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und die Verwendung bestimmter Trennelemente in einem Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten, einen Durchströmbehälter zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und die Verwendung bestimmter Trennelemente in einem Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten.
Flüssigkeiten, beispielsweise Wasser, wässerige Flüssigkeiten, biologische Flüssigkeiten, beispielsweise Sepsisblut, aber auch technische Flüssigkeiten, vor allem Flüssigkeiten, die mit dem menschlichen Körper in Berührung kommen oder stehen, können mit zellaktivierenden Komponenten, wie z.B. Pyrogen, zum Teil mit erheblichen Konsequenzen für daraus gefertigte Produkte belastet sein. Hierzu gehören z.B. Getränke, Infusions- und Injektionslösungen, Dialyseflüssigkeiten, Desinfektionslösungen, z.B. für die Reinigung von medizinischen Materialien, Spüllösung für gewerbliche Zwecke und für die Anwendung in der Medizin, z.B. zum Spülen des Bauchraums, der Hohlräume von Organen bei Operationen oder der Lunge zur Gewinnung von Bronchiallavagen, Flüssigkeitszusätze in klimatechnischen Anlagen zur Luftbefeuchtung oder Flüssigkeitsgemische, zur Kühlung von heißen Materialien während der Bearbeitung, z.B. in der Stahlindustrie.
Eine besondere Bedeutung hat aber die Abwesenheit von Pyrogen in injizierbaren Arzneimitteln (Parenteralia). Diese fieberinduzierenden Verunreinigungen, zu denen auch die Endotoxine gehören, stellen für den Menschen ein erhebliches Risiko dar. Im Extremfall bedeuten sie den Tod durch Schock. Im Kontakt mit immunkompetenten Zellen bewirken Pyrogene die Ausschüttung von Botenstoffen, die direkt auf das zentrale Thermoregulationszentrum im Gehirn einwirken. Die Pharmakopöe schreibt zwei Testsysteme zur Pyrogendetektion vor:

1. den in vivo Kaninchen-Pyrogen-Test, der nach Injektion der Prüfsubstanz die Erhöhung der Körpertemperatur ermittelt, und
2. den in vitro Limulusamöbozytenlysattest (LAL), der die Koagulation eines aus dem Blut des Pfeilschwanzkrebses gewonnenen Lysates mißt, ausgelöst durch das Endotoxin, eines Zellwandbestandteiles gramnegativer Bakterien.

Die gegenwärtig in der Pharmakopöe vorgeschriebene Pyrogentestmethode ist begrenzt auf den Nachweis in Parenteralia (Kaninchentest: biologische und pharmazeutische Arzneimittel; LAL: hauptsächlich pharmazeutische Arzneimittel). Die Prüfung von medizinischen Materialien ist im EU-Gesetz für Medizinprodukte seit 1995 geregelt und schreibt neben dem LAL-Test den Kaninchentest vor. Der Pyrogennachweis sollte darüber hinaus Medizinprodukte wie Implantate, medizinische Materialien, Dialyseprodukte, zelluläre Therapeutika und spezifische Therapeutika wie rekombinante Proteine einschließen.

Um den Kaninchen-Pyrogen-Test, welcher der Arzneimittelsicherheit 50 Jahre gedient hat (Flint, 1984, Alternatives to Animal Testing, New Ways in the Biomedical Science, Trends and Progress (27 – 43), Weinheim, VCH), zu ersetzen, wurde ein neuer Pyrogentest entwickelt (Hartung und Wendel, 1995, ALTEX 12, 70-75; Fennrich et al., ALTEX 16, 164-149). In diesem Test wird die zu überprüfende Substanz mit einer geringen Menge von Blut eines gesunden Spenders inkubiert. Unabhängig von ihrer chemischen Natur induziert jede pyrogenische Aktivität die Bildung von Interleukin-1β (IL-1β), dessen Konzentration durch ELISA bestimmt werden kann.

Die bekannten Verfahren weisen einige Nachteile auf. Der Kaninchen-Pyrogen-Test ist aufgrund des Tierverbrauchs sehr teuer, auch ist es aus ethischen Gründen wünschenswert, seinen Einsatz zu beschränken. Außerdem ist die Selektivität des Tests unbefriedigend, da er auch auf Exotoxine anspricht. Der LAL-Test stellt auch keine befriedigende Alternative dar, da der Nachweis von Endotoxinen im Sepsisblut oder -plasma durch verschiedene Störfaktoren verfälscht wird. Es besteht beispielsweise eine deutliche Anfälligkeit gegen Störfaktoren wie Glucane aus Pilzinfektionen. Weiterhin wird z.B. in Anwesenheit von Cellulose eine Aktivierung des Test beobachtet. Bemühungen, den Einfluß der Störfaktoren zu unterdrücken, führen in der Regel zu deutlichen Einbußen in der Empfindlichkeit. Außerdem ist ein selektiver Nachweis von Endotoxinen nicht möglich. Der LAL-Test hat ferner den Nachteil, daß ebenfalls tierisches Material verwendet wird. Auch die bekannten Pyrogen-Tests, die auf Inkubation mit Vollblut basieren, weisen einige Nachteile auf. Zum einen kann es zu Interferenzen zwischen Probenmatrix und Vollblut kommen, was zu falsch positiven Resultaten führen kann. Zum anderen ist die Sensitivität der Methode nicht immer befriedigend. Außerdem ist auch diese Methode nicht in der Lage, zwischen Exo- und Endotoxinen zu unterscheiden.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Verfahren zu überwinden, also ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxin in Flüssigkeiten bereitzustellen, welches in vitro ohne Beteiligung von Versuchtstieren durchgeführt werden kann, das überdies Störeinflüsse durch die Probenmatrix minimieren und eine höhere Sensitivität aufweisen soll. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur selektiven, das heißt von Exotoxinen unverfälschten Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere wird ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxin in Flüssigkeiten bereitgestellt, was die folgenden Schritte umfaßt:

(b) Inkontaktbringen der Flüssigkeit mit einem oder mehreren Trennelement(en), die ein Trägermaterial umfassen, auf das ein Bindungsprotein für Endotoxine immobilisiert ist;
(c) Trennung von Flüssigkeit und Trennelement(en); und
(d) Bestimmung der Menge an Endotoxin, die in Schritt (b) an das Bindungsprotein gebunden worden ist.

Zu den Beispielen Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung gehören allgemein fließfähige Medien, insbesondere niedriger und mittlerer Viskosität, newtonsche Flüssigkeiten und Sole. Bevorzugt sind Wasser, wässerige Lösungen, Emulsionen, Dispersionen und Suspensionen. Die Flüssigkeiten können biologischer Herkunft sein, wie Urin, Blut, flüssige Blutbestandteile, wie Serum oder Plasma oder andere Körperflüssigkeiten wie Speichel, Lymphe, Cerebrospinalflüssigkeit und ähnliches.

Der Begriff "Endotoxin" unterliegt keinerlei Einschränkung und umfaßt im Rahmen der Erfindung alle Verbindungen, die sowohl einen Zucker als auch eine lipophile Gruppe aufweisen und bei Menschen einen phänotyp hervorrufen können, der SIRS ("Systemic Inflammatory Response Syndrome") genannt wird und der sich durch mindestens zwei der folgenden Symptome auszeichnet:

(i) Körpertemperatur > 38 °C oder < 36 °C;
(ii) Steigerung des Herzschlags (> 90 Schläge pro Minute);
(iii) Tachypnoe (Rate >20/min) oder Hyperventilation (Pa_CO2 > 32 mm Hg);
(iv) Leukocyten > 12.000/mm³ oder < 4.000/mm³ oder > 10 % unnreife Neutrophile.

Bevorzugt handelt es sich bei den Endotoxinen um Bestandteile der Zellwand gram-negativer Bakterien. Zumindest sind die Endotoxine in der Regel solchen Bestandteilen nachempfunden. Bevorzugte Endotoxine haben ein großes Molekulargewicht (zwischen 20.000 und 100.000) und/oder sind hitzestabil. Diese Endotoxine bestehen aus Lipid A (einem Glycosamin, welches mit C₁₀-C₂₀-Fettsäuren verestert ist) einem Kohlenhydratkern und dem Polysaccharid-O-Antigen (sich wiederholende Sequenzen linearer oder verzweigter Oligosaccharide, deren Kettenlänge zwischen den Bakterienstämmen schwankt). Das isolierte Lipid A kann auch allein ohne Kohlenhydratkern und dem Polysaccharid-O-Antigen als Endotoxin angesehen werden und stellt im Rahmen der Erfindung eine besonders bevorzugtes Endotoxin dar.

Trennelemente sind inerte, oder im wesentlichen inerte Materialien und Vorrichtungen, welche imstande sind, aus der. Flüssigkeit eventuell darin enthaltene Endotoxine in einem für den Nachweis ausreichenden Umfang zu binden und zurückzuhalten, also abzutrennen.

Im Rahmen der Erfindung können sowohl ein monolithisches Trennelement als auch eine Vielzahl von Trennelementen (beispielsweise entsprechend behandelte Polymerbeads) zur Anwendung kommen.

Die Trennelemente umfassen ein Trägermaterial auf das mindestens ein Bindungsprotein für Endotoxine immobilisiert ist. Es können auch mehrere verschiedene Bindungsproteine auf dem Trägermaterial immobilisiert sein. Die Dissoziationskonstante des immobilisierten Bindungsproteins kann wesentlich geringer als im nicht immobilisierten Zustand sein.

Im Rahmen der Erfindung können als Bindungsproteine zum Beispiel eingesetzt werden:

- BPI (bactericidal/permeability increasing protein), (Evans, T.J. et al. J. Infect. Dis. 171, 153–160; Ganzzano-Satoro, H. et al. Infect. Immun. 63, 2201–2205; Elsbach P. et al.. Prog. Clin. Biol. Res. 388, 41–51)
- LBP (lipopolysaccharide binding Protein), (Tobias P. S. et al. J. Biol. Chem. 263, 13479–13481)
– CD14 Zellrezeptor von Makrophagen/Monocyten, (Kirikae T. et al. FEMS Immunol Med Microbiol 8, 13–26)
– Faktor C (endotoxin neutralizing protein) aus dem Lysat von Limulus polyphemus. (Obayashi et al. Clina Chimca Acta 149, 55–56)
– Serumalbumin
– A1-Adenosinrezeptor (WO 97/44665)
– EGFP (Enhanced green fluorescence protein) (Goh et al. Protein engineering 15 (2002) 493)
– SAP (Serum amyloid P component) (WO 98/16556, WO 99/55731)

Das Trägermaterial kann selbst Wechselwirkungen mit den abzutrennenden mikrobiologischen Toxinen wechselwirken, z.B. durch Sorption, insbesondere durch Adsorption, durch Mikrofiltration oder durch Molekularsieb-Effekte. Das Trägermaterial ist jedenfalls so auszuwählen, daß eine Immobilisierung von Proteinen möglich ist. Das Trägermaterial ist vorzugsweise porös, wobei die Porengröße so ausgewählt ist, daß die für den Stoffaustausch zur Verfügung stehende Oberfläche vergrößert wird, ohne daß in dem Trägermaterial bei Durchströmen mit der Flüssigkeit ein zu großer Gegendruck aufgebaut wird. Unter Immobilisierung des Proteins auf dem Trägermaterial wird eine kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkung verstanden, die bevorzugt unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens irreversibel ist. Ein Beispiel für eine nicht kovalente Immobilisierung wäre eine Immobilisierung durch Biotin/Streptavidin. Die kovalente Immobilisierung ist bevorzugt. Diese erfolgt bevorzugt über ein oder mehrere Carboxylgruppen des Proteins, wie in EP-B1-0 858 831 beschrieben, zum Beispiel unter Verwendung von Carbodiimid als Kopplungsreagenz.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Flüssigkeit vor Schritt (b) in Schritt (a) mit einer Protease inkubiert. Dieser Schritt bewirkt den proteolytischen Abbau endotoxinbindender Proteine, z.B. den Abbau von Serumalbuminen, LBP, sCD14, und/oder BPI, soweit in der Flüssigkeit vorhanden, was vor allem bei biologischen Flüssigkeiten, insbesondere bei Serum der Fall ist. Damit ist es nun erstmals möglich, die Maskierung der Endotoxine durch in der Flüssigkeit vorhandene Proteine zu vermeiden und auf diese Weise die Empfindlichkeit des Verfahrens zu verbessern und ggf. gleichzeitig die Linearität zwischen Endotoxinmenge und Meßsignal in Schritt (d) zu erhöhen. Weiterhin ist es bevorzugt, die Protease nach erfolgter Inkubation zu inaktivieren. Dies hat den Vorteil, daß die Protease nicht die Bindungsproteine, die auf den Trennelementen immobilisiert sind, angreift, wenn in Schritt (b) die Flüssigkeit mit den Trennelementen in Kontakt gebracht wird. Eine besonders günstige Wahl stellt Proteinase K als Protease dar.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Bindungsprotein Serumalbumin oder ein Fragment davon, wobei letzteres so gewählt ist, daß die Bindungsfähigkeit für Endotoxine erhalten bleibt also die Dissoziationskonstante um nicht mehr als 1,5 Größenordnungen, vorzugsweise um nicht mehr als eine Größenordnung, insbesondere nicht mehr als 50% ansteigt. Ein Fragment des Serumalbumins kann durch proteolytischen Verdau des intakten Proteins entstehen oder mit Hilfe von gentechnologischen Verfahren. Bevorzugt weist das Serumalbumin die Primärstruktur des Humanserumalbumins auf.

Serumalbumin hat die vorteilhafte Eigenschaft, Endotoxine selektiv zu binden, so daß ein selektiver Nachweis von Endotoxinen ermöglicht wird, auch wenn die Probe zusätzlich Exotoxine enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Serumalbumin über ein oder mehrere Carboxylgruppen immobilisiert, wobei die Immobilisierung bevorzugt über eine kovalente Bindung besteht. Über Carboxylgruppen an Polymerbeads immobilisiertes humanes Serumalbumin bindet LPS aus beispielsweise gesundem Plasma um den Faktor 2,5 besser als über Aminogruppen immobilisiertes humanes Serumalbumin (HSA). Diese Erhöhung der Affinität für LPS basiert u.a. auf der Verschiebung des isoelektrischen Punktes als Folge der Immobilisierung des (humanen) Serumalbumins über Carboxylgruppen.

Die bevorzugten Trennelemente sind mit Serumalbumin beschichtete Polymerbeads, vorzugsweise Acylharzbeads, wie in der Patentschrift EP-B 0 858 831 beschrieben, auf die vollinhaltlich Bezug genommen wird. Dabei ist das Serumalbumin bevorzugt kovalent immobilisiert.

Bevorzugt weist das Trennelement eine Kapazität von mehr als 1,5 ng LPS pro ml Trennelement, bevorzugt von mehr als 2 ng/ml, insbesondere von etwa 2,5 ng/ml auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Trägermaterial porös und/oder dispergierfähig. Als Trägermaterial eignen sich alle Stoffe, auf die sich Proteine immobilisieren lassen, wie Filterpapiere oder Filtervliese, vorzugsweise mit einem Gehalt an organischen Fasern, oder Polymerbeads. Bevorzugte Trägermaterialien sind organische Polymerpartikel, insbesondere Polyacrylbeads, mit einem (mittleren) Durchmesser von vorzugsweise 10 bis 500 μm, besonders bevorzugt von 100 bis 300 μm, vor allem von etwa 200 μm, die bevorzugt porös sind. Bei den Trägermaterialien kann es sich auch um Gele und Membranen handeln. Dabei wird die Porosität bevorzugt so gewählt, daß die Oberflächenvergrößererung infolge der Porosität mindestens etwa 500 beträgt, insbesondere etwa 1000.

Als Trägermaterial kommt insbesondere Kunststoffe in Frage, nämlich Polyacrylate, Polymethacrylate, Polysulfon, Polyethersulfon, welche als funktionelle Gruppe Amine oder Amide tragen. Daneben sind auch als Trägermaterial Zellulose, Zelluloseester, Aggarose, Polytetrafluorethylen, Polycarbonat, oder Glasfasern, Keramik oder Metall denkbar. An Metall lassen sich Proteine durch Thiolgruppen immobilisieren, ähnliche Immobilisierungsmethoden existieren für die anderen genannten Trägermaterialien.

Wie bereits erwähnt kann das Trägermaterial selbst mit. den Endotoxin wechselwirken und die Funktion eines Filters oder Molekularsiebs ausüben. Die Porengrößen eines Filters betragen in der Regel 0,2 bis 20 μm. Zur Anstellung der gewünschten Verhältnisse von Filtratgeschwindigkeit und Scheidefähigkeit kann mit Druckfiltration gearbeitet werden. Je nach Viskosität des Fluids und der Art und Menge des erwarteten Toxins wird vorzugsweise mit Porengrößen von 1 bis 10 μm, insbesondere von 3 bis 8 μm gearbeitet. Bei Flüssigkeiten haben sich zum Teil auch Filter mit größeren Poren bewährt, wobei in jedem Falle auch die Teilchengröße des zu erwartenden Endotoxins zu berücksichtigen ist. Die Filterwirkung des Trägermaterials unterstützt in diesem Falle die endotoxinrückhaltenden Eigenschaften des auf dem Trägermaterial Bindungsproteins.

Nachdem die Endotoxin enthaltende Flüssigkeit mit den Trennelementen in Kontakt gebracht worden ist, müssen die Trennelemente von der Flüssigkeit in Schritt (b) wieder abgetrennt werden, wobei die Endotoxine von den Trennelementen zurückgehalten werden. Insbesondere in den Fällen, in welchen das Trägermaterial in der Flüssigkeit dispergierfähig ist, bietet sich die Abtrennung durch Wirkung der Schwerkraft an. Dies kann durch Sedimentation oder Zentrifugation erfolgen. Im übrigen können das Inkontaktbringen gemäß Schritt (b) und Trennung gemäß Schritt (c) auch in einem Verfahrensschritt erfolgen, indem zum Beispiel die Flüssigkeit nach Art der Affinitätschromatographie durch die Trennelemente oder durch das Trennelement hindurch geführt wird, wobei die das Trennelement oder die Trennelemente die Affinitätssäule darstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Trennung in Schritt (c) durch Inkontaktbringen des Trennelements oder der Trennelemente mit einer geeigneten Waschlösung vervollständigt. Bei der Waschlösung handelt es sich vorzugsweise um eine isotonische Lösung (z.B. 0,9 NaCl) und mehr bevorzugt um die sogenannte "Priming"-Lösung, welche Na⁺-, K⁺-, Cal⁺-, Mg² ⁺-, Cl^–- und HCO^– ₃-Ionen enthält (z.B. Na⁺ 134; K⁺ 4; Ca² ⁺ 1,75; Mg² ⁺ 0,5; Cl^– 106,5; HCO₃ ^– 36; Konzentrationsangaben in mmol/l).

In Schritt (d) erfolgt die Bestimmung der Menge an Endotoxin, die in Schritt (b) an das Bindungsprotein gebunden worden ist. Die Bestimmung unterliegt keiner bestimmten Einschränkung und kann im allgemeinen mit jeder im Stand der Technik bekannten Methode durchgeführt werden. Beispielsweise erfolgt dies dadurch, daß das Trennelement oder die Trennelemente einem Vollblut-Inkubationsverfahren unterzogen werden und die dabei gebildeten Mediatoren bestimmt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem Schritt (d) die folgenden Schritte umfaßt:

(d1) Durchführung eines Vollblut-Inkubationsverfahren mit dem Trennelement oder den Trennelementen, wobei entsprechend der Menge des in Schritt (b) gebundenen Endotoxins Mediatoren gebildet werden;
(d2) Bestimmung Menge eines oder mehrerer der in Schritt (c1) gebildeten

Mediatoren sind endogene Pyrogene, also inflammatorische Botenstoffe, welche in der Reaktion auf exogene Pyrogene die Fieberantwort einleiten. Bei den Zellen, welche die Mediatoren ausschütten, handelt es sich hauptsächlich um Monozyten. Zu den Mediatoren gehören IL-1, insbesondere IL-1β, IL-6, Tumor Nekrose Faktor (TNF), Prostaglandin E₂, NO und Neopterin.

Unter Vollblut-Inkubationsverfahren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verfahren verstanden, wie sie in EP-A-0 741 294 und/oder EP-A-0 851 231 beschrieben sind und die durch diese ausdrückliche Bezugnahme Inhalt der vorliegenden Beschreibung sind. Im übrigen wird auf folgende Textstellen verwiesen: Fennrich (1999) ALTEX 16, 146–149; Hartung, T. und Wendel, A. (1995) ALTEX 12, 70–75; Hartung, T. und Wendel, A. (1996), In Vitro Toxicology 9, 953–359; Fennrich, S. et al. (1998) ALTEX 15, 123–128.

Im allgemeinen kann die Bestimmung der Menge an Endotoxin, die in Schritt (b) an das Bindungsprotein gebunden worden ist, neben dem Vollblut-Inkubationsverfahren durch eines der beispielhaft aufgeführten folgenden Verfahren erfolgen:

– Bestimmung mit Hilfe des LAL-Tests, wobei durch die erfindungsgemäß durchgeführte selektive Abtrennung der Endotoxine die vorstehend genannten Störeinflüsse vermieden werden können.
– Bestimmung mit Hilfe von Monocytenzellkulturen. Hierbei werden nach der erfindungsgemäß durchgeführten selektiven Abtrennung der Endotoxine Monocytenzellkulturen mit dem zur Abtrennung verwendeten Bindungsprotein, das zum Beispiel auf Beads immobilisiert sein kann, in Kontakt gebracht. Die Monocytenaktivierung wird mit Antikörpern, die gegen Oberflächenproteine der Zellen gerichtet sind, im Durchflußcytometer oder mit ELISA bestimmt.
– Markierung der Endotoxine auf der Oberfläche der Trennelemente durch geeignete Bindungsproteine. Es können beispielsweise BPI, LBP, CD14, Faktor C, Serumalbumin, A1-Adensosinrezeptor, EGFP, SAP oder Antikörper markiert werden (z.B. mit einer fluoreszierenden oder radioaktiven Markierung) und mit dem zur Abtrennung verwendeten immobilisierten Bindungsprotein in Kontakt gebracht werden, wobei eine Markierung der Endotoxine auf der Oberfläche der Trennelemente erfolgt. Nach Entfernung der markierten Bindungsproteine, die nicht Endotoxin gebunden haben, kann die Endotoxinmenge mit Hilfe der Markierungsintensität bestimmt werden, was z.B. durch ein Cytometer oder durch ein Fluoreszenzmeßgerät erfolgen kann.

Der Bestimmung der Endotoxinmenge kann eine Trennung von Endotoxin und den Trennelementen und ggf. von den Bindungsproteinen vorausgehen, wobei in diesem Fall die Bestimmung des abgetrennten Endotoxins dann zum Beispiel durch Zellaktivierung (zum Beispiel mit Hilfe der oben erwähnten Monocytenkulturen) oder mit markierten Bindungsproteinen (siehe den vorangegangenen Abschnitt) oder mit Antikörpern oder ggf. rekombinanten Antikörperfragmenten kompetitiv oder in der Sandwich-Anordnung erfolgen kann.

Die Erfindung betrifft ferner einen Durchströmbehälter (1), umfassend Zufuhr- und Austrittsöffnung und zwischen Zufuhr- und Austrittsöffnung im Durchströmbereich angeordnet ein oder mehrere Trennelemente (3), die aus einem Trägermaterial bestehen, auf das ein Bindungsprotein für Endotoxine immobilisiert ist.

Die Flüssigkeit durchströmt zur Abtrennung der Endotoxine den Durchströmbehälter, wobei die Trennelemente und das daran gebundene Endotoxin zurückgehalten werden. Die Trennelemente sind dabei lösbar oder unlösbar im Durchströmbehälter angeordnet. Bei Trennelementen, die mit dem Durchströmbehälter lösbar verbunden sind, hat es sich bewährt, wenn sich die Trennelemente als Segmente in einem Rahmen, z.B. aus Polystyrol, befinden. Die Verwendung solcher Segmente hat dank der Austauschbarkeit derselben den Vorteil der mehrfachen Verwendbarkeit eines Durchströmbehälters. Insbesondere bei der Verwendung flüssiger Medien, wie Blut oder Blutbestandteilen, hat sich eine lösbare Anordnung von Trennelementen mit einem Trägermaterial (ggf. auf Basis eines Austauscherharzes) als vorteilhaft erwiesen, da diese nach Erschöpfung der Aufnahmekapazität der Trennelemente dem Durchströmgerät zur Inkubation in einem Inkubationsgefäß (und gegebenenfalls zur Regeneration) entnommen werden können. Der Durchströmbehälter selbst ist meist rohr-, trichter- oder kastenartig aus inertem Material, wie Kunststoff oder Metall mit einem ovalen, rechteckigen, kreisrunden, mehreckigen oder beliebigen anderen Querschnitt, wobei die Größe der Querschnittsfläche im Bereich der Trennelemente vor allem von der Viskosität des Prüfmediums, der vorgesehenen Durchsatzmenge, von der vorbestimmten Durchsatzgeschwindigkeit (Filtrationsgeschwindigkeit), der erwarteten Art und möglichen Konzentration der Endotoxine, ob im Haupt- oder Nebenstrom, und dergleichen bestimmt ist.

Die Filtrationsgeschwindigkeit und -menge des Flüssigkeitsstroms kann nach dem Prinzip der Druckfiltration durch Pumpen oder durch Saugen und z.B. bei Flüssigkeit durch Ausnutzung der Schwerkraft durch den Durchströmbehälter in Abhängigkeit von der Querschnittsfläche und der Schicht- bzw. Filterkuchendicke des Trennelements vorbestimmt werden. So wird auch bei einem fließfähigen Medium unterhalb der Nachweisgrenze liegender bzw. extrem niedriger Endotoxin-Konzentration auf dem Wege der Anreicherung überhaupt noch ein Endotoxinnachweis bzw. ein sicherer Nachweis ermöglicht.

Durch Messung der Durchflußmenge kann bei quantitativer Abtrennung der Endotoxine durch Bindung an das Bindungsprotein (gegebenenfalls in Verbindung mit Mikro- oder Ultrafiltration) die Konzentration an Endotoxin in der Flüssigkeit, z.B. im Blut oder Serum, bestimmt werden.

Unter Durchströmbehälter im vorliegenden Sinne werden z.B. auch Zwei-Kammer-Sammelbehälter verstanden, deren beide Kammern durch ein Trennelement getrennt sind. Sie können nach Beschickung einer Kammer vor allem für die Untersuchung von Flüssigkeiten verwendet werden, beispielsweise unter Ausnutzung der Schwerkraft als Durchströmungshilfe. Gegenstand des Verfahrens ist demgemäß auch ein Durchströmungsbehälter mit mindestens zwei Öffnungen, einer Zufuhröffnung und einer Austrittsöffnung sowie mit damit lösbar oder unlösbar verbundenen Trennelementen zur Abtrennung von Endotoxinen, wobei das Trennelement im Durchströmungsbereich zwischen der Zufuhr- und der Austrittsöffnung angeordnet ist. Vorzugsweise ist das Trennelementldie Trennelemente im wesentlichen senkrecht zur Haupt-Durchströmungsrichtung und/oder so angeordnet, daß eine Zwangsdurchströmung des Trennelements erzielt wird, z.B. durch eine Erstreckung des Trennelements im wesentlichen über den ganzen Querschnittsbereich des Durchstrombehältnisses im Bereich des Sitzes des Trennelements. Insbesondere weist der Durchstrombehälter im jeweiligen Öffnungsbereich (Zufuhröffnung, Austrittsöffnung) Dichtungselemente auf, die ein toxin-undurchlässigen Verschluß, z.B. mit Kappen oder anderen Deckelverschlüssen gewährleisten. Zum Verschluß der Öffnungen sind den Öffnungen angepaßte, gegebenenfalls Dichtungselemente aufweisende Deckel vorgesehen. Ein besonderer Vorteil liegt darin, daß die Abtrennung der Endotoxine und das Vollblut-Inkubationsverfahren in demselben Behälter durchgeführt werden kann, so daß Handhabungsprobleme, die beim Behälterwechsel entstehen könnten, entfallen. Es ist ohne weiteres möglich, zunächst die mikrobiologischen Toxine aus dem Fluid abzutrennen und anschließend den Durchstrombehälter durch dafür vorgesehene Deckel zu verschließen und an mikrobiologische Fachlabors zur Untersuchung zu verschicken.

Zur Untersuchung auf Endotoxine werden die Trennelemente oder das Trennelement zunächst mit der Endotoxin enthaltenden Flüssigkeit in Schritt (b) in Kontakt gebracht, die vorzugsweise zuvor mit einer Protease inkubiert worden war. Anschließend wird in Schritt (c) die Flüssigkeit von den Trennelementen oder dem Trennelement getrennt, wozu ggf. auch ein Waschritt gehören kann. Schließlich werden die Trennelemente oder das Trennelement in Schritt (c) mit Vollblut enthaltenden Zubereitungen inkubiert und auf an sich bekannte Weise, z.B. mit Hilfe des ELISAs bzw. RIAs auf die Bildung von Mediatoren, insbesondere auf IL-1, vor allem auf IL-1β, ferner auf IL-6, TNF, Prostaglandin E₂, NO und/oder Neopterin, untersucht.

Tierisches oder menschliches Vollblut, wie z.B. frisch gewonnenes, gegebenenfalls verdünntes Blut gesunder menschlicher Spender kann dabei ohne Trennung von Einzelkomponenten eingesetzt werden. Der Einsatz von Säugetierblut ist bevorzugt, insbesondere der von humanem Vollblut. Die Leukozyten liegen so in ihrer natürlichen Zusammensetzung und Umgebung vor. Dies gilt insbesondere auch für die Monozyten, die hauptsächlich die Mediatoren freisetzen. Gleichzeitig sind die Serumkomponenten anwesend, die auf die Wirkung eines Toxins Einfluß haben könnten. Das Vollblut enthält in der Regel gerinnungsverzögernde oder gerinnungshemmende Bestandteile, wie Zitrat, so z.B. in einer Endkonzentration von 0,38%, oder Heparin, wie Na-Heparin oder Heparin-Fraktionen, wobei die Erkenntnis wichtig ist, daß die gerinnungsverzögernden oder -hemmenden Bestandteile auch die Inkubationsreaktion nicht beeinträchtigen oder gar verfälschen. Eine Verdünnung der Vollblutzubereitung, z.B. mit isotonischen Lösungen oder mit einem Zellkulturmedium, beispielsweise mit RMPI 1640 oder z.B. mit einer physiologischen Kochsalzlösung (20%ige Verdünnung) ist von Vorteil. Vorsorglich können Antibiotika, wie Penicillin oder Streptomycin, ohne Störung der Reaktion zugegeben werden. Die Inkubation wird bei erhöhten Temperaturen, vorzugsweise im Bereich von 35 bis 38°C über einen Zeitraum von ca. 2 bis 24 Stunden durchgeführt. Bei der Durchführung der Vollblut-Inkubation ist auf den Ausschluß von störenden Kontaminationen von Gerät und Reagenzien zu achten.

Zur Positivkontrolle können Preparationen von gram-negativen und gram-positiven Bakterien, wie Endotoxin und Lipoteichonsäure, zur Negativkontrolle z.B. pyrogenfreie physiologische Kochsalzlösung verwendet werden.

Nach dem Vollblutinkubationsverfahren wird die körpereigene Primärreaktion der Bildung von Mediatoren auf Gabe von Endotoxin zur Untersuchung herangezogen. Es sind alle Blutkomponenten vorhanden, die gegebenenfalls für eine Interaktion der Toxine mit Leukozyten notwendig sind, z.B. LPS-bindendes Protein LBP, bakterizides Permeabilitäts-erhöhendes Protein BPI, lösliches CD14, Definsine, usw. Das Vollblut-Inkubationsverfahren kann im übrigen auch mit dem Vollblut von Betroffenen mit einer Flüssigkeit, das aus dem individuellen Umfeld stammt, durchgeführt werden. So kann bei Applikation einer definierten Endotoxinmenge die individuelle Empfindlichkeit festgestellt und ein überempfindlicher Patient identifiziert werden.

Für Reihenprüfungen oder Vergleichsprüfungen über gewisse Zeiträume hat sich aus Gründen der Standardisierbarkeit die Verwendung von tiefgefrorenem Blut bzw. von kollektiven tiefgefrorenen Blutes in Form standardisierter Bluteinheitsdosen bewährt ( EP-A 0 951 231 ).

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann z.B. mit Vollblutzubereitung gearbeitet werden aus 8 ml physiologischer Kochsalzlösung von klinischer Qualität und 2 ml heparenisiertem Vollblut (Blutabnahme mit 7,5 ml heparinisierten Monovetten, Firma Sarstedt) von gesunden Spendern. Die mit Vollblut-Zubereitung bestückten Durchstrombehälter werden im Inkubationsschrank z.B. bei 37°C, 5% CO₂ über Nacht (18 – 24 Stunden) inkubiert. Die inkubierte Lösung kann mit einer Pipette gut aufgemischt, in sterile Flakonröhrchen überführt und z.B. zwei Minuten bei 4000g und Raumtemperatur zentrifugiert werden. Die dabei gebildeten Überstände werden gegebenenfalls in der Kälte zwischengelagert. Anschließend erfolgt beispielsweise durch ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) oder durch RIA (radioimmuno assay) oder durch ähnliche Verfahren unter Verwendung monoklonaler oder polyklonaler, gegebenenfalls rekombinanter Antikörper die Bestimmung der Menge an gebildetem Mediator.

Die Figuren zeigen:
1 zeigt einen Vergleich der IL-1-Meßwerte, die mit unbehandeltem Sepsis-Plasma und mit einer Protease inkubiertem Sepsis-Plasma erzielt wurden. Die mit unbehandeltem Sepsis-Plasma erzielten Werte sind mit gefüllten Quadraten gekennzeichnet. Die Werte, die mit Sepsis-Plasma erzielt worden sind, das zuvor mit einer Protease inkubiert wurde, sind mit gefüllten Dreiecken gekennzeichnet. Abszisse: pg/ml LPS; Ordinate: pg/ml IL-1. Die Fehlerbalken beziehen sich auf die Standardabweichungen bei 3-fach-Bestimmungen.
2 zeigt einen Vergleich der IL-6-Meßwerte, die mit unbehandeltem Sepsis-Plasma und mit einer Protease inkubiertem Sepsis-Plasma erzielt wurden. Abszisse: pg/ml LPS; Ordinate: pg/ml IL-6. Ansonsten entspricht die Legende der 1. Die Fehlerbalken beziehen sich auf die Standardabweichungen bei 3-fach-Bestimmungen.
3 zeigt beispielhaft einen erfindungsgemäßen Durchströmbehälter. Der dargestellte, gegenüber bevorzugt verwendeten Behältern etwa 5 bis 10-fach vergrößerte Durchströmbehälter 1 weist ein im wesentlichen zylindrischen Mantel 2, ein Trennelement 3 zwischen der unten befindlichen Zufuhröffnung und der oben erkennbaren Austrittsöffnung sowie als Mittel für den Toxin-undurchlässigen Verschluß die Deckel 4 und 5 auf. Die Durchflußrichtung für das Fluid verläuft im wesentlichen achsparallel zur Zylinderachse. Das Trennelement, das ein- oder mehrstückig sein kann, ist in 3 einstückig ausgeführt, wodurch die Entnahme des Trennelements erleichtert wird.
Die vorliegende Erfindung wird nun in bezug auf Beispiele näher erläutert, welche in keiner Weise eine Beschränkung des erfindungsgemäßen Gegenstandes darstellen.
Beispiele
Vorbereitung der Matisse-beads
5 ml Matisse-Beads (Fresenius Hemocare) werden in 50 ml-Falcon-Röhrchen überführt und mit 0,9% NaCl auf 50 ml Gesamtvolumen überschichtet. Unter gelegentlichem Schwenken werden die Beads ca. 10 Minuten gewaschen.
Durch Zentrifugation (2 Minuten 3000 rpm Heraeaus varifuge, ~ 2100 g) werden die Beads sedimentiert und der Überstand komplett abgenommen.
Die Beads werden nun mit Priming-Lösung überschichtet (Fresenius Hemocare) und unter gelegentlichem Schwenken mind. 10 Minuten equilibriert. Nach erneuter Zentrifugation (2 Minuten 3000 rpm Heraeus varifuge, ~ 2100 g), wird durch Abnahme eines Teils des Überstandes das Gesamtvolumen auf 10 ml reduziert. Anschließend werden 2% DMSO (Sigma, "zellkulturgetestet") hinzugegeben und vermischt.
Inkontaktbringen der Matisse-Beads mit Plasmaproben, die unterschiedliche Mengen an Endotoxin enthalten
Je 100 μl Suspension der vorbereiteten Beads werden mit 100 μl Plasmaproben im 2 ml-Eppendorfgefäß gemischt. Die Beads werden entweder mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze (steril & pyrogenfrei) oder mit einer Eppendorf Multipette (ebenfalls steril und pyrogenfrei mit abgeschnittener Spitze) aliquotiert.
Mit Endotoxin versetzte Plasmaproben
Plasma von 5 Spendern (A-E) wird durch Zentrifugation (10' ~ 2100 g) aus Li-Heparin-Blut (Sarstedt, "Monovette") gewonnen. Ein Teil hiervon wird in Aliquots bei –80°C gelagert und als Nullkontrollen verwendet.
Der Rest wird zu gleichen Teilen gemischt und mit LPS von E. coli 0-113 versetzt (0, 12.5, 25, 50, 100 und 200 pg/ml) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit soll gelöstes LPS von Bindungsproteinen so gebunden werden wie dies in physiologischer Weise auch geschieht. Die Aliquots werden bei –80°C gelagert.
Probenvorbreitung
Das Plasmaproben werden auf der Laborbank aufgetaut.
Komponenten des Komplement-Systems werden durch 30 Minuten Inkubation bei 56°C inaktiviert. Anschließend wird 1 Minute gevortext und abzentrifugiert (2 Minuten 6000 upm, Heraeus pico oder fresco, entspricht ~ 2100 g). Je 100 μl Überstand werden in ein 2 ml-Eppendorfgefäß überführt.
Sofern ein Protease-Inkubation stattfinden soll, werden die Proben mit 0,8 mg/ml Proteinase-K inkubiert (16h bei 37°C), anschließend 15' bei 95°C inaktiviert.
Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 gezeigt. Man erkennt, daß die Protease-Inkubation die Empfindlichkeit des Meßsystems für Endotoxine erhöht. Es wird gepooltes Plasma von verschiedenen Sepsispatienten gemessen. Von diesem Poolplasma werden zusätzlich noch Aliquots gemessen, die mit LPS Spikes unterschiedlicher Konzentration angereichert sind. Die Spikekonzentrationen entsprechen den auf der Abszisse angegebenen Werten.

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxin in Flüssigkeiten, umfassend folgende Schritte (b) Inkontaktbringen der Flüssigkeit mit einem oder mehreren Trennelement(en), die ein Trägermaterial umfassen, auf das ein Bindungsprotein für Endotoxine immobilisiert ist; (c) Trennung von Flüssigkeit und Trennelement(en); und (d) Bestimmung der Menge an Endotoxin, die in Schritt (b) an das Bindungsprotein gebunden worden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flüssigkeit vor Schritt (b) in einem Schritt (a) mit einer Protease inkubiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei in Schritt (a) die Protease nach erfolgter Inkubation inaktiviert wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei es sich bei der Protease um Proteinase K handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Trennelemente Schritt (c) mit einer isotonischen Lösung oder mit einer Lösung, enthaltend Na⁺-, K⁺-, Ca² ⁺-, Mg² ⁺-, Cl^–- und HCO₃ ^–-Ionen, gewaschen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Flüssigkeit eine biologische Flüssigkeit ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die biologische Flüssigkeit Blut ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die biologische Flüssigkeit Sepsisplasma ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Schritt (d) die folgenden Schritte umfaßt (d1) Durchführung eines Vollblut-Inkubationsverfahren mit dem Trennelement oder den Trennelementen, wobei entsprechend der Menge des in Schritt (b) gebundenen Endotoxins Mediatoren gebildet werden; (d2) Bestimmung Menge eines oder mehrerer der in Schritt (c1) gebildeten Mediatoren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Bindungsprotein Serumalbumin oder ein Fragment davon ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Serumalbumin die Primärstruktur des Humanserumalbumins aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Protein ein Antikörper oder ein Fragment davon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Bindungsprotein an das Trägermaterial kovalent gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Bindungsprotein über eine oder mehrere seiner Carboxylgruppen an das Trägermaterial gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Trägermaterial porös ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Trägermaterial dispergierfähig ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Trägermaterial Filterpapiere oder Filtervliese, vorzugsweise mit einem Gehalt an organischen Fasern, oder Polymerbeads, Schäume, Gele oder Membranen umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Trägermaterial Polyacrylate, Polymethacrylate, Polysulfon, Polyethersulfon, Zellulose, Zelluloseester, Agarose, Polytetrafluorethylen, Polycarbonat, Polyacrylate, Glasfasern oder Keramik umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei die in Schritt (d2) quantifizierten Mediatoren Interleukin (IL) IL-1, insbesondere IL-1β, oder IL-6, Tumornekrosefaktor (TNF) und/oder Prostaglandin E₂ sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 19, wobei der Mediator oder die Mediatoren in Schritt (c2) mit einem ELISA oder RIA bestimmt werden.
Durchströmbehälter (1) für ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend Zufuhr- und Austrittsöffnung und zwischen Zufuhr- und Austrittsöffnung im Durchströmbereich angeordnet ein oder mehrere Trennelemente (3), die ein Trägermaterial umfassen, auf das ein Bindungsprotein für Endotoxine immobilisiert ist.
Verwendung von Trennelementen, die ein Trägermaterial umfassen, auf das ein Bindungsprotein für Endotoxine immobilisiert ist, in einem Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten.