JP6231989B2 - 充填バイアル - Google Patents

Description

米国、カナダ、および西欧では、感染症では人間の死亡率に占める割合が約７％であるが、発展途上地域では、感染症は人間の死亡率の４０％超を占める。感染症は様々な臨床症状に結び付く。共通の明白な症状の中には、熱、肺炎、髄膜炎、下痢、および出血を伴う下痢がある。身体的症状により、病原因子としていくつかの病原体が示唆され、他のものが排除されるが、様々な潜在的な原因物質が残り、明確な診断には様々な検定を行うことを要する場合が多い。病原体を診断するための従来の微生物学技術には、数日または数週間かかる可能性があり、しばしば、それによって適切な一連の治療が遅れる。

近年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、感染因子を迅速に診断するための選択法となってきている。ＰＣＲは、感染症を診断するための、迅速、高感度、かつ特異的なツールであり得る。ＰＣＲを診断の主要な手段として使用するための課題は、可能性のある原因微生物が様々であることであり、また、病理学的標本によっては、中に存在する微生物が低レベルなことである。ほとんどが陰性であることが予期される、可能性のある原因微生物それぞれに対して１つずつのＰＣＲ検定の大型パネルを動かすのは非実用的である場合が多い。病原体核酸が低濃度であり、十分な反応テンプレートを集約するのに大量のサンプルを要する場合に問題が悪化する。場合によっては、可能性があるすべての病原因子に対して検定を行うのには、サンプルが不十分である。解決策は、単一の反応で複数の標的に関してサンプルが同時に検定される、「多重ＰＣＲ」を実行することである。多重ＰＣＲは、いくつかのシステムでは有益であることが判明しているが、高レベルの多重反応の堅牢性、および複数の生成物の明瞭な分析に関する困難という欠点が存在する。これらの問題を解決するため、検定は、続いて複数の二次ＰＣＲに分割されてもよい。二次反応を一次生成物に組み込むことによって堅牢性が向上する。しかし、このさらなる取扱いは高価である可能性があり、汚染または他の問題に結び付くことがある。

本発明は、生物学的分析を行うために材料を取り扱うことの様々な課題に対処する。

一実施形態では、カニューレ状バイアル（cannulated vial）が提供され、カニューレ状バイアルは、一端にある頂面、他端にある底面、およびそれらの間にある外壁を有して内側バイアル容積部を画成し、頂面が開口部を有する、バイアル本体と、底面から延在するとともに、第１の端部、第２の端部、およびそれらの間の外表面を有してカニューレ容積を画成するカニューレであって、第１の端部が内側バイアル容積部と流体連通している、カニューレと、開口部を封止可能に閉止するようにサイズ決めされた舌を有するキャップであって、舌がさらに、カニューレ容積以上の容積を有する、キャップとを備える。例えば、舌を頂面の開口部に入れて、開口部を封止可能に閉止することによって、内側バイアル容積部が加圧され、底部キャップを除去することによって加圧流体がカニューレに流し込まれる。フィルタがバイアル本体の底面付近に位置してもよく、フィルタは、流体がカニューレに入る際に流体を濾過するように構成されている。一実施形態では、フィルタは、原生動物または他の微生物を通すのには十分に大きいが、より大きな微粒子状物質を捕捉するのには十分に小さい孔径を有する。水和流体を流体系に供給する、第２のバイアルが設けられてもよい。

別の実施形態では、カニューレ状バイアルが提供され、カニューレ状バイアルは、１つまたは複数の外壁によって外部環境から封止された内側バイアル容積部を有するバイアル本体と、バイアル本体の底面から延在するとともに、外表面によって接続され、内部カニューレ容積部を画成する第１の端部および第２の端部を有するカニューレであって、第１の端部が内側バイアル容積部と流体連通している、カニューレと、着脱可能な底部キャップがカニューレの第２の端部に固着されると、カニューレの第２の端部を外部環境から着脱可能に封止するようにサイズ決めされ成形された第１の端部を有する着脱可能な底部キャップとを備え、内側容積部に供給された流体が圧力下にあり、底部キャップを除去することによってカニューレの第２の端部が外部環境に露出し、それによって流体がカニューレに流される。

さらに別の実施形態では、パウチ装填ステーション（pouch loading station）が提供され、パウチ装填ステーションは、パウチを受け入れるように構成されたスロットと、カニューレ状バイアルを受け入れるようにそれぞれ構成された１つまたは複数のレセプタクルとを備え、各カニューレ状バイアルが、内側容積部を外部環境から封止するように構成されたバイアル本体、バイアル本体の底面から延在するとともに、第１の端部および第２の端部を有するカニューレであって、第１の端部が内側容積部と流体連通している、カニューレ、カニューレの第２の端部を外部環境から封止する着脱可能な底部キャップを備え、各レセプタクルが、個々の底部キャップの形状と噛合して底部キャップの除去を支援するように成形される。２つ以上のレセプタクルが設けられる場合、レセプタクルは、異なるサイズまたは形状の底部キャップを受け入れるため、異なるようにサイズ決めされるかまたは成形されてもよい。

さらに別の実施形態では、流体系を充填するための方法が提供され、方法は、カニューレ状バイアルを用意するステップであって、カニューレ状バイアルが、外部環境から封止された、圧力下で供給される流体およびある量のガスを含む内側容積部を有するバイアル本体と、バイアル本体の底面から延在するとともに、第１の端部および第２の端部を有するカニューレであって、第１の端部が内側容積部と流体連通しており、第２の端部が外部環境から封止された、カニューレとを備える、ステップ、カニューレの第２の端部を開封し、それによってバイアル本体内の圧力が流体をカニューレに流し込むステップ、第２の端部を流体系に入れ、それによって流体を真空下に置くステップ、ならびに真空によって流体をカニューレ状バイアルから引き出すことを可能にし、流体がカニューレを通して駆動され、バイアル本体内のガスの膨張によって流体系に追い込まれるステップを含む。

本発明の追加の特徴は、現在理解されているような本発明を実施するための最良の形態を例証する、好ましい実施形態の以下の詳細な説明を考察することにより、当業者には明白となるであろう。

本発明の一実施形態による可撓性パウチを示す図である。 図１による可撓性パウチの細胞溶解域の一実施形態を示す図であり、図２ａは、図２に示される細胞溶解域に相当するブラダーの一部分の一実施形態を示す図、図２ｂは、代替のボルテックス形成（vortexing）機構を有する、図１による可撓性パウチの細胞溶解域の一実施形態を示す図である。 図１による可撓性パウチの核酸調製域の一実施形態を示す図である。 図１による可撓性パウチの第一段階増幅域の一実施形態を示す図である。 図１に類似した、ただしパウチの代替実施形態を示す図であり、図５ａは、図５のパウチの付属部品を示す断面図、図５ｂは、図５のパウチの一部分を示す拡大図である。 パウチの別の代替実施形態を示す斜視図であり、図６ａは、図６のパウチの付属部品を示す断面図である。 図６のパウチとともに使用される、実例となるブラダー構成要素を示す図である。 図６のパウチを含む、図６のパウチとともに使用される機器を示す拡大斜視図である。 図６のパウチが陰影で示される、図７のブラダー構成要素を含む図８の機器の部分断面図である。 ピンチ弁のための様々なブラダーおよび図６のパウチを含む、図８の機器の部分断面図である。 図５のパウチ内で溶解し増幅したサンプルの第二段階増幅の増幅曲線を示すグラフ（破線は正の対照、一点鎖線は出芽酵母（S. cerevisaie）標的１、実線は出芽酵母標的２、太線は出芽酵母標的３、二点短鎖線は***酵母（S. pombe）標的１、二点長鎖線は***酵母標的２、点線は負の対照）である。 図６に類似した、ただし第二段階高密度アレイを有するパウチを示す図である。 図８の機器の構成要素の修正例を示す、支持部材が図１２のパウチとともに使用するように構成されたモータを備えている図である。 図１２の第二段階高密度アレイの分解斜視図である。 第二段階高密度アレイの構築中を示す、図１２の第二段階高密度アレイの底面図である。 図１２のパウチを含む、図１２のパウチを充填するための充填ステーションを示す図である。 サンプルを図１２のパウチに充填するための充填バイアルを示す図である。 水和流体を図１２のパウチに供給するための水和バイアルを示す図である。 図１６と同等の、ただし異なる充填ステーション構成および充填ステーションとともに使用されるバイアルを表示する図である。 図１９のサンプルバイアルの一部分を示す、かつサンプルバイアルが、図１９の充填ステーションのサンプルバイアルレセプタクルにどのように調和するかを示す図である。 図１９の水和バイアルの一部分を示す、かつ水和バイアルが、図１９の充填ステーションの水和バイアルレセプタクルにどのように調和するかを示す図である。

本明細書に記載される内蔵式の核酸分析パウチは、抗原および核酸配列などの様々な生物学的物質の存在に関して、例えば単一の閉システム内で、サンプルを検定するのに使用され得る。一実施形態では、パウチは複数の病原体に関して検定するのに使用される。例えば、任意に使い捨てのパウチ内で、核酸の調製、多量の一次多重ＰＣＲ、一次増幅生成物の希釈、および二次ＰＣＲを含む様々なステップが行われ、リアルタイム検出および／または融解曲線分析などの増幅後分析で完結してもよい。しかし、病原体検出は１つの例示的な用途であり、パウチは、他の核酸分析に、またはペプチド、毒素、および小分子を含むがそれらに限定されない他の物質の検出に使用されてもよいことが理解される。さらに、様々なステップが本発明のパウチ内で行われてもよく、特定の用途に対してステップの１つまたは複数が省略されてもよく、パウチの構成が適宜変更されてもよいことが理解される。

ＰＣＲは本明細書の実施例で使用される増幅方法であるが、プライマーを使用する任意の増幅方法が適切なことがあることが理解される。かかる適切な手順としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、カスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）、ループ介在（loop-mediated）等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ）、等温キメラプライマー核酸増幅（ＩＣＡＮ）、標的ベースのヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）などが挙げられる。したがって、ＰＣＲという用語が使用されるとき、他の代替の増幅方法を含むものと理解すべきである。プロトコルの適宜の調節を要することがあることが理解される。

図１は、実例となる内蔵式の核酸分析パウチ１０を示す。パウチ１０は、細胞溶解域２０、核酸調製域４０、第一段階増幅域６０、および第二段階増幅域８０を有する。核酸を含有するサンプルは、サンプル注入ポート１２を介してパウチ１０に導入される。パウチ１０は、様々なサイズの様々なチャネルおよびブリスタを備え、サンプルがシステムを通って流れるように配列される。サンプルは、様々な域を通り抜け、適宜処理される。

サンプル処理は、パウチ１０内に位置する様々なブリスタで生じる。サンプルを処理域内および処理域間で移動させる、様々なチャネルが設けられる一方で、流体および試薬をサンプルに送達する、またはかかる流体および試薬をサンプルから除去する、他のチャネルが設けられる。パウチ１０内の液体は、例えば、後述するように、空気圧などの圧力によってブリスタ間を移動させられるが、パウチ内で材料を移動させる他の方法が想到される。

他の容器が使用されてもよいが、例えば、パウチ１０は、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ならびに押出し、プラズマ蒸着、および積層などの当該分野で知られている任意のプロセスによって作ることができる上記材料の混合物など、可撓性プラスチックフィルムまたは他の可撓性材料の二層から形成される。アルミニウム積層体を有する金属箔またはプラスチックも使用されてもよい。互いに封止してブリスタおよびチャネルを形成することができる、他のバリア材料が当該分野において知られている。プラスチックフィルムが使用される場合、例えばヒートシールによって、層を互いに結合させてもよい。例えば、材料は低い核酸結合能力を有する。

蛍光モニタリングを用いる実施形態の場合、動作波長における吸光度および自己蛍光が十分に低いプラスチックフィルムが好ましい。かかる材料は、異なるプラスチック、異なる可塑剤、および合成比、ならびにフィルムの異なる厚さを試みることによって特定することができる。アルミニウムまたは他の箔の積層体を有するプラスチックの場合、蛍光検出デバイスによって読み取るべきパウチの部分を、箔を有さないままにすることができる。例えば、パウチ１０の第二段階増幅域８０のブリスタ８２で蛍光がモニタリングされる場合、ブリスタ８２における一層または両方の層が箔を有さないままにされる。ＰＣＲの例では、フィルム積層体は、厚さ約０．００４８インチ（０．１２１９ｍｍ）のポリエステル（マイラー（Mylar）、デュポン社（Dupont）、デラウェア州ウィルミントン（Wilmington DE））と、厚さ０．００１〜０．００３インチ（０．０２５〜０．０７６ｍｍ）のポリプロピレンフィルムとから成る。例えば、パウチ１０は、入射光の約８０％〜９０％を透過させることができる透明材料で作られる。

実施形態では、材料は、空気圧などの圧力をブリスタおよびチャネルに印加することによって、ブリスタ間を移動させられる。したがって、空気圧を用いる実施形態では、パウチ材料は、例えば、空気圧が所望の効果を有し得るのに十分に可撓性である。「可撓性」という用語は、本明細書では、パウチの材料の物理的特性を説明するのに使用される。「可撓性」という用語は、本明細書では、割れ、破断、ひび割れなどを伴うことなく、本明細書で使用される空気圧のレベルによって容易に変形可能であるものとして定義される。例えば、サラン（商標）ラップおよびジップロック（登録商標）バッグなどの薄いプラスチックシート、ならびにアルミ箔などの薄い金属箔が可撓性である。しかし、空気圧を用いる実施形態であっても、ブリスタおよびチャネルの特定の領域のみが可撓性であれば良い。さらに、ブリスタおよびチャネルが容易に変形可能である限り、ブリスタおよびチャネルの片面のみが可撓性であれば良い。パウチ１０の他の領域は、剛性材料で作られてもよく、または合成材料で補強されてもよい。

例えば、プラスチックフィルムがパウチ１０に使用される。アルミニウムなどの金属、または他の適切な材料のシートが、圧延されるかまたは別の方法で切断されて、***した表面のパターンを有するダイが作成されてもよい。例えば１９５℃の動作温度に調整された、空気圧プレス（例えば、Ａ−５３０２−ＰＤＳ、ジェーンズビル・ツール社（Janesville Tool Inc.）、ウィスコンシン州ミルトン（Milton WI））に嵌合させると、空気圧プレスは印刷機のように働いて、ダイがフィルムに接触する場所でのみ、プラスチックフィルムの封止表面を融解させる。ＰＣＲプライマー（例えば、フィルム上に点在させ乾燥させる）、抗原結合基質（antigen binding substrates）、磁性ビーズ、およびケイ酸ジルコニウムビーズなどの様々な構成成分が、パウチ１０が形成される際に様々なブリスタ内部に封止されてもよい。サンプル処理用の試薬を、封止に先立って、集合的にまたは別々にフィルム上に点在させることができる。一実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を、ポリメラーゼおよびプライマーとは別個にフィルム上に点在させて、反応が水性サンプルによって水和されるまでポリメラーゼの活性を本質的に排除する。水性サンプルを水和に先立って加熱している場合、これによって、真のホットスタートＰＣＲのための条件が作成され、高価なホットスタートのための化学成分の必要性が低減または排除される。この個別のスポッティングについては、図５ｂを参照してさらに後述するが、かかるスポッティングは、本明細書で考察される実施形態のいずれとともに使用されてもよいことが理解される。

パウチ１０内の材料を移動させるのに空気圧が使用されるとき、一実施形態では、「ブラダー」が用いられてもよい。一部分が図２ａに示されるブラダーアセンブリ７１０は、パウチを作るプロセスに類似したプロセスで製造されてもよいが、ブラダーアセンブリ７１０の個々のブラダーは、ブラダーアセンブリ７１０内の個々のブラダーを圧縮ガス源によって加圧することを可能にする、空気圧管継手（例えば、管継手７２４ａ）を含む。ブラダーアセンブリは圧縮ガスに晒され、複数回使用されることがあるので、ブラダーアセンブリは、パウチよりも強靭なまたは厚い材料から作られてもよい。あるいは、ブラダーは、ガスケット、シール、弁、およびピストンを用いて互いに締結される一連のプレートから形成されてもよい。他の構成も本発明の範囲内である。

パウチ１０が機器に入れられると、空気圧ブラダーアセンブリ７１０は、パウチ１０の１つの面に押し付けられるので、特定のブラダーを膨張させた場合、圧力によって液体がパウチ１０の対応するブリスタから押し出される。パウチ１０のブリスタの多くに対応する空気圧ブラダーに加えて、ブラダーアセンブリは、ブラダーまたは空気圧駆動式のピストンなど、パウチ１０の様々なチャネルに対応する追加の空気圧アクチュエータを有してもよい。活性化されると、これらの追加の空気圧アクチュエータはピンチ弁を形成して、対応するチャネルをインチオフし、閉止する。パウチ１０の特定のブリスタ内に液体を拘束するため、ピンチ弁空気圧アクチュエータを、ブリスタとの間に通じるチャネルの上で膨張させ、それによってアクチュエータがピンチ弁として機能してチャネルを狭窄して閉鎖する。例えば、異なるブリスタ内にある２つの液体容量を混合するため、接続チャネルを封止しているピンチ弁空気圧アクチュエータが減圧され、ブリスタの上にある空気圧ブラダーが代わりに加圧されて、液体がブリスタを接続するチャネルを通って往復して中の液体が混合される。ピンチ弁空気圧アクチュエータは、様々な形状およびサイズであってもよく、一度に２つ以上のチャネルをピンチオフするように構成されてもよい。かかる実例となるピンチ弁は、ピンチ弁１６として図１に示されており、すべての注入ポートを閉止するのに使用されてもよい。空気圧アクチュエータが本明細書において考察されるが、リニアステップモータ、モータ駆動式カム、空気圧によって駆動される剛性のパドル、液圧または電磁力、ローラ、ロッカーアーム、および場合によってはコックトスプリング（cocked springs）などの様々な電気機械式アクチュエータを含む、パウチに圧力を供給する他の方法が想到されることが理解される。それに加えて、チャネルの軸線に垂直に圧力を印加することに加えて、可逆的または不可逆的にチャネルを閉止する様々な方法がある。これらは、チャネルを横切ってバッグを捩じること、ヒートシール、アクチュエータの回転、ならびにバタフライ弁およびボール弁など、チャネル内に封止される様々な物理的な弁を含む。それに加えて、小型のペルチェ素子または他の温度調整装置が、チャネルに隣接して配置され、流体を凍結してシールを効率的に形成するのに十分な温度に設定されてもよい。また、図１の設計は、ブリスタおよびチャネルそれぞれの上に位置付けられたアクチュエータ要素を特徴とする自動機器に適応されているが、アクチュエータが定置のままであることができ、また、サンプルの破壊、核酸の捕捉、第一および第二段階のＰＣＲ、ならびにイムノアッセイおよびイムノＰＣＲなどのパウチの他の適用例を含む、いくつかの処理ステーションに少数のアクチュエータを使用できるように、パウチを一次元または二次元で移行させることができることも想到される。チャネルおよびブリスタに作用するローラは、パウチがステーション間で平行移動させられる構成において特に有用であることが証明できる。したがって、空気圧アクチュエータが現在開示される実施形態で使用されるが、「空気圧アクチュエータ」という用語が本明細書で使用されるとき、パウチおよび機器の構成に応じて、圧力を供給する他のアクチュエータおよび他の方法が使用されてもよいことが理解される。

図１を参照すると、核酸抽出および多重ＰＣＲ用に構成された、実例となるサンプルパウチ１０が提供される。サンプルは、付属部品９０のサンプル注入ポート１２を介してパウチ１０に入る。注入ポート１２は、脆弱なシール、一方向弁、または他の入口ポートであってもよい。パウチ１０内部からの真空が、サンプルをパウチ１０に引き込むのに使用されてもよく、注射器または他の圧力がサンプルをパウチ１０に流し込むのに使用されてもよく、または注入ポート１２を介してサンプルをパウチ１０に導入する他の手段が使用されてもよい。サンプルは、チャネル１４を介して、サンプル中の細胞が溶解される細胞溶解域２０の三葉ブリスタ２２へと移動する。一旦サンプルが三葉ブリスタ２２に入ると、ピンチ弁１６が閉止される。既に閉止されていることがあるピンチ弁３６に加えて、ピンチ弁１６を閉止することによって、サンプルが三葉ブリスタ２２内に封止される。細胞溶解はすべてのサンプルで必須ではなくてもよいことが理解される。かかるサンプルの場合、細胞溶解域が省略されてもよく、またはサンプルを次の域に直接移動させてもよい。しかし、多くのサンプルでは、細胞溶解が必要である。一実施形態では、ビーズミリングを使用して細胞を溶解する。

ケイ酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ３４などの溶解粒子の存在下でサンプルを振とうまたはボルテックス形成することによる、ビーズミリングは、溶解物を形成するのに有効な方法である。本明細書で使用するとき、「溶解する」、「溶解」、および「溶解物」などの用語は細胞を破壊することに限定されず、かかる用語は、ウィルスなどの非細胞粒子の破壊を含むことが理解される。図２は、収束流がビーズの高速衝撃を生じさせて溶解物を作成する、細胞溶解域２０の一実施形態を示す。例えば、三葉ブリスタ２２の２つの下側の葉２４、２６はチャネル３０を介して接続され、上側の葉２８は、チャネル３０の反対側３１で下側の葉２４、２６に接続される。図２ａは、パウチ１０の細胞溶解域２０と接触していることになる、ブラダーアセンブリ７１０の対応する部分を示す。パウチ１０が機器に入れられると、パウチ１０上の各葉２４、２６、２８に隣接するのは、ブラダーアセンブリ７１０における対応する空気圧ブラダー７２４、７２６、７２８である。「隣接する」という用語は、パウチのブリスタまたはチャネルとそれに対応する空気圧アクチュエータとの間の関係について言及するとき、パウチを機器に入れたときのブリスタまたはチャネルと対応する空気圧アクチュエータとの間の関係を指すものと理解される。一実施形態では、隣接する下側の葉２４、２６の２つの下側の空気圧ブラダー７２４、７２６の空気圧管継手７２４ａ、７２６ａが互いに配管される。空気圧管継手７２４ａ、７２６ａ、および上側の葉２８に隣接した上側の空気圧ブラダー７２８の空気圧管継手７２８ａは、二重作用空気圧シリンダを駆動するように構成された電気作動弁の反対側に配管される。このように構成されると、圧力は、上側の空気圧ブラダー７２８と２つの下側の空気圧ブラダー７２４、７２６との間で交互になる。バルブが前後に切り替えられると、パウチ１０内の液体が、下側の葉２４、２６と上側の葉２８との間で駆動されて、チャネル３０の狭いネクサス３２を通る。２つの下側の葉２４、２６は同時に加圧されるので、流れは収束し、上側の葉２８に噴き込む。葉の幾何学形状に応じて、ネクサス３２におけるビーズ３４の衝突速度は少なくとも約１２ｍ／秒であって、高衝撃の衝突がもたらされ、その結果、溶解が生じる。実例となる三葉のシステムによって、良好な細胞破壊および構造上の堅牢性が可能になる一方で、サイズおよび空気圧のガス消費が最小限に抑えられる。ＺＳビーズが溶解粒子として使用されるが、この選択は単なる例示であり、他の材料および他の形状の粒子が使用されてもよいことが理解される。また、細胞溶解域２０の他の構成も本発明の範囲内にあることが理解される。

三葉ブリスタが採用溶解に使用されているが、他の多葉の構成が本発明の範囲内にあることが理解される。例えば、四葉ブリスタ、例えばクローバーの葉のパターンのものを使用することができ、その場合、向かい合ったブリスタが同時に加圧されて、溶解粒子が互いに向かって押しやられ、次に他の２つの葉へと角度を変え、次にそれらの葉がともに加圧されてもよい。かかる四葉ブリスタは、両方向の高速衝撃を有するという利点を有することになる。さらに、一葉ブリスタが使用されてもよく、その場合、溶解粒子が一葉ブリスタのある部分から他の部分へと迅速に移動させられることが想到される。例えば、空気圧アクチュエータは、一葉ブリスタの領域を閉止して、残りの領域に多葉ブリスタを一時的に形成するのに使用されてもよい。デバイスの葉に作用する、モータ、空気圧、液圧、または電磁駆動式のパドルなど、他の作動方法が使用されてもよい。例えば、上側および下側の葉の間に再循環手段が設けられ、アクチュエータが蠕動ポンプ作用を提供する場合、ローラまたは回転パドルを使用して、図２のネクサス３２において流体をともに駆動することができる。他の構成も本発明の範囲内にある。

また、多葉ブリスタを一時的に形成することなく、一葉溶解ブリスタ内で溶解を生じさせるのに十分に迅速に、サンプルおよび溶解粒子を移動させることが可能な場合もある。図２ｂに示されるような、かかる１つの代替実施形態では、電気モータ１９に取り付けられた回転ブレードまたはパドル２１を用いてパウチに衝撃を与えることによって、ボルテックス形成が達成されてもよい。ブレード２１は、溶解ブリスタにおいてパウチに衝撃を与えてもよく、または溶解ブリスタ付近で、例えば溶解ブリスタに隣接した縁部１７で、パウチに衝撃を与えてもよい。かかる一実施形態では、溶解ブリスタは１つまたは複数のブリスタを備えてもよい。図１２は、１つのかかる溶解ブリスタ５２２を備える一実施形態を示す。図１３は、第２の支持部材８０４の第１の面８１１に搭載されてもよい、図８に示される機器８００のブレード２１を備える、ビーズ撹拌モータ１９を示す。しかし、モータ１９は、機器８００の第１の支持部材８０２上または他の構造上に搭載されてもよいことが理解される。

図２ａはまた、空気圧管継手７１６ａを備えた空気圧ブラダー７１６と、空気圧管継手７３６ａを備えた空気圧ブラダー７３６とを示す。パウチ１０がブラダーアセンブリ７１０と接触して配置されると、ブラダー７１６がチャネル１２とぴったり合って、ピンチ弁１６が完成する。同様に、ブラダー７３６がチャネル３８とぴったり合って、ピンチ弁３６が完成する。空気圧ブラダー７１６および７３６の動作によって、ピンチ弁１６および３６を開閉することが可能になる。ブラダーアセンブリ７１０のうち、細胞溶解域に隣接した部分のみが示されているが、ブラダーアセンブリ７１０は、パウチ１０の残りの域全体にわたる流体の移動を制御するため、空気圧ブリスタの類似の構成を備えるはずであることが理解される。

他の従来技術の機器は、封止された可撓性容器内におけるＰＣＲについて教示している。例えば、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第６，６４５，７５８号および第６，７８０，６１７号、ならびに同時係属中の米国特許出願第１０／４７８，４５３号を参照のこと。しかし、特に試験すべきサンプルがバイオハザードを含有し得る場合、封止されたＰＣＲ容器内に細胞溶解を含めることによって、使用の容易さおよび安全性を改善することができる。本明細書に例証される実施形態では、細胞溶解からの、ならびに他のすべてのステップからの廃棄物は、封止されたパウチ内に残る。しかし、パウチの内容物をさらなる試験のために除去できることが理解される。

一旦細胞が溶解されると、ピンチ弁３６が開放され、図３で最も良く分かるように、溶解物がチャネル３８を通って核酸調製域４０へと移動させられ、その後、ピンチ弁３６が閉止されて、サンプルが核酸調製域４０内に封止される。図３に示される実施形態では、核酸の精製は、ビーズミリングされた材料を用い、シリカベースの磁性ビーズ５６に対する親和結合を使用して、ビーズをエタノールで洗浄し、水または他の流体で核酸を溶出して、細胞溶解物から核酸を精製する。核酸抽出に必要な個々の構成成分は、例えば、チャネル４５、４７、４９によって接続されて試薬混合を可能にしている、ブリスタ４４、４６、４８内に存在する。溶解物はチャネル３８からブリスタ４４に入る。ブリスタ４４は、磁性ビーズ５６および適切な結合緩衝液、例えば１−２−３（商標）サンプル調製キット（アイダホ・テクノロジー（Idaho Technology）、ユタ州ソルトレークシティ（Salt Lake City, UT））などの高塩濃度緩衝液を備えてもよく、あるいは、これらの構成成分のどちらかまたは両方が、ブリスタ４４に接続された１つもしくは複数のチャネルを通して続いて提供されてもよい。核酸はビーズ５６上で捕捉され、次にピンチ弁５３が開放され、溶解物およびビーズ５６は、ブリスタ４４および５８に交互に緩やかに圧力を掛けることによって混合され、次に、例えばブラダーアセンブリ７１０上の対応する空気圧ブラダーによって供給される空気圧によって、ブリスタ５８へと移動させられてもよい。磁性ビーズ５６は、ブリスタ５８に隣接して機器内に配置される格納式の磁石５０によってブリスタ５８内で捕捉され、廃棄物は、廃棄物リザーバへと移動させられてもよく、またはブリスタ５８に圧力を印加することによってブリスタ４４に戻されてもよい。次に、ピンチ弁５３が閉止される。磁性ビーズ５６は、ピンチ弁５５を解放すると、エタノール、イソプロパノール、またはブリスタ４６から供給される他の有機もしくは無機洗浄溶液で洗浄される。任意に、磁石５０が撤回されて、ブリスタ４６および５８に交互に圧力を供給することによって、ビーズの洗浄が可能になってもよい。ビーズ５６は、磁石５０によってブリスタ５８内で再度捕捉され、溶解物の非核酸部分がビーズ５６から洗い流され、ブリスタ４６に戻されるとともにピンチ弁５５によって固定されてもよく、または別のチャネルを介して廃棄物リザーバへと押し流されてもよい。一旦磁性ビーズが洗浄されると、ピンチ弁５７が開放されて、水（例えば、緩衝水）または別の核酸溶離液がブリスタ４８から放出される。再度磁石５０が撤回されて、例えばブリスタ４８および５８に交互に圧力を供給することによって、水およびビーズ５６の最大限の混合が可能になってもよい。ビード５６を回収するため、磁石５０が再度配備される。ピンチ弁５９が開放され、溶出した核酸がチャネル５２を介して第一段階増幅域６０へと移動させられる。次に、ピンチ弁５９が閉止され、それにより、サンプルが第一段階増幅域６０で固定される。

図３に示すとともに上述したような、核酸調製域４０の構成は単なる例示であり、他の様々な構成も本開示の範囲内で可能であることが理解される。

本明細書で使用されるエタノール、水、および他の流体は、様々な方法でブリスタに供給されてもよい。流体はブリスタに格納されてもよく、その首部は、様々なピンチ弁によって、またはサンプル調製シーケンスの適切な時点で開放されてもよい脆弱部分によって、ピンチオフされてもよい。あるいは、流体は、図５に示されるパウチ１１０のようなパウチ内のリザーバに、または図６のパウチ２１０に関して考察されるような付属部品に格納され、必要に応じてチャネルを介して移動させられてもよい。さらに別の実施形態では、流体は、特にエタノール注入ポート４１、８８およびプランジャ６７、６８、６９に関して図１に示されるように、外部源から導入されてもよい。例えば、プランジャ６７、６８、６９は、例えばより剛性の材料の付属部品９０に挿入されてもよく、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許出願第１０／５１２，２５５号のように、プランジャを活性化させた際に流体の測定された体積を提供してもよい。あるいは、プランジャはより柔軟な材料であってもよく、付属部品はより剛性の材料であってもよい。測定された体積は、プランジャそれぞれに対して同じであってもまたは異なってもよい。最後に、さらに別の実施形態では、パウチは、１つまたは複数のブリスタに格納された流体の測定された体積を備えてもよく、その際、流体はブリスタ内に収容され、例えばブリスタ内の小さな封止されたパウチの形で提供されて、ブリスタ内にブリスタを有効に形成する。適切な時点で、封止されたパウチを次に、例えば空気圧によって破裂させ、それによって流体をパウチのブリスタ内に放出させてもよい。機器はまた、機器が稼働中に汚染されるのを防ぐため、流体の通過が一方向弁によって厳密に調整されるという条件で、機器と付属部品またはパウチ材料との間の直接の液体接触を通じて、試薬のいくつかまたはすべてを提供するように構成されてもよい。さらに、多くの場合、汚染ＤＮＡがパウチから漏れるのを妨げるため、パウチまたはその付属部品を動作後に封止するのが望ましい。シリンジポンプなど、要求に応じて試薬を供給する様々な手段、ならびに、有刺管継手またはＯリングシールなど、付属部品またはパウチと一時的に流体接触させる様々な手段が知られている。特定の用途の必要性によって決定付けられるように、流体を適切なブリスタに導入するこれらの方法のいずれかが、本明細書で考察されるパウチの実施形態のいずれかとともに使用されてもよいことが理解される。

上述したように、入れ子ＰＣＲは二段階で行われる標的増幅を伴う。第一段階では、標的は、例えばゲノムまたは逆転写テンプレートから増幅される。第一段階増幅は、所望であれば、プラトー相に先立って終了してもよい。二次反応では、第一段階単位複製配列が希釈されてもよく、二次増幅は同じプライマーを使用するか、または例えば、第一段階生成物のプライマーに対して内部で交雑する入れ子プライマーを使用する。入れ子ＰＣＲの利点としては、次のものが挙げられる。ａ）初期反応生成物が、二次反応における高い忠実度を保証する均質かつ特異的なテンプレートを形成し、比較的低効率の場合であっても、第一段階反応によって堅牢な第二段階反応を支持する適切なテンプレートが生成される。ｂ）異なる入れ子プライマーが使用され、元の増幅テンプレート（例えば、ゲノムＤＮＡもしくは逆転写生成物）が、二次増幅におけるその有意性が排除される程度まで希釈されてもよいので、第一段階反応による非特異的な生成物は第二段階反応と有意に干渉しない。また、ｃ）入れ子ＰＣＲによって高次の反応多重化が可能になる。第一段階反応は、いくつかの固有の増幅生成物のプライマーを含むことができる。次に、これらの生成物は第二段階反応で同定される。しかし、第一段階多重化および第二段階一重化（singleplex）は単なる例示であり、他の構成も可能であることが理解される。例えば、第一段階は、単一のプライマー対を使用して、様々な異なる関連の単位複製配列を増幅してもよく、第二段階は、例えば融解曲線分析を使用して、単位複製配列間の差を標的にするのに使用されてもよい。

図１を再び参照すると、核酸サンプルは、チャネル５２を介して第一段階増幅域６０に入り、ブリスタ６１に送達される。ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、およびプライマー、例えば多重増幅のための複数のプライマー対を含む、ＰＣＲ混合物は、ブリスタ６１内に提供されてもよく、上述したような様々な手段を介してブリスタ６１に導入されてもよい。あるいは、パウチ１０を組み立てる際に、乾燥試薬がブリスタ６１の位置上にスポッティングされてもよく、図１に示されるように、例えばプランジャ６８を介して、水または緩衝液がブリスタ６１に導入されてもよい。図４で最も良く分かるように、サンプルはここで、ピンチ弁５９および７２によってブリスタ６１内で固定され、例えば、機器内に配置されるとともにブリスタ６１に接触して構成される熱ブロックまたはペルチェ素子によって、２つ以上の温度の間で熱サイクリングされる。しかし、当該分野において知られているような、ブリスタ６１内に収容されたサンプルを加熱および冷却する他の手段が、本発明の範囲内にあることが理解される。熱サイクリングのための代替の加熱／冷却デバイスの非限定例としては、ブリスタ６１に隣接した空気圧ブリスタ内の空気を２つ以上の温度間で循環させる、ブラダー内に空気循環式のブリスタを有するもの、あるいは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許出願第１０／４７８，４５３号のように、例えば複数の空気圧プレスを使用して、またはパウチ１０を軸線上で平行移動させるか、もしくはパウチ１０に回転レイアウトを提供し、パウチ１０を旋回させて、固定温度の加熱域間で内容物を移動させることによって、サンプルをブリスタ６１内の温度域へと移動させるものが挙げられる。

病原体からの核酸は、相当量の宿主核酸と同時に単離される場合が多い。これらの宿主由来の核酸は、プライマーと相互作用し、結果として望ましくない生成物が増幅される場合が多く、その生成物は次に、プライマー、ｄＮＴＰ、およびポリメラーゼ活性を除去して、望ましい生成物の資源を枯渇させる可能性がある。病原体からの核酸は、一般に、存在量が低く、望ましくない生成物は潜在的な問題である。域６０の第一段階反応におけるサイクル数は、特異的な生成物を最大限にし、非特異的な生成物を最小限に抑えるように最適化されてもよい。最適なサイクル数は、約１０〜約３０サイクル、例えば約１５〜２０サイクルとなることが予期されるが、サイクル数は、特定の標的、宿主、およびプライマー配列に応じて変動してもよいことが理解される。

第一段階多重増幅に続いて、例えば不完全なＰＣＲマスターミックス中で、第一段階増幅生成物が希釈され、その後、流体は二次反応部位に移送される。

図４は、３ステップでサンプルを希釈する、実例となる一実施形態を示す。第１のステップで、ピンチ弁７２が開放され、サンプルは、ブリスタ６１内のサンプルをブリスタ６２からの等量の水または緩衝液と混合することによって二倍希釈され、それが、上述したように、ブリスタ６２ならびにブリスタ６４および６６に供給される。ブリスタ６１、６２の間で容積を交互に圧搾することによって、完全な混合がもたらされる。上述したように、混合は、ブラダー７１０内に設けられるとともにブリスタ６１、６２に隣接して配置された空気圧ブラダーによって提供されてもよい。空気圧ブラダーは、交互に加圧されて、液体を往復させてもよい。混合中、ピンチ弁７４は、液体が隣接したブリスタへと流入するのを防ぐ。混合の終了時、ある量の希釈サンプルは領域７０に捕捉され、ピンチ弁７２は閉止されて、希釈サンプルを領域７０内に封止する。ピンチ弁７４が開放され、サンプルは、ブリスタ６３、６４のどちらかもしくは両方に供給された水または緩衝液によってさらに希釈される。上述したように、ブリスタ６３、６４の間で体積を交互に圧搾することによって、混合がもたらされる。続いて、ピンチ弁７４が閉止されて、サンプルのさらに希釈された体積を領域７１内に封止する。最終の希釈は、例えば、上述のような混合を用いて、ブリスタ６５、６６のどちらかもしくは両方に供給された緩衝液または水を使用することによって行われる。例えば、この最終の希釈は、流体としての不完全なＰＣＲマスターミックス（例えば、プライマー以外のＰＣＲ試薬をすべて含有する）を使用して行われる。第二段階増幅に先立って、ブリスタ６６の内容物を任意に加熱することで、高価な抗体または酵素を必要とすることなく、ホットスタート増幅の利益を提供することができる。しかし、水または他の緩衝液が最終の希釈に使用され、追加のＰＣＲ構成成分が第二段階増幅域８０に供給されてもよいことが理解される。実施形態は３つの希釈段階を使用するが、適切なレベルの希釈を提供するため、任意の数の希釈段階が使用されてもよいことが理解される。希釈量は、領域７０および７１に捕捉されるサンプルの量を調節することによって制御することができ、その際、領域７０および７１に捕捉されるサンプルの量が少ないほど、希釈量は多くなるか、あるいは、ピンチ弁７２および７４ならびに／またはピンチ弁７４および７６を繰返し開閉することによって、領域７０および／または領域７１に捕捉される追加のアリコートが、希釈量を減少させるのに使用されてもよいことが理解される。約１０^−２〜約１０^−５希釈が多くの用途に適しているはずであることが予期される。

二次ＰＣＲ反応の成功は、多重第一段階反応によって発生するテンプレートに応じて決まる。一般的には、ＰＣＲは高純度のＤＮＡを使用して行われる。フェノール抽出または市販のＤＮＡ抽出キットなどの方法により、高純度のＤＮＡが供給される。パウチ１０を通して試料を処理するには、より低純度の調製を相殺するような適応を要することがある。ＰＣＲは、潜在的な障害物である、生物学的サンプルの構成成分によって阻害されることがある。例えば、ホットスタートＰＣＲ、より高濃度のｔａｑポリメラーゼ酵素、ＭｇＣｌ_２濃度の調節、プライマー濃度の調節、および補助薬（ＤＭＳＯ、ＴＭＳＯ、またはグリセロールなど）の添加は、任意に、低い核酸純度を相殺するのに使用されてもよい。純度の問題は、むしろ第一段階増幅における問題であり得るが、類似の調節が第二段階増幅で同様に提供されてもよいことが理解される。

希釈および第二段階サンプル調製は、実施形態では、少量の増幅されたサンプルをパウチの第一段階ＰＣＲ部分のブリスタおよびチャネル内で保定することによって達成されるが、これらのプロセスはまた、他の方法で行われてもよいことが理解される。かかる実例となる１つの例では、予め増幅されたサンプルを、固定量のサンプルを第一段階から第二段階ＰＣＲ試薬へと移動させることができる、平行移動もしくは回転部材などの部材の小さなキャビティに捕捉することができる。予め増幅されたサンプルの１マイクロリットルの部分を、１００マイクロリットルの新鮮なＰＣＲ試薬と混合することで、濃度が１００分の１に低減されることになる。この希釈は単なる例示であり、他の体積および希釈レベルが可能であることが理解される。この方策は、第一段階増幅生成物を剛性の付属部品に流し込み、そこで図１のプランジャ６８または６９の一方と接触させることによって達成することができる。かかる実施形態では、プランジャは、ごく少量のサンプルを、隣接した希釈緩衝液または第二段階ＰＣＲ緩衝液と接触させるように構成されることになる。同様に、段階間のシールを維持したまま、かつ増幅されたサンプルを剛性の付属部品９０内に含有したまま、滑動要素を使用して、少量の第一段階増幅生成物を第二段階反応問合物と接触させることができる。

第一段階ＰＣＲおよび希釈に続いて、チャネル７８は、二次入れ子ＰＣＲのため、複数の低容積ブリスタ８２にサンプルを移送する。１つの実施形態では、第二段階ブリスタに供給される乾燥プライマーは、入ってくる水性材料によって再懸濁されて、反応混合物が完成する。任意に、二本鎖核酸の検出に使用されるＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（アイダホ・テクノロジー（Idaho Technology）、ユタ州ソルトレークシティ（Salt Lake City, UT））などの蛍光色素が、各ブリスタに供給されてもよく、あるいは、連続希釈の終了時に不完全ＰＣＲマスターミックスに添加されてもよいが、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓは単なる例示であり、当該分野で知られているような他の色素が利用可能であることが理解される。別の任意の実施形態では、特異的な単位複製配列それぞれのために構成された乾燥蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが、個々の乾燥プライマーとともに、個々の第二段階ブリスタそれぞれに供給されてもよい。さらに、パウチ１０は、すべての反応および操作を中に含め、汚染を低減するように設計されるが、状況によっては、さらなる分析を行うため、増幅生成物を各ブリスタ８２から除去するのが望ましいことがある。当該分野で知られているような、第二段階単位複製配列を検出する他の手段は、本発明の範囲内にある。一旦サンプルがブリスタ８２に移送されると、ピンチ弁８４および８６が活性化されて、ブリスタ８２を閉鎖する。各ブリスタ８２は、この時点で、特定の標的の増幅に必要なすべての試薬を含有している。例えば、各ブリスタは固有のプライマー対を含有してもよく、複数のブリスタ８２が同じプライマーを含有して、多数の複製増幅を提供してもよい。

本明細書で開示される実施形態は、第二段階増幅にブリスタを使用し、その際、ブリスタは、残りの可撓性部分と同じまたは類似のプラスチックフィルムで形成されることに留意されたい。しかし、多くの実施形態では、第二段階ブリスタの内容物は決して第二段階ブリスタから除去されることはなく、したがって、第二段階反応を可撓性のブリスタ内で行う必要はない。第二段階反応は、ブリスタに流体接続された、複数の剛性、半剛性、または可撓性のチャンバ内で行われてもよいことが理解される。チャンバは、本例の場合のように、チャンバを接続する可撓性のチャネルに圧力を掛けることによって封止することができ、または、例えばヒートシールもしくは一方向弁の使用によって、他の方法で封止されてもよい。本明細書で考察される様々な実施形態は、廃棄物の回収のみのために提供されるブリスタを含む。廃棄物は決して除去されることがないので、廃棄物を、剛性、半剛性、または可撓性のチャンバに回収することができる。

第一段階増幅で使用したものと同じプライマーを用いて第二段階増幅を行うことは、本発明の範囲内にある（米国特許第６，６０５，４５１号を参照）。しかし、第一段階および第二段階のプライマー結合部位間に重複がないか、または重複が最小限であるように、第二段階反応において、第一段階生成物の内部にあるプライマーを有することが有利な場合が多い。第一段階生成物を希釈することによって、第二段階反応に対する元のテンプレートＤＮＡおよび第一段階試薬の寄与の大部分が排除される。さらに、例えば、第一段階で使用されるものよりも高いＴｍの第二段階プライマーが、入れ子増幅を増強するのに使用されてもよい。プライマーは、有意なヘアピン、ヘテロ／ホモダイマー、および望ましくない交雑を回避するように設計されてもよい。入れ子形式により、第二段階プライマーは、単一ステップでゲノムＤＮＡから標的を増幅するのに使用されるプライマーよりも、有害な相互作用に対してはるかに寛容である。任意に、第二段階増幅に対してホットスタートが使用される。

当該分野において知られているように、例えばｄｓＤＮＡ結合色素として、または蛍光プローブの一部として、第二段階増幅に蛍光色素が含まれる場合、提供される光学を使用して、サンプルの１つまたは複数の増幅がモニタリングされてもよい。任意に、増幅曲線の形状の分析が、各サンプルの陽性または陰性を判定するために提供されてもよい。サンプルを判定するための実例となる方法は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第６，７３０，５０１号で考察されている。あるいは、交差閾値（crossing threshold）を用いる方法が使用されてもよい。コンピュータが、外部または機器内に提供されてもよく、方法を行い、第二段階増幅の存在または不在に基づいてサンプルの陽性または陰性を判定するように構成されてもよく、増幅曲線の特性パラメータ（交差閾値など）を標準曲線または実行の中の他の増幅曲線に対して比較することによって、出発テンプレート濃度に関する定量的情報を提供してもよい。しかし、当該分野において知られているような他の方法が、各サンプルを判定するのに使用されてもよいことが理解される。他の分析が蛍光情報に対して行われてもよい。１つのかかる非限定例は、融解曲線分析を使用して、単位複製配列の適正な融解特性（例えば、Ｔｍ、融解プロファイル形状）を示すことである。提供される光学は、すべてのブリスタ８２の画像を一度に捕捉するように構成されてもよく、または、個々のブリスタそれぞれに対して個々の光学が提供されてもよい。他の構成も本発明の範囲内にある。

図５は、代替のパウチ１１０を示す。この実施形態では、様々な試薬は付属部品１９０を介してパウチ１１０に装填される。図５ａは、複数のプランジャ１６８の１つを含む付属部品１９０の断面を示す。図５ａは、図５の実施形態に示されるような、入口チャネル１１５ａを通る断面を示し、１２個の入口チャネル（入口チャネル１１５ａ〜１１５ｌ）が存在しており、そのそれぞれが付属部品１９０で使用されるそれ自体のプランジャ１６８を有してもよいが、この特定の構成では、入口チャネル１１５ｃ、１１５ｆ、および１１５ｉは使用されないことが理解される。１２個の入口チャネルを有する構成は単なる例示であり、任意の数の入口チャネルおよび関連するプランジャが使用されてもよいことが理解される。実施形態では、付属部品１９０の任意の真空ポート１４２は、付属部品１９０の第１の表面１９４を通って形成されて、チャンバ１９２と連通する。任意の真空ポート１４２は、真空または真空チャンバ（図示なし）と連通してパウチ１１０内から空気を引き出して、チャンバ１９２ならびにパウチ１１０の様々なブリスタおよびチャンバ内に真空を作り出すために提供されてもよい。次に、プランジャ１６８は、真空ポート１４２を密閉するのに十分に奥までチャンバ１９２に挿入される。チャンバ１９２は、例えば、所定量の真空下で提供されて、使用の際に所望量の液体をチャンバ１９２に引き込む。チャンバ１９２の調製に関する追加の情報は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許出願第１０／５１２，２５５号に見出すことができる。

実例となる付属部品１９０は、付属部品１９０の第２の表面１９５に形成される注入ポート１４１をさらに含む。例えば、注入ポート１４１は、図５ａに示されるように、真空ポート１４２よりもパウチ１１０のプラスチックフィルム部分により近接して位置付けられるので、注入ポート１４１を介してチャンバ１９２へとアクセスするのが可能なままの状態で、プランジャ１６８が、真空ポート１４２を密閉するのに十分に奥まで挿入される。図示されるように、プラスチックフィルム部分１１７の第２の表面１１９は、注入ポート１４１を介したチャンバ１９２と周囲雰囲気との間の連通を防ぐ、貫通可能なシール１３９を提供する。しかし、第２の表面１１９は、任意に、注入ポート１４１まで延在しなくてもよく、他の様々なシールが用いられてもよいことが理解される。さらに、シールの別の位置が、例えば付属部品１９０の第１の表面１９４が望ましい場合、注入ポート１４１は、付属部品１９０のその位置へのチャネルを含んでもよい。引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許出願第１０／５１２，２５５号は、シールが注入ポートから離れて位置し、シールがチャネルを介してチャンバに接続される、様々な構成を示している。また、米国特許出願第１０／５１２，２５５号は、チャネルが単一のシールを複数のチャンバに接続する、様々な構成を開示している。シールの位置の変化、ならびに複数のチャンバに対する単一の注入ポートの接続は、本発明の範囲内にある。任意に、シール１３９は脆弱であってもよく、カニューレ（図示なし）を挿入すると破壊されて、カニューレ内の流体サンプルをチャンバ１９２に引き込むか、または流し込むことが可能になってもよい。

パウチアセンブリ１１０の実例となるプランジャ１６８は、円筒形状であり、チャンバ１９２にプレス嵌めされるように約５ｍｍの直径を有する。プランジャ１６８は、第１の端部部分１７３および反対側の第２の端部部分１７５を含む。図５ａに示されるように、プランジャ１６８のノッチ１６９が第２の端部部分１７５に形成される。使用の際、第２の端部部分１７５はチャンバ１９２に一部挿入され、ノッチ１６９は注入ポート１４１と位置合わせされて、プランジャ１６８が他の場合では注入ポート１４１を遮断することになる奥までプランジャ１６８が十分に挿入されても、流体サンプルをチャンバ１９２に引き込むか、または注入することが可能になってもよい。

例えば、流体は、注入ポート１４１に挿入して中のシール１３９を穿孔することができるカニューレ状の先端を有する、シリンジを備えた容器（図示なし）に入れられる。排気したパウチアセンブリ１１０を使用する際、シール１３９が穿孔されると、周囲気圧に対するチャンバ１９２内の陰圧によって流体が容器から抜き出される。次に、流体はポート１４１を通過してチャンバ１９２を充填する。この時点では、流体は通常、パウチ１１０のプラスチックフィルム部分１１７に流入しない。最後に、プランジャ１６８がチャンバ１９２に挿入され、それによってプランジャ１６８の第２の端部部分１７５がチャンバ１９２の底部１９１に近付いて、測定された量の試薬またはサンプルがプラスチックフィルム部分１１７に押し込まれる。図示されるように、プランジャ１６８は、完全に挿入したとき、第２の端部部分１７５がチャンバ１９２の底部１９１と完全には触れないように構成されている。残りの空間は、泡を捕捉し、それによってプラスチックフィルム部分１１７に入る泡の数を低減するのに有用である。しかし、いくつかの実施形態では、プランジャ１６８を完全に挿入したとき、第２の端部部分１７５が底部１９１に触れるのが望ましいことがある。図５に示される実施形態では、入口チャネル１１５ａ、１１５ｂ、１１５ｄ、１１５ｅ、１１５ｇ、１１５ｈ、１１５ｊ、１１５ｋ、および１１５ｌはすべて、反応域またはリザーバブリスタにつながる。入口チャネル１１５ａと関連付けられたプランジャを完全に挿入すると、サンプルが三葉ブリスタ１２２に流し込まれ、入口チャネル１１５ｂと関連付けられたプランジャを完全に挿入すると、試薬がリザーバブリスタ１０１に流し込まれ、入口チャネル１１５ｄと関連付けられたプランジャを完全に挿入すると、試薬がリザーバブリスタ１０２に流し込まれ、入口チャネル１１５ｅと関連付けられたプランジャを完全に挿入すると、試薬がリザーバブリスタ１０３に流し込まれ、入口チャネル１１５ｇと関連付けられたプランジャを完全に挿入すると、試薬がリザーバブリスタ１０４に流し込まれ、入口チャネル１１５ｈと関連付けられたプランジャを完全に挿入すると、試薬がリザーバブリスタ１０５に流し込まれ、入口チャネル１１５ｊと関連付けられたプランジャを完全に挿入すると、試薬がリザーバブリスタ１０６に流し込まれ、入口チャネル１１５ｋと関連付けられたプランジャを完全に挿入すると、試薬がリザーバブリスタ１０７に流し込まれ、入口チャネル１１５ｌと関連付けられたプランジャを完全に挿入すると、試薬がリザーバブリスタ１０８に流し込まれる。

図５ａに示される実施形態で例証されるような、ノッチ１６９を含むプランジャ設計が使用される場合、プランジャ１６８を下に下げるのに先立って回転させ、それによってノッチ１６９をオフセットし、注入ポート１４１をチャンバ１９２との連通から閉鎖して、内容物を中に封止してもよい。これは、流体が注入ポート１４１を通って周囲雰囲気へと逆流するあらゆる可能性を最小限に抑えるように作用し、そのことは、プランジャの完全な挿入を遅らせることが望ましいときに特に有用である。ノッチ１６９が示され、プランジャ１６８に関して上述されているが、例えば、プランジャ１６８をチャンバ１９２の底部に向かって押し下げること、ヒートシール、一方向弁、または自己封止性ポートなどの他の手段によって、流体サンプルをチャンバ１９２内に分配した直後に注入ポート１４１を閉鎖することは、本開示の範囲内である。ヒートシールが封止方法として使用される場合、パウチを機器に挿入した際にすべてのチャンバがヒートシールされるように、シールバーを機器に含めることができる。

実例となる方法では、ユーザは、入口チャネル１１５ａと関連付けられた注入ポート１４１にサンプルを注入し、他の様々な注入ポートに水を注入する。水は、既に凍結乾燥させてある試薬を再水和し、入口チャネル１１５ｂ、１１５ｄ、１１５ｅ、１１５ｇ、１１５ｈ、１１５ｊ、１１５ｋ、および１１５ｌそれぞれと関連付けられたチャンバ１９２に入れる。水は、図６で以下に示されるように、１つの単一シールを通して注入され、次にチャネルを介してチャンバそれぞれへと分配されてもよく、または、水を各チャンバに独立して注入することができる。あるいは、水を注入して乾燥試薬を再水和するのではなく、溶解試薬、核酸抽出試薬、およびＰＣＲ試薬などの湿潤試薬が、付属部品１９０の適切なチャンバ１９２に注入されてもよい。

入口チャネル１１５ａと関連付けられたプランジャ１６８を活性化すると、サンプルは、チャネル１１４を介して三葉ブリスタ１２２に直接流し込まれる。ユーザはまた、残りのプランジャ１６８を押しやって、内容物を付属部品１９０のチャンバ１９２それぞれから押し出し、リザーバブリスタ１０１〜１０８に押し込む。この時点で、パウチ１１０は処理のために機器に装填される。図８に示される機器８００は図６のパウチ２１０用に構成されているが、機器８００のブラダーの構成を修正することで、機器８００が、パウチ１１０および５１０とともに、または他の構成のパウチとともに使用するのに適するようになることが理解される。

１つの実例となる例では、プランジャ１６８を押し下げると、リザーバブリスタ１０１は、イソプロパノール中のＤＮＡ結合磁性ビーズを収容するようになり、リザーバブリスタ１０２は、第１の洗浄溶液を収容するようになり、リザーバブリスタ１０３は、第２の洗浄溶液を収容するようになり、リザーバブリスタ１０４は、核酸溶出緩衝液を収容するようになり、リザーバブリスタ１０５は、多重化第一段階プライマーを含む第一段階ＰＣＲ試薬を収容するようになり、リザーバブリスタ１０６は、プライマーを含まない第二段階ＰＣＲ試薬を収容するようになり、リザーバブリスタ１０７は、プライマーを含まずテンプレートを含まない陰性対照ＰＣＲ試薬を収容するようになり、リザーバブリスタ１０８は、テンプレートを含む陽性対照ＰＣＲ試薬を収容するようになる。しかし、これらの試薬は単なる例示であり、所望の反応および最適化条件に応じて、他の試薬が使用されてもよいことが理解される。

一旦パウチ１１０が機器８００に入れられ、サンプルが三葉ブリスタ１２２へと移動すると、ＺＳまたはセラミックビーズなどの溶解粒子を用いてサンプルを撹拌することによって、サンプルを破壊してもよい。溶解粒子は、三葉ブリスタ１２２内に供給されてもよく、またはサンプルとともに三葉ブリスタ１２２に注入されてもよい。図５の三葉ブリスタ１２２は、図１の三葉ブリスタ２２とほぼ同じ方法で動作し、２つの下側の葉１２４、１２６がともに加圧され、上側の葉１２８と２つの下側の葉１２４、１２６との間で交互に圧力が掛けられる。しかし、図示されるように、下側の葉１２４、１２６は下側の葉２４、２６よりもはるかに丸く、チャネル１３０へとビーズが円滑に流れるのが可能になるとともに、ネクサス３２に三角形のフローセパレータがなくても高速衝突が可能になっている。三葉ブリスタ２２と同様に、図５の三葉ブリスタ１２２によって、サンプル中の微生物、細胞、およびウィルス粒子の有効な溶解または破壊が可能になっている。幅約３〜４ｍｍ、例えば約３．５ｍｍのチャネル１３０が、溶解中にビーズを比較的含まず、高速衝突を提供するのに有効であることが分かっている。

溶解後、リザーバブリスタ１０１の上に位置付けられたブラダーを加圧することによって、チャネル１３８を介して上側の葉１２８に核酸結合磁性ビーズが注入される。磁性ビーズは、例えば溶解中の方がより緩やかに、三葉ブリスタ１２２の内容物と混合され、溶液が例えば約１分間培養されて、核酸がビーズに結合することが可能になる。

次に、溶液はチャネル１４３を介して「図８」のブリスタ１４４に給送され、そこで、例えば空気圧駆動式である、機器に収納された格納式の磁石によってビーズが捕捉される。ビーズ捕捉プロセスは、ビーズミリング装置１２２のすべての葉１２４、１２６、および１２８を加圧することによって始まる。これにより、１２２の液体内容物の大部分がチャネル１４３を通ってブリスタ１４４に入る。磁石がブリスタ１４４の下側部分１４４ｂと接触させられ、サンプルが数秒間培養されて、磁石が溶液からビーズを捕捉することが可能になり、次に、ブリスタ１２２に隣接したブラダーが減圧され、ブリスタ部分１４４ａおよび１４４ｂに隣接したブラダーが加圧され、液体がブリスタ１２２に押し戻される。すべてのビーズが単一の通過で捕捉されるわけではないので、ブリスタ１４４内のビーズをほぼすべて捕捉するため、このプロセスが最大１０回繰り返されてもよい。次に、液体がブリスタ１４４から押し出されて、磁性ビーズおよび捕捉された核酸のみが後に残され、２回の連続洗浄で（それぞれ、チャネル１４５および１４７を介してリザーバブリスタ１０２および１０３から）洗浄試薬がブリスタ１４４に導入される。各洗浄において、洗浄試薬を収容したリザーバブリスタの上に位置付けられたブラダーが加圧されて、内容物がブリスタ１４４に流し込まれる。磁石が抜き出され、ブリスタ１４４の各葉１４４ａおよび１４４ｂを覆っている２つのブラダーそれぞれを交互に加圧することによって、磁性ビーズを収容したペレットが破壊される。上側の葉１４４ａが圧縮されると、液体内容物が下側の葉１１４ｂに流し込まれ、下側の葉１４４ｂが圧縮されると、内容物が上側の葉１４４ａに流し込まれる。上側の葉１４４ａと下側の葉１４４ｂとの間でブリスタ１４４内の溶液を撹拌することによって、磁性ビーズの不純物が有効に洗い流される。ビーズのペレットが破壊されないままで残る不適切な撹拌と、核酸がビーズの表面から洗い流され、洗浄試薬とともに失われる可能性がある過剰な撹拌との間でバランスが維持される。各洗浄サイクル後、磁性ビーズはブリスタ１４４内の磁石を介して捕捉され、洗浄試薬は、例えば、今度は廃棄物レセプタクルとして役立つ、三葉ブリスタ１２２に流し込まれる。しかし、使用済みのリザーバブリスタも廃棄物レセプタクルとして役立ってもよく、または他のブリスタが廃棄物レセプタクルとして特異的に提供されてもよいことが理解される。

次に、リザーバブリスタ１０４からの核酸溶出緩衝液が、チャネル１４９を介してブリスタ１４４に注入され、サンプルは再度撹拌され、磁石を用いることによって磁性ビーズが再捕捉される。ブリスタ１４４内の流体混合物は、ここでは、元のサンプルからの核酸を含有する。ブリスタ１４４に対する圧力によって、核酸サンプルがチャネル１５２を介して第一段階ＰＣＲブリスタ１６１に移動し、そこでサンプルが、チャネル１６２を介してリザーバブリスタ１０５から供給される、複数のプライマーセットを含有する第一段階ＰＣＲマスターミックスと混合される。望ましい場合、サンプルおよび／または第一段階ＰＣＲマスターミックスは、混合に先立って加熱されて、ホットスタートという利点を提供してもよい。任意に、ＲＮＡ標的の逆転写のための構成成分が、第一段階ＰＣＲに先立って供給されてもよい。あるいは、ＲＴ酵素、例えば熱安定性ＲＴ酵素が、第一段階ＰＣＲマスターミックス中に供給されて、ＲＮＡ標的の同時逆転写が可能になってもよい。ＲＴ酵素は、本明細書に開示される実施形態のいずれかにおける第一段階ＰＣＲ混合物中に存在してもよいことが理解される。以下で分かるように、図５のパウチ１１０は最大１０のプライマーセット用に構成されているが、構成が変更されてもよく、任意の数のプライマーセットが使用されてもよいことが理解される。ブリスタ１６１の上に位置付けられたブラダーは低圧で加圧されて、ブリスタ１６１の内容物を、ブリスタ１６１の他方の面上にある、ペルチェ素子などの加熱／冷却素子と密接に接触させる。ブリスタ１６１に対する圧力は、加熱／冷却素子との良好な接触を保証するのに十分であるべきであるが、流体がブリスタ１６１から押し出されないように十分に緩やかなものであるべきである。加熱／冷却素子は、例えば約６０℃〜約９５℃の間で、温度循環させられる。例えば、温度サイクリングは約１５〜２０サイクル行われ、その結果、存在する１つまたは複数の核酸標的が増幅される。また、例えば、温度サイクリングはプラトー相に先立って終わり、ログ相で、またはさらにはログ相に先立って終わってもよい。一例では、最小限のレベルの検出に達することなく、所望の単位複製配列でサンプルを濃縮するのが単に望ましいことがある。引用することにより本明細書の一部をなすものとする、米国特許第６，６０５，４５１号を参照のこと。

次に、増幅されたサンプルは、任意に、少量の増幅されたサンプルのみ（例えば、約１〜５％）をブリスタ１６１に残して、サンプルの大部分をチャネル１５２を介してブリスタ１４４に戻すことによって希釈され、第二段階ＰＣＲマスターミックスが、チャネル１６３を介してリザーバブリスタ１０６から供給される。サンプルは、例えば、チャネル１６３を介してブリスタ１０６および１６１の間で前後に移動させることによって完全に混合される。望ましい場合、反応混合物は、第二段階増幅に先立って、伸長温度よりも高温に、例えば少なくとも６０℃に加熱されてもよい。次に、サンプルは、チャネル１６５を通して、第二段階増幅域１８０の中央にある低容積ブリスタ１８２のアレイに流し込まれる。１０個の実例となる低容積ブリスタ１８２はそれぞれ、第一段階増幅におけるプライマー対の１つと本質的に同じであるか、あるいは短縮された単位複製配列を増幅するため、第一段階プライマー対内で「入れ子」にされた、異なるプライマー対を収容してもよい。プライマーは、ここでサンプルによって水和されて、増幅混合物が完成する。陽性および陰性対照サンプルも、リザーバブリスタ１０７および１０８それぞれの内容物を加圧し、標的ＤＮＡを含まないＰＣＲマスターミックスを、チャネル１６６を介してリザーバブリスタ１０７から、または対照ＤＮＡを含むＰＣＲマスターミックスを、リザーバブリスタ１０８からチャネル１６７を介して流すことによって導入される。図示されるように、それぞれ５つの陽性対照ブリスタ１８３および陰性対照ブリスタ１８１があり、１０の異なる第二段階増幅反応に対して必要な対照を提供するため、二倍に多重化されてもよい。この構成は単なる例示であり、任意の数の第二段階ブリスタが提供されてもよいことが理解される。

例えば、第二段階増幅に使用されるＰＣＲマスターミックスはプライマーが欠落しているが、それ以外は完全である。しかし、「不完全」ＰＣＲマスターミックスも同様に他のＰＣＲ構成成分が欠落していてもよい。一例では、第二段階ＰＣＲマスターミックスは水または緩衝液のみであり、それが次に、任意に希釈された第一段階ＰＣＲ増幅生成物と混合される。この混合物は、残りの構成成分がすべて既に供給されている、小容積のＰＣＲ反応ブリスタへと移動させられる。望ましい場合、残りの構成成分がすべて互いに混合され、単一の混合物として小容積のＰＣＲ反応ブリスタ内へとスポッティングされてもよい。あるいは、図５ｂに示されるように、構成成分はそれぞれ、小容積のＰＣＲ反応ブリスタ１８２の別個の領域上にスポッティングされてもよい。図５ｂに示されるように、４つの領域が存在し、例えば、ｄＮＴＰが領域１８２ａに、プライマーが１８２ｂに、ポリメラーゼが１８２ｃに、マグネシウム化合物が１８２ｄにスポッティングされる。構成成分を別個にスポッティングし、構成成分を再水和するのに先立ってサンプル混合物を加熱することによって、非特異的な反応を最小限に抑えることができる。構成成分の任意の組み合わせをこのようにしてスポッティングすることができ、構成成分をブリスタの１つまたは複数の領域にスポッティングするこの方法は、本発明の任意の実施形態とともに使用されてもよいことが理解される。

小容積のＰＣＲ反応ブリスタ１８１、１８２、および１８３につながるチャネル１６５、１６６、および１６７は封止され、空気圧ブラダーは、熱サイクリングのため、ペルチェ素子などの加熱／冷却素子にアレイを緩やかに押し付ける。サイクリングパラメータは、第二段階熱サイクリングに対して独立して設定されてもよい。例えば、青色光（４５０〜４９０ｎｍ）などの励起源の焦点をアレイ上に合わせ、結果として得られる蛍光発光を、例えば５１０ｎｍを上回る蛍光発光を画像化することによって、反応がモニタリングされる。

上述の例では、ピンチ弁について考察されていない。しかし、サンプルをブリスタの１つに収容することが望ましいとき、特定のブリスタとの間に通じるチャネルの上に位置付けられた空気圧アクチュエータが加圧されて、ピンチ弁が作成され、チャネルが閉鎖されることが理解される。反対に、サンプルをブリスタの１つから移動させることが望ましいとき、適切な空気圧アクチュエータが減圧されて、チャネルを通してサンプルを流すことが可能になる。

図５で上述したパウチは、試薬リザーバブリスタ１０１〜１０８を含み、ユーザは、例えばパウチ１１０を機器に挿入するのに先立って、試薬を付属部品１９０からパウチ１１０のプラスチックフィルム部分１１７内の試薬リザーバブリスタ１０１〜１０８に注入している。様々なブリスタの内容物を異なる温度で維持する能力を有することを含め、図５の試薬リザーバブリスタを使用することには利点があるが、いくつかの不利な点もある。オペレータは、試薬を付属部品１９０からリザーバブリスタ１０１〜１０８へと移動させることに関与しており、また、これは機械の外部で、したがって活性化されたピンチ弁を有さずに行われる場合が多いので、時には試薬がリザーバブリスタから作動中のブリスタへと漏れる恐れがある。調製および装填の間、リザーバブリスタ内の試薬は露出する。それらが圧迫され、圧搾され、またはさらには軽くぶつけられた場合、試薬が利用可能なチャネルを通して漏れることがある。試薬の損失が相当量である場合、反応が完全に失敗することがある。さらに、動作中、リザーバブリスタ１０１〜１０８から押し出される試薬の量がある程度ばらつくことがあり、一貫しない結果につながる。付属部品１９０に対する試薬の導入、および付属部品１９０から試薬リザーバブリスタ１０１〜１０８への試薬の移動を自動化することによって、これらの問題の多くが解決され、これは本発明の範囲内にある。

図６のパウチ２１０は、これらの課題の多くに対して、例えば空気圧ピストンを介して、機器自体がプランジャ２６８を移動させ、試薬が必要なときに試薬を様々な作動中のブリスタに流し込む、直接注入の方策を使用することによって、異なる形で対処する。試薬を図５のリザーバブリスタ１０１〜１０８に格納するのではなく、図６の実施形態では、試薬は、付属部品２９０の様々なチャンバ２９２に導入され、必要になるまでそこで維持される。適切な時点でピストン２６８を空気圧で動作させることによって、測定された量の試薬が適切な反応ブリスタに導入される。上述の課題の多くに対処することに加えて、パウチ２１０はまた、はるかに小型の形状を有して、より小型の機器設計を可能にしており、パウチ２１０は、より短いチャネルを有して、流体の流れをより良好にするとともに、チャネル内での試薬の損失を最小限に抑えている。

図６の１つの実施形態では、試験すべきサンプル（１００μｌ）および溶解緩衝液（２００μｌ）を含む３００μｌの混合物が、注入ポート２４１ａに注入される。水もシール２３９ｂを介して付属部品２９０に導入されて、チャネル２９３（陰影で示される）を介してチャンバ２９２ｂ〜２９２ｌにそれぞれ乾燥形態ですでに供給されている、最大１１の異なる試薬を水和する。これらの試薬は、例えば、凍結乾燥されたＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄溶液、イムノアッセイ試薬、または他の化学的実体を含んでもよい。図６の例の場合、試薬は、核酸抽出、第一段階多重ＰＣＲ、多重反応の希釈、および第二段階ＰＣＲ試薬の調製、ならびに対照反応のためのものである。図６に示される実施形態では、注入する必要があるのは、ポート２４１ａ内のサンプルおよびポート２４１ｂ内の水のみである。

図６に示されるように、シール２９３ｂを介して注入される水は、チャネル２９３を介して様々なチャンバに分配される。この実施形態では、サンプルおよび水のみをパウチ２１０に注入すればよい。しかし、水を各チャンバ２９２に独立して注入できることが理解される。さらに、乾燥試薬を様々なチャンバ２９２に供給し、水を注入する際に水和するのではなく、特定の湿潤試薬を所望に応じて各チャンバに注入できることが理解される。それに加えて、チャンバ２９２の１つまたは複数には水のみを供給することができ、必要な試薬が適切な反応ブリスタ内で乾燥させて供給されてもよいことが理解される。特定の反応の必要性によって決定付けられるような、上述のものの様々な組み合わせが、本発明の範囲内にある。

図６で分かるように、付属部品２９０の底面２９７上に任意の突起２１３が設けられる。図示されるように、突起２１３はそれら個々の入口チャネル２１５内に位置する。しかし、他の構成も可能である。突起２１３は、入口チャネル２１５を開放し、プランジャ２６８が押し下げられたときに入口チャネル２１５をピンチオフするような形で、底面２９７が別の平坦面を係合するのを防ぐのを支援し、それによってプランジャ２６８を活性化する際の逆流を防ぐ助けとなる。かかる突起は、本発明による様々なパウチのいずれに使用されてもよい。

水がパウチに注入されて、付属部品の複数のチャンバ内にある複数の乾燥試薬を水和する実施形態では、注入ポートと多数のチャンバとの間でチャネルを閉止する手段が望ましい。チャネルが閉止されない場合、各プランジャの活性化によって、その個々のチャンバの内容物の一部がチャネルに戻ることがあり、場合によっては隣のチャンバが汚染され、チャンバに収容されそこから送達される体積が変更される。上述したようなノッチ付きのプランジャ２６８を回転させること、チャネルを横切ってプラスチックフィルムをヒートシールし、それによってチャネルを恒久的に閉止すること、およびピンチ弁としてチャネルに圧力を印加することを含む、このチャネルを閉止するいくつかの方法が使用されてきた。付属部品に組み込まれた弁、例えば一方向弁など、他の閉鎖も使用されてもよい。

流体がチャンバ２９２に装填され、パウチ２１０が機器に装填された後、プランジャ２６８ａが、例えば空気圧ピストンの活性化によって押し下げられて、サンプルの余りがチャネル２１４を介して三葉ブリスタ２２０に流し込まれる。図１および５に示される実施形態と同様に、三葉ブリスタ２２０の葉２２４、２２６、および２２８は、図７〜９に示される、ブラダーアセンブリ８１０の作用ブラダー８２４、８２６、および８２８を介して連続して圧縮されて、液体が葉の間の狭いネクサス２３２を通され、高速衝突が駆動され、サンプルが剪断し、例えば開きにくい胞子（hard-to-open spores）、細菌、および真菌からの核酸を含む、核酸が遊離する。細胞溶解は、適当な時間長の間、例えば０．５〜１０分間継続する。

一旦細胞が適切に溶解されると、プランジャ２６８ｂが活性化され、チャンバ２９２ｂに格納された核酸結合磁性ビーズが、チャネル２３６を介して三葉ブリスタ２２０の上側の葉２２８に注入される。サンプルは磁性ビーズと混合され、混合物を適当な時間長の間、例えば約１０秒〜１０分間培養することができる。

サンプルおよびビーズの混合物は、ブラダー８２６の作用によってチャネル２３８を通ってブリスタ２４４に、次にブラダー８４４の作用によってチャネル２４３を通ってブリスタ２４６に流し込まれ、そこで、図８に示される、ブリスタ２４５に隣接して機器８００内に配置された格納式の磁石８５０が、溶液からの磁性ビーズを捕捉して、ブリスタ２４６の内表面に接してペレットを形成する。次に、ブリスタ２４６の上に位置付けられた空気圧ブラダー８４６が、液体をブリスタ２４６から押し出し、ブリスタ２４４を通して、この場合は廃棄物レセプタクルとして使用されるブリスタ２２２に戻す。しかし、図５に関して上述したように、他の廃棄物レセプタクルが本発明の範囲内にある。プランジャ２６８ｃ、２６８ｄ、および２６８ｅの１つが活性化されて、洗浄溶液を、チャネル２４５を介してブリスタ２４４に、次にチャネル２４３を介してブリスタ２４６に供給してもよい。任意に、磁石８５０は撤回され、磁性ビーズは、ブラダー８４４および８４６を交互に加圧することにより、チャネル２４３を介してブリスタ２４４および２４６からビーズを前後に移動させることによって洗浄される。一旦磁性ビーズが洗浄されると、磁性ビーズは、磁石８５０の活性化によってブリスタ２４６内で再捕捉され、次に洗浄溶液がブリスタ２２２へと移動させられる。このプロセスは、溶解緩衝液およびサンプルのデブリを核酸結合磁性ビーズから洗い流すため、必要に応じて繰り返されてもよい。例えば、チャンバ２９２ｃ、２９２ｄ、および２９２ｅ内の洗浄試薬を１回ずつ使用して、３回の洗浄が行われる。しかし、より多数またはより少数の洗浄が本発明の範囲内にあることが理解される。より多数の洗浄が望ましい場合、より多数のチャンバ２９２が提供されてもよい。あるいは、各チャンバ２９２がより多量の流体を保持してもよく、プランジャの活性化によって、活性化毎に体積の一部のみがチャンバから押し出されてもよい。

洗浄後、チャンバ２９２ｆに格納された溶出緩衝液は、チャネル２４７を介してブリスタ２４８へと移動させられ、磁石は撤回される。溶液はチャネル２５２を介してブリスタ２４６および２４８の間で循環されて、ブリスタ２４６内の磁性ビーズのペレットが破壊され、捕捉された核酸をビーズから解離し溶液に加えることが可能になる。磁石８５０は再度活性化されて、ブリスタ２４６内で磁性ビーズが捕捉され、溶出された核酸溶液がブリスタ２４８に流し込まれる。

プランジャ２６８ｈは押し下げられ、チャンバ２９２ｈからの第一段階ＰＣＲマスターミックスはブリスタ２４８内の核酸サンプルと混合される。任意に、混合物は、ブラダー８４８および８６４を交互に活性化して、チャネル２５３を介して２４８および２６４の間で混合物を移動させることによって混合される。いくつかの混合サイクル後、溶液は、第一段階多重ＰＣＲが行われるブリスタ２６４に収容される。望ましい場合、混合に先立って、例えば第一段階ＰＣＲマスターミックスをブリスタ２６４内へと移動させることによって、またはブリスタ２４８に隣接してヒーターを提供することによって、第一段階ＰＣＲマスターミックスを予熱する間、サンプルがブリスタ２４６内で保定されてもよい。上述したように、この予熱はホットスタートＰＣＲの利益をもたらしてもよい。図８に示される機器８００は、サンプルを加熱し冷却する、ペルチェベースの熱サイクラー８８６および８８８を特徴とする。しかし、上述したように、他のヒーター／クーラーデバイスが使用されてもよいことが理解される。任意に、ブリスタ２４８および２６４の間での混合は、両方のブリスタ２４８および２６４を加熱し冷却するように位置付けられた熱サイクラー８８６を用いて、温度サイクリングの間継続してもよい。かかる混合によって、いくつかの実施形態において第一段階ＰＣＲ反応が改善することが見出されている。また、熱サイクリングは、２つ以上の異なるブリスタの温度を変化させ、エネルギー消費を最小限に抑えられるようにし、熱サイクリング速度を最大にすることによって達成することができる。例えば、温度は、ブリスタ２４８で９５℃、ブリスタ２６４で６５℃に維持することができ、これらのブリスタ間でサンプルを移動させることによって、熱がサンプルを有効に出入りして、迅速かつ正確な熱サイクリングが可能になる。温度サイクリングは、例えば１５〜２０サイクル行われるが、上述したように、用途に応じて、他のレベルの増幅が望ましいことがある。以下で分かるように、第二段階増幅域２８０は１８の第二段階反応で増幅を検出するように構成されている。したがって、１８の異なるプライマー対が、ブリスタ２６４内におけるＰＣＲ反応に含まれてもよい。

代替のホットスタート方法では、パウチ２１０は、ブリスタの１つ、例えばブリスタ２６４内に提供されるプライマーを有して製造される。一実施形態では、プライマーは、別個に凍結乾燥され、次に製造中に、脆いペレットとしてブリスタ２６４に導入される。第一段階ＰＣＲに先立って、例えば、サンプルはブリスタ２４６から溶出され、ブリスタ２６４まで押し進められてプライマーペレットを再水和する。ブリスタ２４８および２６４に隣接して位置付けられるペルチェ８８６は、４８℃まで加熱され、ＰＣＲマスターミックスはブリスタ２４８まで押し進められる。２つのブリスタが４８℃に達するまでの、例えば１０秒間の保持の後、ブリスタ２４８および２６４の間の混合が始まる。したがって、構成成分が別個に４８℃に達するまで、酵素およびｄＮＴＰはブリスタ２４８内に残り、サンプルおよびプライマーの大部分はブリスタ２６４内に残る。しかし、４８℃という選択は、第一段階増幅と、５０℃以下で活性であるＡＭＶを使用したＲＴとを同時に行う場合に使用したことが理解される。ＲＴが不要の場合、またはより熱安定性の高いＲＴ酵素が使用される場合、特定の第一段階増幅プロトコルにおけるプライマー融解温度または他の因子に応じて、２つのブリスタ２４８および２６４の一方または両方が５８℃以上に加熱されてもよい。このホットスタート方法が、本発明の任意の実施形態とともに使用されてもよいことが理解される。

代替実施形態では、第一段階ＰＣＲ反応の複雑さを低減するため、ブリスタ２４８は２つ以上のブリスタに分割されてもよい。多重反応の非特異的な生成物の数は、混合物中のプライマーの数の二乗（または場合によってはより高倍率）に増加し、一方で、検定の感度の損失は入力サンプルの量の線形関数であると考えられる。したがって、例えば、第一段階ＰＣＲを、この実施形態の単一の反応量のそれぞれ半分である２つの反応に分割することで、感度が２分の１に低減されるが、非特異的な反応の量および複雑さは４分の１程度になる。ブリスタ２４８が２つ以上のブリスタに分割される場合、ブリスタ２６４は、ブリスタ２４８の数に等しい数のブリスタに分割されてもよい。個々のブリスタ２４８はそれぞれ、個々のチャネル２５３を介して、その個々のブリスタ２６４に接続されることになる。各ブリスタ２６４は、すべてのプライマーの部分集合を含むペレットを備えることになる。ブリスタ２４６からのサンプルは各ブリスタ２４８にわたって分割され、各ブリスタ２４８は他のすべてから封止され、熱サイクリングは、上述したように、ブリスタ２４８および２６４の各対を用いて進行することになる。熱サイクリング後、サンプルは、ブリスタ２６６内へと再結合されるか、または第二段階ブリスタの別個の組へと個々に送られることになる。

所望のサイクル数にわたって第一段階ＰＣＲが進行した後、サンプルは、少量のみを残してサンプルの大部分をブリスタ２４８内に戻し、チャンバ２９２ｉからの第二段階ＰＣＲマスターミックスを添加することによって、図５の実施形態に関して上述したように希釈されてもよい。あるいは、２９２ｉからの希釈緩衝液は、チャネル２４９を介してブリスタ２６６へと移動させられ、次に、流体をブリスタ２６４および２６６の間で前後に移動させることによって、ブリスタ２６４内の増幅サンプルと混合されてもよい。混合後、ブリスタ２６４に残っている希釈されたサンプルの一部分は、ここでは廃棄物レセプタクルである三葉ブリスタ２２２へと押し流される。望ましい場合、希釈は、チャンバ２９２ｊおよび２９２ｋからの希釈緩衝液を使用して、複数回繰り返されてもよく、次に、チャンバ２９２ｇからの第二段階ＰＣＲマスターミックスが、希釈された増幅サンプルの一部またはすべてに添加される。希釈ステップの数を変更することによって、または希釈緩衝液もしくは第二段階ＰＣＲマスターミックスとの混合に先立って廃棄されるサンプルの割合を変更することによって、希釈のレベルが調節されてもよいことが理解される。望ましい場合、サンプルおよび第二段階ＰＣＲマスターミックスのこの混合物は、第二段階増幅のために第二段階ブリスタ２８２へと移動させるのに先立って、ブリスタ２６４内で予熱されてもよい。上述したように、かかる予熱は、第二段階ＰＣＲ混合物中のホットスタート構成成分（抗体、化学薬品、その他）の必要性を取り除いてもよい。

実例となる第二段階ＰＣＲマスターミックスは不完全であってプライマー対が欠落しており、１８個の第二段階ブリスタ２８２にはそれぞれ、特異的なＰＣＲプライマー対が予備装填される。望ましい場合、第二段階ＰＣＲマスターミックスは他の反応構成成分が欠落していてもよく、それにより、これらの構成成分は、同様に第二段階ブリスタ２８２に予備装填されてもよい。上記例に関して上述したように、各プライマー対は、第一段階ＰＣＲプライマー対と同一であってもよく、または第一段階プライマー対内で入れ子であってもよい。サンプルをブリスタ２６４から第二段階ブリスタへと移動させることで、ＰＣＲ反応混合物が完成する。チャンバ２９２ｌからの対照サンプルも、チャネル２６７を介して対照ブリスタ２８３へと移動させられる。対照サンプルは、所望に応じて陽性または陰性の対照であってもよい。例えば、各パウチは、プロセスにおける各ステップの動作を検証し、陽性の結果は以前に増幅された核酸による自己汚染の結果ではないことを実証する、対照反応を含むことになる。しかし、これは多くのプロトコルにおいて、特に高度に多重化された反応の場合に実用的でない。適切な対照を提供する１つの実例となる方法は、パン酵母などの種をサンプルに加えることを伴う。核酸は、他の核酸とともに、酵母から抽出される。第一および第二段階ＰＣＲ反応は、酵母ゲノムからのＤＮＡおよび／またはＲＮＡ標的を増幅する。例えば、スプライシングしたｍＲＮＡ前駆体由来のｍＲＮＡ配列を使用して、イントロンをつなぐようにプライマー配列を配置することによって、ＲＮＡ特異的な標的配列を生成することができる。参照標準に対する酵母コピー数を定量的に分析することによって、システムの各構成要素が作動していることの実質的な検証が可能になる。多くの第二段階検定それぞれに対する陰性対照反応が、より大きな問題である。対照反応を並行して、または別個の実行において行うことが望ましいことがある。

ブラダーアセンブリ８１０のブラダー８８２を活性化することによって、サンプルがそれらの個々の第二段階ブリスタ２８２、２８３に封止され、ブラダー８８０を活性化することによって、第二段階ブリスタ２８２、２８３に対して緩やかな圧力が掛かって、第二段階ブリスタ２８２、２８３がヒーター／クーラーデバイスと接触する。第二段階増幅域２８０の上に位置付けられたウィンドウ８４７によって、ＰＣＲ中、および反応生成物のＤＮＡ融解曲線分析中の、アレイの蛍光モニタリングが可能になる。

図６のパウチ２１０は、未封止の範囲２５５および未封止の範囲２５６など、いくつかの未封止の範囲を有することに留意されたい。これらの未封止の範囲は、この実施形態における反応のいずれにも関与しないブリスタを形成する。むしろ、これらの未封止の範囲は、作動中のブリスタとチャネルとの間の空間に提供される。いくつかの製造プロセスでは、すべての未使用の空間に封止されるパウチと比べて、２５５および２５６などの未封止の範囲が提供されたとき、恐らくはフィルム材料における問題となるしわを低減することによって、漏れがより少なくなる場合があることが見出されている。かかる未封止の範囲は、任意に、あらゆるパウチの実施形態で提供されてもよい。

図８は、パウチ２１０とともに使用することができる、実例となる装置８００を示す。機器８００は、ケーシングの壁を形成することができる、またはケーシング内に搭載することができる、支持部材８０２を含む。機器８００はまた、パウチ２１０の挿入および抜出しを可能にする、支持部材８０２に対して任意に移動可能である第２の支持部材８０４を含む。可動の支持部材８０４は、トラック上に搭載されてもよく、または様々な方法のいずれかで支持部材８０２に対して移動させてもよい。例えば、一旦パウチ２１０が機器８００に挿入されると、蓋８０５がパウチ２１０の上に適合する。別の実施形態では、両方の支持部材８０２および８０４が固定され、パウチ２１０が他の機械的手段によって、または空気圧によって適所で保持されてもよい。

例えば、ブラダーアセンブリ８１０および空気圧弁アセンブリ８０８は可動部材８０２上に搭載され、ヒーター８８６および８８８は支持部材８０２上に搭載される。しかし、この配置は単なる例示であり、他の配置が可能であることが理解される。ブラダーアセンブリ８１０および空気圧弁アセンブリ８０８が可動の支持部材８０４上に搭載されると、これらの空気圧アクチュエータを、空気圧アクチュエータがパウチ２１０と接触するように、パウチ２１０に向かって移動させてもよい。パウチ２１０が機器８００に挿入され、可動の支持部材８０４が支持部材８０２に向かって移動させられると、パウチ２１０の様々なブリスタは、ブラダーアセンブリ８１０の様々な空気圧ブラダーおよび空気圧弁アセンブリ８０８の様々な空気圧ピストンに隣接した位置にあるので、空気圧アクチュエータを活性化することによって、液体がパウチ２１０のブリスタの１つもしくは複数から押し出されてもよく、またはパウチ２１０の１つもしくは複数のチャネルとともにピンチ弁が形成されてもよい。パウチ２１０のブリスタおよびチャネルと、ブラダーアセンブリ８１０および空気圧弁アセンブリ８０８の空気圧アクチュエータとの間の関係については、図９および１０に関して以下でより詳細に考察する。

各空気圧アクチュエータは１つまたは複数の空気圧管継手を有する。例えば、ブラダーアセンブリ８１０のブラダー８２４は空気圧管継手８２４ａを有し、空気圧ピストン８４３はそれに関連する空気圧管継手８４３ａを有する。実施形態では、ブラダーアセンブリ８１０の空気圧管継手はそれぞれ、可動の支持部材８０４の通路８１６を通って延在し、そこでホース８７８が弁８９９を介して各空気圧管継手を圧縮空気源８９５に接続する。実施形態では、通路８１６は圧縮空気源８９５へのアクセスを提供するだけでなく、通路はまた、ブラダーがパウチ２１０のブリスタと適正に並ぶように、ブラダーアセンブリ８１０の様々な構成要素を位置合わせする助けとなる。

同様に、空気圧弁アセンブリ８０８も可動の支持部材８０４上に搭載されるが、他の構成も可能であることが理解される。実施形態では、空気圧弁アセンブリ８０８のピン８５８は、可動の支持部材８０４上の搭載開口部８５９に嵌め込まれ、空気圧ピストン８４３、８５２、８５３、および８６２は、可動の支持部材８０４の通路８１６を通って延在してパウチ２１０に接触する。例証されるように、ブラダーアセンブリは可動の支持部材８０４の第１の面８１１に搭載され、空気圧弁アセンブリ８０８は可動の支持部材８０４の第２の面８１２に搭載される。しかし、空気圧ピストン８４３、８５２、８５３、および８６２が通路８１６を通って延在するため、空気圧弁アセンブリ８０８の空気圧ピストンおよびブラダーアセンブリ８１０の空気圧ブラダーは、ともに作動して、パウチ２１０に必要な空気圧アクチュエータを提供する。

上述したように、ブラダーアセンブリ８１０および空気圧弁アセンブリ８０８の空気圧アクチュエータはそれぞれ、関連する空気圧管継手を有する。いくつかのホース８７８のみが図８に示されているが、各空気圧管継手は、ホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に接続されることが理解される。圧縮ガス源８９５はコンプレッサであってもよく、あるいは、圧縮ガス源８９５は、二酸化炭素シリンダなどの圧縮ガスシリンダであってもよい。圧縮ガスシリンダは、可搬性が望ましい場合に特に有用である。他の圧縮ガス源は本発明の範囲内である。

機器８１０の他のいくつかの構成要素も圧縮ガス源８９５に接続される。支持部材８０２の第１の面８１３に搭載される磁石８５０は、例えば、ホース８７８を介した圧縮ガス源８９５からのガスを使用して配備され撤回されるが、磁石８５０を移動させる他の方法が当該分野において知られている。磁石８５０は、支持部材８０２の陥凹部８５１に収まる。陥凹部８５１は支持部材８０２を通る通路であることができるので、磁石８５０はパウチ２１０のブリスタ２４６に接触できることが理解される。しかし、磁石８５０が配備されるとき、磁石８５０がブリスタ２４６に十分な磁場を提供するのに十分に近く、磁石８５０が撤回されるとき、磁石８５０がブリスタ２４６内に存在するいずれの磁性ビーズにも有意に影響しない限り、支持部材８０２の材料に応じて、陥凹部８５１が必ずしも支持部材８０２全体を通って延在しなくてもよいことが理解される。磁石８５０の撤回を参照すると、電磁石が使用されてもよく、電磁石を通る電気の流れを制御することによって電磁石が活性化され不活性化されてもよいことが理解される。したがって、本明細書では磁石の抜出しまたは撤回について考察するが、これらの用語は磁場を抜き出す他の方法を組み込むのに十分に広範であることが理解される。空気圧接続は、空気圧ホースまたは空気圧マニホルドであってもよく、したがって必要なホースまたは弁の数が低減されることが理解される。

支持体８０２上に搭載される、空気圧ピストンアレイ８６９の様々な空気圧ピストン８６８も、ホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に接続される。空気圧ピストン８６８を圧縮ガス源８９５に接続する２つのホース８７８のみが示されているが、空気圧ピストン８６８はそれぞれ圧縮ガス源８９５に接続されることが理解される。１２個の空気圧ピストン８６８が示される。パウチ２１０が機器８００に挿入されると、１２個の空気圧ピストン８６８は、パウチ２１０のそれら個々の１２個のプランジャ２６８を活性化させるように位置付けられる。蓋８０５がパウチ２１０の上で閉止されると、蓋８０５の上のリップ８０６が付属部品２９０を支持するので、空気圧ピストン８６８が活性化されると、蓋８０５が付属部品２９０を適所で保持する。付属部品２９０の他の支持体は、本発明の範囲内にあることが理解される。

一対の加熱／冷却デバイス、例えばペルチェヒーターが、支持体８０２の第２の面８１４に搭載される。第一段階ヒーター８８６は、第一段階ＰＣＲのために、ブリスタ２６４の内容物を加熱および冷却するように位置付けられる。第二段階ヒーター８８８は、第二段階ＰＣＲのために、パウチ２１０の第二段階ブリスタ２８２および２８３の内容物を加熱および冷却するように位置付けられる。しかし、これらのヒーターを他の加熱目的にも使用することができ、特定の用途に対して適切に、他のヒーターが含まれてもよいことが理解される。

望ましい場合、サンプルが実際に特定のブリスタに流れ込んだかに関してフィードバックを提供する、フィードバック機構（図示なし）が機器８００に含まれてもよい。実例となるフィードバック機構は、特に蛍光または着色色素が含まれる場合、温度もしくは圧力センサまたは光学検出器を含む。かかるフィードバック機構は、例えば、支持部材８０２または８０４のどちらかに搭載されてもよい。例えば、圧力センサは、ブリスタ２６４の位置に隣接して支持体８０２に搭載されてもよい。サンプルが仮にブリスタ２６４へと移動させられると、圧力センサが押し下げられた場合、サンプル処理を継続することが可能になる。しかし、圧力センサが押し下げられない場合、サンプル処理が停止されてもよく、またはエラーメッセージが画面８９２に表示されてもよい。ブリスタすべての任意の組み合わせがフィードバックを有して、パウチを通るサンプルの適正な移動に関するフィードバックを提供してもよい。

蛍光検出が望ましい場合、光学アレイ８９０が提供されてもよい。図８に示されるように、光学アレイ８９０は、光源８９８、例えばフィルタ付きＬＥＤ光源、フィルタ処理済みの白色光、またはレーザー照明と、カメラ８９６とを含む。可動の支持体８０４を通るウィンドウ８４７は、パウチ２１０の第二段階増幅域２８０へのアクセスを光学アレイ８９０に提供する。カメラ８９６は、例えば、パウチ２１０の第二段階ブリスタ２８２、８２３にそれぞれ対応する複数の光検出器を有する。あるいは、カメラ８９６は、第二段階ブリスタ２８２、２８３をすべて含む画像を撮ってもよく、画像は、第二段階ブリスタ２８２、２８３それぞれに対応する別個のフィールドに分割されてもよい。構成に応じて、光学アレイ８９０は定置であってもよく、または、光学アレイ８９０は、１つもしくは複数のモータに取り付けられた移動装置上に配置され、個々の第二段階ブリスタ２８２、２８３それぞれからの信号を得るように移動させられてもよい。他の配置が可能であることが理解される。

図示されるように、コンピュータ８９４は、圧縮空気源８９５の弁８９９を制御し、したがって、機器８００の空気圧すべてを制御する。コンピュータ８９４はまた、ヒーター８８６および８８８ならびに光学アレイ８９０を制御する。これらの構成要素はそれぞれ、例えばケーブル８９１を介して、電気的に接続されるが、他の物理的または無線接続が本発明の範囲内にある。コンピュータ８９４は、機器８９０内に収納されてもよく、または機器８９０の外部にあってもよいことが理解される。さらに、コンピュータ８９４は、構成要素のいくつかまたはすべてを制御する内蔵回路基板を含んでもよく、また、光学アレイからデータを受信し表示する、デスクトップもしくはラップトップＰＣなどの外部コンピュータを含んでもよい。温度、サイクル数などの情報および変数を入力するキーを含む、インターフェース８９３、例えばキーボードインターフェースが提供されてもよい。例えば、ディスプレイ８９２も提供される。ディスプレイ８９２は、例えば、ＬＥＤ、ＬＣＤ、または他のかかるディスプレイであってもよい。

図９は、機器８００の動作中におけるブラダーアセンブリ８１０とパウチ２１０との間の関係を示す。ブラダーアセンブリは、サブアセンブリ８１５、８１７、８１８、８１９、および８２２を備える。ブラダーサブアセンブリ８１５のブラダー８０９は大型であるため、ブラダーサブアセンブリ８１５は、例えば、２つの空気圧管継手８１５ａおよび８１５ｂを有する。ブラダー８０９は、チャンバ２９２を（図６に示されるように）パウチ２１０のプラスチックフィルム部分２１７から閉鎖するのに使用される。プランジャ２６８の１つが押し下げられると、空気圧管継手８１５ａおよび８１５ｂの一方または両方によってブラダー８０９を収縮させることができる。チャンバ２９２の１つからの流体が通過した後、ブラダー８０９が再加圧されて、チャネル２１４、２３６、２４５、２４７、および２４９が密閉される。実例となるブラダーサブアセンブリ８１５は１つのみのブラダー８０９を有するが、例えば、チャネル２１４、２３６、２４５、２４７、および２４９がそれぞれ、それ自体の関連するブラダーまたは空気圧ピストンを有する、他の構成も可能であることが理解される。ブラダーサブアセンブリ８２２は、例えば、３つのブラダー８２４、８２６、および８２８を備える。上述したように、ブラダー８２４、８２４、および８２８は、細胞溶解のために三葉ブリスタ２２２を駆動する。例証されるように、ブラダー８２４、８２６、および８２８はそれらの対応するブリスタ２２４、２２６、２２８よりもわずかに大きい。ブラダーの表面は、膨張すると、ある程度ドーム状になることができ、わずかに大きすぎるサイズのブラダーを使用することによって、対応するブリスタの表面全体に良好に接触することが可能になり、ブリスタのより均一な圧力およびより良好な排気が可能になることが見出されている。しかし、状況によっては、個々のブリスタの完全な排気は望ましいことも望ましくないこともあり、排気されるブリスタの容積を制御するため、より大型またはより小型のブラダーが使用されてもよい。ブラダーサブアセンブリ８１７は４つのブラダーを有する。ブラダー８３６は、チャネル２３６のピンチ弁として機能し、ブラダー８４４、８４８、および８６６はそれぞれ、ブリスタ２４４、２４８、および２６６に圧力を供給するように構成されている。ブラダーサブアセンブリ８１８は、ブリスタ２４６および２６４にそれぞれ圧力を供給するように構成されている、２つのブラダー８４６および８６４を有する。最後に、ブラダーサブアセンブリ８１９は第二段階増幅域２８０を制御する。ブラダー８６５はチャネル２６５および２６７のピンチ弁として作用し、ブラダー８８２は、第二段階ブリスタ２８２および２８３に緩やかに圧力を供給して、第二段階ブリスタをヒーター８８８と密接に接触させる。ブラダーアセンブリ８１０は５つのサブアセンブリを備えるが、この構成は単なる例示であり、任意の数のサブアセンブリを使用することができ、ブラダーアセンブリ８１０を単一の統合アセンブリとして提供できることが理解される。

図１０は、同様に、機器８００の動作中における空気圧弁アセンブリ８０８とパウチ２１０との間の関係を示す。空気圧弁アセンブリ８０８は、ブラダーではなく、４つの空気圧ピストン８４２、８５２、８５３および、８６２を有する。これらの空気圧ピストン８４２、８５２、８５３、および８６２は、圧縮空気によってそれぞれ駆動され、チャネル２４２、２５２、２５３、および２６２に対して指示された圧力を供給する。ピストンの直径はかなり狭いため、ブラダーサブアセンブリ８１７とブラダーサブアセンブリ８１８との間に適合して、チャネル２４２、２５２、２５３、および２６２に対してピンチ弁を提供して、チャネル２４２、２５２、２５３、および２６２をかなり短くするのを可能にすることができる。しかし、望ましい場合、空気圧ピストン８４２、８５２、８５３、および８６２を、ブラダーアセンブリ８１０に含まれてもよいブラダーに置き換えて、空気圧弁アセンブリ８０８の必要性を取り除くことができる。ブラダーおよび空気圧ピストンの任意の組み合わせが本発明の範囲内にあることが理解される。また、当該分野において知られているような、パウチ２１０のチャネルおよびブリスタに圧力を供給する他の方法が、本発明の範囲内にあることが理解される。

図１２は、図６のパウチ２１０と類似したパウチ５１０を示す。入口チャネル５１５ａ〜５１５ｌを有する付属部品５９０は、入口チャネル２１５ａ〜２１５ｌを有する付属部品２９０と類似している。個々のチャネル５３８、５４３、５５２、５５３、５６２、および５６５を有するブリスタ５４４、５４６、５４８、５６４、および５６６は、パウチ２１０の個々のチャネル２３８、２４３、２５２、２５３、２６２、および２６５を有するブリスタ２４４、２４６、２４８、２６４、および２６６に類似している。パウチ２１０のチャネル２４５、２４７、および２４９は、パウチ５１０上のチャネル５４５ａ〜ｃ、５４７ａ〜ｂ、および５４８ａ〜ｃとして多少再構成されており、５１０の個々のチャネルは、パウチ２１０上のそれらに対応するチャネルより多少短い。しかし、チャネル構成は単なる例示であり、様々なチャネル構成が本発明の範囲内にあることが理解される。

図１２のパウチ５１０と図６のパウチ２１０との間には２つの主な違いがある。第一に、三葉ブリスタ２２２が溶解ブリスタ５２２と置き換えられている。溶解ブリスタ５２２は、図２ｂに示されるような、電気モータ１９に取り付けられた回転ブレードまたはパドル２１を使用して、衝撃によってボルテックス形成するように構成されている。この溶解方法は、空気圧ピストンの交互の圧力に依存しないので、一葉ブリスタのみが示される。溶解ブリスタ５２２は単一の葉のみを有するので、両方のチャネル５１４および５３６は溶解ブリスタ５２２の単一の葉につながる。溶解ブリスタ５２２が、本明細書に開示されるパウチの実施形態のいずれに使用されてもよいことが理解される。さらに、溶解アセンブリ８１０は、例えば、ブラダーサブアセンブリ８２２のブラダー８２４、８２６および８２８を、ブリスタ５２２用に構成された単一のブラダーと置き換えるように修正されてもよいことが理解される。反対に、上述の他の様々な実施形態に記載したような三葉ブリスタが、パウチ５１０に使用されてもよい。溶解ブリスタ５２２は、例えば、接着剤または積層を使用して溶解ブリスタ５２２の外表面に取り付けられる、任意の補強パッチ５２３を備えてもよい。補強パッチ５２３は、パドル２１が繰返し接触することによるパウチ５１０の裂けを最小限に抑える助けとなる。図１３は、第２の支持部材８０４上に搭載された電気モータ、例えばマブチＲＣ−２８０ＳＡ−２８６５直流モータ（千葉、日本）を示す。実例となる一実施形態では、モータは、５，０００〜２５，０００ｒｐｍで、さらに例えば１０，０００〜２０，０００ｒｐｍで、さらにまた例えば約１５，０００〜１８，０００ｒｐｍで回転する。マブチモータの場合、７．２Ｖで溶解に十分なｒｐｍが提供されることが見出されている。しかし、ブレード２１がパウチ５１０に衝撃を与えれば、実際の速度は多少低速であってもよいことが理解される。使用されるモータおよびパドルに応じて、他の電圧および速度が溶解に使用されてもよい。任意に、少量の制御された空気が、溶解ブリスタ５２２に隣接したブラダーに供給されてもよい。いくつかの実施形態では、隣接したブラダーに１つもしくは複数の少量の空気を部分的に充填することは、溶解プロセス中に溶解ブリスタを位置付け支持する助けとなることが見出されている。あるいは、他の構造、例えば、溶解ブリスタ５２２の周りの剛性もしくは柔軟なガスケットまたは他の保定構造を使用して、溶解中にパウチ５１０を拘束することができる。

図１２のパウチ５１０と図６のパウチ２１０との間の第２の主な違いは、第二段階増幅域２８０のブリスタ２８１、２８２、および２８３が、第二段階増幅域５８０内の高密度アレイ５８１と置き換えられていることである。高密度アレイ５８１は、複数の第二段階ウェル５８２、例えば５０以上のウェル、さらに例えば１２０以上のウェルを備える。より多数の、例えば約２００、約４００、またはさらには約５００以上の第二段階ウェル５８２を含む実施形態は、本発明の範囲内にある。他の構成も同様に本発明の範囲内にある。追加の第二段階ウェル５８２は、ウェル５８２をより小さく作ることによって、高密度アレイ５８１をより大きくすることによって、またはそれらの組み合わせによって追加されてもよい。第二段階ＰＣＲの場合、ウェルはそれぞれ一対のプライマーを収容してもよい。１つまたは複数のウェルが陽性または陰性対照に使用されてもよいことが理解される。

ブリスタ５６６内の希釈された第一段階増幅生成物がウェルに充填されるにつれて、ウェル間の相互汚染が主要な問題となり得る。相互汚染は、パウチ２１０では、図９に示されるように、チャネル２６５の別個のブランチを通して各第二段階ブリスタを充填し、次にブラダー８８２で封止することによって制御していた。流体がブリスタ５８４のいくつかまたはすべてを充填してもよい、高密度アレイ５８１を用いると、ウェル間の相互汚染も制御しなければならない。一実施形態では、第二段階ＰＣＲプライマーは、各ウェルの内表面に対して共有結合的または非共有結合的に結合され、それによってＰＣＲチップと非常に類似して機能してもよい。しかし、多くの実施形態では、ＰＣＲプライマーをウェルに係留することなく、ウェル間の相互汚染を制御することが望ましい。ウェル間の相互汚染の制御は、ブリスタ５６６からの流体が高密度アレイ５８１の第１の表面５８１aを横切って流れることによってウェル５８２へと移動させられる一実施形態において、困難な場合がある。

第二段階増幅域５８０の装填を成功させるための、いくつかの望ましい特徴がある。第一に、ブリスタ５６６から入ってくる流体が、ウェル５８２のほぼすべてをほぼ同じレベルまで充填することが望ましい。充填されていないウェルは偽陰性信号を生成することになる。第二に、ウェル５８２を充填するプロセスによって、ウェル内のプライマーの漏れを引き起こさないことが望ましい。１つのウェルからのプライマーの損失によって、そのウェルにおけるＰＣＲ反応の効率が制限される場合があり、隣のウェルを汚染する場合がある。第三に、ウェル５８２が充填され、ＰＣＲが開始された後、ウェルは互いから完全に封止されることが望ましい。単位複製配列が１つのウェルから漏れ出し、別のウェルに入ることによって、第１のウェルの信号が低下し、第２のウェルの信号が上昇し、場合によっては第１のウェルの偽陰性および第２のウェルの偽陽性に結び付く可能性がある。さらに、特定の種類の対照の場合、１つのウェルで生成された単位複製配列が、それをさらに増幅させ得る別のウェルに入らないことが重要である。

この問題に対する解決策は、バリア層を使用することを含む。一例では、バリア層は、ウェルを迅速に装填し、バルク流体から迅速に封止することを可能にするために提供される、物理的バリアである。別の例では、組み合わされた科学的および物理的バリアが使用され、物理的バリアはウェルを封止するのに使用され、次に化学的バリアが、例えば加熱、徐放、または酵素消化によって、オリゴヌクレオチドプライマーをウェル溶液内へと条件付きで放出する。ウェル深さ、または各ウェルまでのチャネル長さも、ウェルからの試薬の放出を制御するのに使用されてもよい。高密度アレイ５８１を装填する他の手段が可能である。

図１２〜１５は、物理的バリアを使用する第二段階５８０の実例となる一実施形態を示す。パウチ５１０の第１の層５１８と第２の層５１９との間に、高密度アレイ５８１がウェル５８２とともに挟まれる。図１４で最も良く分かるように、穿孔５８６を有する穿孔層５８５は、高密度アレイ５８１の一面に提供されて物理的バリアとして作用し、第２の層５８７は、高密度アレイ５８１の反対側の面に提供されてウェル５８２の底部を形成する。例えば、穿孔層５８５および第２の層５８７は、例えばヒートシールによって、高密度アレイ５８１に封止されているプラスチックフィルムであるが、他の封止方法が用いられてもよいことが理解される。また、高密度アレイ５８１に使用される材料、ならびに穿孔層５８５および第２の層５８７に使用される材料は、互いに対して、封止方法に対して、かつ使用される化学作用に対して適合性であるべきであることが理解される。ＰＣＲに使用されるとき、高密度アレイ５８１に使用することができ、かつヒートシールすることができる適合性のプラスチックの例は、ＰＥ、ＰＰ、Ｍｏｎｐｒｅｎｅ（登録商標）、および他のブロックコポリマーエラストマーである。蛍光色素が検出化学作用で使用される場合、高密度アレイ５８１は、１つのウェル５８２からその隣のウェルへの信号漏れを最小限に抑えるため、黒色または他の比較的蛍光不透過性の材料から形成され、層５８５および５８７の少なくとも１つに関しては、比較的蛍光透過性の材料から形成されるのが望ましいことがある。穿孔層５８５および第２の層５８７の場合、Ｍｙｌａｒ（登録商標）またはＰＥＴなどの強いエンジニアリングプラスチックと、ＰＥ、ＰＰ、およびＤｕｐｏｎｔ Ｓｕｒｌｙｎ（登録商標）などのヒートシール可能なプラスチック層との積層体が使用されてもよい。接着剤ベースのシステムの場合、ＰＥＴまたはポリカーボネートなどの剛性のエンジニアリングプラスチックを使用して、高密度アレイ５８１が形成されてもよく、次に、ＰＣＲ適合性プラスチックのフィルムが、穿孔層５８５および第２の層５８７として使用される。実例となる一実施形態では、高密度アレイ５８１は黒色のＰＥで形成され、合成ポリエチレン／ＰＥＴ積層体（またはＸｅｒｏｘ（登録商標）ＰＮ １０４７０２ホットラミネート加工パウチ材料）が、穿孔層５８５および第２の層５８７に使用され、それが高密度アレイ５８１にヒートシールされ、剛性ポリプロピレン／ＰＥＴが、パウチ５１０の第１および第２の層５１８、５１９に使用される。

穿孔５８６はウェル５８２と並ぶことが理解される。また、穿孔５８６は、何らかの力なしでは、流体が穿孔５８６を通って容易に流れないように十分に小さいことが理解される。実例となる穿孔は、０．００１〜０．１ｍｍ、例えば０．００５〜０．０２ｍｍ、さらに例えば約０．０１ｍｍであってもよい。実施形態では、第二段階増幅域５８０は真空下で提供されるので、流体がブリスタ５６６から受け入れられると、真空によって流体が穿孔５８６を通して各ウェル５８２に引き込まれる。一旦ウェル５８２が充填されると、流体をウェル５８２に流し込む、またはウェル５８２から押し出す力はもう存在しない。次に、第二段階増幅域５８０に隣接したブラダー（図示されないが、ブラダー８８０／８８２と位置が類似している）が活性化されて、第１の層５１８を高密度アレイ５８１に押し付け、流体をウェル５８２内に封止してもよい。パウチ５１０の第１の層５１８がウェル５８２を封止するのに使用されるが、穿孔層５８５と第１の層５１０との間に任意の封止層が提供されてもよいことが理解される。

１つの実例となる例では、第二段階増幅域５８０は以下のように調製されてもよい。高密度アレイ５８１は、最初に、ウェルのアレイ５８２をプラスチックシート（例えば、厚さ０．１〜１ｍｍ）に穴開け、成型、または別の形で形成することによって調製されてもよい。ウェルは、望ましい任意の規則的または不規則なアレイを形成してもよく、例えば０．０５μｌ〜２０μｌ、さらに例えば０．１μｌ〜４μｌの容積を有してもよい。次に、層５８５または５８７の１つが、例えば熱または接着剤によって、高密度アレイ５８１の第１の表面５８１ａに積層される。図１５に示されるように、穿孔層５８５は第１の表面の５８１ａに適用される。次に、試薬５８９、例えばＰＣＲプライマー対など、固有のアレイの化学作用の要素が、ピペッティングによって手作業で、あるいは自動的に（例えば、ピンスポッター、ドットマトリックススポッター、少量自動ピペット、またはマイクロ流体マイクロ接触スポッター（micro-fluidic micro-contact spotters）など、ｘ／ｙ位置決定可能なスポッターを使用して）ウェルにスポッティングされる。試薬５８９が各ウェル５８２内で乾燥された後、層５８５または５８７の第２のものがアレイ５８１の第２の表面５８１ｂに適用される。層５８５は、小径の針のアレイを使用して穿孔されて、穿孔５８６が形成される。穿孔５８６は、層５８５がアレイ５８１に固着される前または後のどちらかで形成されてもよい。穿孔前もしくは穿孔後の層５８５に対して、または層５８７に対して、スポッティングを行うことができることが理解される。予め穿孔された穴を有するアレイのスポッティングは、実質的に漏れを示さず、穿孔に使用される針が、スポッティングされた試薬に触れることによって汚染されないという利点が提供される。あるいは、漏れの可能性を最小限に抑え、スポッティングされた試薬をアレイの最も遠い位置に位置付けるため、試薬５８９を第２の層５８７上にスポッティングし、アレイ５８１を層５８５で封止し、次に層５８５を穿孔するのが望ましいことがある。実例となる例では、試薬は、ＧｅＳｉＭ Ａ０６０−３２４ナノプロッター２．１／Ｅ（Ｇｒｏｓｓｅｒｋｍａｎｎｓｄｏｒｆ、ドイツ）を使用して、第２の層５８７上にスポッティングされる。かかるスポッターを使用して、複数のアレイが同時にスポッティングされてもよい。

一旦スポッティングされ穿孔されると、アレイ５８１は、パウチ５１０の層５１８および５１９の内部に配置され、例えば、ヒートシール、接着剤の使用、超音波溶接、機械的閉鎖、またはアレイ５８１をブリスタ５８４内のパウチ５１０の内部に封入する他の手段によって、適所で封止される。ブリスタ５８４は、チャネル５６５を介してブリスタ５６６に流体接続され、液体は、チャネル５６５からブリスタ５８４内へ、かつ穿孔５８６の上を流れることができることが理解される。１つの実例となる例では、ブリスタ５８４が形成されると、空気の経路を逃がすことができるように注意が払われる。これは、第二段階増幅域５８０に隣接した第１の層５１８の内表面を「ワッフル加工（waffling）」して、フィルム材料にわずかに***したテクスチャのパターンを刻印することによって達成することができる。これによって、空気および液体が穿孔層５８５の表面に沿って通ることが可能になり、より良好には、液体がウェル５８２に達し、それを充填することが可能になる。次に、パウチ５１０は真空チャンバの内部に配置され、排気される。例えば、圧力が約０．３ミリバールに達すると、真空チャンバ内部の空気圧シリンダが作動して、プランジャを付属部品５９０に押し込んでチャネル５６７を封止し、それによって、シールされたパウチ内部のアレイおよび真空チャンバからの経路が遮断される。複数の他のプランジャも、付属部品５９０に押し込まれて、様々な入口チャネル５１５が封止される。パウチは、真空チャンバから除去され、真空バッグ内で長期保存するためにパッケージ化されてもよい。

パウチ５１０は、パウチ２１０に類似した形で使用されてもよい。アレイ５８１は真空でパッケージ化されるので、液体がブリスタ５６６から第二段階増幅域５８０へと移動させられると、液体サンプルは穿孔５８６を通してウェル５８２に引き込まれる。過剰な液体は、空気圧ブラダーをアレイの上で膨張させることによって排除され、熱サイクリングは、例えばアレイの１つの面に押し付けられたペルチェ素子を加熱および冷却することによって、上述したように達成される。

上述したように、穿孔層５８５は、様々な適切な物理的または化学的バリアと置き換えられてもよい。化学的バリアを使用する、実例となる一実施形態では、穿孔層５８５は省略され、試薬５８９は、比較的ゆっくり溶解する緩衝液中でウェル５８２内にスポッティングされる。例えば、ＰＥＧ、フィコール、もしくはポリソルベート２０などのポリマー、またはスクロース、トレハロース、もしくはマンニトールなどの糖を適切な濃度で含有する試薬５８９は、第二段階ＰＣＲ反応と適合性があり、単に水またはＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ中にスポッティングされたプライマーよりもゆっくりと溶解してもよい。上述したように、これらの緩衝液の１つにスポッティングされたプライマーは、ウェル５８２内で空気乾燥されてもよい（かかる一実施形態では、第２の層５８７はスポッティングのために高密度アレイ５８１に固着されることが理解される）。これらの同じポリマーが、酵素試薬（例えば、ＰＣＲで使用される酵素および緩衝液）の凍結乾燥に使用されて、安定化酵素を含有するオープンマトリックスが形成されてもよい。したがって、これらの緩衝液中にスポッティングされたプライマーを、ウェル５８２内の適所で凍結乾燥して、空気乾燥によるよりもゆっくりであるが、場合によってはより完全な再水和をもたらすことができる。パウチ５１０が使用されるとき、ブリスタ５６６からの流体は、真空または圧力によってウェル内へと駆動され、プライマーミックスを溶解し始める。適切にゆっくり溶解する緩衝液を選択することによって、第二段階増幅域５８０に隣接したブラダーを作動させると、各ウェル５８２の内容物が、あらゆる実質的な相互汚染に先立って中に封止される。

別の実施形態は、第二段階増幅域５８０が所定温度を上回って加熱されるまで溶解しないマトリックスを使用する。かかるマトリックスの１つの例は、ＧｅｎｅＰｕｒｅ ＬｏｗＭｅｌｔ Ａｇａｒｏｓｅ（ＩＳＣバイオエクスプレス（ISC Bioexpress））などの低融点アガロースである。一例では、このアガロースの１．５％溶液は、６５℃で融解し、２４〜２８℃でゲル化する。スポッティングに先立って、試薬５８９は、例えば、５０℃まで温められ、すでに融解しているこのアガロースと混合され、次に少量（例えば、１００〜５００ｎｌ）でウェル５８２内にスポッティングされてもよい。スポッティングの間、混合物を液体のまま保つため、これは、アガロースの融解温度を上回って加熱されたキャビネット内で行わなければならないことがある。あるいは、融解せずにアガロースの希釈溶液をピペッティングすることが可能であってもよい。アガロース／試薬の混合物がスポッティングされた後、高密度アレイ５８１が乾燥される。これは単純な空気乾燥であることができ、または、試薬を凍結乾燥できるように、プライマーとアガロースの混合物は、上述した糖およびポリマーを含有することができる。パウチ５１０がＰＣＲに使用されるとき、ブリスタ５６６からの流体が高密度アレイ５８１内へと移動させられるにつれて、例えば５５℃まで、第二段階増幅域５８０が加熱されてもよい。この温度では、アガロースは融解しないので、プライマーは溶液中へと放出されない。一旦高密度アレイ５８１が充填されると、対応するブラダーが膨張してウェルが封止される。第１のＰＣＲサイクルの第１の変性ステップにおいて、温度が６５℃を上回って上昇すると、プライマーを含有するアガロースが融解して、プライマーをマスターミックス内へと放出する。例えば、熱サイクリングは決して６０℃（またはアガロースの他の融解温度）を下回らないので、アガロースは熱サイクリング中にゲル化しない。さらに、図８の実例となる機器８００では、繰り返される温度サイクリングは、パウチの１つの面に配置されるヒーター８８８によって駆動される。ウェル５８２内のＰＣＲ溶液全体にわたる温度勾配が存在する場合が多く、それによって対流性の流体流によるプライマーの混合が容易になるはずであることが予期される。ワックスも同様の実施形態で使用されてもよい。

さらなる実施形態では、プライマーはウェル５８１に条件付きで結合されてもよく、ウェル５８１が充填された後、続いてプライマーが溶液中に放出される。プライマーがプラスチック基材にどのように取り付けられるかに応じて、プライマーは、熱（例えば、ＰＣＲ反応の第１のサイクル中）、光（例えば、ウィンドウ８４７を通して照射する）、化学薬品（例えば、ジチオスレイトールを熱と併せることにより、プライマーをウェルにリンクさせるのに使用されてもよいジスルフィド結合が低減される）、あるいは酵素（例えば、組織プラスミノゲンアクチベータ（Tissue Plasminogen Activator）などの部位特異的なプロテアーゼを使用して、プライマーを基質に付着させる適切なペプチドリンカーを切断することができる）を使用して、切断されてもよい。

さらに別の実施形態では、増幅に続いて、あらゆる汚染の潜在的リスクをさらに最小限に抑えるため、ＤＮａｓｅが第二段階増幅域５８０に注入されてもよい。

第二段階増幅域５８０は、ＰＣＲとともに使用するために本明細書において記載されていることが理解される。しかし、パウチ５１０および第二段階増幅域５８０に対する他の用途は本発明の範囲内である。さらに、第二段階増幅域５８０は、核酸抽出および第一段階ＰＣＲ増幅域とともに、またはそれらを伴わずに使用されてもよいことが理解される。最後に、第二段階増幅域５８０は、本明細書に開示されるパウチの実施形態のいずれかとともに使用されてもよいことが理解される。

入れ子多重ＰＣＲ
機器８００に類似した、ただしパウチ１１０用に構成された機器上で、一連の反応を図５のパウチ１１０内で実行した。二段階核酸増幅の細胞溶解および有効性を示すため、ログ相の出芽酵母および***酵母の生きた培養物各５０μＬを、健康なドナーからの鼻咽頭吸引物サンプル１００μＬと混合してサンプルを形成し、次に溶解緩衝液２００μＬ（６ＭのグアニジンＨＣｌ、１５％のトリトンＸ １００、３Ｍの酢酸ナトリウムと混合した。次に、溶解緩衝液中のサンプル４００μＬのうち３００μＬを、パウチ１１０のチャンバ１９２ａに注入した。

ＺＳビーズ０．２５ｇを三葉ブリス１２２内に封止して、パウチ１１０を製造した。後述するような第二段階プライマーも、パウチ１１０の製造中にブリスタ１８１および１８２内にスポッティングした。パウチ１１０は以下のようにして装填した。
１１５ａ 上述したようなサンプルおよび溶解緩衝液
１１５ｂ 溶解緩衝液中の磁性ビーズ
１１５ｄ〜ｅ 洗浄緩衝液（クエン酸ナトリウム１０ｍＭ）
１１５ｇ 溶出緩衝液（Ｔｒｉｓ１０ｍＭ、ＥＤＴＡ０．１ｍＭ）
１１５ｈ 第一段階ＰＣＲ緩衝液
ｄＮＴＰ０．２ｍＭ
各プライマー０．３μＭ
Ｓｃ１：ＲＮＡおよび出芽酵母のＭＥＸ６７ｐに結合するＹＲＡ１核タンパク質の一部分を増幅するように構成されたプライマー。プライマーは、ｃＤＮＡ（Ｍ−ＭＬＶによって逆転写されたｍＲＮＡ）の増幅によって１８０ｂｐの単位複製配列を生じるようにして、イントロンの全体を増幅するように構成されている。
Ｓｃ２：出芽酵母のＭＲＫ１グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）同族体のｃＤＮＡの１２１ｂｐ領域を増幅するように構成されたプライマー。
Ｓｃ３：出芽酵母のＲＵＢ１ユビキチン様タンパク質のｃＤＮＡの２１３ｂｐ領域を増幅するように構成されたプライマー。
Ｓｐ１：***酵母のｓｕｃ１−サイクリン依存性タンパク質キナーゼ調節サブユニットのｃＤＮＡの２００ｂｐ領域を増幅するように構成されたプライマー。
Ｓｐ２：***酵母のｓａｅ１４−細胞質因子ファミリーのｃＤＮＡの１８０ｂｐ領域を増幅するように構成されたプライマー。
ＭｇＣｌ_２を３ｍＭ含むＰＣＲ緩衝液（ＢＳＡは含有しない）
Ｍ−ＭＬＶ５０単位
Ｔａｑ：抗体４．５単位
ＲＮＡｓｅＯｕｔ１００単位
１１５ｊ〜ｋ 第二段階ＰＣＲ緩衝液
ｄＮＴＰ０．２ｍＭ
ＬＣ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ（アイダホ・テクノロジー（Idaho Technology））１Ｘ
ＭｇＣｌ_２を２ｍＭ含むＰＣＲ緩衝液（ＢＳＡを含有する）
Ｔａｑ４．５単位
１１５ｌ 第一段階単位複製配列のサンプルを含む第二段階ＰＣＲ緩衝液。

製造中、第二段階ブリスタ１８１および１８２に、入れ子の第二段階プライマーをスポッティングした。一旦第二段階ＰＣＲ緩衝液によって再水和すると、約０．３μＭの最終濃度がもたらされる量で、各ブリスタに１つのプライマー対をスポッティングした。第二段階入れ子プライマーは以下の通りである。
Ｓｃ１：Ｓｃ１ ｃＤＮＡ第一段階単位複製配列の８０ｂｐ断片を増幅するように構成されたプライマー。
Ｓｃ２：Ｓｃ１ ｃＤＮＡ第一段階単位複製配列の１２１ｂｐ断片を増幅するように構成されたプライマー。
Ｓｃ３：Ｓｃ１ ｃＤＮＡ第一段階単位複製配列の９３ｂｐ部分を増幅するように構成されたプライマー。
Ｓｐ１：Ｓｃ１ ｃＤＮＡ第一段階単位複製配列の９９ｂｐ部分を増幅するように構成されたプライマー。
Ｓｐ２：Ｓｃ１ ｃＤＮＡ第一段階単位複製配列の９６ｂｐ部分を増幅するように構成されたプライマー。
標的のうちいずれに対しても、第一段階と第二段階のプライマー対の間に重複はない。第二段階増幅がそれぞれ複製で実行され、各複製が陰性対照を有するように、各プライマー対を１つの陰性対照ブリスタ１８１および２つの第二段階ブリスタ１８２内にスポッティングした。

装填後、入口チャネル１１５ａと関連付けられたプランジャを活性化することによってサンプルを三葉ブリスタ１２２に移動させ、入口チャネル１１５ｂと関連付けられたプランジャを活性化することによって磁性ビーズをリザーバ１０１に移動させ、入口チャネル１１５ｄ〜ｅと関連付けられたプランジャを活性化することによって洗浄緩衝液をリザーバ１０２および１０３に移動させ、入口チャネル１１５ｇと関連付けられたプランジャを活性化することによって溶出緩衝液をリザーバ１０４に移動させ、入口チャネル１１５ｈと関連付けられたプランジャを活性化することによって第一段階ＰＣＲ緩衝液をリザーバ１０５に移動させ、入口チャネル１１５ｊ〜ｋと関連付けられたプランジャを活性化することによって第二段階ＰＣＲ緩衝液をリザーバ１０６および１０７に移動させ、入口チャネル１１５ｌと関連付けられたプランジャを活性化することによって陽性対照（先に調製した第一段階単位複製配列のサンプルを含む第二段階ＰＣＲ緩衝液）をリザーバ１０８に移動させた。本実施例では、パウチ１１０を機器に装填するのに先立って、入口チャネル１１５ａおよび１１５ｂと関連付けられたプランジャを押し下げた。実行中、他のすべてのプランジャを機器内で連続して押下げ、流体を必要に応じてリザーバ１０２〜１０８に移動させた。

パウチ１１０が機器に入れられた後、上述したように、ＺＳビーズの存在下で叩解を１０分間行った。細胞溶解が完了した後、リザーバ１０１を圧縮し、リザーバ１０１からの核酸結合磁性ビーズを三葉ブリスタ１２２に流し込み、そこでビーズを緩やかに混合し、５分間培養できるようにした。

次に、サンプルとビーズの混合物をブリスタ１４４に移動させ、そこで磁石を活性化することによって磁性ビーズを捕捉した。磁石を配備した後、ブリスタ１４４に隣接したブラダーを加圧して、流体を三葉ブリスタ１２２に戻した。次に、リザーバ１０２および１０３からの洗浄溶液を使用して、上述したように、捕捉されたビーズを洗浄した。洗浄に続いて、磁石を活性化することによってビーズを再度ブリスタ１４４内に捕捉し、リザーバ１０４に格納された溶出緩衝液をブリスタ１４４に移動させ、そこで、２分間の培養後、上述したように、ビーズから溶出された核酸を次にブリスタ１６１に移動させた。

ブリスタ１６１内で、核酸サンプルをリザーバ１０５からの第一段階ＰＣＲマスターミックスと混合する。次に、サンプルを４０℃で１０分間（その間、Ｍ−ＭＬＶがｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換する）、次に９４℃で２分間（Ｍ−ＭＬＶを不活性化し、抗体をｔａｑから除去する）保持する。次に、熱サイクリングは、９４℃で１０秒間および６５℃で２０秒間の２０サイクルである。

第一段増幅に続いて、リザーバ１０６からの第二段階ＰＣＲマスターミックスを使用してサンプルを約１００倍に希釈する。次に、サンプルを、上述したように、第二段階プライマーをすでにスポッティングしたブリスタ１８２に移動させる。第二段階ＰＣＲ緩衝液をリザーバ１８１から陰性対照ブリスタ１８１に移動させ、陽性対照混合物をリザーバ１０８からブリスタ１８３に移動させた。サンプルを、９４℃で３０秒間変性させ、次に９４℃で５秒間および６９℃で２０秒間の４５サイクル増幅した。

図１１で分かるように、すべての標的単位複製配列および陽性対照は増幅を示し、陰性対照はいずれも増幅を示さなかった。各サンプルは複製で実行した。複製はそれぞれ同様の増幅を示した（データは図示なし）。

出芽酵母および***酵母の標的は単なる例示であり、他の標的が本発明の範囲内にあることが理解される。

高密度ＰＣＲ
上述の実施例は図５のパウチ１１０を使用する。パウチ１１０は、５つの陰性対照ブリスタ１８１と、５つの陽性対照ブリスタ１８３と、１０の低容積サンプルブリスタ１８２とを有する。図６のパウチ２１０は、低容積サンプルブリスタ２８２の数を１８に増加させた。しかし、図１２に示されるパウチ５１０の高密度アレイ５８１は、１２０以上の第二段階ウェル５８２を有することができる。第二段階反応の数のこの増加によって、パウチおよびその機器のサイズを増加させる必要なしに、広範な一連の潜在的な診断および人物同定が可能になる。様々な例が本明細書に記載される。

一例では、一般的な呼吸器系ウィルスに対する標準的な市販のイムノ蛍光アッセイで、アデノウィルス、ＰＩＶ１、ＰＩＶ２、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、インフルエンザＡ型、およびインフルエンザＢ型という７つのウィルスを検出できることが知られている。より完全なパネルは、例えば、コロナウィルス、ヒト・メタ肺炎ウィルス、ＢＯＣＡウィルス、ライノウィルス、および非ＨＲＶエンテロウィルスという５つの追加のウィルスに対する検定を含むことになる。アデノウィルスまたはＨＲＶなどの可変性が高いウィルスの場合、複数のプライマー（例えば、それぞれ４つの外部プライマーおよび４つの内部プライマー）を使用して、ウィルスの系統のブランチすべてを標的にすることが望ましい。コロナウィルスなどの他のウィルスの場合、季節毎に変化しない４つの明確な系統（２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１）が存在するが、それらは別個のプライマーセットが必要とされるのに十分に分岐されている。実例となる完全な呼吸器系ウィルスパネルはまた、ＳＡＲＳコロナウィルス、場合によっては鳥インフルエンザのＨＡおよびＮ亜型、ならびに場合によっては他のものを標的とすることになる。最後に、呼吸器系ウィルスのいくつかは、高い配列変動率を示すので、かかるウィルスそれぞれに対して２つ以上の入れ子ＰＣＲ検定を作成し、それによって、プライマー下における配列の変動によって偽陰性の結果がもたらされる可能性を最小限に抑えることが有益なはずである。本明細書に記載されるプライマーセットがすべて含まれるとき、かかる呼吸器系ウィルスパネルは、第二段階増幅において８０以上の特異的単位複製配列を有することができる。高密度アレイ５８１は、かかるパネルを単一のパウチ５１０に簡単に収容することができる。

パウチ５１０の高密度アレイ５８１の第２の用途は、感染患者から単離された多剤耐性細菌の同一性および抗生物質耐性を判断することになる。現在の方法は、微生物を培養し、個別の薬物耐性プロファイルを実験的に試験するのに数日を要する。結果を受け取るのにかかる時間の間、医師は、広域抗生物質を投与する場合が多くなり、それが多剤耐性細菌の増加に結び付く。ＰＣＲプライマーは、抗生物質耐性の遺伝因子（抗生物質耐性遺伝子自体）を検出するために開発されてきた。しかし、これらの遺伝子のいくつかの変異体が多数であるため、耐性プロファイルを完全に判断するために多数の単位複製配列が必要とされる。Ｈｕｊｅｒらは、アシネトバクター属の単離体中に存在する耐性遺伝子を同定する、６２のＰＣＲ検定のパネルについて記載している。やはり、高密度アレイ５８１は、かかるパネルを単一のパウチに簡単に収容することができる。

高密度アレイの有用性の第３の例は、人物同定、例えば人間の遺体の法鑑定および父系試験の分野である。人物同定の市場の大部分では、縦列型反復配列（ＳＴＲ）を分析するシステムが優勢である。この分析は、一般に、例えばキャビラリー電気液動を使用して、反復をサイズによって分離することを必要としていた。この目的に使用される専門の実験室機器は、一般に可搬型ではなかった。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同一性試験に使用することに関する関心が高まっているが、これは、ＳＮＰを同定する多くの一連の技術が存在し、そのいくつかは現場使用のために修正可能であるためである。Ｓａｎｃｈｅｚらは、２つの個体が偶然一致する可能性を集合的に非常に低くする（少なくとも５．０×１０^−１９の平均一致可能性）、５２の十分に特性決定されたＳＮＰの組を公表している。実際、各遺伝子座を正確に分類するのに、各ＳＮＰに対して２つの単位複製配列を要することがある（例えば、Ｚｈｏｕらを参照のこと）。したがって、１０４の第二段階ウェル５８２を備えた１つのパウチ５１０が、５２のＳＮＰ遺伝子座すべてで個体を完全に分類することができる。

異なる診断用途からの検定を１つのパウチに組み合わせることによって得られる、コストおよびワークフローの利点があることが理解される。例えば、完全な呼吸器系ウィルスのパネルを、細菌同定パネルと組み合わせることができる。組み立てるパウチの種類がより少ないため、これらの組み合わせによって製造を単純化することができる。また、診療所に在庫を置いておく必要があるパウチの特定の種類がより少ないので、エンドユーザの作業を単純化することができ、また、特定の臨床サンプルに対して誤ったパウチを使用する可能性が低減される。いくつかの用途に対して、これらの利点は、より多数のプライマー対を有するパウチを製造するコストの増加を相殺することができる。したがって、１００以上の第二段階ウェル５８２を有する１つのパウチ５１０を使用して、検定の複数のパネルを収容することができる。

プロセス制御
高度に多重化された検定の制御は、特に品質が試験当たりのコストと競合せざるを得ない臨床診断設備の場合に問題となり得る。単一の実行で検定することができる診断標的の数が増加したことによって、パウチ５１０の高密度アレイ５８２は、潜在的にこの問題を増大させる。様々なタイプの制御について本明細書で考察する。

実例となるプロセス制御は、サンプルをパウチ注入する前に、無処置の微生物、例えばＲＮＡ標的を含有する微生物を患者サンプルに混合することを含む。かかる標的は、無処置のＲＮＡバクテリオファージ（ＭＳ２もしくはＱβ）、または無処置の植物ＲＮＡウィルス（タバコモザイクウィルス）、または無処置の酵母中に存在するｍＲＮＡであり得る。ＲＮＡ標的に特異的な外部プライマーは第一段階ＰＣＲ中に存在し、内部プライマーを収容したウェル５８２は高密度アレイ中に存在するはずである。このウェル５８２内の増幅生成物を検出することによって、プロセスのステップがすべて適正に働いていることが確認される。第二段階増幅後の融解曲線も、適正な特異的生成物が作られたことを確認するのに使用することができる。増幅曲線から決定される交差点（「Ｃｐ」）を使用して、試薬の完全性の定量的測定値を得ることができる。例えば、Ｃｐを、異なる時点における同じロットの実行からの他のパウチのものと比較することができる。無処置の微生物が使用されるが、溶解を試験するのに重要でない場合は、精製または単離した核酸が使用されてもよいことが理解される。他の状況では、対照を使用して、分析の後の方のステップのみを試験するのが望ましいことがある。例えば、高密度アレイのウェルに、天然または合成核酸テンプレートを同族（cognate）プライマーとともに加えることを使用して、第二段階ＰＣＲ反応を試験することができ、核酸テンプレートを、第一段階ＰＣＲ増幅混合物中の適切なプライマーとともに第一段階ＰＣＲに、かつ第二段階増幅域のウェル５８２に加えることで、第一および第二段階両方のＰＣＲ反応が試験される。

上述したようなプロセス制御は、標的単位複製配列に特異的なプライマーの完全性を試験しない。特異的なプライマーの完全性を試験する陽性対照の一例は、核酸、例えば合成ＲＮＡの混合物を使用するが、これは、安定性および可変性をより良好に制御できる場合が多く、これらの配列は、混合物が特定のパウチ内に存在するプライマーそれぞれに対して核酸を含有する、環境汚染によって存在することができないためである。診断設備では、患者サンプルを試験するのに使用されるパウチの実行の終了時にこの陽性対照を使用することができる。混合物は、例えば患者サンプルに使用されるものと同じロットから、パウチに注入され、標的単位複製配列がすべて陽性の結果を提供することによって成功が定義される。陰性対照を同じ方法で行うことができ、患者サンプルを試験するのに使用されるパウチの実行の終了時に、水または緩衝液をパウチに注入することができ、標的単位複製配列がすべて陰性の結果を提供することによって成功が定義される。

診断研究室における個々のワークフローおよびプロトコルは、上述した対照パウチが実行される前に、患者サンプルパウチの実行の数を決定するのに使用される。どの程度頻繁に、または稀に対照パウチが実行されるかにかかわらず、これらの対照によってシステム全体の時間およびコストが付加される。このため、対照をパウチに入れるのが有用になる。高密度アレイ５８１の構造によって、陰性対照に対する以下の新規な方策が可能になる。この例では、核酸、例えば合成単位複製配列は、高密度アレイ５８１のウェル５８２ａの１つに加えられる。この配列を増幅するプライマーは、このウェル５８２ａに加えられ、アレイを横切って間隔を空けられた他の２つのウェル５８２ｂおよび５８２ｃに加えられる。例えば、単位複製配列シーケンスおよびプライマーは人工であり、使用されるプライマーが偶然別の標的を増幅することがないように設計される。

清潔で汚染されていないパウチ５１０が機器８００内で実行されると、合成標的を収容したウェル５８２ａが単位複製配列を生成し、したがって陽性と判定されることになる。対応するプライマーを収容した他の２つのウェル５８２ａ、５８２ｂは、サンプル中のなにも増幅せず、したがって陰性と判定されるはずである。パウチ５１０は、追加の対照のため、さらに処理されてもよい。例えば、次に、高密度アレイをヒーター８８８に接して保持するブラダー８８０／８８２が減圧され、ウェル５８２の内容物が混合される。１つの実例となる方法では、ウェル５８２の内容物は以下のように混合される。ヒーター８８８を使用して、短時間の間（例えば、８５℃で１０秒間、次に１０５℃で２０秒間の３サイクル）、高密度アレイの温度を緩衝液の沸点の上下で循環させる。高密度アレイ５８１のウェル５８２内で発生した蒸気の泡は、ウェル５８２の内容物を押し出して、第二段階増幅域ブリスタ５８０に流し込むはずである。任意に、ブラダーを使用して液体をパウチ５１０の一端から他端へと移動させることによって、第二段階増幅域５８０の内容物は、パウチ５１０の残りの内容物と混合されてもよい。これらのステップの目的は、特異的汚染制御の単位複製配列を、パウチ全体にわたる任意の特異的な標的単位複製配列とともに混合することである。

この形式でパウチを実行した後に、ユーザがパウチを偶発的に開放した場合、特異的標的単位複製配列と汚染の両方が解放されることになる。微量のこれらの核酸が後のパウチの実行を汚染した場合、合成単位複製配列に特異的なプライマーのみを収容したウェル５８２ｂ、５８２ｃが陽性と評価されることになるので、機器が汚染の事象を検出してもよい。機器のソフトウェアはユーザに警告を発し、実行の結果が疑わしいとして注意されることになる。

汚染を制御する別の方法では、実行の終わりに、ＤＮＡ分解化学薬品または酵素が添加されて、第一および第二段階ＰＣＲ反応のＤＮＡ生成物のほぼすべてが破壊されてもよい。例えば、これは、上述した汚染検出方法に類似した方法で、第二段階アレイの内容物を局所沸点を上回る温度に加熱し、したがって増幅された試料をアレイ８５１のウェル５８２から引き出し、加熱された液体を第一段階反応の希釈された内容物と混合し、例えば入口チャネル５１５ｋを通して、混合物を冷却しながらまたは冷却せずにＤＮＡ分解基質のアリコートを添加し、ＰＣＲ反応で生成されたＤＮＡがすべて破壊されるまで、ＤＮＡ分解反応の培養を可能にすることによって行うことができる。これは、当該分野において知られているように、ＤＮＡアーゼ、酸、または酸化剤を使用して達成することができる。

本明細書に記載される汚染制御はいずれも、独立してまたは任意の組み合わせで使用されてもよいことが理解される。

パウチ装填
図１６は装填ステーション６００を示す。図示されるように、図１２のパウチ５１０は、パウチ５１０の付属部品５９０のみが見えるようにして、装填ステーション６００のスロット６１０に装填される。図示されるように、装填ステーション６００は、サンプルバイアル６５０を保持するサンプルバイアルレセプタクル６０２と、水和バイアル６７０を保持する水和バイアルレセプタクル６０４とを備える。しかし、レセプタクルおよびバイアルは、ワークフローを支援するためのものであり、単なる例証であることが理解される。他のパウチおよび他のデバイスを備えた他の構成および使用は、本開示の範囲内にある。

サンプルは、ピペッティングまたは別の方法でサンプルバイアル６５０に装填される。より詳細に後述するように、ワークフローに応じて、サンプルバイアル６５０は、生物学的サンプルを受け入れるため、緩衝液または他の流体６５２をすでに含有していてもよく、または、オペレータは、適切な緩衝液中の生物学的サンプルをサンプルバイアル６５０に添加してもよい。任意に、緩衝液は、適切な量の配分された緩衝液とともに、別個のアンプル内に提供されてもよい。同様に、水和バイアル６７０は、水、緩衝液、または他の流体６７２が予備充填されてもよく、オペレータは、水和バイアル６７０にかかる流体を搭載してもよい。

実例となる付属部品５９０は、例えば付属部品５９０の第２の表面５９５付近に形成される、注入ポート５４１を含む。図示されるように、注入ポート５４１は、カニューレ状シリンジなど、付属部品５９０の第１の表面５９４を通してカニューレ状移送容器を受け入れるように構成されている、サンプル注入開口部５６３に配置される。この実例となる構成では、注入ポート５４１は、偶発的な穴開けから保護され、カニューレ状移送容器がサンプル注入開口部５６３に入れられるまで開放されない。同様に、実例となる付属部品５９０は、例えば付属部品５９０の第２の表面５９５付近に形成され、サンプル注入開口部５６３と同様に構成される水和流体注入開口部５８３内に配置される、第２の注入ポート５８８を含む。この実施形態において構成されるように、注入ポート５４１は試験すべきサンプルを受け入れるためのものであり、そのサンプルはチャンバ５９２ａに、または溶解ブリスタ５２２（図１２）内に直接移動させられ、第２の注入ポート５８８は、水または緩衝液などの水和流体６７２（図１８に示される）を受け入れるように構成され、その水和流体６７２はチャンバ５９２ｂ〜５９２ｌに移動させられ、続いて入口チャネル５１５ｂ〜５１５ｌを通って移動する。注入ポート５４１および５８８ならびに開口部５６３および５８３の配置は例証であり、他の構成も本開示の範囲内にあることが理解される。

実例となるサンプルバイアル６５０は、図１７で最も良く示されるように、多くのカニューレ状シリンジに類似した構成で、頂面６６２、バイアル本体６５４、およびカニューレ６５５で構成される。この実施形態では、多くのカニューレ状シリンジに見出されるプランジャの代わりに、サンプルバイアル６５０は、頂面６６２に固着されたシール６５６と、本体６５４を封止するために頂面６６２を通って延在するキャップ６５８とを備える。実施形態では、シール６５６はオペレータによって剥離することができる剥離可能なシールである。しかし、当該分野において知られているように、シールは、様々な異なる構成のものであることができ、例えばねじキャップまたは脆弱なシールであり得ることが理解される。あるいは、別個のシールは省略されてもよく、サンプルバイアル６５０は、バイアル本体６５４を閉止するキャップ６５８を備え、それによってオペレータが使用に先立ってキャップ６５８を開放することを要してもよい。それに加えて、サンプルバイアル６５０に緩衝液または他の流体６５２が予め装填されて提供される場合、または、無菌性を維持するためなど、バイアル本体６５４が使用に先立って外部環境から封止されたままであることを要する場合にのみ、任意の種類のシールが必要とされる。代替実施形態では、サンプルバイアルはシール６５６を有さず空の状態で提供されてもよく、オペレータは、流し込み、ピペッティング、スワブの挿入、固体もしくは半固体材料の採取、または別の方法で流体および／または他の材料を、頂面６６２の開口部６５７を通してバイアル本体６５４内へと移送することになる。

試験すべきサンプルの種類に応じて、サンプルバイアル６５０は、例えばバイアル本体６５４の底面６８６またはその付近に配置される、フィルタ６４６を備えてもよい。図示されるように、フィルタ６４６はＯリング６４４によって適所で保持される。しかし、当該分野において知られているように、接着剤によって、溶接によって、適所にプレス嵌めすることによって、または他の手段によって、フィルタ６４６が適所で保持されてもよいことが理解される。カニューレ６５５がサンプル注入開口部６５３に挿入され、サンプルがパウチ５１０に引き込まれると、サンプル材料は、フィルタ６４６を通ってカニューレ６５５に引き入れられるにつれて濾過される。フィルタ材料の選択はサンプルの種類および粒径に応じて決まるが、様々な生物学的サンプルに適したフィルタとしては、Ｐａｌｌ １００μｍ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｕｌｔｉｐｌｅａｔ Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｍｅｌｔ Ｂｌｏｗｎ ＭｅｄｉａおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ８０μｍ Ｐｏｌｙｐｒｏｙｌｅｎｅ Ｎｅｔ Ｆｉｌｔｅｒが挙げられる。ほとんどのシリンジフィルタは、特定のサイズの微生物を除外し、それによってそれらの微生物を濾過液から除去するように設計される。かかる既に存在するフィルタとは異なり、これらの実例となるフィルタは、便、土壌、粉末などに見出されるより大きな微粒子を除外する一方で、直径約６０μｍ以下の標的微生物（例えば、細菌、ウィルス、原生動物、および真菌微生物）はフィルタを通過させる能力に基づいて選択された。また、実例となるフィルタ材料は不活性であり（即ち、微生物または核酸を結合しない）、目詰まりに比較的耐性がある。これらの実例となるフィルタは、標的微生物（約６０μｍ以下）としての原生動物を含むサンプルに対して選択されたことが理解される。いくつかのパウチ構成はより小さな標的のみを試験することがあるので、細菌および真菌用の１〜１０μｍの孔径、およびウィルス粒子のみを検出すべきである場合の１μｍ未満の孔径を有するフィルタなど、より小さい孔径のフィルタが望ましいことがある。当然ながら、より大きい孔径のフィルタを依然として使用して、より小さい標的を濾過することができる。かかるフィルタは、流体系を目詰まりさせることがある、土壌、便、および粉末などの大量の微粒子状物質を有するサンプルの種類に対して、特に有用であってもよい。さらに、孔径は、濾過すべき材料に基づいて選択され、他の孔径が本発明の範囲内にあることが理解される。

図示されるように、底部キャップ６６４は、六角形のサンプルバイアルレセプタクル６０２に適合するように構成された六角形部分６６６を備える。実施形態では、部分６６６およびサンプルバイアルレセプタクルは六角形であるが、他の形状が使用されてもよく、オペレータが底部キャップ６６４を除去するのを支援するため、六角形もしくは他の噛合または連動する形状が提供されてもよいことが理解される。あるいは、オペレータは、両手を使用して底部キャップ６６４を捻ってバイアル本体６５４から外すなど、他の手段によって底部キャップ６６４を除去してもよい。底部キャップ６５４は、バイアル本体６５４に対してプレス嵌めされるか、ねじ留めされるか、または別の方法で固着されてもよい。

実施形態では、底部キャップ６６４は弁座６４８を備え、それによってカニューレ６５５の下端部６５９は弁座６４８内へと延在する。例えば、カニューレ６５５の下端部６５９は弁座６４８にしっかり嵌合するので、弁座６４８がカニューレ６５５の開いた下端部６５９の周りに気密封止を提供する。任意に、底部キャップ６６４とバイアル本体６５４との間にベント６４９が設けられる。

次に図１８を参照すると、水和バイアル６７０はサンプルバイアル６５０と同様に構成されてもよい。しかし、図１８に示されるように、水和バイアル６７０に水和流体６７２を予備装填し、水和流体６７２を水和バイアル６７０内に予備封止するのが望ましいことがある。実例となるサンプルバイアル６７０は、図１８に示されるように、サンプルバイアル６５０に類似した構成で、頂面６８２、バイアル本体６７４、およびカニューレ６７５で構成される。しかし、実例となる水和バイアル６７０のキャップ６７８の舌６８０は、頂面６８２の開口部６７７に既にプレス嵌めされており、キャップ６７８が頂面６８２に封止され、それによって水和バイアル６７０の開放を防いでもよい。この構成は単なる例示であり、水和流体６７２を水和バイアル６７０内に封止する他の方法が本明細書において想起されることが理解される。例えば、バイアル本体６７４およびカニューレ６７５は、流体で完全に満たされているか、またはほぼ完全に満たされていてもよいので、水和バイアル６７０を取り扱うかまたは回転させても、空気がカニューレ６７５に入ることはできない。あるいは、ある程度の空気６８４または他のガスがバイアル本体６７４内に存在してもよく、オペレータは、水和本体を直立位置で維持して、空気がカニューレ６７５に入るのを防いでもよい。さらに別の代替実施形態では、空気６８４は圧力下で供給されてもよく、底部キャップ６８４を除去することによって、水和流体がカニューレ６７５を通って押し流されるであろう。図示されるように、水和バイアル６７０はフィルタを備えていないが、所望であればフィルタが設けられてもよい。

底部キャップ６８４は、カニューレ６７５から滴下する恐れがある任意の流体を保定するとともに、カニューレ６７５内の水和流体６７２の汚染を防ぐために設けられてもよい。過剰な流体をカニューレ６７５の底部から拭い取るため、ワイパー６８３が底部キャップ６８４に設けられてもよい。ワイパー６８３の円錐形状も、後に続く取扱いおよび廃棄の間、ドリップを底部キャップ６８４内に保定する助けとなり得る。実施形態では、底部キャップ６８４は、六角形の水和バイアルレセプタクル６０４と噛合する六角形部分６８６を備えるが、サンプルバイアル６５０に関して上述したように、他の形状が可能である。水和バイアル６７０の六角形部分６８６および六角形の水和バイアルレセプタクル６０４は、サンプルバイアル６５０の六角形部分６６６および六角形のサンプルバイアルレセプタクル６０２とは異なる寸法および／または異なる形状のものであることがあるので、サンプルバイアル６５０のみがサンプルバイアルレセプタクル６０２に容易に適合し、水和バイアル６７０のみが水和バイアルレセプタクル６０４に容易に適合して、オペレータがサンプルバイアル６５０および水和バイアル６７０を混同する可能性が低減され、それによって適切な流体がポート５４１および５８８を通して注入される。それに加えて、オペレータが適切な流体をポート５４１および５８８に提供する際の視覚的な支援を提供するため、サンプルバイアル６５０および注入開口部５６３は、部分的または全体的に、一致する特定の色で、例えば赤色で提供されてもよく、水和バイアル６７０および注入開口部５８３は、部分的または全体的に、異なる一致する特定の色で、例えば青色で提供されてもよい。誤った液体を誤った注入開口部に挿入するリスクをさらに最小限に抑えるため、カニューレ６５５の直径はカニューレ６７５の直径と異なっていてもよく、サンプル注入開口部５６３と水和流体注入開口部５８３の直径も同様に異なっていてもよい。他の構成が本開示の範囲内にある。

例えば、パウチ５１０を装填するため、オペレータは、装填ステーション６００上で、サンプルバイアル６５０をサンプルバイアルレセプタクル６０２に、水和バイアル６７０を水和バイアルレセプタクル６０４に入れる。パウチ５１０もスロット６１０に入れられるであろう。オペレータは、指示に応じて、シール６５６を除去し、サンプルをバイアル本体６５４内のサンプル緩衝液に入れる。サンプルは、スワブの挿入、流体サンプルのピペッティング、患者から直接バイアル本体内への血液の滴下、および便などの固体または半固体のサンプルをバイアル本体に入れること、また任意に、当該分野において標準的であるような、ボルテックス形成または他の混合を含む、サンプルの種類に適した任意の方法でサンプル緩衝液に入れられる。サンプルの種類および所望の標的核酸に応じて、サンプル緩衝液は、プロテアーゼ、ＲＮＡアーゼ、ＲＮＡアーゼ阻害剤など、１つもしくは複数の添加剤または安定剤を含有してもよい。それに加えて、または別の方法として、これらの添加剤はパウチ５１０に供給されてもよい。好ましくは、ボルテックス形成または混合の前に、オペレータは、キャップ６５８の舌６６０を開口部６５７に入れることによって、サンプルバイアル６５０を閉止するであろう。舌６６０を挿入することによって、バイアル本体６５４内に含まれる空気が加圧される。例えば、舌６６０は、カニューレ６５５の容積以上の容積を有する。例えば、底部キャップ６６４が除去されると、カニューレ６５５の弁座６４８の下端部６５９の間の気密封止が壊れ、ほぼすべての空気がカニューレ６５５から押し出される。舌６６０の容積がカニューレ６５５の容積よりも大きい場合、そのことが、最大量の空気がカニューレ６５５から変位させられることを担保する助けとなるであろう。カニューレ６５５に流し込まれる、また潜在的にそこを通る流体の量における任意のオーバーフローを、底部キャップ６６４に捕捉し、ワイパー６６３によってカニューレ６５５の底部から除去することができる。カニューレ６５５を完全に、または本質的に完全に充填することによって、パウチを装填する際のパウチ５１０内の泡の量が最小限に抑えられる。１つまたは複数のベント６４９は、底部キャップ６６４を水和バイアル６５０から分離するのを支援してもよい。

底部キャップ６６４は、六角形のサンプルバイアルレセプタクル６０２に適合するように構成された六角形部分６６６を備えるので、オペレータは、底部キャップがレセプタクル６０２を係合している状態で底部キャップ６５４を簡単に捻り取り、それによってカニューレ６５５を露出させることができる。次に、カニューレ６５５は、サンプル注入開口部５６３に挿入され、押し込まれて、注入ポート５４１を開放する。パウチ５９０内部の真空（または、気圧もしくはパウチ外部の圧力に対するパウチ内部の低い圧力）によって、例えば、バイアル本体からの圧力を用いて、または用いずに、サンプルがフィルタ（存在する場合）を通され、後に続く溶解チャンバ５２２内への移動のため、サンプルをパウチ５１０に、例えば付属部品５９０内のチャンバ５９２ａに引き込むのに使用されてもよい。カニューレ６５５がほぼ流体６５２で充填されていることを保証することによって、サンプルバイアル６５０からパウチ５１０内へと移動させられる空気または他のガスの量が最小限に抑えられ、それによって泡のサイズおよび量が最小限に抑えられる。さらに、プランジャを備えた従来技術のシリンジが使用され、パウチ５９０内部の真空が流体を引き込むとき、プランジャはシリンジの下方に引き下ろされ、それによってシリンジ内部の圧力が均衡する。図１６〜１７の実施形態では、バイアル本体それぞれの頂部にある開口部が封止されているので、パウチ５９０内部からの真空によって流体がバイアルから引き出されると、バイアルは陰圧も経験し、サンプルを脱ガスし、ある程度の残った気泡をパウチ５９０から引き出してもよい。次に、カニューレ６５５が、サンプル注入開口部５６３から抜き出され、プロトコルにしたがってサンプルバイアル６５０および底部キャップ６６４が廃棄される。バイアル本体は陰圧下にあるので、カニューレ６５５が抜き出されるにつれて、注入ポート５４１付近に回収されていることがある気泡がパウチ５１０から引き出されて、パウチ内の気泡がさらに低減される。

同様に、オペレータは、底部キャップ６８４を水和バイアル６７０から捻り取り、それによってカニューレ６７５を露出させる。水和バイアル６７０の内容物が圧力下で供給される場合、カニューレ６７５が弁座６９２から分離されると、少量の水和流体が底部キャップ６８４内へと漏れ出すことがある。１つまたは複数のベント６９３は、底部キャップ６８４を水和バイアル６７０から分離するのを支援してもよい。次に、カニューレ６７５は、水和注入開口部５８３に挿入され、押し込まれて、注入ポート５８８を開放する。付属部品５９０内部の真空は、後に続くパウチ５１０の様々なブリスタ内への移動のため、水和流体をパウチ５１０に、例えばチャンバ５９２ｂ〜５９２ｌに引き込むのに使用されてもよい。カニューレ６７５は水和注入開口部５８３から除去され、パウチ５１０は充填ステーション６００から除去され、機器８００に入れられ、実行が開始される。バイアルの除去は単なる例証であることが理解される。機器およびバイアルの構成によって可能な場合、バイアルが注入ポートに恒久的に挿入され、それによってパウチの閉システムの一部になり、サンプルからの汚染を最小限に抑えてもよい。かかる一実施形態では、シールバーは不要なことがある。

上述のサンプルバイアル６５０の実施形態では、舌６６０は、カニューレ６５５の容積以上の容積を有する。パウチが１ｍｌの充填容積を有する例示的な一実施形態では、バイアル本体６５４に、１．５ｍｌのサンプル流体６５２と、サンプル流体の上に１ｍｌの空気６４５とが供給されてもよい。したがって、空気はバイアル本体の容積の４０％である。しかし、１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、およびその間の量を含む、空気の他の割合が使用されてもよいことが理解される。舌６６０が開口部６５７を通して挿入されると、サンプル流体の上の空気は、例えば約５０％圧縮されるが、４０〜６０％、３０〜７０％、２０〜８０％、および１０〜９０％の範囲の圧縮はすべて可能である。空気およびサンプル流体の体積の選択は、サンプルのサイズ、カニューレの直径、流体反応を実行するのに先立ってバイアルを除去するのが望ましいか否か、および他の多数の要因に応じて決まることが理解される。例えば、採取するかまたはかき出したサンプルは、流体系の充填容積にかかわらず、大幅により多量のサンプル流体を必要とすることがある。

実例となるバイアル本体６５４および６７４は円筒状である。しかし、これらの実例となるバイアルはプランジャなしで提供されるので、バイアル本体は必ずしも円形の断面を有さなくてもよく、任意の本体形状が本発明の範囲内であることが理解される。

図１９〜２１は、装填ステーション６００およびバイアル６５０、６７０の代替実施形態を示し、同様の番号は類似の部品を示している。装填ステーション８００は、図１９に示されたように、装填ステーション６００に類似していてもよく、図１２に示されるものに類似した、サンプルバイアルレセプタクル８０２および水和バイアルレセプタクル８０４と、パウチ５１０を受け入れるスロット８１０とを備える。しかし、少なくとも１つの実施形態によれば、レセプタクルの形状および位置は、装填ステーション６００と装填ステーション８００との間で大幅に異なる。例えば、少なくとも１つの実施形態では、装填ステーション６００のレセプタクル６０２、６０４と比べて、レセプタクル８０２および８０４はパウチ５１０により近い。この低減された距離によって、パウチ５１０に装填する際に滴下が起こる可能性が低くなる。さらに、図２０〜２１で最も良く分かるように、サンプルバイアル８５０の底部キャップ８６４は、サンプルバイアルレセプタクル８０２の４つの一致するスロット８０３内に適合する４つの比較的短いフィン８６７を備え、水和バイアル８７０の底部キャップ８８４は、水和バイアルレセプタクル８０４の２つの一致するスロット８０５内に適合する２つの比較的長いフィン８８７を備える。これらのフィンは、バイアル６５０および６７０の六角形部分６６６および６８６と置き換えられる。底部キャップ８６４上のフィン８６７がより多数であることによって、サンプルバイアル８５０が水和バイアルレセプタクル８０４に入れられるのを防ぎ、底部キャップ８８４のより長いフィン８８７によって、水和バイアル８７０がサンプルバイアルレセプタクル８０２に入れられるのを防ぐ。しかし、異なるサイズおよび数のフィンの使用は単なる例示であり、異なる調和システムが本開示の範囲内にあることが理解される。装填ステーション６００に関して上述したように、装填ステーション８００のレセプタクル８０２、８０４は、底部キャップ６８４、８８４をそれら個々のバイアル本体８５４、８７４から捻り取って、装填プロセスの助けとするのを支援するのに使用されてもよい。

サンプルバイアル６５０、８５０および水和バイアル６７０、８７０が、パウチ５９０を装填するための実例となる例で使用されているが、これらの装填バイアルは、本明細書に開示されるパウチのいずれを装填するのにも適していることが理解される。それらはまた、他の流体またはマイクロ流体デバイス、特に真空もしくは吸引を使用して液体を流体デバイスに引き込むように構成された流体デバイスに適している。

［参考文献］

好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に記載してきたが、以下の請求項に記載され定義されるような本発明の範囲および趣旨内に変形形態および修正形態が存在する。

Claims (18)

1. 一端にある頂面、他端にある底面、およびそれらの間にある外壁を有して内側バイアル容積部を画成し、前記頂面が開口部を有する、バイアル本体と、
   前記底面から延在するとともに、第１の端部、第２の端部、およびそれらの間の外表面を有してカニューレ容積を画成するカニューレであって、前記第１の端部が前記内側バイアル容積部と流体連通している、カニューレと、
   前記頂面の前記開口部を封止可能に閉止するようにサイズ決めされた舌を有するキャップであって、前記舌がさらに、前記カニューレ容積以上の容積を有する、キャップと
   を備える、カニューレ状バイアル。
2. 前記カニューレの前記第２の端部を外部環境から動作可能に封止するようにサイズ決めされ成形された、着脱可能な底部キャップをさらに備える、請求項１に記載のカニューレ状バイアル。
3. 前記舌を前記頂面の前記開口部に入れて、前記開口部を封止可能に閉止することによって、前記内側バイアル容積部が加圧され、前記底部キャップを除去することによって加圧流体が前記カニューレに流し込まれる、請求項２に記載のカニューレ状バイアル。
4. 前記舌の容積が前記カニューレの容積よりも大きく、前記底部キャップを除去することによって流体を前記カニューレから排出することができる、請求項３に記載のカニューレ状バイアル。
5. 前記バイアル本体がある量の空気をさらに含有し、前記舌が、前記空気を２０〜８０％圧縮するのに十分な容積を有する、請求項３に記載のカニューレ状バイアル。
6. 前記舌が、前記空気を５０％圧縮するのに十分な容積を有する、請求項５に記載のカニューレ状バイアル。
7. 前記底部キャップが前記排出された流体を捕捉するように構成されている、請求項４に記載のカニューレ状バイアル。
8. 前記バイアル本体の前記底面付近に位置するフィルタをさらに備え、前記フィルタが、流体が前記カニューレに入る際に前記流体を濾過するように構成されている、請求項１に記載のカニューレ状バイアル。
9. 前記フィルタが１μｍと１０μｍの間の孔径を有する、請求項８に記載のカニューレ状バイアル。
10. 前記フィルタが少なくとも６０μｍの孔径を有する、請求項８に記載のカニューレ状バイアル。
11. 前記フィルタが少なくとも８０μｍの孔径を有する、請求項８に記載のカニューレ状バイアル。
12. プランジャを欠く、請求項８に記載のカニューレ状バイアル。
13. １つまたは複数の外壁によって外部環境から封止された内側バイアル容積部を有するバイアル本体と、
    前記バイアル本体の底面から延在するとともに、外表面によって接続され、内部カニューレ容積部を画成する第１の端部および第２の端部を有するカニューレであって、前記第１の端部が前記内側バイアル容積部と流体連通している、カニューレと、
    前記カニューレの前記第２の端部に固着されると、前記カニューレの前記第２の端部を前記外部環境から着脱可能に封止するようにサイズ決めされ成形された第１の端部を有する着脱可能な底部キャップとを備え、
    前記内側容積部に供給された流体が圧力下にあり、前記底部キャップを除去することによって前記カニューレの前記第２の端部が前記外部環境に露出し、それによって流体が前記カニューレに流される、カニューレ状バイアル。
14. 前記バイアル本体が、開口部と、舌を有するキャップとをさらに備え、前記舌を前記開口部に通すことによって、前記内側容積部が前記外部環境から封止され加圧される、請求項１３に記載のカニューレ状バイアル。
15. 前記底部キャップが前記第１の端部と反対側の第２の端部を有し、前記第２の端部が、対応する除去レセプタクルと相互作用するようにサイズ決めされ成形される、請求項１３に記載のカニューレ状バイアル。
16. 前記底部キャップが、前記底部キャップ内の前記カニューレからの滴下を保定するように構成されたワイパーを備える、請求項１５に記載のカニューレ状バイアル。
17. 前記流体が水和流体である、請求項１３に記載のカニューレ状バイアル。
18. 前記カニューレ状バイアルがプランジャを含まない、請求項１３に記載のカニューレ状バイアル。

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