PT1934353E - Domínio il-15r alfa sushi como um indutor selectivo e potente da acção de il-15 através de il-15r beta/gama, e proteínas de fusão (ilr alfa sushi-il 15) hiperagonistas - Google Patents

Description

ΡΕ1934353 1

DESCRIÇÃO "DOMÍNIO IL-15R ALFA SUSHI COMO UM INDUTOR SELECTIVO E POTENTE DA ACÇÃO DE IL-15 ATRAVÉS DE IL-15R BETA/GAMA, E PROTEÍNAS DE FUSÃO (ILR ALFA SUSHI-IL 15) HIPERAGONISTAS"

Campo técnico da invenção A presente invenção refere-se ao campo das respostas biológicas induzidas por citocinas e/ou estimuladas por citocinas, mais particularmente ao campo de respostas biológicas induzidas por IL-15 e/ou estimuladas por IL-15, e especialmente ao campo daquelas respostas biológicas que envolvem uma via de sinalização IL15Rp/y.

Antecedentes da Invenção IL-15 é uma citocina que, tal como IL-2, foi originalmente descrita como um factor de crescimento das células T (1) . As duas citocinas que pertencem à família das quatro hélices-α empacotadas, e os seus receptores de membrana partilham duas subunidades (as cadeias IL-2R/IL-15R β e γ) responsáveis pela transdução de sinal (2) . 0 complexo IL-2Rp/y é um receptor de afinidade intermediário para ambas as citocinas. É principalmente expresso pela maioria das células NK, e pode ser activado in vitro por concentrações nanomolares de IL-2 ou IL-15. 2 ΡΕ1934353

Receptores IL-2 e IL-15 de elevada afinidade que são expressos, por exemplo em células T activadas, e que podem ser activadas com concentrações picomolares de qualquer uma das citocinas, contêm além disso a sua própria cadeia α privada (IL2-Roc e IL-15Roc) que conferem especificidade à citocina e aumentam a afinidade da ligação da citocina (3).

Ambas as citocinas desempenham papéis cruciais na imunidade inata e adaptativa. Enquanto experiências in vitro iniciais mostraram uma grande sobreposição funcional (indução da proliferação e citotoxicidade de células NK e linfócitos activados, co-estimulação da proliferação de células B e síntese de imunoglobulina, quimioatracção de células T) (1,4-6), experiências mais recentes indicaram que as duas citocinas exercem acção complementares e mesmo contrastantes in vivo. Enquanto a inactivação de IL-2 ou IL-2Ra em ratinhos foi associada com fenótipos auto-imunes com um aumento das populações de células T e B activadas, a inactivação de IL-15 e IL-15Ra resultou em defeitos específicos em NK, NK-T, linfócitos intraepiteliais e células de memória T CD8 (7,8) . Além disso, IL-2 promove a tolerância periférica através da indução da morte celular induzida pela activação (AICD), enquanto que IL-15 inibe AICD mediada por IL-2 (9), e, ao contrário de IL-2, IL-15 é um factor de sobrevivência para células T de memória CD8 (10) . 3 ΡΕ1934353

Na linha destas observações, foi sugerido que o papel principal de IL-2 fosse limitar a expansão continua de células T activadas, enquanto que IL-15 é crítica para a iniciação da divisão de células T e a sobrevivência de células T de memória (11).

Foi descrito um novo mecanismo de transapresen-tação de IL-15, no qual IL-15 e IL-15Ra são expressos de forma coordenada por células apresentadoras de antigénios (monócitos, células dendríticas), e IL-15 ligada a IL-15Ra é apresentada em trans relativamente a células vizinhas NK ou T CD8 que expressam apenas o receptor IL-15RP/a (12). A transapresentação de IL-15 como um evento de co-estimulação que ocorre na sinapse imunológica, parece agora ser um mecanismo dominante para a activação da acção de IL-15 in vivo (13, 14) . É sugerido que desempenha um papel fundamental na imunovigilância tumoral (15).

As subunidades IL-15Rot e IL-2Ra formam uma subfamília de receptores de citocinas na medida em que compreendem nas suas partes extracelulares nas extremidades N, os denominados domínios estruturais "sushi" (um em IL-15Ra, dois em IL-2Ra) também observados em moléculas complementares ou de adesão (16). Em ambos os casos, verificou-se que estes domínios sushi apresentam a maioria dos elementos estruturais responsáveis pela ligação de citocinas.

Enquanto que a IL-2Ra isoladamente é um receptor 4 ΡΕ1934353 de IL-2 de baixa afinidade (Kd = 10 nM) , IL-15R.OC liga-se a IL-15 com elevada afinidade (Kd = 100 pM). A libertação de IL-2R.0C por proteólise é um mecanismo natural que participa na inibição da activação de linfócitos. IL-2Ra é clivada por Der pl, um alergénio principal de traça, para inibir as células Thl e favorecer um ambiente alérgico (17), e por metaloproteinases derivadas de tumores para inibir a proliferação de células T que combatem cancros (18) . A IL-2Ra assim gerada é um inibidor competitivo da acção de IL-2 in vitro. No entanto, permanece com ligação a IL-2 com baixa afinidade, e não é provável que participe activamente na inibição da actividade de IL-2 in vivo.

Mostrou-se recentemente que uma forma solúvel da IL-15R0C humana pode também ser libertada naturalmente de células positivas para IL-15Roc por um processo de remoção envolvendo MMPs (19). Ao contrário de IL-2Ra solúveis, este receptor IL-15Roc solúvel foi capaz de se ligar a IL-15 com elevada afinidade, e bloquear eficientemente a proliferação através do complexo de sinalização IL-15Roc/p/y de elevada afinidade. Este resultado foi consistente com o conceito de comportamento sIL-15Roc, tal como a sua homologia sIL-2Ra, como um antagonista, e com efeitos inibitórios de sIL-15Ra in vitro ou in vivo (20, 21) .

Aqui, os presentes inventores mostram que um fragmento que consiste essencialmente do domínio sushi de IL-15Ralfa (=IL-15Ra) tem uma acção oposta. 5 ΡΕ1934353

Tal fragmento é capaz de aumentar a ligação, assim como a bioactividade de IL-15 através do receptor de afinidade intermediário IL-15Rbeta/gama ( = IL-15Ra/p/y) , sem afectar aqueles através do receptor de elevada afinidade. Além disso, os presentes inventores descrevem proteínas de fusão que se comportam como potentes super-agonistas do complexo =IL-15Rp/y. Tais proteínas de fusão compreendem uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama, tal como IL-15 (ou um seu fragmento conservativo, agonista, mimético), com fusão covalente, por exemplo através de um agente de ligação flexível, a IL-15Ra ou a um fragmento IL-15Ralfa que reteve o domínio sushi de IL-15Ralfa.

Tanto quanto é conhecimento do inventor, existe apenas uma técnica anterior que apresenta um efeito de estimulação para um composto compreendendo um elemento relacionado com IL-15Ralfa, nomeadamente a forma comercialmente disponível de IL-15Ralfa solúvel.

Trata-se da publicação Giron-Michel et al., que tem o título "Membrane-bound and soluble IL-15/IL-15Ralpha complexes display differential signaling and functíons on human hematopoietic progenitors" (Blood, 1 de Outubro de 2005, Vol. 106, No. 7, pp. 2302-2310; pré-publicação em linha em Junho de 2005). A publicação de Giron-Michel et al. mostra que (ver Figura 7 de Giron-Michel et al.): a IL-15 recombinante (rIL-15) induz um efeito anti- 6 ΡΕ1934353 apoptótico significativo quando é utilizada numa dose de 10 ng/mL e que - rIL-15 não induz qualquer efeito anti-apoptótico significativo numa dose de 0,1 ng/mL, mas que - rIL-15 a uma dose de 0,1 ng/mL induz um efeito anti-apoptótico significativo quando é usada com a forma comercialmente disponível de IL-15Ralfa solúvel. O IL-15Ralfa solúvel que é utilizado por Giron-Michel et al. é a forma comercialmente disponível de IL-15Ralfa (disponível da R&D Systems, sob a referência 147-IR) . Este IL-15Ralfa solúvel é uma forma modificada do IL-15Ralfa que não dispõe do exão 3. A forma de IL-15Ralfa solúvel que é usada por Giron-Michel et al. compreende assim a parte codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa, directamente ligada à parte codificada pelo exão 4 de IL-15Ralfa, sem compreender qualquer parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa. A forma de IL-15Ralfa solúvel que é utilizada por Giron-Michel et al não corresponde assim a um fragmento de IL-15Ralfa, mas a uma sua forma modificada. A forma solúvel de IL-15Ralfa que é utilizada por Giron-Michel et al. compreende ainda um fragmento Fc (IgG humana), a ela ligado por covalência. Um fragmento Fc não se liga a IL-15Rbeta/gama. Deste modo, a publicação de Giron-Michel et al. não apresenta qualquer efeito na proliferação e/ou activação de células positivas para IL-15Rbeta/gama. Pode ser ainda notado que o teste de efeito anti-apoptótico não compreende quaisquer amostras de 7 ΡΕ1934353 controlo que conteriam (i) o fragmento solúvel IL-15Ralfa-Fc na ausência de rIL-15 ou (ii) um IL-15Ralfa solúvel sem qualquer fragmento Fc. 0 efeito anti-apoptótico apresentado não pode deste modo ser directamente atribuído à parte IL-15Ralfa do composto que é usado. A publicação Giron-Michel et al. não contém ainda qualquer pista relativamente ao domínio sushi de IL-15Ralfa (não à região flexível que está ausente da forma solúvel de IL-15Ralfa que está a ser utilizada nesta técnica anterior), nem contém qualquer pista relativamente à via de sinalização IL-15beta/gama. A presente invenção descreve pela primeira vez as unidades estruturais que são necessárias para, e especialmente vantajosas para, a indução e/ou a estimulação de uma acção biológica IL-15, o desencadear das vias de sinalização IL-15beta/gama, e a indução e/ou estimulação da proliferação de células NK e/ou T. A presente invenção representa assim um contributo técnico relativamente à técnica anterior, que permite aplicações biológicas e médicas anteriormente não concretizadas.

Crê-se então que, quando analisada numa base a priori, a publicação Giron-Michel et al. não ensina a invenção reivindicada a uma pessoa com conhecimentos convencionais da técnica, e não guia o perito na técnica para a invenção reivindicada. 8 ΡΕ1934353

Sumário da invenção A presente invenção refere-se à via de sinalização IL-15Rbeta/gama, e à indução e/ou estimulação da activação e/ou da proliferação de células positivas para IL-15Rbeta/gama e/ou a prevenção da apoptose, tais como células NK e/ou T. A presente invenção demonstra que a região extracelular de IL-15Ralfa pode actuar como um agonista da acção biológica de IL-15, através da via de sinalização IL-15Rbeta/gama. Demonstra especialmente que pode estimular e/ou induzir a proliferação e/ou activação de células positivas para IL-15Rbeta/gama e/ou a prevenção da apoptose, tais como células NK e/ou T. A presente invenção demonstra que a unidade estrutural mínima contida nesta região IL-15Ralfa extracelular, que é necessária para exercer tal acção agonista, é o domínio sushi da região IL-15Ralfa extracelular. A presente invenção demonstra ainda que a região flexível e de cauda desta região IL-15Ralfa extracelular aumenta significativamente a eficiência desta acção agonista . A presente invenção proporciona ainda compostos que apresentam um aumento de 30 a 150 vezes de bioactivi-dade, em comparação com a IL-15 nativa, e que são ainda 9 ΡΕ1934353 mais potentes que a associação simples de IL-15 e do domínio sushi IL-15Ralfa solúvel. A presente invenção refere-se aos objectos descritos na secção de descrição detalhada, e mais particularmente àqueles definidos nas reivindicações anexas.

Breve descrição dos desenhos

Fig. 1. Afinidades de ligação das várias proteínas IL-15ROO para IL-15.

Os sensogramas de ligação por SPR (fases de associação e dissociação) de concentrações crescentes de rIL-15 (3,1, 6,2, 12,5, 25, 50 e 100 nM) a (A) sIL-15Ra-IL-2, (B) sIL-15Ra-sushi-IL-2 ou (C) IL-15Ra-sushi. (D): Estudos de competição de sIL-15Roc-sushi (O) , sIL-15Ra-IL-2 (♦) , ou sIL-15Ra- sushi-IL-2 (Δ) imobilizadas com ligação de rlL-15 radioiodinada (200 pM) a células TF-1. Sensogramas de SPR da ligação (fases de associação e dissociação) de concentrações crescentes de rIL-15 (1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100 nM) a (E) sIL-15Roc-Sushi + imobilizado.

Fig. 2. Efeitos na proliferação induzida por IL-15 através de IL-15Rp/y. A proliferação das células Mo-7 foi avaliada pela incorporação de [3H]-timidina. As células foram cultivadas com concentrações crescentes de rIL-15 humana (A) ou rIL-2 humana (B), na ausência (·) ou presença (O) de uma concentração fixa (10 nM) de sIL-15Roc- 10 ΡΕ1934353 sushi. (C): As células foram cultivadas na presença de 1 nM rIL-15, sem (·) ou com concentrações crescentes de sIL-15Ra-sushi (O) . (D) : As células foram cultivadas com concentrações crescentes de rIL-15 (·) , mistura equimolar de IL-15 e sIL-15Ra-sushi (O) , proteína de fusão RLI (▲) ou ILR (Δ) . (E) : Construções moleculares utilizadas para expressar proteínas de fusão RLI e ILR. IL-15Ra sp: péptido sinal IL-15Ra humano, ppl sp: péptido sinal de preprolactina bovina. (F) : Estruturas modelo tridimensionais das proteínas de fusão.

Fig. 3. Efeitos na prevenção da apoptose induzida por IL-15 através de IL-lõRjVy. A apoptose foi avaliada pela expressão à superfície celular da Anexina V utilizando Citometria de Fluxo. O histograma completo (Aa) representa a coloração com anexina V em Mo-7 no início da experiência. As células foram cultivadas durante 48 h, sem (Ab) ou com uma concentração fixa de rIL-15 humana (500 pM) (Ac) , na ausência (histograma completo) ou presença de sIL-15Ra- sushi (10 nM) (linha a cheio). (B) : Cinética da expressão de Anexina V em células Mo-7 na ausência de citocina exógena (·) ou na presença de rIL-15 (500 pM) (O) , sIL-15Ra-sushi (10 nM) (□) , sIL-15Ra-sushi (10 nM) mais rIL-15 (500 pM) (O) , ou RLI (500 pM) (A) . (C) : As células Mo-7 foram cultivadas com concentrações crescentes de rIL-15, na ausência (O) ou presença (O) de uma concentração fixa (10 nM) de sIL-15Ra-sushi, ou com concentrações crescentes de RLI (A) . 11 ΡΕ1934353

Fig. 4. Efeito agonista de sIL-15Ra-sushi na ligação de IL-15 a IL-15R|3/y. Ligação e internalização de RLI. (A): Ligação de rIL-15 marcada com 125I a células Mo7 na ausência () ou presença de 10 nM sIL-15Ra-sushi (□) . (B) : Ligação da proteína de fusão RLI marcada com 125I. Nas inserções, apresentam-se gráficos de Scatchard. (C): Inter-nalização de proteína de fusão RLI marcada com 125I (500 pM).

Fig. 5. Efeitos na proliferação e apoptose celular induzida por IL-15 através de receptores IL-lSRa/β/γ. A incorporação de [3H]-timidina por células Kit 225 (A) e TF-Ιβ (B) cultivadas com concentrações crescentes de rIL-15 (·), mistura equimolar de rIL-15 e sIL-15Ra-sushi (O), proteína de fusão RLI (A) ou ILR (Δ) . (C) :

Coloração com anexina V de TF- 1β no início da experiência (Ca), a 48 h após cultura sem (Cb) ou com uma concentração fixa de rIL-15 humana (500 pM) (Cc), na ausência (histograma completo) ou presença da proteína sIL-15Ra-sushi (10 nM) (linha a cheio), ou na presença de 10 pM de RLI (Cd). (D): Cinética de coloração na ausência de citocina exógena (O) ou na presença de rIL-15 (10 pM) (·), sIL-15Roc-sushi (10 nM) (□) , sIL-15Ra-sushi (10 nM) mais rIL-15 (10 pM) (O), ou proteína de fusão RLI (10 pM) (A). {E) : Coloração a 48 h após cultura com concentrações crescentes de rIL-15, na ausência (·) ou presença (O) de uma concentração fixa (10 nM) de sIL-15Roc-sushi, ou com concentrações crescentes de proteína de fusão RLI (A) . 12 ΡΕ1934353

Fig. 6. Ligação e internalização de sIL-15Ra-sushi e RLI em células TF—1β. Efeitos de sIL—15Ra—sushi na ligação de IL-15. (A) : Curva de saturação de ligação de rIL-15 marcada com 125I na ausência () ou presença de 10 nM de sIL-15Roc-sushi (□) . (5) : Efeito de concentrações crescentes de sIL-15Ra-sushi na ligação de uma concentração fixa de rIL-15 radioiodinada (200 pM) . (C) : Curva de saturação de ligação de sIL-15Ra-sushi marcada com 125I na presença de 1 nM rIL-15 e (D) internalização subsequente. (E) : Curva de saturação de ligação de RLI marcada com 125I e (F) internalização subsequente.

Fig. 7: Modelos propostos para os efeitos diferenciais de sIL-15Ra e sIL-15R<x-sushi. (A) No contexto de receptores IL-15Ra/p/y, sIL-15Ra compete com IL-15Ra de membrana para a ligação a IL-15. (B) No contexto de receptores IL-15R3/y, sIL-15Ra-sushi forma um complexo com a IL-15 que activa o complexo IL-15Rp/y de forma mais eficiente do que a IL-15 isoladamente. As proteínas de fusão RLI ou ILR amplificam este efeito agonista. (C) No contexto de receptores IL-15Ra/p/y, sIL- -15Ra-sushi não é eficiente na competição com IL-15Roc de membrana, ou compete com IL-15Roc de membrana e o complexo de sIL-15Roc-sushi com a IL-15 activa um excesso de complexos IL-15Rp/y como em (B) .

As Fig. 8 a 42 apresentam as sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos, para as quais se listam 13 ΡΕ1934353 as SEQ ID na Tabela 4 (a tabela 4 está localizada depois das referências bibliográficas, antes das reivindicações).

Fig. 8: ADNc de IL-15Ralfa nativa humana (SEQ ID NO: 1).

Fig. 9: Sequência codificante de IL-15Ralfa nativa humana (SEQ ID NO: 2), e da proteína IL-15Ralfa nativa humana (SEQ ID NO: 3).

Fig. 10: Sequência codificante e sequência de aminoácidos de do péptido sinal do IL-15Ralfa nativo humano (SEQ ID NO: 4 e NO: 5), e do péptido maduro (SEQ ID NO: 6, e NO: 7) .

Fig. 11 : sequências de ácidos nucleicos de exões 1 a 5 de IL-15Ralfa nativa humana (SEQ ID NO: 8-12).

Fig. 12: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos do domínio sushi do IL-15Ralfa nativo humano (SEQ ID NO: 13-14), e de um fragmento do IL-15Ralfa nativo humano que compreende o domínio sushi (SEQ ID NO: 15 e NO: 16) .

Fig. 13: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de um fragmento de IL-15Ralfa nativa humana que compreende o domínio sushi (SEQ ID NO: 17 e NO: 18). 14 ΡΕ1934353

Fig. 14: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos da região flexível do IL-15Ralfa nativo humano (SEQ ID NO: 19 e NO: 20) , e dos fragmentos desta região flexível.

Fig. 15: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de fragmentos do IL-15Ralfa nativo humano que compreende o domínio sushi e um fragmento da região flexível (SEQ ID NO: 21-24).

Fig. 16: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de fragmentos de IL-15Ralfa nativa humana que compreende o domínio sushi e um fragmento da região flexível (SEQ ID NO: 25-28).

Fig. 17: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de um fragmento de IL-15Ralfa nativa humana que compreende o domínio sushi e a região flexível (SEQ ID NO: 29-30).

Fig. 18: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos da região rica em locais de glicosilação do IL-15Ralfa nativo humano (SEQ ID NO: 31-32).

Fig. 19: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos da parte da região rica em locais de glicosilação do IL-15Ralfa nativo humano codificado pelo exão 3 (SEQ ID NO: 33- 34), e de um fragmento de IL-15Ralfa que compreende o domínio sushi, a região flexível, e a 15 ΡΕ1934353 parte da região rica em locais de glicosilação codificada pelo exão 3 (SEQ ID NO: 35-36).

Fig. 20: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de um fragmento da região extracelular solúvel de IL-15Ralfa nativa humana (SEQ ID NO: 37-38) . Fig. 21 : sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos da região extracelular solúvel de IL-15Ralfa nativa humana ( SEQ ID NO: 39-40) • Fig. 22: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de um fragmento de domínio extracelular solúvel, com deleção do péptido sinal do IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 41-42).

Fig. 23: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de um domínio extracelular solúvel, com deleção do péptido sinal do IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 43-44).

Fig. 24: sequência de ácido nucleico da IL-15 humana nativa (SEQ ID NO: 45)

Fig. 25: sequência de aminoácido da proteína precursora da IL-15 nativa humana (SEQ ID NO: 46) , sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos da IL-15 nativa humana madura (SEQ ID NO: 47-48). 16 ΡΕ1934353

Fig. 26: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos das duas regiões de ligação flexíveis (sequência de ligação 20 SEQ ID NO: 49-50; sequência de ligação 26 SEQ ID NO: 51-52).

Fig. 27: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de marcação Flag e local de ligação Xa (SEQ ID NO: 53-56), do péptido sinal da preprolactina bovina (SEQ ID NO: 57-58), e sequência de ácido nucleico de IL-15R e sequências Kozak de preprolactina.

Fig. 28: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de RLI (proteína de fusão da invenção; SEQ ID NO: 59-60) . Proteína de fusão RLI = péptido sinal de IL-15Ralfa + marcação Flag e local de ligação Xa + it + sushi + i + rd + onze aa codificados pelo exão 3 aa + sequência de ligação 26 + IL-15 madura nativa humana.

Fig. 29: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de ILR (proteína de fusão da invenção; SEQ ID NO: 61-62) . Proteína de fusão ILR = péptido sinal da preprolactina bovina + marcação Flag e local de ligação Xa + IL-15 madura nativa humana + sequência de ligação 26 + it + sushi + i + rd + onze aminoácidos codificados pelo exão 3.

Fig. 30: sequência de ácido nucleico de IL-2 nativa humana (SEQ ID NO: 63). 17 ΡΕ1934353

Fig. 31 : sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de IL-2 madura nativa humana (SEQ ID NO: 64-65) , e de uma sequência de ligação usada para marcar um fragmento contendo o domínio sushi de IL- 15Ralfa com IL-2.

Fig. 32: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de um fragmento contendo o domínio sushi de IL-15Ralfa, marcado com IL-2 (SEQ ID NO: 66-67).

Fig. 33: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de um fragmento contendo o domínio sushi de IL-15Ralfa (fragmento de IL-15Ralfa extracelular), marcado com IL-2 (SEQ ID NO: 68-69).

Fig. 34: sequências de aminoácidos de IL-15Ralfa de Mus musculus (SEQ ID NO: 72-73).

Fig. 35: sequências de aminoácidos da região extracelular de IL-15Ralfa (SEQ ID NO: 74), do domínio sushi (SEQ ID NO: 75), da região flexível (SEQ ID NO: 76), e da região da cauda (SEQ ID NO: 77) de Mus musculus.

Fig. 36: sequências de aminoácidos de IL-15Ralfa de Pan troglodytes (SEQ ID NO: 78-79).

Fig. 37: sequências de aminoácidos da região extracelular de IL-15Ralfa (SEQ ID NO: 80), do domínio sushi (SEQ ID NO: 81), da região flexível (SEQ ID NO: 82), e da região da cauda (SEQ ID NO: 83) de Pan troglodytes. 18 ΡΕ1934353

Fig. 38: sequências de aminoácidos de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 84-85).

Fig. 39: sequências de aminoácidos da região extracelular de IL-15Ralfa (SEQ ID NO: 86), do domínio sushi (SEQ ID NO: 87), da região flexível (SEQ ID NO: 88), e da região de cauda (SEQ ID NO: 89) de Rattus norvegicus.

Fig. 40: sequência de ácido nucleico do exão 3 de IL-15Ralfa de Mus musculus (SEQ ID NO: 90) , de IL-15Ralfa de Pan troglodytes (SEQ ID NO: 91), e de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 92).

Fig. 41: sequência de aminoácido da parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 93), de IL-15Ralfa de Mus musculus (SEQ ID NO: 94), de IL-15Ralfa de Pan troglodytes (SEQ ID NO: 95), e de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 96).

Fig. 42: sequência de aminoácido da parte codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 24), de IL-15Ralfa de Mus musculus (SEQ ID NO: 97), de IL-15Ralfa de Pan troglodytes (SEQ ID NO: 98), e de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 99).

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se a IL-15Ralfa e a 19 ΡΕ1934353 fragmentos de IL-15Ralfa que compreende pelo menos um domínio sushi de IL-15Ralfa. A presente invenção refere-se a produtos que se pretendem que estimulem a via de sinalização IL-15Rbeta/ gama, para assim induzir e/ou estimular a activação e/ou a proliferação e/ou a prevenção da apoptose de células positivas para IL-15Rbeta/gama, tais como células NK e/ou T. A presente invenção refere-se a polipéptidos contendo o domínio sushi isolados, que contêm o domínio sushi que está compreendido na região extracelular de um IL-15Ralfa, ou seja, refere-se ao fragmento que consiste na região extracelular de IL-15Ralfa, e a seus sub-fragmentos que retiveram o domínio sushi.

Os polipéptidos contendo o domínio sushi da invenção podem ser ou ligados por covalência, ou não ligados por covalência a pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama. A invenção refere-se mais particularmente a um composto ligado covalentemente que compreende pelo menos um destes polipéptidos contendo o domínio sushi, ligado directamente ou indirectamente por covalência a pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama. Tal composto pode ter um aumento de 30 a 150 vezes em bioactividade em comparação com a IL-15 nativa, e pode ser mais potente do 20 ΡΕ1934353 que a associação livre de IL-15 e o domínio sushi IL-15Ralfa solúvel.

Entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama:

Além do referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi, o referido composto covalente-mente ligado da invenção compreende pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama. A referida entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama é preferentemente uma IL-15, ou um fragmento, mimético ou agonista de IL-15, em que o referido fragmento, mimético ou agonista de IL-15 tem uma afinidade para ligação a IL-15Rbeta/gama que não é significativamente inferior àquela da IL-15 nativa. A referida IL-15 pode ser qualquer IL-15, por exemplo, uma IL-15 humana, ou uma IL -15 de mamífero não humano, ou uma IL-15 que não é de mamífero . IL-15 de mamífero não humano ilustrativos são IL-15 de macaco, ou uma IL-15 murina (por exemplo, IL-15 de ratinho de número de acesso NM_008357; IL-15 de rato de número de acesso NM_013129), ou uma IL-15 de coelho (por exemplo, número de acesso DQ157152), uma IL-15 de ovelha (por exemplo, número de acesso NM_001009734), ou uma IL-15 de porco (por exemplo, número de acesso NM_211390). IL-15 ilustrativas que não são de mamíferos são galinha (por exemplo, número de acesso NM J204571). 21 ΡΕ1934353

Mais preferentemente, a referida IL-15 é uma IL-15 humana. Mais preferentemente, a sequência de aminoácido da referida IL-15 humana é a sequência de SEQ ID NO: 48. A IL-15 não se liga a IL-2Ralfa. Em vista das aplicações biológicas e médicas contempladas pela presente invenção, o referido fragmento, mimético ou agonista de IL-15 preferentemente não se liga a IL-2Ralfa.

Aos termos "agonista" e "mimético" são aqui atribuídos os significados convencionais no campo técnico.

Um composto é denominado agonista IL-15 quando induz uma resposta biológica que tem um nível similar ou mais elevado do que aquele induzido pela IL-15 nativa. Preferem-se agonistas que induzem um nível de resposta biológica ainda mais elevado (super-agonista).

Um agonista de IL-15 tem tipicamente uma afinidade para ligação a IL-15Ralfa e/ou a IL-15Rbeta/gama que é pelo menos não significativamente diferente daquela da IL-15 nativa, e que é preferentemente significativamente mais elevada do que aquela da IL-15 nativa.

Um mimético (ou mimetopo) de IL-15 refere-se a qualquer composto que é capaz de mimetizar as acções biológicas de IL-15. 22 ΡΕ1934353

Na presente invenção, miméticos ou agonistas de IL-15 preferidos são aqueles que são capazes de mimetizar a acção biológica de IL-15 através da via de sinalização de IL-15Rbeta/gama. Tal mimético preferido de IL-15 tem assim a capacidade se ligar ao complexo IL-15beta/gama, e assim induzir e/ou estimular a transdução de um sinal biológico através do referido complexo IL-15Rbeta/gama.

Miméticos ou agonistas preferidos de IL-15 da invenção têm uma afinidade para ligação a IL-15beta/gama que é pelo menos não significativamente diferente daquela de IL-15 nativa, e que é preferentemente significativamente superior àquela da IL-15 nativa. Agonistas ou miméticos apropriados foram descritos em, por exemplo, o pedido PCT internacional de patente PCT/EP2005/002367, depositado a 10 de Fevereiro de 2005, no nome de INSERM.

Polipéptido contendo sushi: A sequência de aminoácidos do referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi: - é a sequência de aminoácido da região extracelular de IL-15Ralfa (compreendendo a referida região extracelular de IL-15Ralfa um domínio sushi IL-15Ralfa), ou - é a sequência de aminoácidos de um fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa, em que o referido fragmento reteve o domínio sushi da referida região extracelular de IL-15Ralfa, em que o referido domínio sushi é definido como começando no primeiro resíduo cisteína codificado pelo exão 23 ΡΕ1934353 2 (Cl) e terminando no quarto resíduo cisteína codificado pelo exão 2 (C4), sendo ambos os resíduos Cl e C4 incluídos no domínio sushi, ou - é uma sequência de aminoácidos variante que reteve cada um dos quatro resíduos cisteína (Cl, C2, C3 e C4) do referido domínio sushi.

Uma definição alternativa da definição é que se inicia no primeiro resíduo cisteína (Cl) após o péptido sinal, e termina no quarto resíduo cisteína (C4) após o péptido sinal. A referida sequência de aminoácidos variante pode compreender uma sequência variante conservativa do domínio sushi IL-15Ralfa.

Tal sequência variante conservativa do domínio sushi de IL-15Ralfa deriva da sequência de um domínio sushi parental, através de pelo menos uma deleção e/ou pelo menos uma substituição e/ou pelo menos uma adição de aminoácido, mas reteve a capacidade de pelo menos uma das seguintes características: i. aumento da afinidade de IL-15 para IL15Rbeta/gama, ii. indução e/ou estimulação de um efeito anti-apoptótico em células beta/gama-positivas, e mais particularmente de células beta/gama-positivas alfa-negativas, tais como células T e/ou NK virgens. iii. aumento da eficiência da acção biológica de IL-15 através da via de sinalização IL-15Rbeta/gama, ou seja, 24 ΡΕ1934353 induzindo ou estimulando a proliferação e/ou activação de células positivas para beta/gama, e mais particularmente de células beta/gama-positivas alfa-negativas, tais como células T e/ou NK virgens ou quiescentes.

Preferentemente, as referidas variantes conserva-tivas retiveram a caracteristica descrita em iii. acima.

Linhas celulares apropriadas para testar as ca-racterísticas acima mencionadas são células IL-15Rbeta/ gama-positivas IL-15Ralfa-negativas. Um exemplo ilustrativo de tais linhas celulares é a linha celular 32D, que pode ser transfectada com uma cadeia beta e uma cadeia gama (por exemplo, uma cadeia beta humana e gama humana).

Alternativamente, células NK e/ou T virgens ou quiescentes podem ser purificadas a partir de uma amostra biológica, tal como uma amostra de sangue.

Preferentemente, a referida sequência de amino-ácidos variante é pelo menos 85% idêntica à sequência de aminoácidos de tal região extracelular de IL-15Ralfa, ou de tal fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa, relativamente à totalidade do comprimento desta sequência da região extracelular de IL-15Ralfa ou de um fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa.

Mais preferentemente, esta percentagem de identidade de sequência é de pelo menos 90%, ainda mais preferen- 25 ΡΕ1934353 temente de pelo menos 92%, preferivelmente de pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.

Tais sequências de aminoácidos variantes abrangem especialmente os polimorfismos de IL-15Ralfa que ocorrem naturalmente nas espécies animais, assim como variantes conservativas que podem ser produzidas pela pessoa competente na técnica. IL-15Ralfa: O exão 1 de IL-15Ralfa codifica para o péptido sinal de IL15R-alfa. O exão 2 de IL-15Ralfa codifica para o domínio sushi de ILl5R-alfa.

Uma parte da extremidade 5' do exão 3 codifica para a região conhecida pela região flexível de IL-15Ralfa. A parte remanescente do exão 3, assim como os outros exões extracelulares (isto é, o exão 4, o exão 5, e uma parte 5' do exão 6 para IL-15Ralfa humano, assim como para a maioria das espécies) codificam para uma região rica em locais de glicosilação, também conhecida como a região de cauda do IL-15Ralfa.

Os restantes exões IL-15Ralfa (isto é, uma parte 26 ΡΕ1934353 do exão 6, assim como o exão 7 para IL-15Ralfa humano, assim como para a maioria das espécies) codificam para as regiões transmembranar e intracitoplasmática de IL-15Ralfa.

Vantajosamente, em vista das aplicações médicas da presente invenção, o referido IL-15Ralfa é preferentemente IL-15Ralfa humano. A sequência de aminoácidos do referido IL15Ralfa humano é mais preferivelmente a sequência de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 (267 aminoácidos). A região extracelular do IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 (1..209 de SEQ ID NO: 3). O péptido sinal deletado de SEQ ID NO: 40 é listado como as SEQ ID NO: 44 (31..209 de SEQ ID NO:3).

Alguns alelos de IL-15Ralfa podem ter um aminoácido Thr (aminoácido t, codificado por act, ace, aca, ou acg) , em vez de um aminoácido Asn (aminoácido n, codificado por aat ou aac) na posição 182 de SEQ ID NO: 3. Tais variantes ocorrem naturalmente, e são funcionais.

No presente pedido, pretende-se que tais vari- antes alélicas que ocorrem naturalmente do IL-15Ralfa humano sejam equivalentes às sequências do IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 (sequência de aminoácidos ), e SEQ ID NO: 1 ou NO: 2 (sequências de ADNc e sequências codificantes) , e às sequências de IL-15Ralfa humano de referência que delas derivam directamente, isto é, as sequências da região extracelular de SEQ ID NO: 40 ou NO: 27 ΡΕ1934353 44 (sequências de aminoácidos) , e SEQ ID NO: 39 e NO: 43 (sequências codificantes).

As posições dos sete exões do IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO:3 são descritas na tabela 1 seguinte. A este respeito, deve notar-se que as posições do exão 1 são 1..170, e aquelas do exão 2 são 171..365, tal como descrito na tabela 1 abaixo, e que não são, respectivamente, 1..171 e 172..365, tal como declarado na sequência disponível sob o número de acesso U31628.

Tabela 1:

Sequência codificante de IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 2) Exão 1 1. . 170 Exão 2 171..365 Exão 3 366..464 Exão 4 465..665 Exão 5 666..698 Exão 6 699..774 Exão 7 775..883

As posições das diferentes regiões e partes do IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 são apresentadas na tabela 2 abaixo. 28 ΡΕ1934353

Tabela 2: IL-15Ralfa humano Posições da sequência codificante em SEQ ID NO: 1 Posições dos aminoácidos na SEQ ID NO: 3 Péptido sinal 83. .172 1. .30 Proteína IL-15Ralfa 173 . .883 31 . .267 Péptido sinal 83..172 1 . . 30 Parte codificada pelo exão 2 que contém o domínio sushi (it-sushi-i) 173..364 31..94 Domínio sushi (de Partes da Cl a C4) 179..361 33.93 proteína Região flexível IL-15Ralfa (irdpalvhqrpapp) 362..403 94.107 humana Região rica em locais de glicosilação 404..709 108. .209 Parte transmembranar 710..766 210. .228 Parte intracitoplasmática 767..883 229..267

No presente pedido, o símbolo com dois pontos 29 ΡΕ1934353 colocado entre um primeiro número e um segundo número descreve uma sequência isolada que é idêntica à sequência que se estende da posição do "primeiro número" até à posição do "segundo número".

No presente pedido, quando as sequências são definidas pelas posições de "inicio" e "paragem", pretende-se que estas posições de início e paragem sejam consideradas como incluídas na sequência descrita.

Para algumas aplicações, tais como testes preliminares, investigação, desenvolvimento, rastreio de compostos ou de células, estudos pré-clínicos ou clínicos (incluindo testes relacionados com qualidades farmacológica, toxicológica, farmacocinética, ou biológicas, assim como testes relacionados com "avaliação de risco-benefício" e segurança), pode no entanto ser utilizado IL-15Ralfa de mamífero não humano. IL-15Ralfa de mamífero não humano preferido compreende especialmente IL-15Ralfa de macaco (por exemplo IL-15Ralfa de chimpanzé), ou uma IL-15 murina (por exemplo, IL-15Ralfa de ratinho; IL-15Ralfa de rato), ou um IL-15Ralfa de coelho, ou um IL-15Ralfa de porco.

Exemplos ilustrativos de sequências IL-15Ralfa de tais IL15Ralfa de mamífero não humano são aquelas codificadas pelas sequências de ácidos nucleicos disponíveis como o número de acesso NM 008358 (IL-15Ralfa de Mus musculus: 30 ΡΕ1934353 sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 72, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73), como o número de acesso XM_521684 (IL-15Ralfa de Pan troglodytes: sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 78, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:79), ou como o número de acesso XM_577598 (Rattus norvegicus: IL-15Ralfa: sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 84, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 85). Ver figuras 40, 41, 42 para exemplos ilustrativos das posições e sequências do exão 2 e do exão 3 do IL-15Ralfa humano.

Região extracelular de IL-15Ralfa: A região extracelular de IL-15Ralfa é geralmente definida como a região de uma sequência de IL-15Ralfa que se estende do seu primeiro aminoácido da extremidade N, até ao último aminoácido da região da cauda (ou região rica em locais de glicosilação). Tal como descrito em maior detalhe abaixo, a região de cauda de uma sequência de IL-15Ralfa pode ser determinada pelo perito na técnica, por exemplo, através da ajuda de um programa informático. A referida região extracelular de IL-15Ralfa é uma região extracelular de IL-15Ralfa humano, ou uma região extracelular de IL-15Ralfa de mamífero não humano.

Entre as sequências de aminoácidos das regiões extracelulares de IL-15Ralfa, é preferida a sequência de aminoácidos da região extracelular de IL-15Ralfa de SEQ ID NO: 40. 31 ΡΕ1934353 A sequência de aminoácidos da região extracelular de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 40 é codificada pelos exões 1-5, e uma pequena porção 5' do exão 6 do IL-15Ralfa humano. 0 exão 1 do IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 8) codifica para o péptido sinal de IL-15Ralfa (sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4; sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5). O exão 2 (SEQ ID NO: 9) compreende a sequência que codifica para o domínio sushi de IL-15Ralfa humano. O último codão 3' do exão 2 codifica para o primeiro aminoácido da região flexível.

Uma porção 5' do exão 3 (exão 3 de SEQ ID NO: 10) codifica para a região flexível do IL-15Ralfa humano. A porção 3' remanescente do exão 3, mais o exão 4 (SEQ ID NO: 11), o exão 5 (SEQ ID NO: 12), e uma porção 5' do exão 6 (699..709 de SEQ ID NO:l) codifica para uma região rica em locais de glicosilação (também conhecida como região de cauda). A sequência de SEQ ID NO: 44 é a forma deletada de um péptido sinal da região extracelular do IL-15Ralfa de SEQ ID NO: 40. Na presente invenção podem ser utilizados 32 ΡΕ1934353 péptidos sinal, mas são opcionais. Tala péptido sinal pode ser um péptido sinal IL-15Ralfa, ou o péptido sinal de outra proteína. Assim, a forma deletada de um péptido sinal de uma região extracelular de IL-15Ralfa (tal como SEQ ID NO: 44) é directamente equivalente à sequência completa da sequência extracelular de IL15Ralfa (tal como SEQ ID NO: 40) .

Regiões extracelulares de IL-15Ralfa de mamíferos não humanos, são aquelas que têm a sequência de SEQ ID NO: 74 (1..204 de IL- 15Ralfa de Mus musculus) , de SEQ ID NO: 80 (1..286 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes), de SEQ ID NO: 86 (1..182 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus).

Domínio sushi: A região extracelular de IL-15Ralfa ou um seu fragmento que define o referido pelo menos um polipéptido contendo um domínio sushi contém um domínio sushi IL-15Ralfa. A região extracelular de lL-15Ralfa contém um domínio, que é conhecido como o domínio sushi (Wei et al. 2001, J. Immunol. 167: 277-282). O domínio sushi de IL-15Ralfa tem uma conformação de folha beta. É codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa. Inicia-se 33 ΡΕ1934353 no primeiro resíduo de cisteína codificado pelo exão 2 (Cl), e termina no quarto resíduo de cisteína codificado pelo exão 2 (C4) .

Quando se considera a sequência da proteína IL-15Ralfa na orientação convencional da extremidade N à extremidade C, o domínio sushi de IL-15Ralfa pode ser definido como se iniciando no primeiro resíduo de cisteína (Cl) após o péptido sinal, e terminando no quarto resíduo de cisteína (C4) após o péptido sinal.

Os resíduos Cl e C4 são ambos incluídos na sequência sushi.

Assim, quando a identificação do domínio sushi é realizada numa sequência IL-15Ralfa que é deletada da sua sequência de péptido sinal (tal como, por exemplo, a sequência SEQ ID NO: 44), o domínio sushi é então definido como se iniciando no primeiro resíduo de cisteína (iniciando-se na extremidade N da proteína), e terminando no quarto resíduo de cisteína desta sequência IL-15Ralfa. 0 domínio IL-15Ralfa pode também ser determinado pela análise da sequência de aminoácidos de IL-15Ralfa com um programa informático apropriado tal com:

Prosite (http://us.expasy.org/prosite/),

InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/), SMART (http://elm.eu.org/). 34 ΡΕ1934353 A sequência de aminoácidos do referido domínio sushi pode ser a sequência de aminoácidos de um domínio sushi de IL-15Ralfa humano, ou de um domínio sushi de um mamífero não humano.

Entre as sequências de aminoácidos de domínios sushi IL-15Ralfa humano, a sequência de aminoácidos do domínio sushi de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 14 é preferida.

Por exemplo, a sequência de aminoácidos do referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa humano pode ser a sequência de SEQ ID NO: 16 (it + sushi de IL-15Ralfa humano), ou NO: 18 (t + sushi de IL-15Ralfa humano).

Exemplos ilustrativos de domínios sushi do IL-15Ralfa de mamíferos não humanos, são a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 (36..-96 de IL-15Ralfa de Mus musculus), de SEQ ID NO: 81 (13..73 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes), ou de SEQ ID NO: 87 (24..84 de IL-15Ralfa de

Rattus norvegicus). Péptido sinal:

Um péptido sinal é uma cadeia peptídica curta (comprimento de 15-60 aminoácidos) que governa o transporte após a tradução de uma proteína. Alguns péptidos sinal são 35 ΡΕ1934353 clivados da proteína a partir da peptidase sinal após o transporte das proteínas. Os péptidos sinal podem também ser denominados sinais de direccionamento ou sequências sinal. As sequências de aminoácidos dos péptidos sinal direccionam as proteínas que são sintetizadas no citossol para certos organelos tais como o núcleo, matriz mitocondrial, retículo endoplasmático, cloroplasto, e peroxissoma. 0 péptido sinal de IL-15Ralfa é uma sequência na extremidade N de cerca de 29-33 aminoácidos, por exemplo, 30-32 aminoácidos. Inicia-se no primeiro resíduo de aminoácido da extremidade N de IL-15Ralfa. É determinado pela análise da sequência de aminoácidos da extremidade N de IL-15Ralfa com um programa informático apropriado tal como:

SIGCLEAVE (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/sigcleave.html ) ,

InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/), SMART (http://elm.eu.org/). 0 péptido sinal de IL-15Ralfa de Mus musculus é uma sequência de aminoácidos da extremidade N-terminal de 32 aminoácidos (ver número de acesso NP_032384; sig_peptide 1..32) . 0 péptido sinal de IL-15Ralfa humano, tal como 36 ΡΕ1934353 ilustrado SEQ ID NO: 5, é uma sequência de aminoácidos na terminação N de 30 aminoácidos, que contém um resíduo de cisteína.

Fragmento de parte codificada pelo exão 2: O exão 2 de IL-15Ralfa contém o domínio sushi, isto é, a unidade estrutural mínima que é necessária pela presente invenção. O referido fragmento da região IL-15Ralfa extra-celular pode compreender (ou pode essencialmente consistir em) : - a parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelo exão 2 do referido IL-15Ralfa, ou de - um fragmento de tal parte codificada pelo exão 2.

De acordo com a presente invenção, o referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa tem de compreender pelo menos um domínio IL-15Ralfa. Assim, um fragmento de uma parte codificada pelo exão 2 pode ser qualquer um seu fragmento, desde que ainda compreenda o domínio sushi (do resíduo Cl ao resíduo C4).

Por exemplo, a parte codificada pelo exão 2 da região extracelular humana de SEQ ID NO: 40 é a sequência que se estende da posição 31 à posição 94 (isto é, SEQ ID NO: 24), isto é, é: it + sushi + i. 37 ΡΕ1934353

Fragmentos desta parte codificada pelo exão 2 são: t + sushi; it + sushi; t + sushi + i.

Por exemplo, a referida sequência codificada do exão 2 pode ser: - a parte codificada do exão 2 do IL-15Ralfa extracelular humano, que é a sequência de SEQ ID NO: 24, - a parte codificada do exão 2 de IL-15Ralfa extracelular de Pan troglodytes, que é a sequência de SEQ ID NO: 98, - a parte codificada do exão 2 de IL-15Ralfa extracelular de Mus musculus, que é a sequência de SEQ ID NO: 97, - a parte codificada do exão 2 de IL-15Ralfa extracelular de Rattus norvegicus, que é a sequência de SEQ ID NO: 99.

Variantes de fragmentos da região extracelular de IL-15Ralfa são abrangidos no âmbito da presente invenção.

Tais variantes incluem especialmente aquelas que têm uma deleção e/ou substituição e/ou adição amino conservativa na sua sequência.

Uma sequência variante conservativa de um fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa derivam da sequência da um fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa parental, por pelo menos uma deleção e/ou pelo 38 ΡΕ1934353 menos uma substituição e/ou pelo menos uma adição de aminoácido, e reteve a capacidade de pelo menos uma das seguintes características: i. aumento da afinidade de IL-15 para IL- 15Rbeta/gama, ii. indução e/ou estimulo de um efeito anti- apoptótico nas células positivas para beta/gama, e mais particularmente para células positivas para beta/gama e negativas para alfa, tais como células NK e/ou T virgens, iii. aumento da eficiência da acção biológica de IL-15 através da via de sinalização de IL-15Rbeta/gama, isto é, indução e/ou estímulo da proliferação e/ou activa-ção de células positivas para beta/gama, e mais particularmente para células positivas para beta/gama e negativas para alfa, tais como células NK e/ou T virgens.

Preferentemente, as referidas variantes conserva-tivas retiveram a característica descrita em iii. acima.

Variantes conservativas compreendem especialmente aquelas que têm uma sequência de aminoácido que têm uma identidade de pelo menos 85% com a sequência parental, em relação à totalidade do comprimento total da sequência parental. Preferentemente, a referida percentagem de identidade é de pelo menos 90%, ainda mais preferentemente de pelo menos 92%, preferivelmente de pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. 39 ΡΕ1934353

Por exemplo, iniciando da parte codificada pelo exão 2 acima mencionada da SEQ ID NO: 40, será evidente a pessoas peritas que i+sushi, i+sushi+t, i+sushi+i, it+sushi+t são variantes conservativas, que são tecnicamente equivalentes ao fragmento parental.

Fragmento de parte codificada pelo exão 2-3:

De acordo com uma realização muito vantajosa da presente invenção, o referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa pode ainda compreender pelo menos uma sequência de aminoácidos da sequência que é codificada pelo exão 3 do referido IL-15Ralfa. 0 referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa pode assim compreender, ou consistir em: - a parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelos exões 2 e 3 do referido IL-15Ralfa, ou de - um fragmento de uma tal parte codificada pelo exão 2-3, que reteve o referido domínio sushi. O exão 3 do IL-15Ralfa humano da SEQ ID NO: 3 (isto é, da região extracelular humana da SEQ ID NO: 40) é a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 10. A parte codificada pelo exão 3 da SEQ ID NO: 3 é a sequência da SEQ ID NO: 93, isto é, a parte de sequência 95..127 da SEQ ID NO: 3 ou da SEQ ID NO: 40 (isto é, a sequência de aminoácidos que se estende da posição 95 à posição 127 da 40 ΡΕ1934353 sequência do IL-15Ralfa humano da SEQ ID NO: 3 ou NO: 40, sendo ambas as posições 95 e 127 incluídas).

Por exemplo, a sequência codificada pelo exão 3 pode ser: - a parte codificada pelo exão 3 do IL-15Ralfa extracelular humano, que é a sequência da SEQ ID NO: 93, - a parte codificada pelo exão 3 do IL-15Ralfa extracelular de Pan troglodytes, que é a sequência da SEQ ID NO: 95, - a parte codificada pelo exão 3 do IL-15Ralfa extracelular de Mus musculus, que é a sequência da SEQ ID NO: 94, - a parte codificada pelo exão 3 do IL-15Ralfa extracelular de Rattus norvegicus, que é a sequência da SEQ ID NO: 96.

Um fragmento de uma parte codificada pelo exão 3 pode ser um fragmento de apenas um aminoácido, preferentemente de pelo menos dois aminoácidos, preferivelmente de pelo menos três aminoácidos, mais preferivelmente de pelo menos quatro aminoácidos, preferencialmente de pelo menos cinco aminoácidos.

Os inventores demonstram que uma parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa, ou um seu fragmento, com vantagem aumenta a afinidade e a eficiência do composto resultante, em termos de transdução de sinal IL-15Rbeta/gama, e 41 ΡΕ1934353 de activação e proliferação de células positivas para IL-15Rbeta/gama-positive.

Quando se pretende o polipéptido contendo o domínio sushi para a produção de uma proteína de fusão, o perito na técnica pode preferir limitar o número de aminoácidos do exão 3 a um número óptimo, isto é, ao número de aminoácidos que representa um compromisso equilibrado entre o aumento em afinidade e eficiência por um lado, e o aumento no tamanho molecular e dificuldades conformacionais pelo outro lado.

Assim, o perito na técnica pode considerar vantajoso limitar o número de aminoácidos codificados pelo exão 3 que são adicionados ao referido domínio sushi de IL-15Ralfa a um número de 30, preferentemente de 25, preferivelmente de 20, mais preferivelmente de 18, preferencialmente de 17, por exemplo, de 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 , 10, 9, 8, 7, 6. Os números preferidos de aminoácidos codificados pelo exão 3 são então aqueles cujos intervalos resultam da combinação de cada um dos limites inferiores mencionados acima com cada um dos limites superiores mencionados acima.

Um exemplo ilustrativo de fragmentos preferidos da parte codificada pelo exão 3 são todos os fragmentos que derivam da parte codificada pelo exão 3 do IL-15Ralfa humano da SEQ ID NO: 3 (ou da SEQ ID NO: 40) , isto é, a parte que se estende da posição 95 à posição 127, sendo 42 ΡΕ1934353 ambas as posições 95 e 127 incluídas (por outras palavras: sequência 95..127 da SEQ ID NO: 3 ou NO: 40).

Um composto preferido da invenção compreende assim pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi o qual, além do referido domínio sushi, compreende pelo menos um aminoácido da sequência que se estende da posição 95 à posição 127 da SEQ ID NO: 3 (sendo ambas as posições 95 e 127 incluídas). Muito preferencialmente compreende: - um número preferido de tais aminoácidos (isto é, "pelo menos dois aminoácidos, preferivelmente de pelo menos três aminoácidos, mais preferivelmente de pelo menos quatro aminoácidos, preferencialmente de pelo menos cinco aminoácidos"), ou - um número muito preferido de tais aminoácidos (isto é, qualquer combinação resultante de "pelo menos dois aminoácidos, preferivelmente de pelo menos três aminoácidos, mais preferivelmente de pelo menos quatro aminoácidos, preferencialmente de pelo menos cinco aminoácidos", e "de no máximo 30, preferentemente de no máximo 25, preferivelmente de no máximo 20, mais preferivelmente de no máximo 18, preferencialmente de no máximo 17, por exemplo de 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 , 10, 9, 8, 7, 6").

Assim, o referido fragmento da região extrace-lular de IL-15Ralfa compreende com vantagem a parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelo exão 2 do referido IL-15Ralfa, ou uma sua variante conservativa tal como definido acima, e compreende ainda 43 ΡΕ1934353 pelo menos um aminoácido da sequência codificada pelo exão 3 do referido IL-15Ralfa.

Mais particularmente, o referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa pode compreender (ou pode essencialmente consistir em): - a parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelos exões 2 e 3 do referido IL-15Ralfa, ou uma sua variante conservativa, ou - a parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelo exão 2 do referido IL-15Ralfa, e um fragmento da parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelo exão 3 do referido IL-15Ralfa.

Ainda mais particularmente, o referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa pode compreender (ou pode essencialmente consistir em) : - a parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelos exões 2 e 3 do referido IL-15Ralfa, ou uma sua variante conservativa, ou - um fragmento de uma tal parte codificada pelo exão 2-3 ou de uma tal variante codificada pelo exão 2-3, com a ressalva implicada que tal fragmento reteve o domínio sushi. A definição acima fornecida de variantes conservativas aplica-se mutatis mutandis a uma variante conservativa de uma parte codificada pelo exão 2-3, isto é, é uma sequência que deriva de uma sequência codificada pelo 44 ΡΕ1934353 exão 2-3 parental, por pelo menos uma deleção e/ou pelo menos um substituição e/ou pelo menos um adição de um aminoácido, e reteve a capacidade de pelo menos uma das seguintes características: i. aumentar a afinidade de IL-15 para IL-15Rbeta/gama, ii. induzir e/ou estimular um efeito anti-apoptótico em células positivas para células beta/gama, e mais particularmente de células positivas para beta/gama e negativas para alfa, tais como células NK e/ou T virgens, iii. aumentar a eficiência da acção biológica de IL-15 através da via de sinalização 15Rbeta/gama, isto é, induzindo e/ou estimulando a proliferação e/ou a activação de células positivas para beta/gama-positive, e mais particularmente de células positivas para beta/gama e negativas para alfa, tais como células NK e/ou T virgens ou quiescentes.

Preferentemente, as referidas variantes conserva-tivas retiveram a caracteristica descrita em iii. acima.

As variantes conservativas compreendem especialmente aquelas que têm uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade de pelo menos 85% com a sequência parental, em relação ao comprimento total desta sequência parental. Preferentemente, a referida percentagem de identidade é de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 92%, preferencialmente de pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. 45 ΡΕ1934353

Região flexível (localizada após o domínio sushi, codificada por uma parte 3' do exão 2 e uma parte 5' do exão 3, ou por uma parte 5' do exão 3):

Os inventores demonstram que a região flexível de IL-15Ralfa está mais particularmente envolvida neste aumento na eficiência de transdução de sinal, e neste aumento na proliferação e activação das células positivas para IL-15Rbeta/gama. Assim, de acordo com uma realização muito vantajosa da presente invenção, o referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa pode, além do domínio sushi do IL-15Ralfa, compreender ainda uma região flexível do IL-15Ralfa, ou um fragmento da região flexível do IL-15Ralfa.

Uma região flexível de IL-15Ralfa é definida como uma sequência de aminoácidos que se inicia no primeiro resíduo de aminoácidos após o domínio sushi (quando se considera a sequência IL-15Ralfa na orientação da extremidade N para C), e que termina no último resíduo de amino-ácido antes do primeiro local potencial de glicosilação.

As posições dos potenciais locais de glicosilação são determinadas utilizando o programa informático NetOGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-3.1/) para a identificação de locais de O-glicosilação, e o programa informático NetNGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) para a identificação de potenciais locais de N-glico-silação. 46 ΡΕ1934353

Num IL-15Ralfa humano, a sequência de aminoácidos da região flexível consiste em catorze aminoácidos que estão localizados após o domínio sushi deste IL-15Ralfa, numa posição da extremidade C em relação ao referido domínio sushi, isto é, a referida região flexível de IL-15Ralfa inicia-se no primeiro aminoácido após o referido (C4) resíduo de cisteína, e termina no décimo quarto aminoácido (contando-se na orientação convencional "da extremidade N para a extremidade C").

No IL-15Ralfa humano da SEQ ID NO: 3 (cuja região extracelular é a sequência da SEQ ID NO:40), a sequência de aminoácidos da referida região flexível do IL-15Ralfa humano é a sequência da SEQ ID NO: 20. Contem um aminoácido codificado pelo exão 2 (aminoácido i), e treze aminoácidos codificados pelo exão 3.

No IL-15Ralfa de Mus musculus da SEQ ID NO:73, a região flexível tem a sequência da SEQ ID NO:76.

No IL-15Ralfa de Pan troglodytes da SEQ ID NO:79, a região flexível tem a sequência da SEQ ID NO:82.

No IL-15Ralfa de Rattus norvegicus da SEQ ID NO:85, a região flexível tem a sequência da SEQ ID NO:88.

Os referidos pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi podem então compreender o domínio sushi da SEQ ID NO: 75 e a região flexível da SEQ ID NO: 76 (Mus 47 ΡΕ1934353 musculus) , o domínio sushi da SEQ ID NO: 81 e a região flexível da SEQ ID NO: 82 (Pan troglodytes) , ou o domínio sushi da SEQ ID NO: 87 e a região flexível da SEQ ID NO: 88 (Rattus norvegicus).

Com vantagem, o referido pelo menos um poli-péptido contendo o domínio sushi preferentemente compreende o domínio sushi humano da SEQ ID NO: 14, e a região flexível humana da SEQ ID NO: 20 (por exemplo, SEQ ID NO: 16 ou NO: 18, seguida pela região flexível da SEQ ID NO: 20). Preferentemente, o referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi compreende, ou é, um polipéptido da SEQ ID NO: 30 (it + sushi + flexível), opcionalmente deletado da sua extremidade N i e/ou t. O referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa pode alternativamente compreender, além do domínio sushi, um fragmento da região flexível. Por fragmento da região flexível, pretende-se aqui significar qualquer seu fragmento, desde apenas um aminoácido da referida região flexível. Preferentemente, um fragmento da região flexível compreende pelo menos dois aminoácidos, preferivelmente pelo menos três aminoácidos.

Um fragmento da região flexível de IL-15Ralfa pode deste modo ser um fragmento de 1 (por exemplo, aminoácido i), 2 (por exemplo, aminoácidos ir) , 3 (por exemplo, aminoácidos ird), 4 (por exemplo, aminoácidos irdp), 5 (por exemplo, aminoácidos irdpa), 6 (por exemplo, aminoácidos irdpa), 7 (por exemplo, aminoácidos irdpal), 8 (por 48 ΡΕ1934353 exemplo, aminoácidos irdpalv) , 9 (por exemplo, aminoácidos irdpalvh), 10, 11 , 12, 13 ou 14 aminoácidos.

Com vantagem, o referido pelo menos um poli-péptido contendo o domínio sushi compreende preferentemente o domínio sushi humano da SEQ ID NO: 14, e um fragmento da região flexível da SEQ ID NO: 20. A sequência de aminoácidos do referido fragmento da região flexível de IL-15Ralfa compreende, ou é, i, ou ir, ou ird. 0 polipéptido contendo o domínio sushi da SEQ ID NO: 22, 24, e 26 compreende o domínio sushi da SEQ ID NO: 14, e o fragmento "i" da região flexível da SEQ ID NO: 20. O polipéptido contendo o domínio sushi da SEQ ID NO: 28 compreende o domínio sushi da SEQ ID NO: 14, e o fragmento "ird" da região flexível da SEQ ID NO: 20. A referida sequência de aminoácidos do fragmento da região extracelular do IL-15Ralfa humano pode mais particularmente compreender, além do referido domínio sushi e da sequência de aminoácidos da região flexível: a sequência de aminoácidos de uma região extracelular de IL-15Ralfa que é conhecida como a região rica em locais de glicosilação, ou como a região de cauda, ou - um seu fragmento. 49 ΡΕ1934353

Região rica em locais de glicosilação, também conhecida como região de cauda (codificada por uma parte 3' do exão 3, pelos outros exões extracelulares): A região rica em locais de glicosilação de IL-15Ralfa é uma região que compreende vários potenciais locais de glicosilação. É pro vezes referida como a região de "cauda" de IL-15Ralfa. Inicia-se no primeiro resíduo de aminoácidos após a região flexível (quando se considera a sequência na orientação da extremidade N para a extremidade C), e termina no último resíduo de aminoácido antes da região transmembranar de IL-15Ralfa. Compreende vários potenciais locais de glicosilação. 0 domínio transmembranar é determinado pela análise da sequência de aminoácidos de IL-15Ralfa com programa informático apropriado tal como: TopPred (http://biowed.pasteur.fr/seqanal/interfaces/topred.html), TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html). A região da cauda de IL-15Ralfa humano compreende vários locais de O-glicosilação, e um local de N-glicosilação. A região de cauda do IL-15Ralfa humano da SEQ ID NO: 32 é codificada por uma parte 3' do exão 3, e pelo exão 4, exão 5, e a parte 5' do exão 6 do referido IL-15Ralfa humano.

Exemplo ilustrativo da cauda da região extra- 50 ΡΕ1934353 celular de IL-15Ralfa de um mamífero não humano, são as sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 77 (Mus musculus), da SEQ ID NO: 83 (Pan troglodytes) , ou da SEQ ID NO: 89 (Rattus norvegicus).

Por fragmento, ou sub-fragmento, de uma região em locais de glicosilação (ou fragmento ou sub-fragmento da região de cauda), significa aqui qualquer fragmento, ou sub-fragmento, da referida região, desde apenas um aminoácido da referida região. Preferentemente, o referido fragmento, ou sub-fragmento, compreende pelo menos dois aminoácidos, preferivelmente pelo menos três aminoácidos. A referida sequência de aminoácidos de um fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa pode assim compreender: - a parte codificada pelo exão 3 da região rica em locais de glicosilação de IL-15Ralfa, ou - um fragmento de uma tal parte codificada pelo exão 3.

Uma sequência preferida de aminoácidos para a parte codificada pelo exão 3 da região rica em locais de glicosilação do IL-15Ralfa humano é a sequência de aminoácidos da SEQ SD NO: 34. Um polipéptido contendo o domínio sushi da invenção é com vantagem o polipéptido da SEQ ID NO: 36 (opcionalmente deletado dos primeiros aminoácidos i e/ou t da extremidade C). 51 ΡΕ1934353

Tal como iniciado previamente, pode ser usado qualquer fraqmento da parte codificada pelo exão 3 que o perito na técnica considere apropriado, por exemplo, qualquer fragmento de pelo menos um aminoácido, preferentemente de pelo menos dois aminoácidos, preferivelmente de pelo menos três aminoácidos.

ExÕes extracelulares, diferentes dos exões 1 , 2, 3 :

Os exões IL-15Ralfa extracelulares, diferentes dos exões 1, 2, 3, codificam para um fragmento da extremidade C da região da cauda.

Tais partes, ou seus fragmentos, podem ainda aumentar a eficiência dos compostos da invenção. A referida sequência de aminoácidos de um fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa pode assim ainda compreender a parte de IL-15Ralfa extracelular que é codificada pelo exão 4, e/ou exão 5 e/ou exão 6, ou qualquer fragmento de tal parte.

As posições dos exão posições do IL-15Ralfa humano da SEQ ID NO: 3 são aqui apresentadas na tabela 1 acima.

Um exemplo ilustrativo da sequência de aminoácidos de um tal polipéptido contendo o domínio sushi são as sequências da SEQ ID NO: 38, ou a SEQ NO: 42 52 ΡΕ1934353 deletada do péptido sinal, ou a SEQ NO: 44 deletada do péptido sinal.

Exemplos ilustrativos de polipéptidos contendo os domínios sushi são aqueles que contêm o domínio sushi, a reqião flexível e a cauda completa de IL-15Ralfa (por exemplo, a cauda do IL-15Ralfa humano da SEQ ID NO: 32/ a cauda do IL-15Ralfa de Pan troqlodytes da SEQ ID NO: 83; a cauda do IL-15Ralfa de Mus musculus da SEQ ID NO: 77; a cauda do IL-15Ralfa de Rattus norvegicus da SEQ ID NO: 89) , e opcionalmente um péptido sinal.

Acção biológica de IL-15:

No organismo a nível celular, um produto da invenção caracteriza-se por induzir e/ou estimular a acção biológica de IL-15. Estimula aquelas acções biológicas que são exercidas por, indutíveis com, ou estimuladas por, IL-15, miméticos de IL-15, e/ou agonistas de IL-15. Os produtos da invenção (isto é, os polipéptidos contendo domínios sushi aqui descritos, em forma isolada, e mais particularmente os compostos da invenção) podem então ser considerados como um agonista da acção biológica de IL-15.

Uma propriedade especial e vantajosa que caracteriza um produto da invenção que é capaz de induzir e/ou estimular a via de sinalização IL-15Rbeta/gama, e mais particularmente de estimular a acção biológica de IL15 através da via de sinalização IL-15Rbeta/gama. 53 ΡΕ1934353

Ao nivel molecular, um produto da invenção é assim mais particularmente caracterizado por aumentar a eficiência da via de sinalização IL-15Rbeta/gama. Sensibiliza aquelas células que expressam o complexo IL-15Rbeta/gama à acção de IL-15. Ainda mais particularmente, sensibiliza aquelas células que expressam o complexo IL-15Rbeta/gama, mas não expressam IL-15Ralfa (células IL-15Rp/y+ IL-15RoO , à acção de IL-15.

Alguns dos produtos da invenção são específicos para IL-15Rbeta/gama, no sentido em que não aumentam a eficiência da via de sinalização de IL-15Ralfa/beta/gama. É especialmente o caso da proteína de fusão ILR da invenção (sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 62/ e sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 61).

Alguns outros produtos da invenção são capazes de aumentar a eficiência de ambas as vias de sinalização de IL-15Rbeta/gama e de IL-15Ralfa/beta/gama. É especialmente o caso da proteína de fusão RLI da invenção (sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 60; e sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO: 59). A invenção também mostra que o domínio sushi de IL-15Ra é crucial para transapresentação. Permite assim o acesso a aplicações médicas particularmente úteis e particularmente necessárias no campo do tratamento e/ou paliação e/ou prevenção do cancro, por administração de 54 ΡΕ1934353 vacina, tal como por exemplo administração de uma composição que compreende pele menos um composto contendo pelo menos um domínio sushi de IL-15Ralfa. IL-15 é uma citocina que estimula a proliferação e/ou sobrevivência de linfócitos (tais como células T, células T CD8+ T, células NK, células dendríticas) e/ou a sua actividade contra células tumorais. A IL-15 está envolvida na interferência entre células acessórias e células linfóides. É essencial nos tecidos periféricos para o desenvolvimento de células NK, células NKT, e células T de memória CD8+. É o factor fisiológico mais poderoso capaz de induzir a diferenciação de células hematopoiéticas CD34+. A referida acção biológica de IL-15 é uma acção biológica exercida por, indutível por, ou estimulada por IL-15, e/ou miméticos de IL-15 e/ou agonistas de IL-15. 0 perito na técnica pode escolher qualquer resposta biológica IL-15 que considere apropriada ou conveniente avaliar ou monitorizar.

Preferentemente, a referida acção biológica de IL-15 é uma acção biológica exercida por, indutível por, ou estimulada por IL-15 e/ou miméticos de IL-15 e/ou agonistas de IL-15, em células IL-15Rbeta/gama+ IL-15Ralfa~. 55 ΡΕ1934353

Uma resposta biológica típica a IL-15 é a proliferação de, e/ou a activação de, células sensíveis a IL-15.

Exemplos de células sensíveis a IL-15 são células T, células T CD8+, NK células, células dendríticas, cuja proliferação é induzida e/ou estimulada pela adição de IL-15 e/ou miméticos de IL-15 e/ou agonistas de IL-15, e/ou cuja activação é induzida e/ou estimulada pela adição de IL-15 e/ou miméticos de IL-15 e/ou agonistas de IL-15 (por exemplo, indução de uma actividade antitumoral). Tais células podem por exemplo, recolhidas de um organismo mamífero.

Outros exemples de células sensíveis IL-15 compreendem linhas celulares conhecidas, tais como a linha celular CTL-L2 de célula de linfoma T citotóxica de ratinho (número de acesso ATCC TIB-214), ou células TFl-beta.

As células TFl-beta estão disponíveis por transfecção das células TF-1 com cadeias beta.

As células TF-1 estão disponíveis a partir da American Type Culture Collection ATCC; P.O. Box 1549; Ma-nassas, VA 20108; E.U.A.; cf. http://www.lgcpromochem.com/ atcc/ sob o número de acesso ATCC CRL-2003.

Os retrovírus IL-2R beta recombinantes podem então ser usados para infectar células TF-1 para gerar TF-ip após a selecção no meio contendo G418. 56 ΡΕ1934353

Preferentemente, as referidas células sensíveis para IL-15 são células IL-15Rbeta/gama+ IL-15Ralfa”. Exemplos de células IL-15Rbeta/gama+ IL-15Ralfa” incluem a linha celular Mo-7 humana, ou células NK e/ou T quiescentes. Células NK e/ou T quiescentes estão disponíveis ao perito na técnica. Podem, por exemplo, ser obtidas por purificação de uma amostra celular, tal como uma amostra de sangue.

As células NK e T quiescentes podem ser isoladas do sangue de dadores adultos saudáveis como se segue: centrifuga-se sangue completo a alta velocidade para se obter uma camada leuco-plaquetária. Esta camada leuco-plaquetária é centrifugada num gradiente de densidade (Histopaque, Sigma) para obter linfócitos do sangue periférico. As células NK quiescentes são então isoladas dos linfócitos do sangue periférico utilizando um kit de isolamento de células negativas para NK (Dynal, Biotech ASA, Oslo, Noruega). Alternativamente, são isoladas células T quiescentes de linfócitos do sangue periférico utilizando um kit de isolamento de células negativas para T (Dynal, Biotech ASA, Oslo, Noruega).

Outros exemplos de células IL-15Rbeta/gama+ IL-15Ralfa“ incluem células IL-15Ralfa“, que são transformadas ou transfectadas por IL-15Rbeta/gama, preferentemente por uma IL-15Rbeta/gama humana. 57 ΡΕ1934353

Por exemplo, a linha celular 32D murina (ATCC CRL-11346) pode ser transfectada por cadeias beta e gama, preferentemente com cadeias beta e gama humanas.

As cadeias beta (isto é, cadeias IL-15Rbeta, também referidas como cadeias IL-2Rbeta) são conhecidas pelo, e disponíveis ao, perito na técnica. Entre as cadeias beta, são preferidas as cadeias beta humanas.

Estão disponíveis moldes de cadeias beta a partir de ARN de HuT102 (ATCC TIB-162) por RT-PCR usando a polimerase de revisão e correcção Pfu (Stratagene n° 600390) e 5' GAGAGACTGGATGGACCC 3’ como iniciador no sentido directo (SEQ ID NO: 70), e 5' AAGAAAC T AAC T C T T A-AAGAGGCS' como iniciador no sentido inverso (SEQ ID NO: 71) de acordo com a sequência de IL-2R beta humana (número de acesso NCBI K03122) . O produto de PCR é clonado de forma eficiente utilizando o Zero Blunt PCR Cloning Kit (In Vitrogen n° cat K2700-20) ou o kit de clonagem TOPO XL PCR (In Vitrogen n° cat K4750-10) . O ADNc para o gene IL-2R beta é então subclonado no local de clonagem múltiplo do vector de expressão retroviral pLXRN do Pantropic Retroviral Expression System (BD Biosciences Clontech n° 631512) e transfectado em células GP2-293, tal como descrito no kit para gerar retrovírus recombinantes.

As cadeias gama (isto é, cadeias IL-15Rgama, também referidas como cadeias IL-2Rgama) são conhecidas pelo, 58 ΡΕ1934353 e disponíveis ao, perito na técnica. Entre as cadeias gama, são preferidas as cadeias gama humanas.

Estão disponíveis moldes das cadeias gama a partir do ARN de TF1 (ATCC CRL 2003) ou HuT 102 (ATCC TIB 162) por RT-PCR utilizando a polimerase de revisão e correcção Pfu e 5' GAAGAGCAAG CGCCATGTTG 3' (SEQ ID NO: 100) como iniciador no sentido directo e 5' TCAGGTTTCAGG-CTTTAGGG 3' como iniciador no sentido inverso (SEQ ID NO: 101) de acordo com a sequência do receptor gama da inter-leucina-2 humano (NCBI Número de acesso D 11086) . O produto de PCR é eficientemente clonado utilizando o Zero Blunt PCR Cloning Kit ou o kit de clonagem TOPO XL PCR. O ADNc para o gene IL-2Ry é então subclonado em pcDNA 3.1 /HYGRO (In Vitrogen) para gerar um plasmídeo pcDNA IL-2Ry/HYGRO.

Podem utilizar-se retrovírus recombinantes para infectar células 32D para gerar 32Όβ após selecção em meio contendo G418. 0 plasmídeo pcDNA IL-2Ry/HYGRO pode ser então transfectado para células 32ϋβ por electroporação para gerar 32Ώβγ após selecção em meio contendo higro-micina. 0 perito na técnica pode alternativamente escolher avaliar ou monitorizar uma resposta biológica a IL-15 que é mais a jusante na via de sinalização, tal como a activação de uma tirosina cinase (por exemplo, Jak-l/Jak-3; Lck; Syk), activação de uma MAP cinase, ou um evento de translocação nuclear (por exemplo, translocação de Stat-3 59 ΡΕ1934353 e/ou Stat-5 fosforilada). A referida resposta biológica a IL15 pode então ser uma resposta acelular.

Elementos adicionais (péptido sinal, marcação molecular, local proteolítico, etc.):

Um composto da invenção pode compreender um péptido sinal Este péptido sinal pode estar directamente ou indirectamente ligado ao referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi ou à referida pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama. 0 referido péptido sinal pode estar ligado ao referido composto por covalência.

Os péptidos sinal facilitam a secreção de proteínas das células.

Este péptido sinal pode, por exemplo, ser o péptido sinal de um IL-15Ralfa, tal como um IL-15Ralfa humano (tal como o péptido sinal do IL-15Ralfa humano que é de sequência SEQ ID NO: 5) directamente ou indirectamente ligado ao referido fragmento, ou o péptido sinal de outra proteína (tal como o péptido sinal da preprolactina bovina da SEQ ID NO: 58), directamente ou indirectamente ligado ao referido fragmento.

Exemplos de péptidos sinal são: - o péptido codificado pela sequência líder do IL-15Ralfa nativo humano (SEQ ID NO: 4), isto é, os 60 ΡΕ1934353 primeiros 30 aminoácidos da extremidade N do IL-15Ralfa nativo humano (SEQ ID NO: 5), ou - o péptido codificado pela sequência líder da preprolactina bovina (SEQ ID NO: 57), isto é, os primeiros 31 aminoácidos da extremidade N da preprolactina bovina (SEQ ID NO: 58).

Outros péptidos sinal que sejam considerados apropriados pelo perito na técnica podem também ser utilizados. Além disso, certos nucleótidos na sequência líder de IL-15 podem ser alterados sem alterar a sequência de aminoácidos. Além disso, podem ser realizadas alterações de aminoácido que não afectam a capacidade da sequência actuar como um péptido sinal.

Um polipéptido contendo o domínio sushi da invenção pode estar directamente ligado ao péptido sinal do IL-15Ralfa do qual deriva. Tal polipéptido contendo o domínio sushi pode não obstante ser: - indirectamente ligado a um tal péptido sinal "nativo", ou directamente ou indirectamente ligado a um péptido sinal que não é do IL-15Ralfa do qual deriva o referido polipéptido contendo o domínio sushi.

Um composto da invenção pode ainda compreender pelo menos uma marcação molecular e/ou pelo menos um local proteolítico. 61 ΡΕ1934353

Por exemplo, uma marcação molecular e/ou um local proteolitico podem estar localizados entre o péptido sinal e o domínio sushi, ou entre o péptido sinal e a entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama. A referida marcação molecular e/ou local proteolitico podem ser directamente ou indirectamente ligados ao referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi, ou à referida entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama.

Exemplos de marcações moleculares compreendem especialmente marcações FLAG®.

Exemplos de locais proteolíticos compreendem locais de ligação a Xa. 0 octapéptido FLAG® (uma marca registada) (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988) não altera a actividade biológica das proteínas de fusão, é altamente antigénico, e proporciona um epitopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal específico, permitindo a detecção rápida e purificação fácil da proteína de fusão expressa. A sequência FLAG® é também especificamente clivada pela enterocinase mucosal bovina e no resíduo imediatamente após o par AspLys. Proteínas de fusão que terminem com este péptido podem também ser resistentes à degradação intracelular em E. coli. Um anticorpo monoclonal murino que se liga à sequência FLAG® foi depositado na ATCC sob o número de acesso HB 9259. Os métodos de utilização do anticorpo na purificação de proteínas de fusão 62 ΡΕ1934353 compreendendo a sequência FLAG® são descritos na Patente U.S. No. 5,011,912.

Exemplos de sequências que codificam para o epitopo Flag e um local de ligação ao factor Xa compreendem aquelas de SEQ ID NO: 53 e NO: 55 (respectivamente, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54 e NO: 56).

Aminoácidos:

No contexto da presente invenção, 'resíduo de aminoácido' significa qualquer resíduo de aminoácido conhecido pelos peritos na técnica (ver por exemplo: Sewald et al., 2002 (42); nomenclatura IUPAC em http:// www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/).

Engloba aminoácidos que ocorrem naturalmente (incluindo por exemplo, utilizando o código de três letras, Ala, bAla, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Vai) , assim como aminoácidos raros e/ou sintéticos e seus derivados (incluindo por exemplo Aad, Abu, Acp, Ahe, Aib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Hyl, MeLys, MeVal, Nva, HAO, NCap, Abu, Aib, MeXaa e semelhantes (ver por exemplo: (Miiller et al., 1993; Aurora et al., 1998; Obrecht et al., 1999; Maison et al., 2001; Formaggio et al., 2003; Nowick et al., 2003; {43-48). O referido resíduo de aminoácido ou seu derivado pode ser qualquer um seu isómero, especialmente qualquer isómero quiral, por exemplo, a isoforma L- ou D. 63 ΡΕ1934353

Por derivado de aminoácido, entende-se aqui qualquer derivado de aminoácido tal como conhecido na técnica (ver por exemplo: Sewald et al., 2002 (42); nomenclatura IUPAC em http://www.chem.qmul.ac. uk/iupac/ AminoAcid/).

Por exemplo, derivados de aminoácidos incluem resíduos que podem ser derivados de aminoácidos naturais contendo cadeias laterais adicionais, por exemplo, cadeias laterais alquílicas, e/ou substituições de heteroátomos. Outros exemplos de derivados de aminoácidos compreendem aminoácidos com modificações químicas tais como aquela que se encontra em péptidos miméticos que são compostos contendo elementos estruturais não peptídicos que são capazes de mimetizar ou antagonizar a ou as acções biológicas de um péptido parental natural. Um mimético de péptido geralmente já não tem as características clássicas de péptido, tais como ligações peptídicas que podem ser quebradas enzimaticamente.

Preferentemente, o referido aminoácido ao grupo dos aminoácidos não essenciais. Aminoácidos não essenciais preferidos são glicina, alanina, prolina, serina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, histidina. Aminoácidos apropriados podem ser seleccionadas com precisão através da selecção daqueles aminoácidos que estão em menores quantidades no paciente ao qual o fármaco é administrado. O regime de 64 ΡΕ1934353 dosagem e administração pode ser determinado como função do nível do paciente no referido aminoácido. A dosagem e o regime de administração preferidos são aqueles que pretendem aumentar o nível de aminoácidos no paciente até ao nível normal padrão.

Ligação do referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi à referida pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama: 0 referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi da invenção pode ser ligado directamente à pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama.

Alternativamente, o pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi da invenção, e a referida pelo menos entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama as proteínas podem ser separadas por uma sequência de aminoácidos "de ligação" de um comprimento suficiente para garantir que as proteínas forma estruturas secundárias e terciárias apropriadas.

Preferentemente, a referida sequência de ligação é uma sequência de ligação peptídica que compreende pelo menos um, mas menos do que 30 aminoácidos por exemplo, uma sequência de ligação peptídica de 2-30 aminoácidos, preferentemente de 10-30 aminoácidos, preferivelmente de 15-30 aminoácidos, mais preferivelmente de 19-27 aminoácidos, preferencialmente de 20-26 aminoácidos. 65 ΡΕ1934353

Sequências de ligação preferidas são aquelas que permitem ao composto adoptar uma conformação apropriada (isto é, uma conformação que permite uma actividade de transdução de sinal apropriada através da via de sinalização IL-15Rbeta/gama). Exemplos de sequências de ligação preferidas incluem sequências de ligação flexíveis.

As sequências de ligação mais apropriadas (1) irão adoptar uma conformação de extensão flexível, (2)não irão apresentar uma propensão para desenvolver uma estrutura secundária ordenada que poderia interagir com os domínios funcionais das proteínas de fusão, e (3) terão um carácter hidrofóbico ou carregado mínimo que poderia promover a interacção com os domínios proteicos funcionais. Aminoácidos de superfície típicos incluem Gly, Asn e Ser (isto é, G, N ou S) . Virtualmente, seria esperado que uma permuta das sequências de aminoácidos contendo Gly, Asn e Ser satisfizesse os critérios acima para uma sequência de ligação seria. Outros aminoácidos praticamente neutros, tais como Thr, Ala, Leu, Gin (isto é, T, A, L, Q) podem também ser utilizados na sequência de ligação. 0 comprimento da sequência de ligação pode variar sem afectar significativamente a actividade biológica da proteína de fusão.

Exemplos de sequências de ligação são descritos nas Patentes U.S. Nos. 5,073,627 e 5,108,910. 66 ΡΕ1934353

Exemplos ilustrativos de sequências de ligação que são mais particularmente adequadas para a presente invenção incluem aquelas codificadas pelas sequências de SEQ ID NO: 49 ou NO: 51 (respectivamente, sequências de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 -também referida como sequência de ligação 20- e NO: 52 - também referida como sequência de ligação 26).

Num composto da invenção, a sequência do referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi pode estar na posição da extremidade N em relação à sequência da referida pelo menos uma entidade de ligação a IL- 15Rbeta/gama.

Alternativamente, a sequência do referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi pode estar numa posição da extremidade C em relação à sequência da referida pelo menos uma entidade de ligação a IL- 15Rbeta/gama.

Um composto da invenção pode ser uma proteína de fusão.

Proteínas de fusão são polipéptidos que compreendem duas ou mais proteínas ou péptidos diferentes ou heterólogos. Preparam-se proteínas de fusão utilizando técnicas convencionais de corte e ligação de fragmentos por via enzimática das sequências desejadas. Podem ser utilizadas técnicas de PCR que utilizam oligonucleótidos 67 ΡΕ1934353 sintéticos para preparar e/ou amplificar os fragmentos desejados. Pode também ser utilizados oligonucleótidos que se sobrepõem que representam as sequências desejadas para preparar construções de ADN que codificam para proteínas de fusão. As proteínas de fusão podem compreender várias sequências, incluindo uma sequência líder (ou péptido sinal), uma sequência de ligação, uma sequência "zipper" de leucina, ou outras sequências formadoras de oligonucleótidos, e sequências que codificam para porções altamente antigénicas que proporcionam um meio para uma purificação facilitada ou uma detecção rápida de uma proteína de fusão.

Exemplos ilustrativos dos compostos da invenção são a proteína de fusão que compreende o polipéptido contendo o domínio sushi da SEQ ID NO: 30 (it + sushi + flexível) , e a IL-15 nativa humana da SEQ ID NO: 48, opcionalmente ligados um ao outro através de uma sequência de ligação.

Outro exemplo ilustrativo dos compostos da invenção são as proteínas de fusão que compreendem: - o péptido sinal da SEQ ID NO: 5, - a marcação Flag e a sequência de ligação a Xa da SEQ ID NO: 54, - o polipéptido contendo o domínio sushi da SEQ ID NO: 30 (it + sushi + flexível), - a sequência de ligação da SEQ ID NO: 50, e - a IL-15 nativa humana da SEQ ID NO: 48, isto é, a proteína de fusão RLI codificada pela SEQ ID NO: 60. 68 ΡΕ1934353

Outro exemplo ilustrativo dos compostos da invenção são a proteína de fusão que compreende: - o péptido sinal da SEQ ID NO: 58, a marcação Flag e a sequência de local de ligação Xa da SEQ ID NO: 56, - a IL-15 nativa humana da SEQ ID NO: 48, - a sequência de ligação de SEQ ID NO: 52, - o polipéptido contendo o domínio sushi da SEQ ID NO: 30 (it + sushi + flexível), isto é, proteína de fusão ILR da SEQ ID NO: 62.

Os compostos da invenção podem ser produzidos por qualquer método que o perito na técnica considere apropriado, tal como, por exemplo, síntese química de poli-péptidos, ou biossíntese de polipéptidos. A síntese química de polipéptidos é actualmente um método rotineiro (ver por exemplo Andersson et al., 2000, Biopolymers (Peptide Science) 55: 227-250), e muitas empresas são especializadas em tal síntese.

Preferentemente, os compostos da presente invenção são sintetizados por técnicas de síntese peptídica em fase sólida (SPPS) utilizando protocolos FMOC convencionais (Ver, por exemplo, Carpino et al., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92(19): 5748-5749; Carpino et al., 1972, J. Org. Chem. 37 (22) : 3404-3409) . 69 ΡΕ1934353

Alternativamente, o perito na técnica pode escolher produzir os compostos biologicamente através de tradução in vitro ou in vivo de um ácido nucleico que codifique para um tal composto. Ácidos nucleicos, vectores, células hospedeiras: A presente invenção refere-se também assim a ácidos nucleicos (ADN ou ARN) que codifica para um produto destinado ao estimulo da via de sinalização IL-15Rbeta/ gama, para então induzir e/ou estimular a activação e/ou a proliferação de células positivas para IL-15Rbeta/gama, tais como células NK e/ou T.

Mais particularmente, os ácidos nucleicos da invenção codificam para um polipéptido contendo o domínio sushi da invenção isolado, tal como aqui definido, ou para um composto da invenção ligado covalentemente, tal como aqui definido (isto é, compreendendo pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi directamente ou indirectamente ligado por covalência a pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama). A referida codificação está de acordo com o código genético universal, tendo em devida conta a sua degenerescência.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser opcionalmente contidos num vector, tal como um vector de transfecção, ou um vector de expressão. 70 ΡΕ1934353

Os ácidos nucleicos da invenção podem estar funcionalmente ligados a uma sequência de regulação da tradução ou da transcrição, tal como promotores ou poten-ciadores da transcrição, uma sequência opcional operadora para controlar a transcrição, uma sequência que codifique para locais de ligação ribossomais de ARNm adequados, e sequências apropriadas que controlam a iniciação e a terminação da transcrição e da tradução. Exemplos de tais vectores incluem pEFl/myc-His (In Vitrogen, V921-20) , pcDNA3.1 (In Vitrogen, V800-20).

Os ácidos nucleicos da invenção podem também ser ligados a sequências lider que permitem a mais eficiente secreção extracelular do polipéptido traduzido. Exemplos de tais sequências lider incluem sequências lider da pré-prolactina de rato (SEQ ID NO: 57) ou de um IL-15Ralfa, tal como a sequência codificante para o péptido sinal de IL-15Ralfa humano da SEQ ID NO: 4). A sequência destes ácidos nucleicos pode também compreender um codão de paragem (TAG, TGA, TAA) na sua extremidade 3'. A presente invenção refere-se a qualquer ácido nucleico que codifique para um dos compostos da invenção descritos. A tabla 4, que está localizada antes da secção das reivindicações, indica a respectiva SEQ ID NO: destes ácidos nucleicos. 71 ΡΕ1934353

Por exemplo: - um ácido nucleico que codifique para o referido IL-15Ralfa humano pode compreender a sequência da SEQ ID NO: 2; - um ácido nucleico que codifique para o referido IL-15Ralfa extracelular humano pode compreender a sequência da SEQ ID NO: 39; - um ácido nucleico que codifique para o referido domínio sushi pode compreender a sequência da SEQ ID NO: 13; - um ácido nucleico que codifique para a referida região de cauda humana pode compreender a sequência da SEQ ID NO: 31; - um ácido nucleico que codifique para a referida parte codificada pelo exão 3 da referida região de cauda humana pode compreender a sequência da SEQ ID NO: 33; - um ácido nucleico que codifique para a referida IL-15 humana pode compreender a sequência da SEQ ID NO: 47; um ácido nucleico que codifique para um composto ligado covalentemente da invenção pode compreender a sequência da SEQ ID NO: 59 (proteína de fusão RLI) ou da SEQ ID NO:61 (proteína de fusão ILR).

Um ácido nucleico da invenção pode compreender uma sequência de Kozak na sua extremidade 5', por exemplo, uma sequência de Kozak sequência da IL-15R nativa humana, tal como gcc gcc; ou uma sequência de Kozak sequência da preprolactina bovina, tal como gcc ace. 72 ΡΕ1934353

Um ácido nucleico da invenção pode compreender um codão de paragem (por exemplo, tag, tga, ou taa) na sua extremidade 3'. A presente invenção também se refere a qualquer vector, compreendendo um ácido nucleico da invenção. Preferentemente, um tal vector é um vector de baculovirus. 0 referido vector pode, por exemplo, ser um vector de transfecção, ou um vector de expressão. A presente invenção também se refere a qualquer célula hospedeira, transformada ou transfectada por um ácido nucleico de e/ou por um vector da invenção.

Tal como aqui utilizado, "transfectado" ou "transfecção" significa a introdução de um ou mais ácidos nucleicos exógenos numa célula eucariótica. A transfecção inclui a introdução de ácidos nucleicos livres tais como plasmideos através de técnicas de transfecção físicas e químicas convencionais, incluindo precipitação por fosfato de cálcio, precipitação por sulfato de dextrano, electro-poração, transferência de ácidos nucleicos mediada por lipossomas, métodos balísticos tais como bombardeamento de partículas, etc. A transfecção também inclui a introdução de ácidos nucleicos em células através de métodos biológicos, incluindo a transdução ou infecção virai (mediada por receptor ou não mediada por receptor). 73 ΡΕ1934353

Tal como aqui utilizada, "transformada" ou "transformação" significa a introdução de um ou mais ácidos nucleicos exógenos numa célula procariótica. A transformação inclui a introdução de ácidos nucleicos livres, assim como de um vector de ácido nucleico, tal como um fago. Células hospedeiras adequadas incluem procario-tas, leveduras ou células eucarióticas superiores sob o controlo de promotores apropriados.

Procariotas incluem organismos Gram positivos e Gram negativos, por exemplo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, e várias outras espécies nos géneros Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces e

Staphylococcus.

Exemplos de células hospedeiras adequadas incluem a leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae, e células eucarióticas superiores, tais como linhas celulares estabelecidas de mamíferos ou insecto. Exemplos de tais células eucarióticas superiores adequadas compreendem linhas de células de mamífero, tais como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), por exemplo a linha celular de ovário de hamster Chinês CHO/dhfr “ (CHO duk “) (ATCC n° CRL-9096) , ou tais como linhas celulares epiteliais, por exemplo linha celular epitelial símia COS-7 (ATCC n° CRL 1651), ou linhas celulares humanas, por exemplo linha celular do rim humano 293 cl8 (ATCC n° CRL-10852) ou linha celular do rim humano FreeStyle 293-F (In Vitrogen n° R790-07). 74 ΡΕ1934353 A referida célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica, uma células de mamífero (humana ou não humana, tal como uma célula CHO) , uma célula de levedura ou uma célula procariótica (tal como E. coli).

Preferencialmente, a referida célula hospedeira é uma célula de mamífero, uma vez que na presente invenção tais células são mais eficientes (independentemente de qualquer problema de glicosilação).

Aplicações biológicas e médicas:

Os produtos da invenção compreendem especialmente os referidos polipéptidos contendo o domínio sushi numa forma isolada tal como aqui definido, e a sua forma covalentemente ligada, que é aqui referida como o composto covalentemente ligado da invenção (isto é, o composto que compreende pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi directamente ou indirectamente ligado por covalência a pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama).

Os produtos da invenção também compreendem os ácidos nucleicos que codificam para tais polipéptidos e compostos, o vector que compreende tais ácidos nucleicos, assim como as células hospedeiras transformadas ou transfectadas por um tal ácido nucleico ou um tal vector.

Os produtos da invenção são úteis para expandir 75 ΡΕ1934353 subconjuntos de linfócitos, tais como subconjuntos T/NK particulares. A presente invenção refere-se assim à utilização de um produto da invenção como um agente para expandir uma ou várias populações de linfócitos, tais como células NK, células NK-T, células de memória CD8+, e aos adjuvantes, composições e kits que se pretendem para uma tal utilização, incluindo as composições farmacêuticas e fárma-cos, que compreendem pelo menos um produto da invenção. 0 referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi e a referida pelo menos uma entidade de ligação a 15Rbeta/gama pode ser utilizados numa forma combinada, tais como por exemplo, na forma de um composto covalentemente ligado da invenção, ou em formas separadas. A presente invenção refere-se então a: - a referida pelo menos uma entidade de ligação IL-15Rbeta/gama, tal como aqui definida, e - o referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi, tal como aqui definido, ou os respectivos ácidos nucleicos, vectores, células hospedeiras, na forma de uma preparação combinada para a utilização simultânea, separada ou sequencial, por exemplo num formato de kit de partes. A presente invenção refere-se então a uma tal preparação, que é um adjuvante, uma composição ou um kit, incluindo uma composição farmacêutica e um fármaco. 76 ΡΕ1934353 0 presente pedido refere-se então à prevenção e/ou ao alívio e/ou ao tratamento de uma condição ou de uma doença na qual se deseja um aumento da actividade IL-15, tal como especialmente cancro ou imunodeficiência. Tal prevenção e/ou alívio e/ou tratamento pode actuar através da estimulação da proliferação e/ou sobrevivência de linfócitos (tais como células T, células T CD8+, células NK, células dendríticas) e/ou a sua actividade contra células tumorais. 0 método de prevenção e/ou alívio e/ou tratamento da invenção compreende a administração de um produto da invenção a um paciente que dele necessite. A presente invenção também se refere a adjuvantes, composições, composições farmacêuticas, fármacos, vacinas, que se destinam para tal prevenção e/ou alívio e/ou tratamento.

As composições farmacêuticas, fármacos e vacinas da invenção compreendem pelo menos um produto da invenção e opcionalmente um veículo e/ou diluente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. A presente invenção refere-se mais particu- larmente a um adjuvante. Tal adjuvante é especialmente adaptado à indução e/ou ao estímulo de uma resposta imunitária que compreende um domínio sushi de IL-15Ralfa 77 ΡΕ1934353 isolado, ou uma sua variante conservativa. Um tal adjuvante pode ser um adjuvante para uma vacina antimicrobiana (antiviral, antibacteriana, antifúngica), ou para uma vacina antitumoral. A presente invenção também se refere a: uma composição que pode ser especialmente destinada à indução e/ou ao estimulo numa acção biológica IL-15, que compreende um domínio sushi isolado de IL-15Ralfa, ou uma sua variante conservativa, - a utilização de um domínio sushi de IL-15Ralfa isolado, ou de uma sua variante conservativa, para o fabrico de um adjuvante para uma composição imunoterapêutico, - a utilização de um domínio sushi de IL-15Ralfa isolado, ou de uma sua variante conservativa, para o fabrico de uma composição destinada à indução e/ou ao estímulo de uma acção biológica de IL-15. 0 presente pedido refere-se assim a um fármaco ou uma vacina compreendendo pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi tal como aqui definido e opcionalmente um veículo e/ou diluente e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

Tal fármaco ou vacina destina-se à prevenção e/ou ao tratamento e/ou ao alívio de uma condição ou doença na qual se deseja um aumento da actividade de IL-15, tal como especialmente cancro ou imunodeficiência. Tal fármaco ou vacina pode actuar através do estímulo da proliferação e/ou 78 ΡΕ1934353 da sobrevivência de linfócitos (tais como células T, células T CD8+, células NK, células dendriticas) e/ou a sua actividade contra células tumorais. A presente invenção refere-se mais particularmente a um fármaco ou vacina antitumoral que exerce a sua acção preventiva e/ou de alivio e/ou terapêutica através do estimulo ou da proliferação de células NK e T CD8+ que expressam 15Rbeta/gama mas não IL15Ralfa.

Tal fármaco ou vacina antitumoral é então destinada para aqueles pacientes cujas populações de células NK e/ou T CD8+ são insuficientemente activas para exercer uma vigilância ou eliminação antitumoral eficaz.

Um tal fármaco ou vacina antitumoral é mais particularmente destinada para aqueles pacientes que têm uma população insuficiente ou uma população insuficientemente activa de células NK e/ou T CD8+ que expressam IL-15Rbeta/gama mas não IL-15Ralfa.

Um fármaco ou vacina antitumoral da invenção pode compreender um domínio sushi IL-15Ralfa ou uma sua variante conservativa.

Um fármaco ou uma vacina antitumoral preferidos da invenção compreende: pelo menos uma entidade de ligação a IL-15beta/gama, tal como aqui definida, tal como IL-15, e 79 ΡΕ1934353 - pelo menos um polipéptido contendo um domínio sushi, tal como aqui definido, tal como um domínio sushi de IL-15Ralfa isolado, ou uma sua variante conservativa.

Preferentemente, pelo menos uma entidade de ligação a IL-15beta/gama, tal como IL-15, e o referido pelo menos um polipéptido contendo um domínio sushi, tal como um domínio sushi IL-15Ralfa isolado, ou uma sua variante conservativa, estão ligados numa proteína de fusão, formando assim um composto covalentemente ligado da invenção. A presente invenção também se refere à prevenção e/ou alívio e/ou tratamento de uma doença ou condição envolvendo uma imunodeficiência relacionada com VIH.

Esta prevenção e/ou alívio e/ou tratamento compreende a administração do produto da invenção a um paciente que dele necessite. A presente invenção refere-se a um fármaco e/ou uma composição para uma tal prevenção e/ou alívio e/ou tratamento. A presente invenção refere-se assim a um adjuvante para uma composição imunoterapêutica, caracterizada por compreender pelo menos um elemento entre os seguintes elementos: - um composto da invenção, - um ácido nucleico da invenção, 80 ΡΕ1934353 - um vector da invenção, - uma célula hospedeira da invenção.

Com vantagem, o referido adjuvante melhora a resposta de memória CD8.

No presente pedido, "imunoterapia" compreende terapia, paliação, e/ou prevenção por indução e/ou estimulo de uma resposta imunitária. O termo "composição imunote-rapêutica" engloba assim vacinas preventivas, assim como "vacinas" paliativas e/ou terapêuticas. 0 termo "adjuvante" pretende definir uma substância que pode ser adicionada a uma composição para melhorar uma resposta imunitária (resposta imunitária inata e/ou resposta imunitária adaptativa). Na presente invenção, engloba ainda uma substância que pode ser adicionada a uma composição para melhorar a eficiência desta composição ao longo do tempo, isto é, a duração da resposta imunitária (células T de memória CD8+). O composto da invenção pode ser usado numa composição como um composto adjuvante, mas pode também actuar por si só como um principio activo. É com efeito, por si só e isoladamente, capaz de induzir e/ou estimular a proliferação e a activação de células positivas para IL-15Rbeta/gama, e mais particularmente a diferenciação de células NK e/ou T a partir de células NK e/ou T virgens. 81 ΡΕ1934353 0 termo "princípio activo" pretende definir uma substância que pode provocar uma resposta imunitária.

Como um adjuvante para a composição imunote-rapêutica, um composto da invenção melhora a intensidade da resposta imunitária (resposta imunitária inata; uma resposta imunitária adaptativa) e/ou melhora a duração da resposta imunitária (melhora a resposta de memória T CD8).

Como um ingrediente activo para uma composição imunoterapêutica, um composto da invenção induz uma resposta imunitária, que é de intensidade superior e/ou de maior duração do que aquela induzida por outros estimuladores de células NK/T.

Assim, seja quando usado como um adjuvante em associação com outra resposta imunitária induzida, ou utilizado como um princípio activo que por si só e isoladamente induz uma resposta imunitária, o composto da invenção melhora a intensidade e/ou a duração da resposta imunitária. Com vantagem: - induz uma resposta imunitária inata melhorada, - induz uma resposta imunitária adaptativa melhorada, e mais particularmente uma resposta de memória CD8 melhorada. 0 pedido também se refere a uma composição adjuvante que compreende pelo menos um elemento entre os seguintes elementos: 82 ΡΕ1934353 um composto da invenção, tal como aqui definido, - um ácido nucleico da invenção, - um vector da invenção, - uma célula hospedeira da invenção. 0 pedido também se refere a um método para a produção de um adjuvante para uma composição imunotera-pêutica, caracterizado por compreender: proporcionar uma molécula IL-15Ralfa solúvel, ou um seu fragmento que reteve o seu domínio sushi, ligá-la por covalência a um elemento de ligação IL-15Rbeta/gama, seleccionada de IL-15, um fragmento agonista ou mimético de IL-15, que tem uma afinidade para ligação a IL-15Rbeta/gama que não é significativamente inferior àquela da IL-15 nativa (capaz de competir com IL-15 e/ou IL-2 para ligação a IL-15Rbeta/gama), e que preferencialmente não se liga a IL-2Ralfa, em que o composto daí resultante é um adjuvante para uma composição imunoterapêutica. A presente invenção também se refere a uma composição, uma composição farmacêutica de um fármaco compreendendo pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi do IL-15Ralfa, tal como aqui definido, isto é, em que a sequência de aminoácidos do referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi: - é a sequência de aminoácidos da região extra-celular de IL-15Ralfa, ou de um seu fragmento que reteve o 83 ΡΕ1934353 domínio sushi do referido IL-15Ralfa, em que o domínio sushi de IL-15Ralfa é definido como começando no primeiro resíduo cisteína codificado pelo exão 2 (Cl) e terminando no quarto resíduo cisteína codificado pelo exão 2 (C4), sendo ambos os resíduos Cl e C4 incluídos no domínio sushi, ou - pelo menos idêntica em 85% a uma tal sequência de IL-15Ralfa ou de fragmento de IL-15Ralfa, desde que cada um dos quatro resíduos cisteína (Cl, C2, C3 e C4) do referido domínio sushi tenham sido retidos.

Preferentemente, esta percentagem de identidade de sequência é de pelo menos 90%, ainda mais preferentemente de pelo menos 92%, preferivelmente de pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. A presente invenção mais particularmente refere-se a uma composição, uma composição farmacêutica ou um fármaco que compreende pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi de IL-15Ralfa, tal como aqui definido, em que o referido pelo menos um polipéptido contendo um domínio sushi compreende, ou consiste em, a parte do IL-15Ralfa extracelular que é codificada pelos exões 2 e 3, ou um fragmento de uma tal parte que reteve o domínio sushi. A presente invenção refere-se preferentemente a uma composição, uma composição farmacêutica ou um fármaco que compreende: 84 ΡΕ1934353 - um fragmento IL-15Ralfa humano, cuja sequência é a sequência de aminoácidos que se estende da posição 1 até à posição 127 de SEQ ID NO: 3, ou - um seu sub-fragmento que reteve o domínio sushi do referido fragmento, em que: o referido domínio sushi é definido como começando no primeiro resíduo cisteína codificado pelo exão 2 (Cl) e terminando no quarto resíduo cisteína codificado pelo exão 2 (C4), sendo ambos os resíduos Cl e C4 incluídos no domínio sushi, e - a sequência de aminoácidos do referido péptido sinal é a sequência que se estende da posição 1 até á posição 30 da referida SEQ ID NO: 3, ou uma variante do referido fragmento ou sub-fragmento que tem uma identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85% relativamente ao comprimento total do referido fragmento ou sub-fragmento.

Preferentemente, esta percentagem de identidade é de pelo menos 90%, ainda mais preferentemente de pelo menos 92%, preferivelmente de pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.

Tal composição, composição farmacêutica, ou fármaco pode ainda compreender pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama, tal como IL-15, ou um fragmento de IL-15 ou uma sua variante, tal como aqui definido. 85 ΡΕ1934353 A referida pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama pode não estar ligada ao referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi por cova-lência, isto é, ser colocada numa forma livre na referida composição, e/ou pode estar ligada por covalência ao referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi. Neste último caso, a composição, composição farmacêutica ou fármaco da invenção de facto compreende um composto da invenção tal como aqui definido.

Uma tal composição farmacêutica ou fármaco pode ser destinada para ser agonista de uma acção biológica de IL-15, e mais particularmente para induzir e/ou estimular a proliferação e/ou activação de células positivas para IL-15Rbeta/gama.

Uma tal composição farmacêutica ou fármaco pode ser destinada para induzir e/ou estimular a proliferação e/ou a activação de uma resposta imunitária NK e/ou T.

Uma tal composição farmacêutica ou fármaco pode ser destinada como uma composição de vacina preventiva e/ou paliativa e/ou terapêutica.

Uma tal composição farmacêutica ou fármaco pode ser destinada para a prevenção e/ou paliação e/ou tratamento de uma doença infecciosa, e/ou para a prevenção e/ou paliação e/ou tratamento de uma imunodeficiência (tal 86 ΡΕ1934353 como uma imunodeficiência induzida pelo VIH), e/ou para a prevenção e/ou paliação e/ou tratamento do desenvolvimento ou da presença de um tumor (e pode então ainda conter pelo menos um antigénio tumoral) , e/ou para a prevenção e/ou paliação e/ou tratamento de X-SCID.

De acordo com uma realização vantajosa da presente invenção, o referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi está covalentemente ligado a uma entidade de ligação IL-15Rbeta/gama. Mais preferentemente, esta entidade de ligação IL-15Rbeta/gama não se liga a IL-2Ralfa.

De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi está covalentemente ligado a uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama, que é IL-15, ou é um fragmento, mimético ou agonista de IL-15, que tem uma afinidade para ligação a IL-15Rbeta/gama que não é significativamente inferior do que uma IL-15 nativa (isto é, um fragmento mimético ou agonista que é capaz de competir com a IL-15 nativa e/ou a IL-2 para ligação à IL-15Rbeta/gama). A presente invenção assim refere-se mais particularmente a uma composição farmacêutica que se destina a estimular a via de sinalização de IL-15Rbeta/gama, para assim induzir e/ou estimular a activação e/ou a proliferação de células positivas para IL-15Rbeta/gama, tais 87 ΡΕ1934353 como células NK e/ou células T, caracterizada por compreender pelo menos um elemento entre os seguintes elementos: - um composto da invenção, - um ácido nucleico da invenção, - um vector da invenção, - uma célula hospedeira da invenção.

Uma tal composição farmacêutica pode ainda compreender um veiculo farmaceuticamente apropriado (veiculo, diluente, excipiente, aditivo, agente de ajuste do pH, emulsionante ou agente dispersante, conservante, sur-factante, agente gelificante, assim como agente tamponi-zante e outro agente de estabilização e solubilização, etc.). A presente invenção também se refere a um fármaco, destinado a estimular a via de sinalização de IL-15Rbeta/gama, para então induzir e/ou estimular a activação e/ou a proliferação de células positivas para IL-15Rbeta/gama, tais como células NK e/ou T, caracterizada por compreender pelo menos um elemento entre os seguintes elementos: - um composto da invenção, - um ácido nucleico da invenção, - um vector da invenção, - uma célula hospedeira da invenção. 0 referido fármaco é preferentemente uma composição imunoterapêutica. ΡΕ1934353 0 referido fármaco é preferivelmente uma composição de vacina preventiva e/ou paliativa e/ou terapêutica. 0 referido fármaco pode ainda compreender um veiculo fisiologicamente apropriado (veiculo, diluente, excipiente, aditivo, agente de ajuste do pH, emulsionante ou agente dispersante, conservante, surfactante, agente gelificante, assim como agente tamponizante e outro agente de estabilização e solubilização, etc.).

Veículos e formulações farmaceuticamente aceitáveis incluem todos os veículos conhecidos farmaceuticamente aceitáveis, tais como aqueles descritos em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a edição, Mack Publishing Co. ; e "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Ansel, Popovich e Allen Jr., Lippincott Williams and Wilkins.

Em geral, a natureza do veículo dependerá do modo particular de administração em utilização. Por exemplo, formulações parenterais geralmente compreendem, além de um ou mais agentes de contraste, fluidos injectáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis, incluindo água, solução salina fisiológica, solução equilibrada de sais, tampões, dextrose aquosa, glicerol, etanol óleo de sésamo, combinações destes, ou semelhantes como veículo. O meio pode também conter materiais adjuntos farmacêuticos convencionais tais como, por exemplo, sais 89 ΡΕ1934353 farmaceuticamente aceitáveis para ajustar a pressão osmótica, tampões, conservantes e semelhantes. 0 veiculo e a composição podem ser estéreis, e a formulação adequa-se ao modo de administração.

Para composições sólidas (por exemplo, formas em pó, pastilha, comprimido, ou cápsula), veículos sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, ou estearato de magnésio. Além de veículos biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes, e agentes tampo-nizantes do pH e semelhantes, por exemplo acetato de sódio ou monolaureato de sorbitan. A composição pode ser uma solução líquida, uma suspensão uma solução, um comprimido, uma pastilha, uma cápsula, uma formulação de libertação prolongada, ou um pó. A composição pode ser formulada com aglutinantes e veículos tradicionais, tais como triglicéridos.

Uma composição ou fármaco da invenção é útil para induzir e/ou estimular uma acção biológica IL-15 através da via de sinalização IL-15Rbeta/gama. É mais particularmente útil na indução e/ou estimulação de uma resposta imunitária inata (células NK) e/ou uma imunidade adaptativa (células T e mais particularmente células T de memória CD8+). 90 ΡΕ1934353

De acordo com uma realização muito vantajosa da presente invenção, o referido fármaco pode ser destinado à prevenção e/ou paliação e/ou tratamento da presença ou do desenvolvimento de um tumor. O referido tumor pode, por exemplo, ser um mela-noma, um linfoma, um carcinoma (por exemplo, carcinoma cervical), um cancro da mama, um cancro dos ovários, um tumor pancreático.

Com vantagem, o referido fármaco antitumoral, é uma vacina antitumoral que actua através de trans-apresentação.

Um fármaco antitumoral da invenção pode ainda compreender pelo menos um antigénio tumoral. O referido pelo menos um antigénio tumoral pode ser uma forma solúvel, ou pode ser ligado a um composto da invenção (por covalência ou por outra forma de ligação). O referido um antigénio tumoral é com vantagem proporcionado na forma de células dendriticas carregadas com um tal antigénio, por exemplo, células dendriticas geneticamente modificadas que expressam o referido pelo menos um antigénio tumoral.

Os antigénios tumorais são antigénios que são apresentados por moléculas MHC I à superfície das células 91 ΡΕ1934353 tumorais. Os antigénios tumorais podem estar também à superfície do tumor na forma de, por exemplo, um receptor mutado, caso em que serão reconhecidos pelas células B.

Antigénios tumorais podem por vezes ser apresentados apenas por células tumorais e nunca pelas células normais. Neste caso, são denominados antigénios específicos para tumores (TSA), ou antigénios de transplantação específicos para tumores (TSTA) , ou antigénios de rejeição tumoral (TRA), e tipicamente resultam da uma mutação específica para mutação. Os TSA normalmente aparece quando um vírus infeccioso fez com que a célula se tornasse imortal e expressasse o antigénio virai. 0 TSA não induzido por vírus são os idiotipos de BCR em linfomas das células B ou TCR em linfomas das células T.

Mais comuns são antigénios que são apresentados por células tumorais e células normais, e são denominados antigénios associados com tumores (TAA) . Os TAA são encontrados em células tumorais e em células normais durante a vida fetal (antigénios onco-fetais), após o nascimento em órgãos seleccionados, ou em muitas células mas numa concentração muito inferior do que nas células tumorais.

Os oncogenes podem ser expressos em vírus causadores de cancro. A maioria dos oncogenes estão de facto presentes na célula hospedeira, na qual funcionam no crescimento celular regulado. Quando transduzidos pelo vírus e expressos sob o controlo de um promotor virai, o 92 ΡΕ1934353 produto do gene da célula hospedeira, isto é, o produto do proto-oncogene, contribui para o crescimento desregulado da célula tumoral. Uma vez que as proteínas codificadas por proto-oncogenes são geralmente expressas por células normais, a sua sobre-expressão em células tumorais irá qualificá-los como antigénios associados a tumores.

Linfócitos T citotóxicos que reconheceram estes antigénios podem ser capazes de destruir as células tumorais antes que proliferem e metastizem. As células tumorais podem não então inibir a expressão de MC de Classe I. Frequentemente não dispõem de moléculas co-estimuladoras como B7 ou moléculas de adesão que são necessárias para que interactuem com células T CD8+. Algumas células tumorais suprimem activamente a resposta imunitária através da produção de uma citocina supressora, tal como TGFbeta, que inibem a imunidade celular.

Exemplos de antigénios tumorais compreendem especialmente: - reguladores do ciclo celular, tais como cinase 4 dependente de ciclina (melanoma), - transdutores de sinal, tais como beta-catenina (melanoma), - reguladores da apoptose, tais como caspase-8 (carcinoma de células escamosas), proteínas testiculares tais como antigénios MAGE (melanoma, tumores da mama, gliomas), por exemplo, MAGE-1 (número de acesso P43355), MAGE-2 (número de acesso 93 ΡΕ1934353 Ρ43356), MAGE-3 (número de acesso P43357), MAGE-4 (número de acesso P43358), MAGE-6 (número de acesso P43360), MAGE-8 (número de acesso P43361), MAGE-9 (número de acesso P43362), MAGE-10 (número de acesso P43363), MAGE-11 (número de acesso P43364), MAGE-12 (número de acesso P43365), composto envolvido na síntese de melanina (melanoma), tal como tirosinase (número de acesso P14679), idiotipos BCR, tais como o idiotipo Ig de superfície (linfoma), - receptores da tirosina cinase, tais como Her-2/neu, MUC-1 (cancro da mama e dos ovários), mucinas sub-glicosiladas, tais como MUC-1 (tumores da mama e pancreáticos), - produtos génicos virais, tais como HPV E6 e E7 (carcinoma cervical).

Uma composição ou fármaco da invenção podem ser destinados à prevenção e/ou paliação e/ou tratamento de uma doença infecciosa (infecção por um microrganismo, tal como vírus, bactéria, levedura, fungo, etc.)·

Uma composição ou fármaco da invenção podem ser destinados à prevenção e/ou paliação e/ou tratamento de uma imunodeficiência (por exemplo, uma imunodeficiência induzida como efeito secundário por um tratamento particular, tal como um tratamento antitumoral, ou um tratamento prévio a um transplante; ou induzida por um vírus, tal como VIH).

Uma composição ou fármaco da invenção podem ser 94 ΡΕ1934353 destinados à prevenção e/ou paliação e/ou tratamento de SCID-X (imunodeficiência combinada grave associada ao cromossoma X, que está ligada a uma disfunção da IL-15Rgama). A formulação de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um dos produtos da invenção está bem no âmbito da técnica. 0 mesmo permanece verdadeiro para os detalhes da administração da referida composição. 0 médico que trata o paciente terá de ter em conta, entre outros parâmetros, a idade, a condição geral e o estado de doença.

Os compostos terapeuticamente úteis identificados da acordo com o método da invenção podem ser administrados a um paciente por qualquer método apropriado para o composto particular, por exemplo, por via oral, intravenosa, parenteral, transdérmica, transmucosal, ou por cirurgia ou implantação (por exemplo, estando o composto na forma de uma matriz sólida ou semi-sólida biologicamente compatível e passível de ressorção) no local ou perto do local em que se deseja o efeito do composto. As doses terapêuticas são determinadas como sendo apropriadas por um perito na técnica, e são uma função do peso corporal. A invenção também se refere a um método para o tratamento por terapia e/ou paliação e/ou prevenção de um paciente ou animal não humano que dele necessite com um composto. 95 ΡΕ1934353 A presente invenção também se refere a um método para o tratamento de um paciente que dele necessite (tratamento por terapia e/ou paliação e/ou prevenção), pela administração de um produto, composição ou fármaco da invenção. A presente invenção também se refere a um processo para a indução e/ou estimulação da proliferação e/ou activação de células IL-15Rbeta/gama, caracterizada por compreender: - contactar células positivas para IL-15Rbeta/ gama com pelo menos um dos seguintes elementos: - um composto da invenção, - um ácido nucleico da invenção, - um vector da invenção, - uma célula hospedeira da invenção, em que a proliferação e/ou a activação das referidas células positivas para IL-15Rbeta/gama é induzida e/ou estimulada. 0 referido contacto é levado a cabo sob condições que permitem a proliferação e/ou a activação das referidas células positivas para IL-15Rbeta/gama. Tais condições compreendem especialmente a duração temporal, e as condições ambientais (temperatura, atmosfera, meio de cultura) . 0 ajustamento destas condições pertence à competência da pessoa competente na técnica. A presente invenção também se refere a um 96 ΡΕ1934353 processo in vitro para a indução e/ou a estimulação da proliferação e/ou activação de células positivas para IL-15Rbeta/gama, caracterizada por compreender: proporcionar uma amostra de células que compreende células positivas para IL-15Rbeta/gama, - contactar a referida amostra com pelo menos um dos seguintes elementos: - um composto da invenção, - um ácido nucleico da invenção, - um vector da invenção, - uma célula hospedeira da invenção, durante um período de tempo e sob condições ambientais que permitem o referido contacto para induzir e/ou estimular a proliferação e/ou a activação das referidas células positivas para IL-15Rbeta/gama. A presente invenção também se refere a um processo para a produção de células activadas NK e/ou T, caracterizada por compreender: - contactar células NK e/ou T quiescentes com pelo menos um dos seguintes elementos: - um composto da invenção, - um ácido nucleico da invenção, - um vector da invenção, - uma célula hospedeira da invenção, durante um período de tempo e sob condições ambientais que permitem o referido contacto para induzir a activação das referidas células NK e/ou T quiescentes compreendidas na referida amostra. 97 ΡΕ1934353 A presente invenção também se refere a um processo in vitro para a produção de células NK e/ou T, caracterizadas por compreender: proporcionar uma amostra de células que compreende células NK e/ou T quiescentes, - contactar a referida amostra com pelo menos um dos seguintes elementos: - um composto da invenção, - um ácido nucleico da invenção, - um vector da invenção, - uma célula hospedeira da invenção, durante um período de tempo e sob condições ambientais que permitem o referido contacto para induzir a activação das referidas células NK e/ou T quiescentes compreendidas na referida amostra.

No processo para a indução e/ou estimulação da proliferação e/ou activação das células positivas para IL-15Rbeta/gama, e no processo para a produção de células NK e/ou T, as células contactadas podem ser linhas celulares. Alternativamente podem ser células ex vivo recolhidas de um organismo (por exemplo, um paciente humano), e pretendem ser devolvidas a este ou a outro organismo (por exemplo, o mesmo paciente) após o tratamento in vitro.

Assim, a presente invenção abrange a implementação ex vivo dos referidos processos, e a sua implementação no decurso de um tratamento por terapia e/ou paliação e/ou prevenção. 98 ΡΕ1934353

No presente pedido, o codão de paragem (TAG, TGA, ou TAA) não é geralmente declarado com estando compreendido no interior da sequência codificante. 0 termo "compreendendo", que é um sinónimo de "incluindo" ou "contendo", é aberto, e não exclui elemento (s), ingrediente(s) ou passo(s) de método adicionais não citados, enquanto que o termo "consistindo em" é um termo fechado, que exclui qualquer elemento adicional, passo, ou ingrediente que não explicitamente citado. 0 termo "consistindo essencialmente em" é um termo parcialmente aberto que não exclui elemento(s), passo(s) ou ingrediente(s) adicionais, desde que estes não exclui elemento(s), passo(s) ou ingrediente(s) adicionais não afectem materialmente as novas e básicas propriedades de invenção. 0 termo "compreendendo" (ou "compreende") inclui assim o termo "consistindo em" ("consiste em"), assim como o termo "consistindo essencialmente em" ("consiste essencialmente em"). Em concordância, "compreendendo" (ou "compreende") é, no presente pedido, considerado como mais particularmente abrangendo o termo "consistindo em" ("consiste em"), e o termo "essencialmente consistindo em" ("essencialmente consiste em"). 0 termo "significativamente" tal como aqui 99 ΡΕ1934353 utilizado no seu significado usual no campo da estatística (por exemplo, teste t, teste z, valor do qui quadrado, ou razão F, etc), isto é, para comparar um valor em relação a outro, e determinar se estes valores diferem uns dos outros. 0 termo "significativamente" engloba assim o facto do perito na técnica poder ter em conta o desvio padrão (se existente), que mede a quantidade de dispersão de dados numa distribuição de frequências. 0 valor p desejado é geralmente fixado num nivel alfa de 5%, ou no nível alfa mais restringente de 1%.

Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração, e de nenhum modo como limitação.

EXEMPLOS

Procedimentos Experimentais

Cultura celular e Citocinas - A IL-15 humana recombinante (rIL-15) foi da

Peprotech Inc (Rocky Hill, NK). A linha celular da leucemia mielóide Mo-7 (linha celular humana que expressa IL-15Ra/y mas não IL-15Ra), e a linha celular humana de eritroleucemia TF-1 (linha celular que expressa 15Ra e IL-15Ry, mas não IL-15RP; ATCC CRL-2003) foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo soro fetal bovino inactivado pelo calor a 10% (FCS) , glutamina a 2 mM, e GM-CSF a 1 ng/mL (R&D Systems; Abington, UK) . As células TFl-β (22) foram cultivadas no mesmo meio suplementado com 250 pg/mL de 100 ΡΕ1934353 geneticina. A linha celular de linfoma T humano Kit 225 (linha celular dependente da IL-2) foi cultivada em meio RPMI 1640 contendo FCS a 6%, glutamina a 2 mM, rIL-2 a 10 ng/mL (Chiron; Emeryville, CA). A linha celular 32Όβ de ratinho que expressa a cadeia IL-15Ry de ratinho e a cadeia IL-15RP humana transfectada (linha celular 32D da ATCC CRL-1134 6) foi cultivada em RPMI, 10% de FCS, m-IL-3 a 0,4 ng/mL, b- mercaptoetanol a 10 pg/mL, geneticina a 250 pg/mL. sIL-15Ra, sIL-15Ra-sushi-IL-2 e sIL-15Ra-sushi -

Expressou-se sIL-15Ra-IL-2 em células CHO e preparou-se como descrito (23). Uma construção similar foi realizada na qual o domínio sushi de IL-15Ra (aminoácidos 1-66 da sequência codificante madura) foi ligada a uma molécula de IL-2 humana (sIL-15Ra-sushi-IL-2). 0 domínio sushi de IL15Ra foi amplificado por PCR. Os produtos de PCR foram purificados, digeridos com BamHI e HindiII (Fermentas, Vilnius, Lituânia) e ligados no vector de expressão pQE30. A expressão foi realizada em células E. coli SG13009 com indução por IPTG. Após a lise celular, os corpos de inclusão foram lavados, solubilizados em guanidina HC1 a 6 mM, fosfato de sódio a 20 mM, pH de 7,4, imidazole a 20 mM, cloreto de sódio a 150 mM e DTT a 1 mM. Reteve-se IL15Ra-sushi numa coluna de agarose Ni-NTA (Qiagen) equilibrada com o tampão de solubilização mais glutationa reduzida a 1 mM e glutationa oxidada a 0,2 mM. 101 ΡΕ1934353

Foi enrolada na conformação activa através de um gradiente de 6 a 0 M de guanidina HC1 no tampão da coluna (24) e eluiu-se com imidazole a 250 mM.

Proteínas de fusão RLI e ILR -

As construções das proteínas de fusão são apresentadas na Fig 2E. Separaram-se o domínio sushi IL-15Roc humano (aa 1-77) e a IL-15 humana pela sequência de ligação 20 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ; SEQ ID NO: 50) para RLI, ou pela sequência de ligação 26 (SGGGSGGGGSGGGGS-GGGGSGGGSLQ, de SEQ ID NO: 52) para ILR. Uma sequência que codifica para o epitopo Flag e o local de ligação do Factor Xa (DYKDDDDKIEGR, de SEQ ID NO: 54, par RLI; TTRDYKDDDDKIEGR, de SEQ ID NO: 56, para ILR) foram adicionados entre o péptido sinal (sp) e as sequências codificantes. O sp endógeno de IL-15Ra humano (SEQ ID NO: 5) foi utilizado para RLI, e o sp da preprolactina bovina (SEQ ID NO: 58) para ILR.

Estas construções foram inseridas entre os locais BamHI e HindiII do vector de expressão pFastBac 1 (InVitrogen) para gerar dois vectores de expressão que foram recombinados no ADN de baculovírus utilizando o vector de expressão Bac a Bac (InVitrogen). Os baculovírus recombinantes foram usados para infectar células SF9 (ATCC CRL-1711), e foram expressas proteínas de fusão no meio SF 900 II (GibcoTM Invitrogen Corp.) e recolhidas 4 dias após a infecção. As concentrações das proteínas de fusão foram medidas por ELISA com o mAb 247 anti-IL-15 (R & D Systems) 102 ΡΕ1934353 como anticorpo de captura, e o conjugado anti-Flag M2-pero-xidase (Sigma; St Louis, MO) como anticorpo de revelação.

Estudos de ressonância plasmónica superficial (SPR) -

Estas experiências foram levadas a cabo com o biossensor BIACore 2000 (BIACore, Uppsala, Suécia). Ligou-se rIL-15 a chips do sensor CM5, e a monitorizou-se a ligação de concentrações crescentes de sIL-15Ra-IL-2, sIL-15Roc-sushi-IL-2 ou sIL-15Ra-sushi. A análise de sensogramas foi levada a cabo utilizando um programa informático de avaliação cinética BIAlogue.

Ensaios de proliferação -

As respostas de proliferação de células Mo-7, TF-1β e Kit 225 a rIL-15, rIL-2, mediram-se RLI ou ILR pela incorporação de [3H]-timidina tal como descrito (19) após 4 h num meio desprovido de citocina, 48 h de cultura e 16 h com [3H]-timidina.

Apoptose - O teste da anexina V foi levada a cabo utilizando um citómetro de fluxo FACScan e o kit de detecção Annexin V-FITC Apoptosis (BD Biosciences Pharmigen, França). Após a privação de citocinas, as células foram inoculadas em microplacas a 5.105 células/poço em 1 mL e cultivadas em meios suplementados com os vários reagentes (rIL-15, sIL-15Ra-sushi e proteína de fusão RLI. Os dados são adquiridos e analisados com a utilização do programa informático CellQuest. 103 ΡΕ1934353

Ensaios de ligação e Internalização - A marcação com [125I]-iodo de rIL-15, sIL-15Ra-sushi humanos e a proteína de fusão RLI, e realizaram-se subsequentemente experiências de ligação tal como descrito anteriormente (19) . Para internalização, as células foram equilibradas a 4°C com sIL-15Ra-sushi ou RLI, e a temperatura alterada para 37°C. A diferentes intervalos de tempo, lavaram-se e centrifugaram-se duas amostras. Um dos sedimentos foi tratado com tampão glicina-HCl a 0,2 M, pH 2,5, enquanto que o outro foi tratado com PBS a pH 7,4 a 4°C durante 5 min. Após a centrifugação, a ligação total do ligando foi determinada a partir do sedimento das células tratadas com PBS, enquanto que as fracções ligada à membrana e internalizada foram determinadas, respectiva-mente, a partir do sobrenadante e do sedimento das células tratadas com pH ácido. sIL-15Ra-Sushi +: O sIL-15Ra-Sushi + marcado por Flag-Factor Xa foi expresso em células de insecto SF9 (ATCC CRL-1711) meio, SF 900 II (In Vitrogen, Cergy-Pontoise, França) tal como descrito para as proteínas RLI e ILR. Os sobrenadantes foram concentrados por precipitação com sulfato de amónio a 90% de saturação e carregado numa coluna de imunoafinidade de agarose anti-Flag (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, França). A pureza do sIL-15Ra-Sushi+ foi de 100% com uma massa molecular aparente de 12 kDa, tal como avaliado por SDS-PAGE após iodação com o método da cloramina-T tal como descrito anteriormente 104 ΡΕ1934353

(Lehours et al. Eur. Cytokine Netw. 11 (2000), 207-5). A sua concentração foi determinada pelo teste de proteína baseado no Ácido Bicinconínico (BCA) (Pierce, Perbio Science, Brebières, France).

Resultados A ligação de IL-15Ra a IL-15 é principalmente devida ao domínio sushi -

Um estudo prévio (25) mostrou que o domínio "sushi" codificado pelo exão 2 de IL-15R resultou numa inibição da ligação de IL-15 ao IL-15Ra ancorado na membrana, sugerindo que o domínio sushi foi indispensável para a ligação. De modo a medir directamente a contribuição do domínio sushi na ligação de IL-15, prepararam-se formas solúveis de IL-15Ra contendo a totalidade do domínio extracelular ou apenas o domínio sushi da extremidade N e testou-se a ligação a IL-15 num ensaio de competição e utilizando a tecnologia de ressonância plasmónica de superfície (SPR).

Tal como ilustrado na Fig IA, uma proteína de fusão sIL-15Roc-Il-2 foi produzida em células CHO, e compreendendo a totalidade do domínio extracelular IL-15Ra ligado a uma molécula de IL-2 humana (utilizada como cauda para purificação) , ligou-se a IL-15 com elevada afinidade (kon = 3,7 105 M_1s_1; koff = 1,4 1CT5 s-1/ Kd = 38 pM) . Uma construção similar ligando o domínio sushi de IL-15Ra à IL-2 humana também se ligou a IL-15 (Fig 1B) , mas com uma 105 ΡΕ1934353 afinidade 10 vezes inferior, principalmente devido a uma velocidade de saída mais elevada (kon =3,1 105 M_1s_1; koff = 1,3 IO-4 s"1; Kd = 420 pM) .

Foi também produzido em E. coli um domínio sushi solúvel. Este sIL-15Roc-sushi foi também ligado a IL-15 com uma afinidade mais baixa (kon = 2,5 105 M_1s_1; koff = 3,8 IO-4 s_1; Kd = 1,5 nM) (Fig 1C) .

Estes resultados indicam que o domínio sushi é responsável por uma parte substancial da afinidade de ligação de IL-15, mas que não reconstitui totalmente a ligação de elevada afinidade apresentada pelo domínio extracelular de comprimento total.

Como ilustrado na Figura 1E, um domínio sushi estende-se dos primeiros 13 aminoácidos codificados pelo exão 3, denominada região flexível, apresentou um aumento de quatro vezes na afinidade de ligação em comparação com sIL-15Roc-sushi-IL-2 que contém o domínio sushi não estendido, e apenas uma afinidade três vezes inferior à do IL-15Roc solúvel de comprimento total, enquanto a totalidade das três construções foram produzidas em sistemas eucarióticos com capacidades de enrolamento similares. Estes resultados indicam que o domínio sushi estendido até à região flexível praticamente reconstitui na totalidade a elevada afinidade de ligação apresentada pelo domínio extracelular de comprimento total. 106 ΡΕ1934353

Os resultados da análise de sensogramas que fornecem as constantes de afinidade para IL-15 (KD) , calculadas para as várias proteínas solúveis IL-15Roc, e a constante do teste estatístico (Qui 2), são apresentados na tabela 3 abaixo:

Tabela 3: KD (pM) Qui 2 SIL-15R-IL-2 34 0,183 Sushil5-IL-12 428 0, 159 Sushil5+ 102 0,443

Proteínas IL-15Ra inibem a ligação de IL-15 a IL-15Ra ancoradas a membrana -

As três formas solúveis de IL-15Ra foram testadas para a sua capacidade de competir com a ligação de IL-15 radio-iodinado a IL-15Ra expressos pela linha celular humana TF-1 que também expressa a cadeia IL-15Ry, mas não a cadeia IL-15RP (Fig 1D) . As três proteínas inibiram completamente a ligação de IL-15 às células TF-1 com os respectivos IC50 que foram similares aos Kds medidos pela tecnologia SPR: 100 pM (sIL-15 (-IL-2) , 270 pM (alL- 15Ra-sushi-IL-2) e 1,3 nM (sIL-15Ra-sushi). sIL-15Roc-sushi aumenta a proliferação celular estimulada por IL-15 através do complexo 15ύβ/γ -

Uma vez que o domínio sushi é facilmente produzido em E. coli com elevados rendimentos, foi seleccionado 107 ΡΕ1934353 para todos os estudos subsequentes. Numa primeira instância, foi testado em linhas celulares que apenas expressam o complexo IL-15R3/y (linha celular Mo-7 humana, linha celular 32ϋβ de ratinho que expressa a cadeia IL-15Ry de ratinho endógena e a cadeia IL-15R.p humana transfec-tada) . Como esperado, a linha celular Mo-7 proliferou em resposta a concentrações nanomolares de rIL-15 ou rIL-2 (Fig 2A e 2B) . Inesperadamente, a adição no ensaio de uma concentração fixa de sIL-15Ra-sushi (10 nM) aumentou a resposta proliferativa que foi desviada em cerca de 4 vezes para concentrações mais baixas de rIL-15R. Por si só, o sIL-15Roc-sushi não induziu qualquer resposta proliferativa. Em 32Όβ, obtiveram-se resultados similares com um desvio de cerca de 10 vezes. A especificidade foi avaliada pelo facto de sIL-15Ra-sushi não afectar a proliferação governada por rIL-2 das células Mo-7 (Fig 2B). A Fig 2C mostra que sIL-15Ra-sushi, de uma forma dependente da dose, com um IC50 (3,5 nM) similar ao seu Kd para IL-15, potenciou o efeito de uma concentração fixa de rIL-15 (1 nM) que isoladamente induz apenas um pequeno efeito proliferativo.

As proteínas de fusão RLI e ILR são indutores potentes da proliferação celular através do complexo Ι]1-15Ββ/γ -

De modo a avaliar se o efeito sinérgico de sushi na bioactividade de IL-15 poderia ser transferido numa única molécula, foram elaboradas construções moleculares que codificam para proteínas de fusão que ligam IL-15 e o domínio sushi. Para as duas construções, introduziu-se uma 108 ΡΕ1934353 sequência de ligação flexível entre a extremidade C de IL-15 e a extremidade N do domínio sushi (ILR) ou vice-versa (RLI) (Fig 2E) . Modelos moleculares que ilustram as estruturas destas proteínas são apresentados na Fig 2F. Estas duas proteínas de fusão foram testadas na proliferação de células Mo-7.

Como ilustrado na Fig. 2D, ambas as proteínas induziram a indução dependente da dose da proliferação de células Mo-7, com EC50s que foram similares (25 pM) e substancialmente inferiores aos EC50s da rIL-15 isoladamente (3 nM) , ou de uma mistura equimolar de rIL-15 mais sIL-15Ra-sushi (0,9 nM) . Estes resultados confirmam ainda o efeito sinérgico de sIL-15Ra-sushi na acção IL-15, e indicam que a estabilização do complexo IL-15 : sIL-15Ra-sushi com uma sequência de ligação covalente aumenta marcadamente esta acção sinérgica. sIL-15Ra-sushi aumenta a prevenção da apoptose induzida por IL-15, e RLI evita eficientemente a apoptose celular -

Após a remoção de citocina, a fracção de células Mo-7 apoptóticas aumentou de 10 % a 80 % em 48 horas (Fig 3A, gráficos a e b). Quando se adiciona no tempo zero, rlL-15 (5 nM) reduziu esta apoptose a 70% (Fig 3A, gráfico c) . Isoladamente, sIL-15Ra-sushi (10 nM) não teve efeito (Fig 3Ab). No entanto, potenciou marcadamente o efeito anti-apoptótico de rIL-a5 (35 % de apoptose a 48 h) (Fig 3A, gráfico c). O efeito sinérgico de sIL-15Ra-sushi na 109 ΡΕ1934353 prevenção de IL-15 da apoptose é confirmado por análise cinética (Fig 3B) e por curvas de dose-resposta (Fig 3C). A rIL-15 actuou com uma IC50 de cerca de 1,5 nM, um valor em concordância com a saturação de receptores IL-15p/y. Este IC50 foi cerca de 10 vezes inferior (170 pM) na presença de 10 nM de sIL-15Ra-sushi. A proteína de fusão RLI preveniu marcadamente a apoptose (Fig 3B) . Numa base molar, foi ainda mais activa do que a associação IL-15 : sIL-15Ra-sushi, com um IC50 de cerca de 40 pM (Fig 3C). sIL-15Ra-sushi aumenta a ligação de IL-15 a células Mo-7 e a proteína de fusão RLI liga-se a e é internalizada pelas células Mo-7 -

Como esperado, as células Mo-7 ligadas a IL-15 com afinidade intermediária (Kd = 13,5 nM), com uma capacidade de ligação máxima de 800 locais/célula (Fig 4A). A adição de sIL-15Ra-sushi (10 nM) aumentou a afinidade da ligação a IL-15 (Kd = 7 nM) sem afectar significativamente a capacidade de ligação máxima (1180 locais/célula). Quando se utiliza a proteína de fusão RLI radio-iodinada (Fig 4B), descobrimos que se ligou a um número de locais de receptor similar (730 locais/célula), e a afinidade de ligação (Kd = 780 pM) foi marcadamente superior do que aquela de IL-15. Fig 4C mostra que RLI pode ser eficientemente e rapidamente internalizada. A fracção da radioactividade associada às células diminuiu em cerca de 2 0 min e foi acompanhada por um aumento concomitante da radioactividade intracelular. 110 ΡΕ1934353 sIL-15Roc-sushi não afecta a proliferação celular governada por IL-15 nem a inibição da apoptose através do complexo de elevada afinidade IL-15Ra/p/y - A linha celular de linfoma humano Kit 225 expressa cadeias IL-15Ra, β e γ, endógenas e a linha celular TF-Ιβ expressa cadeias IL-15Roc e γ endógenas mais a cadeia IL-15Rβ humana transfectada. Consequentemente, estas linhas celulares proliferam em resposta a concentrações baixas, picomolares de IL-15, tal como apresentado na Fig 5A e 5B (respectivamente, EC50 = 19 pM e 21 pM) . Contra-riamente ao que foi descoberto em células Mo-7 ou 32Όβ, a adição de concentrações equimolares de sIL-15Ra-sushi a IL-15 não afectou significativamente a curva de dose-resposta de IL-15 em qualquer tipo de célula. A proteína de fusão foi tão activa como rIL-15 em ambas as linhas celulares. A RLI foi também tão activa como rIL-15 em células Kit 225, mas cerca de 16 vezes mais eficiente (EC50 =1,2 pM) do que rIL-15 em células TF-Ιβ.

Os efeitos de sIL-15Ra-sushi e RLI foram ainda analisados na apoptose de células TF-Ιβ induzida pela privação de citocina. Os histogramas são apresentados na Fig 5C (gráficos a, b, c e d), enquanto que a cinética e as curvas de dose-resposta são apresentadas, respectivamente, em Fig 5D e 5E. A dose de rIL-15 e o tempo inibiram de forma dependente a apoptose de TF- 1β. O sIL-15Ra-sushi isoladamente não teve efeito e não alterou o efeito de IL-15. A proteína de fusão ILR foi tão activa como rIL-15, enquanto que RLI tem um efeito protector que foi cerca de 111 ΡΕ1934353 três vezes superior ao de rIL-15 (IC50 =2,5 pM para RLI em vez de 6,5 pM para rIL-15 ou sIL-15Roc-sushi mais rIL-15) . IL-15, sIL-15Ra-sushi e ligação de RLI a células ΤΠβ -

Na medida em que sIL-15Ra-sushi não afectou a proliferação de IL-15 de TF-Ιβ, examinámos o seu efeito na ligação de IL-15 que foi analisada numa larga gama de concentrações (Fig 6A). A análise de Scatchard da curva de ligação de saturação indicou a presença de duas classes de locais de ligação IL-15, compatíveis com a presença de um pequeno número de locais de ligação de levada afinidade (complexos IL-lSRa/β/γ, Kd = 22 pM, Bmax = 100 locais/célula) mais quantidades mais elevadas de locais de ligação com afinidade intermédia (complexos IL-15Rβ/γ, Kd = 30 nM, 2800 locais/célula). sIL-15Ra-sushi induziu um aumento da ligação de IL-15 que, mediante análise de Scatchard, foi principalmente devido a um aumento da afinidade da ligação de IL-15 para o componente de afinidade intermédia (Kd =3,5 nM).

De modo a testar mais especificamente o efeito de sIL-15Ra no componente de elevada afinidade, o seu efeito foi analisado a baixas concentrações de IL-15 marcada radioactivamente. Tal como apresentado na Fig 6B, sIL-15Ra-sushi, a concentrações até 25 nM, não afecta a ligação de IL-15 a baixas concentrações de IL-15 (200 pM) que principalmente são direccionados para o receptor de elevada afinidade (Fig 6B). 112 ΡΕ1934353 A ligação do sIL-15Roc-sushi marcado radio-activamente a células TF-Ιβ (Fig 6C) revelou um componente de ligação específica que foi estritamente dependente da presença de rIL-15. Na presença de 1 nM de rIL-15, o Kd que reflecte a ligação de sIL-15Ra-sushi foi 3,5 nM, um valor compatível com a sua afinidade para IL-15, com uma capacidade de ligação máxima (3300 locais/célula) compatível com o número de locais de ligação a IL-15 intermediários. Como ainda ilustrado em Fig 6D, sIL-15Ra-sushi marcado radio-activamente foi eficientemente internalizado. A proteína de fusão RLI marcada radioactivamente também e ligou às células TFip (Fig 6E). Foi observado um único componente de ligação específico com um Kd de 250 pM e uma capacidade máxima (4000 locais/célula) de novo comparável ao número de locais de ligação de afinidade intermédia a IL-15. Uma vez ligada, a RLI foi também eficientemente internalizada (Fig 6F) .

Discussão

Mostrou-se anteriormente que a deleção do exão 2 de IL-15Ra humano completamente inibe a ligação de IL-15, indicando o papel dispensável do domínio sushi no reconhecimento de citocina (25). A presente invenção mostra que a remoção da cauda da extremidade C (exões 3 a 5) da parte extracelular de IL-15Roc (no contexto da proteína de fusão sIL-15Ra-IL-2) resulta numa diminuição de 10 vezes da sua afinidade de ligação para IL-15, tal como observado por SPR, e uma diminuição de 3,5 da sua afinidade tal como observado num ensaio de competição. 113 ΡΕ1934353

Em termos de termodinâmica, uma diminuição de 10 vezes na afinidade foi calculada como correspondendo a uma perda de 10 % da energia livre de interacção de IL-15 com IL-15Ra. Assim, o domínio estrutural da extremidade N codificado pelo exão 2 (domínio sushi) contém a maioria (90 %) mas não a totalidade da capacidade de ligação a IL-15. Dados recentes do nosso laboratório indicam que o domínio codificado pelo exão 3 também contribui para a ligação a IL-15. O sIL-15Roc-sushi produzido em E. coli tem uma afinidade que foi 3 a 4 vezes inferior àquela de sIL-15Ra-sushi-IL-2 produzida em células CHO. Esta diferença não pode ser explicada por diferenças no estado de glicosilação das duas proteínas, na medida em que o domínio sushi não contém quaisquer locais potenciais para glicosilações ligadas a N- ou O- (2) . É então provavelmente devida a diferenças no enrolamento estrutural das duas proteínas.

Enquanto compete com a ligação de IL-15 a IL-15Roc de membrana, descobriu-se que sIL-15Ra-sushi exerce efeitos agonistas através do aumento da acção IL-15 através do complexo IL-15p/y. Estudos em células que expressam ou apenas receptores de IL-15 de afinidade intermediária (Mo-7, 32Όβ) ou ambos os receptores de IL-15 de afinidade elevada e intermediária (TF-Ιβ, Kit 225) mostraram que a acção agonista de sIL-15Roc-sushi foi especif icamente direccionada para o complexo ΙΕ-15Εβ/γ: (i) não apresentou 114 ΡΕ1934353 efeito na ausência de IL-15, (ii) ligou-se a células TF-Ιβ na presença de IL-15 com uma única classe de afinidade de locais de ligação, cuja densidade foi comparável àquela dos locais de ligação intermediários a IL-15, (iii) em células Mo-7 e células TF-Ιβ, aumentou a afinidade de IL-15 para o complexo IL-15Rj3/y enquanto que não afecta a ligação de IL-15 ao complexo de elevada afinidade em células TF-Ιβ, (iv) aumentou a eficiência da acção biológica de IL-15 (proliferação, prevenção da apoptose) através de IL-15Rj3/y em células Mo-7, mas não apresentou qualquer efeito nos mesmos efeitos biológicos mediados através do receptor de elevada afinidade nas células TF-Ιβ. A funcionalidade desta acção agonista foi ainda suportada pelo facto de sIL-15Roc-sushi, uma vez ligada em conjunção com IL-15 para IL-15Rj3/y nas células Mo-7, ter sido eficientemente internalizado na célula. A sua potência foi aumentada no contexto das proteínas de fusão ILR e RLI: (i) RLI ligou-se a IL-15Rβ/γ com uma afinidade quase 20 vezes superior à própria IL-15. (ii) a ligação de RLI foi seguida por uma rápida internalização da proteína de fusão. (iii) as proteínas de fusão RLI ou ILR foram muito mais potentes do que IL-15 nos ensaios funcionais. As curvas de dose-resposta das duas proteínas de fusão nas células Mo-7 foram comparáveis àquelas de IL-15 através do receptor de elevada afinidade em células Kit 225 ou TF-Ιβ, indicando que estas proteínas de fusão praticamente reconstituem por completo a resposta de elevada afinidade em células que apenas expressam o receptor de afinidade intermédia. 115 ΡΕ1934353

Os resultados então indicam que sIL-15Ra-sushi e IL-15 formam um complexo que aumenta de forma cooperativa as suas afinidades de ligação ao receptor IL-15R.p/y. Pelo contrário, sIL-15Ra-sushi não é capaz de afectar a ligação e a bioactividade de IL-15 uma vez que esta última está já associada com o complexo receptor de elevada afinidade da membrana. Não se pode excluir no entanto que sIL-15Ra-sushi esteja possa ainda se ligar à IL-15 já envolvida neste complexo de elevada afinidade e poderia ser testado com a disponibilidade de células que expressam principalmente o receptor de elevada afinidade, isto é, células que expressam níveis similares das três subunidades do receptor. 0 nosso laboratório mostrou anteriormente que sIL-15Ra expresso em células COS ou produzido naturalmente por células positivas para sIL-15Ra, comporta-se como antagonista potente através da ligação com elevada afinidade a IL-15 (Kd = 166 pM) e da inibição da proliferação de células Kit 225 induzida por IL-15 a concentrações baixas (IC50 entre 3 e 10 pM) (19) . Estes resultados contrastam com a presente invenção mostrando que sIL-15Ra-sushi não tem qualquer efeito na proliferação das células Kit 225 ou TF-Ιβ, e é agonista nas células Mo-7.

Outro resultado contrastante, é um relatório recente que mostra que uma mistura de rIL-15 com uma quimera homodimérica sIL-15Roc humano recombinante (sem o 116 ΡΕ1934353 exão 3)-Fc podia induzir um efeito anti-apoptótico em células Mo-7, enquanto que a IL-15 isoladamente na mesma dose não tinha qualquer efeito (26).

Numa tentativa de explicar estas diferenças de acção, propõe-se um modelo na Fig 7 do presente pedido de patente. No contexto da resposta de elevada afinidade de IL-15, sIL-15Roc actua como um competidor da IL-15Ra membranar para o recrutamento de 11-15 (Fig 7A). 0 complexo de sIL-15Roc-sushi com IL-15, pelo contrário, é capaz de se associar com IL-15R3/y e aumentar o efeito biológico de II-15 (Fig 7B). Para explicar a ausência de efeito inibidor de sIL-15Roc-sushi no contexto do receptor de elevada afinidade, existem duas alternativas (Fig 7C) . De acordo com a primeira alternativa, sIL-15Ra-sushi tem uma afinidade mais baixa para IL-15 (Kd = 1,5 nM, este documento) do que tem sIL-15Ra (Kd = 160 pM) (19), e como tal não é capaz de competir de forma eficiente com o IL-15Roc em células Kit 225 e TF- 1β· De acordo com a segunda alternativa, sIL-15Ra-sushi pode competir com IL-15Ra de membrana para se ligar a IL-15 e forma complexos com IL-15Rp/y similar àquele formado em células Mo-7. Tais complexos são menos eficientes uma vez que necessitam de concentrações mais elevadas de IL-15 para serem activados (IC50 = 750 pM em vez de 20 pM para receptores de elevada afinidade, Figs 2 e 5) . No entanto, dado o facto de IL- 15Κβ/γ estarem em excesso relativamente a IL-15Roc nas células Kit 225 ou TF-Ιβ, a menor eficiência de tais complexos poderia ser compensada pela sua maior densidade 117 ΡΕ1934353 (cerca de 3000 receptores de afinidade intermédia em vez de 100 receptores de elevada afinidade em células TF-Ιβ, cf. Fig 6) . Isto resultaria em alterações não observáveis em termos de efeitos biológicos. A nossa observação de que sIL-15Roc-sushi não afecta a ligação de elevada afinidade a IL-15 em células TF-Ιβ (Fig 6B) favorece no entanto a primeira alternativa.

As diferenças funcionais entre sIL-15Roc e sIL-15Ra-sushi indicam que a cauda da extremidade C de sIL-15Ra desempenha um papel crucial para competir com IL-15Ra de membrana e deste modo para a acção antagonista de sIL-15Ra. Esta cauda poderia ou impedir a associação de IL-15Roc solúvel com IL-15Rβ/γ, ou permitir uma tal associação, mas resultar numa conformação inapropriada de Ιύ-15Ββ/γ para o seu funcionamento. Foi proposto um mecanismo similar no caso de uma cadeia γ comum solúvel (27) . A actividade inibidora desta cadeia γ solúvel (correspondendo à totalidade da parte extracelular da cadeia γ) foi abolida pela remoção da sua extremidade C ou por mutações na unidade WSXWS, duas regiões não envolvidas na ligação a citocinas.

Os efeitos agonistas de sushi são reminiscentes dos efeitos agonistas descritos para receptores solúveis no seio da família IL-6 ampliada de citocinas (nomeadamente SIL-6R, sIL-HR, sCNTFR e a subunidade IL-12p40) (28) . No entanto, tal acção agonista no caso de IL-15R não poderia ser antecipada na medida em que todos os receptores 118 ΡΕ1934353 solúveis descritos até à data na família yc (sIL-2Ra, sIL-2ύβ, sIL-4R) e ou próprio sIL-15Ra, se comportam como antagonistas de citocinas (19, 29). Os presentes resultados deste modo identificam o domínio sushi solúvel de IL-15Roc como um agonista inesperado e eficiente no seio desta família. O conceito de trans-sinalização foi utilizado primeiro no caso de IL-6, em que se mostrou que IL-6R solúvel aumentava a sensibilidade de células com resposta a IL-6 através da acção de IL-6 e para tornar células que expressam gpl30 mas não IL-6R de membrana sensíveis a IL-6 (30). Este conceito foi ampliado a outros membros da família de citocinas gpl30 (IL-11R, CNTFR, CLC) (31-34) . No caso de IL-15, foi apresentado um mecanismo de transapre-sentação (12), no qual IL-15 produzido por monócitos/cé-lulas dendríticas está associado ao IL-15Ra expresso pelas mesmas células e pode estimular a proliferação de células não envolvidas IL-15R3/y+IL-15RoT. Em relatórios recentes sugeriu-se que a transapresentação é um mecanismo dominante in vivo, que necessita da expressão de IL-15 e IL-15Ra pelas mesmas células (13, 14, 35, 36). Tem alguma semelhança com a o conceito de trans-sinalização, na medida em que o complexo IL-15/IL-15Ra transapresentado pode provocar uma resposta em células IL-15Rp/y+IL-15RoT a concentrações fisiológicas de IL-15. A este respeito, ao IL-15RO. de membrana acuta como um agonista de acção de IL-15 através do aumento da sua avidez pelo complexo IL-15Rp/y e da eficiência de sinalização (12). Os nossos dados 119 ΡΕ1934353 mostram que sIL-15Roc-sushi se comporta de um modo similar e provoca uma resposta das células IL-15Rp/y+ IL-15Ra_ à acção de IL-15. Isto sugere que o domínio sushi do IL-15Roc de membrana é crucial para a transapresentação. Mostrámos que sIL-15Roc produzido por células que expressam IL-15Ra e que engloba a totalidade da parte extracelular de IL-15Ra, inibe a acção IL-15 (19). Constitui provavelmente um mecanismo de "feedback" negativo que limita os efeitos biológicos de IL-15. Pelo contrário, o sIL-15Ra-sushi descrito neste estudo apresenta um efeito agonista. Se um tal domínio sushi for gerado por células que expressam IL-15Ra, poderia participar no mecanismo de transapresentação de IL-15. A existência de tais domínios sushi solúveis produzidos naturalmente não foi ainda descrita, mas é suportada pelos factos de que (i) foram descritas diferentes isoformas do IL-15Ra de membrana, incluindo algumas que carecem de cauda (codificadas pelos exões 3 a 5) ligando o domínio sushi ao domínio transmembranar (3, 25, 37), e (ii) foi demonstrada a geração de homólogos solúveis para alguns deles por perda (19) . Assim, sIL-15Ra e sIL-15Ra-sushi poderiam ter efeitos reguladores opostos, e como tal ambos participam na afinação da magnitude e duração da acção biológica de IL-15. A presente invenção também mostra que a utilização de uma sequência de ligação flexível para produzir uma proteína de fusão tal como ILR e RLI é uma abordagem válida no caso de IL-15. Foi gerado um modelo molecular de IL-15 com o domínio sushi (Fig 2) que ajudou a desenhar uma 120 ΡΕ1934353 sequência de ligação flexível para ligar a extremidade C de IL-15 à extremidade N de sushi (proteína de fusão ILR) ou vice-versa (proteína de fusão RLI) . O modelo também previu que a sequência de ligação não mascarava as áreas de IL-15 que se mostraram estar envolvidas na ligação às cadeias IL-15RP e γ. Tal como discutido acima, verificou se que as duas proteínas de fusão eram muito mais activas do que IL-15 e a combinação de IL-15 mais sIL-15Ra-sushi na activação do complexo IL-15Rp/y em células Mo-7. Em células TF-Ιβ, e no contexto da activação do receptor de elevada afinidade, a proteína de fusão ILR foi tão activa como IL-15 e a proteína de fusão RLI foi mesmo 10 vezes mais activa, com um EC50 tão baixo quando 1,2 pM na indução da proliferação celular. Devido à sua actividade mais elevada, estas proteínas de fusão hiper-IL-15 parecem constituir ferramentas valiosas para a expansão de subconjuntos de linfócitos, e especialmente aqueles (células NK, T de memória CD8) para os quais a transapresentação de IL-15 foi sugerida como sendo o processo de activação fisiológica (13). São deste modo moléculas adjuvantes muito eficientes em estratégias terapêuticas com o objectivo de curar pacientes com cancro, imunodeficiências, ou doenças infecciosas.

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Tabela 4: lista de SEQ ID NO: hIL-15Ralfa = IL-15Ralfa humano hIL-2 = IL-2 humana SEQ IN NO: 1 ADNc de hIL15Ralfa (1610 pb) 2 Sequência codificante de hIL-15Ralfa (83..883 de SEQ ID NO: 1) 3 Proteína hIL15Ralfa (267 aa) 4 Sequência codificante do péptido sinal de hIL-15Ralfa (83..172 de SEQ ID NO:l) 5 péptido sinal de hIL-15Ralfa (1..30 de SEQ ID NO:3) 6 Sequência codificante do péptido maturo de hIL-15Ralfa (173..883 de SEQ ID NO:l) 7 péptido sinal do péptido maturo de hIL-15Ralfa (31..267 de SEQ ID NO:3) 8 Exão 1 de hIL-15Ralfa (1..170 de SEQ ID NO: 1) 9 Exão 2 de hIL-15Ralfa (171..365 de SEQ ID NO: 1) 10 Exão 3 de hIL-15Ralfa (366..464 de SEQ ID NO: 1) 127 ΡΕ1934353 11 Exão 4 de hIL-15Ralfa (465..665 de SEQ ID NO: 1) 12 Exão 5 de hIL-15Ralfa (666..698 de SEQ ID NO: 1) 13 Sequência codificante do domínio sushi de hIL-5Ralfa; de Cl a C4 (179..361 de SEQ ID NO: 1) 14 Domínio sushi de hIL-5Ralfa; de Cl a C4 (33..93 de SEQ ID NO: 3) 15 Sequência codificante de [it + domínio sushi de hlL-15Ralfa] (173..361 da SEQ ID NO: 1) 16 [it + domínio sushi de hIL-15Ralfa] (31..93 da SEQ ID NO: 3) 17 Sequência codificante de [t + domínio sushi de hlL-lõRalfa] (176..361 da SEQ ID NO: 1) 18 [t + domínio sushi de hIL-15Ralfa] (32..93 da SEQ ID NO: 3) 19 Sequência codificante da região flexível de hIL-15Ralfa (362..403 da SEQ ID NO: 1) 20 Região flexível de hIL-15Ralfa (94..107 da SEQ ID NO: 3; irdpalvhqrpapp) 21 Sequência codificante de [domínio sushi de hIL-15Ralfa + i] (179..364 da SEQ ID NO: 1) 22 [domínio sushi de hIL-15Ralfa + i] (33..94 da SEQ ID NO: 3) 128 ΡΕ1934353 23 Sequência codificante de [it + domínio sushi de hlL-15Ralfa + i] (173..364 da SEQ ID NO: 1) 24 [it + domínio sushi de hIL-15Ralfa + i] (31..94 da SEQ ID NO: 3) 25 Sequência codificante de [t + domínio sushi de hlL-15Ralfa + i] (176..364 da SEQ ID NO: 1) 26 [t + domínio sushi hIL-15Ralfa + i] (32..94 da SEQ ID NO: 3) 27 Sequência codificante de [it + domínio sushi de hlL-15Ralfa + i + rd] (173..370 da SEQ ID NO: 1) 28 [it + domínio sushi hIL-15Ralfa + i + rd] (31..96 da SEQ ID NO: 3) 29 Sequência codificante de [it + domínio sushi de hlL-15Ralfa + i + rd + 11 aa codificados pelo exão 3] (173..403 da SEQ ID NO: 1) 30 [it + domínio sushi de hIL-15Ralfa + i + rd + 11 aa codificados pelo exão 3] (31..107 da SEQ ID NO: 3) 31 Sequência codificante de região rica em locais de glicosilação de hIL-15Ralfa (404..709 da SEQ ID NO: 1) 32 Região rica em locais de glicosilação de hIL-15Ralfa (108..209 da SEQ ID NO: 3) 129 ΡΕ1934353 33 Sequência que codifica para a parte codificada pelo exão 3 da região rica em locais de glicosilação de hlL-15Ralfa humano (404..464 da SEQ ID NO: 1) 34 Parte codificada pelo exão 3 da região rica em locais de glicosilação de hIL-15Ralfa humano (108..127 da SEQ ID NO: 3) 35 Sequência codificante de [it + domínio sushi de hlL-15Ralfa + i + todos os aa codificados pelo exão 3] (173..464 da SEQ ID NO: 1) 36 [it + domínio sushi de hIL-15Ralfa + i + todos os aa codificados pelo exão 3] (31..127 da SEQ ID NO: 3) 37 Sequência codificante de um fragmento extracelular solúvel de hIL-15Ralfa (83..697 da SEQ ID NO: 1) 38 fragmento de hIL-15Ralfa extracelular solúvel (1..205 da SEQ ID NO: 3) 39 Sequência codificante de um hIL-15Ralfa extracelular solúvel (83..709 da SEQ ID NO: 1) 40 um hIL-15Ralfa extracelular solúvel (1..209 da SEQ ID NO: 3) 41 Sequência codificante de um fragmento extracelular, com o péptido sinal deletado, solúvel de hIL-15Ralfa (173..697 da SEQ ID NO: 1) 42 fragmento extracelular, com o péptido sinal deletado, solúvel de hIL-15Ralfa (31..205 da SEQ ID NO: 3) 130 ΡΕ1934353 43 Sequência codificante de um hIL-15Ralfa extracelular, com o péptido sinal deletado, solúvel (173..709 da SEQ ID NO: 1) 44 Um hIL-15Ralfa extracelular, com o péptido sinal deletado, solúvel (31..209 da SEQ ID NO: 3) 45 ADNc de hIL-15 (1496 pb) 46 Proteína precursora de hIL-15 (162 aa) 47 Sequência codificante de hIL-15 nativa madura (517..858 de SEQ ID NO: 45) 48 hIL-15 nativa madura (49..162 de SEQ ID 0: 46) 49 Sequência de ácidos nucleicos da sequência de ligação 20 50 Sequência de aminoácidos da sequência de ligação 20 51 Sequência de ácidos nucleicos da sequência de ligação 26 52 Sequência de aminoácidos da sequência de ligação 26 53 Sequência de ácidos nucleicos da marcação Flag e do local de ligação Xa 54 Sequência de aminoácidos da marcação Flag e do local de ligação Xa 55 Sequência de ácidos nucleicos da marcação Flag e do local de ligação Xa 56 Sequência de aminoácidos da marcação Flag e do local de ligação Xa 131 ΡΕ1934353 57 Sequência codificante do péptido sinal da preprolactina bovina 58 péptido sinal da preprolactina bovina 59 Sequência de ácidos nucleicos da proteina de fusão RLI 60 proteina de fusão RLI 61 Sequência de ácidos nucleicos da proteina de fusão ILR 62 proteina de fusão ILR 63 ADNc de hIL-2 (1047 pb) 64 Sequência codificante de hIL-2 madura (355..753 de SEQ ID NO: 63) 65 hIL-2 madura (133 aa) 66 Sequência de ácidos nucleicos de um fragmento de hlL-15Ralfa contendo o domínio sushi, marcado com IL-2 [péptido sinal de hIL-15Ralfa + it + hIL + domínio sushi de hIL-15Ralfa + i + rd + sequência de ligação lq + hIL-2] 67 Fragmento de hIL-15-Ralfa contendo o domínio sushi, marcado com IL-2 [péptido sinal de hIL-15Ralfa + it + hIL + domínio sushi de hIL-15Ralfa + i + rd + sequência de ligação lq + hIL-2] 132 ΡΕ1934353 68 Sequência de ácidos nucleicos de um fragmento de hlL-15Ralfa extracelular, marcado com IL-2 [péptido sinal de hIL-15Ralfa + fragmento da região extracelular de hIL-15Ralfa + sequência de ligação lq + hIL-2] 69 Fragmento de hIL-15Ralfa extracelular, marcado com IL-2 [péptido sinal de hIL-15Ralfa + fragmento da região extracelular de hIL-15Ralfa + sequência de ligação lq + hIL-2] 70 Iniciador no sentido directo da cadeia beta (GAGAGACTGGATGGACCC) 71 Iniciador no sentido inverso da cadeia beta (AAGAAACTAACTCTTAAAGAGGC) 72 ADNc de IL-15Ralfa de ratinho (Mus musculus) (792 pb) 73 Proteína IL-15Ralfa de ratinho (263 aa) 74 Região extracelular de IL-15Ralfa de ratinho (1..205 de SEQ ID NO: 73) 75 Domínio sushi de IL-15Ralfa de ratinho (36..96 de SEQ ID NO: 73) 76 Região flexível de IL-15Ralfa de ratinho (97..109 de SEQ ID NO: 73) 77 Região da cauda de IL-15Ralfa de ratinho (110..205 de SEQ ID NO: 73) 78 ADNc de IL-15Ralfa de chimpanzé (Pan troglodytes) (1035 pb) 133 ΡΕ1934353 79 Proteína IL-15Ralfa de chimpanzé (344 aa) 80 Região extracelular de IL-15Ralfa de chimpanzé (1..286 de SEQ ID NO: 79) 81 Domínio sushi de IL-15Ralfa de chimpanzé (13..73 de SEQ ID NO: 79) 82 Região flexível de IL-15Ralfa de chimpanzé (74..88 de SEQ ID NO: 79) 83 Região da cauda de IL-15Ralfa de chimpanzé (89..286 de SEQ ID NO: 79) 84 ADNc de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (765 pb) 85 Proteína IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (3254 aa) 86 Região extracelular de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (1. .182 de SEQ ID NO: 85) 87 Domínio sushi de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (24. . 84 de SEQ ID NO: 85) 88 Região flexível de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (85..96 de SEQ ID NO: 85) 89 Região da cauda de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (97..182 de SEQ ID NO: 85) 90 Exão 3 de IL-15Ralfa de Mus musculus 91 Exão 3 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes 92 Exão 3 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus 93 Parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa 134 ΡΕ1934353 94 Parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa de Mus musculus 95 Parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes 96 Parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus 97 Parte codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa de Mus musculus 98 Parte codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes 99 Parte codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus 100 Iniciador no sentido directo para a cadeia gama (5' GAAGAGCAAG CGCCATGTTG 3') 101 Iniciador no sentido inverso para a cadeia gama (5' TCAGGTTTCAGGCTTTAGGG 3')

Lisboa, 22 de Dezembro de 2011

Claims (45)

1. ΡΕ1934353 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto para estimular a via de sinalização IL-15Rbeta/gama, para deste modo induzir e/ou estimular a activação e/ou a proliferação de células positivas para IL-15Rbeta/gama, tais como células NK e/ou T, caracterizado por compreender pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama, directamente ou indirectamente ligada por covalência a pelo menos um polipéptido que contém o domínio sushi da região extracelular de um IL-15Ralfa, em que: - a referida pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama é IL-15, ou um fragmento, mimético ou agonista de IL-15, em que o referido fragmento, mimético ou agonista de IL-15 tem uma afinidade para ligação a IL-15Rbeta/gama que não é significativamente inferior àquela da IL-15 nativa, e - a sequência de aminoácidos do referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi: - é a sequência de aminoácidos de um fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa, em que o referido fragmento reteve o domínio sushi da referida região extracelular de IL-15Ralfa, em que o referido domínio sushi é definido como começando no primeiro resíduo cisteína codificado pelo exão 2 (Cl) e terminando no quarto resíduo cisteína codificado pelo exão 2 (C 4), sendo ambos os resíduos Cl e C4 incluídos no domínio sushi, ou - é uma sequência e aminoácidos variante que é pelo menos idêntica em 85% à sequência de aminoácidos de uma tal 2 ΡΕ1934353 região extracelular de IL-15Ralfa, ou um tal fragmento da região extracelular, em relação ao comprimento total desta sequência de aminoácidos da região extracelular ou fragmento da região extracelular, desde que cada um dos quatro resíduos cisteína (Cl, C2, C3 e C4) do referido domínio sushi tenham sido retidos na referida sequência variante.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referido IL-15Ralfa ser um IL-15Ralfa humano, ou um IL-15Ralfa de macaco, ou um IL-15Ralfa murino, ou um IL-15Ralfa de coelho, ou um IL-15Ralfa de porco.
3. 3. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-2, caracterizado pela sequência de aminoácidos da referida região extracelular de IL-15Ralfa ser a sequência da região extracelular de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 40, da região extracelular de IL-15Ralfa de Pan troglodytes de SEQ ID NO: 80, da região extracelular de IL-15Ralfa de Mus musculus de SEQ ID NO: 74, ou da região extracelular de IL-15Ralfa de SEQ ID NO: 86.
4. 4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pela sequência de aminoácidos do referido domínio sushi ser a sequência do domínio sushi de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 14, do domínio sushi de IL-15Ralfa de Pan troglodytes de SEQ ID NO: 81, do domínio sushi IL-15Ralfa de Mus musculus de SEQ 3 ΡΕ1934353 ID NO: 75, ou do domínio sushi de IL-15Ralfa de SEQ ID NO: 87 .
5. 5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa compreender: - a parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelos exões 2 e 3 do referido IL-15Ralfa, ou de - um fragmento de uma tal parte codificada pelos exões 2-3, que reteve o referido domínio sushi.
6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela referida sequência codificada pelo exão 2 ser: - a parte codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa extracelular humano, que é a sequência de SEQ ID NO: 24, - a parte codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa extracelular de Pan troglodytes, que é a sequência de SEQ ID NO: 98, - a parte codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa extracelular de Mus musculus, que é a sequência de SEQ ID NO: 97, - a parte codificada pelo exão 2 de IL-15Ralfa extracelular de Rattus norvegicus, que é a sequência de SEQ ID NO: 99.
7. 7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-6, caracterizado pela referida sequência codificada pelo exão 3 ser: 4 ΡΕ1934353 - a parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa extracelular humano, que é a sequência de SEQ ID NO: 93, - a parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa extracelular de Pan troglodytes, que é a sequência de SEQ ID NO: 95, - a parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa extracelular de Mus musculus, que é a sequência de SEQ ID NO: 94, - a parte codificada pelo exão 3 de IL-15Ralfa extracelular de Rattus norvegicus, que é a sequência de SEQ ID NO: 96.
8. 8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa consistir em: - a parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelo exão 2 do referido IL-15Ralfa, ou em - um fragmento de uma tal parte codificada pelo exão 2, que reteve o referido domínio sushi.
9. 9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa compreender a parte da região extracelular de IL-15Ralfa que é codificada pelo exão 2 do referido IL-15Ralfa, e compreende ainda pelo menos um aminoácido da sequência codificada pelo exão 3 do referido IL-15Ralfa. 5 ΡΕ1934353
10. 10. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo referido fragmento da região extrace-lular de IL-15Ralfa consistir em: - a parte da região extracelular de IL-15Ralfa que é codificada pelos exões 2 e 3 do referido IL-15Ralfa, ou - a parte da região extracelular de IL-15Ralfa que é codificada pelo exão 2 e do referido IL-15Ralfa, e um fragmento da parte da região extracelular de IL-15Ralfa, que é codificada pelo exão 3 do referido IL15Ralfa.
11. 11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa ser um fragmento IL-15Ralfa que compreende ainda: - a região flexível do referido IL-15Ralfa, ou - um fragmento da referida região flexível, em que a sequência de aminoácidos da referida região flexível é: - a sequência flexível de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 20, - a sequência flexível de IL-15Ralfa de Pan troglodytes de SEQ ID NO: 82, - a sequência flexível de IL-15Ralfa de Pan troglodytes de SEQ ID NO: 82, - a sequência flexível de IL-15Ralfa de Mus musculus de SEQ ID NO: 76 , ou - a sequência flexível de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus de SEQ ID NO: 88. 6 ΡΕ1934353
12. 12. Um composto de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi ser o polipéptido da SEQ ID NO: 30.
13. 13. Um composto de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pela sequência de aminoácidos do referido fragmento da região flexível de IL-15Ralfa humano compreender i, ou ir, ou ird.
14. 14. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi ser o polipéptido de SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28.
15. 15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, 9-11, caracterizado pelo referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa humano compreender ainda: - a parte codificada pelo exão 3 da região rica em locais de glicosilação do IL-15Ralfa humano, sendo a referida parte codificada pelo exão 3 a sequência de SEQ ID NO: 34, ou - um fragmento de SEQ ID NO: 34.
16. 16. Composto de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi ser o polipéptido de SEQ ID NO: 36. 7 ΡΕ1934353
17. 17. Composto de acordo com as reivindicações 5-7, 9-11, 12, 15, caracterizado pelo referido fragmento da região extracelular de IL-15Ralfa compreender ainda: uma parte de IL-15Ralfa extracelular que é codificada por um ou vários exões de IL-15Ralfa extracelular, diferentes dos exões 1, 2, 3, ou - um fragmento de uma tal parte.
18. 18. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizado por compreender um péptido sinal, directamente ou indirectamente ligado ao referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi, ou à referida pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama.
19. 19. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pela referida IL-15 ser uma IL-15 humana.
20. 20. Composto de acordo com qualquer a reivindicação 19, caracterizado pela sequência de aminoácidos da referida IL-15 humana ser a sequência de SEQ ID NO: 48.
21. 21. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, caracterizado pela referida pelo menos uma entidade de ligação IL-15Rbeta/gama não se ligar a IL-2Ralfa. 8 ΡΕ1934353
22. 22. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, caracterizado pelo referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi estar directamente ligado à referida pelo menos uma entidade de ligação a IL- 15Rbeta/gama.
23. 23. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, caracterizado pelo referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi estar indirec-tamente ligado à referida pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama.
24. 24. Composto de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi estar ligado à referida pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama, através de uma sequência de ligação peptídica que compreende pelo menos um, mas menos de 30 aminoácidos.
25. 25. Composto de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pela sequência de aminoácidos da referida sequência de ligação peptídica ser a sequência de SEQ ID NO: 50 ou NO: 52.
26. 26. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi estar numa posição da extremidade N em relação à referida pelo menos uma entidade de ligação a IL-15Rbeta/gama. 9 ΡΕ1934353
27. 27. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-25, caracterizado pelo referido pelo menos um polipéptido contendo o domínio sushi estar numa posição da extremidade C em relação à referida pelo menos uma entidade de liqação a IL-15Rbeta/gama.
28. 28. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, 9-12, 18-21, 23-25, 26, caracterizado pela sequência de aminoácidos ser a sequência SEQ Dl NO: 60.
29. 29. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, 9-12, 18-21, 23-25, 26, caracterizado pela sequência de aminoácidos ser a sequência SEQ Dl NO: 62 .
30. 30. Ácido nucleico que codifica para um composto para estimular a via de sinalização IL-15Rbeta/gama, para deste modo induzir e/ou estimular a activação e/ou a proliferação de células positivas para IL-15Rbeta/gama, tais como células NK e/ou T, caracterizado por codificar para o composto de qualquer uma das reivindicações 1-29, de acordo com o código genético universal, tendo em devida conta a sua degenerescência.
31. 31. Vector, caracterizado por compreender pelo menos um ácido nucleico da reivindicação 30. 10 ΡΕ1934353
32. 32. Célula hospedeira, transformada ou trans-fectada por um ácido nucleico da reivindicação 30, e/ou por um vector da reivindicação 31.
33. 33. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 32, caracterizada por ser uma célula de mamífero.
34. 34. Adjuvante para uma composição imunoterapêu-tica, caracterizado por compreender pelo menos um elemento entre os seguintes elementos: - um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, - um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 30, - um vector de acordo com a reivindicação 31, - uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-33.
35. 35. Adjuvante de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por melhorar a resposta de memória CD8.
36. 36. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender pelo menos um elemento entre os seguintes elementos: - um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, - um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 30, - um vector de acordo com a reivindicação 31, 11 ΡΕ1934353 - uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-33.
37. 37. Fármaco, caracterizado por compreender pelo menos um elemento entre os seguintes elementos: - um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, - um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 30, - um vector de acordo com a reivindicação 31, - uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-33.
38. 38. Fármaco de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por ser uma composição de vacina preventiva e/ou paliativa e/ou terapêutica.
39. 39. Fármaco de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado por se destinar à prevenção e/ou paliação e/ou tratamento do desenvolvimento ou da presença de um tumor.
40. 40. Fármaco de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por compreender ainda pelo menos um antigénio tumoral.
41. 41. Fármaco de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado por se destinar à prevenção e/ou paliação e/ou tratamento de uma doença infecciosa. 12 ΡΕ1934353
42. 42. Fármaco de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado por se destinar à prevenção e/ou paliação e/ou tratamento de uma imunodeficiência.
43. 43. Fármaco de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado por se destinar à prevenção e/ou paliação e/ou tratamento de imunodeficiência combinada severa ligada ao cromossoma X.
44. 44. Processo in vitro para a indução e/ou estimulação da proliferação e/ou activação de células positivas para IL-15Rbeta/gama, caracterizado por compreender: proporcionar uma amostra de células que compreende células positivas para IL-15Rbeta/gama, - contactar a referida amostra com pelo menos um dos seguintes elementos: - um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, - um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 30, - um vector de acordo com a reivindicação 31, - uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-33, durante um período de tempo e sob condições ambientais que permitam o referido contacto para induzir e/ou estimular a proliferação e/ou a activação das referidas células positivas para 15Rbeta/gama. 13 ΡΕ1934353
45. 45. Processo in vitro para a produção de células NK e/ou T activadas, caracterizado por compreender: - proporcionar uma amostra de células que compreende células NK e/ou T quiescentes, - contactar a referida amostra com pelo menos um dos sequintes elementos: - um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, - um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 30, - um vector de acordo com a reivindicação 31, - uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-33, durante um período de tempo e sob condições ambientais que permitam o referido contacto para induzir a activação das referidas células NK e/ou T quiescentes compreendidas na referida amostra. Lisboa, 22 de Dezembro de 2011