PT2542257T - Anticorpos monoclonais otimizados contra inibidor da via do fator tecidual (tfpi) - Google Patents

Description

"ANTICORPOS MONOCLONAIS OTIMIZADOS CONTRA INIBIDOR DA VIA DO FATOR TECIDUAL (TFPI)"

DESCRIÇÃO

Apresentação de lista de sequências A Lista de Sequências associada com este pedido é depositada em formato eletrónico via EFS-Web.

Campo das formas de realização São proporcionados anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos que se ligam ao inibidor da via do fator tecidual humano (TFPI).

Antecedentes A coagulação sanguínea é um processo através do qual o sangue forma coágulos estáveis para parar a hemorragia. 0 processo envolve uma série de proenzimas e procofatores (ou "fatores de coagulação") que se encontram em circulação no sangue. Estas proenzimas e procofatores interatuam através de várias vias através das quais são convertidos, quer sequencialmente ou simultaneamente, na forma ativada. Em última análise, o processo resulta na ativação de protrombina a trombina através de Fator X ativado (FXa) na presença de fator Va, cálcio iónico, e plaquetas. A trombina ativada induz por sua vez a agregação de plaquetas e converte o fibrinogénio em fibrina, que é então reticulado através de Fator XIII ativado (FXIIIa) para formar um coágulo. 0 processo que leva à ativação do Fator X pode ser levado a cabo através de duas vias diferentes: a via de ativação de contacto (anteriormente conhecida como a via intrínseca) e a via de fator tecidual (anteriormente conhecida como a via extrínseca). Foi anteriormente pensado que a cascata de coagulação consistia em duas vias de igual importância unidas a uma via comum. É agora sabido que a via primária para a iniciação da coagulação sanguínea é a via de fator tecidual. 0 Fator X pode ser ativado através do fator tecidual (TF) em combinação com Fator VII ativado (FVIIa). 0 complexo de Fator Vila e o seu cofator essencial, TF, é um iniciador potente da cascata de coagulação. A via do fator tecidual de coagulação é controlada negativamente pelo inibidor da via do fator tecidual ("TFPI"). TFPI é um inibidor natural, por retrocontrolo dependente de FXa , do complexo FVIIa/TF. É um membro dos inibidores de serina protease de tipo Kunitz multivalentes. Fisiologicamente, TFPI liga a Fator X ativado (FXa) para formar um complexo heterodimérico, que subsequentemente interatua com o complexo FVIIa/TF para inibir a sua atividade, consequentemente inativando a via do fator tecidual de coagulação. Em principio, o bloqueamento da atividade de TFPI pode restaurar a atividade de FXa e FVIIa/TF, consequentemente prolongando a duração da ação da via do fator tecidual e amplificando a geração de FXa, que é o defeito comum na hemofilia A e B.

Com efeito, alguma evidência experimental preliminar indicou que o bloqueamento da atividade de TFPI por parte de anticorpos contra TFPI normaliza o tempo prolongado de coagulação ou reduz o tempo de hemorragia. Por exemplo, Nordfang et al. mostraram que o tempo prolongado de protrombina diluída de plasma com hemofilia foi normalizado após tratar o plasma com anticorpos para TFPI (Thromb. Haemost., 1991, 66(4): 464-467). De forma semelhante,

Erhardtsen et al. mostraram que o tempo de hemorragia no modelo de coelho de hemofilia A foi significativamente reduzido por anticorpos anti-TFPI (Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995, 6: 388-394). Estes estudos sugerem que a inibição de TFPI por anticorpos anti-TFPI pode ser útil para o tratamento da hemofilia A ou B. Somente foi utilizado anticorpo anti-TFPI policlonal nestes estudos.

Utilizando técnicas de hibridoma, foram preparados e identificados anticorpos monoclonais contra TFPI humano recombinante (rhTFPI). Veja-se Yang et al., Chin. Med. J., 1998, 111(8): 718-721. Foi testado o efeito do anticorpo monoclonal sobre o tempo de protrombina diluída (PT) e o tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT). As experiências mostraram que o anticorpo monoclonal anti-TFPI reduziu o tempo de coagulação de tromboplastina diluída de plasma deficiente em Fator IX. É sugerido que a via do fator tecidual desempenha um papel importante não só na coagulação fisiológica mas também na hemorragia da hemofilia (Yang et al., Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, 22 (4) : 297-300) .

Consequentemente, são necessários anticorpos específicos para TFPI para tratar doenças hematológicas e cancro.

De modo geral, foram gerados anticorpos terapêuticos para doenças humanas utilizando engenharia genética para criar anticorpos de ratinho, quiméricos, humanizados ou totalmente humanos. Os anticorpos monoclonais de ratinho foram mostrados como tendo utilização limitada como agentes terapêuticos devido a uma semivida em soro curta, uma incapacidade de desencadear funções efetoras humanas, e à produção de anticorpos humanos anti-ratinho (Brekke e Sandlie, "Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century," Nature 2, 53, 52-62, Jan. 2003). Os anticorpos quiméricos foram mostrados como dando origem a respostas anti-anticorpos quiméricos humanos. Os anticorpos humanizados minimizam adicionalmente o componente de ratinho dos anticorpos. Contudo, um anticorpo totalmente humano evita completamente a imunogenicidade associada com elementos de ratinho. Consequentemente, existe uma necessidade de desenvolver anticorpos totalmente humanos para evitar a imunogenicidade associada com outras formas de anticorpos monoclonais manipulados geneticamente. Em particular, o tratamento profilático crónico tal como seria requerido para o tratamento da hemofilia com um anticorpo monoclonal anti-TFPI tem um risco elevado de desenvolvimento de uma resposta imune à terapêutica se for utilizado um anticorpo com um componente de ratinho ou de origem de ratinho devido à dosagem frequente requerida e à longa duração da terapêutica. Por exemplo, a terapêutica de anticorpos para a hemofilia A pode requerer dosagem semanal durante o tempo de vida de um paciente. Este seria um desafio continuo para o sistema imune. Consequentemente, existe a necessidade de um anticorpo totalmente humano para terapêutica de anticorpos para a hemofilia e deficiências ou defeitos de coagulação genéticos e adquiridos relacionados.

Foram fabricados anticorpos terapêuticos através de tecnologia de hibridoma descrita por Koehler e Milstein em "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity," Nature 256, 495-497 (1975). Podem também ser fabricados anticorpos totalmente humanos recombinantemente em procariotas e eucariotas. É preferida produção recombinante de um anticorpo numa célula hospedeira em vez de produção de hibridoma para um anticorpo terapêutico. A produção recombinante tem as vantagens de maior consistência do produto, nivel de produção provavelmente mais elevado, e um fabrico controlado que minimiza ou elimina a presença de proteínas derivadas a partir de animais. Por estes motivos, é desejável ter um anticorpo anti-TFPI monoclonal produzido recombinantemente.

Além disso, dado que TFPI liga a Fator X ativado (FXa) com afinidade elevada, um anticorpo anti-TFPI deve ter uma afinidade comparável. Consequentemente, é desejável ter um anticorpo anti-TFPI que tenha afinidade de ligação que possa competir com a ligação TFPI/FXa.

Sumário São proporcionados anticorpos para o inibidor da via do fator tecidual humano (TFPI). São adicionalmente proporcionadas as moléculas de ácido nucleico isoladas codificando as mesmas. São também descritas composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos monoclonais anti-TFPI e métodos de tratamento de deficiências ou defeitos de coagulação genéticos e adquiridos tais como hemofilia A e B. São também descritos métodos para reduzir o tempo de hemorragia administrando um anticorpo monoclonal anti-TFPI a um paciente com necessidade do mesmo. São também proporcionados métodos para produzir um anticorpo monoclonal que liga a TFPI humano de acordo com a presente invenção.

Nalgumas formas de realização, os anticorpos monoclonais para TFPI proporcionados foram otimizados, por exemplo para ter afinidade aumentada ou atividade funcional aumentada.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 representa um gráfico de barras ilustrando variantes 2A8 selecionadas com substituições de aminoácido único que mostraram mais potência na redução do tempo de coagulação em plasma de hemofilia A humano utilizando um ensaio dPT. A Figura 2 representa um gráfico mostrando o efeito de anticorpos anti-TFPI com aminoácido único mutado sobre o tempo de coagulação de sangue hemofílico humano induzido por anticorpo anti-fator VIII. A Figura 3 representa um gráfico mostrando que 4B7-D62R tem muito mais potência na redução do tempo de coagulação em sangue de hemofilia A induzido por anticorpos conforme comparado com o anticorpo 4B7 parental e a um menor grau, conforme comparado com substituições de aminoácido único dentro de 2A8. A Figura 4 representa dois gráficos mostrando a sobrevivência de ratinhos com hemofilia A tratados com o anticorpo parental 2A8 e uma variante de 2A8 tendo várias substituições de aminoácidos (Δ200) de uma forma dependente da dose conforme comparado com o ratinho de controlo IgGl (CTX IgGl). A Figura 5 representa um gráfico mostrando que uma variante de 2A8 potenciou a coagulação em plasma de hemofilia C humano (deficiente para FXI) de uma forma dependente da dose e os seus efeitos foram comparáveis com os de FVIIa recombinante.

Descrição Detalhada Definições 0 termo "inibidor da via do fator tecidual" ou "TFPI" conforme utilizado no presente documento refere-se a qualquer variante, isoforma e espécies homólogas de TFPI humano que é naturalmente expresso por células. Numa forma de realização preferida da invenção, a ligação de um anticorpo da invenção a TFPI reduz o tempo de coagulação sanguínea.

Conforme utilizado no presente documento, um "anticorpo" refere-se a um anticorpo completo e qualquer fragmento de ligação a antigénio (isto é, "porção de ligação a antigénio") ou cadeia simples do mesmo. 0 termo inclui uma molécula de imunoglobulina de comprimento completo (por exemplo, um anticorpo IgG) que é de ocorrência natural ou formada através de processos de recombinação de fragmentos génicos de imunoglobulina, ou uma porção imunologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina, tal como um fragmento de antigénio, que retém a atividade de ligação específica. Independentemente da estrutura, um fragmento de anticorpo liga com o mesmo antigénio que é reconhecido pelo anticorpo de comprimento completo. Por exemplo, um fragmento de anticorpo monoclonal anti-TFPI liga a um epítopo de TFPI. A função de ligação a antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e Chi; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHi; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste num domínio VH; (vi) uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada; (vii) minicorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, e corpos capa (veja-se, por exemplo 111 et al., Protein Eng 1997;10:949-57); (viii) IgG de camelo; e (ix) IgNAR. Adicionalmente, embora os dois fragmentos do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes diferentes, podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, através de um ligante sintético que lhes permite serem feitos como uma cadeia de proteína simples na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); veja-se por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples também se destinam a ser abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas para os peritos na especialidade, e os fragmentos são analisados para utilidade da mesma forma que o são os anticorpos intactos.

Adicionalmente, é contemplado que um fragmento de ligação a antigénio possa ser abrangido num mimético de anticorpo. O termo "mimético de anticorpo" ou "mimético" conforme utilizado no presente documento destina-se a significar uma proteína que exibe ligação semelhante a um anticorpo mas é um anticorpo alternativo mais pequeno ou uma proteína não anticorpo. Tal mimético de anticorpo pode ser compreendido numa estrutura. 0 termo "estrutura" refere-se a uma plataforma de polipéptidos para a manipulação de novos produtos com funções e características à medida.

Conforme utilizado no presente documento, os termos "inibe a ligação" e "bloqueia a ligação" (por exemplo, referindo-se a inibição/bloqueamento da ligação do ligando de TFPI a TFPI) são utilizados indistintamente e abrangem inibição ou bloqueamento tanto parciais como completos. A inibição e o bloqueamento também se destinam a incluir qualquer diminuição mensurável da afinidade de ligação de TFPI a um substrato fisiológico quando em contacto com um anticorpo anti-TFPI conforme comparado com TFPI não em contacto com um anticorpo anti-TFPI, por exemplo, o bloqueamento da interação de TFPI com fator Xa ou bloqueamento da interação de um complexo TFPI-fator Xa com fator tecidual, fator Vila ou o complexo de fator tecidual/fator Vila por pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", conforme utilizados no presente documento referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade e afinidade de ligação para um epítopo particular. Consequentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos apresentando uma especificidade de ligação única que têm regiões constantes variáveis derivadas a partir de sequências de imunoglobulinas de linha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas de linha germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou dirigida in vitro ou por mutação somática in vivo).

Um "anticorpo isolado", conforme utilizado no presente documento, destina-se a referir-se a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigénicas (por exemplo, um anticorpo isolado que liga a TFPI é substancialmente isento de anticorpos que ligam a antigénios para além de TFPI). Um anticorpo isolado que liga a um epítopo, isoforma ou variante de TFPI humano pode, contudo, ter reatividade cruzada com outros antigénios, por exemplo, a partir de outras espécies (por exemplo, homólogos de espécie de TFPI) . Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.

Conforme utilizado no presente documento, "ligação específica" refere-se a ligação de anticorpo a um antigénio predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga com uma afinidade de pelo menos cerca de 105 M'1 e liga ao antigénio predeterminado com uma afinidade que é superior, por exemplo pelo menos duas vezes superior, do que a sua afinidade para ligar a um antigénio irrelevante (por exemplo, BSA, caseína) para além do antigénio predeterminado ou um antigénio estreitamente relacionado. As frases "um anticorpo reconhecendo um antigénio" e "um anticorpo específico para um antigénio" são utilizadas indistintamente no presente documento com o termo "um anticorpo que liga especificamente a um antigénio".

Conforme utilizado no presente documento, o termo "afinidade elevada" para um anticorpo IgG refere-se a uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 107M-1, nalgumas formas de realização pelo menos cerca de 108M-1, nalgumas formas de realização pelo menos cerca de 109Μ_1, 1010M_1, 1011m“1 ou superior, por exemplo, até 1013M_1 ou superior. Contudo, ligação de "afinidade elevada" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de "afinidade elevada" para um isótipo de IgM refere-se a uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 1,0 x 107M_1. Conforme utilizado no presente documento, "isotipo" refere-se à classe do anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificado por genes de região constante de cadeia pesada. "Região de determinação da complementaridade" ou "CDR" refere-se a uma de três regiões hipervariáveis dentro da região variável da cadeia pesada ou da região variável da cadeia leve de uma molécula de anticorpo que formam a superfície de ligação a antigénio N-terminal que é complementar à estrutura tridimensional do antigénio ligado. Procedendo a partir do terminal N de uma cadeia pesada ou leve, estas regiões de determinação da complementaridade são denotadas como "CDRl," "CDR2", e "CDR3", respetivamente. As CDRs estão envolvidas na ligação antigénio-anticorpo, e a CDR3 compreende uma região única específica para ligação antigénio-anticorpo. Um sítio de ligação a antigénio, como tal, pode incluir seis CDRs, compreendendo as regiões de CDR a partir de cada uma de uma região V de cadeia pesada e de cadeia leve.

Conforme utilizado no presente documento, "substituições conservativas" refere-se a modificações de um polipéptido que envolvem a substituição de um ou mais aminoácidos por aminoácidos tendo propriedades bioquímicas semelhantes que não resultam em perda de uma função biológica ou bioquímica do polipéptido. Uma "substituição de aminoácido conservativa é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. Foram definidas na técnica famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais semelhantes. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais com ramificação beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). É visado que os anticorpos da presente invenção possam ter substituições de aminoácido conservativas e ainda assim reter atividade.

Para ácidos nucleicos e polipéptidos, o termo "homologia substancial" indica que dois ácidos nucleicos ou dois polipéptidos, ou sequências designadas dos mesmos, quando alinhados e comparados de forma ótima, são idênticos, com inserções ou eliminações de nucleótidos ou aminoácidos adequadas, em pelo menos cerca de 80% dos nucleótidos ou aminoácidos, habitualmente pelo menos cerca de 85%, preferentemente cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou 95%, mais preferentemente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, ou 99,5% dos nucleótidos ou aminoácidos. Alternativamente, existe homologia substancial para ácidos nucleicos quando os segmentos hibridem sob condições de hibridação seletiva com o complemento da cadeia. A invenção inclui sequências de ácidos nucleicos e sequências de polipéptidos tendo homologia substancial com as sequências de ácidos nucleicos e sequências de polipéptidos especificas recitadas no presente documento. A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (isto é, % homologia = n.° de posições idênticas / n.° total de posições x 100), tendo em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que necessitam ser introduzidas para o alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação da percentagem de identidade entre as duas sequências pode ser obtida utilizando um algoritmo matemático, tal como sem limitação o módulo AlignX™ de of VectorNTI™ (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Para AlignX™, os parâmetros por defeito de alinhamento múltiplo são: penalização de abertura de lacuna: 10; penalização de extensão de lacuna: 0,05; intervalo de penalização de separação de lacuna: 8; % de identidade para atraso de alinhamento: 40. (detalhes adicionais encontrados em http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-Communities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-software-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html).

Outro método para determinar a melhor coincidência global entre uma sequência de consulta (uma sequência da presente invenção) e uma sequência em questão, também referido como um alinhamento de sequências global, pode ser determinado utilizado o programa de computador CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Research, 1994, 2(22): 4673-4680), que é baseado no algoritmo de Higgins et al., (Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, 8(2): 189-191). Num alinhamento de sequências as sequência de consulta e em questão são ambas sequências de ADN. O resultado do dito alinhamento de sequências global está em percentagem de identidade. Os parâmetros preferidos utilizados num alinhamento CLUSTALW de sequências de ADN para calcular percentagem de identidade por meio de alinhamentos por pares são: Matriz = IUB, k-tuplo = 1, Número de Diagonais Superiores = 5, Penalização de Lacuna = 3, Penalização de Lacuna Aberta = 10, Penalização de

Extensão de Lacuna = 0,1. Para alinhamentos múltiplos, são preferidos os seguintes parâmetros de CLUSTALW: Penalização de Abertura de Lacuna= 10, Parâmetro de Extensão de Lacuna = 0,05; Intervalo de Penalização de Separação de Lacuna = 8; % Identidade para Atraso do Alinhamento = 40.

Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células completas, num lisado celular, ou numa forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado a partir de outros componentes celulares com os quais é normalmente associado no ambiente natural. Para isolar um ácido nucleico, podem ser utilizadas técnicas padrão tais como as seguintes: tratamento alcalino/SDS, produção de bandas com CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica.

Anticorpos Monoclonais otimizados para afinidade elevada e atividade funcional

Foram identificados vários anticorpos anti-TFPI num estudo anterior e descritos no documento W02010/017196. Estes anticorpos anti-TFPI podem ser adicionalmente otimizados, por exemplo melhorando a sua afinidade e atividade de bloqueamento de TFPI. Tal otimização pode ser realizada por exemplo utilizando mutagénese por saturação de sitio das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) ou resíduos em estreita proximidade às CDRs, isto é, cerca de 3 ou 4 resíduos adjacentes às CDRs, dos anticorpos. São também proporcionados anticorpos monoclonais tendo afinidade aumentada ou elevada a TFPI. Nalgumas formas de realização, os anticorpos anti-TFPI têm uma afinidade de ligação de pelo menos cerca de 107Μ_1, nalgumas formas de realização pelo menos cerca de 108Μ_1, nalgumas formas de realização pelo menos cerca de 109Μ_1, 1010M_1, ÍO^M-1 ou superior, por exemplo, até 1013M_1 ou superior.

Foi utilizada mutagénese por saturação de sítio em e adjacente às CDRs de dois anticorpos anti-TFPI parentais, designados no presente documento como 2A8 e 4B7, para otimizar os anticorpos para afinidade e atividade funcional. É também contemplado que a mesma otimização possa ser realizada em qualquer dos anticorpos descritos no documento PCT/US2009/052702 anterior. A mutagénese por saturação de sítio das CDRs pode ser realizada nos anticorpos anti-TFPI. Para 2A8, as CDRs na cadeia pesada mostrada na SEQ ID N0:1 correspondem aos resíduos FTFRSYGMS (resíduos 27 a 35), SIRGSSSSTYYADSVKG (resíduos 50 a 66), e KYRYWFDY (resíduos 99 a 106). Para a cadeia leve de 2A8 mostrada na SEQ ID NO: 2, as CDRs correspondem aos resíduos SGDNLRNYYAH (resíduos 23 a 33), YYDNNRPS (resíduos 48 a 55) , e QSWDDGVPV (resíduos 88 a 96) . Para 4B7, as CDRs na cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 3 correspondem aos resíduos DSVSSNSAAWS (resíduos 27 a 37), IIYKRSKWYNDYAVSVKS (resíduos 52 a 70), e WHSDKHWGFDY (resíduos 102 a 112). Para a cadeia leve de 4B7 mostrada na SEQ ID NO:4, as CDRs correspondem aos resíduos RSSQSLVFSDGNTYLN (resíduos 24 a 39), KGSNRAS (resíduos 55 a 61), e QQYDSYPLT (resíduos 94 a 102) da SEQ ID NO: 4. Pode ser realizada uma modificação em qualquer das seis CDRs individualmente ou podem ser realizadas combinações de modificações. Adicionalmente, podem ser realizadas duas ou mais modificações numa única CDR. Noutras variantes divulgadas, podem também ser introduzidas modificações em estreita proximidade às CDRs, por exemplo cerca de 3 ou 4 resíduos a cada lado de cada CDR.

Brevemente, foram introduzidas modificações de aminoácidos únicos ou múltiplos e analisadas para otimizar, por exemplo melhorar a afinidade, dos anticorpos parentais 2A8 e 4B7. Em primeiro lugar, foram introduzidas modificações de aminoácido único nas seis CDRs ou adjacentes às CDRs de cada anticorpo seguido por análise das propriedades de ligação a TFPI. Foram selecionadas modificações que aumentaram o sinal de ligação a TFPI para combinação com uma ou mais outras modificações e analisadas para aumento adicional do sinal de ligação. Após cada análise, as variantes de anticorpo selecionadas foram utilizadas para medir a sua afinidade a TFPI e atividade no bloqueamento de TFPI e tempo de coagulação reduzido. Consequentemente, nalgumas formas de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano tendo afinidade aumentada para TFPI conforme comparado com os anticorpos parentais não modificados. Adicionalmente, nalgumas formas de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano tendo atividade de bloqueamento de TFPI aumentada conforme comparado com os anticorpos parentais não modificados. Nalgumas formas de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano tendo um tempo de coagulação reduzido conforme comparado com os anticorpos parentais não modificados.

Nalgumas formas de realização, foram introduzidas modificações de aminoácidos adicionais para reduzir a divergência a partir da sequência da linha germinal. Noutras formas de realização, foram introduzidas modificações de aminoácidos adicionais para facilitar a produção de anticorpos para processos de produção a grande escala. 0 anticorpo pode ser especifico de espécie ou pode ter reatividade cruzada com várias espécies. Nalgumas formas de realização, o anticorpo pode especificamente reagir ou ter reatividade cruzada com TFPI humano, de ratinho, rato, coelho, porquinho-da-índia, macaco, porco, cão, gato ou outra espécie de mamífero. 0 anticorpo pode ser de qualquer das várias classes de anticorpos, tais como sem limitação um anticorpo IgGl, um IgG2, um IgG3, um IgG4, um IgM, um IgAl, um IgA2, um IgA secretório, um IgD, e um IgE.

Numa forma de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal totalmente humano isolado para o inibidor da via do fator tecidual humano.

Noutra forma de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal totalmente humano isolado para o domínio 2 de Kunitz do inibidor da via do fator tecidual humano.

Variantes de 2A8

Consequentemente, nalgumas formas de realização, é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N0:1, em que a dita sequência de aminoácidos compreende uma ou mais modificações de aminoácidos conforme definido nas reivindicações.

As substituições estão localizadas nas CDRs da cadeia pesada de 2A8.

Nalgumas variantes divulgadas, a substituição da cadeia pesada de 2A8 está numa posição selecionada a partir de S31, G33, S35, 151, S54, S55, K99 e F104. Nalgumas variantes, a substituição da cadeia pesada de 2A8 pode também incluir uma posição selecionada a partir de Ql, R30, M34, S50, R52 e S56. Por exemplo, a substituição pode ser selecionada a partir de Q1E, R30S, S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K, S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52S, S54F, S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L, e F104Y.

Adicionalmente, nalgumas variantes, o anticorpo pode compreender duas ou mais substituições selecionadas a partir de Q1E, R30S, S31P, S31V, G33A, G33K, G33P, M34I, M34K, S35L, S35D, S50A, I51D, I51E, R52S, S54F, S54D, S55A, S55G, S55R, S56G, K99V, K99L, e F104Y.

Nalgumas variantes, a cadeia pesada de 2A8 tem as seguintes substituições em relação à SEQ ID N0:1: S31V+I51D+S54F+K99V; G33P+S35D+S54F+K99L; S35D+I51D+S55R+K99V; S35L+S54F+K99V; S31V+G33P+S35D; S35D+I51D+K99L; S31V+I51D+S55R+K99L; S31V+S35D+I51D+K99V; G33P+I51D+S54F; I51D+S54F+K99L; S35D+K99L; S31V+G33P+I51D+S54F+K99V; S35D+I51E+S55R+K99L; S31V+K99V; S31V+I51E+S55R+K99V; S35D+S55R+K99L; S31V+S54F+K99L; S31V+I51D+S55R+K99V; S31V+S35D+S55R; S31V+S35D; S31V+I51D+S55R; S35D+S54F+S55R+K99L; S31V+S35D+S54F S31V+S35L+I51D+S54F+K99V; e S31V+S35L+I51E+S54F+K99V.

Nalgumas variantes, a cadeia pesada de 2A8 tem as seguintes substituições em relação à SEQ ID N0:1: G33A+S35D+S55R+K99L; G33P+I51D+S54F; G33P+S35D+S54F+K99L; I51D+S54F+K99L; M34I+S35D+S55R+K99L; M34K+S35D+S55R+K99L; Q1E+R30S + S35D+S55G+S5 6G+K9 9L; Q1E+R30S + S35D+S55R+S56G+K99L; Q1E+S31V +S50A+I51D+S55R+S56G+K99V; Q1E+S35D+S55R+K99L; R30S+S31V+I51D+S55R+K99V; R30S+S35D+S55R+K99L; S31V+G33A+I51D+S55R+K99V; S31V+G33P+I51D+S54F+K99V; S31V+G33P+S35D; S31V+I51D+R52S+S55R+K99V; S31V+I51D+S54F+K99V; S31V+I51D+S55R; S31V+I51D+S55R+K99L; S31V+I51D+S55R+K99V; S31V+I51D+S55R+S56G+K99V; S31V+I51E+S55R+K99V; S31V+K99V; S31V+S35D; S31V+S35D+I51D+K99V; S31V+S35D+S54F; S31V+S35D+S55R; S31V+S35L+I51D+S54F+K99V; S31V+S35L+I51E+S54F+K99V; S31V+S50A+I51D+S55R+K99V; S31V+S54F+K99L; S35D+I51D+K99L; S35D+I51D+S55R+K99V; S35D+I51E+S55R+K99L; S35D+K99L; S35D+R52S+K99L; S35D+R52S+S55R+K99L; S35D+S50A+K99L; S35D+S50A+S55R+K99L; S35D+S54F+S55R+K99L; S35D+S55G+K99L; S35D+S55R+K99L; S35D+S55R+S56G+K99L; S35D+S56G+K99L; e S35L+S54F+K99V.

Nalgumas variantes divulgadas, a cadeia pesada de 2A8 tem uma ou mais eliminações. Nalgumas variantes, as eliminações estão localizadas nas CDRs da cadeia pesada de 2A8. Noutras formas de realização, as eliminações estão localizadas fora das CDRs da cadeia pesada de 2A8. Nalgumas variantes, por exemplo, a eliminação está numa posição selecionada a partir de 151, S56 e S57.

Adicionalmente, é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N0:2, em que a dita sequência de aminoácidos compreende uma ou mais modificações de aminoácidos, conforme definido nas reivindicações.

As substituições estão localizadas nas CDRs da cadeia leve de 2A8.

Nalgumas variantes divulgadas no presente documento, a substituição da cadeia leve de 2A8 está numa posição selecionada a partir de A32, Y48, N51, N52, P54, D91, D92 e V96. Nalgumas variantes, a substituição da cadeia leve de 2A8 pode também incluir uma posição selecionada a partir de Dl, 12, Al 3, S21, N26, R28, N29, H33, Y49, G56, E80, S89, G93, V94 e P95. Por exemplo, a substituição pode ser selecionada a partir de DlS, I2Y, A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P54L, G56D, E80M, S89A, D91L, D91R, D91W, D91K, D92S, D92T, G93S, V94T, P95V, P95A, V96G, V96M e V96W. Adicionalmente, nalgumas variantes, o anticorpo pode compreender duas ou mais substituições selecionadas a partir de DlS, I2Y, A13S, S21T, N26A, R28P, N29K, A32N, H33Y, Y48F, Y49R, N51S, N51V, N52G, P54L, G56D, E80M, S89A, D91L, D91R, D91W, D91K, D92S, D92T, G93S, V94T, P95V, P95A, V96G, V96M e V96W.

Nalgumas formas de realização, a cadeia leve de 2A8 tem as seguintes substituições em relação à SEQ ID N0:2: Y48F+N51V; Y48F+N52G; Y48F+D91K; Y48F+D91L+V96W; Y48F+D91W; Y48F+N52G+D91L+V96W; Y48F+N51V+V96W; D91L+V96W; Y48F+N51V+D91W; Y48F+N51V+D91L+V96W; N51V+D91W; Y48F+N51V+G56D+V96W; Y48F+N51V+D91L; e N51V+D91K.

Nalgumas variantes, a cadeia leve de 2A8 tem as seguintes substituições em relação à SEQ ID N0:2: A13S+Y48F+N51V+D91W; D1S + I2Y+Al3S + S21T+R2 8P+N2 9K+Y4 8F+E8 0M+D91L+D92S+V94T+V9 6W; D1S + I2Y+Al3S + S21T+R2 8P+N2 9K+Y4 8F+N51S+E8 0M+D91L+D92S+V94T+V 9 6W; D1S + I2Y+Al3S + S21T+R2 8P+N2 9K+Y4 8F+N51V+E8 0M+D91W;

D1S + I2Y+A13S + S21T+R2 8P+N2 9K+Y4 8F+N51V+E8 OM+S8 9A+D91W+D92S+G 93S+V 94Τ; D1S + I2Y+A13S+S21T+R2 8P+N2 9K+Y4 8F+Y4 9R+N51S+E8 0M+D91L+D92S+V 94T+V9 6W; D1S+I2Y+A13S+S21T+R28P+Y48F+N51V+E80M+D91W; D1S + I2Y+Al3S + S21T+R2 8P+Y4 8F+N51V+E8 OM+S 8 9A+D91W+D92S + G93S+V 94T; D1S+Y48F+N51V+D91W; D91L+V96W; H33Y+Y48F+N51V+D91W; I2Y+Y48F+N51V+D91W; N26A+Y48F+N51V+D91W; N29K+Y48F+N51V+D91W; N51V+D91K; N51V+D91W; R28P+Y48F+N51V+D91W; S21T+Y48F+N51V+D91W; Y48F+D91K; Y48F+D91L+D92S+V96W; Y48F+D91L+G93S+V96W; Y48F+D91L+P95V+V96W; Y48F+D91L+V94T+V96W; Y48F+D91L+V96W; Y48F+D91W; Y48F+N51S+D91L+V96W; Y48F+N51V; Y48F+N51V+D91L; Y48F+N51V+D91L+V96W; Y48F+N51V+D91W; Y48F+N51V+D91W+D92S; Y48F+N51V+D91W+G93S; Y48F+N51V+D91W+P95V; Y48F+N51V+D91W+V94T; Y48F+N51V+E80M+D91W; Y48F+N51V+G56D+V96W; Y48F+N51V+S89A+D91W; Y48F+N51V+S89A+D91W+D92S+G93S+V94T+P95A; Y48F+N51V+V96W; Y48F+N52G; Y48F+N52G+D91L+V96W; e Y48F+S89A+D91L+V96W.

Também é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia pesada compreende uma ou mais modificações de aminoácidos; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia leve compreende uma ou mais modificações de aminoácidos, conforme definido nas reivindicações. São proporcionados acima outros exemplos de modificações que podem ser realizadas.

Nalgumas variantes o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11.

Nalgumas variantes o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18.

Nalgumas variantes divulgadas no presente documento, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 5; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 13. Nalgumas formas de realização, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 7; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 14. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 15. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 16. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 17. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 11; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 18.

Variantes de 4B7 É também divulgado no presente documento um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:3 compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos. Nalgumas variantes, a modificação da cadeia pesada de 4B7 é uma substituição, uma inserção ou uma eliminação.

Nalgumas variantes, as substituições estão localizadas nas CDRs da cadeia pesada de 4B7. Noutras variantes, as substituições estão localizadas fora das CDRs da cadeia pesada de 4B7.

Nalgumas variantes, a substituição da cadeia pesada de 4B7 está numa posição selecionada a partir de S30, N32, S57, K58, N61, D62, H103, H107, G109 e Y112. Nalgumas variantes, a substituição da cadeia pesada de 4B7 pode também incluir uma posição selecionada a partir de Ql, S37, G44, 153 e K55. Por exemplo, a substituição pode ser selecionada a partir de Q1E, S30R, N32D, N32E, S33G, S37N, G44S, I53T, K55Y, S57K, S57R, K58M, N61G, N61T, D62I, D62R, D62Q, D62L, D62S, D62V, D62N, D62K, H103D, H103G, H107M, G109A e Y112D. Adicionalmente, nalgumas variantes, o anticorpo pode compreender duas ou mais substituições selecionadas a partir de Q1E, S30R, N32D, N32E, S33G, S37N, G44S, I53T, K55Y, S57K, S57R, K58M, N61G, N61T, D62I, D62R, D62Q, D62L, D62S, D62V, D62N, D62K, H103D, H103G, H107M, G109A e Y112D.

Nalgumas variantes, a cadeia pesada de 4B7 tem as seguintes substituições em relação à SEQ ID NO:3: N32D+D62Q+H107M+Y112D; N32D+D62R+H103D+H107M+Y112D; N32D+D62R+H107M+Y112D; N32D+D62R+Y112D; D62Q+Y112D; D62R+Y112D; D62R+H107M+Y112D; N32D+D62Q+Y112D; N32D+D62R+H107M; N32D+D62S+H107M+Y112D; D62Q+H107M+Y112D; N32D+D62R+H103D; D62S+H107M+Y112D; S30R+S57K; N61G+D62V; e K58M+D62N. Nalgumas variantes, a cadeia pesada de 4B7 tem as seguintes substituições em relação à SEQ ID NO:3: D62Q+H107M+Y112D; D62Q+Y112D; D62R+H107M+Y112D; D62R+Y112D; D62S+H107M+Y112D; N32D+D62K+Y112D; N32D+D62Q+H107M+Y112D; N32D+D62Q+Y112D; N32D+D62R+H103D; N32D+D62R+H103D+H107M+Y112D; N32D+D62R+H107M; N32D+D62R+H107M+Y112D; N32D+D62R+Y112D; N32D+D62S+H107M+Y112D; N32D+G44S+D62R+Y112D; N32D+I53T+D62Q+Y112D; N32D+I53T+D62R+Y112D; N32D+K55Y+D62Q+Y112D; N32D+K55Y+D62R+Y112D; N32D+S37N+D62R+Y112D; Q1E+N32D+D62R+Y112D; Q1E+N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D; N32D+G44S+K55Y+D62R+Y112D; S30R+S57K; N61G+D62V; e K58M+D62N.

Adicionalmente, é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:4 compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos. Nalgumas variantes, a modificação da cadeia leve de 4B7 é selecionada a partir de uma substituição, uma inserção ou uma eliminação.

Nalgumas variantes, as substituições estão localizadas nas CDRs da cadeia leve de 4B7. Noutras variantes, as substituições estão localizadas fora das CDRs da cadeia leve de 4B7.

Nalgumas variantes, a substituição da cadeia leve de 4B7 está numa posição selecionada a partir de F31, S32, D33, N35, Y37, Y54, G56, S57, S61 e D97. Nalgumas variantes, a substituição da cadeia leve de 4B7 pode também incluir uma posição selecionada a partir de M4, V30, T36, N39, L42, K44, Q50, L51, K55, A60 e S98. Por exemplo, a substituição pode ser selecionada a partir de M4I, M4L, V30L, F31I, F31M, F31Y, F31H, S32L, S32R, S32Y, D33F, D33R, N35I, N35L, N35T, N35V, T36N, Y37F, N39D, L42Q, K44R, Q50R, L51R, Y54F, K55L, G56D, G56A, G56V, S57Y, A60D, S61C, D97M, D97T e S98H. Adicionalmente, nalgumas variantes, o anticorpo pode compreender duas ou mais substituições selecionadas a partir de M4I, M4L, V30L, F31I, F31M, F31Y, S32L, S32R, S32Y, D33F, D33R, N35I, N35L, N35T, N35V, T36N, Y37F, N39D, L42Q, K44R, Q50R, Y54F, K55L, G56D, G56A, G56V, S57Y, A60D, S61C, D97M, D97T e S98H.

Nalgumas variantes, a cadeia leve de 4B7 tem as seguintes substituições em relação à SEQ ID NO: 4: S32R+N35T; S32R+N35T+D97T; S32R+D33F+N35I; S32R+D33F+N35I+D97T; S32R+D33F+N35T; S32R+D33F; S32R+D33R+N35I; S32R+D33R+N35I+D97T; S32R+D33R; S32R+D33R+N35T; N35T+D97T; D33F+N35I; D33F+N35I+D97T; D33F+N35T+Y37F; D33R+N35I; D33R+N35I+D97T; D33R+N35T; F31I+S32R+N35I+D97T; F31I+S32R+D33F+N35I+D97T; F31I+S32R+D33F+N35T; F31I+S32R+D33R+N35I+D97T; F31I+N35I; F31I+D33F+N35I; F31I+D33F+N35I+D97T; F31I+D33R+N35I; F31I+D33R; F31M+S32L+D33R+N35I+D97T; F31M+S32R+D33F+N35I; F31M+S32R+D33F+N35I+D97T; F31M+S32R+D33F+D97T; F31M+S32R+D33R+N35I; F31M+S32R+D33R+N35I+D97T; F31M+S32R+D33R; F31M+S32R+D33R+N35T; F31M+D33F+N35I; F31M+D33F; F31M+D33F+N35T; F31M+D33R+N35I; F31M+D33R; S32R+N35I; F31M+D33F+N35T+Y37F; N35V+G56D; N35L+G56A; e D33F+Y54F.

Nalgumas variantes, a cadeia leve de 4B7 tem as seguintes substituições em relação à SEQ ID NO: 4: D33F+N35I; D33F+N35I+D97T; D33F+N35T+Y37F; D33R+N35I; D33R+N35I+D97T; D33R+N35T; F31H+S32R+D33F+N35I+D97T; F31I+D33F+N35I; F31I+D33F+N35I+D97T; F31I+D33F+N35I+K44R; F31I+D33F+N35I+L42Q; F31I+D33F+N35I+S98H; F31I+D33F+N35I+T36N; F31I+D33R; F31I+D33R+N35I; F31I+N35I; F31I+S32R+D33F+N35I+D97T; F31I+S32R+D33F+N35T; F31I+S32R+D33R+N35I+D97T; F31I+S32R+N35I+D97T; F31M+D33F; F31M+D33F+N35I; F31M+D33F+N35T; F31M+D33F+N35T+Y37F; F31M+D33R; F31M+D33R+N35I; F31M+S32L+D33R+N35I+D97T; F31M+S32R+D33F+D97T; F31M+S32R+D33F+N35I; F31M+S32R+D33F+N35I+D97T; F31M+S32R+D33R; F31M+S32R+D33R+N35I; F31M+S32R+D33R+N35I+D97T; F31M+S32R+D33R+N35T; F31Y+S32R+D33F+N35I+D97T; M4I+S32R+D33F+N35I+D97T; M4L+S32R+D33F+N35I+D97T; N35T+D97T; S32R+D33F; S32R+D33F+N35I; S32R+D33F+N35I+A60D+D97T; S32R+D33F+N35I+D97T; S32R+D33F+N35I+D97T+S98H; S32R+D33F+N35I+G56V+D97T; S32R+D33F+N35I+K44R+D97T; S32R+D33F+N35I+K55L+D97T; S32R+D33F+N35I+L42Q+D97T; S32R+D33F+N35I+L51R+D97T; S32R+D33F+N35I+N39D+D97T; S32R+D33F+N35I+Q50R+D97T; S32R+D33F+N35I+T3 6N+D97T; S32R+D33F+N35T; S32R+D33R; S32R+D33R+N35I; S32R+D33R+N35I+D97T; S32R+D33R+N35T; S32R+N35I; S32R+N35T; S32R+N35T+D97T; V30L+F31I+D33F+N35I ; V30L+S32R+D33F+N35I+D97T; V30L+S32R+D33F+N35I+T36N+D97T; V30L+S32R+N35I+T36N; N35V+G56D; N35L+G56A; e D33F+Y54F.

Também é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia pesada compreende uma ou mais modificações de aminoácidos; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:4, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia leve compreende uma ou mais modificações de aminoácidos. São proporcionados acima exemplos de modificações que podem ser realizadas.

Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26.

Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34.

Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 19; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 27. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 20; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 28. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 21; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 29. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 22; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 30. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 23; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 31. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 24; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 32. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 25; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 33. Nalgumas variantes, o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano compreende: a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 26; e b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 34.

Combinações de Variantes 2A8/4B7 É também divulgado que o anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano pode compreender combinações das cadelas pesada e leve de 2A8 e 4B7 .

Consequentemente, é divulgado no presente documento um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende: a) uma cadeia pesada de 2A8 compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N0:1, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia pesada compreende uma ou mais modificações de aminoácidos; e (b) uma cadeia leve de 4B7 compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia leve compreende uma ou mais modificações de aminoácidos. São proporcionados acima exemplos de modificações que podem ser realizadas.

Também é proporcionado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende: a) uma cadeia pesada de 4B7 compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia pesada compreende uma ou mais modificações de aminoácidos; e (b) uma cadeia leve de 2A8 compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia leve compreende uma ou mais modificações de aminoácidos. São proporcionados acima exemplos de modificações que podem ser realizadas. É adicionalmente divulgado um anticorpo monoclonal isolado que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende: (a) uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, e 26; e (b) uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, e 34. Ácidos Nucleicos, Vetores e Células Hospedeiras São também proporcionadas moléculas de ácido nucleico isoladas codificando quaisquer dos anticorpos monoclonais descritos acima.

Consequentemente, é proporcionada uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um anticorpo que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N0:1, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia pesada compreende uma ou mais modificações de aminoácidos. São descritos acima exemplos de tais modificações. É também proporcionada uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um anticorpo que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia leve compreende uma ou mais modificações de aminoácidos. São descritos acima exemplos de tais modificações. É também proporcionada uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um anticorpo que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:3, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia pesada compreende uma ou mais modificações de aminoácidos. São descritos acima exemplos de tais modificações. É também proporcionada uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um anticorpo que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, em que a dita sequência de aminoácidos de cadeia leve compreende uma ou mais modificações de aminoácidos. São descritos acima exemplos de tais modificações.

Adicionalmente, são também proporcionados vetores compreendendo as moléculas de ácido nucleico isoladas codificando quaisquer dos anticorpos monoclonais descritos

acima e células hospedeiras compreendendo tais vetores. Métodos de Preparar Anticorpos para TFPI 0 anticorpo monoclonal pode ser produzido recombinantemente expressando uma sequência de nucleótidos codificando as regiões variáveis do anticorpo monoclonal de acordo com as formas de realização da invenção numa célula hospedeira. Com o auxilio de um vetor de expressão, um ácido nucleico contendo a sequência de nucleótidos pode ser transfetado e expresso numa célula hospedeira adequada para a produção. Consequentemente, é também proporcionado um método para produzir um anticorpo monoclonal que liga a TFPI humano compreendendo: (a) transfetar uma molécula de ácido nucleico codificando um anticorpo monoclonal da invenção numa célula hospedeira, (b) cultivar a célula hospedeira de modo a expressar o anticorpo monoclonal na célula hospedeira, e opcionalmente (c) isolar e purificar o anticorpo monoclonal produzido, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleótidos codificando um anticorpo monoclonal da presente invenção.

Num exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpos dos mesmos, são inseridos ADNs codificando cadeias leves e pesadas parciais ou de comprimento completo obtidas através de biologia molecular padrão em vetores de expressão tal que os genes estejam operativamente ligados a sequências de controlo transcricional e traducional. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" destina-se a significar que um gene de anticorpo é ligado a um vetor de tal modo que sequências de controlo traducional e transcricional dentro do vetor servem a sua função pretendida de regulação da tradução e transcrição do gene de anticorpo. 0 vetor de expressão e sequências de controlo de expressão são eleitos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. 0 gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos em vetores separados ou, mais tipicamente, ambos genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpos são inseridos no vetor de expressão através de meios padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento de gene de anticorpo e vetor,ou ligação de extremos rombos se não estiverem presentes sítios de restrição). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos descritos no presente documento podem ser utilizadas para criar genes de anticorpos de comprimento total de qualquer isotipo de anticorpo através da inserção dos mesmos em vetores de expressão que já codificam regiões constantes de cadeia pesada e de cadeia leve do isotipo desejado tal que o segmento VH esteja operativamente ligado com o(s) segmento (s) CH dentro do vetor e o segmento VK esteja operativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um péptido de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo a partir de uma célula hospedeira. 0 gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o péptido de sinal esteja ligado em estrutura com o terminal amino do gene de cadeia de anticorpo. 0 péptido de sinal pode ser um péptido de sinal de imunoglobulina ou um péptido de sinal heterólogo (isto é, um péptido de sinal a partir de uma proteína não imunoglobulina).

Para além dos genes codificantes da cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção portam sequências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo numa célula hospedeira. 0 termo "sequência reguladora" destina-se a incluir promotores, potenciadores e outros elementos de controlo da expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes de cadeia do anticorpo. Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Será apreciado pelos peritos na especialidade que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências reguladoras pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nivel de expressão de proteína desejado, etc. Exemplos de sequências reguladoras para expressão de células hospedeiras de mamíferos incluem elementos virais que direcionam níveis elevados de expressão proteica em células de mamífero, tais como promotores e/ou potenciadores derivados a partir de citomegalovírus (CMV), Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)) e polioma. Alternativamente, podem ser utilizadas sequências reguladoras não virais, tais como o promotor de ubiquitina ou promotor de β-globina.

Pra além dos genes de cadeia de anticorpo e sequências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem portar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras nas quais o vetor foi introduzido (veja-se, por exemplo, U.S. Pat. Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todos por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, numa célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem o gene da dihidrofolato redutase (DHFR) (para utilização em células hospedeiras dhfr com seleção/amplif icação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418) .

Para a expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor (es) de expressão codificando as cadeias pesadas e leves é(são) transfetado(s) numa célula hospedeira através de técnicas padrão. As várias formas do termo "transfeção" destinam-se a abranger uma ampla variedade de técnicas habitualmente utilizadas para a introdução de ADN exógeno numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfeção com DEAE-dextrano e semelhantes. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e mais preferentemente células hospedeiras de mamíferos, é a mais preferida dado que tais células eucarióticas, e em particular células de mamíferos, são mais propensas do que as células procarióticas a montar e secretar um anticorpo devidamente dobrado e imunologicamente ativo.

Exemplos de células hospedeiras de mamífero para expressar os anticorpos recombinantes incluem de Ovário de Hámster Chinês (células CHO) (incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216-4220, utilizadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS, células HKBll e células SP2. Quando são introduzidos vetores de expressão recombinantes codificando genes de anticorpo em células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos através de cultura das células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou a secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos de purificação de proteínas padrão, tais como ultrafiltração, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de permuta iónica e centrifugação.

Utilização de Sequência de Anticorpos Parciais para Expressar Anticorpos Intactos

Os anticorpos interatuam com antigénios alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis CDRs de cadeia pesada e leve. Por este motivo, as sequências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRs. Dado que as sequências CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antigénio, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos através da construção de vetores de expressão que incluem sequências CDR a partir do anticorpo de ocorrência natural específico enxertado em sequências estruturais a partir de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (veja-se, por exemplo, Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al.r 1986, Nature 321:522-525; e Queen, C. et al. , 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:10029-10033). Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de bases de dados de ADN públicas que incluem sequências génicas de anticorpos de linha germinal. Estas sequências de linha germinal irão diferir das sequências de genes de anticorpos maduros dado que não irão incluir genes variáveis completamente montados, que são formados por união V(D)J durante a maturação de células B. Não é necessário obter a sequência de ADN completa de um anticorpo particular de modo a recriar um anticorpo recombinante intacto tendo propriedades de ligação semelhantes às do anticorpo original (veja-se o documento WO 99/45962). A extensão parcial das sequências de cadeia pesada e leve das regiões CDR é tipicamente suficiente para este propósito. A sequência parcial é utilizada para determinar que segmentos génicos variáveis da linha germinal e de união contribuíram para os genes variáveis do anticorpo recombinado. A sequência da linha germinal é então utilizada para preencher porções ausentes das regiões variáveis. As sequências líder de cadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação proteica e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Por este motivo, é necessário utilizar a sequência líder da linha germinal correspondente para construções de expressão. Para adicionar sequências ausentes, podem ser combinadas sequências de ADNc clonado com oligonucleótidos sintéticos através de ligação ou amplificação de PCR. Alternativamente, a totalidade da região variável pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucléotidos curtos, sobrepostos, e combinada através de amplificação de PCR para criar um clone de região variável totalmente sintético. Este processo tem determinadas vantagens tais como sítios de eliminação ou inclusão ou restrição particulares, ou otimização de codões particulares.

As sequências de oligonucleótidos de transcritos de cadeia pesada e leve são utilizadas para desenhar um conjunto sobreposto de oligonucleótidos sintéticos para criar sequências V sintéticas com capacidades de codificação de aminoácidos idênticas às das sequências naturais. As sequências de cadeia pesada e leve sintéticas podem diferir das sequências naturais. Por exemplo: as cadeias de bases nucleotídicas repetidas são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleótidos e a amplificação por PCR; são incorporados sítios de iniciação da tradução ótimos de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870); e são manipulados sítios de restrição a montante ou a jusante dos sítios de iniciação da tradução.

Para as regiões variáveis tanto de cadeia pesada como leve, as sequências de cadeias codificantes, e correspondentes não codificantes, otimizadas são simplificadas em secções de 30-50 nucleótidos aproximadamente no ponto médio do correspondente oligonucleótido não codificante. Consequentemente, para cada cadeia, os oligonucleótidos podem ser montados em conjuntos de cadeia dupla sobrepostos que abrangem segmentos de 150-400 nucleótidos. Os agrupamentos são então utilizados como moldes para produzir produtos de amplificação de PCR de 150-400 nucleótidos. Tipicamente, um único conjunto de oligonucleótidos de região variável será simplificado em dois agrupamentos que são amplificados separadamente para gerar dois produtos de PCR sobrepostos. Estes produtos sobrepostos são então combinados através de amplificação por PCR para formar a região variável completa. Pode também ser desejável incluir um fragmento sobreposto da região constante de cadeia pesada ou leve na amplificação por PCR para gerar fragmentos que possam ser facilmente clonados nas construções de vetores de expressão.

As regiões variáveis de cadeia pesada e leve reconstruídas são então combinadas com sequências de promotor, iniciação da tradução, região constante, 3' não traduzidas, poliadenilação, e terminação da transcrição clonadas para formar construções de vetores de expressão. As construções de expressão de cadeia pesada e leve podem ser combinadas num único vetor, cotransfetadas, transfetadas em série, ou transfetadas separadamente em células hospedeiras que são então fundidas para formar uma célula hospedeira expressando ambas cadeias.

Consequentemente, noutro aspeto, as características estruturais de um anticorpo anti-TFPI humano são utilizadas para criar anticorpos anti-TFPI humanos estruturalmente relacionados que retêm a função de ligação a TFPI. Mais especif icamente, uma ou mais CDRs das regiões de cadeia pesada e leve especificamente identificadas dos anticorpos monoclonais da invenção podem ser combinadas recombinantemente com regiões estruturais humanas conhecidas e CDRs para criar anticorpos anti-TFPI humanos manipulados recombinantemente adicionais da invenção. Composições Farmacêuticas

Também são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo quantidades terapeuticamente eficazes de anticorpo monoclonal anti-TFPI e um portador farmaceuticamente aceitável. "Portador farmaceuticamente aceitável" é uma substância que pode ser adicionada ao ingrediente ativo para ajudar a formular ou estabilizar a preparação e não causa efeitos toxicológicos adversos significativos ao paciente. Exemplos de tais portadores são bem conhecidos para os peritos na especialidade e incluem água, açúcares tais como maltose ou sacarose, albumina, sais tais como cloreto de sódio, etc. São descritos outros portadores por exemplo em Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin. Tais composições irão conter uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo monoclonal anti-TFPI.

Portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é conhecida na técnica. A composição é preferentemente formulada para injeção parentérica. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para uma concentração elevada de fármaco. 0 portador pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol liquido, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos. Nalguns casos, irá incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição.

Podem ser preparadas soluções injetáveis estéreis incorporando o composto ativo na quantidade requerida num solvente adequado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por microfiltração de esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo num veiculo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, alguns métodos de preparação preferidos são técnicas de secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução anteriormente esterilizada por filtração do mesmo.

Utilizações Farmacêuticas 0 anticorpo monoclonal pode ser utilizado para fins terapêuticos para tratar deficiências ou defeitos de coagulação genéticos e adquiridos. Por exemplo, os anticorpos monoclonais nas formas de realização descritas acima podem ser utilizados para bloquear a interação de TFPI com FXa, ou para prevenir a inibição dependente de TFPI da atividade de TF/FVIIa. Adicionalmente, o anticorpo monoclonal pode também ser utilizado para restaurar a geração acionada por TF/FVIIa de FXa para contornar a insuficiência da amplificação de FXa dependente de FVIII ou FIX.

Os anticorpos monoclonais têm utilização terapêutica no tratamento de distúrbios de hemostasia tais como trombocitopenia, distúrbios das plaquetas e distúrbios de hemorragia (por exemplo, hemofilia A, hemofilia B e hemofilia C). Tais distúrbios podem ser tratados administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal anti-TFPI a um paciente com necessidade do mesmo. Os anticorpos monoclonais também têm utilização terapêutica no tratamento de hemorragias descontrolados em indicações tais como trauma e acidente vascular cerebral hemorrágico. Consequentemente, é também proporcionado um método para reduzir o tempo de hemorragia compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo monoclonal anti-TFPI da invenção a um paciente com necessidade do mesmo.

Os anticorpos podem ser utilizados como monoterapêutica ou em combinação com outras terapêuticas para abordar um distúrbio hemostático. Por exemplo, a coadministração de um ou mais anticorpos da invenção com um fator de coagulação tal como fator Vila, fator VIII ou fator IX é acreditada como sendo útil para tratar a hemofilia. Numa forma de realização, é proporcionado um método para tratar deficiência ou defeitos de coagulação genéticos e adquiridos compreendendo administrar (a) uma primeira quantidade de um anticorpo monoclonal que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano e (b) uma segunda quantidade de fator VIII ou fator IX, em que as ditas primeira e segunda quantidades em conjunto são eficazes para tratar as ditas deficiências ou defeitos. Noutra forma de realização, é proporcionado um método para tratar deficiência ou defeitos de coagulação genéticos e adquiridos compreendendo administrar (a) uma primeira quantidade de um anticorpo monoclonal que liga ao inibidor da via do fator tecidual humano e (b) uma segunda quantidade de fator VIII ou fator IX, em que as ditas primeira e segunda quantidades em conjunto são eficazes para tratar as ditas deficiências ou defeitos, e adicionalmente em que não é coadministrado fator VII. A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da combinação de um anticorpo monoclonal da invenção e fator VIII ou fator IX, em que a composição não contém fator VII. "Fator VII" inclui fator VII e fator Vila. É provável que estas terapêuticas de combinação reduzam a frequência de infusão necessária do fator de coagulação. Coadministração ou terapêutica de combinação significa administração dos dois fármacos terapêuticos formulados cada um separadamente ou formulados em conjunto numa composição, e, quando formulados separadamente, administrados ou aproximadamente ao mesmo tempo ou em momentos diferentes, mas durante o mesmo período terapêutico.

Nalgumas formas de realização, podem ser utilizados um ou mais anticorpos descritos no presente documento em combinação para abordar um distúrbio hemostático. Por exemplo, a coadministração de dois ou mais dos anticorpos descritos no presente documento é acreditada como sendo útil para tratar a hemofilia ou outro distúrbio hemostático.

As composições farmacêuticas podem ser administradas por via parentérica a indivíduos sofrendo de hemofilia A ou B a uma dosagem e frequência que podem variar com a gravidade do episódio de hemorragia ou, no caso de terapêutica profilática, podem variar com a gravidade da deficiência de coagulação do paciente.

As composições podem ser administradas a pacientes com necessidade como um bólus ou através de infusão contínua. Por exemplo, uma administração em bólus de um anticorpo da invenção presente como um fragmento Fab pode ocorrer numa quantidade de desde 0,0025 até 100 mg/kg de peso corporal, 0,025 a 0,25 mg/kg, 0,010 a 0,10 mg/kg ou 0,10-0,50 mg/kg. Para infusão contínua, pode ser administrado um anticorpo da invenção presente como um fragmento Fab a 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal/minuto, 0,0125 a 1,25 mg/kg/min., 0,010 a 0,75 mg/kg/min., 0,010 a 1,0 mg/kg/min. ou 0,10-0,50 mg/kg/min. durante um período de 1-24 horas, 1-12 horas, 2-12 horas, 6-12 horas, 2-8 horas, ou 1-2 horas.

Para a administração de um anticorpo da invenção presente como um anticorpo de comprimento completo (com regiões constantes completas), as quantidades de dosagem podem ser cerca de 1-10 mg/kg de peso corporal, 2-8 mg/kg, ou 5-6 mg/kg. Tais anticorpos de comprimento completo seriam tipicamente administrados através de infusão estendendo-se durante um período de trinta minutos até três horas. A frequência da administração dependeria da gravidade da condição. A frequência poderia variar desde três vezes por semana até uma vez cada duas semanas até seis meses.

Adicionalmente, as composições podem ser administradas a pacientes por meio de injeção subcutânea. Por exemplo, pode ser administrada uma dose de 10 a 100 mg de anticorpo anti-TFPI a pacientes por meio de injeção subcutânea semanalmente, duas vezes por semana ou mensalmente.

Conforme utilizado no presente documento, "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de um anticorpo monoclonal anti-TFPI ou de uma combinação de tal anticorpo e fator VIII ou fator IX que é necessária para aumentar de forma eficaz o tempo de coagulação in vivo ou de outra forma causar um benefício mensurável in vivo a um paciente com necessidade. A quantidade precisa irá depender de vários fatores, incluindo, -mas não limitados aos componentes e características físicas da composição terapêutica, população de pacientes pretendida, considerações do paciente individual, e semelhantes, e pode prontamente ser determinada por um perito na especialidade. Exemplos

Exemplo 1. Clonagem, expressão e quantificação de níveis de expressão de anticorpos

As cadeias pesada e leve dos Fabs 2A8 e 4B7 de tipo selvagem transportando uma etiqueta c-myc e uma etiqueta de hexa-histidina no terminal C da cadeia pesada foram subclonadas no vetor de expressão bacteriana pET28a (Novagen/Merck Chemicals Ltd., Nottingham, R.U.) e transformadas em células ToplOF' (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha). Alternativamente, podem ser utilizados outros vetores de expressão bacteriana (por exemplo, o sistema de vetor pQE, Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e estirpes (por exemplo DH5a, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha). Foram geradas variantes através de mutagénese dirigida com base oligo e confirmadas através de seguenciação de ADN. Em particular, foram modificados resíduos de aminoácidos dentro ou à volta de regiões de determinação de complementaridade dentro da cadeia pesada e/ou leve.

Para ser possível utilizar anticorpos de tipo selvagem ou mutantes como competidores, etiguetas de epítopos localizadas no terminal C da cadeia pesada foram removidas ou substituídas utilizando técnicas à base de PCR padrão. Em particular, para 4B7 a etigueta c-myc foi permutada por uma etigueta de epítopo de hemaglutinina (HA) para todas as variantes analisadas. Em contraste, 4B7 de tipo selvagem ou variantes utilizados como competidores transportaram uma etiqueta c-myc. No caso de 2A8, a etiqueta de epítopo c-myc foi ou substituída por uma etiqueta de HA ou eliminada, resultando numa variante que somente exibiu uma etiqueta de epítopo de Histidina 6x no seu terminal C.

Para a expressão, foram transformadas variantes na estirpe BL21starDE3 de Escherichia coli (Invitrogen, C6010-03) , inoculadas numa cultura durante a noite em meio LB contendo canamicina (30 yg/ml) e incubadas a 37 °C durante 18 horas. Foram geradas culturas de expressão através de inoculação da cultura durante a noite 1:20 em meio LB fresco com canamicina (30 yg/ml). Após 6 horas, foi adicionado isopropil-b-D-l-tiogalactopiranósido 1 mM (Roth, 2316.5) para induzir a expressão dos anticorpos e as culturas foram incubadas durante 18 horas adicionais a 30 °C. Alternativamente, foram inoculadas culturas durante a noite 1:20 no meio de auto-indução Overnight Express TB (Merck, 71491) e incubadas a 30 °C durante 24 horas.

Para a quantificação dos níveis de expressão foi utilizada uma abordagem ELISA. Brevemente, foram incubadas placas MTP (Nunc maxisorp preto, 460518) com um anticorpo específico para Fab (Sigma, 15260) diluído em tampão de revestimento (Candor Bioscience GmbH, 121500) a 4 °C durante a noite, lavadas com PBST (solução salina tamponada com fosfato: NaCl a 137 mM, Merck 1.06404.5000; KC1 a 2,7 mM, Merck 1.04936.1000; Na2HP04 a 10 mM, Merck 1.06586.2500, KH2P04 a 1,8 mM, Merck 1.04871.5000; contendo Tween 20 Acros Organics a 0,05%, 233360010), bloqueadas com leite a 2% em PBST durante lh à temperatura ambiente e lavadas novamente. As culturas foram diluídas em leite magro a 0,25% (Fluka analytical, 70166) em PBS e ligadas às placas MTP durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem com PBST, os anticorpos capturados foram incubados com um anticorpo anti-Fab acoplado a HRP (Sigma, A0293) e detetados incubando a placa com substrato vermelho amplex a 10μΜ (Invitrogen, A12222) durante 10 a 30 minutos à temperatura ambiente no escuro seguido por medição de fluorescência. Os níveis de expressão foram normalizados após determinar a concentração relativa ao anticorpo purificado de tipo selvagem (2A8 ou 4B7).

Exemplo 2. Determinação da atividade e reatividade cruzada Interespécle das variantes de anticorpo geradas

Para determinar a atividade das variantes de anticorpo mutadas sobre TFPI humano ou de ratinho (American

Diagnostica, 4900B e R&D Systems, 2975-P1, respetivamente) foi utilizado um formato de ensaio ELISA de equilíbrio ou competitivo. Brevemente, foram revestidas placas MTP (ou Mesoscale Discovery, L21XA-4 ou Nunc maxisorp preto, 460518) com TFPI humano ou de ratinho a 0,04-2 yg/ml diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou em tampão de revestimento (Candor Bioscience GmbH, 121500), respetivamente e incubadas durante a noite a 4 °C. Após a lavagem, as placas foram bloqueadas com albumina sérica bovina a 3% (Sigma, A4503) em PBST durante 1 hora à temperatura ambiente e a etapa de lavagem foi repetida. Para a ligação dos anticorpos foram adicionados 10-25 μΐ de sobrenadantes de cultura normalizados ao seu nível de expressão respetivo (se não indicado de outra forma) às placas durante 1 hora à TA seguido por lavagem com PBST. Foram então detetados tipo selvagem e variantes ligados por um anticorpo específico de etiqueta de epítopo ou foi incluída uma etapa de competição. Para a competição, foi adicionado competidor ou antigénio livre a 50-300 nM e incubado durante 20 minutos a 24 horas à temperatura ambiente. Após a lavagem, as restantes variantes foram detetadas com um anticorpo específico de etiqueta de epítopo quer acoplado a peroxidase de rábano (Biomol, anti-c-myc A190-105P para variantes de 2A8 e anti-HA A190-108P para variantes de 4B7) quer através de um anticorpo anti-myc (Sigma, C3956) ou anti-HA (Sigma, H6908) que foi previamente etiquetado com um reagente sulfo-NHS de acordo com as instruções do fabricante para deteção eletroquimioluminescente (Mesoscale Discovery, R91AN-1). Para a deteção de sinal em placas maxisorp foi adicionado substrato vermelho amplex a 10μΜ (Invitrogen, A12222) e incubado durante 10 a 30 minutos à temperatura ambiente no escuro seguido por medição da fluorescência. Para a deteção em placas MSD foi diluído tampão de leitura MSD T até 2x em H2O (Mesoscale Discovery, R92TC-1), adicionado às placas e o sinal de eletroquimioluminescência foi detetado a 620 nm utilizando o Discovery Sector Imager 6000.

Exemplo 3. Substituições de aminoácidos únicos e múltiplos São proporcionados no Quadro 1 vários exemplos de substituições de aminoácido único introduzidas na cadeia pesada ou leve de 2A8. O nível de expressão das variantes foi analisado em quádruplos no ELISA de quantificação. Após normalização ao respetivo nível de expressão, foi analisado o desempenho em quádruplos no ELISA competitivo em TFPI humano e de ratinho e foram determinadas as razões de variante para tipo selvagem (wt). Os erros foram calculados através de propagação de erro a partir dos desvios padrão.

Quadro 1. Analise de substituições de aminoácido único _dentro de 2A8.

São proporcionados no Quadro 2 alguns exemplos de substituições de aminoácidos combinadas dentro de anticorpos de TFPI de 2A8. Embora não seja proporcionada cada combinação no Quadro 2, é contemplado que o anticorpo de TFPI possa compreender qualquer combinação de modificações proporcionadas. 0 nivel de expressão das variantes foi analisado em quádruplos no ELISA de quantificação. Se não indicado de outra forma, as variantes foram normalizadas ao respetivo nivel de expressão e o desempenho foi analisado em quádruplos no ELISA competitivo em TFPI humano e de ratinho seguido por cálculo das razões de variante para referência (HC_K99L). Os valores são marcados com "n.°" no caso de o desempenho da variante ser analisado sem anterior normalização e as razões de variante para referência serem normalizadas até ao nivel de expressão dividindo o sinal do ensaio pelo nivel de expressão. Nos casos onde foi utilizada uma referência diferente no ELISA competitivo e as variantes foram analisadas sem anterior normalização, os valores são marcados com "*". Para estas variantes, o valor listado no quadro foi calculado multiplicando as razões variante/referência alternativa com referência alternativa/HC_K99L. Os erros foram calculados através de propagação de erro a partir dos desvios padrão.

Quadro 2. Exemplo de substituições de vários aminoácidos dentro de 2A8.

São proporcionados no Quadro 3 vários exemplos de substituições de aminoácido único e/ou duplo introduzidas na cadeia pesada e/ou leve de 4B7. 0 nivel de expressão das variantes foi analisado em quádruplos no ELISA de quantificação. Após normalização ao respetivo nivel de expressão, foi analisado o desempenho em quádruplos no ELISA competitivo em TFPI humano e no ELISA de equilíbrio em TFPI de ratinho seguido por determinação das razões de variante para tipo selvagem. Os erros foram calculados através de propagação de erro a partir dos desvios padrão. Quadro 3. Análise de substituições de aminoácido único e duplo dentro de 4B7.

São proporcionados no Quadro 4 alguns exemplos de combinações de substituições de aminoácidos dentro dos anticorpos de TFPI de 4B7. Embora não seja proporcionada cada combinação no Quadro 4, é contemplado que o anticorpo de TFPI possa compreender qualquer combinação de modificações proporcionadas. 0 nível de expressão das variantes foi analisado em quádruplos no ELISA de quantificação. Se não indicado de outra forma, as variantes foram normalizadas ao respetivo nivel de expressão e o desempenho foi analisado em quádruplos no ELISA competitivo em TFPI humano e de ratinho seguido por cálculo das razões de variante para referência (HC_D62R) . Em casos onde foi utilizada uma referência diferente e as variantes foram analisadas sem normalização anterior, os valores são marcados com Para estas variantes, o valor listado no quadro foi calculado multiplicando as razões variante/referência alternativa com referência alternativa/HC_D62R. Os erros foram calculados através de propagação de erros a partir dos desvios padrão, nb: não foi detetada ligação sob as condições de ensaio utilizadas.

Quadro 4. Exemplo de substituições de vários aminoácidos dentro de 4B7.

Exemplo 4. Purificação de anticorpos

Foram colhidas células através de centrifugação a 9000 rpm durante 30 min a 4 °C e armazenadas a -20 °C. 0 sobrenadante foi submetido a permuta de tampão com tampão A (NaH2P04 a 50 mM, NaCl a 300 mM, imidazol a 10 mM ρΗδ,Ο), concentrado e purificado utilizando um procedimento de purificação de duas etapas. Brevemente, foram carregados 100 ml de sobrenadante concentrado numa coluna de superfluxo Ni-NTA de 5 ml (Qiagen, 1018142) lavados primeiro com 5x volumes de coluna de tampão A seguido por5x volumes de coluna de tampão B 4,3% (NaH2P04 a 50 mM, NaCl a 300 mM, imidazol a 250 mM pH8,0) e eluidos com 7 volumes de tampão B. As frações são combinadas e dialisadas em PBS. Numa segunda etapa de purificação os anticorpos purificados com Ni-NTA foram incubados com uma matriz de afinidade especifica de cadeia, isto é, captura de lambda ou capa selectos (BAC 0849.010 e BAC 0833.10, respetivamente) para 2A8 e 4B7, respetivamente. Após incubação a 4 °C durante a noite a matriz foi carregada numa coluna, lavada com 5 volumes de PBS, 5 volumes de arginina a 500 mM, NaP^PCN a 100 mM, NaCl a 100 mM pH6, 0 e novamente 5 volumes de PBS. Os anticorpos foram eluidos com 6 volumes de glicina a 100 mM pH3,0 seguido por 3 volumes de glicina a 100 mM pH2,0 em 1/10 do volume total de HEPES 1M pH 7,5 para neutralizados os eluatos. Finalmente, os eluatos foram dialisados em PBS durante a noite a 4 °C. Os anticorpos purificados foram analisados através de SDS-PAGE e espetrometria de massa. Exemplo 5. Medição da afinidade de ligação dos anticorpos a TFPI utilizando ressonância de plasmão de superfície (Biacore) TFPI quer humano quer de ratinho, foi imobilizado na superfície para análise. Foram utilizados os chips CM5 e o kit de acoplamento de amina (GE Healthcare) para a imobilização do ligando de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de TFPI imobilizado foi aproximadamente 70 RU para adaptar à massa de anticorpo que poderia gerar RMax de 100 RU. Os anticorpos anti-TFPI parentais e maturados por afinidade estavam na fase móvel. A determinação de afinidade foi realizada com pelo menos cinco concentrações diferentes (0,1, 0,4, 1,6, 6,4 e 25 nM) dos anticorpos purificados.

Ao analisar as variantes de anticorpos que contêm mutações únicas nas regiões CDR, foram identificados vários clones que tinham um sinal mais elevado no ensaio de ligação de ELISA. Os clones selecionados foram purificados e a sua afinidade a TFPI humano ou de ratinho foi analisada utilizando Biacore. Conforme mostrado no Quadro 5 e Quadro 6, estes clones têm afinidade mais elevada a TFPI do que os anticorpos parentais 2A8 ou 4B7. Embora alguns dos mutantes 2A8 tenham taxa de associação (ka) mais lenta do que o anticorpo parental 2A8, todos estes mutantes têm taxa de dissociação mais lenta (kd) do que 2A8. No geral, estas mutações únicas aumentam a afinidade de 2A8 no intervalo de 1,47 vezes a 7,22 vezes em TFPI humano, e 1,71 vezes a 7,20 vezes em TFPI de ratinho. Quando foram analisadas as variantes 4B7, a mutação D62R no domínio CDR2 de cadeia pesada aumentou significativamente o sinal. Este clone foi eleito para medição da afinidade. Conforme mostrado no Quadro 5 e Quadro 6, esta mutação única aumenta a afinidade de 4B7 a TFPI humano de 11,1 nM a 58,2 pM, uma melhoria de 191 vezes. A taxa de dissociação lenta (kd) de 4B7HcD62R contribui principalmente para a melhoria da sua afinidade, de 8,40xl0~3 /s de 4B7 a l,65xl0~4 de 4B7HcD62R, melhoria de aproximadamente 50 vezes. De forma semelhante, esta mutação aumenta a afinidade de 4B7 a TFPI de ratinho de 58,6 nM a 427 pM, uma melhoria de 137 vezes.

Quadro 5. Afinidade das variantes de 2A8 ou 4B7 selecionadas (mutação única) sobre TFPI humano

Quadro 6. Afinidade das variantes de 2A8 ou 4B7 _selecionadas (mutação única) sobre TFPI de ratinho_

A seguir, foi investigada a afinidade de ligação de mutações múltiplas dentro de 2A8 e 4B7. Conforme mostrado no Quadro 7(a) e Quadro 8(a), os mutantes de 2A8 que contêm mutações múltiplas em domínios CDR têm afinidade mais elevada do que 2A8 com mutações únicas na ligação tanto de TFPI humano como de ratinho. Por exemplo, 2A8-200 tem afinidade 53,7 vezes mais elevada do que 2A8 na ligação a TFPI humano, e 55,4 vezes mais elevada na ligação a TFPI de ratinho. Conforme mostrado no Quadro 7(b) e Quadro 8(b), os mutantes de 4B7 que contêm mutações múltiplas em domínios CDR têm afinidade mais elevada do que 4B7 com mutações únicas na ligação tanto de TFPI humano como de ratinho. Estas variantes a partir das sequências de 2A8 e 4B7 parentais proporcionadas nos Quadros 7 e 8 foram também proporcionadas na lista de sequências. As SEQ ID NOs: 5-11 correspondem às variantes de cadeia pesada de 2A8 listadas no Quadro 7 e 8. As SEQ ID NOs: 12-18 correspondem às variantes de cadeia leve de 2A8. As SEQ ID NOs: 19-26 correspondem às variantes de cadeia pesada de 4B7 listadas no Quadro 7 e 8. As SEQ ID NOs: 27-34 correspondem às variantes de cadeia leve de 4B7.

Quadro 7(a). Afinidade de variantes de 2A8 selecionadas (mutações múltiplas) sobre TFPI humano_

Quadro 7(b). Afinidade de variantes de 4B7 selecionadas (mutações múltiplas) sobre TFPI humano

Quadro 8(a). Afinidade de variantes de 2A8 selecionadas (mutações múltiplas) sobre TFPI de ratinho

Quadro 8(b). Afinidade de variantes de 4B7 selecionadas (mutações múltiplas) sobre TFPI de ratinho

Exemplo 6. Os anticorpos com afinidade melhorada mostraram maior potência ao restaurar a atividade de FXa

Para determinar se os anticorpos anti-TFPI com afinidade melhorada melhoraram também a sua potência ao restaurar a atividade de FXa bloqueando o efeito inibitório da proteína TFPI, foi realizado um ensaio de restauração de FXa. Neste ensaio, foi incubada uma quantidade variável dos anticorpos melhorados por afinidade individuais (30 μΐ) com a quantidade fixa de TFPI humano, de ratinho ou de rato recombinante (20 μΐ, 6, 6 nM) numa mistura de reação total de 50 μΐ durante 30 min à temperatura ambiente. Após a incubação, foram adicionados 50 μΐ de FXa (3,39 nM) à mistura de reação e incubados a 37 °C durante 30 min. Posteriormente, Foram adicionados 20 μΐ de substrato Spectrozyme FXa à mistura de reação. Após incubação de 12 min, a absorvância de cada poço foi lida a 405 nm utilizando um leitor de placas (Molecular Device). Para cada experiência, foi obtida uma curva padrão linear da mesma quantidade de FXa (3,39 nM) inibida por quantidades conhecidas de TFPI. A atividade de FXa restaurada a 100% foi definida como a atividade de FXa sem adicionar qualquer quantidade de TFPI e 0% de atividade foi definida como a atividade de FXa na presença de proteína TFPI (6,6 nM). Foi consequentemente calculada a metade da concentração inibitória máxima (Cl50)para cada anticorpo anti-TDPI individual, algumas das quais são proporcionadas no Quadro 9. A metade da concentração eficaz máxima (CI50) foi também calculada para variantes de segunda ronda de 2A8 selecionadas e proporcionada no Quadro 10.

Quadro 9. CI50 e melhoria da potência para anticorpos anti-TFPI selecionados com substituições de aminoácidos únicos utilizando um ensaio de restauração de FXa conforme comparado com os seus anticorpos parentais, 2A8 e 4B7, _respetivamente._

Quadro 10. CEtO e magnitude de melhoria para os anticorpos anti-TFPI selecionados tendo substituições de múltiplos aminoáeidos conforme comparado com 2Ά8 parental.

Exemplo 7. Os anticorpos com afinidade melhorada mostraram mals potência na redução do tempo de coagulação num ensaio dPT

Para confirmar se estes anticorpos com afinidade melhorada também melhoraram a potência na redução do tempo de coagulação, é realizado um dPT determinando o efeito dos anticorpos anti-TFPI selecionados sobre o tempo de coagulação utilizando plasma de hemofilia A humano. 0 ensaio dPT é realizado essencialmente conforme descrito em Welsch et al. (Thrombosis Res., 1991, 64(2): 213-222). Brevemente, é preparado plasma de hemofilia A humano (George King Biomedical) misturando plasma com 0,1 volumes de tampão de controlo (como um controlo negativo) ou anticorpos anti-TFPI indicados. Após incubação durante 30 minutos a 25 °C, cada uma das amostras de plasma preparadas (100 μΐ) é combinada com 100 μΐ de Simplastin (Biometieux) adequadamente diluído (diluição 1:500) como uma fonte de tromboplastina e 100 μΐ de cloreto de cálcio a 25 mM. O tempo de coagulação é determinado utilizando um fibrómetro STA4 (Stago) imediatamente após adicionar cloreto de cálcio.

Exemplo 8. Os anticorpos com afinidade melhorada mostraram mais potência na redução do tempo de coagulação de sangue inteiro utilizando sangue com hemofilia A humano induzido por anticorpos anti-fator VIII

Para confirmar se os anticorpos com afinidade melhorada mostram mais potência na redução do tempo de coagulação, foi utilizado um sistema ROTEM para testar o efeito destes anticorpos sobre o tempo de coagulação em sangue com hemofilia A humano induzido por anticorpos neutralizadores de FVIII, que imita o sangue de pacientes com hemofilia A com inibidores. O sistema ROTEM (Pentapharm GmbH) inclui um instrumento de quatro canais, um computador, padrões de plasma, ativadores e recipientes e pinos descartáveis. Os parâmetros trombelastográficos dos sistemas de homeostasia ROTEM incluem: Tempo de Coagulação (CT), que reflete o tempo de reação (o tempo requerido para obter 2 mm de amplitude após a iniciação da recolha de dados) para iniciar a coagulação sanguínea; Tempo de Formação de Coágulos (CFT) e o ângulo alfa para refletir a propagação da coagulação, e a amplitude máxima e o módulo elástico máximo para refletir a firmeza dos coágulos. Num ensaio ROTEM, foram utilizados 300 μΐ de sangue inteiro citrado recém-extraído, no qual a atividade de FVIII foi neutralizada através da adição de anticorpos policlonais contra FVIII, para testar o efeito de anticorpos anti-TFPI melhorados por afinidade conforme comparado com os anticorpos anti-TFPI parentais. Todos os constituintes foram reconstituídos e misturados de acordo com as instruções do fabricante, com recolha de dados para o período de tempo requerido para cada sistema. Brevemente, as amostras foram misturadas extraindo/distribuindo 300 μΐ de sangue/plasma com uma pipeta automatizada em recipientes ROTEM com 20 μΐ de CaCl2 (200 mmol) adicionados, seguidos imediatamente por mistura da amostra e iniciação da recolha de dados. Os dados foram recolhidos durante 2 horas utilizando um sistema ROTEM controlado por computador (software versão 2.96). É mostrado um resultado exemplar de ensaio ROTEM na deteção do efeito de anticorpos anti-TFPI melhorados por afinidade na redução do tempo de coagulação sanguínea na Fig. 2 e 3. Δ Fig. 2 mostra o efeito de anticorpos anti-TFPI maturados por afinidade de primeira ronda selecionados sobre o tempo de coagulação de sangue com hemofilia induzida por anticorpos humano. Os anticorpos com afinidade melhorada significativamente, 2A8-9 e 2A8-17 mostram muita mais potência na redução do tempo de coagulação em sangue com hemofilia A induzida por anticorpos, enquanto 2A8-10, cuja afinidade de ligação a TFPI não foi melhorada, permaneceram com uma potência de coagulação semelhante, conforme comparado com o anticorpo 2A8 parental.

Exemplo 9. Os anticorpos com afinidade melhorada mostram melhor taxa de sobrevivência num modelo de transecção da veia caudal de ratinhos com hemofilia A

Para determinar se os anticorpos melhorados por afinidade são mais potentes num efeito protetor em ratinhos com hemorragia, foi utilizado um modelo de transecção da veia caudal de ratinhos com hemofilia A. Os ratinhos foram doseados por meio de infusão da veia caudal com uma quantidade variável indicada do anticorpo anti-TFPI 2A8 ou a quantidade variável indicada de A200, 24 h antes da lesão. 24 horas após a dosagem, a veia esquerda da cauda a 2,7 mm a partir da base (em diâmetro) foi cortada transversalmente. A sobrevivência foi observada durante as 24 horas após a transecção. A taxa de sobrevivência foi demonstrada como sendo dependente da dose quando administrada com FVIII recombinante (10 Ul/kg a 30 Ul/kg). A Figura 4 mostra que um anticorpo A200 com afinidade melhorada prolongou significativamente a sobrevivência de ratinhos com hemofilia A de uma forma dependente da dose conforme comparado com IgGl de ratinhos de controlo (CTX IgGl) , e exibiu uma melhor taxa de sobrevivência do que o anticorpo parental 2A8 a cada uma das doses equivalentes. Exemplo 10. Os anticorpos com afinidade melhorada mostraram coagulação potenclada utilizando plasma de hemofilia C (deficiente em FXI) humano

Adicionalmente, foi utilizado um ensaio ROTEM para testar a eficácia dos anticorpos sobre o tempo de coagulação em plasma deficiente em Fator XI (deficiente em FXI) humano, que inita os pacientes com hemofilia C. O resultado deste ensaio ROTEM na deteção do efeito de anticorpos anti-TFPI com afinidade melhorada na redução do tempo de coagulação do plasma é mostrado na Figura 5. A Figura 5 mostra que uma variante de 2A8, 2A8-200, potenciou a coagulação em plasma de hemofilia C humano de uma forma dependente da dose e os seus efeitos são comparáveis aos de FVIIa recombinante.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> Bayer Healthcare LLC <120> Anticorpos Monoclonais Otimizados contra Inibidor da Via do Fator Tecidual (TFPI)

<130> BHC 10 5 001 PCT <160> 34 <170> Patentln versão 3.5

<210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser lie Arg Gly Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Xle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Lys Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser 115

<210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Vai Vai lie Tyr 35 40 45

Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Asp Asp Gly Vai Pro Vai 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin 100 105

<210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asn 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Ser Trp lie Arg Gin Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 val Ser vai Lys Ser Arg ile Thr ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 4 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai Phe Ser 20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 85 90 95

Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 5

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Asp Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Arg Gly Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 €0

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 6 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 6

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Asp Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser lie Arg Gly Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Léu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 35

Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 7

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Asp Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser lie Arg Gly Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 8

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Vai Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Asp Arg Gly Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Het Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Vai Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 9

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Asp Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Ile Arg Gly Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 10

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met Asp Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser lie Arg Gly Ser Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 lio

Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 11 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante <400> 11

Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Vai Tyr 20 25 30

Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Ser Asp Arg Gly Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Vai Tyr Arg Tyr Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Vai Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante <400> 12

Asp II* Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Vai Vai Ile Phe 35 40 45

Tyr Asp Vai Asn Arg Pro Ser Asp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Asp Asp Gly Vai Pro Trp 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin 100 105 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 13

Asp lie Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Vai Vai Ile Phe 35 40 45

Tyr Asp Vai Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Leu Asp Gly Vai Pro Trp 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin 100 105 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 14

Asp Ile Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Vai Vai Ile Phe 35 40 45

Tyr Asp Vai Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Trp Asp Gly Vai Pro Vai 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin 100 105 <210> 15 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante <400> 15

Asp Ile Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg He Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Vai Vai Ile Phe 35 40 45

Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Leu Asp Gly Vai Pro Trp 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin 100 105 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante <400> 16

Asp He Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Vai Vai Ile Phe 35 40 45

Tyr Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Leu Asp Gly Vai Pro Trp 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin 100 105 <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 17

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Vai Vai Ile Phe 35 40 45

Tyr Asp Vai Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Trp Ser Ser Thr Pro Vai 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin 100 105 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 18

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Arg lie Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Vai Vai Ile Phe 35 40 45

Tyr Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr ile Ser Gly Thr Gin Ala Mèt 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Trp Leu Ser Gly Thr Pro Trp 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly Gin 100 105 <210> 19 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 19

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asp 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Ser Trp ile Arg Gin Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Gin Tyr Ala 50 55 60

Vai Ser Vai Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante <400> 20

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asp 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala 50 55 60

Vai Ser Vai Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 21

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asp 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala 50 55 60

Vai Ser Vai Lys Ser Arg Ile Thr lie Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 22

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asn 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala 50 55 60

Vai Ser Vai Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp 100 105 lio

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 23

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asp 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala 50 55 60

Vai Ser Vai Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante <400> 24

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asp 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Lys Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala 50 55 60

Vai Ser Vai Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante <400> 25

Glu Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala ile Ser Gly Asp Ser vai Ser Ser Asp 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Ser Trp lie Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala 50 55 60

Vai Ser Vai Lys Ser Arg Ile Thr lie Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante <400> 26

Gin Vai Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala lie Ser Gly Asp Ser Vai Ser Ser Asp 20 25 30

Ser Ala Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Arg Tyr Ala 50 55 60

Vai Ser Vai Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Leu Gin Leu Asn Ser Vai Thr Pro Glu Asp Thr Ala Vai 85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Ser Asp Lys His Trp Gly Phe Asp Asp 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 27

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai Ile Ser 20 25 30

Phe Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 85 90 95

Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr <210> 28 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 28

Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Xle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Phe Arg 20 25 30

Phe Gly lie Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 85 90 95

Thr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr <210> 29 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 29

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai Phe Ser 20 25 30

Asp Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 85 90 95

Thr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr <210> 30 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 30

Asp Ile vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai Phe Ser 20 25 30

Phe Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 85 90 95

Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys 100 105 110

Arg Thr <210> 31 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 31

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai Phe Arg 20 25 30

Phe Gly lie Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 85 90 95

Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr <210> 32 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Variante <400> 32

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai Phe Arg 20 25 30

Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 85 90 95

Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr <210> 33 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 33

Asp Xle Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Vai Phe Arg 20 25 30

Asp Gly lie Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 85 90 95

Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr <210> 34 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Variante <400> 34

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val Phe Arg 20 25 30

Asp Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 85 90 95

Asp Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Thr

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2010017196 A [0030] • US 2009052702 W [0032] • US 4399216 A [0082] • US 4634665 A [0082] • US 5179017 A, Axel [0082] • WO 9945962 A [0085]

Documentos de não patente citados na descrição • Thromb. Haemost., 1991, vol. 66 (4), 464-467 [0007] • Blood Coagulation and Fíbrinolysis, 1995, vol. 6, 388-394 [0007] • YANG et al. Chin. Med. J. , 1998, vol. 111 (8), 718-721 [0008] • YANG et al. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997, vol. 22 (4), 297-300 [0008] • BREKKE; SANDLIE. Therapeutic Antibodies for Human

Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century. Nature, January 2003, vol. 2 (53), 52-62 [0010] • KOEHLER; MILSTEIN. Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity. Nature, 1975, vol. 256, 495-497 [0011] • WARD et al. Nature, 1989, vol. 341,544-546 [0017] • ILL et al. Protein Eng, 1997, vol. 10, 949-57 [0017] • BIRD et al. Science, 1988, vol. 242, 423-426 [0017] • HUSTON et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1988, vol. 85, 5879-5883 [0017] • THOMPSON et al. Nucleic Acids Research, 1994, vol. 2 (22), 4673-4680 [0028] • HIGGINS et al. Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 1992, vol. 8 (2), 189-191 [0028] • URLAUB; CHASIN. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1980, vol. 77, 4216-4220 [0084] • R. J. KAUFMAN; P. A. SHARP. Mol. Biol. , 1982, vol. 159, 601-621 [0084] • RIECHMANN, L. et al. Nature, 1998, vol. 332, 323-327 [0085] • JONES, P. et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0085] • QUEEN, C. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1989, vol. 86, 10029-10033 [0085] • KOZAK. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 19867-19870 [0086] • WELSCH et al. Thrombosis Res., 1991, vol. 64 (2), 213-222 [0115]

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um anticorpo IgG monoclonal humano que se liga especificamente ao inibidor da via do fator tecidual humano, em que o anticorpo compreende: a) uma cadeia pesada humana compreendendo: i. uma região CDRl com a sequência de aminoácidos de FTFRSYGMD (correspondente aos resíduos 27 a 35 da SEQ ID NO: 1 com uma substituição S35D); ii. uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos de SIRGSRSSTYYADSVKG (correspondente aos resíduos 50 a 66 da SEQ ID NO: 1 com uma substituição S55R); iii. uma região CDR3 com a sequência de aminoácidos de LYRYWFDY (correspondente aos resíduos 99 a 106 da SEQ ID NO: 1 com uma substituição K99L); e b) uma cadeia leve humana compreendendo: i. uma região CDRl com a sequência de aminoácidos de SGDNLRNYYAH (correspondente aos resíduos 23 a 33 da SEQ ID NO: 2); ii. uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos de FYDVNRPS (correspondente aos resíduos 48 a 55 da SEQ ID NO: 2 com uma substituição Y48F e uma N51V); iii. uma região CDR3 com a sequência de aminoácidos de QSWWDGVPV (correspondente aos resíduos 8 8 a 9 6 da SEQ ID NO: 2 com uma substituição D91W).
2. 2. O anticorpo IgG monoclonal humano de acordo com a reivindicação 1, em que a) a cadeia pesada humana compreende a SEQ ID NO: 7 e b) a cadeia leve humana compreende a SEQ ID NO: 14.
3. 3. Um produto farmacêutico compreendendo o anticorpo IgG monoclonal humano de acordo com qualquer das reivindicações 1-2.