DE19528847C2 - Affinitätschromatographisches Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern - Google Patents
Affinitätschromatographisches Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder AntikörpernInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein affinitätschromatographisches Verfahren
zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern gemäß Anspruch 1.
Für den Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern auf Zellen verwendet man
häufig Agglutinationsreaktionen, wobei die agglutinierten und nicht-agglutinierten
Zellen optisch beurteilt werden. Konventionelle Techniken sind Reaktionen auf
Platten oder in Röhrchen (Röhrchen-Zentrifugationstest) bzw. in Mikrotiterplatten.
Mit modernen Methoden können agglutinierte bzw. nicht-agglutinierte Zellen über
eine Filtration in mit Gelen oder Glaskügelchen gefüllten Mikrogefäßen aufgrund
ihrer unterschiedlichen Größe physikalisch voneinander getrennt werden. Eine
scharfe Trennung der Zellen findet allerdings oft nicht statt, so daß insbesondere
bei schwachen Reaktionen Auswertungs-Unsicherheiten entstehen. Darüber
hinaus werden die Agglutinate durch Erschütterungen leicht zerstört, was -
ebenso wie auftretende Prozonenphänomene - zu falschen Testergebnissen
führen kann.
Eine andere Methode - die sogenannte Festphasen-Methode - nutzt die unter
schiedlichen Immun-Reaktionsfähigkeiten von Antigenen und Antikörpern. Die zu
untersuchenden Zellen (z. B. Erythrozyten oder Thrombozyten) werden mit für die
nachzuweisenden Antigene spezifischen Antikörpern (z. B. Immunglobulinen) be
laden und in einem Reaktionsgefäß mit einer immunoreaktiven festen Phase in
Kontakt gebracht. Anschließend lassen sich die unbeladenen Zellen mit einer
isotonen Kochsalzlösung oder mit geeigneten Puffern im Durchflußverfahren oder
unter Sedimentationsbedingungen, z. B. durch Zentrifugation, von der festen
Phase trennen, was zur Ausbildung von farbigen Ablagerungen auf dem Gefäß
boden führt. Zellen, die das gesuchte Antigen aufweisen, bleiben als farbige
Schicht auf der Festphase zurück.
In DE 42 08 732 C2 ist die Verwendung eines Einwegreaktionsgefäßes
beschrieben, das eine rasche Durchführung der quantitativen Bestimmung von
Komponenten erlaubt, die über Immunreaktionen bestimmbar sind. Dies ist jedoch
eindeutig ein affinitätschromatiographisches Durchflußsystem, das keinen Bezug
zur Trennung korpuskulärer Blutbestandteile hat. Ohne vorherige Waschschritte
käme es beim Durchfluß IgG-beladener Erythrozyten und bei gleichzeitigem
Durchfluß von Plasmaproteinen aus einem Inkubationsansatz zu konkurrierenden
Reaktionen zwischen beladenen Erythozyten und Immunglobulinen um die
Bindungsstellen auf der festen Matrix, was mit starkem Empfindlichkeits-Verlust
einhergeht.
Ein aus EP-B1-0 363 510 bekanntes Verfahren zur Suche und Identifizierung von
erythrozytären Antikörpern verwendet als Festphase Mikrotiterplatten aus Poly
styrol, die mit Protein A oder Protein G beschichtet sind. Dadurch ist es möglich,
ein polyspezifisches Antihumanglobulin auf der Festphase zu binden, was nicht
nur die Empfindlichkeit des Testsystems erhöht, sondern auch den Nachweis von
Zellen mit Antikörpern vom IgM-Typ oder mit Komplementfaktoren ermöglicht. Ein
ähnliches Verfahren geht aus EP-A1-0 594 506 hervor, welches als Festphase
eine poröse Matrix in Form eines Gelmilieus oder aus Microbeads vorsieht. Das
Anti-IgG oder eines seiner Fab- oder F(ab)′₂-Fragmente wird ebenfalls mittels
einer Schicht aus Protein A oder Protein G an das Gel gebunden. Man verwendet
als Matrix beispielsweise Sepharose CL4B-Protein A, Sephadex G200 oder
Sepharose 6MB (Handelsbezeichnungen von Pharmacia) oder IPA-300 oder
PA-400 (Handelsbezeichnungen von Repligen).
Es ist ferner bekannt, für den Nachweis von Antikörpern oder Antigenen als Fest
phase Partikel (z. B. Agarose oder Sepharose) einzusetzen, an die über reaktive
Gruppen (z. B. Glutaraldehyd) Liganden aus einem spezifischen Protein kovalent
gebunden sind. Als Liganden werden wiederum Protein A, Protein G, Protein A/G
oder KappaLockTM vorgeschlagen, welche die für den gewünschten Nachweis
notwendigen, korrespondierenden Antikörper bzw. Antigene aufnehmen können.
Allen genannten Verfahren ist gemeinsam, daß zwischen den immunoreaktiven
festen Oberflächen und den Antihumanglobulin-Molekülen nur relativ schwache
Bindungskräfte wirksam sind. Postuliert werden Wasserstoffbrückenbindungen,
van-der-Waals Kräfte oder elektrostatische Anziehungen. Die schwachen
Wechselwirkungen führen dazu, daß sich nach dem Massenwirkungsgesetz ein
Gleichgewicht zwischen gebundenen und freien Anti-IgG-Molekülen einstellt, was
zu einer Überlappung von Festphasen-Bindungen und Agglutinationsreaktionen
antikörperbeladener Zellen führt. Der Empfindlichkeitsverlust der erwünschten
Zelladsorption ist enorm. Beispielsweise beträgt die Dissoziation in Gegenwart
konkurrierender IgG-Moleküle oder von Seren innerhalb von 30 bis 60 min bei
37°C (den in der Serologie üblichen Inkubationsbedingungen) 75 bis 90%.
Ziel der Erfindung ist es, ein zuverlässiges Verfahren zu schaffen, das eine hohe
Nachweisempfindlichkeit aufweist und damit eine hohe Ablesegenauigkeit und
-sicherheit, insbesondere bei schwachen Reaktionen, gewährleistet. Die Bildung
von freien immunoreaktiven Protein-Liganden im Testserum soll wirksam ver
mieden werden.
Hauptmerkmale der Erfindung sind im Anspruch 1 angegeben. Ausgestaltungen
sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 12. Anspruch 13 bezieht sich auf eine
bevorzugte Verwendung.
Gemäß Anspruch 1 betrifft die Erfindung ein affinitätschromatographisches
Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern in einem einseitig
geschlossenen Reaktionsgefäß unter Verwendung einer transparenten Festphase
mit daran kovalent über Spacerarms gebundenen immunoreaktiven Proteinen,
wobei zuerst die zu untersuchenden Proben mit Zellen, die definierte antigene
Merkmale aufweisen, inkubiert werden, dann eine physikalische Trennung unbe
ladener von beladenen Zellen durchgeführt wird und schließlich beladene Zellen
über die immunoreaktiven Proteine an die Festphase gebunden werden. Weil mit
einseitig geschlossenen Röhrchen gearbeitet wird, lassen sich unterschiedliche
Reaktionspartner auf physikalischem Wege bequem unter Zentrifugation ohne
Waschschritte trennen. Zwischen der Festphase und den nachzuweisenden
beladenen Zellen entsteht über die kovalent gebundenen immunoreaktiven
Proteine eine außerordentlich stabile Bindung, so daß die Sensitivität des Test
verfahrens außerordentlich hoch ist; unspezifische Effekte werden zuverlässig
vermieden. Lediglich die (beladenen bzw. unbeladenen) Erythrozyten können in
die immunoreaktive Matrix eindringen und - im positiven Fall - eine Festphasen
bindung eingehen, wogegen die Immunglobuline sowie andere Plasma- oder
Serumbestandteile unter definierten Testbedingungen zurückbleiben. Eine teil
weise oder völlige Neutralisation der immunoreaktiven Bindungsstellen durch
Immunoglobuline kann mithin nicht eintreten.
Anspruch 2 sieht vor, daß die zu untersuchenden Proben mit Testerythrozyten
inkubiert werden, was die rasche Durchführung von Serumgegenproben erlaubt.
Laut Anspruch 3 können die zu untersuchenden Proben Patientenseren oder
-plasmen sein, so daß sich auch serologische Verträglichkeitsproben (Kreuz
proben) schnell ausführen lassen. Gemäß Anspruch 4 werden Autokontrollen
unter Einsatz von Patienten- oder Spendererythrozyten und von Eigenserum oder
-plasma durchgeführt.
Die Ausgestaltung von Anspruch 5 besteht darin, daß die Festphase einen Träger
aus Agarose, Sepharose, Glaskügelchen und/oder Kunststoffkügelchen aufweist.
Auf diese Weise können adsorptiv gebundene Zellen selbst im Inneren des Reak
tionsgefäßes beobachtet werden, was insbesondere die visuelle Auswertung
wesentlich erleichtert. Zudem ist eine maschinelle Bearbeitung der Testreihen
problemlos möglich.
Von besonderer Bedeutung ist die in Anspruch 6 angegebene Gestaltung des
Verfahrens, wonach die Festphase einen Träger mit zumindest einer reaktiven
Gruppe aufweist. Die kovalente Bindung der immunoreaktiven Proteine mit den an
dem Träger ansetzenden Spacerarms bildet sich während der Reaktion mit den
reaktiven Gruppen. Besondere Vorteile ergeben sich, wenn gemäß Anspruch 7 als
Träger NHS-aktivierte Sepharose verwendet wird und zwischen den immunore
aktiven Proteinen und der Festphase laut Anspruch 8 eine Peptidbindung entsteht.
Die Anbindung der Proteine ist äußerst stabil, so daß das Freisetzen von
immunoreaktiven Proteinen nahezu vollständig vermieden wird.
Gemäß Anspruch 9 weisen die Spacerarms 5 bis 9 Kohlenstoffatome auf. Sie
besitzen dadurch für die Bindung der beladenen Zellen an die Festphase eine
optimale Länge und unterbinden zuverlässig sterische Hinderungen. Es wird eine
außerordentlich hohe Reaktivität erzielt. Für den Verfahrensschritt der kovalenten
Bindung werden nach dem Umsetzen der immunoreaktiven Proteine gemäß
Anspruch 10 ungebundene Reaktionspartner mit einer Pufferlösung ausge
waschen und laut Anspruch 11 nicht umgesetzte reaktive Gruppen blockiert
und/oder inaktiviert, so daß eine hohe Spezifität der Festphase erreicht wird.
Um die Festphasenbindung der mit Antikörpern beladenen Zellen an die immu
noreaktiven Festphasen-Präparationen zu verstärken, werden nach Anspruch 12
hochpolymere Substanzen zugesetzt, beispielsweise Dextran oder Albumin. Diese
verhindern das Eindringen überschüssiger Immunglobuline und damit die Neutra
lisation des Trägermaterials. Günstig ist eine Konzentration im Bereich von 1 bis
15 Vol.-%, vorzugsweise 3 Vol.-%.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem
Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden spezielleren Beschreibung.
In einem Reaktionsgefäß wird zunächst NHS-aktivierte Sepharose (Pharmacia
Biotech, Schweden) in Gegenwart eines Kopplungspuffers bei pH 8,3 mit einem
Serum versetzt, das ein gegen ein bestimmtes, mit Antikörpern beladenes Zell
antigen gerichtetes Antihumanglobulin, z. B. monoklonales Antihuman-IgG,
enthält. Die Umsetzung zwischen der Sepharose und den Liganden, die primäre
Aminogruppen enthalten, erfolgt unter Abspaltung von N-Hydroxysuccinimid aus
der aktivierten Esterverbindung. Zwischen dem Anti-IgG und den an der Sepha
rose ansetzenden Spacerarms mit vorzugsweise 5 Kohlenstoffatomen bildet sich
eine stabile Peptidbindung. Anschließend werden ungebundene Reaktionspartner
in verschiedenen Waschschritten mit geeigneten Pufferlösungen entfernt. Nicht
umgesetzte, reaktive Gruppen lassen sich mit Äthanolamin blockieren oder mit
Trispuffer inaktivieren, so daß eine hohe Spezifität der Sephadex-Präparation er
zielt wird. Um das Eindringen überschüssiger Immunglobuline und damit die
Neutralisation des Trägermaterials zu verhindern, wird noch eine 3%ige
Dextran-Lösung zugesetzt.
Wie die Prüfung auf Agglutination IgG-beladener Erythrozyten (Coombcell E,
Biotest AG) im Röhrchen-Zentrifugationstest (RZT) zeigt, enthält eine auf diese
Weise hergestellte Sephadex-Suspension in einer low-ionic strength solution
(LISS), einer isotonen Kochsalzlösung oder in einem geeigneten Puffer kein un
gebundenes Antihuman-IgG mehr, so daß Überlappungen von Festphasen-Bin
dungen und Agglutinationsreaktionen antikörperbeladener Zellen wirksam
vermieden werden. Die Nachweis-Empfindlichkeit übertrifft diejenige herkömm
licher Verfahren erheblich.
Die Bindung blutgruppenspezifischer Antikörper, z. B. Antikörper des AB0- oder
Rh-Systems, des Kell-, Kidd- oder Duffy-Systems u. dgl., an Sepharose ist in
gleicher Art und Weise problemlos möglich. Das vollständige Entfernen über
schüssiger, nicht gebundener Antikörper kann leicht durch Prüfung der Über
stände oder Eluate mit geeigneten serologischen Agglutinationsmethoden erfol
gen.
Für Serumgegenproben wird in gleicher Weise Antihuman-IgM an die
Sepharose-Präparation gebunden. Dabei werden mit Isoantikörpern vom
IgM-Typ beladene Testerythrozyten an die feste Phase gebunden, während unbe
ladene Erythrozyten sedimentieren. Der Antihuman-IgM-Sepharose-Präparation
kann eine inerte, hochmolekulare Substanz, z. B. 3% Dextran, zugesetzt werden.
Für die Durchführung des Verfahrens werden als Reaktionsgefäße einseitig
geschlossene Röhrchen verwendet, die einen runden Querschnitt sowie einen
trichterförmig erweiterten Hals mit einer nach oben offenen, konisch ausgebildeten
Stufe als Inkubationskammer aufweisen. Mehrere Röhrchen sind zweckmäßig in
einer Basisplatte parallel zu einer Testeinheit verbunden; sie werden mit einer für
die jeweilige Bestimmung präparierten Sephadex-Matrix beschickt.
In die für die Inkubationen vorgesehenen Abschnitte der mit immunoreaktiven
Sephadex-Präparationen gefüllten Testeinheit werden 25 bis 100 µl einer 0,5 bis
1%igen Erythrozytensuspension in NaCl, LISS oder einer geeigneten Puffer
lösung luftblasenfrei pipettiert. Anschließend wird 1 bis 10 min lang bei 100 bis
2000 g (Erdbeschleunigung) zentrifugiert. Im Fall einer positiven Reaktion ist die
spezifische Bindung der Erythrozyten an die vorgelegte Sephadex-Präparation als
Rotfärbung deutlich erkennbar. Stimmen hingegen die antigenen Merkmale nicht
mit den Spezifitäten der vorgelegten Präparationen überein, sedimentieren die
Erythrozyten als negative Reaktion am Boden der Testeinheit.
25 bis 100 µl von 0,5 bis 1%igen A₁-, A₂-, B- und 0-Testerythrozyten (Biotestcell
A₁, A₂, B, 0; Biotest AG) in NaCl werden mit 25 bis 100 µl Seren oder Plasmen 5
bis 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird 1 bis 10 min lang bei
100 bis 2000 g zentrifugiert. Liegen Isoantikörper vor, werden die Testerythrozyten
an die Festphase gebunden.
25 bis 100 µl von 0,5 bis 1%iger Such- oder Identifizierungszellen in NaCl oder
LISS und 25 bis 100 µl Seren oder Plasmen werden in einer mit Antihuman-IgG-Sepha
rose beschickten Testeinheit 10 bis 30 min lang bei 37°C inkubiert. An
schließend wird 1 bis 10 min bei 100 bis 2000 g zentrifugiert. Das Vorhandensein
von Antikörpern wird durch die Bindung der beladenen Testerythrozyten an die
immunoreaktive Matrix in den Teströhrchen angezeigt. Negative Ergebnisse sind
an der vollständigen Sedimentation der Erythrozyten erkennbar.
Autokontrollen, bei denen Patienten- oder Spendererythrozyten und das Eigen
serum oder -plasma eingesetzt werden, sind ebenso wie serologische Verträg
lichkeitsproben (Kreuzproben) in gleicher Weise durchführbar.
Ein Vergleich der Reaktivitäten zwischen antihuman-IgG-beladener Protein
A-Sepharose CL-4B und erfindungsgemäß mit Antihuman-IgG gekoppelter Sepha
rose zeigt, daß die Test-Empfindlichkeit gegenüber dem Stand der Technik
wesentlich verbessert ist.
Dazu wurden in AB-Serum verdünnte Antikörper verschiedener Spezifitäten mit
einem Erythrozyten-Panel (Biotestcell P3, Biotest AG) inkubiert und deren Nach
weis parallel geprüft. Die Reaktionsstärken sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Als Beispiele für Blutgruppenbestimmungen wurden die Bestimmungen der Blut
gruppe A und des Rhesusfaktors D mit erfindungsgemäßen Anti-A- bzw. Anti-D-Prä
parationen herangezogen. Die Präparationen ergaben, wie die folgende Ta
belle zeigt eindeutige Festphasen-Reaktionen sowohl im AB0-System als auch
bei der Bestimmung des Rhesus-Faktors D.
Die Prüfung der Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Erfassung
erythrozytärer Antikörper erfolgte durch Titervergleich mit dem konventionellen
LISS-Coombs-Röhrchen-Zentrifugationstest (RZT). Dieser Vergleich wurde mit
denselben Verdünnungsstufen in AB-Serum und denselben Testerythrozyten
durchgeführt. Als Endtiter wurden die Verdünnungsstufen betrachtet, die mit allen
das entsprechende Antigen tragenden Panel-Zellen noch einfach-positive Resul
tate ergaben. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen be
schränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar. Man erkennt, daß für den
Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern in einem Reaktionsgefäß
immunoreaktive Proteine, z. B. gegen Zellantigene gerichtete Antikörper oder
Antihumanglobuline, erfindungsgemäß über Spacerarms kovalent an eine Fest
phase, z. B. NHS-aktivierte Sepharose, gebunden werden. Ungebundene
Reaktionspartner werden nach der Umsetzung mit einer Pufferlösung ausge
waschen; verbliebene reaktive Gruppen der Festphase werden blockiert bzw.
inaktiviert. Die zu untersuchenden Proben, z. B. Zellen zur Antigenbestimmung
oder Zellen nach Inkubation mit Seren oder Plasmen zum Antikörpernachweis,
werden mit der immunoreaktiven Festphase in Kontakt gebracht. Anschließend
werden die beladenen Zellen und unbeladenen Zellen physikalisch voneinander
getrennt.
Claims (13)
1. Affinitätschromatographisches Verfahren zum Nachweis von Antigenen
und/oder Antikörpern in einem einseitig geschlossenen Reaktionsgefäß
unter Verwendung einer transparenten Festphase mit daran kovalent über
Spacerarms gebundenen immunoreaktiven Proteinen, wobei zuerst die zu
untersuchenden Proben mit Zellen, die definierte antigene Merkmale
aufweisen, inkubiert werden, dann eine physikalische Trennung unbe
ladener von beladenen Zellen durchgeführt wird und schließlich beladene
Zellen über die immunoreaktiven Proteine an die Festphase gebunden
werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu
untersuchenden Proben mit Testerythrozyten inkubiert werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
die zu untersuchenden Proben Patientenseren oder -plasmen sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß Autokontrollen unter Einsatz von Patienten- oder
Spendererythrozyten und von Eigenserum oder -plasma durchgeführt
werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Festphase einen Träger aus Agarose, Sepharose,
Glaskügelchen und/oder Kunststoffkügelchen aufweist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Festphase einen Träger mit einer reaktiven Gruppe
aufweist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Festphasen-Träger NHS-aktivierte Sepharose ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß zwischen den immunoreaktiven Proteinen und dem
Festphasen-Träger eine Peptidbindung besteht.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Spacerarms 5 bis 9 Kohlenstoffatome aufweisen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn
zeichnet, daß für den Verfahrensschritt der kovalenten Bindung
Reaktionspartner, die nach dem Umsetzen der immunoreaktiven Proteine
ungebunden sind, mit einer Pufferlösung ausgewaschen werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn
zeichnet, daß für den Verfahrensschritt der kovalenten Bindung nicht
umgesetzte reaktive Gruppen blockiert und/oder inaktiviert werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekenn
zeichnet, daß hochpolymere Substanzen zugesetzt werden, beispiels
weise Dextran oder Albumin.
13. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für Blut
tests, insbesondere zur Blutgruppen- und Rhesusfaktor-Bestimmung.
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DE4208732C2 (de) * | 1992-03-18 | 1995-04-27 | Abion Ohg | Einwegreaktionsgefäß für die Festphasenimmunanalytik und Verfahren zur Messung von über Immunreaktionen bestimmbaren Komponenten |
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