EA032189B1 - Изолированные человеческие моноклональные антитела против ингибитора пути тканевого фактора (tfpi) и фармацевтическая композиция, содержащая их - Google Patents

Abstract

Изобретение представляет изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (TFPI), где антитело содержит: а) тяжелую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью FTFRSYGMS, содержащей замену R30S или S35D или обе относительно SEQ ID NO: 1; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью SIRGSSSSTYYADSVKG, содержащей замену S55R или S56G или обе относительно SEQ ID NO: 1; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью KYRYWFDY, содержащей замену K99L относительно SEQ ID NO: 1; и b) легкую цепь антитела человека, содержащую: i) CDR1 участок с аминокислотной последовательностью SGDNLRNYYAH, содержащей замену R28P или N29K относительно SEQ ID NO: 2; ii) CDR2 участок с аминокислотной последовательностью YYDBNRPS, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из Y48F и N51V и их комбинаций относительно SEQ ID NO: 2; iii) CDR3 участок с аминокислотной последовательностью QSWDDGVPV, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из S89A, D91W, D92S, G93S и V94T и их комбинаций относительно SEQ ID NO: 2. Также представлены изолированные человеческие моноклональные антитела, как определено в пп.2, 3. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для лечения нарушения свертывания крови, содержащую указанные изолированные человеческие моноклональные антитела.

Description

Настоящее изобретение предоставляет изолированные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (ΤΕΡΙ) и фармацевтическую композицию для лечения нарушения свертывания крови, содержащую указанные моноклональные антитела.

Уровень техники

Свертывание крови представляет собой процесс, когда для остановки кровотечения образуются сгустки крови. В этом процессе участвуют несколько проферментов и прокофакторов (или факторов свертывания крови), которые циркулируют в крови. Существует несколько путей взаимодействия данных проферментов и прокофакторов, с помощью которых они переходят (одновременно или последовательно) в активированную форму. В конечном итоге, процесс приводит к тому, что в результате активации протромбина получается тромбин путем активации фактора X (ЕХа) в присутствии фактора Уа, ионов кальция и тромбоцитов. В свою очередь активированный тромбин стимулирует агрегацию тромбоцитов и превращает фибриноген в фибрин, который затем под воздействием активированного фактора XIII (ЕХ111а) образует сетчатую основу тромба.

Процесс, приводящий к активации фактора X, может осуществляться двумя различными путями: контактным путем свертывания крови (ранее именовавшимся внутренним путем свертывания крови) и путем тканевого фактора (ранее именовавшимся внешним путем свертывания крови). Ранее считалось, что каскад свертывания крови состоял из двух путей, имеющих равную значимость, объединенных в общий путь. Сегодня известно, что более значимым для инициации процесса свертывания крови является путь тканевого фактора.

Фактор X может быть активирован с помощью тканевого фактора (ТЕ) в комплексе с активированным фактором VII (ЕУПа). Комплекс фактора У11а и его важного кофактора - ТЕ, является потенциальным инициатором каскада свертывания.

Путь тканевого фактора свертывания крови подавляется ингибитором пути тканевого фактора (ТЕРЦ. ΤЕΡI - это естественный, ЕXа-зависимый ингибитор по типу обратной связи комплекса ЕУНа/ТЕ. Он является одним из ингибиторов серин-протеазы Кунитц-типа. С точки зрения физиологии, ТТИ связывает активизированный фактор X (ЕXа), в результате чего формируется гетеродимерный комплекс, который в свою очередь взаимодействует с комплексом ЕУНа/ТЕ, активность которого подавляется, и путь тканевого фактора свертывания крови блокируется. В принципе, блокирование активности ΤЕΡI может восстановить активность ЕXа и ЕУПа/ТЕ, таким образом, продолжительность активности пути тканевого фактора увеличивается, и генерация ЕXа усиливается, что является обыкновенным нарушением при гемофилии А и В.

На самом деле, некоторые предварительные результаты исследований указывают на то, что блокирование активности ΤЕΡI антителами нормализует увеличенное время свертывания крови или сокращает время кровотечения. Например, исследования Νοτάίπη^ е! а1. продемонстрировали, что увеличенное протромбиновое время при гемофилии нормализовалось после обработки плазмы антителами ΤЕΡI (ТйтотЬ. НаетоД. 1991, 66(4): 464-467). Подобным образом, исследования Егйагб!8еп е! а1. продемонстрировали, что время кровотечения при гемофилии А (модель кролика) существенно сократилось при использовании анти-ΤЕΡI антител (В1ооб Соащбабоп апб Е1Ьг1по1у818, 1995, 6: 388-394). Результаты этих исследований указывают на то, что ингибирование ΤЕΡI с помощью анти-ТТИ антител может применяться при лечении гемофилии А или В. В данных исследованиях использовались исключительно поликлональные анти-ТТИ антитела.

Моноклональные антитела против рекомбинантного человеческого ΤЕΡI (ЛТЕРЦ были получены с использованием гибридомных методов. См. Уапд е! а1., СЫп. Меб. 1., 1998, 111(8): 718-721. Производились исследования воздействия моноклонального антитела на протромбиновое время (РТ) и активированное частичное тромбопластиновое время (АРТТ). В результате исследований было обнаружено, что при введении анти-ΤЕΡI моноклонального антитела сокращается протромбиновое время при использовании плазмы с недостатком фактора IX. Предполагается, что путь тканевого фактора играет важную роль не только в физиологическом процессе свертывания крови, но также при кровотечениях, вызванных гемофилией (Уапд е! а1., Нипап Υί Ке Эа Xие Xие Вао, 1997, 22(4): 297-300).

Соответственно для лечения гематологических заболеваний и рака необходимы антитела, специфические для ТЕР!

Методами генной инженерии для лечения заболеваний человека были получены терапевтические антитела: мышиные, химерные, гуманизированные и полностью человеческие антитела. Было обнаружено, что мышиные моноклональные антитела не могут быть широко использованы в качестве лекарственных препаратов из-за короткого периода полураспада сыворотки, невозможности активирования эффекторных функций человека и вырабатывания у человека антимышиных антител (Вгекке апб ЗапбИе,

- 1 032189

ТБегареибс ΛηΙίόοάίοδ £ог Нитап О|5са5С5 а! (Не Оа\уп о£ (Нс Т\усп1у-Пг51 СеШигу, Ыа1иге 2, 53, 52-62, 1ап. 2003). Было обнаружено, что при использовании химерных антител у человека начинает развиваться иммунная реакция. В гуманизированных антителах мышиный компонент еще более снижен. При использовании полностью человеческих антител, однако иммуногенность, вызванная наличием мышиного компонента в антителах, совершенно исключается. Таким образом, существует необходимость в разработке полностью человеческих антител, чтобы исключить иммуногенность, связанную с другими формами антител, полученных способами генной инженерии. В частности, при требующемся длительном профилактическом лечении гемофилии с применением анти-ΤΡΡΙ моноклональных антител, в случае использования мышиных антител или антител с компонентом мышиного происхождения высока вероятность развития иммунной реакции на терапию из-за необходимости частого введения препарата, а также из-за длительной терапии. Например, при лечении гемофилии А для терапии с применением антител препараты могут вводиться раз в неделю в течении всей жизни пациента. Это означает, что иммунная система в течение долгого времени будет подвергаться опасности. Таким образом, существует необходимость в разработке полностью человеческих антител для терапии с применением антител при лечении гемофилии и других, схожих наследственных и приобретенных нарушений свертывания крови.

Терапевтические антитела были получены гибридомным методом, что описано в статье КоеЫег апб Μίϊδίαη СопЦпиощ СиИигек о£ Бикеб Се11§ Зесгебпд АпОЬобу о£ Ргебейпеб 8ресШсйу, ЫаШге 256, 495497 (1975). Полностью человеческие антитела могут быть получены рекомбинантными способами в прокариотических и эукариотических организмах. Получение антител в клетке-хозяине рекомбинантными способами является предпочтительным способом получения терапевтических антител по сравнению с использованием гибридомных методов. Получение антител рекомбинантными способами имеет следующие преимущества: большая стабильность продукта, возможна большая продуктивность и большая степень контроля при производстве, которая исключает или сводит к минимуму присутствие белков, полученных из организмов животных. Поэтому, желательно иметь возможность получать моноклональные анти-ТБР1 антитела рекомбинантным способом.

В дополнение, т.к. ТБР1 связывает активированный фактор X (БХа) с высокой аффинностью, эффективное анти-ТБР1 антитело должно обладать сопоставимой аффинностью. Таким образом, желательно иметь анти-ТБР1 антитело со связывающей аффинностью, сопоставимой со связыванием ТБР1/БХа.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение представляет изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (ТБР1), где антитело содержит:

a) тяжелую цепь антитела человека, содержащую:

ί) СЭК1 участок с аминокислотной последовательностью БТБР8УСМ8. содержащей замену К.308 или 835Ό или обе относительно 8Е6 ΙΌ N0: 1;

ίί) СЭК2 участок с аминокислотной последовательностью 81К68888Т¥УЛП8УК6, содержащей замену 855К или 8566 или обе относительно 8Е6 ΙΌ N0: 1;

ίίί) СЭК3 участок с аминокислотной последовательностью КУКУХУЕОУ, содержащей замену К99Б относительно 8Е6 ΙΌ N0: 1; и

b) легкую цепь антитела человка, содержащую:

ί) СЭК1 участок с аминокислотной последовательностью 86ΌΝΕΚΝΥΥΑΗ, содержащей замену К28Р или Ν29Ε относительно 8Е6 ΙΌ N0: 2;

ίί) СЭК2 участок с аминокислотной последовательностью ΥУ^ΒNКΡ8, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из Υ48Ε и №1У и их комбинаций относительно 8Е6 ΙΌ N0: 2;

ίίί) СЭК3 участок с аминокислотной последовательностью Р8УОП6УРУ, содержащей по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из 889Α, Э91У, Ό928, 6938 и У94Т и их комбинаций относительно 8Е6 ΙΌ N0: 2.

Другим объектом изобретения является изолированное человеческое моноклональное антитело, которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (ТЕРЦ где антитело содержит:

a) тяжелую цепь антитела человека, содержащую:

ί) СЭК1 участок с аминокислотной последовательностью ΕΊΈΚ8Υ6Μ8, содержащей замены К308 и 835Ό относительно 8Е6 ΙΌ N0: 1;

ίί) СЭК2 участок с аминокислотной последовательностью 8[К68888ТУУАО8УК6, содержащей замены 855К и 8566 относительно 8Е6 ΙΌ N0: 1;

ίίί) СЭК3 участок с аминокислотной последовательностью ΕΥΚΥ^ΕΩΥ, содержащей замену К99Б относительно 8Е6 ΙΌ N0: 1; и

b) легкую цепь антитела человка, содержащую:

ί) СЭК1 участок с аминокислотной последовательностью 86^N^КNΥΥΑΗ, содержащей замены К28Р и N2914 относительно 8Е6 ΙΌ N0: 2;

ίί) СЭК2 участок с аминокислотной последовательностью ΥУ^ΒNКΡ8, содержащей замены Υ48Ε и

- 2 032189

Ν5ΐν относительно 8ЕО ΙΌ N0: 2;

ίίί) СБКЗ участок с аминокислотной последовательностью ΟδΑΟΟΟνΡν. содержащей замены 889А. Ό91Α. Ό928. 6938 и ν94Τ относительно 8ЕО ΙΌ N0: 2.

Также настоящее изобретение представляет изолированное человеческое моноклональное антитело. которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (ΤΤΡΙ). где антитело содержит: (а) тяжелую цепь антитела человека. содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 10; и (Ь) легкую цепь антитела человека. содержащую аминокислотную последовательность как показано в 8Е0 ΙΌ N0: 17.

Кроме того. объектом изобретения является фармацевтическая композиция для лечения нарушения свертывания крови. содержащая терапевтически эффективное количество вышеуказанного моноклонального антитела и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретения. предоставленные моноклональные антитела к ΤΡΡΙ были оптимизированы. например. для получения антител с большей связывающей способностью или повышенной функциональной активностью.

Предпочтительно изолированное антитело является антителом Ι§6. Более предпочтительно изолированное антитело является антителом Ц62.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображена столбиковая диаграмма. иллюстрирующая 2А8 варианты с единичными аминокислотными заменами. которые в результате проведенного άΡΤ анализа. проявили большую эффективность для сокращения времени свертывания крови с применением гемофильной А плазмы.

На фиг. 2 изображена диаграмма. которая демонстрирует эффективность выбранных анти-ΤΡΡΙ антител с единичной аминокислотной мутацией для сокращения времени свертывания крови гемофильной крови человека с индуцированным антифактор νΙΙΙ антителом.

На фиг. 3 изображена диаграмма. которая демонстрирует. что 4Β7-Ό62Κ. имеет значительно большую эффективность для сокращения времени свертывания гемофильной А крови человека с индуцированным антителом по сравнению с исходным 4В7 антителом и. в меньшей степени. по сравнению вариантами с единичными аминокислотными заменами в 2А8.

На фиг. 4 изображена диаграмма. которая демонстрирует (в соответствии с введенными дозами препарата) выживаемость мышей. больных гемофилией А. которым было введено исходное антитело 2А8. а также 2А8 вариант с множественными аминокислотными заменами (А200) по сравнению с ΙβΟ1 контрольной мышью (СТХ Ιβ61).

На фиг. 5 изображена диаграмма. которая демонстрирует. что. в результате применения 2А8 варианта. свертываемость гемофильной С (с недостатком ΡΧΙ) плазмы человека повысилась в зависимости от дозировки. и его эффективность является сопоставимой с эффективностью ТУПа. полученного рекомбинантными способами.

Подробное описание изобретения

Определения

Термин ингибитор пути тканевого фактора или ΤΡΡΙ при использовании по тексту настоящего документа относится к любому варианту. изоформе или видовому гомологу ΤΡΡΙ человека. экспрессия которого происходит в клетках естественным образом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения. в результате того. что антитело по изобретению связывает ΤΡΡΙ. время свертывания крови сокращается.

При использовании по тексту настоящего документа. термин антитело относится к целому антителу. а также к любому фрагменту. связывающему антиген (т.е. антиген-связывающему фрагменту) или к одиночной цепи. Термин относится к молекуле иммуноглобулина полной длины (например. ΙβΟ антитело). которая встречается в природе. или которая формируется в результате обычных рекомбинационных процессов в фрагменте иммуноглобулинового гена или к иммунологически активному фрагменту молекулы иммуноглобулина. такому как фрагмент антитела. который сохраняет специфическую связывающую активность. Вне зависимости от структуры. фрагмент антитела связывает тот же антиген. что распознается антителом полной длины. Например. фрагмент анти-ΤΡΡΙ моноклонального антитела связывается с эпитопом ΤΡΡΙ. Антиген-связывающая функция антитела может быть выполнена фрагментами антитела полной длины. Термин антиген-связывающий фрагмент относится к связывающим фрагментам. которые включают. например: (ί) РаЬ (моновалентный фрагмент. состоящий из Уь. У_н. Сь и С_Н1 доменов); (ίί) Р(аЬ')₂(бивалентный фрагмент. включающий РаЬ фрагменты. соединенные дисульфидным мостиком в шарнирной области); (ίίί) Ρά фрагмент. состоящий из У_н и С_Н1 доменов; (ίν) Ρν фрагмент. состоящий из У_ь и У_н доменов одной ветки антитела. (ν) а бАЬ фрагмент (Аагб с1 а1.. (1989) №11игс 341: 544-546). состоящий из У_н домена; (νί) изолированную определяющую комплементарность область (СБК); (νίί) миниантитела. диатела. триотела. тетратела и каппа тела (см.. например. Ι11 с1 а1.. ΡΐΌΐοίη Епд 1997; 10: 949-57); (νίίί) ΙβΟ верблюда и (ίχ) Ι^ΑΚ Кроме того. несмотря на то. что эти два домена Ρν фрагмента. и У_н. кодированы различными генами. они могут быть соединены рекомбинантными способами. при помощи синтетичечкого линкера. который позволяет им сформировать одиночную белковую цепь. в которой Уь и У_н участки образуют пары и формируют моновалентные молекулы (известные

- 3 032189 как одноцепочечные Εν-фрагменты (κεΕν); см., например, Βίτά е! а1. (1988) 8с1епсе 242: 423-426; апб Ни§1оп е! а1 (1988) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 85:5879-5883). Предполагается, что подобные одноцепочечные антитела также будут включены в термин антиген-связывающий фрагмент антитела. Подобные фрагменты антитела получают с использованием стандартных методов, известных специалистам, и фрагменты проходят такой же анализ на полезность, как и полные антитела.

Более того, предполагается, что антиген-связывающий участок может находиться в миметическом антителе. Термин миметическое антитело или миметик при использовании по тексту настоящего документа относится к белку, который проявляет способность связывания, подобную способности связывания антитела, однако является меньшим альтернативным антителом или является белком, не являющимся антителом. Такое миметическое антитело может содержаться на подложке-носителе. Термин подложка-носитель относится к платформе полипептида для конструирования новых продуктов со специализированными функциями и характеристиками.

При использовании по тексту настоящего документа, термины подавляет связывание и блокирует связывание (например, в отношении подавления/блокирования связывания ΤΕΡΙ лигандом ΤΕΡΙ) используются взаимозаменяемо и относятся как к частичному, так и к полному подавлению или блокированию. Также, подразумевается, что подавление и блокирование включают любое ощутимое снижение в связывающей аффинности ΤΕΡΙ с физиологическим субстратом, возникающее при контакте с анти-ΤΕΡΙ антителом, по сравнению с ΤΕΡΙ, не контактирующим с анти-ΤΕΡΙ антителом, например, блокирование взаимодействия ΤΕΡΙ с фактором Ха или блокирование взаимодействия комплекса ΤΕΡΙ-фактор Ха с тканевым фактором, фактором УПа или комплексом тканевый фактор/фактор УПа приблизительно на по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%.

Термины моноклональное антитело или антитела с мономолекулярным составом при использовании по тексту настоящего документа относятся к получению молекул антител с мономолекулярным составом. Антитело с мономолекулярным составом проявляет единичную специфичность связывания и аффинность к определенному эпитопу. Соответственно при использовании по тексту настоящего документа, термин человеческое моноклональное антитело относится к антителам, которые проявляют единственную специфическую связывающую способность и которые имеют вариабельные и константные области, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевой линии человека. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодированные последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, внедренные неспецифическим или сайт-специфическим мутагенезом ίη νίΐτο или путем соматической мутации ίη νΐνο).

При использовании по тексту настоящего документа, термин изолированное антитело относится к антителу, по существу, свободному от других антител с иными антигенными свойствами (например, изолированное антитело, связывающее ΤΕΡΙ, по существу свободно от антител, связывающих другие антигены, отличные от ΤΕΡΙ). Изолированное антитело, связывающее эпитоп, изоформу или вариант ΤΕΡΙ человека может, тем не менее, иметь перекрестную реактивность к другим родственным антигенам, например, к антигенам из других видов (например, к видовым гомологам ΤΕΡΙ). Кроме того, изолированное антитело может быть по существу свободно от другого клеточного материала и/или химических веществ.

При использовании по тексту настоящего документа, термин специфически связывающий относится к антителу, связывающему определенный антиген. Обычно антитело связывает антиген с аффинностью по меньшей мере около 10⁵ М^-1, причем связывает определенный антиген с более высокой аффинностью (например, в два раза более высокой), чем аффинность при связывании другого антигена (например, бычьего сывороточного альбумина, казеина), отличного от определенного антигена или антигена, родственного определенному. Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное для антигена используются взаимозаменяемо с термином антитело, специфически связывающее антиген.

При использовании по тексту настоящего документа, термин высокая аффинность Ι§Ο антитела относится к связывающей аффинности, которая составляет, по меньшей мере, приблизительно 10⁷ М^-1, в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере приблизительно 10⁸М^-1, в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере приблизительно 10⁹ М^-1, 10¹⁰ Μ^-1, 10¹¹ М^-1 или выше, например до 10¹³ М^-1 или выше. Тем не менее, высокая связывающая аффинность может варьироваться для других изотипов антител. Например, высокая аффинность Ι§Ο изотипа относится к связывающей аффинности, которая составляет по меньшей мере приблизительно 1.0 х 10⁷ М^-1. При использовании по тексту настоящего документа термин изотип относится к классам антител (например, ΙβΜ или !дС1), которые кодированы генами константной области тяжелой цепи.

Термины определяющая комплементарность область или СИЯ относятся к одному из трех гипервариабельных участков в вариабельном участке тяжелой цепи или в вариабельном участке легкой цепи молекулы антитела, которые формируют Ν-терминальную антиген-связывающую поверхность, которая является комплементарной по отношению к трехмерной структуре связываемого антигена. Эти определяющие комплементарность области берут начало от Ν-конца тяжелой или легкой цепи, и именуются СИРТ, СИК2 и СИК.3 соответственно. СИР. участвуют в связывании антигенов антителами, и

- 4 032189

СИКЗ содержит единственный участок, специфичный для связывания антигенов антителами. Следовательно, антиген-связывающий сайт может включать шесть СЭК и содержать СЭК участки из V участков тяжелой и легкой цепи.

При использовании по тексту настоящего документа термин консервативные замены относится к модификациям полипептида, которые включают замену одной или более аминокислот на аминокислоты с подобными биохимическими свойствами, в результате чего полипептид не утрачивает свои биологические или биохимические функции. Консервативная аминокислотная замена - это замена, когда аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком с подобной боковой цепью. Специалистам известны семейства остатков аминокислот с подобными боковыми цепями. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), с полярными неионными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Предполагается, что антитела по настоящему изобретению могут иметь консервативные аминокислотные замены и сохранять активность.

Для нуклеиновых кислот и полипептидов термин существенная гомология означает, что две нуклеиновые кислоты или два полипептида или их обозначенные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными (при наличии соответствующих инсерций или делеций нуклеотидов), по меньшей мере приблизительно на 80% нуклеотидов или аминокислот, обычно по меньшей мере приблизительно 85%, предпочтительно приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94 или 95%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 или 99.5% нуклеотидов или аминокислот. Альтернативно, имеется существенная гомология, когда сегменты гибридизируют в условиях селективной гибридизации с комплементом цепочки. Изобретение включает нуклеотидные последовательности и полипептидные последовательности существенно гомологичные специфическим нуклеотидным последовательностям и аминокислотным последовательностям, перечисленным в настоящем документе.

Процентом идентичности между двумя последовательностями является функциональная зависимость количества идентичных положений в обеих последовательностях (т.е., % гомологии = количество идентичных положений/ общее количество положений х 100), включая количество разрывов, и длину каждого разрыва, которые необходимо вставить при оптимальном выравнивании двух последовательностей. Сравнивание последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может осуществляться с использованием математического алгоритма, такого как, помимо прочего, модуль ΛΙφπΧ'™ νοοΙοιΝΤΙ™ (1иуйгодеи Согр., Карлсбад, Калифорния). Для АНдиХ™, взяты следующие параметры по умолчанию для множественного выравнивания: штраф на внесение делеции: 10; штраф на продолжение делеции: 0,05; диапазон штрафа на разрыв делеции: 8; % отсрочки для идентичности выравнивания: 40. (более подробная информация может быть найдена по адресу: 1Шр:/Лу\у\у.туЦго8еп.сот/5Йе/и5/еп/1юте/ЫХХЕА-Оп1те-Сш6е5/ЫХХЕА-СоттипЦ|е5Аес1ог-ХТ1Соттиш1у/§едиеисе-аиа1у818-аи6-6а1а-таиадетеи1-8о1'Щаге-Гог-РС8/А11диХ-Мо6и1е-Гог^ес1ог-НТ1А6уаисе.гед.и8.Ыт1).

Еще один способ определения общего соответствия между исследуемой последовательностью (последовательность по настоящему изобретению) и искомой последовательностью, также называемый глобальным выравниванием последовательностей, может производиться с использованием программного обеспечения СЬи8ТАЕ^ (Тйотрзои е! а1., ЫисШс Ас16б Кезеагсй, 1994, 2(22):4673-4680), на основе алгоритма Н1ддш8 е! а1., (Сотри!ег АррйсаДоиб ш !1е Вюбшеисеб (САВ1О8), 1992, 8(2): 189-191). При выравнивании последовательностей как исследуемые, так и искомые последовательности являются последовательностями ДНК. В результате проведения указанного глобального выравнивания последовательностей определяется процент идентичности. Предпочтительными параметрами при выравнивании последовательностей ДНК с использованием СЬи8ТАЕ^ для расчета процента идентичности путем парных выравниваний являются: матрица = ГОВ, размер участка максимального совпадения = 1, количество непрерывно совпадающих к-плетов на участке парного выравнивания = 5, штраф за делецию = 3, штраф на внесение делеции =10, штраф на продолжение делеции = 0,1. Для множественного выравнивания, предпочтительными параметрами являются следующие параметры СЬи8ТАЕ^: штраф на внесение делеции = 10, штраф на продолжение делеции = 0,05; диапазон штрафа на разрыв делеции = 8; % отсрочка для идентичности выравнивания = 40.

Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в лизате клеток или в частично очищенной или по существу очищенной форме. Нуклеиновая кислота является изолированной или по существу, очищенной при очистке от других сопутствующих в природном окружении клеточных компонентов. Для изоляции нуклеиновой кислоты могут использоваться стандартные методы, такие как, например, следующие способы: обработка щелочью/ДСН, СбС1-бэндинг, колоночная хроматография и

- 5 032189 другие способы, известные специалистам.

Оптимизированные моноклональные антитела, с высокой аффинностью и функциональной активностью

Некоторые анти-ΤΕΡΙ антитела были идентифицированы в более ранних исследованиях и описаны в заявке РСТ № ΡΟΤ/ϋ8 2009/052702, зарегистрированной 4 августа 2009 г., которая включена в настоящую заявку посредством ссылки для любых возможных целей. Эти анти-ΤΕΡΙ антитела могут быть подвергнуты дальнейшей оптимизации, например, путем улучшения аффинности и блокирующей активности к ΤΕΡΙ. Подобная оптимизация может осуществляться, например, путем сайт-насыщающего мутагенеза определяющих комплементарность областей (СЭК) или остатков вблизи СЭК антител, т.е приблизительно 3 или 4 остатка, непосредственно прилегающих к СЭК.

Кроме того, настоящее изобретение предоставляет моноклональные антитела с повышенной или высокой аффинностью к ΤΕΡΙ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анти-ΤΡΡΙ антитела имеют связывающую аффинность по меньшей мере приблизительно 10⁷ М^-1, в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере приблизительно 10⁸ М^-1, в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере приблизительно 10⁹ М^-1, 10¹⁰ М^-1, 10¹¹ М^-1 или выше, например до 10¹³ М^-1 или выше.

Сайт-насыщающий мутагенез в определяющих комплементарность областях и в остатках, непосредственно прилегающих к СЭК анти-ΤΡΡΙ исходного антитела, которое именуется в настоящем документе 2А8, использовался для оптимизации аффинности и функциональной активности антител. Предполагается, что такая же оптимизация может быть произведена в отношении антител, описанных в предшествующей заявке ΡСΤ/υ8 2009/052702.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, сайт-насыщающий мутагенез определяющих комплементарность областей может производиться на анти-ΤΡΡΙ антителах. Для 2А8, СЭК в тяжелой цепи, показанные в 8ЕО ΙΌ N0: 1 соответствуют остаткам ΡΤΡК8Υ6М8 (остатки 27-35), 8ΙΒΟ8888ΤΥΥΑΌδνΚΟ (остатки 50-66) и ΚΥΒΥΑΕΩΥ (остатки 99-106). Для 2А8 легкой цепи, показанной в 8ЕО ΙΌ N0: 2, СЭК соответствуют остаткам 8ΟΌΝΕΗΝΥΥΑΗ (остатки 23-33), ΥΥΩΝΝΒΡ8 (остатки 48-55) и ΟδΧνΟΩΟνΡν (остатки 88-96). Модификация может производиться в любой из СЭК по отдельности или могут производиться комбинации модификаций. Помимо этого, в отдельной СЭК могут быть произведены две и более модификаций. В других вариантах осуществления изобретения, модификации могут также быть внедрены в непосредственной близости от СЭК, например, в пределах 3 или 4 остатков с каждой стороны каждой СЭК.

Вкратце, были введены единичные и/или множественные аминокислотные модификации для оптимизации исходного антитела 2А8, например, для улучшения аффинности. Вначале, единичные аминокислотные модификации были внедрены в шесть СЭК или в остатки, находящиеся в непосредственной близости к СЭК антитела, после чего производился анализ связывающих свойств ΤΕΡΙ. Модификации, которые усиливают сигнал связывания ΤΡΡΙ, были выбраны для комбинирования с другой одной или несколькими модификациями, а также для проведения анализа на обнаружение дальнейшего увеличения сигнала связывания. После проведения каждого анализа, выбранные варианты антитела использовались для определения его аффинности к ΤΡΡΙ и блокирующей активности по отношению к активности ΤΡΡΙ, а также для определения того, насколько сокращается время свертывания. Таким образом, в некоторых вариантах изобретения предоставлено изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, с повышенной аффинностью по сравнению с немодифицированными исходными антителами. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения предоставлено изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, с увеличенной блокирующей активностью ΤΡΡΙ по сравнению с немодифицированными исходными антителами. В некоторых вариантах осуществления изобретения предоставлено изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, с уменьшенным временем свертывания по сравнению с немодифицированными исходными антителами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения для уменьшения дивергенции от последовательности зародышевой линии были внедрены дополнительные аминокислотные модификации. В других вариантах осуществления изобретения, аминокислотные модификации были произведены с целью, сделать свойства антитела более подходящими для производства в промышленных масштабах.

Антитело может быть видоспецифичным или давать перекрестную реакцию с несколькими видами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может специфически реагировать или давать перекрестную реакцию с ΤΡΡΙ человека, мыши, крысы, кролика, морской свинки, обезьяны, свиньи, собаки, кошки или других видов млекопитающих.

Антителом может являться любое антитело из различных классов антител, таких как, помимо прочего, Ι§Ο1 антитело, Ι§Ο2, Ι§Ο3, Ι§Ο4, ^М. ΙβΑ1. ΙβΑ2. секреторное ΙβΑ. Ι§Ό и Ι§Ε антитела.

2Α8 варианты

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления изобретения, может предоставляться изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фак

- 6 032189 тора, где антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в 8Ε6 ГО N0: 1, где указанная аминокислотная последовательность, содержит одну или более модификаций аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификация тяжелой цепи 2А8 является заменой.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, замены находятся в СГОК тяжелой цепи 2А8. В других вариантах осуществления изобретения, замены находятся вне СГОК тяжелой цепи 2А8.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, замена в тяжелой цепи 2А8 находится в положении, выбранном из: 835, 855 и К99. В некоторых вариантах осуществления изобретения, замена в тяжелой цепи 2А8 может также включать положение, выбранное из: К30 и 856. Например, замена может быть выбрана из: К308, 835Ό, 855К, 8566 и К99Ь. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать две или более замены, выбранных из: К308, 835Ό, 855К, 8566 и К99Ь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, тяжелая цепь 2А8 имеет следующие замены, родственные 8ЕС) ГО N0: 1: 835О+К99Ь; 835О+855К+К99Ь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, тяжелая цепь 2А8 имеет следующие замены, родственные 8 ЕС) ГО N0: 1: К308+835О+855К+К99Ь; 835О+К99Ь; 835О+855К+К99Ь;

835О+855К+8566+К99Ь и 835О+8566+К99Ь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, замены находятся в СГОК легкой цепи 2А8. В других вариантах осуществления изобретения, замены находятся вне СГОК легкой цепи 2А8.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, замена в легкой цепи 2А8 находится в положении, выбранном из Υ48, N51, Ό91 и Ό92. В некоторых вариантах осуществления изобретения замена в легкой цепи 2А8 может включать положение, выбранное из 693 и У94. Например, замена может быть выбрана из К28Р, Е29К, Υ48Ρ, №1У, 889А, Ό91\, Ό928, 6938 и У94Т. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может содержать две или более замены, выбранных из К28Р, №9К, Υ48Ρ, №1У, 889А, Ό91\, Ό928, 6938 и У94Т.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, легкая цепь 2А8 имеет следующие замены, родственные 8ЕС) ГО N0: 2: Υ48Ρ+N51V; Υ48Ρ+Ό91\; ¥48Е-\51У-|)91\\' и \51У+)91\\'.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, легкая цепь 2А8 имеет следующие замены, родственные 8 ЕС) ГО N0: №9К+-Υ48Ε-+-N51V+091 ХНУ-1)91 \\'; К28Р+-Υ48Ρ-+-N51 У·+1)91 \;

¥489 +1)91 К; Υ48Ρ+Ό91\; Υ48Ρ+N51V; Υ48Ρ+N51V+^91\; Υ48Ρ+N51V+^91\+^928;

Υ48Ρ+N51V+^91\+6938; Υ48Ρ+N51V+^91\+V94Т и Υ48Ρ+N51V+889А+^91\.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Ε6 ГО N0: 10.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Ε6 ГО N0: 17.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, изолированное моноклональное антитело, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора, содержит: а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из 8Ε6 ГО N0: 10; а также Ь) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из 8Ε6 ГО N0: 17.

Способы получения антител к ΊΤΡΙ

Моноклональное антитело может быть получено рекомбинантными способами или путем экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей вариабельные области моноклонального антитела согласно вариантам осуществления изобретения в клетке-хозяине. С помощью вектора экспрессии подходящая клетка-хозяин может быть также трансфицирована нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, и использована для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты. Соответственно, настоящее изобретение предоставляет способ получения моноклонального антитела, которое связывает ТРР1 человека, включающий:

(a) трансфицирование молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей моноклональное антитело по изобретению, в клетку-хозяина, (b) культивирование клетки-хозяина для экспрессии указанного моноклонального антитела в клетке-хозяине, и, при необходимости, (c) изолирование и очищение полученного моноклонального антитела, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую моноклональное антитело по настоящему изобретению.

Согласно одному из примеров для экспрессии указанных антител или фрагментов антител ДНК, кодирующие частичные легкие и тяжелые цепи или цепи полной длины, полученные стандартными способами молекулярной биологии, могут быть встроены в векторы экспрессии таким образом, что гены функционально связаны с регуляторными последовательностями транскрипции и трансляции. В данном контексте термин функционально связанные означает, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что регуляторные последовательности транскрипции и трансляции в векторе выполняют их пред

- 7 032189 полагаемую функцию регуляции транскрипции и трансляции гена данного антитела. Вектор экспрессии и регуляторные последовательности экспрессии выбраны таким образом, что они являются совместимыми с используемой экспрессионной клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в отдельные векторы или, более конкретно, оба гена встроены в один и тот же вектор экспрессии. Гены антител встраивают в вектор экспрессии стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе, или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют). Вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, описанных в настоящем документе, могут быть использованы для создания полноразмерных генов антител любого изотипа антитела встраиванием их в векторы экспрессии, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и константные области легкой цепи желаемого изотипа таким образом, что У_н-сегмент функционально связывается с Сн-сегментом (сегментами) в данном векторе, и Уь-сегмент функционально связывается с Сь-сегментом в этом векторе. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид связывается в рамке считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т. е. сигнальным пептидом из белка, не являющегося иммуноглобулином).

В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные экспрессирующие векторы по настоящему изобретению несут регуляторные последовательности, которые регулируют экспрессию генов цепей антитела в клетке-хозяине. Термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы регуляции экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые регулируют транскрипцию и трансляцию генов цепей антител. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббе1; Сеие Ехртезыоп Тес1по1оду. Мебюбз ίη Епхуто1оду 185, Асабетк Ргсзз. 8ап Ωίοβο. СайТ (1990). Специалистам в данной области будет понятно, что конструкция вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Примеры регуляторных последовательностей для экспрессии клетки-хозяина млекопитающего включают в себя вирусные элементы, которые определяют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающего, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (СМУ), вируса обезьян 40 (8У40), аденовируса, (например, основной поздний промотор аденовируса (АбМЬР)) и полиомы. Альтернативно, могут быть использованы невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор убиквитина или промотор β-глобина.

В дополнение к генам цепей антитела и регуляторным последовательносстям, рекомбинантные экспрессирующие векторы могут нести дополнительные последовательности, например, последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, сайты инициации репликации), и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США и.8. Ра1. Ыоз. 4399216, 4634665 и 5179017, все Ахе1 е! а1.). Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как С418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен данный вектор. Примеры генов селектируемых маркеров включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (ΌΗΕΚ) (для применения в бЫт-клетках-хозяевах с отбором/амплификацией в присутствии метотрексата) и ген пео (для отбора в присутствии С418).

Для экспрессии легкой и тяжелой цепей вектор (векторы) экспрессии, кодирующие тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяина стандартными способами. Подразумевается, что различные формы термина трансфекция включают большое разнообразие способов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например электропорацию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию с использованием ΌΕΑΕ-декстрана и т.п. Хотя теоретически можно экспрессировать антитела по настоящему изобретению в любых прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительной является экспрессия антител в эукариотических клетках и, наиболее предпочтительно, в клетках-хозяевах млекопитающих, так как такие эукариотические клетки и, в частности, клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, будут собираться и секретировать правильно уложенное и иммунологически активное антитело.

Примеры клеток-хозяев млекопитающего для экспрессии рекомбинантных антител включают овариальные клетки китайского хомячка (СНО клетки) (включая бЫт- СНО клетки, описанные в статье ϋτ1аиЬ апб Сйазш, (1980) Ргос. №111. Асаб. 8с1. ϋδΑ 77: 4216-4220, используемые с ΌΗΕΚ-селектируемым маркером, например, как описано Κ. 1. КаиЕтап апб Р. А. 81агр (1982) Мо1. Вю1. 159: 601-621), N80 миеломные клетки, С08 клетки, НКВ11 клетки и 8Р2 клетки. При введении рекомбинантных векторов экспрессии, кодирующих гены антител, в клетки-хозяев млекопитающих антитела получают культивированием клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клеткаххозяевах или для секреции антитела в культуральную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Антитела могут быть извлечены из культуральной среды с использованием стандартных методов очистки белка, таких как ультрафильтрация, эксклюзионная хроматография, ионнообменная хроматография и

- 8 032189 центрифугирование.

Использование частичных последовательностей антител для экспрессии полных антител

Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно через аминокислотные остатки, которые расположены в шести СЭЯ тяжелой и легкой цепи. По этой причине аминокислотные последовательности в СОЯ являются более разнообразными между отдельными антителами, чем последовательности вне СОЯ. Поскольку последовательности СОЯ ответственны за большинство взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических встречающихся в природе антител, конструированием векторов экспрессии, которые включают в себя последовательности СОЯ из специфического встречающегося в природе антитела, привитые на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, Я1есЬтапи, Ь. е! а1., 1998, Ыа!иге 332:323-327; 1оие8, Р. е! а1., 1986, №11игс 321: 522-525; апб Риееп, С. е! а1., 1989, Ртос.Ыа!1. Асаб. 8с1. И.8.А. 86:10029-10033). Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных, которые включают в себя последовательности генов антител зародышевой линии. Эти последовательности зародышевой линии будут отличаться от последовательностей генов созревших антител, так как они не будут включать полностью собранные изменчивые гены, которые формируются в результате УЭ1 рекомбинации в процессе созревания В-клетки. Необязательно получать полную последовательность ДНК определенного антитела для создания полного рекомбинантного антитела со связывающими свойствами, подобными свойствам оригинального антитела (см. XV О 99/45962). Обычно для этой цели достаточно частичной последовательности тяжелой и легкой цепей, перекрывающей области СЭЯ. Данная частичная последовательность используется для идентификации вариабельных и соединяющихся сегментов генов зародышевой линии, которые участвовали в создании рекомбинированных вариабельных генов антитела. Затем, для заполнения пропущенных фрагментов в вариабельных областях используется последовательность зародышевой линии. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепей расщепляются в ходе созревания белка и не влияют на свойства конечного антитела. Поэтому необходимо использовать соответствующую лидерную последовательность зародышевой линии для конструктов экспрессии. Для добавления отсутствующих последовательностей, клонированные последовательности кДНК могут комбинироваться с синтетическими олигонуклеотидами путем лигирования или ПЦР-амплификации. В качестве альтернативы, вся вариабельная область может быть синтезирована как набор коротких, перекрывающих олигонуклеотидов и комбинирована ПЦРамплификацией для создания полностью синтетического клона вариабельной области. Этот процесс имеет определенные преимущества, такие как элиминация или введение определенных сайтов рестрикции, а также оптимизация определенных кодонов.

Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелой и легкой цепей используются для разработки перекрывающего набора синтетических олигонуклеотидов для создания синтетических V последовательностей со способностью кодирования аминокислот, идентичной природным последовательностям. Синтетические последовательности тяжелых и легких цепей могут иметь отличия от природных последовательностей. Напримерб цепочки повторяющихся нуклеиновых оснований прерывают для облегчения олигонуклеотидного синтеза и ПЦР-амплификации; оптимальные сайты инициации трансляции инкорпорируют в соответствии с правилами Козака (Кохак. 1991, 1. Βίο1. СЪеш. 266: 19867-19870); а вверх или вниз по ходу транскрипции от сайтов инициации транскрипции конструируются сайты рестрикции.

Для оптимизированного кодирования и соответствующего некодирования вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепей последовательности цепей разбивают на фрагменты из 30-50 нуклеотидов, примерно в середине соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи, олигонуклеотиды могут быть собраны в перекрывающие двухцепочечные наборы, которые перекрывают сегменты из 150-400 нуклеотидов. Затем пулы используют как матрицы для получения продукты ПЦР-амплификации из 150-400 нуклеотидов. Как правило, один набор олигонуклеотидов вариабельной области разбивают на два пула, которые раздельно амплифицируют с получением двух перекрывающихся продуктов ПЦР. Затем эти перекрывающиеся продукты комбинируют путем ПЦРамплификации с образованием полной вариабельной области. Желательно, включить перекрывающий фрагмент константной области тяжелой и легкой цепи в ПЦР-амплификацию для создания фрагментов, которые с легкостью могут быть клонированы в конструкты вектора экспрессии.

Реконструированные вариабельные области тяжелых и легких цепей затем комбинируют с клонированным промотором, последовательностями инициации трансляции, константной областью, 3' нетранслируемыми последовательностями, сайтами полиаденилирования и последовательностями терминации транскрипции для формирования конструктов вектора экспрессии. Конструкты экспрессии тяжелой и легкой цепей могут комбинироваться в один вектор, котрансфицированы, серийно трансфицированы или трансфицированы по отдельности в клетки-хозяева, которые затем сливаются в одну клеткухозяина, экспрессирующую обе цепи.

Таким образом, согласно еще одному аспекту структурные особенности человеческого анти-ТРР1 антитела используются для создания структурно родственных человеческих анти-ТРР1 антител, которые сохраняют функцию связывания ТРР1. Более конкретно, одна или несколько СЭЯ специфически идентифицированных областей тяжелых и легких цепей моноклональных антител по изобретению могут быть

- 9 032189 комбинированы рекомбинантными способами с известными человеческими каркасными областями и СЭР, в результате чего получаются дополнительные, полученные рекомбинантными способами, человеческие анти-ΤΤΡΙ антитела по изобретению.

Фармацевтические композиции

Кроме того, настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество анти-ΤΕΡΙ моноклонального антитела, и фармацевтически приемлемый носитель. Под термином фармацевтически приемлемый носитель подразумевается вещество, которое может быть добавлено к активному компоненту для изготовления препарата согласно рецептуре или для стабилизации препарата и которое не вызывает значительных нежелательных побочных эффектов у пациента. Примеры подобных носителей хорошо известны специалистам и включают воду, сахара, такие как мальтозный сахар и сахароза, альбумин, соли, такие как хлорид натрия и т.д. Другие виды носителей описаны, например, в КетшдЩп'к Рйагтасеийса1 8с1епсе5 Ьу Е. ^. Майш. Подобные композиции содержат терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного анти-ΤΕΡΙ моноклонального антитела.

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления инъекционных растворов или дисперсий. Способы использования подобных сред и агентов с фармацевтически активными веществами хорошо известны специалистам. Предпочтительно полученный состав композиции предназначена для парентеральной инъекции. Композиция может быть в форме раствора, микроэмульсии, липосомы или в любой другой форме, подходящей для высоких концентраций активного вещества. Носителем может быть растворитель или дисперсная среда, которые содержат, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), а также их подходящие смеси. В некоторых случаях в состав носителя могут входить изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия.

Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены путем введения активного соединения в требующийся объем соответствующего растворителя с одним из компонентов, перечисленных выше, или, при необходимости, с комбинацией таких компонентов, после чего следует этап стерилизующей микрофильтрации. Обычно дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильную основу, содержащую основную дисперсионную среду и другие требующиеся компоненты из тех, что перечислены выше. В случае если при приготовлении стерильных инъекционных растворов используются стерильные порошки, некоторыми методами их получения являются вакуумная сушка и сушка замораживанием (лиофилизация), когда из раствора прошедшего стерилизующую фильтрацию получают порошок, содержащий активный компонент вместе с любым дополнительным компонентом по желанию.

Фармацевтическое применение

Моноклональное антитело может использоваться для терапевтических целей при лечении наследственных и приобретенных нарушений свертывания крови. Например, моноклональные антитела в вариантах осуществления изобретения, описанных выше, могут использоваться для блокирования взаимодействия ΤΕΡΙ с ЕХа или для предотвращения ΤΕΡΙ-зависимого подавления активности ТР/ЕУПа. В качестве дополнения, моноклональное антитело может использоваться для восстановления генерации ЕХа, вызываемой ΤΕ/ЕУПа, для того, чтобы избежать влияния недостаточности ЕУШ- или ΕΙΧ-зависимой амплификации ЕХа.

Моноклональные антитела могут иметь терапевтическое применение для лечения нарушений свертывания крови, таких как тромбоцитопения, нарушения функции тромбоцитов и кровоточивость (например, гемофилия А, гемофилия В и гемофилия С). Лечение подобных нарушений может осуществляться путем введения терапевтически эффективного количества анти-ΤΕΡI моноклонального антитела пациенту, нуждающегося в таком лечении. Моноклональные антитела могут иметь терапевтическое применение при лечении неконтролируемых кровотечений с такими показаниями к применению, как травма или геморрагический инсульт. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ сокращения времени кровотечения путем введения терапевтически эффективного количества анти-ΤΕΡΙ моноклонального антитела по изобретению пациенту, нуждающегося в таком лечении.

Антитела могут использоваться для монотерапии или в сочетании с другими средствами терапии при лечении гемостатических расстройств. Например, полагается, что совместное введение одного или более антител по изобретению с фактором свертывания крови, таким как, например, фактор УПа, фактор УШ или фактор ΙΧ может эффективно применяться при лечении гемофилии. В одном варианте осуществления изобретения предоставлен способ лечения наследственных и приобретенных нарушений свертывания крови, включающий введение: (а) первой дозы моноклонального антитела, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора и (Ь) второй дозы фактора УШ или фактора ΙΧ, при этом дозы, введенные вместе, эффективно используются для лечения указанных нарушений. В другом варианте осуществления изобретения предоставлен способ лечения наследственных и приобретенных нарушений свертывания крови, включающий введение: (а) первой дозы моноклонального антитела, которое связывает человеческий ингибитор пути тканевого фактора и (Ь) второй дозы фактора УШ или фактора ΙΧ, при этом дозы, введенные вместе, эффективно используются для лечения указанных нарушений, причем

- 10 032189 фактор νΙΙ совместно не вводится. Изобретение также включает фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество комбинации моноклонального антитела по изобретению и фактора νΙΙΙ или фактора ΙΧ, причем композиция не содержит фактор νΙΙ. В понятие фактор УЛ входит фактор νΙΙ и фактор УПа. Эти комбинированные терапии способны снизить частоту необходимого введения фактора свертывания. Под совместным введением или под комбинированной терапией подразумевается применение двух лекарственных средств в одной композиции, либо в случае, когда они изготовлены раздельно, два лекарственных средства вводятся пациенту приблизительно одновременно, либо неодновременно, но в течение одного терапевтического периода.

В некоторых вариантах осуществления изобретения одно или несколько антител, описанных в настоящем документе, могут использоваться при лечении гемостатических расстройств. Например, полагается, что совместное введение одного или нескольких антител, описанных в настоящем документе, может использоваться для лечения гемофилии или каких-либо других гемостатических расстройств.

Фармацевтические композиции могут приниматься парентерально пациентами, страдающими от гемофилии А или В, доза и частота приема препарата могут варьироваться в зависимости от степени тяжести кровотечения, либо (в случае профилактической терапии) в зависимости от степени тяжести нарушения системы свертывания крови пациента.

Композиции могут вводиться пациентам, нуждающимся в таком лечении, болюсным введением или постоянной инфузией. Например, при болюсном введении антитела по изобретению, в качестве РаЬфрагмента дозировка может составлять 0,0025-100 мг/кг массы тела, 0,025-0,25 мг/кг, 0,010-0,10 мг/кг или 0,10-0,50 мг/кг. При постоянной инфузии антитела по изобретению, в качестве РаЬ-фрагмента дозировка может составлять 0,001-100 мг/кг массы тела/мин, 0,0125-1,25 мг/кг/мин, 0,010-0,75 мг/кг/мин, 0,010-1,0 мг/кг/мин или 0,10-0,50 мг/кг/мин на протяжении 1-24 ч, 1-12 ч, 2-12 ч, 6-12 ч, 2-8 ч, либо 1-2 ч. При введении антитела по изобретению, в качестве антитела полной длины (с полной константной областью) дозировка может составлять приблизительно 1-10 мг/кг массы тела, 2-8 или 5-6 мг/кг. Подобные антитела полной длины обычно вводятся инфузией на протяжении 0,5-3 ч. Частота введения препарата зависит от степени тяжести состояния пациента. Частота введения препарата может варьироваться от трех раз в неделю до одного раза в две недели или одного раза в шесть месяцев.

В дополнение к этому композиции могут вводиться пациентам подкожной инъекцией. Например, анти-ΤΕΡΙ антитело может вводиться пациентам подкожной инъекцией при дозировке 10-100 мг один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в месяц.

При использовании по тексту настоящего документа термин терапевтически эффективное количество обозначает количество анти-ΤΕΡΙ моноклональныого антитела или комбинации данного антитела и фактора νΙΙΙ или фактора ΙΧ, которое требуется для повышения времени свертывания ίη νΐνο или для оказания ощутимой пользы пациенту, нуждающемуся в таком лечении, каким-либо другим способом. Точное количество будет зависеть от множества факторов, включающих, помимо прочего, такие факторы, как конкретные компоненты и физические характеристики терапевтической композиции, особенности обследуемой группы пациентов, индивидуальные особенности пациента и другие, подобные факторы. Точное количество может быть с легкостью определено специалистом в данной области.

Примеры

Пример 1. Клонирование, экспрессия и количественное определение уровней экспрессии антитела

Тяжелая и легкая цепь РаЬ 2А8 и 4В7 дикого типа, несущие метку с-тус и гексагистидиновую метку на С-конце тяжелой цепи, были субклонированы в бактериальный вектор экспрессии рЕТ28а (Νοуадеп/Мегск СкешкаН Ыб., Ноттингем, Великобритания) и трансформированы в клетки Τορ10Ε' (Ιηνίίτοдеп СтЬН, Карлсруэ, Германия). В качестве альтернативы, могут использоваться другие бактериальные векторы экспрессии (например, система векторов рОЕ. 01адеп СтЬН, Хильден, Германия) и штаммы (например, ΌΗ5α, ЕгсЦгодеп СтЬН, Карлсруэ, Германия).

Варианты были получены стандартным олигонуклеотид-направленным сайт-специфическим мутагенезом и подтверждены секвенированием ДНК. В частности, аминокислотные остатки, находящиеся внутри или окружающие, определяющие комплементарность области, были модифицированы в тяжелой и/или легкой цепи.

Для того, чтобы иметь возможность использовать антитела дикого типа и мутантные антитела в качестве конкурентов, эпитопные метки, находящиеся на С-конце тяжелой цепи были удалены или замещены с помощью стандартных методов на основе ПНР. В частности, для 4В7 метку с-тус заменили на эпитопную метку гемагглютинина (НА) для всех анализируемых вариантов. Напротив, 4В7 дикого типа или варианты, используемые в качестве конкурентов, несли метку с-тус. В случае 2А8, с-тусэпитопную метку заменили на НА-метку или удалили, в результате чего был получен вариант с 6х гистидиновыми эпитопными метками на С-конце.

Для экспрессии варианты были трансформированы в штамм ВБ2151агОЕ3 ЕксйепсЫа сο1^ (Ιηνίΐτοдеп, С6010-03), инокулированы в выращенную в течение ночи культуру, в ЬВ среде, содержащей канамицин (30 мкг/мл), и инкубировали при температуре 37°С в течение 18 ч. Экспрессионные культуры были получены путем инокулирования выращенной в течение ночи культуры 1:20 в свежую ЬВ среду, со

- 11 032189 держащую канамицин (30 мкг/мл). По прошествии 6 ч, для того чтобы вызвать экспрессию антитела, было добавлено 1 мМ изопропил-Ь-О-1-тиогалактопиранозида (Ко1Н, 2316.5), и культуры инкубировали еще в течение 18 ч при температуре 30°С. В качестве альтернативы, инкубированные в течение ночи культуры инокулировали 1:20 в среду с автоиндукцией ОуегшдЫ Ехргекк ТВ тебшт (Мегск, 71491) и инкубировали при температуре 30°С в течение 24 ч.

Для количественного определения уровня экспрессии использовался иммуноферментный анализ (ЕЫ8Л). Вкратце, пластины микротитратора (Ыипс тахЦогр Ь1аск, 460518) инкубировали с ЕаЬспецифическим антителом (81дта, Ι5260), растворенном в буфере для иммобилизации (Сапбог Вюкаепсе СтЬН, 121500) при температуре 4°С в течение ночи, промыли ΡΒ8Τ (фосфатно-солевой буферный раствор: 137 мМ ЫаС1, Мегск 1.06404.5000; 2,7 мМ КС1, Мегск 1.04936.1000; 10 мМ ^ΗΡΟ^ Мегск 1.06586.2500, 1,8 мМ ΚΗ₂ΡΟ₄, Мегск 1.04871.5000; с 0,05% твин 20 Лсгоз Огдашсз, 233360010), блокировали 2% молока в ΡΒ8Τ в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем снова промыли. Культуры растворили в 0,25% обезжиренного молока (Е1ика апа1убса1, 70166) в ΡΒ8 и оставили в пластинах микротитратора в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки ΡΒ8Τ, пойманные антитела инкубировали вместе с ΗΚΡ-спаренным анти-ЕаЬ антителом (81дта, А0293) и обнаружили путем инкубирования пластины с 10 мкМ субстрата Амплекс красный (Атр1ех геб) Цпуйгодеп, А12222) в течение 10-30 мин при комнатной температуре в темноте, а затем было произведено измерение флуоресценции. Уровни экспрессии были нормализованы после определения концентрации, относительно очищенного антитела дикого типа (2А8 или 4В7).

Пример 2. Определение активности и межвидовой перекрестной реактивности полученных вариантов антитела

Для определения активности мутированных вариантов антитела на ΤΕΡΙ человека или мыши (Атег1сап П1адпо8Йса, 4900В и Β&Ό Зуйетк, 2975-Ρ1, соответственно) использовался неконкурентный или конкурентный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А). Вкратце, пластины микротитратора (Ме8о8са1е Όίδсоуегу, Б21ХА-4, либо Ыипс тахЦогр Ь1аск, 460518) были покрыты 0,04-2 мкг/мл ΤΕΡI человека или мыши, растворенном в фосфатно-солевом буферном растворе (ΡΒ8) или в буфере для иммобилизации (Сапбог В1о8с1епсе СтЬН, 121500), соответственно, и инкубировали при температуре 4°С в течение ночи. После промывки, пластины блокировали 3% альбумина бычьей сыворотки (81дта, А4503) в ΡΒ8Τ в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем повторили стадию промывки. Для связывания антител на пластины добавили 10-25 мкл культурального супернатанта, который был нормализован до уровня экспрессии соответствующего антитела (если не указано иное) на 1 ч при комнатной температуре, а затем промыли ΡΒ8Τ. Связанные антитела дикого типа или варианты антител затем идентифицировали с помощью специфического антитела, распознающего эпитопную метку, или либо с помощью конкурентного анализа. Для конкурентного анализа, добавляли 50-300 нМ конкурента или свободного антигена и инкубировали в течение от 20 мин до 24 ч при комнатной температуре. После промывки оставшиеся варианты идентифицировали с помощью специфического антитела, распознающего эпитопную метку, соединенного с пероксидазой хрена (Бюто^ анти-с-тус А190-105Р для 2А8 вариантов и анти-НА А190-108Р для 4В7 вариантов) или с помощью анти-тус антитела (81дта, С3956) или анти-НА антитела (81дта, Н6908), которое было предварительно помечено сульфо-ΝΗδ реагентом в соответствии с инструкциями производителя для электрохемилюминесцентного анализа (Ме8о8са1е ПЦсоуегу, Ρ91ΛΝ-1). Для детекции сигнала, на пластины микротитратора добавили 10 мкМ субстрата Амплекс красный (Атр1ех геб) (Iην^ΐ^одеη. А12222) и инкубировали в течение 10-30 мин при комнатной температуре в темноте, а затем было произведено измерение флуоресценции. Для детекции, на М8Э пластинах М8Э трис-буфер Кеаб РиГГег Т растворили 2х в Н₂О (Ме8о8са1е ПЦсоуегу, Κ92ΤΟ-1), добавили на пластины и детектировали электрохемилюминесцентный сигнал на 620 нм при помощи Ме8о8са1е ОЦсоуегу 8ес1ог Ипадег 6000.

Пример 3. Единичные и множественные аминокислотные замены

В табл. 1 приведены несколько примеров единичных и множественных аминокислотных замен в тяжелой и легкой цепи 2А8. Для количественного определения уровня экспрессии вариантов (по четыре) применялся иммуноферментный анализ (ЕЫ8А). После нормализации до соответствующего уровня экспрессии, был проведен анализ эффективности воздействия антител (по четыре) путем конкурентного иммуноферментного анализа на ΤΓΡΙ человека и мыши, после чего были определены соотношения между эффективностью воздействия вариантных антител и антител дикого типа (\\1). Расчет погрешностей производился путем распространения ошибки от стандартных отклонений.

- 12 032189

Таблица 1. Анализ единичных аминокислотных замещений в 2А8

2А8 варианты НС 831Р	11ΤΕΡΙ вариант/дикого типа 3.6	погрешность 0.5	гпТЕР вариант/дикоготипа 2.4	I погрешность 0.3
НС 83IV	9.7	1.1	7.4	4.1
НС 63 ЗК	1.8	0.2	0.7	0.1
НС 63 ЗР	5.1	0.6	2.9	0.4
НС 83 5Ь	1.7	0.1	1.5	0.2
НС 83 5ϋ	4.3	0.6	2.6	0.6
НС 15 Ю	3.9	0.3	1.4	0.2
НС 151Е	7.3	0.6	0.7	0.1
НС 854Е	6.5	0.6	3.1	0.6
НС 854Ώ	1.7	0.2	1.2	0.2
НС 855А НС 855К	2.0 4.4	0.3 1.1	1.2 2.1	0.2 0.3
НС К99У	7.5	0.9	3.9	0.5
НС К99И	13.5	1.4	10.8	2.8
НС Ε104Υ	2.0	0.3	1.5	0.2
ИС Α32Ν	3.5	0.4	2.0	0.3
ИС Υ48Ε	4.6	0.6	3.2	0.7
ЬС N5IV	4.4	0.4	2.0	0.4
ИС N526	3.4	0.5	1.5	0.2
ИС Р54Ь	5.3	0.8	2.7	0.5
ИС ϋ91Ε	4.2	0.3	1.6	0.5
ИС ϋ91Κ	3.1	0.5	2.0	0.3
ИС ϋ91\ν	7.4	0.7	4.0	0.7
ИС ϋ91Κ	3.5	0.4	1.4	0.2
ЬС Ώ928	3.8	0.5	2.6	0.3
ИС ϋ92Τ	2.6	0.4	1.2	0.2
ЬС У966	3.2	0.4	1.2	0.2
ИС У96М	3.5	0.5	1.5	0.2
ИС У96\¥	4.0	0.4	4.3	0.6
	11ΤΕΡΙ	Π1ΤΕΡΙ
2А8 варианты	вариант/дикого - типа	погрешность	вариант/дикого- типа	погрешность
НС 831Р	3.6	0.5	2.4	0.3
НС 83IV	9.7	1.1	7.4	4.1
НС 63 ЗК	1.8	0.2	0.7	0.1
НС 63 ЗР	5.1	0.6	2.9	0.4
НС 83 5Ь	1.7	0.1	1.5	0.2
НС 8350	4.3	0.6	2.6	0.6
НС 15 Ю	3.9	0.3	1.4	0.2
НС 151Е	7.3	0.6	0.7	0.1
НС 854Е	6.5	0.6	3.1	0.6
НС 8540	1.7	0.2	1.2	0.2
НС 855А	2.0	0.3	1.2	0.2
НС 855К.	4.4	1.1	2.1	0.3
НС К99У	7.5	0.9	3.9	0.5
НС К99Ь	13.5	1.4	10.8	2.8
НС Ε104Υ	2.0	0.3	1.5	0.2
ИС Α32Ν	3.5	0.4	2.0	0.3
ИС Υ48Ε	4.6	0.6	3.2	0.7
ЬС N5IV	4.4	0.4	2.0	0.4
ИС N526	3.4	0.5	1.5	0.2
ИС Р54Ь	5.3	0.8	2.7	0.5
ИС О91И	4.2	0.3	1.6	0.5
ЬС Ώ91Κ	3.1	0.5	2.0	0.3
ЬС ϋ91\ν	7.4	0.7	4.0	0.7
ЬС Ώ91Κ	3.5	0.4	1.4	0.2
ЬС Ώ928	3.8	0.5	2.6	0.3
ЬС Ώ92Τ	2.6	0.4	1.2	0.2
ЬС У966	3.2	0.4	1.2	0.2
ЬС У96М	3.5	0.5	1.5	0.2
ЬС У96№	4.0	0.4	4.3	0.6

- 13 032189

В табл. 2 приведены несколько примеров комбинированных аминокислотных замен в 2А8 ΤΡΡΙ антителах. В связи с тем, что в табл. 2 приведены не все возможные комбинации, предполагается, что ΤΡΡΙ антитело может содержать любую комбинацию предоставленных модификаций. Для количественного определения уровня экспрессии вариантов (по четыре) применялся иммуноферментный анализ (ЕЫ8Л). Если не указано иное, варианты нормализировали до соответствующего уровня экспрессии, и был проведен анализ эффективности воздействия антител (по четыре) путем конкурентного иммуноферментного анализа ΤΡΡΙ человека и мыши, после чего были определены соотношения между эффективностью воздействия вариантных антител и эталонных антител (НС_К99Е). Значения помечены знаком #, в случае если эффективность варианта анализировалась без предварительной нормализации и отношения вариантэталон были нормализованы до уровня экспрессии путем деления сигнала анализа на уровень экспрессии. В случаях, когда для конкурентного иммунологического анализа ΕΕΙ8Ά использовался другой эталон, и варианты анализировались без предварительной нормализации, значения помечены знаком Для этих вариантов, указанное в таблице значение было получено путем умножения отношения вариант/альтернативный эталон на отношение альтернативный эталон/НС_ К99Р. Расчет погрешностей производился путем распространения ошибки от стандартных отклонений.

- 14 032189

ϋ

Η

ь

Е

V

А

νν

18.6*

5.0

18.2*

6.8

ϋ

Η

ь

Е

V

νν

8

23.9*

6.3

22.8*

7.6

ϋ

Η

ь

Е

V

νν

8

17.0*

4.0

16.5*

5.9

ϋ

Η

ь

Е

V

νν

Т

22.8*

6.4

19.9*

8.0

ϋ

Η

ь

Е

V

νν

V

15.7*

3.9

13.7*

5.1

ϋ

Η

ь

Е

V

А

νν

8

8

Т

А

10.9*

3.1

9.0*

4.0

Е

ϋ

Η

ь

Е

V

νν

20.9*

5.3

20.3*

7.4

5

ϋ

Η

ь

Е

V

νν

17.9*

4.5

19.1*

6.9

А

ϋ

Η

ь

Е

V

νν

16.0*

3.6

14.7*

5.2

1

ϋ

Η

ь

Е

V

νν

19.6*

4.9

18.1*

6.8

К

ϋ

Η

ь

Е

V

νν

11.2*

2.8

11.6*

4.1

ϋ

Α

Η

ь

Е

V

νν

10.9*

2.8

12.6*

4.4

ϋ

5

Η

ь

Е

V

νν

10.1*

2.7

7.9*

2.7

ϋ

Η

С

ь

Е

V

νν

21.4*

5.2

18.7*

7.2

Е

5

ϋ

Η

С

ь

5

Υ

8

т

Р

к

Е

V

М

А

νν

8

8

т

18.3*

4.6

13.3*

4.3

Е

5

ϋ

Η

С

ь

Е

V

νν

11.9*

2.1

9.3*

2.9

ϋ

Η

ь

5

Υ

8

т

Р

к

Е

V

М

А

νν

8

8

т

21.4*

3.6

16.8*

5.8

Е

5

ϋ

Η

С

ь

5

Υ

8

т

Р

Е

V

М

А

νν

8

8

т

18.8*

4.4

12.3*

3.5

Е

5

ϋ

Η

С

ь

5

Υ

8

т

Р

к

Е

V

М

νν

19.8*

3.3

15.5*

4.8

Е

5

ϋ

Η

С

ь

5

Υ

8

т

Р

Е

V

М

νν

18.7*

3.4

15.1*

4.6

ϋ

ь

Е

8

ь

νν

19.9*

4.0

20.3*

5.7

ϋ

ь

Е

А

ь

νν

4.4*

1.3

6.1*

1.7

ϋ

ь

Е

ь

8

νν

20.7*

4.1

20.5*

6.7

ϋ

ь

Е

ь

8

νν

14.2*

2.7

15.6*

4.2

ϋ

ь

Е

ь

т

νν

18.6*

4.0

19.3*

5.4

ϋ

ь

Е

ь

V

νν

10.2*

2.1

13.6*

4.6

ϋ

Α

ь

Е

ь

νν

4.0*

0.9

4.6*

1.3

ϋ

5

ь

Е

ь

νν

3.9*

1.2

3.0*

1.0

ϋ

С

ь

Е

ь

νν

18.1*

4.3

18.2*

5.8

ϋ

С

ь

Е

ь

νν

17.8*

4.2

16.9*

5.0

Е

5

ϋ

С

С

ь

Е

ь

νν

13.6*

2.8

10.6*

3.6

5

V

ϋ

Η

V

Е

ь

νν

13.5*

2.8

6.5*

3.3

V

А

ϋ

Η

V

Е

ь

νν

9.0*

2.0

4.7*

2.3

V

Α

ϋ

Η

V

Е

ь

νν

16.6*

3.8

9.3*

4.3

V

ϋ

5

Η

V

Е

ь

νν

11.7*

2.9

7.9*

4.6

V

ϋ

Η

С

V

Е

ь

νν

16.2*

3.9

12.1*

6.0

Е

V

Α

ϋ

Η

С

V

Е

ь

νν

12.1*

2.8

7.7*

3.8

V

ϋ

Η

V

5

Υ

8

т

Р

к

Е

К

8

М

ь

8

т

νν

2.2*

0.9

2.4*

1.4

Е

V

Α

ϋ

к

С

V

δ

Υ

δ

т

Р

к

Е

δ

М

ь

δ

т

νν

11.4*

2.7

7.1*

3.6

Е

V

Α

ϋ

Η

С

V

8

Υ

8

т

Р

к

Е

М

ь

8

т

νν

9.8*

2.5

5.9*

2.0

V

ϋ

Η

V

8

Υ

8

т

Р

к

Е

8

М

ь

8

т

νν

19.6*

3.5

21.4*

9.6

V

ϋ

Η

V

8

Υ

8

т

Р

к

Е

М

ь

8

т

νν

18.0*

4.9

15.4*

7.6

В табл. 3 приведены несколько примеров единичных и/или двойных аминокислотных замен в тяжелой и легкой цепи 4В7. Для количественного определения уровня экспрессии вариантов (по четыре) применялся иммуноферментный анализ (ЕЫ8А). После нормализации до соответствующего уровня экспрессии. был проведен анализ эффективности воздействия антител (по четыре) путем конкурентного иммуноферментного анализа на ΤΡΡΙ человека и путем неконкурентного иммуноферментного анализа на ΤΡΡΙ мыши. после чего были определены соотношения между эффективностью воздействия вариантных антител и антител дикого типа. Расчет погрешностей производился путем распространения ошибки от стандартных отклонений.

- 15 032189

Таблица 3. Анализ единичных и двойных аминокислотных замещений в 4В7

	11ΤΡΡΙ	тТРР!
4В7 варианты	вариантЛуйй(уре	погрешность	вариант/ννίΐά(уре	погрешность
НС Ν32Ό	3.8	0.7	6.0	2.9
НС Ν32Ε	3.2	1.0	2.1	0.3
НС 8336	1.5	0.3	6.5	1.2
НС 857К	1.7	0.4	6.5	1.1
НС 857Р	2.0	0.4	6.6	1.4
НС Ό62Ι	9.8	1.6	44.4	11.6
НС Ό62Κ	32.3	4.5	230.2	34.1
НС О62Ь	6.8	1.2	22.9	6.1
НС 0620	20.6	2.8	142.5	28.0
НС 0628	29.3	4.3	146.5	40.4
НС Η103ϋ	2.4	0.4	12.9	2.0
НС Н1036	1.4	0.3	10.7	2.0
НС Υ112Ό	2.9	0.6	5.7	1.3
ЬС 832К	4.2	0.7	7.8	1.5
ЬС 832Υ	2.0	0.4	6.7	1.2
ЬС Ό33Ρ	5.3	1.3	7.0	2.6
ЬС Ό33Κ	3.6	0.7	7.2	1.9
ЬС N351	3.6	0.7	7.1	1.5
ЬС Ν35Ε	2.1	1.0	6.0	1.3
ЬС Ν35Τ	5.4	1.0	3.4	1.1
ЬС Υ37Ρ	3.6	0.7	1.9	0.6
ЬС 857Υ	1.6	0.4	2.2	0.4
ЬС 861С	3.1	0.5	15.3	4.2
ЬС Ό97Μ	2.4	0.5	1.3	0.4
ЬС Ό97Τ	1.8	0.3	5.5	1.6
НС N616	2.2	0.5	1.4	0.3
НС О62У	31.9	5.6	95.0	20.4
НС Ό62Ν	52.3	9.5	146.4	28.9
НС Н107М	8.1	1.6	5.6	1.7
ЬС Ρ31Ι	9.1	2.1	23.6	4.3
ЬС Р31М	1.7	0.4	1.3	0.4
ЬС Н35УЬС 6560	1.9	0.4	8.2	1.7
ЬС Ν35ΕΕΟ 656А	3.1	0.7	6.9	1.6
ЬС ОЗЗРЬС Υ54Ρ	4.3	0.9	7.9	1.9
НС 830КНС 857К	1.6	0.3	6.6	1.1
НС N616 НС ϋ62V	8.0	1.1	31.1	9.1
НС Н107МЬС Ρ31Ι	3.7	0.7	9.2	2.7
НС 6109АЬС Ό33Κ	3.8	0.6	8.0	1.3
НС Ν6ΠΈ0 6167С	2.8	0.4	6.4	1.6
НС К58М НС Ό62Ν	6.6	1.2	15.2	4.5

В табл. 4 приведены несколько примеров комбинаций аминокислотных замен в 4В7 ΤΕΡΙ антителах. В связи с тем, что в табл. 4 приведены не все возможные комбинации, предполагается, что ΤΕΡΙ антитело может содержать любую комбинацию предоставленных модификаций. Для количественного определения уровня экспрессии вариантов (по четыре) применялся иммуноферментный анализ (ΕΕΙΒΑ). Если не указано иное, варианты нормализировали до соответствующего уровня экспрессии, и был проведен анализ эффективности воздействия антител (по четыре) путем конкурентного иммуноферментного анализа на ΤΕΡΙ человека и мыши, после чего были определены соотношения между эффективностью воздействия вариантных антител и эталонных антител (НС О62Е). В случаях, когда использовался другой эталон, и варианты анализировались без предварительной нормализации, значения помечены знаком *. Для этих вариантов, указанное в таблице значение было получено путем умножения отношения вариант/альтернативный эталон на отношение альтернативный эталон/НС_О62К. Расчет погрешностей производился путем распространения ошибки от стандартных отклонений, пЬ - при используемых условиях анализа связывания не обнаружено.

- 16 032189

Клетки осаждали центрифугированием при 9000 об./мин в течение 30 мин при температуре 4°С и хранили при температуре -20°С. Супернатант заменили на буфер А (50 мМ №Н₂РО₄, 300 мМ №С1, 10 мМ имидазола рН8.0), концентрировали и очистили с использованием двухэтапной процедуры очистки. Вкратце, 100 мл концентрированного супернатанта загрузили на 5 мл Νΐ-ΝΤΑ спин-колонки (Р1а§еи, 1018142) и промыли, сперва, 5х объемами колонки буфера А, а затем 5х объемами колонки 4,3% буфера В (50 мМ №Н₂РО₄, 300 мМ №С1, 250 мМ имидазола рН8.0) и элюировали 7 объемами буфера В. Фракции комбинируются и диализируют в РВ8. На втором этапе очистки, антитела, очищенные с помощью, Νΐ-ΝΤΑ инкубировали с аффинной матрицей, специфичной для легкой цепи, то есть, с захватом и выбором лямбда или каппа (ВАС 0849.010 и ВАС 0833.10, соответственно) для 2А8 и 4В7, соответственно. После инкубирования в течение ночи при температуре 4°С матрицу загрузили в колонку, промыли 5 пятью объемами РВ8, 5 пятью объемами 500 мМ аргинина 100 мМ №Н₂РО₄, 100 мМ \аС1 рН6,0, а затем снова 5 пятью объемами РВ8. Антитела элюировали 6 объемами 100 мМ глицина рН3.0, а затем 3 объемами 100 мМ глицина рН2.0 в 1/10 общего объема 1М НЕРЕ8 рН 7.5 для нейтрализации элюата. В завершение, элюаты диализированы в РВ8 в течение ночи при температуре 4°С. Очищенные антитела анализировали с помощью метода электрофореза в полиакриламидном геле 8Э8-РАОЕ и массспектрометрии.

- 17 032189

Пример 5. Измерение аффинности связывания ΤΕΡΙ антителом с использованием поверхностного плазмонного резонанса (^а^ге)

Для анализа на поверхности были иммобилизованы ΤΕΡΙ человека или мыши. Для иммобилизации лиганда, в соответствии с инструкциями производителя, использовались сенсорные чипы СМ5 и аминный набор для иммобилизации (СЕ НеаНИСаге). Количество иммобилизованного ΤΕΡΙ составляло, приблизительно, 70 КИ для адаптации к массе антитела, которое может генерировать КМах из 100 КП. Исходные антитела и анти-ΤΕΡΙ антитела с развившейся аффинностью находились в подвижной фазе. Производилось определение аффинности, по меньшей мере, пяти различных концентраций (0,1, 0,4, 1,6, 6,4 и 25 нМ) очищенных антител.

С помощью анализа вариантов антител, содержащих единичные мутации в областях СЭК, нами было идентифицировано большое количество клонов с более высоким сигналом при проведении иммуноферментного анализа связывания (ЕЫ8А). Выбранные клоны были очищены, был проведен анализ их аффинности к ΤΕΡΙ человека или мыши с использованием Виссше. Как показано в табл. 5 и 6, эти клоны имеют более высокую аффинность к ΤΕΡΙ, чем исходные антитела 2А8 или 4В7. Хотя некоторые 2А8 мутанты имеют более низкую скорость ассоциации (ка) чем исходное антитело 2А8, все эти мутанты имеют гораздо более низкую скорость диссоциации (кб), чем 2А8. В целом, эти единичные мутации увеличили аффинность 2А8 в 1,47 - 7,22 раз, при использовании человеческого ΤΕΡΙ, и в 1,71 - 7,20 раз при использовании мышиного ΤΕΡΙ. При проведении нами анализа 4В7 вариантов, мутация Э62К в СТЖ2 домене тяжелой цепи имела существенно увеличенный сигнал. Этот клон был выбран для определения аффинности. Как показано в табл. 5 и табл. 6, эта единичная мутация увеличивает аффинность 4В7 к ΤΕΡΙ человека с 11,1 нМ до 58,2 нМ, то есть в 191 раз. Низкая скорость диссоциации (кб) 4В7НсЭ62К в основном способствует улучшению аффинности, с 8,40х10'³/с (4В7) до 1,65х10'⁴ (4В7НсО62К), то есть, приблизительно, в 50 раз. Подобным образом, эта мутация увеличивает аффинность 4В7 к мышиному ΤΕΡΙ с 58,6 до 427 нМ, то есть в 137 раз.

Таблица 5. Аффинность выбранных 2А8 или 4В7 вариантов (единичная мутация) к _________________________человеческому ΤΕΡΙ_____________________ ка

Образец	Клон	(1/Мсек)	1«] (1/сек.)	КБ (М)	Улучшение
2А8-1	НСДЗЗЗР	2.71Е+06	2.24Е-03	8.27Е-10	2.70
2А8-2	НС831Р	2.91Е+06	З.ЗЗЕ-ОЗ	1.15Е-09	1.95
2А8-3	НС831У	3.84Е+06	1.43Е-03	3.73Е-10	6.00
2А8-4	ΗΟ_835ϋ	4.01Е+06	3.80Е-03	9.50Е-10	2.35
2А8-6	НС151Е	1.29Е+06	1.62Е-03	1.26Е-09	1.78
2А8-7	НС 854Р	2.81Е+06	2.04Е-03	7.27Е-10	3.08
2А8-8	НС 855Я	4.30Е+06	3.94Е-03	9.17Е-10	2.44
2А8-9	НСК99Б	2.60Е+06	8.03Е-04	3.09Е-10	7.22
2А8-10	НСК99У	2.55Е+06	2.54Е-03	9.95Е-10	2.25
2А8-11	ΕΟ_Α32Ν	2.70Е+06	4.10Е-03	1.52Е-09	1.47
2А8-12	НС15Ю	3.61Е+06	4.95Е-03	1.37Е-09	1.63
2А8-13	ЬС_Ы51У	4.26Е+06	2.20Е-03	5.18Е-10	4.32
2А8-14	ЬС_У48Р	2.64Е+06	З.ООЕ-ОЗ	1.14Е-09	1.97
2А8-15	БСО91К	4.33Е+06	2.09Е-03	4.82Е-10	4.64
2А8-16	ЬС_О91Ь	4.41Е+06	4.40Е-03	9.99Е-10	2.24
2А8-17	ЬС_О91А	3.86Е+06	4.32Е-03	1.12Е-09	2.00
2А8-20	2А8зП	3.13Е+06	7.00Е-03	2.24Е-09	1.00
4В7НсО62К	НСО62Я	2.83Е+06	1.65Е-04	5.82Е-11	190.83
4В7	4В7-М	7.56Е+05	8.40Е-03	1.11Е-08	1.00

- 18 032189

Таблица 6. Аффинность выбранных 2А8 и 4В7 вариантов (единичная мутация) к мышиному ТЕРТ

Образец	Клон	ка (1/Мсек)	1«! (1/сек.)	КО(М)	Улучшение
2А8-1	НС_633Р	9.12Е+05	1.45Е-03	1.59Е-09	2.21
2А8-2	НС831Р	1.53Е+06	3.16Е-03	2.06Е-09	1.71
2А8-3	НС_831У	3.39Е+06	2.02Е-03	5.95Е-10	5.91
2А8-4	НС 835О	1.25Е+06	2.46Е-03	1.98Е-09	1.78
2А8-7	НС 854Е	8.84Е+05	1.83Е-03	2.07Е-09	1.69
2А8-9	НС_К99Ь	1.56Е+06	7.59Е-04	4.88Е-10	7.20
2А8-17	ЬС_О91№	2.86Е+06	2.32Е-03	8.14Е-10	4.32
2А8\\1	2А8\\1	1.47Е+06	5.17Е-03	3.51Е-09	1.00
4Β7ΗοΌ62Κ	НСО62В.	8.58Е+06	3.67Е-03	4.27Е-10	137.00
4В7\\1	4В7\\1	2.18Е+06	1.28Е-01	5.86Е-08	1.00

Затем была исследованна связывающая аффинность множественных мутаций в 2А8 и 4В7. Как показано в табл. 7(а) и табл. 8(а), мутанты 2А8, которые содержат множественные мутации в СЭК доменах, имеют более высокую аффинность, чем единично мутированные 2А8, как при связывании ТЕРТ человека, так и мышиного ТЕРТ. Например, 2А8-200 имеет в 53,7 раз более высокую аффинность, чем 2А8 при связывании ТЕРТ человека, и в 55,4 раз более высокую аффинность при связывании ТЕРТ мыши. Как показано в табл. 7(Ь) и табл. 8(Ь), мутанты 4В7, которые содержат множественные мутации в СЭК доменах, имеют более высокую аффинность, чем единично мутированные 4В7, как при связывании ТЕРТ человека, так и мышиного ТЕРТ. Эти варианты из исходных последовательностей 2А8 и 4В7, приведенные в табл. 7 и 8, также приведены в перечне последовательностей. 8Ер П) N0: 5-11 соответствуют вариантам тяжелой цепи 2А8, список которых приведен в табл. 7 и 8. 8Ер П) N0: 12-18 соответствуют вариантам легкой цепи 2А8. 8Ер П) N0: 19-26 соответствуют вариантам тяжелой цепи 4В7, список которых приведен в табл. 7 и 8. 8Ер П) N0: 27-34 соответствуют вариантам легкой цепи 4В7.

Таблица 7(а). Аффинность выбранных 2А8 вариантов (множественные мутации) к ТЕРТ человека

V ϋ

В

V ε

γ ε

τ

Ρ к

1= ε

м ΐε τ

νν 1.45Ε+06

5.29Е-05

3.80Е-03

3.65Е-11

1.85Е-09

50.7

2А8-д200

2А8-д216

2А8М

Таблица 7(Ь). Аффинность выбранных 4В7 вариантов (множественные мутации) к ТЕРТ человека

2.05Ε+06

О <о а. га и =г 3

4В7 НС

4Β7 1.С

5 2 ο α.

--- ο φ *

ο Η -

Л Η χ о Φ >-, С >-,

а

N32

δ

2

ϋ62

Υ112

ω

2

Ζ

097

В18.5

ϋ

0

ϋ

1

Ε

1

1 23Ε+06

3.18Ε-05

2.60Ε-11

428.2

В2.0

ϋ

Β

ϋ

Β

Ε

1

τ

7.46Ε+06

3.81Ε-05

5.10Ε-12

2177.8

В27.1

ϋ

Ρ

ϋ

τ

τ

2.78Ε+06

3.53Ε-05

1.27Ε-11

874.9

В32.5

Β

ϋ

Ε

1

2.15Ε+06

3.19Ε-05

1.48Ε-11

748.7

В41.2

ϋ

Β

ϋ

Β

Ε

1

3.46Ε+06

2.47Ε-05

7.16Ε-12

1552.7

В9.7

ϋ

Β

ϋ

Β

1

2.97Ε+06

2.61Ε-05

8.78Ε-12

1266.2

ЯВ9.7

Е

ϋ

ε

Υ

Β

ϋ

Β

1

9.38Ε+05

9.55Ε-06

1.02Ε-11

1091.5

дВ9.7-1д<3

ϋ

3

Υ

Β

ϋ

Β

1

2.03Ε+06

1.56Ε-05

7.65Ε-12

1450.9

4В7

7.56Ε+05

8.40Ε-03

1.11Ε-08

1

- 19 032189

Таблица 8(Ь). Аффинность выбранных 4В7 вариантов (множественные мутации) к ΤΕΡI мыши

Для того, чтобы определить улучшилась ли эффективность анти-ΤΕΡI антител с улучшенной аффинностью при восстановлении активности ЕХа путем блокирования подавляющего действия белка ТЕРЦ нами был проведен также анализ восстановления ЕХа. При проведении этого анализа, различное указанное количество отдельных антител с улучшенной аффинностью (30 мкл) инкубировалось с определенным количеством человеческого, мышиного или крысиного рекомбинантного ΤΕΡI (20 мкл, 6,6 нМ) в общем объеме реакционной смеси 50 мкл в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубации 50 мкл ЕХа (3,39 нМ) были добавлены к реакционной смеси и инкубированы при температуре 37°С в течение 30 мин. Затем, к реакционной смеси были добавлены 20 мкл субстрата 8рес1гогуте ЕХа. После инкубирования в течение 12 мин измерялся коэффициент поглощения каждой лунки при 405 нм с использованием планшет-ридера (Мо1еси1аг Эеуще). Для каждого опыта была получена линейная стандартная кривая такого же количества ЕХа (3,9 нМ), ингибируемого известными количествами ТЕР! Активность ЕХа, восстановленная на 100%, определялась как активность ЕХа, без добавления какого-либо количества ТЕРЦ а активность, восстановленная на 0%, определялась как активность ЕХа в присутствии белка ΤΕΡI (6,6 нМ). Для каждого отдельного анти-ΤΕΡI антитела был произведен расчет концентрации с половинной эффективностью подавления (Юе), некоторые результаты расчетов приведены в табл. 9. Для выбранных на второй стадии 2А8 вариантов был произведен расчет концентрации с половинной эффективностью (ЕС₅₀), результаты расчетов приведены в табл. 10.

- 20 032189

Таблица 9. 1С₅₀ и улучшение эффективности для выбранных анти-ΤΡΡΙ антител с единичными аминокислотными заменами, с использованием анализа восстановления РХа по сравнению с исходными антителами 2А8 и 4В7 соответственно

Образец	1С 50
Клон	(мкг/мл)	Улучшение
2А8-2	НС831Р	0.33	1.7
2А8-3	НС831У	0.201	3.5
2А8-4	НС 835Р	0.55	1.1
2А8-6	НС151Е	0.76	0.9
2А8-7	НС 854Е	0.35	2.0
2А8-9	НС_К99Ь	0.181	3.9
2А8-10	НСК99У	0.39	1.6
2А8-14	ЬС_У48Е	0.34	1.9
2А8-15	ЬС_Р91К	0.34	1.9
2А8-16	ЕС_Р91Ь	0.37	1.7
2А8-17	ЬС_Р91Х¥	0.23	3.0
2А8-20	2Α8\νΙ	0.70	1.0
4В7НсР62К	НСР62К	0.058	25
4В7	4В7зИ	1.46	1.0

Таблица 10. ЕС₅₀ и улучшение эффективности для выбранных анти-ΤΡΡΙ антител с множественными аминокислотным и заменами по сравнению с исходным антителом 2А8 2А8НС 2А8 ЬС

ЕС50

Образцы 831 835 151 855 К99 Υ48 N51 656 Р91 У96 (нМ) Улучшение

2А8-127	Р	Е	Е	V	Р	XV	0.44	18.2
2А8-143	Р	к	Ь	Г	V	ь	XV	0.50	15.8
2А8-200	Р	к	Ь	Г	V	XV		0.81	9.7
2А8-216 V	Р	я	V	Г		ь	XV	1.08	7.3
2А8-9			ъ					1.00	7.9
2Α8\νΙ								7.91	1.00

Пример 7. Антитела с улучшенной аффинностью по результатам анализа 6ΡΤ, которые проявили большую эффективность при сокращении времени свертывания крови

Для того, чтобы определить улучшилась ли эффективность антител с улучшенной аффинностью при сокращении времени свертывания, был проведен анализ 6ΡΤ, с помощью которого определялась эффективность воздействия выбранных антител с улучшенной аффинностью при сокращении времени свертывания с использованием человеческой гемофильной А плазмы. Анализ 6ΡΤ был проведен способом, существенно не отличающимся от способа, описанного в работе ШсЕсН е! а1. (ΤЬ^отЬо8^8 Кез., 1991, 64(2): 213-222). Вкратце, человеческая гемофильная А плазма (Оеогде Κίπ§ ВютеФеа1) готовится следующим образом: плазма смешивается с 0,1 объема контрольного буфера (в качестве негативного контроля) или с указанными анти-ΤΡΡΙ антителами. После инкубирования в течение 30 мин при температуре 25°С, каждый из приготовленных образцов плазмы (100 мкл) соединяют с 100 мкл соответствующим образом растворенного 81тр1а811п (ВютеВеих) (раствор 1:500), в качестве источника тробопластина, а также с 100 мкл 25 мМ хлорида кальция. Время свертывания было определено при помощи фиброметра 8ΤΑ4 (8!адо) непосредственно после добавления хлорида кальция.

Пример 8. Антитела с улучшенной аффинностью, которые проявили большую эффективность при сокращении времени свертывания человеческой гемофильной А крови с введенным анти-фактор УШ антителом

Для того чтобы определить, улучшилась ли эффективность антител с улучшенной аффинностью при сокращении времени свертывания, нами использовалась система ΚΟΤΕΜ для проведения тестирования воздействия этих антител на время свертывания РУШ-нейтрализующей гемофильной А крови человека с введенными антителами, которая имитирует кровь пациентов, больных гемофилией А, с ингибиторами. Система ΚΟΤΕΜ ^^арИагт ОтЬН) включает четырехканальное устройство, компьютер, стандарты плазмы, активаторы, а также чашки и иголки одноразового употребления. Параметры тромбэластографии системы ΚΟΤΕΜ для гемостаза включают время свертывания (СТ), которое отражает время реакции (время, требующееся для того, чтобы получить амплитуду 2 мм после начала сбора данных), необходимое для инициации коагуляции, время тромбообразования (СР^ и угол альфа для отображения распространения коагуляции, и максимальная амплитуда и максимальный модуль упругости для отображения ригидности сгустка. В анализе с использованием ΚΟΤΕΜ, 300 мкл свежевзятой цитратной цельной крови, в которой активность РУШ была нейтрализована путем добавления поликлональных ан

- 21 032189 тител к ЕУ111, использовалось для тестирования эффективности воздействия анти-ТЕР1 антител с улучшенной аффинностью по сравнению с исходными анти-ТЕР1 антителами. Все компоненты растворялись и смешивались в соответствии с инструкциями производителя, сбор данных происходил в течение требующегося для каждой системы периода времени. Вкратце, образцы перемешивались путем забора и помещения 300 мкл крови или плазмы с помощью автоматизированной пипетки в чашки К0ТЕМ 20 мкл СаС12 (200 ммоль), непосредственно после этого образец перемешивался, и начинался сбор данных. Данные собирались в течение 2 ч с использованием компьютерной системы (версия 2.96) К0ТЕМ.

На фиг. 2 и 3 приведен пример результата анализа, проведенного с использованием К0ТЕМ, для определения эффективности анти-ТЕР1 антител с улучшенной аффинностью для сокращения время свертывания. На фиг. 2 показана эффективность выбранных на первой стадии анализа анти-ТЕР1 антител с развившейся аффинностью для сокращения времени свертывания гемофильной крови человека с индуцированным антителом. Антитела с существенно улучшенной аффинностью, 2А8-9 и 2А8-17, проявляют существенно большую эффективность при сокращении времени свертывания крови гемофильной А крови человека с индуцированным антителом, в то время как 2А8-10, связывающая аффинность к ТЕР1 которых не улучшилась, сохранили такую же эффективность при свертывании крови, как и исходное 2А8 антитело.

Пример 9. Антитела с улучшенной аффинностью, которые проявили улучшенный уровень выживаемости в модели рассечения хвостовой вены мышей, больных гемофилией А

Для того, чтобы определить, имеют ли антитела большую эффективность при сворачивании крови мышей, использовалась модель рассечения хвостовой вены мышей, больных гемофилией А. Через хвостовую вену мышам были введены дозы указанных количеств исходного анти-ТЕР1 антитела 2А8 или указанных количеств А200 за 24 ч до нанесения мышам повреждений. По прошествии 24 ч после введения дозы препарата, было проведено рассечение левой хвостовой вены на расстоянии 2,7 мм от кончика (поперечное). По прошествии 24 ч после рассечения была произведена оценка выживаемости. Выяснилось, что уровень выживаемости имеет зависимость от дозировки при введении с рекомбинантным ЕУШ (10 ιυ/кг - 30 ιυ/кг).

Фиг. 2 демонстрирует, что выбранное антитело А200 с улучшенной аффинностью в значительной степени увеличило выживаемость мышей, больных гемофилией А (в соответствии с введенными дозами препарата), по сравнению с 1дС1 контрольной мышью (СТХ 1дС 1) и проявило лучший уровень выживаемости, чем исходное антитело 2А8 (при одинаковых дозах введения).

Пример 10. Антитела с улучшенной аффинностью, которые проявили улучшенную коагуляцию при использовании гемофильной С (с недостатком ЕХ1) плазмы человека

Также, с помощью системы К0ТЕМ был проведен анализ, в ходе которого тестировалась эффективность воздействия антител на время свертывания крови, с использованием человеческой плазмы с дефицитом фактора XI (ЕХ1-недостаточной плазмы), которая имитирует плазму пациентов, больных гемофилией С. На фиг. 5 приведен результат анализа, проведенного с использованием К0ТЕМ, для определения эффективности анти-ТЕР1 антител с улучшенной аффинностью для сокращения время свертывания. На фиг. 5 изображена диаграмма, которая демонстрирует, что, в результате применения 2А8 варианта, 2А8-200, коагуляция гемофильной С плазмы человека улучшилась в зависимости от дозировки, и его эффективность является сопоставимой с эффективностью ЕУ11а, полученного рекомбинантными способами.

Так как настоящее изобретение описано в соответствии с конкретными примерами и вариантами осуществления, следует понимать, что изобретение оставляет возможность для различных модификаций, изменений, а также замены каких-либо элементов на эквивалентные, без отступления от существа и объема настоящего изобретения. Соответственно, необходимо также понимать, что описание изобретения и примеры служат в качестве иллюстрации, а не ограничительного условия. Кроме того, все статьи, книги, патентные заявки и патенты, на которые ссылается настоящий документ, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>	Байер ХельсКер ЛЛСи
<120>	Изолированные человеческие моноклональные антитела против ингибитора

пути тканевого фактора (ТЕРТ) и фармацевтическая композиция, содержащая их

<130>	ВНС 10 5 001 РСТ
<160>	34
<170>	РабепбТп чегзФоп 3.5

- 22 032189 <210> 1 <211> 117 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <400> 1

О1п Уа1 1

О1п

Ьеи

Уа1 5

О1и

Бег

О1у

О1у О1у Ьеи 10

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

А1а

Бег

О1у

Рке

ТЬг

Рке

Агд

Бег

Туг

20

25

30

О1у

МеЬ

Бег

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Бег

Бег

11е

Агд

О1у

Бег

Бег

Бег

Бег

ТЬг

Туг

Туг

А1а

Азр

Бег

Уа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

Рке

ТЬг

11е

Бег

Агд

Азр

Азп

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

МеЬ

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Ьуз

Туг

Агд

Туг

Тгр

Рке

Азр

Туг

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

<210> 2 <211> 108 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <400> 2

Азр 1

11е

О1и

Ьеи

ТЬг О1п 5

Рго

Рго

Бег

Уа1 10

Бег

Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЬг

А1а

Агд

11е

Бег

Суз

Бег

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Агд

Азп

Туг

Туг

А1а

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

11е

Туг

35

40

45

Туг

Азр

Азп

Азп

Агд

Рго

Бег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

Рке

Бег

О1у

Бег

50

55

60

Азп

Бег

О1у

Азп

ТЬг

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Бег

О1у

ТЬг

О1п

А1а

О1и

- 23 032189

Азр О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

5ег

Тгр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Рго

Уа1

85

90

95

РЪе О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

100

105

<210>

3

<211>

123

<212>

РКТ

<213>

Ното

зар1епз

<400>

3

О1п Уа1

О1п

Ьеи

О1п

О1п

5ег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

5ег

О1п

1

5

10

15

ТЪг Ьеи

5ег

Ьеи

ТЪг

Суз

А1а

11е

5ег

О1у

Азр

5ег

Уа1

5ег

5ег

Азп

20

25

30

5ег А1а

А1а

Тгр

5ег

Тгр

11е

Агд

О1п

5ег

Рго

О1у

Агд

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр Ьеи

О1у

11е

11е

Туг

Ьуз

Агд

5ег

Ьуз

Тгр

Туг

Азп

Азр

Туг

А1а

50

55

60

Уа1 5ег

Уа1

Ьуз

5ег

Агд

11е

ТЪг

11е

Азп

Рго

Азр

ТЪг

5ег

Ьуз

Азп

65

70

75

80

О1п РЪе

5ег

Ьеи

О1п

Ьеи

Азп

5ег

Уа1

ТЪг

Рго

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг Туг

Суз

А1а

Агд

Тгр

Н1з

5ег

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

О1у

РЪе

Азр

Туг

100

105

110

Тгр О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

5ег

115

120

<210>

4

<211>

114

<212>

РКТ

<213>

Ното

зар1епз

<400>

4

Азр 11е

Уа1

МеЬ

ТЪг

О1п

5ег

Рго

Ьеи

5ег

Ьеи

Рго

Уа1

ТЪг

Рго

О1у

1

5

10

15

О1и Рго

А1а

5ег

11е

5ег

Суз

Агд

5ег

5ег

О1п

5ег

Ьеи

Уа1

РЪе

5ег

25 30

- 24 032189

Азр О1у Азп ТЪг Туг 35

Ьеи

Азп Тгр 40

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго 45

О1у О1п

Вег

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

О1у

Вег

Азп

Агд

А1а

Вег

О1у

Ъа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЪе

Вег

О1у

Вег

О1у

Вег

О1у

ТЪг

Азр

РЪе

ТЪг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Вег

Агд

Ъа1

О1и

А1а

О1и

Азр

Ъа1

О1у

Ъа1

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

85

90

95

Азр

Вег

Туг

Рго

Ьеи

ТЪг

РЪе

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд ТЪг <210> 5 <211> 117 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 5

О1п 1

Ъа1

О1п Ьеи

Ъа1 5

О1и

Вег

О1у О1у О1у Ьеи 10

Ъа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Вег

Ьеи

Агд

Ьеи

Вег

Суз

А1а

А1а

Вег

О1у

РЪе

ТЪг

РЪе

Агд

Вег

Туг

20

25

30

О1у

МеЬ

Азр

Тгр

Ъа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Ъа1

35

40

45

Вег

Вег

11е

Агд

О1у

Вег

Вег

Вег

Вег

ТЪг

Туг

Туг

А1а

Азр

Вег

Ъа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

РЪе

ТЪг

11е

Вег

Агд

Азр

Азп

Вег

Ьуз

Азп

ТЪг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

МеЬ

Азп

Вег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Ъа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Ьеи

Туг

Агд

Туг

Тгр

РЪе

Азр

Туг

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

100

105

110

- 25 032189

Уа1 Ткг Уа1 Вег Вег

115

<210>	6
<211>	117
<212>	РВТ
<213>	Синтетическая
<220>
<223>	Вариант
<400>	6

О1п Уа1 1

О1п

Ьеи

Уа1 5

О1и

Вег

О1у

О1у О1у Ьеи 10

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Вег

Ьеи

Агд

Ьеи

Вег

Суз

А1а

А1а

Вег

О1у

РЪе

ТЪг

РЪе

Агд

Вег

Туг

20

25

30

О1у

МеЬ

Азр

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Вег

Вег

11е

Агд

О1у

Вег

Агд

Вег

Вег

ТЪг

Туг

Туг

А1а

Азр

Вег

Уа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

РЪе

ТЪг

11е

Вег

Агд

Азр

Азп

Вег

Ьуз

Азп

ТЪг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

МеЬ

Азп

Вег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Ьеи

Туг

Агд

Туг

Тгр

РЪе

Азр

Туг

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

100

105

110

Уа1

ТЪг

Уа1

Вег

Вег

115

<210> <211> <212> <213>	7 117 РВТ Синтетическая
<220> <223>	Вариант
<400>	7
О1п Уа1	О1п Ьеи Уа1 О1и Вег О1у
1	5

О1у О1у Ьеи Уа1 О1п Рго О1у О1у

15

Вег Ьеи Агд Ьеи Вег Суз А1а А1а

Вег О1у Рке ТЪг РЪе Агд Вег Туг

30

- 26 032189

О1у

Меб Азр 35

Тгр

Уа1

Агд О1п А1а 40

Рго О1у

Ьуз

О1у

Ьеи О1и 45

Тгр

Уа1

Бег

Бег

Т1е

Агд

О1у

Бег

Агд

Бег

Бег

ТЬг

Туг

Туг

А1а

Азр

Бег

Уа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

РЬе

ТЬг

Т1е

Бег

Агд

Азр

Азп

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Меб

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Ьеи

Туг

Агд

Туг

Тгр

РЬе

Азр

Туг

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

<210> 8 <211> 117 <212> РВТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 8

О1п 1

Уа1

О1п Ьеи

Уа1 5

О1и

Бег

О1у О1у О1у Ьеи 10

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

А1а

Бег

О1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Агд

Уа1

Туг

20

25

30

О1у

Меб

Бег

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Бег

Бег

Азр

Агд

О1у

Бег

Агд

Бег

Бег

ТЬг

Туг

Туг

А1а

Азр

Бег

Уа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

РЬе

ТЬг

Т1е

Бег

Агд

Азр

Азп

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

Меб

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Уа1

Туг

Агд

Туг

Тгр

РЬе

Азр

Туг

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

100

105

110

- 27 032189

Уа1 Ткг Уа1 Бег Бег

115

<210>	9
<211>	117
<212>	РКТ
<213>	Синтетическая
<220>
<223>	Вариант
<400>	9

О1п Уа1 1

О1п

Ьеи

Уа1 5

О1и

Бег

О1у

О1у О1у Ьеи 10

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

А1а

Бег

О1у

РЪе

ТЪг

РЪе

Агд

Бег

Туг

20

25

30

О1у

МеЬ

Азр

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Бег

Бег

11е

Агд

О1у

Бег

Бег

Бег

Бег

ТЪг

Туг

Туг

А1а

Азр

Бег

Уа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

РЪе

ТЪг

11е

Бег

Агд

Азр

Азп

Бег

Ьуз

Азп

ТЪг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

МеЬ

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Ьеи

Туг

Агд

Туг

Тгр

РЪе

Азр

Туг

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

100

105

110

Уа1

ТЪг

Уа1

Бег

Бег

115

<210> <211> <212> <213>	10 117 РКТ Синтетическая
<220> <223>	Вариант
<400>	10
О1и Уа1	О1п Ьеи Уа1 О1и Бег О1у
1	5

О1у О1у Ьеи Уа1 О1п Рго О1у О1у

15

Бег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а А1а

Бег О1у Рке ТЪг РЪе Бег Бег Туг

30

- 28 032189

О1у

МеЬ Азр 35

Тгр

Уа1

Агд О1п А1а 40

Рго О1у

Ьуз

О1у

Ьеи О1и 45

Тгр

Уа1

Бег

Бег

11е

Агд

О1у

Бег

Агд

О1у

Бег

ТЬг

Туг

Туг

А1а

Азр

Бег

Уа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Бег

Агд

Азр

Азп

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

МеЬ

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Ьеи

Туг

Агд

Туг

Тгр

РЬе

Азр

Туг

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

<210> 11 <211> 117 <212> РВТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 11

О1п 1

Уа1

О1п Ьеи

Уа1 5

О1и

Бег

О1у О1у О1у Ьеи 10

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

О1у

Бег

Ьеи

Агд

Ьеи

Бег

Суз

А1а

А1а

Бег

О1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Агд

Уа1

Туг

20

25

30

О1у

МеЬ

Бег

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Бег

Бег

Азр

Агд

О1у

Бег

Агд

Бег

Бег

ТЬг

Туг

Туг

А1а

Азр

Бег

Уа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Бег

Агд

Азр

Азп

Бег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

О1п

МеЬ

Азп

Бег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

Уа1

Туг

Агд

Туг

Тгр

РЬе

Азр

Туг

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

100

105

110

- 29 032189

Уа1 ТЪг Уа1 5ег 5ег

115 <210> 12 <211> 108 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 12

Азр 1

11е

О1и

Ьеи

ТЪг 5

О1п

Рго

Рго

5ег

Уа1 10

5ег

Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЪг

А1а

Агд

11е

5ег

Суз

5ег

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Агд

Азп

Туг

Туг

А1а

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

11е

РЪе

35

40

45

Туг

Азр

Уа1

Азп

Агд

Рго

5ег

Азр

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

5ег

О1у

5ег

50

55

60

Азп

5ег

О1у

Азп

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

5ег

О1у

ТЪг

О1п

А1а

О1и

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

5ег

Тгр

Азр

Азр

О1у

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

РЪе

О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

100

105

<210>

13

<211>

108

<212>

РКТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

13

Азр

11е

О1и

Ьеи

ТЪг

О1п

Рго

Рго

5ег

Уа1

5ег

Уа1

А1а

Рго

О1у

О1п

1

5

10

15

ТЪг

А1а

Агд

11е

5ег

Суз

5ег

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Агд

Азп

Туг

Туг

А1а

20

25

30

Нтз

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

11е

РЪе

40 45

- 30 032189

Туг Азр

Уа1

Азп

Агд

Рго

Бег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

50

55

60

Азп Бег

О1у

Азп

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Бег

О1у

ТЪг

О1п

А1а

О1и

65

70

75

80

Азр О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Бег

Тгр

Ьеи

Азр

О1у

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

РЪе О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

100

105

<210>

14

<211>

108

<212>

РКТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

14

Азр 11е

О1и

Ьеи

ТЪг

О1п

Рго

Рго

Бег

Уа1

Бег

Уа1

А1а

Рго

О1у

О1п

1

5

10

15

ТЪг А1а

Агд

11е

Бег

Суз

Бег

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Агд

Азп

Туг

Туг

А1а

20

25

30

Н1з Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

11е

РЪе

35

40

45

Туг Азр

Уа1

Азп

Агд

Рго

Бег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

50

55

60

Азп Бег

О1у

Азп

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Бег

О1у

ТЪг

О1п

А1а

О1и

65

70

75

80

Азр О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Бег

Тгр

Тгр

Азр

О1у

Уа1

Рго

Уа1

85

90

95

РЪе О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

100

105

<210>	15
<211>	108
<212>	РКТ
<213>	Синтетическая
<220>
<223>	Вариант

- 31 032189 <400> 15

Азр 1

11е

О1и

Ьеи

ТЬг 5

О1п

Рго

Рго

Вег

Уа1 10

Вег

Уа1

А1а

Рго

О1у 15

О1п

ТЬг

А1а

Агд

11е

Вег

Суз

Вег

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Агд

Азп

Туг

Туг

А1а

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

11е

РЬе

35

40

45

Туг

Азр

Азп

Азп

Агд

Рго

Вег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЬе

Вег

О1у

Вег

50

55

60

Азп

Вег

О1у

Азп

ТЬг

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Вег

О1у

ТЬг

О1п

А1а

О1и

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Вег

Тгр

Ьеи

Азр

О1у

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

РЬе

О1у

О1у

О1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

100

105

<210>

16

<211>

108

<212>

РВТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

16

Азр

11е

О1и

Ьеи

ТЬг

О1п

Рго

Рго

Вег

Уа1

Вег

Уа1

А1а

Рго

О1у

О1п

1

5

10

15

ТЬг

А1а

Агд

11е

Вег

Суз

Вег

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Агд

Азп

Туг

Туг

А1а

20

25

30

Н1з

Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

11е

РЬе

35

40

45

Туг

Азр

Азп

Азп

Агд

Рго

Вег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЬе

Вег

О1у

Вег

50

55

60

Азп

Вег

О1у

Азп

ТЬг

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Вег

О1у

ТЬг

О1п

А1а

О1и

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Вег

Тгр

Ьеи

Азр

О1у

Уа1

Рго

Тгр

85

90

95

- 32 032189

РЪе О1у О1у О1у ТЪг Ьуз Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи О1у О1п

100 105 <210> 17 <211> 108 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 17

Вег Туг

О1и

Ьеи

ТЪг

О1п

Рго

Рго

Вег

Уа1

Вег

Уа1

Вег

Рго

О1у

О1п

1

5

10

15

ТЪг А1а

Агд

11е

ТЪг

Суз

Вег

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Рго

Ьуз

Туг

Туг

А1а

20

25

30

Н1з Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

11е

РЪе

35

40

45

Туг Азр

Уа1

Азп

Агд

Рго

Вег

О1у

11е

Рго

О1и

Агд

РЪе

Вег

О1у

Вег

50

55

60

Азп Вег

О1у

Азп

ТЪг

А1а

ТЪг

Ьеи

ТЪг

11е

Вег

О1у

ТЪг

О1п

А1а

МеЕ

65

70

75

80

Азр О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

А1а

Тгр

Тгр

Вег

Вег

ТЪг

Рго

Уа1

85

90

95

РЪе О1у

О1у

О1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

ТЪг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

100

105

<210>

18

<211>

108

<212>

РКТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

18

Вег Туг

О1и

Ьеи

ТЪг

О1п

Рго

Рго

Вег

Уа1

Вег

Уа1

Вег

Рго

О1у

О1п

1

5

10

15

ТЪг А1а

Агд

11е

ТЪг

Суз

Вег

О1у

Азр

Азп

Ьеи

Рго

Ьуз

Туг

Туг

А1а

20

25

30

Н1з Тгр

Туг

О1п

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

А1а

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

11е

РЪе

- 33 032189

Туг

Азр 50

Вег Азп

Агд

Рго

Вег 55

О1у

11е

Рго

О1и

Агд 60

РЬе

Вег

О1у

Вег

Азп

Вег

О1у

Азп

ТЬг

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

11е

Вег

О1у

ТЬг

О1п

А1а

МеЬ

65

70

75

80

Азр

О1и

А1а

Азр

Туг

Туг

Суз

О1п

Вег

Тгр

Ьеи

Вег

О1у

ТЬг

Рго

Тгр

85

90

95

Рке

О1у

О1у

О1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

О1у

О1п

100

105

<210>

19

<211>

123

<212>

РВТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

19

О1п

Уа1

О1п

Ьеи

О1п

О1п

Вег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Вег

О1п

1

5

10

15

ТЬг

Ьеи

Вег

Ьеи

ТЬг

Суз

А1а

11е

Вег

О1у

Азр

Вег

Уа1

Вег

Вег

Азр

20

25

30

Вег

А1а

А1а

Тгр

Вег

Тгр

11е

Агд

О1п

Вег

Рго

О1у

Агд

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

О1у

11е

11е

Туг

Ьуз

Агд

Вег

Ьуз

Тгр

Туг

Азп

О1п

Туг

А1а

50

55

60

Уа1

Вег

Уа1

Ьуз

Вег

Агд

11е

ТЬг

11е

Азп

Рго

Азр

ТЬг

Вег

Ьуз

Азп

65

70

75

80

О1п

Рке

Вег

Ьеи

О1п

Ьеи

Азп

Вег

Уа1

ТЬг

Рго

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Тгр

Н1з

Вег

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

О1у

РЬе

Азр

Азр

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Вег

Вег

115

120

<210> 20 <211> 123

- 34 032189

<212> <213>	РВТ Синтетическая
<220>
<223>	Вариант
<400>	20

О1п Уа1

О1п

Ьеи

О1п

О1п

Вег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Вег

О1п

1

5

10

15

ТЕг Ьеи

Вег

Ьеи

ТЕг

Суз

А1а

11е

Вег

О1у

Азр

Вег

Уа1

Вег

Вег

Азр

20

25

30

Вег А1а

А1а

Тгр

Вег

Тгр

11е

Агд

О1п

Вег

Рго

О1у

Агд

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр Ьеи

О1у

11е

11е

Туг

Ьуз

Агд

Вег

Ьуз

Тгр

Туг

Азп

Агд

Туг

А1а

50

55

60

Уа1 Вег

Уа1

Ьуз

Вег

Агд

11е

ТЕг

11е

Азп

Рго

Азр

ТЕг

Вег

Ьуз

Азп

65

70

75

80

О1п РЕе

Вег

Ьеи

О1п

Ьеи

Азп

Вег

Уа1

ТЕг

Рго

О1и

Азр

ТЕг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг Туг

Суз

А1а

Агд

Тгр

Н1з

Вег

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

О1у

РЕе

Азр

Азр

100

105

110

Тгр О1у

О1п

О1у

ТЕг

Ьеи

Уа1

ТЕг

Уа1

Вег

Вег

115

120

<210>

21

<211>

123

<212>

РВТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

21

О1п Уа1

О1п

Ьеи

О1п

О1п

Вег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Вег

О1п

1

5

10

15

ТЕг Ьеи

Вег

Ьеи

ТЕг

Суз

А1а

11е

Вег

О1у

Азр

Вег

Уа1

Вег

Вег

Азр

20

25

30

Вег А1а

А1а

Тгр

Вег

Тгр

11е

Агд

О1п

Вег

Рго

О1у

Агд

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр Ьеи

О1у

11е

11е

Туг

Ьуз

Агд

Вег

Ьуз

Тгр

Туг

Азп

Агд

Туг

А1а

- 35 032189

Уа1 65

Бег

Уа1

Ьуз

Бег

Агд 70

11е

ТЬг

11е

Азп

Рго 75

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Азп 80

О1п

Рке

Бег

Ьеи

О1п

Ьеи

Азп

Бег

Уа1

ТЬг

Рго

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Тгр

Н1з

Бег

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

О1у

Рке

Азр

Азр

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

120

<210>

22

<211>

123

<212>

РКТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

22

О1п

Уа1

О1п

Ьеи

О1п

О1п

Бег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Бег

О1п

1

5

10

15

ТЬг

Ьеи

Бег

Ьеи

ТЬг

Суз

А1а

11е

Бег

О1у

Азр

Бег

Уа1

Бег

Бег

Азп

20

25

30

Бег

А1а

А1а

Тгр

Бег

Тгр

11е

Агд

О1п

Бег

Рго

О1у

Агд

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

О1у

11е

11е

Туг

Ьуз

Агд

Бег

Ьуз

Тгр

Туг

Азп

Агд

Туг

А1а

50

55

60

Уа1

Бег

Уа1

Ьуз

Бег

Агд

11е

ТЬг

11е

Азп

Рго

Азр

ТЬг

Бег

Ьуз

Азп

65

70

75

80

О1п

Рке

Бег

Ьеи

О1п

Ьеи

Азп

Бег

Уа1

ТЬг

Рго

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Тгр

Н1з

Бег

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

О1у

Рке

Азр

Азр

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Бег

Бег

115

120

<210> 23 <211> 123

- 36 032189 <212> РВТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 23

οίη ναι

О1п

Ьеи

О1п

О1п

Вег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Вег

О1п

1

5

10

15

ТЪг Ьеи

Вег

Ьеи

ТЪг

Суз

А1а

11е

Вег

О1у

Азр

Вег

Уа1

Вег

Вег

Азр

20

25

30

Вег А1а

А1а

Тгр

Вег

Тгр

11е

Агд

О1п

Вег

Рго

О1у

Агд

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр Ьеи

О1у

11е

11е

Туг

Ьуз

Агд

Вег

Ьуз

Тгр

Туг

Азп

Агд

Туг

А1а

50

55

60

Уа1 Вег

Уа1

Ьуз

Вег

Агд

11е

ТЪг

11е

Азп

Рго

Азр

ТЪг

Вег

Ьуз

Азп

65

70

75

80

О1п РЪе

Вег

Ьеи

О1п

Ьеи

Азп

Вег

Уа1

ТЪг

Рго

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг Туг

Суз

А1а

Агд

Тгр

Н1з

Вег

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

О1у

РЪе

Азр

Азр

100

105

110

Тгр О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

Вег

Вег

115

120

<210>

24

<211>

123

<212>

РКТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

24

οίη ναι

О1п

Ьеи

О1п

О1п

Вег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Вег

О1п

1

5

10

15

ТЪг Ьеи

Вег

Ьеи

ТЪг

Суз

А1а

11е

Вег

О1у

Азр

Вег

Уа1

Вег

Вег

Азр

20

25

30

Вег А1а

А1а

Тгр

Вег

Тгр

11е

Агд

О1п

Вег

Рго

О1у

Агд

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр Ьеи

О1у

11е

11е

Туг

Ьуз

Агд

Вег

Ьуз

Тгр

Туг

Азп

Агд

Туг

А1а

- 37 032189

Уа1 65

5ег

Уа1

Ьуз

5ег

Агд 70

11е

ТЪг

11е

Азп

Рго 75

Азр

ТЪг

5ег

Ьуз

Азп 80

О1п

РЪе

5ег

Ьеи

О1п

Ьеи

Азп

5ег

Уа1

ТЪг

Рго

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Тгр

Н1з

5ег

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

О1у

РЪе

Азр

Азр

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

5ег

115

120

<210>

25

<211>

123

<212>

РКТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

25

О1и

Уа1

О1п

Ьеи

О1п

О1п

5ег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

5ег

О1п

1

5

10

15

ТЪг

Ьеи

5ег

Ьеи

ТЪг

Суз

А1а

11е

5ег

О1у

Азр

5ег

Уа1

5ег

5ег

Азр

20

25

30

5ег

А1а

А1а

Тгр

5ег

Тгр

11е

Агд

О1п

5ег

Рго

5ег

Агд

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр

Ьеи

О1у

11е

11е

Туг

Туг

Агд

5ег

Ьуз

Тгр

Туг

Азп

Агд

Туг

А1а

50

55

60

Уа1

5ег

Уа1

Ьуз

5ег

Агд

11е

ТЪг

11е

Азп

Рго

Азр

ТЪг

5ег

Ьуз

Азп

65

70

75

80

О1п

РЪе

5ег

Ьеи

О1п

Ьеи

Азп

5ег

Уа1

ТЪг

Рго

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг

Туг

Суз

А1а

Агд

Тгр

Н1з

5ег

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

О1у

РЪе

Азр

Азр

100

105

110

Тгр

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

5ег

5ег

115

120

<210> 26 <211> 123

- 38 032189

<212> <213>	РКТ Синтетическая
<220>
<223>	Вариант
<400>	26

О1п Уа1

О1п

Ьеи

О1п

О1п

Вег

О1у

Рго

О1у

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

Вег

О1п

1

5

10

15

ТЪг Ьеи

Вег

Ьеи

ТЪг

Суз

А1а

11е

Вег

О1у

Азр

Вег

Уа1

Вег

Вег

Азр

20

25

30

Вег А1а

А1а

Тгр

Вег

Тгр

11е

Агд

О1п

Вег

Рго

Вег

Агд

О1у

Ьеи

О1и

35

40

45

Тгр Ьеи

О1у

11е

11е

Туг

Туг

Агд

Вег

Ьуз

Тгр

Туг

Азп

Агд

Туг

А1а

50

55

60

Уа1 Вег

Уа1

Ьуз

Вег

Агд

11е

ТЪг

11е

Азп

Рго

Азр

ТЪг

Вег

Ьуз

Азп

65

70

75

80

О1п РЪе

Вег

Ьеи

О1п

Ьеи

Азп

Вег

Уа1

ТЪг

Рго

О1и

Азр

ТЪг

А1а

Уа1

85

90

95

Туг Туг

Суз

А1а

Агд

Тгр

Н1з

Вег

Азр

Ьуз

Н1з

Тгр

О1у

РЪе

Азр

Азр

100

105

110

Тгр О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьеи

Уа1

ТЪг

Уа1

Вег

Вег

115

120

<210>

27

<211>

114

<212>

РКТ

<213>

Синтетическая

<220>

<223>

Вариант

<400>

27

Азр 11е

Уа1

МеЬ

ТЪг

О1п

Вег

Рго

Ьеи

Вег

Ьеи

Рго

Уа1

ТЪг

Рго

О1у

1

5

10

15

О1и Рго

А1а

Вег

11е

Вег

Суз

Агд

Вег

Вег

О1п

Вег

Ьеи

Уа1

11е

Вег

20

25

30

РЪе О1у

11е

ТЪг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

Вег

35

40

45

Рго О1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

О1у

Вег

Азп

Агд

А1а

Вег

О1у

Уа1

Рго

- 39 032189

50

55

60

Азр

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

О1у

Бег

О1у

ТЪг

Азр

РЪе

ТЪг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Бег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1и

Азр

Уа1

О1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

85

90

95

Азр

Бег

Туг

Рго

Ьеи

ТЪг

РЪе

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд ТЪг <210> 28 <211> 114 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 28

Азр 1

11е

Уа1

МеЕ

ТЪг 5

О1п

Бег

Рго

Ьеи

Бег 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЪг

Рго 15

О1у

О1и

Рго

А1а

Бег

11е

Бег

Суз

Агд

Бег

Бег

О1п

Бег

Ьеи

Уа1

РЪе

Агд

20

25

30

РЪе

О1у

11е

ТЪг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

Бег

35

40

45

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

О1у

Бег

Азп

Агд

А1а

Бег

О1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

О1у

Бег

О1у

ТЪг

Азр

РЪе

ТЪг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Бег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1и

Азр

Уа1

О1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

85

90

95

ТЪг

Бег

Туг

Рго

Ьеи

ТЪг

РЪе

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд ТЪг <210> 29 <211> 114

- 40 032189 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400>29

Азр 1

11е

Уа1

МеЕ

ТЬг 5

О1п

Бег

Рго

Ьеи

Бег 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

О1у

О1и

Рго

А1а

Бег

11е

Бег

Суз

Агд

Бег

Бег

О1п

Бег

Ьеи

Уа1

РЬе

Бег

20

25

30

Азр

О1у

ТЬг

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

Бег

35

40

45

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

О1у

Бег

Азп

Агд

А1а

Бег

О1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Бег

О1у

Бег

О1у

Бег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Бег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1и

Азр

Уа1

О1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

85

90

95

ТЬг

Бег

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд

ТЬг

<210>30 <211>114 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 30

Азр 1

11е

Уа1

МеЕ

ТЬг О1п 5

Бег

Рго

Ьеи

Бег 10

Ьеи

Рго Уа1

ТЬг

Рго 15

О1у

О1и

Рго

А1а

Бег

11е

Бег

Суз

Агд

Бег

Бег

О1п

Бег

Ьеи

Уа1

РЬе

Бег

20

25

30

РЬе

О1у

11е

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

Бег

35

40

45

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

О1у

Бег

Азп

Агд

А1а

Бег

О1у

Уа1

Рго

- 41 032189

50

55

60

Азр

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

О1у

Бег

О1у

ТЪг

Азр

РЪе

ТЪг

Ьеи

Ьуз

Т1е

65

70

75

80

Бег

Агд

Ъа1

О1и

А1а

О1и

Азр

Ъа1

О1у

Ъа1

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

85

90

95

Азр

Бег

Туг

Рго

Ьеи

ТЪг

РЪе

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьуз

Уа1

О1и

Т1е

Ьуз

100

105

110

Агд ТЪг <210> 31 <211> 114 <212> РВТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 31

Азр 1

Т1е

Ъа1

Меб

ТЪг 5

О1п

Бег

Рго

Ьеи

Бег 10

Ьеи

Рго

Ъа1

ТЪг

Рго 15

О1у

О1и

Рго

А1а

Бег

Т1е

Бег

Суз

Агд

Бег

Бег

О1п

Бег

Ьеи

Ъа1

РЪе

Агд

20

25

30

РЪе

О1у

Т1е

ТЪг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

Бег

35

40

45

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

Т1е

Туг

Ьуз

О1у

Бег

Азп

Агд

А1а

Бег

О1у

Ъа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЪе

Бег

О1у

Бег

О1у

Бег

О1у

ТЪг

Азр

РЪе

ТЪг

Ьеи

Ьуз

Т1е

65

70

75

80

Бег

Агд

Ъа1

О1и

А1а

О1и

Азр

Ъа1

О1у

Ъа1

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

85

90

95

Азр

Бег

Туг

Рго

Ьеи

ТЪг

РЪе

О1у

О1п

О1у

ТЪг

Ьуз

Уа1

О1и

Т1е

Ьуз

100

105

110

Агд ТЪг <210> 32 <211> 114

- 42 032189 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400>32

Азр 1

11е Уа1

МеЕ

ТЬг 5

О1п

Бег

Рго

Ьеи

Бег 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

О1у

О1и

Рго

А1а

Бег

11е

Бег

Суз

Агд

Бег

Бег

О1п

Бег

Ьеи

Уа1

Рке

Агд

20

25

30

Азр

О1у

11е

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

Бег

35

40

45

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

О1у

Бег

Азп

Агд

А1а

Бег

О1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

Рке

Бег

О1у

Бег

О1у

Бег

О1у

ТЬг

Азр

Рке

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Бег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1и

Азр

Уа1

О1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

85

90

95

Азр

Бег

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

Рке

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд

ТЬг

<210>33 <211>114 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 33

Азр 1

11е

Уа1

МеЕ

ТЬг О1п 5

Бег

Рго

Ьеи

Бег 10

Ьеи

Рго Уа1

ТЬг

Рго 15

О1у

О1и

Рго

А1а

Бег

11е

Бег

Суз

Агд

Бег

Бег

О1п

Бег

Ьеи

Уа1

Рке

Агд

20

25

30

Азр

О1у

11е

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

Бег

35

40

45

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

О1у

Бег

Азп

Агд

А1а

Бег

О1у

Уа1

Рго

- 43 032189

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Вег

О1у

Вег

О1у

Вег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Вег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1и

Азр

Уа1

О1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

85

90

95

Азр

Вег

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд ТЬг <210> 34 <211> 114 <212> РКТ <213> Синтетическая <220>

<223> Вариант <400> 34

Азр 1

11е

Уа1

МеЬ

ТЬг 5

О1п

Вег

Рго

Ьеи

Вег 10

Ьеи

Рго

Уа1

ТЬг

Рго 15

О1у

О1и

Рго

А1а

Вег

11е

Вег

Суз

Агд

Вег

Вег

О1п

Вег

Ьеи

Уа1

РЬе

Агд

20

25

30

Азр

О1у

11е

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Туг

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

О1у

О1п

Вег

35

40

45

Рго

О1п

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

О1у

Вег

Азп

Агд

А1а

Вег

О1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Вег

О1у

Вег

О1у

Вег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Вег

Агд

Уа1

О1и

А1а

О1и

Азр

Уа1

О1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

О1п

О1п

Туг

85

90

95

Азр

Вег

Туг

Рго

Ьеи

ТЬг

РЬе

О1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

О1и

11е

Ьуз

100

105

110

Агд ТЬг

- 44 032189

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Изолированное человеческое моноклональное антитело. которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (ΤΡΡΙ). где антитело содержит:

   a) тяжелую цепь антитела человека. содержащую:

   ί) СБВ1 участок с аминокислотной последовательностью ΡΤΡΚ8ΥΟΜ8. содержащей замену В30З. или З35Б. или обе относительно ЗЕО ΙΌ N0: 1;

   ίί) СБВ2 участок с аминокислотной последовательностью δΙΒΟδδδδΤΥΥΑΌδνΚΟ. содержащей замену 355В. или З566. или обе относительно ЗЕО ΙΌ N0: 1;

   ίίί) СБВ3 участок с аминокислотной последовательностью ΚΥΒΥ^ΡΌΥ. содержащей замену К99Ь относительно ЗЕО ΙΌ N0: 1; и

   b) легкую цепь антитела человека. содержащую:

   ί) СБВ1 участок с аминокислотной последовательностью 3^^N^ΒNΥΥΑН. содержащей замену Β28Ρ или N294 относительно ЗЕО ΙΌ N0: 2;

   ίί) СБВ2 участок с аминокислотной последовательностью ΥΥ^ΒNΒΡ3. содержащей по меньшей мере одну замену. выбранную из группы. состоящей из Υ48Ρ и №1У и их комбинаций относительно ЗЕО ΙΌ N0: 2;

   ίίί) СБВ3 участок с аминокислотной последовательностью ^3\V^^^VΡV. содержащей по меньшей мере одну замену. выбранную из группы. состоящей из З89А. Б91\У. Б92З. 693З и ν94Τ и их комбинаций относительно ЗЕО ΙΌ N0: 2.
2. 2. Изолированное человеческое моноклональное антитело изотипа ΙβΟ. которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (ΤΡΡΙ). где антитело содержит:

   a) тяжелую цепь антитела человека. содержащую:

   ί) СБВ1 участок с аминокислотной последовательностью ΡΤΡΒ3Υ^Μ3. содержащей замены В30З и З35Б относительно ЗЕО ΙΌ N0: 1;

   ίί) СБВ2 участок с аминокислотной последовательностью ЗШ.ОЗЗЗЗ'Г^АОЗУКО. содержащей замены З55В и З566 относительно ЗЕО ΙΌ N0: 1;

   ίίί) СБВ3 участок с аминокислотной последовательностью ΚΥΡΥΧΥΡΩΥ. содержащей замену К99Ь относительно ЗЕО ΙΌ N0: 1; и

   b) легкую цепь антитела человека. содержащую:

   ί) СБВ1 участок с аминокислотной последовательностью 3^^N^ΒNΥΥΑН. содержащей замены Β28Ρ и N294 относительно ЗЕО ΙΌ N0: 2;

   ίί) СБВ2 участок с аминокислотной последовательностью ΥΥ^ΒNΒΡ3. содержащей замены Υ48Ρ и №1У относительно ЗЕО ΙΌ N0: 2;

   ίίί) СБВ3 участок с аминокислотной последовательностью ^3\V^^^VΡV. содержащей замены З89А. Б91№. Б92З. 693З и ν94Τ относительно ЗЕО ΙΌ N0: 2.
3. 3. Изолированное человеческое моноклональное антитело изотипа ΙβΟ. которое специфически связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора (ΤΡΡΙ). где антитело содержит:

   (a) тяжелую цепь антитела человека. содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ N0: 10; и (b) легкую цепь антитела человека. содержащую аминокислотную последовательность. как показано в ЗЕО ΙΌ N0: 17.
4. 4. Изолированное антитело по п.1 или 2. где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10⁸ М^-1.
5. 5. Изолированное антитело по п.1 или 2. где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10⁹ М^-1.
6. 6. Изолированное антитело по п.1 или 2. где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10¹⁰ М^-1.
7. 7. Изолированное антитело по п.1 или 2. где антитело связывается с человеческим ингибитором пути тканевого фактора с аффинностью по меньшей мере 10¹¹ М^-1.
8. 8. Изолированное антитело по одному из пп.1. 2 или 3. где антитело является антителом Ι§0.
9. 9. Изолированное антитело по п.8. где антитело является антителом Ι§02.
10. 10. Фармацевтическая композиция для лечения нарушения свертывания крови. содержащая терапевтически эффективное количество моноклонального антитела по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

    - 45 032189

    130-

    Ъ << ή?

    2А8 варианты (1,25 мкг/мл)

    Номер Клон Образец 3 НС 33ΐν 2А8-3 9 НС К991 2А8-9 17 1 С О91\Л/ 2А8-17 20 Дикий тип 2А8