ES2374166T3

ES2374166T3 - Dominios sushi de il-15ralfa como potenciadores selectivos y eficaces de la acción de il-15 a través de il-15rbeta/gamma, en las prote�?nas de fusión hiperagonistas il15ralfa sushi-il 15.

Info

Publication number: ES2374166T3
Application number: ES06842352T
Authority: ES
Inventors: Yannick Jacques; Ariane Plet; Erwan Mortier; Agnès QUEMENER; Patricia Vusio
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2005-10-20
Filing date: 2006-10-06
Publication date: 2012-02-14
Anticipated expiration: 2026-10-06
Also published as: WO2007046006A3; RU2008114488A; US10358477B2; CA2625694A1; JP2013226155A; CN101360827A; JP5394742B2; US20200109184A1; CA2625694C; EP1777294A1; EP1934353B1; EP1934353A2; BRPI0619300A2; US20090238791A1; CN101360827B; BRPI0619300B1; PT1934353E; MX2008005141A; RU2454463C2; DK1934353T3

Abstract

Compuesto, para estimular la via de senalización de IL-15Rbeta/gamma, para inducir con ello y/o estimular la activación y/o la proliferación de las celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma, tales como celulas NK y/o linfocitos T, caracterizado porque comprende al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, directa o indirectamente ligada por covalencia a por lo menos un polipeptido que contiene el dominio de sushi de la región extracelular de una IL-15Ralfa, en donde: - dicha al menos una entidad que se une IL-15Rbeta/gamma es IL-15, o es un fragmento, un mimetico o un agonista de IL-15, en donde dicho fragmento, mimetico o agonista de IL-15, tiene una afinidad para unirse a IL-15Rbeta/gamma que no es significativamente inferior a la de una IL-15 natural, y - la secuencia de aminoacidos de dicho al menos un polipeptido que contiene sushi: - es la secuencia de aminoacidos de la región extracelular de IL-15Ralfa, o - es la secuencia de aminoacidos de un fragmento de la región extracelular de IL-15Ralfa, en donde dicho fragmento conserva el dominio sushi de dicha región extracelular de IL-15Ralfa, en donde dicho dominio sushi se define como el que comienza en el primer residuo de cisteina codificado por el exón 2 (C1) , y termina en el cuarto residuo de cisteina codificado por el exón 2 (C4) , estando los residuos C1 y C4 ambos incluidos en dicho dominio sushi, o - es una secuencia variante de aminoacidos que tiene una identidad de al menos S5% con la secuencia de aminoacidos de tal regi6n extracelular de IL-15Ralfa, o de un fragmento tal de la región extracelular de IL-15Ralfa, en toda la longitud de esta secuencia de aminoacidos de la regi6n extracelular o del fragmento de la región extracelular, con la condición de que cada uno de los cuatro residuos de cisteina (C1, C2, C3 y C4) de dicho dominio sushi se hayan conservado en dicha secuencia variante.

Description

Dominios sushi de IL-15Ralfa como potenciadores selectivos y eficaces de la acci6n de IL-15 a traves de IL

15Rbeta/gamma, en las proteinas de fusi6n hiperagonistas IL15Ralfa sushi-IL15

Campo teenieo de la inveneian

5 La presente invenci6n se refiere al campo de las respuestas biol6gicas inducidas por citocinas y/o estimuladas por citocinas, mas particularmente al campo de las respuestas biol6gicas inducidas por IL-15 y/o estimuladas por IL-15, y especialmente al campo de aquellas respuestas biol6gicas que implican una ruta de senalizaci6n de IL15RW/V.

Anteeedentes de la inveneian

IL-15 es una citocina que, como IL-2, se ha descrito originalmente como un factor de crecimiento de los linfocitos T

10 (1). Las dos citocinas pertenecen a la familia de cuatro helices a agrupadas, y sus receptores de membrana comparten dos subunidades (las cadenas W y V de IL-2R/IL-15R), responsables de la transducci6n de senales (2). El complejo IL-2RW/V es un receptor de afinidad intermedia hacia ambas citocinas. Es expresado principalmente por la mayoria de las celulas NK, y se puede activar in vitro mediante concentraciones nanomolares de IL-2 o IL-15.

Los receptores de alta afinidad de IL-2 e IL-15, que se expresan por ejemplo en los linfocitos T activados, y que se

15 pueden activar con concentraciones picomolares de cualquiera de ambas citocinas, contienen ademas su propia cadena a particular, (IL-2Ra e IL-15Ra) que confiere una especificidad hacia las citocinas y potencia la afinidad de la uni6n de las citocinas (3).

Ambas citocinas tienen un papel fundamental en la inmunidad innata y adaptativa. Mientras que experimentos iniciales in vitro han mostrado un gran solapamiento funcional (inducci6n de la proliferaci6n y de la citotoxicidad de 20 los linfocitos activados y las celulas NK, coestimulaci6n de la proliferaci6n de los linfocitos B y sintesis de inmunoglobulinas, quimioatracci6n de linfocitos T) (1,4-6), experimentos mas recientes han indicado que las dos citocinas ejercen acciones complementarias e incluso opuestas, in vivo. Mientras que IL-2 o IL-2Ra desactivados en ratones, se asociaban con fenotipos autoinmunes, con aumento de la poblaci6n de linfocitos T y B activados, IL-15 e IL-15Ra desactivados dan como resultado defectos especificos en celulas NK, NK-T, linfocitos intraepiteliales y

25 linfocitos T CDS de memoria (7,S). Por otra parte, la IL-2 promueve la tolerancia periferica induciendo la activaci6n de la muerte celular inducida (AICD), mientras que la IL-15 inhibe la AICD mediada por IL-2 (9), y, a diferencia de la IL-2, la IL-15 es un factor de supervivencia para los linfocitos T CDS de memoria (10).

De acuerdo con estas observaciones, se ha sugerido que el papel principal de la IL-2 es limitar la expansi6n continua de los linfocitos T activados, mientras que la IL-15 es fundamental para el inicio de la divisi6n de los

30 linfocitos T y la supervivencia de los linfocitos T de memoria (11).

Se ha descrito un nuevo mecanismo de transpresentaci6n de IL-15, en el que IL-15 e IL-15R-a se expresan de forma coordinada por celulas presentadoras de antigeno (monocitos, celulas dendriticas), e IL-15 unida a IL-15Ra se presenta en trans a NK o linfocitos T CDS pr6ximos, que expresan s6lo el receptor IL-15RW/V (12). La transpresentaci6n de IL-15 como un evento coestimulador que tiene lugar en la sinapsis inmunol6gica, parece ser

35 ahora un mecanismo dominante de la acci6n de IL-15 in vivo (13,14). Se sugiere que tiene un papel importante en la inmunovigilancia de tumores (15).

Las subunidades IL-15Ra e IL-2Ra forman una subfamilia de receptores de citocinas porque comprenden en sus partes extracelulares N-terminales, los dominios estructurales denominados "sushi" (uno en IL-15Ra, dos en IL-2Ra), tambien encontrados en moleculas del complemento o de adhesi6n (16). En ambos casos, se ha mostrado que

40 estos dominios sushi son portadores de la mayor parte de los elementos estructurales responsables de la uni6n a citocinas.

Mientras que IL-2Ra aislado es un receptor de baja afinidad para la IL-2 (Kd = 10 nM), IL-15Ra se une a IL-15 con alta afinidad (Kd = 100 pM). La liberaci6n de IL-2Ra por prote6lisis es un mecanismo natural que participa en la regulaci6n negativa de la activaci6n de los linfocitos. IL-2Ra se escinde con Der p1, un alergeno importante de los

45 acaros, para inhibir los linfocitos Th1 y favorecer un ambiente alergico (17), y con metaloproteinasas obtenidas a partir de tumores para suprimir la proliferaci6n de linfocitos T encontrados en el cancer (1S). El IL-2Ra soluble generado de este modo es un inhibidor competitivo de la acci6n de IL-2 in vitro. Sin embargo, sigue siendo un ligante de IL-2 de baja afinidad, y no es probable que participe de manera eficaz en la regulaci6n negativa de la actividad de IL-2 in vivo.

50 Recientemente se ha mostrado que una forma soluble de IL-15Ra humano tambien se puede liberar de forma natural desde celulas positivas para IL-15Ra, mediante un proceso de liberaci6n que implica MMPs (19). En contraste con IL-2Ra soluble, este receptor de IL-15Ra soluble era capaz de unirse a IL-15 con una afinidad alta, y de bloquear de manera eficaz la proliferaci6n impulsada a traves del complejo de senalizaci6n IL-15Ra/W/V de alta afinidad. Este resultado era coherente con el concepto del comportamiento de sIL-15Ra, al igual que su hom6logo

55 sIL-2Ra, como antagonista, y con efectos inhibidores de sIL-15Ra de rat6n in vitro o in vivo (20,21).

En esta memoria, los presentes inventores muestran que un fragmento que consiste esencialmente en el dominio sushi de IL-15Ralfa (= IL-15Ra) tiene una acci6n opuesta. Tal fragmento es capaz de potenciar la uni6n, asi como la bioactividad de IL-15 a traves del receptor de afinidad intermedia IL-15Rbeta/gamma (= IL-15RW/V), sin afectar a aquellos a traves del receptor de alta afinidad. Ademas, los presentes inventores describen proteinas de fusi6n que se comportan como potentes superagonistas del complejo IL-15RW/V. Tales proteinas de fusi6n comprenden una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, tal como IL-15 (o un fragmento conservador, un agonista, un mimetico del mismo), fusionada por covalencia, por ejemplo, a traves de un enlazador flexible, a IL-15Ra o a un fragmento de IL15Ralfa que conserva el dominio sushi de IL-15Ralfa.

Hasta donde llega el conocimiento de los inventores, s6lo hay una tecnica anterior que describe un efecto estimulante para un compuesto que comprende un elemento relacionado con IL-15Ralfa, a saber, la forma comercialmente disponible de IL-15Ralfa soluble. Es la publicaci6n de Giron-Michel y colaboradores, que se titula "Membrane-bound and soluble IL-151IL-15Ralfa complexes display differential signalling and functions on human haematopoietic progenitors" (Blood, 1 de octubre de 2005, vol. 106, nO 7, pags. 2302-2310, publicado previamente en linea en junio de 2005).

La publicaci6n de Giron-Michel y colaboradores describe que (vease la Figura 7 de Giron-Michel y col.)

-: la IL-15 recombinante (rIL-15) induce un efecto anti-apopt6tico significativo cuando se usa en una dosis de 10 ng/ml, y que

-rIL-15 no induce ningun efecto anti-apopt6tico significativo con una dosis de 0,1 ng/mL, pero que

-: con una dosis de 0,1 ng/ml de rIL-15 se induce un efecto anti-apopt6tico significativo cuando se usa junto con la forma disponible en el mercado de IL-15Ralfa soluble.

El IL-15Ralfa soluble que es utilizada por Giron-Michel y col. es la forma comercialmente disponible de IL-15Ralfa (disponible en R&D Systems, con la referencia 147-IR). Este IL-15Ralfa soluble es una forma modificada de IL15Ralfa soluble, que carece del ex6n 3. La forma de IL-15Ralfa soluble que es utilizada por Giron-Michel y col., comprende, por lo tanto, la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa, ligada directamente a la parte codificada por el ex6n 4 de IL-15Ralfa, sin comprender ninguna parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa. La forma de IL15Ralfa soluble que es utilizada por Giron-Michel y col., no se corresponde por tanto, a un fragmento de IL-15Ralfa, pero a una forma modificada del mismo.

La forma de IL-15Ralfa soluble que es utilizada por Giron-Michel y col. comprende, ademas, un fragmento Fc (IgG humana), ligado a ella, por covalencia. Un fragmento Fc no se une a IL-15Rbeta/gamma. La publicaci6n de Giron-Michel y col. no describe, por lo tanto, ningun compuesto en el que la forma de IL-15Ralfa soluble este ligada por covalencia a una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma. La publicaci6n de Giron-Michel y col. describe ademas un efecto anti-apopt6tico, pero no describe ningun efecto sobre la proliferaci6n y/o la activaci6n de celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma. Asimismo, cabe senalar que el ensayo para el efecto anti-apopt6tico descrito, no comprende ninguna muestra testigo que contenga (i) el fragmento IL-15Ralfa-Fc soluble en ausencia de rIL-15 o (ii) un IL-15Ralfa soluble sin ningun fragmento Fc. El efecto anti-apopt6tico descrito, no se puede atribuir por ello directamente a la parte de IL-15Ralfa del compuesto que se utiliza.

La publicaci6n de Giron-Michel y col. no contiene ademas ninguna sugerencia sobre el dominio sushi de IL-15Ralfa (ni sobre la regi6n bisagra que esta ausente de la forma de IL-15Ralfa soluble que se utiliza en esta tecnica anterior), ni tampoco contiene una sugerencia sobre la ruta de senalizaci6n de IL -15beta/gamma.

La presente invenci6n describe por primera vez las unidades estructurales que son necesarias y especialmente ventajosas, para la inducci6n y/o la estimulaci6n de una acci6n biol6gica de IL-15, la activaci6n especifica de las rutas de senalizaci6n de IL-15beta/gamma y la inducci6n y/o la estimulaci6n de la proliferaci6n de las celulas NK y/o de los linfocitos T. La presente invenci6n representa por tanto, una contribuci6n tecnica sobre la tecnica anterior, que permite unas aplicaciones biol6gicas y medicas, previamente inalcanzables.

Por lo tanto, se cree que, cuando se analiza sobre una base a priori, la publicaci6n de Giron-Michel y col. no describe la invenci6n reivindicada a la persona con conocimientos en la materia, y no dirige al experto a la invenci6n reivindicada.

Sumario de la inveneian

La presente invenci6n se refiere a la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma, y a la inducci6n y/o la estimulaci6n de la activaci6n y/o proliferaci6n de las celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma, y/o a la prevenci6n de la apoptosis, tales como celulas NK y/o linfocitos T.

La presente invenci6n muestra que la regi6n extracelular de IL-15Ralfa puede actuar como un agonista de la acci6n biol6gica de IL-15, a traves de la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma. Se muestra particularmente que puede estimular y/o inducir la proliferaci6n y/o la activaci6n de celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma y/o la prevenci6n

de la apoptosis, tales como celulas NK y/o linfocitos T.

La presente invenci6n muestra que la unidad estructural minima contenida en esta regi6n extracelular de IL-15Ralfa, que se requiere para ejercer tal acci6n agonista, es el dominio sushi de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa.

La presente invenci6n muestra ademas que la regi6n bisagra y la regi6n de la cola de esta regi6n extracelular de IL15Ralfa, aumentan significativamente la eficacia de esta acci6n agonista.

La presente invenci6n proporciona adicionalmente, compuestos que muestran un aumento de 30 a 150 veces de la actividad biol6gica, en comparaci6n con IL-15 de tipo silvestre, y que son incluso mas potentes que la simple asociaci6n de IL-15 y el dominio sushi de IL-15Ralfa soluble.

La presente invenci6n se refiere a los objetos descritos en la secci6n de la descripci6n detallada, y mas particularmente a los que se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Breve deseripeian de los dibujos

Fig.1. Afinidades de la unian de diversas proteinas IL-15Ra solubles haeia IL-15. Sensorgramas de SPR de la uni6n (fases de asociaci6n y disociaci6n) de concentraciones crecientes de rIL-15 (3,1, 6,2, 12,5, 25, 50 y 100 nM) para (A) sIL-15Ra-IL-2, (8) sIL-15Ra-sushi-IL-2 o (C) IL-15Ra-sushi inmovilizados. (0): Estudios de la competencia de sIL-15Ra-sushi (�), sIL-15Ra-IL-2(�) o sIL-15Ra-sushi-IL-2(�), con rIL-15 radioyodada (200 pM) que se une a celulas TF-1. Sensorgramas de SPR de la uni6n (fases de asociaci6n y disociaci6n) de concentraciones crecientes de rIL-15 (1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100 nM) para (E) sIL-15Ra-Sushi + inmovilizada.

Fig. 2. Efeetos sobre la proliferaeian indueida eon IL-15 a traves de IL-15Rl/y. La proliferaci6n de celulas Mo-7 se evalu6 mediante la incorporaci6n de [3H]-timidina. Las celulas se cultivaron con concentraciones crecientes de rIL-15 humana (A) o rIL-2 humana (8), en ausencia (�) o en presencia (�) de una concentraci6n fija (10 nM) de sIL15Ra-sushi. (C): Las celulas se cultivaron en presencia de rIL-15 1 nM, sin (�) o con concentraciones crecientes de sIL-15Ra-sushi (�). (0): Las celulas se cultivaron con concentraciones crecientes de rIL-15 (�), mezcla equimolar de IL-15 y sIL-15Ra-sushi (�), la proteina de fusi6n RLI (�) o ILR (�). (E): estructuras artificiales moleculares utilizadas para expresar las proteinas de fusi6n RLI e ILR. IL-15Ra sp: peptido senal de IL-15Ra humano, ppl sp: peptido senal de preprolactina bovina. (F): estructuras modelo tridimensionales de las proteinas de fusi6n.

Fig. 3. Efeetos sobre la preveneian de la apoptosis indueida eon IL-15 a traves de IL-15Rl/y. La apoptosis se evalu6 mediante la expresi6n de anexina V en la superficie celular, usando citometria de flujo. El histograma completo (Aa) representa la tinci6n de la anexina V sobre celulas Mo-7 al inicio del experimento. Las celulas se cultivaron durante 4S horas, sin (Ab) o con una concentraci6n fija de rIL-15 humana (500 pM) (Ac), en ausencia (histograma completo) o en presencia de sIL-15Ra-sushi (10 nM) (linea continua). (8): Cineticas de la expresi6n de la anexina V sobre celulas Mo-7, en ausencia de citocina ex6gena (�) o en presencia de rIL-15 (500 pM) (�), sIL15Ra-sushi (10 nM) (�), sIL-15Ra-sushi (10 nM) mas rIL-15 (500 pM) (�), o RLI (500 pM) (�). (C): las celulas Mo-7 se cultivaron con concentraciones crecientes de rIL-15, en ausencia (�) o en presencia (�) de una concentraci6n fija (10 nM) de sIL-15Ra-sushi, o con concentraciones crecientes de RLI (�).

Fig. 4. Efeeto agonista de sIL-15Ra-sushi sobre la unian de IL-15 a IL-15Rl/y. Unian e internalizaeian de RLI. (A): Uni6n de rIL-15 marcada con 125I a celulas Mo7 en ausencia (�) o en presencia de sIL-15Ra-sushi (10 nM) (�). (8): Uni6n de la proteina de fusi6n RLI marcada con 125I. En las inserciones se muestran diagramas de Scatchard. (C): Internalizaci6n de la proteina de fusi6n RLI marcada con 125I (500 pM).

Fig. 5. Efeetos sobre la proliferaeian y la apoptosis indueidas eon IL-15 a traves de reeeptores IL-15Ra/l/y. La incorporaci6n de[3H]-timidina mediante Kit 225 (A) y celulas TF-1W (B) cultivadas con concentraciones crecientes de rIL-15 (�), mezcla equimolar de rIL-15 y sIL-15Ra-sushi (�), la proteina de fusi6n RLI (�) o ILR (�). (C): tinci6n de la anexina V de TF-1W al inicio del experimento (Ca), 4S h despues del cultivo sin (Cb) o con una concentraci6n fija de rIL-15 humana (500 pM) (Cc), en ausencia (histograma completo) o en presencia de proteina sIL-15Ra-sushi (10 nM) (linea continua), o en presencia de RLI 10 pM (Cd). (0): Cineticas de la tinci6n en ausencia de citocina ex6gena (�) o en presencia de rIL-15 (10 pM) (�), sIL-15Ra-sushi (10 nM) (�), sIL-15Ra-sushi (10 nM) mas rIL-15 (10 pM) (�), o la proteina de fusi6n RLI (10 pM) (�). (E): Tinci6n 4S h despues del cultivo con concentraciones crecientes de rIL-15, en ausencia (�) o presencia (�) de una concentraci6n fija (10 nM) de sIL-15Ra-sushi, o con concentraciones crecientes de la proteina de fusi6n RLI (�).

Fig. 6. Unian e internalizaeian de sIL-15Ra-sushi y RLI en eelulas TF-1l. Efeetos de sIL-15Ra-sushi sobre la unian de IL-15. (A): Curva de saturaci6n de la uni6n de rIL-15 marcada con 125I en ausencia (�) o en presencia de sIL-15Ra-sushi (10 nM) (�). (8): Efecto de concentraciones crecientes de sIL-15Ra-sushi sobre la uni6n de una concentraci6n fija de rIL-15 radioyodada (200 pM). (C): Curva de saturaci6n de la uni6n de sIL-15Ra-sushi marcado con 125I, en presencia de rIL-15 1 nM y (0) la internalizaci6n posterior. (E): Curva de saturaci6n de la uni6n de RLI marcado con 125I y (F) la internalizaci6n posterior.

Fig. 7: Modelos propuestos para los efeetos difereneiales de sIL-15Ra y sIL-15Ra-sushi. (A) En el contexto de

los receptores IL-15Ra/W/V, sIL-15Ra compite con IL-15Ra de la membrana por la uni6n de IL-15. (8) En el contexto de los receptores IL-15RW/V, sIL-15Ra-sushi forma un complejo con IL-15 que activa el complejo IL-15RW/V de manera mas eficaz que IL-15 sola. Las proteinas de fusi6n RLI o ILR amplifican este efecto agonista. (C) En el contexto de los receptores IL-15Ra/W/V, sIL-15Ra-sushi no es eficaz para competir con IL-15Ra de la membrana, o compite con IL-15Ra de la membrana y el complejo sIL-15Ra-sushi, con IL-15, activa en exceso el complejo IL-15RW/V como en (8).

Figs. 8 a 42 muestran las seeueneias de aminoaeidos y de aeidos nueleieos, cuyas SEQ ID se enumeran en la lista de la Tabla 4 (la tabla 4 se encuentra despues de las referencias bibliograficas, antes de las reivindicaciones).

Fig. S: ADNc de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1).

Fig. 9: CDS de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2), y la proteina de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 3).

Fig. 10: CDS y secuencias de aminoacidos del peptido senal de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 4 y NO: 5), y del peptido maduro (SEQ ID NO: 6, y NO: 7).

Fig. 11: secuencias de acido nucleico de los exones 1 a 5 de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: S-12).

Fig. 12: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos del dominio sushi de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 13-14), y de un fragmento de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre que comprende el dominio sushi (SEQ ID NO: 15 y NO: 16).

Fig. 13: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de un fragmento de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre que comprende el dominio sushi (SEQ ID NO: 17 y NO: 1S).

Fig. 14: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de la regi6n bisagra de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 19 y NO: 20), y de fragmentos de esta regi6n bisagra.

Fig. 15: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de los fragmentos de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre que comprenden el dominio sushi y un fragmento de la regi6n bisagra (SEQ ID NO: 21-24).

Fig. 16: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de fragmentos de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre que comprenden el dominio sushi y un fragmento de la regi6n bisagra (SEQ ID NO: 25-2S).

Fig. 17: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de un fragmento de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre que comprende el dominio sushi y la regi6n bisagra (SEQ ID NO: 29-30).

Fig. 1S: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de la regi6n rica en sitios de glicosilaci6n de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 31-32).

Fig. 19: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de la parte codificada por el ex6n 3 de la regi6n rica en sitios de glicosilaci6n de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 33-34), y de un fragmento de IL-15Ralfa que comprende el dominio sushi, la regi6n bisagra y la parte codificada por el ex6n 3 de la regi6n rica en sitios de glicosilaci6n (SEQ ID NO: 35-36).

Fig. 20: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de un fragmento de la regi6n extracelular soluble de IL15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 37-3S).

Fig. 21: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de una regi6n extracelular soluble de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 39-40).

Fig. 22: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de un fragmento del dominio extracelular soluble, con el peptido senal eliminado, de IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 41-42).

Fig. 23: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de un dominio extracelular soluble con el peptido senal eliminado, de IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 43-44).

Fig. 24: secuencia de acido nucleico de IL-15 humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 45).

Fig. 25: secuencia de aminoacidos de la proteina precursora de IL-15 humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 46), secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de IL-15 madura humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 47-4S).

Fig. 26: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de dos enlazadores flexibles (enlazador 20 SEQ ID NO: 4950; enlazador 26 SEQ ID NO: 51-52).

Fig. 27: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos del marcador Flag y del sitio de uni6n de Xa (SEQ ID NO: 53-56), del peptido senal de preprolactina bovina (SEQ ID NO: 57-5S), y la secuencia de acido nucleico de IL-15R y

las secuencias de Kozak de la preprolactina.

Fig. 2S: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de RLI (proteina de fusi6n de la invenci6n; SEQ ID NO: 5960). Proteina de fusi6n de RLI = peptido senal de IL-15Ralfa + marcador Flag y sitio de uni6n de Xa + it + sushi + i + rd + once aa codificados por el ex6n 3 + enlazador 20 + IL-15 madura humana de tipo silvestre.

Fig. 29: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de ILR (proteina de fusi6n de la invenci6n; SEQ ID NO: 6162). Proteina de fusi6n ILR = peptido senal de preprolactina bovina + marcador Flag y sitio de uni6n de Xa + IL-15 madura humana de tipo silvestre + enlazador 26 + it + sushi + i + rd + once aminoacidos codificados por el ex6n 3.

Fig. 30: secuencia de acido nucleico de IL-2 humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 63).

Fig. 31: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de IL-2 madura humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 6465), y de un enlazador utilizado para marcar un fragmento que contiene sushi de IL-15Ralfa con IL-2.

Fig. 32: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de un fragmento que contiene sushi de IL-15Ralfa, marcado con IL-2 (SEQ ID NO: 66-67).

Fig. 33: secuencias de acido nucleico y de aminoacidos de un fragmento que contiene sushi de IL-15Ralfa (fragmento de IL-15Ralfa extracelular), marcado con IL-2 (SEQ ID NO: 6S-69).

Fig. 34: secuencias de aminoacidos de IL-15Ralfa de Mus musculus (SEQ ID NO: 72-73).

Fig. 35: secuencias de aminoacidos de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa de Mus musculus (SEQ ID NO: 74), del dominio sushi (SEQ ID NO: 75), de la regi6n bisagra (SEQ ID NO: 76) y de la regi6n de la cola (SEQ ID NO: 77).

Fig. 36: secuencias de aminoacidos de IL-15Ralfa de Pan troglodytes (SEQ ID NO: 7S-79).

Fig. 37: secuencias de aminoacidos de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa de Pan troglodytes (SEQ ID NO: S0), del dominio sushi (SEQ ID NO: S1), de la regi6n bisagra (SEQ ID NO: S2) y de la regi6n de la cola (SEQ ID NO: S3).

Fig. 3S: secuencias de aminoacidos de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: S4-S5).

Fig. 39: secuencias de aminoacidos de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: S6), del dominio sushi (SEQ ID NO: S7), de la regi6n bisagra (SEQ ID NO: SS) y de la regi6n de la cola (SEQ ID NO: S9).

Fig. 40: secuencia de acido nucleico del ex6n 3 de IL-15Ralfa de Mus musculus (SEQ ID NO: 90), de IL-15Ralfa de Pan troglodytes (SEQ ID NO: 91) y de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 92).

Fig. 41: secuencia de aminoacidos de la parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 93), de IL-15Ralfa de Mus musculus (SEQ ID NO: 94), de IL-15Ralfa de Pan troglodytes (SEQ ID NO: 95) y de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 96).

Fig. 42: secuencia de aminoacidos de la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: 24), de IL-15Ralfa de Mus musculus (SEQ ID NO: 97), de IL-15Ralfa de Pan troglodytes (SEQ ID NO: 9S) y de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 99).

Deseripeian detallada de la inveneian

La presente invenci6n se refiere a IL-15Ralfa y a fragmentos de IL-15Ralfa que comprenden al menos un dominio sushi de IL-15Ralfa.

La presente invenci6n se refiere a productos, que pueden ser destinados a la estimulaci6n de la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma, para inducir con ello y/o estimular la activaci6n y/o la proliferaci6n y/o la prevenci6n de la apoptosis de celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma, tales como NK y/o linfocitos T.

La presente invenci6n se refiere a polipeptidos aislados que contienen sushi, los cuales contienen el dominio sushi que esta comprendido en la regi6n extracelular de un IL-15Ralfa, es decir, se refiere al fragmento aislado que consiste en la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, y en subfragmentos de la misma que han conservado el dominio sushi.

Los polipeptidos que contienen sushi de la invenci6n pueden estar unidos por covalencia, o no estar unidos por covalencia, a al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma.

La invenci6n mas particularmente se refiere a un compuesto ligado covalentemente que comprende al menos un tal polipeptido que contiene sushi, ligado directa o indirectamente por covalencia a al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma. Dicho compuesto puede tener una actividad biol6gica incrementada de 30 a 150 veces, en comparaci6n con IL-15 de tipo silvestre, y ser mas potente que la asociaci6n libre de IL-15 y el dominio sushi de IL15Ralfa soluble.

Entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma

Ademas del mencionado, al menos un polipeptidos que contienen sushi, dicho compuesto ligado covalentemente relacionados de la invenci6n, comprende al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma.

Dicha entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma es preferiblemente una IL-15, o un fragmento, un mimetico o un agonista de IL-15, en donde dicho fragmento, mimetico o agonista de IL-15 tiene una afinidad para unirse a IL15Rbeta/gamma que no es significativamente inferior a la de una IL-15 natural.

Dicha IL-15 puede ser cualquier IL-15, por ejemplo, una IL-15 humana o una IL-15 de mamifero no humano, o una IL-15 que no sea de mamifero. Ejemplos ilustrativos de IL-15 de mamifero no humano son la IL-15 de mono, o una IL-15 de murido (por ejemplo, IL-15 de rat6n, con el numero de orden NM 00S357; IL-15 de rata, con el numero de orden NM 013129), o una IL-15 de conejo (por ejemplo, el numero de orden DQ157152), una IL-15 de oveja (por ejemplo, el numero de orden NM 001009734), o una IL-15 de cerdo (por ejemplo, el numero de orden NM 211390). IL-15 ilustrativas que no son de mamifero, es la IL-15 de pollo (por ejemplo, el numero de orden NM 204571).

Mas preferiblemente, dicha IL-15 es una IL-15 humana. Lo mas preferible, la secuencia de aminoacidos de dicha IL15 humana, es la secuencia de SEQ ID NO: 4S.

IL-15 no se une a IL-2Ralfa. En vista de las aplicaciones biol6gicas y medicas contempladas en la presente invenci6n, dicho fragmento, mimetico o agonista de IL-15, preferiblemente no se une a IL-2Ralfa.

Los terminos "agonista" y "mimetico" tienen en esta memoria su significado ordinario en el campo. Un compuesto se denomina agonista de IL-15 cuando induce una respuesta biol6gica que tiene un nivel similar o superior a la inducida por IL-15 natural. Los agonistas preferidos son aquellos que inducen un mayor nivel de respuesta biol6gica (superagonista). Un agonista de IL-15 por lo general tiene una afinidad por unirse a IL-15Ralfa y/o a IL15Rbeta/gamma que al menos no es significativamente diferente de la de IL-15 natural y que es con preferencia significativamente superior a la de IL-15 natural.

Un mimetico (o mimetopo) de IL-15 se refiere a cualquier compuesto que es capaz de imitar las acciones biol6gicas de IL-15.

En la presente invenci6n, los mimeticos o los agonistas preferidos de IL-15, son aquellos que son capaces de imitar la acci6n biol6gica de la IL-15, a lo largo de la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma. Tal mimetico de IL-15 preferido tiene, por lo tanto, la capacidad de unirse al complejo IL-15beta/gamma, e inducir y/o estimular de esta manera la transducci6n de una senal biol6gica a traves de dicho complejo IL-15Rbeta/gamma. Los mimeticos o agonistas preferidos de IL-15 de la invenci6n tienen una afinidad para unirse a IL-15Rbeta/gamma que al menos no es significativamente diferente de la de una IL-15 natural, y que es de forma preferible significativamente mas elevada que la de una IL-15 natural. Agonistas o mimeticos apropiados se han descrito, por ejemplo, en el documento PCT de solicitud internacional PCT/EP2005/002367, presentada el 10 de febrero de 2005, a nombre de INSERM.

Polipeptido que contiene sushi:

La secuencia de aminoacidos de dicho al menos un polipeptido que contiene sushi:

•: es la secuencia de aminoacidos de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa (dicha regi6n extracelular de IL15Ralfa que comprende un dominio sushi de IL-15Ralfa), o

•: es la secuencia de aminoacidos de un fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, en donde dicho fragmento ha conservado el dominio sushi de dicha regi6n extracelular de IL-15Ralfa, en donde dicho dominio sushi se define como el que comienza en el primer residuo de cisteina (C1) codificado por el ex6n 2, y termina en el cuarto residuo de cisteina (C4) codificado por el ex6n 2, estando los residuos C1 y C4 ambos incluidos en el dominio sushi, o

•: es una secuencia de aminoacidos variante que ha conservado cada uno de los cuatro residuos de cisteina (C1, C2, C3 y C4) de dicho dominio sushi.

Una definici6n alternativa de la definici6n, es que se inicia en el primer residuo de cisteina (C1) despues del peptido senal y termina en el cuarto residuo de cisteina (C4), despues del peptido senal.

Dicha secuencia de aminoacidos variante puede comprender una secuencia variante conservadora del dominio sushi de IL-15Ralfa. Una secuencia variante conservadora tal del dominio sushi de IL-15Ralfa, se obtiene a partir de la secuencia de un dominio sushi original, mediante al menos una deleci6n y/o al menos una sustituci6n y/o al menos una adici6n de aminoacidos, pero que ha conservado la capacidad de al menos una de las siguientes caracteristicas:

i. incrementar la afinidad de IL-15 hacia IL-15Rbeta/gamma,

ii. inducir y/o estimular un efecto anti-apopt6tico sobre celulas positivas para beta/gamma, y en particular de celulas positivas para beta/gamma y negativas para alfa, tales como celulas NK y/o linfocitos T indiferenciados,

iii. mejorar la eficacia de la acci6n biol6gica de IL-15 a traves de la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma, es decir, la inducci6n y/o la estimulaci6n de la proliferaci6n y/o activaci6n de celulas positivas para beta/gamma, y mas particularmente de celulas positivas para beta/gamma y negativas para alfa, tales como NK y/o linfocitos T indiferenciados o en reposo.

Preferiblemente, dichas variantes conservadoras han conservado la caracteristica descrita en iii., mas arriba. Lineas celulares adecuadas para analizar las caracteristicas mencionadas anteriormente, son celulas positivas para IL15Rbeta/gamma-positive y negativas para IL-15Ralfa. Ilustrativa de tales lineas celulares es la linea celular 32D, que se puede transfectar con una cadena beta y una gamma (por ejemplo, una cadena beta humana y una cadena gamma humana). Por otra parte, las celulas NK y/o los linfocitos T indiferenciados o en reposo, se pueden purificar a partir de una muestra biol6gica, tal como una muestra de sangre.

Preferiblemente, dicha secuencia variante de aminoacidos tiene una identidad de al menos S5% con la secuencia de aminoacidos de tal regi6n extracelular de IL-15Ralfa, o de un fragmento tal de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, en toda la longitud de esta secuencia de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa o de un fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa. Mas preferiblemente, este porcentaje de identidad de secuencia es de por lo menos 90%, aun mas preferentemente de al menos 92%, mas preferentemente de al menos el 95%, por ejemplo, al menos 96%, al menos 97%, al menos 9S%, al menos 99% o 100%.

Tales secuencias variantes de aminoacidos, en especial abarcan los polimorfismos de IL-15Ralfa que se presentan de forma natural dentro de una especie animal, asi como las variantes conservadoras que pueden ser producidas por el experto en la materia.

IL-15Ralfa:

El ex6n 1 de IL-15Ralfa codifica el peptido senal de IL-15Ralfa.

El ex6n 2 de IL-15Ralfa codifica el dominio sushi de IL-15Ralfa.

La parte 5' terminal del ex6n 3 codifica la regi6n conocida como regi6n bisagra de IL-15Ralfa.

La parte restante del ex6n 3, asi como los otros exones extracelulares (es decir, el ex6n 4, el ex6n 5 y una parte 5' del ex6n 6 de IL-15Ralfa humano, asi como de la mayoria de las especies) codifica una regi6n rica en sitios de glicosilaci6n, tambien conocida como regi6n de la cola de IL-15Ralfa.

El resto de los exones de IL-15Ralfa (es decir, una parte 3' del ex6n 6, asi como el ex6n 7 de IL-15Ralfa humano, asi como de la mayoria de las especies) codifica las regiones transmembranal e intracitoplasmatica de IL-15Ralfa.

De manera ventajosa, en vista de las aplicaciones medicas de la presente invenci6n, dicho IL-15Ralfa es preferentemente un IL-15Ralfa humano. La secuencia de aminoacidos de dicho IL-15Ralfa humano es mas preferentemente la secuencia de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 (267 aminoacidos). La regi6n extracelular del IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 40 (1..209 de SEQ ID NO: 3). La forma con el peptido senal delecionado de SEQ ID NO: 40 se muestra como SEQ ID NO: 44 (31..209 de SEQ ID NO: 3). Algunos alelos humanos de IL-15Ralfa pueden tener un aminoacido Thr (aminoacido t, codificado por act, acc, aca o acg), en lugar de un aminoacido Asn (aminoacido n, codificado por aat o aac) en la posici6n 1S2 de SEQ ID NO: 3. Dichas variantes son de origen natural y son funcionales. En la presente solicitud, tales variantes alelicas de origen natural de IL-15Ralfa humano, se entienden como equivalente a las secuencias de referencia de IL15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 (secuencia de aminoacidos) y SEQ ID NO: 1 o NO: 2 (ADNc y secuencias CDS), y las secuencias de referencia de IL-15Ralfa humano que se obtienen directamente a partir de las mismas, es decir, las secuencias de la regi6n extracelular de SEQ ID NO: 40 o NO: 44 (secuencias de aminoacidos) y SEQ ID NO: 39 y NO: 43 (secuencias CDS). Las posiciones de los siete exones de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3, son como se describen en la siguiente tabla 1. En este sentido, se debe tener en cuenta que las posiciones del ex6n 1 son 1..170, y las del ex6n 2 son 171..365, tal y como se describe en la tabla 1 mas abajo, y no son 1..171 ni 172..365, respectivamente, segun lo declarado en la secuencia disponible bajo el numero de orden U3162S.

Tabla 1:

CDS de IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO:2)

Ex6n 1: 1..170

Ex6n 2: 171..365

Ex6n 3: 366..464

Ex6n 4: 465..665

Ex6n 5: 666..69S

Las posiciones de las diferentes regiones y partes del IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 se muestran en la tabla 2, mas abajo.

Tabla 2:

IL-15Ralfa humano

Posiciones de CDS en SEQ ID NO: 1: Posiciones de aminoacidos en SEQ ID NO: 3

Peptido senal: S3..172 1..30

Proteina IL-15Ralfa: 173..SS3 31..267

Partes de la proteina de IL-15Ralfa humano: Peptido senal S3..172 1..30

Parte codificada por el ex6n 2 que contiene el dominio sushi (it-sushi-i): 173..364 31..94

Dominio sushi (desde C1 hasta C4): 179..361 33..93

Regi6n bisagra (irdpalvhqrpapp): 362..403 94..107

Regi6n rica en sitios de glicosilaci6n: 404..709 10S..209

Parte transmembranal: 710..766 210..22S

Parte intracitoplasmica: 767..SS3 229..267

En la presente solicitud, el simbolo de doble punto (< .. ») situado entre un primer numero y un segundo numero, describe una secuencia aislada que es identica a la secuencia que se extiende desde la posici6n del "primer numero" a la posici6n del "segundo numero". En la presente solicitud, cuando las secuencias se definen por las posiciones de "inicio" y "detenci6n", estas posiciones de inicio y detenci6n se incluyen dentro de la secuencia descrita.

Para algunas aplicaciones biol6gicas, como por ejemplo, ensayos preliminares, investigaci6n, desarrollo, compuesto

o detecci6n de celulas, estudios preclinicos y clinicos (incluyendo las pruebas relativas a las calidades farmacol6gicas, toxicol6gicas, farmacocineticas o biol6gicas, asi como "la evaluaci6n de riesgo-beneficio" y los ensayos de seguridad relacionados), se puede utilizar sin embargo, el IL-15Ralfa de mamifero no humano. Los IL15Ralfa de mamifero no humano preferidos, comprenden IL-15Ralfa de mono (por ejemplo, un IL-15Ralfa de chimpance), o un IL-15Ralfa de murido (por ejemplo, IL-15Ralfa de rat6n, IL-15Ralfa de rata), o un IL-15Ralfa de conejo, o un IL-15Ralfa de cerdo.

Secuencias ilustrativas de aminoacidos de IL-15Ralfa de dichos IL-15Ralfa de mamiferos no humanos, son las codificadas por las secuencias de acidos nucleicos disponibles con el numero de orden NM 00S35S (IL-15Ralfa de Mus musculus: secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 72, secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 73), el numero de orden XM 5216S4 (IL-15Ralfa de Pan troglodytes: secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 7S, secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 79), o con el numero de orden XM 57759S (IL-15Ralfa de Rattus norvegicus: secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: S4, secuencia de aminoacidos deSEQ ID NO: S5). Veanse las figuras 40, 41, 42 para ilustrar las posiciones y las secuencias del ex6n 2 y del ex6n 3 de IL-15Ralfa humano.

Regi6n extracelular de IL-15Ralfa:

La regi6n extracelular de IL-15Ralfa se define generalmente como la regi6n de una secuencia de IL-15Ralfa que se extiende desde su primer aminoacido N-terminal hasta el ultimo aminoacido de la regi6n de la cola (o regi6n rica en sitios de glicosilaci6n). Tal y como se describe mas detalladamente a continuaci6n, la regi6n de la cola de una secuencia de IL-15Ralfa puede ser determinada por el experto, por ejemplo, con la ayuda de programas informaticos.

Dicha regi6n extracelular de IL-15Ralfa es una regi6n extracelular de IL-15Ralfa humano o una regi6n extracelular de IL-15Ralfa de mamifero no humano.

Entre las secuencias de aminoacidos de las regiones extracelulares de IL-15Ralfa humano, se prefiere la secuencia de aminoacidos de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa de SEQ ID NO: 40. La secuencia de aminoacidos de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 40, esta codificada por los exones 1-5, y una pequena parte 5' del ex6n 6 de IL-15Ralfa humano. El ex6n 1 de IL-15Ralfa humano (SEQ ID NO: S) codifica el peptido senal de IL-15Ralfa (secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 4; secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5). El ex6n 2 (SEQ ID NO: 9) comprende la secuencia codificante del dominio sushi de IL-15Ralfa humano. El ultimo cod6n 3' del ex6n 2 codifica el primer aminoacido de la regi6n bisagra. Una parte 5' del ex6n 3 (ex6n 3 de SEQ ID NO: 10)

codifica la regi6n bisagra de IL-15Ralfa humano. La parte 3' restante del ex6n 3, mas el ex6n 4 (SEQ ID NO: 11), el ex6n 5 (SEQ ID NO: 12) y una parte 5' del ex6n 6 (699..709 de SEQ ID NO: 1) codifican una regi6n rica en sitios de glicosilaci6n (tambien conocida como regi6n de la cola). La secuencia de SEQ ID NO: 44 es la forma con el peptido senal delecionado de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa de SEQ ID NO: 40. En la presente invenci6n se pueden utilizar los peptidos senal, pero son opcionales. Un peptido senal tal puede ser un peptido senal de IL-15Ralfa, o el peptido senal de otra proteina. Por lo tanto, la forma con el peptido senal delecionado de una regi6n extracelular de IL-15Ralfa (tal como SEQ ID NO: 44) es directamente equivalente a la secuencia extracelular completa de IL15Ralfa (como SEQ ID NO: 40).

Son ilustrativas de las regiones extracelulares de IL-15Ralfa de mamifero no humano, las que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 74 (1..204 de IL-15Ralfa de Mus musculus), de SEQ ID NO: S0 (1..2S6 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes), de SEQ ID NO: S6 (1..1S2 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus).

Domino sushi:

La regi6n extracelular de IL-15Ralfa o un fragmento de la misma que define dicho al menos un polipeptido que contiene sushi, contiene un dominio sushi de IL-15Ralfa.

La regi6n extracelular de IL-15Ralfa contiene un dominio, que se conoce como el dominio sushi (Wei y col. 2001, J. Immunol. 167:277-2S2). El dominio sushi de IL-15Ralfa tiene una conformaci6n de lamina beta. Esta codificado por el ex6n 2 de IL-15Ralfa. Se inicia en el primer residuo de cisteina codificada por el ex6n 2 (C1), y termina en el cuarto residuo de cisteina codificado por el ex6n 2 (C4). Al considerar la secuencia de la proteina IL-15Ralfa, con la orientaci6n convencional de N-terminal a C-terminal, el dominio sushi de IL-15Ralfa se puede definir como el que comienza en el primer residuo de cisteina (C1) despues del peptido senal, y termina en el cuarto residuo de cisteina (C4) despues del peptido senal. Los residuos C1 y C4 estan incluidos en la secuencia de sushi.

Por lo tanto, cuando la identificaci6n del dominio sushi se realiza en una secuencia de IL-15Ralfa que tiene delecionada su secuencia del peptido senal (como por ejemplo, la secuencia de SEQ ID NO: 44), el dominio sushi se define entonces como el que comienza en el primer residuo de cisteina (empezando por el extremo N-terminal de la proteina), y termina en el cuarto residuo de cisteina de esta secuencia de IL-15Ralfa. El dominio sushi de IL-15Ralfa tambien se puede determinar mediante el analisis de la secuencia de aminoacidos de IL-15Ralfa con un programa adecuado, tal como:

Prosite (http://us.expasy.org/prosite/),

InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/),

SMART (http://elm.eu.org/).

La secuencia de aminoacidos de dicho dominio sushi puede ser la secuencia de aminoacidos de un dominio sushi de IL-15Ralfa humano, o de un dominio sushi de mamifero no humano.

Entre las secuencias de aminoacidos de los dominios sushi de IL-15Ralfa humano, la secuencia de aminoacidos del dominio sushi de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 14 es la preferida. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa humano puede ser la secuencia de SEQ ID NO: 16 (it + sushi de IL-15Ralfa humano) o NO: 1S (t + sushi de IL-15Ralfa humano).

Son ilustrativas de dominios sushi de IL-15Ralfa de mamifero no humano, las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 75 (36..96 de IL-15Ralfa de Mus musculus), de SEQ ID NO: S1 (13..73 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes) o de SEQ ID NO: S7 (24..S4 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus).

Peptido senal:

Un peptido senal es una cadena peptidica corta (15-60 aminoacidos de longitud) que dirige el transporte posttraduccional de una proteina. Algunos peptidos senal se escinden de la proteina mediante la peptidasa senal, despues de que las proteinas se han transportado. Los peptidos senal tambien se pueden denominar senales que dirigen hacia la diana o secuencias de senales. Las secuencias de aminoacidos de los peptidos senal dirigen proteinas que se sintetizan en el citosol, hacia ciertos organulos, tales como el nucleo, la matriz mitocondrial, el reticulo endoplasmatico, el cloroplasto y el peroxisoma.

El peptido senal de IL-15Ralfa es una secuencia N-terminal de aproximadamente 29 a 33 aminoacidos, por ejemplo, 30-32 aminoacidos. Se inicia en el primer residuo de aminoacido N-terminal de IL-15Ralfa. Se determina mediante el analisis de la secuencia de aminoacidos N-terminal de IL-15Ralfa, con un programa adecuado, tal como:

SIGCLEAVE (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/sigcleave.html),

InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/),

SMART (http://elm.eu.org/).

El peptido senal de IL-15Ralfa de Mus musculus es una secuencia de aminoacidos N-terminal de 32 aminoacidos (ver el numero de orden NP 0323S4; sig peptide 1..32). El peptido senal de IL-15Ralfa humano, tal y como se muestra en SEQ ID NO: 5, es una secuencia de aminoacidos N-terminal de 30 aminoacidos, que contiene un residuo de cisteina.

Fragmento de la parte codificada por el ex6n 2:

El ex6n 2 de IL-15Ralfa contiene el dominio sushi, es decir, la unidad estructural minima que es requerida por la presente invenci6n.

Dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa puede comprender (o puede consistir esencialmente en):

-: la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, que esta codificada por el ex6n 2 de dicho IL-15Ralfa, o

-: un fragmento de dicha parte codificada por el ex6n 2.

De acuerdo con la presente invenci6n, dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa tiene que comprender al menos un dominio de IL-15Ralfa. Por lo tanto, un fragmento de una parte codificada por el ex6n 2 puede ser cualquier fragmento de la misma, a condici6n de que todavia comprenda el dominio sushi (desde el residuo C1 hasta el residuo C4).

Por ejemplo, la parte codificada por el ex6n 2 de la regi6n extracelular humana de SEQ ID NO: 40, es la secuencia que se extiende desde la posici6n 31 hasta la posici6n 94 (es decir, SEQ ID NO: 24), es decir, es:

it + sushi + i.

Los fragmentos de esta parte codificada por el ex6n 2 son: t + sushi; it + sushi, t + sushi + i.

Por ejemplo, dicha secuencia codificada por el ex6n 2 puede ser:

-: la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa extracelular humano, que es la secuencia de SEQ ID NO: 24,

-: la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa extracelular de Pan troglodytes, que es la secuencia de SEQ ID NO: 9S,

-: la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa extracelular de Mus musculus, que es la secuencia de SEQ ID NO: 97,

-: la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa extracelular de Rattus norvegicus, que es la secuencia de SEQ ID NO: 99.

Las variantes de tales fragmentos de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa se incluyen en el alcance de la presente invenci6n. Tales variantes incluyen en particular las que tienen una deleci6n y/o sustituci6n y/o adici6n conservadora de aminoacido en su secuencia.

Una secuencia variante conservadora de un fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa se obtiene a partir de la secuencia de un fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa original, con al menos una deleci6n y/o al menos una sustituci6n y/o al menos una adici6n de un aminoacido, y conserva la capacidad de al menos una de las siguientes caracteristicas:

i. incrementar la afinidad de IL-15 hacia IL-15Rbeta/gamma,

ii. inducir y/o estimular un efecto anti-apopt6tico sobre celulas positivas para beta/gamma, y mas concretamente de celulas positivas para beta/gamma y negativas para alfa, tales como celulas NK y/o linfocitos T indiferenciados,

iii. potenciar la eficacia de la acci6n biol6gica de IL-15 a traves de la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma, es decir, inducir y/o estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de celulas positivas para beta/gamma, y en particular de celulas positivas para beta/gamma y negativas para alfa, tales como NK y/o linfocitos T indiferenciados o en reposo.

Preferiblemente, dichas variantes conservadoras han conservado la caracteristica descrita en iii., mas arriba. Las variantes conservadoras comprenden en particular las que tienen una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos el S5% con la secuencia original, a lo largo de toda la longitud de esta secuencia original. Preferentemente, dicho porcentaje de identidad es de al menos 90%, aun mas preferentemente de al menos 92%, lo mas preferible de al menos 95%, p. ej., al menos 96%, al menos 97, al menos 9S%, al menos 99 % o 100%.

Por ejemplo, partiendo de la parte codificada por el ex6n 2 mencionada anteriormente, de SEQ ID NO: 40, sera evidente para el experto que i + sushi, i + sushi + t, i + sushi + i, it + sushi + t son variantes conservadoras, que son

tecnicamente equivalentes al fragmento original.

Fragmento de la parte codificada por el ex6n 2-3:

De acuerdo con una realizaci6n muy ventajosa de la presente invenci6n, dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa puede comprender ademas al menos un aminoacido de la secuencia que esta codificada por el ex6n 3 de dicho IL-15Ralfa.

Dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa puede comprender o consistir, por lo tanto, en:

-: la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, que esta codificada por los exones 2 y 3 de dicho IL15Ralfa, o

-: un fragmento de dicha parte codificada por el ex6n 2-3, que ha conservado dicho dominio sushi.

El ex6n 3 de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 (es decir, de la regi6n extracelular humana de SEQ ID NO: 40) es la secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 10. La parte codificada por el ex6n 3 de SEQ ID NO: 3 es la secuencia de SEQ ID NO: 93, es decir, la parte de la secuencia 95..127 de SEQ ID NO: 3 o de SEQ ID NO: 40 (es decir, la secuencia de aminoacidos que se extiende desde la posici6n 95 a la posici6n 127 de la secuencia de IL15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 o NO: 40, posiciones 95 y 127, estando ambas incluidas).

Por ejemplo, dicha secuencia codificada por el ex6n 3 puede ser:

-: la parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa extracelular humano, que es la secuencia de SEQ ID NO: 93,

-: la parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa extracelular de Pan troglodytes, que es la secuencia de SEQ ID NO: 95,

-: la parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa extracelular de Mus musculus, que es la secuencia de SEQ ID NO: 94,

-: la parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa extracelular de Rattus norvegicus, que es la secuencia de SEQ ID NO: 96.

Un fragmento de una parte codificada por el ex6n 3 puede ser un fragmento de un solo aminoacido, preferentemente de al menos dos aminoacidos, mas preferiblemente de al menos tres aminoacidos, aun mas preferentemente de al menos cuatro aminoacidos, lo mas preferible de al menos cinco aminoacidos.

Los inventores muestran que una parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa, o un fragmento de la misma, incrementa de forma ventajosa la afinidad y la eficacia del compuesto resultante, en terminos de transducci6n de la senal de IL-15Rbeta/gamma, y de proliferaci6n y activaci6n de celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma.

Cuando el polipeptido que contiene sushi esta destinado a la producci6n de una proteina de fusi6n, el experto puede preferir limitar el numero de aminoacidos del ex6n 3 hasta el numero 6ptimo, es decir, el numero de aminoacidos que representa un equilibrio justo entre el aumento de la afinidad y la eficacia, por una parte, y el aumento del tamano molecular y las dificultades de la conformaci6n, por otra parte. Por lo tanto, el experto puede encontrar ventajoso limitar el numero de aminoacidos codificados por el ex6n 3 que se agregan a dicho dominio sushi de IL15Ralfa, a un numero de 30, preferentemente de 25, mas preferiblemente de 20, aun mas preferiblemente de 1S, lo mas preferible de 17, por ejemplo, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, S, 7, 6. El numero mas preferido de aminoacidos codificados por el ex6n 3, por lo tanto, es el de los intervalos que resultan de la combinaci6n de cada uno de los limites inferiores mencionados anteriormente, para cada uno de los limites superiores mencionados anteriormente. Son ilustrativos de los fragmentos preferidos de la parte codificada por el ex6n 3, todos los fragmentos que se obtienen a partir de la parte codificada por el ex6n 3 del IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 (o de SEQ ID NO: 40), es decir, la parte que se extiende desde la posici6n 95 a la posici6n 127, estando incluidas ambas posiciones 95 y 127 (en otras palabras: la secuencia 95..127 de SEQ ID NO: 3 o NO: 40). Un compuesto preferido de la invenci6n comprende, por tanto, al menos un polipeptido que contiene sushi que, ademas de dicho dominio sushi, comprende al menos un aminoacido de la secuencia que se extiende desde la posici6n 95 a la posici6n 127 de SEQ ID NO: 3 (estando las posiciones 95 y 127 ambas incluidas). Lo mas preferible comprende:

-: un numero preferido de tales aminoacidos (es decir, "por lo menos dos aminoacidos, mas preferiblemente al menos tres aminoacidos, aun mas preferentemente al menos cuatro aminoacidos, lo mas preferible al menos cinco aminoacidos"), o

-: un numero mas preferido de tales aminoacidos (es decir, cualquier combinaci6n resultante de "al menos dos aminoacidos, mas preferiblemente al menos tres aminoacidos, aun mas preferentemente al menos cuatro aminoacidos, lo mas preferible al menos cinco aminoacidos", y "como maximo 30, de preferencia como maximo 25, mas preferiblemente como maximo 20, aun mas preferiblemente como maximo 1S, lo mas preferible como maximo 17, por ejemplo, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, S, 7, 6 ").

Por lo tanto, dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa comprende ventajosamente la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, que esta codificada por el ex6n 2 de dicho IL-15Ralfa, o una variante conservadora de la misma, tal y como se ha definido anteriormente, y comprende, ademas, al menos un aminoacido de la secuencia codificada por el ex6n 3 de dicho IL-15Ralfa.

Mas concretamente, dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa puede comprender (o puede consistir esencialmente en):

-: la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, que esta codificada por los exones 2 y 3 de dicho IL15Ralfa, o una variante conservadora de la misma, o

-: la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, que esta codificada por el ex6n 2 de dicho IL-15Ralfa, y un fragmento de la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, que esta codificada por el ex6n 3 de dicho IL-15Ralfa.

Aun mas particularmente, dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa puede comprender (o puede consistir esencialmente en):

-: un fragmento de tal parte codificada por el ex6n 2-3 o de tal variante codificada por el ex6n 2-3, con la condici6n implicita de que un fragmento tal, conserva el dominio sushi.

La definici6n mencionada anteriormente de variantes conservadoras se aplica, cambiando lo que haya que cambiar, a una variante conservadora de una parte codificada por el ex6n 2-3, es decir, es una secuencia que se obtiene a partir de una secuencia original de la secuencia codificada por el ex6n 2-3, mediante al menos una deleci6n y/o al menos una sustituci6n y/o al menos una adici6n de aminoacidos, y que conserva la capacidad al menos de una de las siguientes caracteristicas:

i. aumentar la afinidad de IL-15 hacia IL-15Rbeta/gamma,

ii. inducir y/o estimular un efecto anti-apopt6tico sobre celulas positivas para beta/gamma y, en particular, celulas positivas para beta/gamma y negativas para alfa, tales como NK y/o linfocitos T indiferenciados,

iii. potenciar la eficacia de la acci6n biol6gica de IL-15 a traves de la ruta de senalizaci6n de IL15Rbeta/gamma, es decir, inducir y/o estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de celulas positivas para beta/gamma, y en particular de celulas positivas para beta/gamma y negativas para alfa, tales como NK y/o linfocitos T indiferenciados o en reposo.

Preferiblemente, dichas variantes conservadoras han conservado la caracteristica descrita en iii., mas arriba. Las variantes conservadoras comprenden en particular las que tienen una secuencia de aminoacidos que tiene una identidad de al menos S5% con la secuencia original, a lo largo de toda la longitud de esta secuencia original. Preferentemente, dicho porcentaje de identidad es de al menos 90%, aun mas preferentemente de al menos 92%, lo mas preferible de al menos 95%, por ejemplo, al menos 96%, al menos 97%, al menos 9S%, al menos 99% o 100%.

Regi6n bisagra (localizada despues del dominio sushi, codificada por una parte 3' del ex6n 2 y una parte 5' del ex6n 3, o por una parte 5' del ex6n 3):

Los inventores muestran que la regi6n bisagra de IL-15Ralfa esta involucrada mas particularmente en este aumento de la eficacia de la transducci6n de senales, y en este aumento de la proliferaci6n y la activaci6n de celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma.

Por lo tanto, de acuerdo con una realizaci6n muy ventajosa de la presente invenci6n, dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa puede comprender, ademas de dicho domino sushi de IL-15Ralfa, una regi6n bisagra de IL-15Ralfa o un fragmento de la regi6n bisagra de IL -15Ralfa.

Una regi6n bisagra de IL-15Ralfa se define como la secuencia de aminoacidos que se inicia en el primer residuo de aminoacido despues del dominio sushi (cuando se considera la secuencia de IL-15Ralfa con la orientaci6n convencional de N-terminal a C-terminal), y que termina en el ultimo residuo de aminoacidos antes del primer sitio potencial de glicosilaci6n. Las posiciones de los sitios de glicosilaci6n potenciales se determinan usando el programa NetOGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-3.1/) para la identificaci6n de posibles sitios de O-glicosilaci6n, y el programa NetNGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) para la identificaci6n de posibles sitios de Nglicosilaci6n.

En un IL-15Ralfa humano, la secuencia de aminoacidos de la regi6n bisagra consiste en los catorce aminoacidos que se encuentran localizados despues del dominio sushi de este IL-15Ralfa, en una posici6n C-terminal en relaci6n con dicho dominio sushi, es decir, dicha regi6n bisagra de IL-15Ralfa se inicia en el primer aminoacido despues de dicho residuo de cisteina (C4), y termina en el aminoacido decimocuarto (contando con la orientaci6n convencional

"desde N-terminal a C-terminal").

En el IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3 (en la que la regi6n extracelular de la misma es la secuencia de SEQ ID NO: 40), la secuencia de aminoacidos de dicha regi6n bisagra de IL-15Ralfa humano, es la secuencia de SEQ ID NO: 20. Contiene un aminoacido codificado por el ex6n 2 (aminoacido i), y trece aminoacidos codificados por el ex6n

3.

En el IL-15Ralfa de Mus musculus de SEQ ID NO: 73, la regi6n bisagra tiene la secuencia de SEQ ID NO: 76. En el IL-15Ralfa de Pan troglodytes de SEQ ID NO: 79, la regi6n bisagra tiene la secuencia de SEQ ID NO: S2. En el IL15Ralfa de Rattus norvegicus de SEQ ID NO: S5, la regi6n bisagra tiene la secuencia de SEQ ID NO: SS.

Dicho al menos un polipeptido que contiene sushi, puede comprender por lo tanto, el dominio sushi de SEQ ID NO: 75 y la regi6n bisagra de SEQ ID NO: 76 (Mus musculus), el dominio sushi de SEQ ID NO: S1 y la regi6n bisagra de SEQ ID NO: S2 (Pan troglodytes), o el dominio sushi de SEQ ID NO: S7 y la regi6n bisagra de SEQ ID NO: SS (Rattus norvegicus).

Ventajosamente, dicho al menos un polipeptido que contiene sushi comprende preferentemente el dominio sushi humano de SEQ ID NO: 14, y la regi6n bisagra humana de SEQ ID NO: 20 (por ejemplo, SEQ ID NO: 16 o NO: 1S, seguida por la regi6n bisagra de SEQ ID NO: 20). Preferiblemente, dicho al menos un polipeptido que contiene sushi comprende, o es, un polipeptido de SEQ ID NO: 30 (it + sushi + bisagra), opcionalmente con deleci6n de su i y/o t Nterminal.

Dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, puede comprender alternativamente, ademas del dominio sushi, un fragmento de la regi6n bisagra. Por fragmento de una regi6n bisagra, se entiende en esta memoria, cualquier fragmento de la misma, hasta solo un aminoacido de dicha regi6n bisagra. Preferiblemente, un fragmento de la regi6n bisagra comprende al menos dos aminoacidos, mas preferiblemente al menos tres aminoacidos. Un fragmento de la regi6n bisagra de IL-15Ralfa, por lo tanto, puede ser un fragmento de 1 (por ejemplo, el aminoacido i), 2 (por ejemplo, los aminoacidos ir), 3 (por ejemplo, los aminoacidos ird), 4 (por ejemplo, los aminoacidos irdp), 5 (por ejemplo, los aminoacidos irdpa), 6 (por ejemplo, los aminoacidos irdpal), 7 (por ejemplo, los aminoacidos irdpalv), S (por ejemplo, los aminoacidos irdpalvh), 9, 10, 11, 12, 13 o 14 aminoacidos. Ventajosamente, dicho al menos un polipeptido que contiene sushi comprende preferentemente el dominio sushi humano de SEQ ID NO: 14, y un fragmento de la regi6n bisagra de SEQ ID NO: 20. La secuencia de aminoacidos de dicho fragmento de la regi6n bisagra de IL-15Ralfa comprende, o es, i o ir o ird. El polipeptido que contiene sushi de SEQ ID NO: 22, 24 y 26 comprende el dominio sushi de SEQ ID NO: 14, y el fragmento "i" de la regi6n bisagra de SEQ ID NO: 20.

El polipeptido que contiene sushi de SEQ ID NO: 2S comprende el dominio sushi de SEQ ID NO: 14, y el fragmento "ird" de la regi6n bisagra de SEQ ID NO: 20.

Dicha secuencia de aminoacidos de un fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa humano, puede comprender mas particularmente, ademas de dichas secuencias de aminoacidos del dominio sushi y de la regi6n bisagra:

-: la secuencia de aminoacidos de una regi6n extracelular de IL-15Ralfa que se conoce como la regi6n rica en sitios de glicosilaci6n, o como la regi6n de la cola, o

-: un fragmento de la misma.

Regi6n rica en sitios de glicosilaci6n, tambien conocida como regi6n de la cola (codificada por una parte 3' del ex6n 3, por los otros exones extracelulares):

La regi6n rica en sitios de glicosilaci6n de IL-15Ralfa es una regi6n que comprende varios sitios potenciales de glicosilaci6n. A veces se denomina como la regi6n de la "cola" de IL-15Ralfa. Se inicia en el primer residuo de aminoacido despues de la regi6n bisagra (cuando se considera la secuencia con la orientaci6n convencional de "Nterminal a C-terminal "), y termina en el ultimo residuo de aminoacido antes de la regi6n transmembranal de IL15Ralfa. Se compone de varios sitios potenciales de glicosilaci6n. El dominio transmembranal esta determinado por el analisis de la secuencia de aminoacidos de IL-15Ralfa con un programa adecuado, tal como: TopPred http://biowed.pasteur.fr/seganal/interfaces/topred.html),TMpred http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html).

La regi6n de la cola de IL-15Ralfa humano comprende varios sitios de O-glicosilaci6n, y un sitio de N-glicosilaci6n. La regi6n de la cola de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 32 esta codificada por una parte 3' del ex6n 3, y por el ex6n 4, el ex6n 5 y una parte 5' del ex6n 6 de dicho IL-15Ralfa humano.

Son ilustrativos de la cola de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa de mamifero no humano, las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 77 (Mus musculus), de SEQ ID NO: S3 (Pan troglodytes) o de SEQ ID NO: S9 (Rattus norvegicus).

Por fragmento, o subfragmento, de una regi6n rica en sitios de glicosilaci6n (o fragmento o subfragmento de la regi6n de la cola), se entiende en esta memoria cualquier fragmento o subfragmento de dicha regi6n, hasta solo un aminoacido de dicha regi6n. Preferiblemente, dicho fragmento o subfragmento comprende al menos dos aminoacidos, mas preferiblemente al menos tres aminoacidos.

Dicha secuencia de aminoacidos de un fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, puede comprender por lo tanto:

-: la parte de la regi6n rica en sitios de glicosilaci6n de IL-15Ralfa codificada por el ex6n 3, o

-: un fragmento de dicha parte codificada por el ex6n 3.

Una secuencia de aminoacidos preferida para la parte codificada por el ex6n 3, de la regi6n rica en sitios de glicosilaci6n de IL-15Ralfa humano, es la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 34. Un polipeptido que contiene sushi de la invenci6n, es de forma ventajosa el polipeptido de SEQ ID NO: 36 (con deleci6n opcional de los primeros aminoacidos C-terminales i y/o t). Tal y como se ha indicado anteriormente, se puede utilizar cualquier fragmento de una parte codificada por el ex6n 3, que el experto considere adecuada, por ejemplo, cualquier fragmento de al menos un aminoacido, preferentemente de al menos dos aminoacidos, mas preferiblemente de al menos tres aminoacidos.

Exones extracelulares, distintos de los exones 1, 2, 3:

Los exones extracelulares de IL-15Ralfa, que son distintos de 1, 2, 3, codifican un fragmento C-terminal de la regi6n de la cola. Dichas partes, o fragmentos de las mismas, pueden potenciar aun mas la eficacia de los compuestos de la invenci6n.

Dicha secuencia de aminoacidos de un fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa puede comprender por lo tanto, ademas una parte extracelular de IL-15Ralfa que esta codificada por el ex6n 4, y/o el ex6n 5 y/o el ex6n 6, o cualquier fragmento de dicha parte.

Las posiciones de los exones de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 3, se muestran en esta memoria en la tabla 1 anterior. Son ilustrativas de las secuencias de aminoacidos de tales polipeptidos que contienen sushi, las secuencias de SEQ ID NO: 3S, o el peptido senal delecionado SEQ: 42, o el peptido senal delecionado SEQ: 44.

Son ilustrativos de los polipeptidos que contienen sushi, aquellos que contienen el dominio sushi, la regi6n bisagra y la cola completa de IL-15Ralfa (por ejemplo, la cola de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 32, la cola de IL-15Ralfa de Pan troglodytes de SEQ ID NO: S3; la cola de IL-15Ralfa de Mus musculus de SEQ ID NO: 77; la cola de IL15Ralfa de Rattus norvegicus de SEQ ID NO: S9), y, opcionalmente, un peptido senal.

Acci6n biol6gica de IL-15:

A nivel de organismo o a nivel celular, un producto de la invenci6n se caracteriza porque induce y/o estimula la acci6n biol6gica de IL-15. Estimula las acciones biol6gicas que se ejercen, o que se pueden inducir, o se estimulan con IL-15, mimeticos de IL-15, y/o agonistas de IL-15. Los productos de la invenci6n (es decir, los polipeptidos que contienen sushi descritos en esta memoria, en forma aislada, y mas particularmente los compuestos de la invenci6n), se pueden considerar por ello, como un agonista de la acci6n biol6gica de IL-15.

Un rasgo caracteristico especial y ventajoso de un producto de la invenci6n, es que es capaz de inducir y/o estimular la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma, y en particular de estimular la acci6n biol6gica de IL15 a traves de la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma.

A nivel molecular, un producto de la invenci6n se caracteriza, por tanto de forma mas particular, porque aumenta la eficacia de la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma. Sensibiliza las celulas que expresan el complejo IL15Rbeta/gamma para la acci6n de IL-15. Aun mas particularmente, sensibiliza las celulas que expresan el complejo IL-15Rbeta/gamma, pero que no expresan IL-15Ralfa (celulas IL-15RW/V+ IL-15Ra-), para la acci6n de IL-15.

Algunos de los productos de la invenci6n son especificos de IL-15Rbeta/gamma, en el sentido de que no potencian la eficacia de la ruta de senalizaci6n de IL-15Ralfa/beta/gamma. Es especial el caso de la proteina de fusi6n de la invenci6n ILR (secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 62, y secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 61). Algunos otros productos de la invenci6n son capaces de mejorar la eficacia de las rutas de senalizaci6n de IL15Rbeta/gamma y de IL-15Ralfa/beta/gamma. Es especial el caso de la proteina de fusi6n RLI de la invenci6n (secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 60; y secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO: 59).

La invenci6n tambien muestra que el dominio sushi de IL-15Ra es crucial para transpresentaci6n. De este modo se accede a aplicaciones medicas particularmente utiles y necesarias en el campo del tratamiento y/o paliaci6n y/o prevenci6n del cancer, mediante la administraci6n de una vacuna, como por ejemplo la administraci6n de una composici6n que comprende al menos un compuesto que contiene al menos un dominio sushi de IL-15Ralfa.

IL-15 es una citocina que estimula la proliferaci6n y/o la supervivencia de los linfocitos (tales como los linfocitos T, los linfocitos T CDS+, las celulas NK, las celulas dendriticas) y/o su actividad contra celulas tumorales. IL-15 participa en la intercomunicaci6n entre las celulas accesorias y las celulas linfoides. Es esencial en los tejidos perifericos para el desarrollo de las celulas NK, las celulas NKT, y los linfocitos T CDS+ de memoria. Es el factor fisiol6gico mas potente capaz de inducir la diferenciaci6n de las celulas hematopoyeticas CD34+.

Dicha acci6n biol6gica de IL-15 es una acci6n biol6gica ejercida, inducible o estimulada por IL-15, y/o mimeticos de IL-15 y/o agonistas de IL-15. El experto puede elegir cualquier respuesta biol6gica de IL-15 que considere adecuada

o conveniente para determinar o vigilar. Preferiblemente, dicha acci6n biol6gica de IL-15 es una acci6n biol6gica ejercida, inducible o estimulada por IL-15 y/o mimeticos de IL-15 y/o agonistas de IL-15, sobre celulas IL15Rbeta/gamma+IL-15Ralfa-.

Una respuesta biol6gica tipica de IL-15 es la proliferaci6n y/o la activaci6n de celulas sensibles a IL-15.

Ejemplos de celulas sensibles a IL-15 son los linfocitos T, los linfocitos T CDS+, las celulas NK, las celulas dendriticas, cuya proliferaci6n se induce y/o se estimula despues de la adici6n de IL-15 y/o de mimeticos de IL-15 y/o de agonistas de IL-15, y/o cuya activaci6n se induce y/o se estimula despues de la adici6n de IL-15 y/o de mimeticos de IL-15 y/o agonistas de IL-15 (por ejemplo, la inducci6n de una actividad antitumoral). Estas celulas se pueden recoger, por ejemplo, a partir de un organismo de mamifero.

Otros ejemplos de celulas sensibles a IL-15 comprenden lineas de celulas conocidas, tales como la linea celular de linfocitos T citot6xicos de linfoma de rat6n CTL-L2 (numero de orden ATCC TIB-214), o celulas TF1-beta. Las celulas TF1-beta se consiguen mediante la transfecci6n de celulas TF-1 con cadenas beta. Las celulas TF-1 estan disponibles en la "American Type Culture Collection ATCC", c6digo postal 1549, Manassas, VA 2010S, EE.UU., cf. http://www.lgcpromochem.com/atcc/, con el numero de orden de la ATCC, CRL-2003. Retrovirus recombinantes IL2R beta se pueden utilizar entonces para infectar celulas TF-1 para generar TF-1W, despues de la selecci6n en un medio que contiene G41S.

Preferiblemente, dichas celulas sensibles a IL-15 son celulas IL-15Rbeta/gamma+ IL-15Ralfa-. Ejemplos de celulas IL-15Rbeta/gamma+ IL-15Ralfa-incluyen la linea celular humana Mo-7, o celulas NK y/o linfocitos T en reposo. Las celulas NK y/o los linfocitos T en reposo estan disponibles para los expertos. Se pueden obtener, por ejemplo, mediante la purificaci6n de una muestra celular, tal como una muestra de sangre. Las celulas NK y/o linfocitos T en reposo se pueden aislar a partir de la sangre de donantes adultos sanos, de la siguiente manera: la sangre se centrifuga a alta velocidad para obtener una capa leucocitaria. Esta capa leucocitaria se centrifuga en un gradiente de densidad (Histopaque, Sigma) para obtener linfocitos de la sangre periferica. Las celulas NK en reposo se aislan entonces a partir de los linfocitos de la sangre periferica mediante un equipo de reactivos para el aislamiento negativo de las celulas NK (Dynal, Biotech ASA, Oslo, Noruega). Por otra parte, los linfocitos T en reposo se aislan de la sangre periferica, usando un equipo de reactivos para el aislamiento negativo de linfocitos T (Dynal, Biotech ASA, Oslo, Noruega).

Otros ejemplos de celulas IL-15Rbeta/gamma+IL-15Ralfa-incluyen celulas IL-15Ralfa-, que se transforman o se transfectan con IL-15Rbeta/gamma, preferiblemente con un IL-15Rbeta/gamma humano. Por ejemplo, la linea celular de murido 32D (ATCC CRL-11346) puede ser transfectada con cadenas beta y gamma, de preferencia con cadenas beta y gamma humanas.

Las cadenas beta (es decir, cadenas IL-15Rbeta, tambien conocidas como cadenas IL-2Rbeta) son conocidas y estan disponibles para el experto en la tecnica. Entre las cadenas beta, se prefieren las cadenas beta humanas. Los moldes para la cadena beta se pueden conseguir a partir del ARN de HuT102 (ATCC TIB-162) mediante RT-PCR utilizando la polimerasa Pfu correctora de la lectura (Stratagene nO 600390) y 5' GAGAGACTGGATGGACCC 3' como cebador directo (SEQ ID NO: 70), y 5' AAGAAACTAACTCTTAAAGAGGC 3' como cebador inverso (SEQ ID NO: 71), de acuerdo con la secuencia de IL-2R beta humana (NCBI, numero de orden K03122). El producto de la PCR se clona de forma eficaz, utilizando el equipo de reactivos para la clonaci6n Zero Blunt PCR (InVitrogen, nO de cat. K2700-20) o el equipo de reactivos para clonaci6n TOPO XL PCR k (InVitrogen, nO de cat. K4750-10). El ADNc para el gen de IL-2R beta, se subclona a continuaci6n en el sitio de clonaci6n multiple del vector de expresi6n del retrovirus pLXRN, del sistema de expresi6n retrovirica Pantropic (BD Biosciences Clontech nO 631512) y se transfecta en celulas GP2-293, tal y como se describe en el equipo de reactivos para generar retrovirus recombinantes.

Las cadenas gamma (es decir, cadenas IL-15Rgamma, tambien conocidas como cadenas IL-2Rgamma) son conocidos y estan disponibles para el experto en la tecnica. Entre las cadenas gamma, se prefieren las cadenas gamma humanas. Los moldes para las cadenas gamma se pueden obtener a partir del ARN de TF1 (ATCC CRL 2003) o de HuT 102 (ATCC TIB 162) mediante RT-PCR, utilizando la polimerasa Pfu correctora de la lectura y 5' GAAGAGCAAG CGCCATGTTG 3' (SEQ ID NO: 100) como cebador directo y 5' TCAGGTTTCAGGCTTTAGGG 3' como cebador inverso (SEQ ID NO: 101), de acuerdo con la secuencia del receptor gamma de la interleucina-2 humana (numero de orden de NCBI D 110S6). El producto de la PCR se clona de forma eficaz utilizando el equipo de reactivos para la clonaci6n de Zero Blunt PCR o el equipo de reactivos para la clonaci6n de TOPO XL PCR. El

ADNc del gen de IL-2RV se subclona entonces en pcDNA 3.1/H�GRO (InVitrogen) para generar un plasmido pcDNA IL-2RV/H�GRO.

Los retrovirus recombinantes IL-2R beta se pueden utilizar para infectar celulas 32D para generar 32DW, despues de la selecci6n en un medio que contiene G41S. El plasmido pcDNA IL-2RV/H�GRO se puede transfectar a continuaci6n en las celulas 32DW mediante electroporaci6n, para generar 32DWV despues de la selecci6n en un medio que contiene higromicina.

El experto en la materia, puede optar alternativamente por evaluar o vigilar una respuesta biol6gica de IL-15 que esta mas abajo en la ruta de senalizaci6n, tal como la activaci6n de quinasa de tirosina (por ejemplo, Jak-1/Jak-3; Lck; Syk), la activaci6n de una quinasa de MAP, o un evento de translocaci6n nuclear (por ejemplo, la translocaci6n de Stat-3 y/o Stat-5 fosforilada). Dicha respuesta biol6gica de IL15 puede ser entonces una respuesta acelular.

Elementos adicionales (peptido senal, marcador molecular, sitio proteolitico, etc.):

Un compuesto de la invenci6n puede comprender un peptido senal. Este peptido senal puede estar ligado directa o indirectamente a dicho al menos un polipeptido que contiene sushi o a dicha al menos una entidad que se une a IL15Rbeta/gamma. Dicho peptido senal puede estar ligado a dicho compuesto por covalencia. Los peptidos senal facilitan la secreci6n de proteinas desde las celulas. Este peptido senal puede ser, por ejemplo, el peptido senal de un IL-15Ralfa, tal como IL-15Ralfa humano (tal como el peptido senal de IL-15Ralfa humano que tiene la secuencia SEQ ID NO: 5), ligado directa o indirectamente a dicho fragmento, o el peptido senal de otra proteina (tal como el peptido senal de la preprolactina bovina de SEQ ID NO: 5S), ligado directa o indirectamente a dicho fragmento. Peptidos senal a modo de ejemplo son:

-: el peptido codificado por la secuencia lider de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 4), es decir, los primeros 30 aminoacidos N-terminales de IL-15Ralfa humano de tipo silvestre (SEQ ID NO: 5), o

-: el peptido codificado por la secuencia lider de la preprolactina bovina (SEQ ID NO: 57), es decir, los primeros 31 aminoacidos N-terminales de la preprolactina bovina (SEQ ID NO: 5S).

Otros peptidos senal que son apropiados para el experto tambien se pueden emplear. Ademas, ciertos nucle6tidos en la secuencia lider de IL-15 se pueden modificar sin alterar la secuencia de aminoacidos. Ademas, se pueden realizar cambios de aminoacidos que no afectan a la capacidad de la secuencia para actuar como un peptido senal.

Un polipeptido que contiene sushi de la invenci6n puede estar ligado directamente con el peptido senal de IL15Ralfa a partir del cual se ha obtenido. Tal polipeptido que contiene sushi puede estar, sin embargo:

-: ligado indirectamente con dicho peptido senal "natural", o

-: ligado directa o indirectamente con un peptido senal que no procede del IL-15Ralfa a partir del cual se ha obtenido dicho polipeptido que contiene sushi.

Un compuesto de la invenci6n puede comprender adicionalmente, al menos un marcador molecular y/o al menos un sitio proteolitico. Por ejemplo, un marcador molecular y/o un sitio proteolitico pueden estar localizados entre el peptido senal y el dominio sushi, o entre el peptido senal y la entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma. Dicho marcador molecular y/o sitio proteolitico puede estar ligado directa o indirectamente a dicho al menos un polipeptido que contiene sushi o a dicha entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma. Ejemplos de marcadores moleculares, comprenden en particular los marcadores FLAG�. Ejemplos de sitios proteoliticos comprenden en particular los sitios de uni6n a Xa. El octapeptido (Hopp y col., Bio/Technology 6:1204, 19SS) FLAG� (marca registrada) no altera la actividad biol6gica de las proteinas de fusi6n, es altamente antigenico, y proporciona una uni6n reversible al epitopo, mediante un anticuerpo monoclonal especifico, lo que permite una detecci6n rapida y una purificaci6n sencilla de la proteina de fusi6n expresada. La secuencia de FLAG� tambien se escinde especificamente por la enteroquinasa de mucosa bovina en el residuo inmediatamente despues del apareamiento AspLys. Las proteinas de fusi6n con una caperuza a base de este peptido, tambien pueden ser resistentes a la degradaci6n intracelular en E. coli. Un anticuerpo monoclonal de murido que se une a la secuencia de FLAG� ha sido depositado en la ATCC con el numero de orden HB 9259. Los metodos de uso del anticuerpo en la purificaci6n de proteinas de fusi6n que comprenden la secuencia de FLAG�, se describen en el documento de patente de EE.UU. nO 5.011.912. Ejemplos de secuencias que codifican un epitopo de Flag y un sitio de uni6n al factor Xa, comprenden las de SEQ ID NO: 53 y NO: 55 (secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 54 y NO: 56, respectivamente).

Aminoacidos:

En el contexto de la presente invenci6n, "residuo de aminoacido" significa cualquier residuo de aminoacido conocido por los expertos en la materia (vease, por ejemplo: Sewald y col., 2002 (42), nomenclatura de la IUPAC en http://www.chem.qmul.ac.uk/IUPAC/AminoAcid/). Esto incluye aminoacidos presentes en la naturaleza (que incluyen, por ejemplo, utilizando el c6digo de tres letras, Ala, bAla, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val), asi como aminoacidos poco frecuentes y/o sinteticos y sus derivados (que incluyen

por ejemplo, Aad, Abu, Acp, Ahe, Aib, Apm, Dbu, Des, Dpm, Hyl, MeLys, MeVal, Nva, HAO, NCap, Abu, Aib, MeXaa y similares (vease, por ejemplo: (M�ller y col., 1993; Aurora y col., 199S; Obrecht y col., 1999; Maison y col., 2001; Formaggio y col., 2003; Nowick y col., 2003; (43-4S). Dicho residuo de aminoacido o derivado del mismo puede ser cualquiera de sus is6meros, especialmente cualquier is6mero quiral, por ejemplo, la L-oD-isoforma. Por derivadode aminoacido, entendemos en la presente memoria: cualquier derivado de aminoacidos, tal y como se conocen en la tecnica (vease por ejemplo: Sewald y col., 2002 (42), nomenclatura de la IUPAC en http://www.chem.qmul.ac .uk/iupac/AminoAcid/). Por ejemplo, los derivados de aminoacidos incluyen residuos que se pueden obtener a partir de los aminoacidos presentes en la naturaleza, que son portadores de cadenas laterales adicionales, por ejemplo, cadenas laterales de alquilo y/o sustituciones de heteroatomos. Otros ejemplos de derivados de aminoacidos comprenden aminoacidos que son portadores de modificaciones quimicas, tal como la que se encuentra en los peptidos mimeticos o peptidomimeticos, que son compuestos que contienen elementos estructurales no peptidicos que son capaces de imitar o antagonizar la(s) acci6n(es) biol6gica(s) de un peptido original natural. Un peptidomimetico generalmente ya no tiene las caracteristicas clasicas de peptidos, tales como los enlaces peptidicos escindibles enzimaticamente.

Preferiblemente, dicho aminoacido pertenece al grupo de los aminoacidos no esenciales. Los aminoacidos no esenciales preferidos son glicina, alanina, prolina, serina, cisteina, tirosina, asparagina, glutamina, acido aspartico, acido glutamico, arginina, histidina. Los aminoacidos adecuados se pueden seleccionar con precisi6n, mediante la selecci6n de los aminoacidos que se encuentran en cantidades menores en el paciente en el que se va administrar el farmaco. La dosificaci6n y la pauta de administraci6n se pueden determinar en funci6n del nivel que tenga el paciente de dicho aminoacido. La dosificaci6n y el regimen de administraci6n preferidos son aquellos que tienden a aumentar el nivel de aminoacidos del paciente, hasta el nivel normal convencional.

Uni6n de dicho al menos un polipeptido que contiene sushi a al menos una de dicha entidad que se une a IL15Rbeta/gamma:

Dicho al menos un polipeptido que contiene sushi de la invenci6n puede estar ligado directamente con al menos una de dicha entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma.

Por otra parte, en dicho al menos un polipeptido que contiene sushi de la invenci6n, y en dicha al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, las proteinas se pueden separar mediante una secuencia de aminoacidos "enlazadora", con una longitud suficiente para asegurar que las proteinas formen estructuras secundarias y terciarias adecuadas. Preferentemente, dicho enlazador es un enlazador peptidico que comprende al menos uno, pero menos de 30 aminoacidos, por ejemplo, un enlazador peptidico de 20-30 aminoacidos, preferiblemente de 10-30 aminoacidos, mas preferiblemente de 15 a 30 aminoacidos, siendo mas preferible de 19 a 27 aminoacidos, lo mas preferible de 20 a 26 aminoacidos. Los enlazadores preferidos son aquellos que permiten que el compuesto adopte una conformaci6n adecuada (es decir, una conformaci6n que permita una actividad transductora de una senal adecuada a traves de la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma). Ejemplos de enlazadores preferidos incluyen los enlazadores flexibles. Las secuencias enlazadoras mas adecuadas (1) adoptaran una conformaci6n extendida flexible, (2) no mostraran una propensi6n a desarrollar una estructura ordenada secundaria que podria interaccionar con los dominios funcionales de las proteinas de fusi6n, y (3) tendran caracter hidrof6bico o cargado minimo que podria favorecer la interacci6n con los dominios funcionales de las proteinas. Los aminoacidos de superficie tipicos incluiran Gly, Asn y Ser (es decir, G, N o S). Practicamente de cualquier permutaci6n entre secuencias de aminoacidos que contienen Gly, Asn y Ser, se espera que cumplan los criterios anteriores para una secuencia enlazadora. Otros aminoacidos casi neutros, tales como Thr, Ala, Leu, Gln (es decir, T, A, L, Q) tambien se pueden utilizar en la secuencia enlazadora. La longitud de la secuencia enlazadora puede variar sin afectar significativamente a la actividad biol6gica de la proteina de fusi6n. Secuencias enlazadoras a modo de ejemplo, se describen en los documentos de patente de EE.UU. nO 5.073.627 y 5.10S.910. Enlazadores flexibles ilustrativos que son especialmente mas adecuados para la presente invenci6n, incluyen los codificados por las secuencias de SEQ ID NO: 49 o NO: 51 (las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO: 50 -tambien conocido como enlazador 20 -y NO: 52 -tambien conocido como enlazador 26 -, respectivamente).

En un compuesto de la invenci6n, la secuencia de dicho al menos un polipeptido que contiene sushi puede estar en una posici6n N-terminal en relaci6n con la secuencia de dicha al menos una entidad que se une a IL15Rbeta/gamma. Por otra parte, la secuencia de dicho al menos un polipeptido que contiene sushi puede estar en una posici6n C-terminal en relaci6n con la secuencia de dicha al menos una entidad que se une a IL15Rbeta/gamma.

Un compuesto de la invenci6n puede ser una proteina de fusi6n. Las proteinas de fusi6n son polipeptidos que comprenden dos o mas regiones obtenidas a partir de proteinas o peptidos diferentes o heter6logos. Las proteinas de fusi6n se preparan utilizando tecnicas convencionales de corte con enzima y ligaci6n de fragmentos procedentes de las secuencias deseadas. Las tecnicas de PCR que utilizan oligonucle6tidos sinteticos, se pueden utilizar para preparar y/o amplificar los fragmentos deseados. La superposici6n de oligonucle6tidos sinteticos que representan las secuencias deseadas, tambien se puede utilizar para preparar estructuras artificiales de ADN que codifican proteinas de fusi6n. Las proteinas de fusi6n pueden comprender varias secuencias, incluyendo una secuencia lider (o peptido senal), una secuencia enlazadora, una secuencia de cremallera de leucina, u otras secuencias que

forman olig6meros, y secuencias que codifican fracciones muy antigenicas que proporcionan un medio para una purificaci6n sencilla o una detecci6n rapida de una proteina de fusi6n.

Es ilustrativa de los compuestos de la invenci6n, la proteina de fusi6n que comprende el polipeptido que contiene sushi de SEQ ID NO: 30 (it + sushi + bisagra), y la IL-15 humana de tipo silvestre de SEQ ID NO: 4S, ligadas opcionalmente entre si mediante un enlazador. Mas ilustrativa de los compuestos de la invenci6n, es la proteina de fusi6n que comprende:

-: el peptido senal de SEQ ID NO: 5,

-: el marcador Flag y la secuencia del sitio de uni6n a Xa de SEQ ID NO: 54,

-: el polipeptido que contiene sushi de SEQ ID NO: 30 (it + sushi + bisagra),

-: el enlazador de SEQ ID NO: 50, y

-: la IL-15 humana de tipo silvestre de SEQ ID NO: 4S,

es decir, la proteina de fusi6n RLI codificada por SEQ ID NO: 60.

Mas ilustrativa de los compuestos de la invenci6n, es la proteina de fusi6n que comprende:

-: el peptido senal de SEQ ID NO: 5S,

-: el marcador Flag y la secuencia del sitio de uni6n a Xa de SEQ ID NO: 56,

-: la IL-15 humana de tipo silvestre de SEQ ID NO: 4S,

-: el enlazador de SEQ ID NO: 52,

-: el polipeptido que contiene sushi de SEQ ID NO: 30 (it + sushi + bisagra), es decir, la proteina de fusi6n ILR de SEQ ID NO: 62.

Los compuestos de la invenci6n se pueden producir por cualquier medio que el tecnico lo estime oportuno, como por ejemplo, la sintesis quimica de polipeptidos o la biosintesis de polipeptidos.

La sintesis quimica de polipeptidos es ya algo habitual (vease, por ejemplo, Andersson y col., 2000, "Biopolymers" (Peptide Science) 55: 227-250), y muchas empresas estan especializadas en dicha sintesis. Preferiblemente, los compuestos de la presente invenci6n son sintetizadas mediante tecnicas de sintesis de peptidos en fase s6lida (SPPS) que utilizan protocolos convencionales de FMOC (vease, por ejemplo, Carpino y col., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92(19):574S-5749; Carpino y col., 1972, J. Org. Chem. 37(22):3404-3409).

Por otra parte, el experto puede optar por producir los compuestos biol6gicamente, mediante traducci6n in vitro o in vivo de un acido nucleico que codifica dicho compuesto.

Acidos nucleicos, vectores, celulas hospedadoras:

Por ello, la presente invenci6n se refiere tambien a acidos nucleicos (ADN o ARN) que codifican un producto que esta destinado a estimular la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma, para inducir y/o estimular de esta manera la activaci6n y/o la proliferaci6n de celulas positivas para IL -15Rbeta/gamma, tales como celulas NK y/o linfocitos T. Mas concretamente, los acidos nucleicos de la invenci6n codifican un polipeptido que contiene sushi aislado de la invenci6n, tal y como se define en esta memoria, o un compuesto ligado covalentemente de la invenci6n, tal y como se define en esta memoria (es decir, que comprende al menos un polipeptido que contiene sushi, ligado directa o indirectamente por covalencia, a al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma). Dicha codificaci6n esta de acuerdo con el c6digo genetico universal, teniendo debidamente en cuenta su degeneraci6n. Los acidos nucleicos de la invenci6n, puede estar contenidos opcionalmente dentro de un vector, tal como un vector de transfecci6n, o un vector de expresi6n. Los acidos nucleicos de la invenci6n pueden estar ligados funcionalmente a una secuencia adecuada reguladora de la transcripci6n o de la traducci6n, tal como los promotores o potenciadores de la transcripci6n, una secuencia operadora opcional para controlar la transcripci6n, una secuencia que codifica sitios de uni6n a ARNm ribosomal y secuencias apropiadas que controlan la iniciaci6n y la terminaci6n de la transcripci6n y la traducci6n. Ejemplos de tales vectores incluyen pEF1/myc-His (InVitrogen, V921-20), pcDNA3.1 (InVitrogen, VS0020). Los acidos nucleicos de la invenci6n tambien pueden estar ligados a una secuencia lider que permite una secreci6n extracelular mejorada del polipeptido traducido. Ejemplos de tales secuencias lider incluyen secuencias lider procedentes de la preprolactina de rata (SEQ ID NO: 57) o procedentes de un IL-15Ralfa, tal como el peptido senal CDS de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 4). La secuencia de estos acidos nucleicos tambien puede comprender un cod6n de detenci6n (TAG, TGA, TAA) en su extremo terminal 3'.

La presente invenci6n se refiere a cada acido nucleico que codifica uno de los compuestos descritos de la invenci6n.

La Tabla 4, que se encuentra antes de la secci6n de las reivindicaciones, indica las SEQ ID NO: respectivas de estos acidos nucleicos.

Por ejemplo:

-: un acido nucleico que codifica dicho IL-15Ralfa humano, puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 2;

-: un acido nucleico que codifica dicho IL-15Ralfa humano extracelular, puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 39;

-: un acido nucleico que codifica dicho dominio sushi humano, puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 13;

-: un acido nucleico que codifica dicha regi6n de la cola humana puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 31;

-: un acido nucleico que codifica dicha parte codificada por el ex6n 3 de dicha regi6n de la cola humana, puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 33;

-: un acido nucleico que codifica dicha IL-15 humana, puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 47;

-: un acido nucleico que codifica un compuesto enlazado covalentemente de la invenci6n, puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 59 (proteina de fusi6n RLI) o de SEQ ID NO: 61 (proteina de fusi6n ILR).

Un acido nucleico de la invenci6n puede comprender una secuencia Kozak en su extremo 5', por ejemplo, una secuencia Kozak procedente de IL-15R humano de tipo silvestre, tal como gcc gcc, o una secuencia Kozak procedente de la preprolactina bovina, tal como gcc acc. Un acido nucleico de la invenci6n puede comprender un cod6n de detenci6n (por ejemplo, tag, tga, o taa) en su extremo 3'.

La presente invenci6n se refiere tambien a cualquier vector, que comprende un acido nucleico de la invenci6n. Preferiblemente, dicho vector es un vector de baculovirus. Dicho vector puede ser, por ejemplo, una transfecci6n, o un vector de expresi6n.

La presente invenci6n se refiere tambien a cualquier celula hospedadora, transformada o transfectada por un acido nucleico y/o por un vector de la invenci6n. Tal y como se usa en esta memoria, "transfectado" o "transfecci6n" significa la introducci6n de uno o varios acidos nucleicos ex6genos en una celula eucariota. La transfecci6n incluye la introducci6n de acidos nucleicos desnudos, tales como plasmidos, mediante tecnicas de transfecci6n fisicas y quimicas convencionales, que incluyen la precipitaci6n con fosfato de calcio, la precipitaci6n con sulfato de dextrano, la electroporaci6n, la transferencia de acido nucleico mediada por liposomas, los metodos de balistica, tal como el bombardeo de particulas, etc. La transfecci6n tambien incluye la introducci6n de acidos nucleicos en celulas mediante metodos biol6gicos, que incluyen la transducci6n o la infecci6n virica (mediada por el receptor y no mediada por el receptor). Tal y como se usa en esta memoria, "transformado" o "transformaci6n" se refiere a la introducci6n de uno o varios acidos nucleicos ex6genos en una celula procariota. La transformaci6n incluye la introducci6n de acidos nucleicos desnudos, asi como de un vector de acido nucleico, tal como un fago.

Las celulas hospedadora adecuadas incluyen celulas procariotas, levaduras o celulas eucariotas superiores, bajo el control de promotores apropiados. Las procariotas incluyen organismos Gram positivos y Gram negativos, por ejemplo, Escherichia coli, 8acillus subtilis, Salmonella typhimurium, y varias otras especies dentro de los generos 8acilllus, Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus . Ejemplos de celulas hospedadora adecuadas tambien incluyen levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y celulas eucariotas superiores, tales como lineas celulares establecidas de origen mamifero o de insectos. Ejemplos de celulas eucariotas superiores adecuadas comprenden lineas de celulas de mamiferos, tales como por ejemplo, celulas de ovario de hamster chino (CHO), p. ej., la linea celular de ovario de hamster chino CHO/dhfr -(CHO duk-) (ATCC nO CRL-9096), o tales como lineas de celulas epiteliales, por ejemplo, la linea de celulas epiteliales de simio COS-7 (ATCC nO CRL 1651), o lineas celulares humanas, por ejemplo, la linea de celulas renales humanas 293 c1S (ATCC nO CRL-10S52) o la linea de celulas renales humanas FreeStyle 293-F (InVitrogen nO R790-07). Dicha celula hospedadora puede ser una celula eucariota, una celula de mamifero (humano o no humano, tal como una celula CHO), una celula de levadura o una celula procariota (tal como E. coli). Mas preferiblemente, dicha celula hospedadora es una celula de mamifero, de la presente invenci6n ya que estas celulas son mas eficaces (con independencia de cualquier problema de glicosilaci6n).

Aplicaciones medicas y biol6gicas:

Los productos de la invenci6n comprenden en particular, dichos polipeptidos que contienen sushi en forma aislada tal y como se define en esta memoria, y la forma ligada covalentemente de los mismos, que se denomina en esta memoria como el compuesto ligado covalentemente de la invenci6n (es decir, el compuesto que comprende al menos un polipeptido que contiene sushi, ligado directa o indirectamente mediante covalencia, a al menos una

entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma).

Los productos de la invenci6n comprenden tambien los acidos nucleicos que codifican tales polipeptidos y compuestos, el vector que comprende tales acidos nucleicos, asi como las celulas hospedadoras transformadas o transfectadas por tal acido nucleico o tal vector. Los productos de la invenci6n son utiles para expandir subgrupos de linfocitos, tales como en particular subgrupos T/NK. La presente invenci6n se refiere por tanto a la utilizaci6n de un producto de la invenci6n, tal como un agente para la expansi6n de una o varias poblaciones de linfocitos, tales como las celulas NK, NK-linfocitos T, linfocitos T CDS+ de memoria, y los adyuvantes, las composiciones y los equipos de reactivos destinados a tal uso, incluyendo las composiciones farmaceuticas y los farmacos, que comprenden al menos un producto de la invenci6n. Dicho al menos un polipeptido que contiene sushi y dicha al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, se pueden utilizar de forma combinada, como por ejemplo, en forma de un compuesto enlazado covalentemente de la invenci6n, o en forma separada. La presente invenci6n se refiere, por tanto, a:

-: dicha al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, tal y como se define en esta memoria, y

-: dicho al menos un polipeptido que contiene sushi, tal y como se define en esta memoria,

o sus acidos nucleicos, vectores, celulas hospedadora, respectivas, como una preparaci6n combinada para uso simultaneo, separado o secuencial, es decir, en un formato de equipo de reactivos por partes. La presente invenci6n se refiere, por tanto, a una preparaci6n tal, que es un adyuvante, una composici6n o un equipo de reactivos, que incluye una composici6n farmaceutica y un farmaco.

La presente solicitud se refiere asi a la prevenci6n y/o el alivio y/o el tratamiento de un estado o una enfermedad, en la que se desea un aumento de la actividad de IL-15, tal como en particular cancer o inmunodeficiencia. Tal prevenci6n y/o alivio y/o tratamiento pueden actuar mediante la estimulaci6n de la proliferaci6n y/o supervivencia de los linfocitos (tales como linfocitos T, linfocitos T CDS+, celulas NK, celulas dendriticas) y/o de su actividad contra los celulas tumorales.

Un metodo para la prevenci6n y/o el alivio y/o el tratamiento de la invenci6n, comprende la administraci6n de un producto de la invenci6n a un paciente que lo necesita.

La presente invenci6n tambien se refiere a adyuvantes, composiciones, composiciones farmaceuticas, farmacos y vacunas, que estan destinados a dicha prevenci6n y/o alivio y/o tratamiento. Las composiciones farmaceuticas, los farmacos y las vacunas de la invenci6n comprenden al menos un producto de la invenci6n, y, opcionalmente, un vehiculo y/o un portador y/o un diluyente y/o un adyuvante farmaceuticamente aceptable.

La presente invenci6n se refiere mas particularmente a un adyuvante. Tal adyuvante esta adaptado en particular a la inducci6n y/o la estimulaci6n de una respuesta inmune, que comprende un dominio sushi aislado de IL-15Ralfa, o una variante conservadora del mismo. Este tipo de adyuvante puede ser un coadyuvante para una vacuna antimicrobiana (antivirica, antibacteriana, antifungica) o para una vacuna antitumoral.

La presente invenci6n tambien se refiere a:

-: una composici6n que puede estar destinada especialmente a inducir y/o estimular una acci6n biol6gica de IL-15, que comprende un dominio sushi de IL-15Ralfa aislado, o una variante conservadora del mismo,

-: el uso de un dominio sushi de IL-15Ralfa aislado, o de una variante conservadora del mismo, para la preparaci6n de un adyuvante para la composici6n inmunoterapeutica,

-: el uso de un dominio sushi de IL-15Ralfa aislado, o de una variante conservadora del mismo, para la preparaci6n de una composici6n destinada a inducir y/o estimular una la acci6n biol6gica de IL-15.

La presente solicitud se refiere por tanto a un farmaco o a una vacuna que comprende al menos un polipeptido que contiene sushi, tal y como se define en esta memoria, y, opcionalmente, un vehiculo y/o un portador y/o un diluyente y/o un adyuvante farmaceuticamente aceptable. Tal farmaco o vacuna esta indicada para la prevenci6n y/o el tratamiento y/o el alivio de un estado o una enfermedad en la cual se desea un aumento de la actividad de IL-15, como en particular el cancer o la inmunodeficiencia. Tal farmaco o vacuna puede actuar mediante la estimulaci6n de la proliferaci6n y/o la supervivencia de linfocitos (tales como linfocitos T, linfocitos T CDS+, celulas NK, celulas dendriticas) y/o de su actividad contra celulas tumorales.

La presente invenci6n se refiere mas particularmente a un farmaco o una vacuna antitumoral que ejerce su acci6n preventiva y/o de alivio y/o terapeutica a traves de la estimulaci6n de la proliferaci6n de las celulas NK y los linfocitos T CDS+ que expresan IL-15Rbeta/gamma pero no IL-15Ralfa. Un farmaco o una vacuna tal antitumoral esta destinada a aquellos pacientes cuyas poblaciones de celulas NK y/o linfocitos T CDS+ no son suficientemente activas para ejercer una vigilancia o aclaramiento antitumoral eficaz. Un farmaco o una vacuna tal antitumoral se dirige mas particularmente a aquellos pacientes que tienen una poblaci6n insuficiente o una poblaci6n

insuficientemente activa de celulas NK y/o linfocitos T CDS+ que expresan IL-15Rbeta/gamma pero no IL-15Ralfa.

Un farmaco o una vacuna antitumoral de la invenci6n pueden comprender un dominio sushi aislado de IL-15Ralfa o una variante conservadora del mismo.

Un farmaco o vacuna antitumoral preferida de la invenci6n comprende:

-: por lo menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, segun se define en esta memoria, tal como la IL-15, y

-: por lo menos un polipeptido que contiene sushi, tal y como se define en esta memoria, como un dominio sushi aislado de IL-15Ralfa, o una variante conservadora del mismo.

Preferiblemente, al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, tal como IL-15, y dicho al menos un polipeptido que contiene sushi, como un dominio sushi aislado de IL-15Ralfa, o una variante conservadora del mismo, estan enlazados en una proteina de fusi6n, formando asi un compuesto enlazado covalentemente de la invenci6n.

La presente invenci6n se refiere tambien a la prevenci6n y/o el alivio y/o el tratamiento de una enfermedad o un estado que implica una inmunodeficiencia. La presente invenci6n se refiere mas particularmente a la prevenci6n y/o el alivio y/o el tratamiento de una enfermedad o un estado que implica una inmunodeficiencia relacionada con el VIH. Esta prevenci6n y/o alivio y/o tratamiento comprende la administraci6n de un producto de la invenci6n a un paciente que lo necesita. La presente invenci6n se refiere a un farmaco y/o a una composici6n para tal prevenci6n y/o alivio y/o tratamiento.

La presente invenci6n se refiere, por tanto, a un adyuvante para una composici6n inmunoterapeutica, que se caracteriza porque comprende al menos un elemento entre los siguientes elementos:

-: un compuesto de la invenci6n,

-: un acido nucleico de la invenci6n,

-: un vector de la invenci6n,

-: una celula hospedadora de la invenci6n.

Ventajosamente, dicho adyuvante mejora la respuesta de los linfocitos T CDS de memoria.

En la presente solicitud, <inmunoterapia» incluye terapia, cuidados paliativos y/o prevenci6n, mediante inducci6n y/o estimulaci6n de una respuesta inmune. La expresi6n <composici6n inmunoterapeutica», abarca las vacunas preventivas, asi como las "vacunas" paliativas y/o terapeuticas. El termino <adyuvante» tiene por objeto definir una sustancia que se puede anadir a una composici6n, para mejorar la respuesta inmune (respuesta inmune innata y/o respuesta inmune adaptativa). En la presente invenci6n, comprende ademas una sustancia que se puede anadir a una composici6n para mejorar la eficacia de esta composici6n con el tiempo, es decir, la duraci6n de la respuesta inmune (linfocitos T CDS+ de memoria).

El compuesto de la invenci6n se puede usar en una composici6n como compuesto adyuvante, pero tambien puede actuar por si mismo como un principio activo. De hecho, es capaz solo y por si mismo, de inducir y/o estimular la proliferaci6n y la activaci6n de celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma, y mas particularmente la diferenciaci6n de las celulas NK y/o los linfocitos T de las celulas NK y/o linfocitos T indiferenciados. La expresi6n <principio activo» tiene por objeto definir una sustancia que puede provocar una respuesta inmune.

Como un adyuvante para una composici6n inmunoterapeutica, un compuesto de la invenci6n mejora la intensidad de la respuesta inmune (respuesta inmune innata, respuesta inmune adaptativa) y/o mejora la duraci6n de la respuesta inmune (mejora la respuesta de los linfocitos T CDS de memoria).

Como un agente activo para una composici6n inmunoterapeutica, un compuesto de la invenci6n induce una respuesta inmune, que tiene una intensidad superior y/o una duraci6n mayor que la inducida por otros estimuladores de celulas NK/linfocitos T. Por lo tanto, tanto si se utiliza como un adyuvante en asociaci6n con otra respuesta inmune inducida, como si se utiliza como un principio activo que induce solo y por si mismo una respuesta inmune, un compuesto de la invenci6n mejora la intensidad y/o la duraci6n de la respuesta inmune. Ventajosamente:

-: induce una respuesta inmune innata mejorada,

-: induce una respuesta inmune adaptativa mejorada, y en particular una respuesta mejorada de los linfocitos T CDS de memoria.

La aplicaci6n tambien se refiere a una composici6n de adyuvante, que comprende al menos un elemento entre los

siguientes elementos:

-: un compuesto de la invenci6n, tal y como se define en esta memoria,

-: un acido nucleico de la invenci6n,

-: un vector de la invenci6n,

-: una celula hospedadora de la invenci6n.

La aplicaci6n tambien se refiere a un metodo para producir un adyuvante para una composici6n inmunoterapeutica, que se caracteriza porque comprende:

proporcionar una molecula de IL-15Ralfa soluble, o un fragmento de la misma que ha conservado su dominio sushi,

enlazar covalentemente un elemento que se une a IL-15Rbeta/gamma, seleccionado entre IL-15, un fragmento de IL-15, un agonista o un mimetico que tiene una afinidad para unirse a IL-15Rbeta/gamma que no es significativamente mas baja que la de IL-15 natural (capaz de competir con IL-15 natural y/o IL-2 por la uni6n a IL15Rbeta/gamma), y que preferiblemente no se une a IL-2Ralfa,

siendo por ello el compuesto resultante, un adyuvante para una composici6n inmunoterapeutica.

La presente invenci6n tambien se refiere a una composici6n, a una composici6n farmaceutica o a un farmaco que comprende al menos un polipeptido que contiene el dominio sushi de IL-15Ralfa, tal y como se define en esta memoria, es decir, en donde la secuencia de aminoacidos de dicho al menos un polipeptido que contiene sushi:

•: es la secuencia de aminoacidos de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa humano, o de un fragmento del mismo que ha conservado el dominio sushi de dicho IL-15Ralfa, en donde el dominio sushi de IL-15Ralfa se define como el que comienza en el primer residuo de cisteina codificado por el ex6n 2 (C1), y termina en el cuarto residuo de cisteina codificado por el ex6n 2 (C4), estando los residuos de C1 y C4 ambos incluidos en la secuencia de sushi, o

•: tiene una identidad de al menos S5% con una secuencia tal de IL-15Ralfa o de un fragmento de IL-15Ralfa, siempre que cada uno de los cuatro residuos de cisteina (C1, C2, C3 y C4) de dicho dominio sushi se hayan conservado.

Preferiblemente, dicho porcentaje de identidad es de al menos 90%, aun mas preferentemente de al menos 92%, mas preferentemente de al menos el 95%, por ejemplo, al menos 96%, al menos el 97%, al menos 9S%, al menos 99% o 100%. La presente invenci6n se refiere mas particularmente a una composici6n, a una composici6n farmaceutica o a un farmaco que comprende al menos un polipeptido que contiene el dominio sushi de IL-15Ralfa, tal y como se define en esta memoria, en donde dicho al menos un polipeptido que contiene sushi, comprende o consiste en la parte extracelular de IL-15Ralfa que esta codificada por los exones 2 y 3, o un fragmento de dicha parte que ha conservado el dominio sushi. La presente invenci6n se refiere preferentemente a una composici6n, a una composici6n farmaceutica o a un farmaco que comprende:

-: un fragmento de IL-15Ralfa humano, cuya secuencia de aminoacidos son los aminoacidos que se extienden desde la posici6n 1 hasta la posici6n 127 de SEQ ID NO: 3, o

-: un subfragmento del mismo que ha conservado el dominio sushi de dicho fragmento, en donde:

: o dicho dominio sushi se define como el que comienza en el primer residuo de cisteina codificado por el ex6n 2 (C1), y termina en el cuarto residuo de cisteina codificado por el ex6n 2 (C4), estando los residuos C1 y C4 ambos incluidos en el dominio sushi, y

: o la secuencia de aminoacidos de dicho peptido senal, es la secuencia que se extiende desde la posici6n 1 hasta la posici6n 30 de dicha SEQ ID NO: 3,

: o una variante de dicho fragmento o subfragmento, tiene una identidad de la secuencia de aminoacidos de al menos S5%, en toda la longitud de dicho fragmento o subfragmento.

Preferiblemente, dicho porcentaje de identidad es de al menos 90%, aun mas preferentemente de al menos 92%, mas preferentemente de al menos el 95%, por ejemplo, al menos 96%, al menos el 97%, al menos 9S%, al menos 99% o 100%. Tal composici6n, composici6n farmaceutica o farmaco puede comprender ademas al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, tal como IL-15, o un fragmento de IL-15 o una variante, tal y como se define en esta memoria. Dicha al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma puede estar no unida a dicho,, polipeptido que contiene sushi por covalencia, es decir, estar colocada de forma libre en dicha composici6n, y/o puede estar unida por covalencia a dicho al menos un polipeptido que contiene sushi. En este ultimo caso, la composici6n, la composici6n farmaceutica o el farmaco de la invenci6n, comprende de hecho un compuesto de la invenci6n tal y como se define en esta memoria.

Una composici6n farmaceutica o un farmaco tal, pueden estar destinados a extinguir una acci6n biol6gica de IL-15, y mas particularmente para inducir y/o estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de celulas positivas para IL15Rbeta/gamma. Dicha composici6n farmaceutica o farmaco, pueden estar destinados a inducir y/o estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de una respuesta inmune de celulas NK y/o linfocitos T. Tal composici6n farmaceutica

o farmaco pueden estar destinados a ser una composici6n de vacuna preventiva y/o paliativa y/o terapeutica. Tal composici6n farmaceutica o farmaco pueden estar destinados a la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa, y/o para la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento de una inmunodeficiencia (por ejemplo, una inmunodeficiencia inducida por VIH), y/o para la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento del desarrollo o presencia de tumores (y puede contener ademas al menos un antigeno tumoral), y/o para la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento de X-SCID.

De acuerdo con una realizaci6n ventajosa de la presente invenci6n, dicho al menos un polipeptido que contiene sushi esta unido covalentemente a una entidad que se une IL-15Rbeta/gamma. Lo mas preferible, esta entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma no se une a IL-2Ralfa. De acuerdo con una realizaci6n preferida de la presente invenci6n, dicho al menos un polipeptido que contiene sushi esta unido covalentemente a una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, que es IL-15, o es un fragmento, un mimetico o un agonista de IL-15, que tiene una afinidad para unirse a IL-15Rbeta/gamma que no es significativamente inferior que la de IL-15 natural (es decir, un fragmento, un mimetico o un agonista que es capaz de competir con IL-15 natural y/o IL-2 para unirse a IL15Rbeta/gamma).

La presente invenci6n se refiere mas particularmente a una composici6n farmaceutica, destinada a estimular la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma, para inducir con ello y/o estimular la activaci6n y/o la proliferaci6n de celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma, tales como celulas NK y/o linfocitos T, caracterizada porque comprende al menos un elemento entre los siguientes elementos:

-: un compuesto de la invenci6n,

-: un acido nucleico de la invenci6n,

-: un vector de la invenci6n,

-: una celula hospedadora de la invenci6n.

Dicha composici6n farmaceutica puede comprender ademas un vehiculo farmaceuticamente adecuado (agente portador, diluyente, excipiente, aditivo, para ajustar el pH, emulsionante o dispersante, conservante, tensioactivo, agente gelificante, asi como agente tamponador y otros agentes estabilizantes y solubilizantes, etc.).

La presente invenci6n tambien se refiere a un farmaco, destinado a estimular la ruta de senalizaci6n de IL15Rbeta/gamma, para inducir con ello y/o estimular la activaci6n y/o la proliferaci6n de celulas positivas para IL15Rbeta/gamma, tales como celulas NK y/o linfocitos T, caracterizada porque comprende al menos un elemento entre los siguientes elementos:

-: un compuesto de la invenci6n,

-: un acido nucleico de la invenci6n,

-: un vector de la invenci6n,

-: una celula hospedadora de la invenci6n.

Dicho farmaco es preferiblemente una composici6n inmunoterapeutica.

Dicho farmaco es mas preferiblemente una composici6n de vacuna preventiva y/o paliativa y/o terapeutica. Dicho farmaco puede comprender ademas un vehiculo fisiol6gicamente apropiado (agente portador, diluyente, excipiente, aditivo, para ajustar el pH, emulsionante o dispersante, conservante, tensioactivo, agente gelificante, asi como agente tamponador y otros agentes estabilizantes y solubilizantes, etc.).

Vehiculos y formulaciones aceptables farmaceuticamente adecuados incluyen todos los vehiculos y formulaciones aceptables farmaceuticamente adecuados, conocidos, tales como los descritos en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20a edici6n, Mack Publishing Co., y "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", Ansel, Popovich y Allen Jr., Lippincott Williams y Wilkins.

En general, la naturaleza del vehiculo dependera del modo particular de administraci6n que se emplea. Por ejemplo, las formulaciones originales suelen incluir como vehiculo, ademas de uno o varios agentes de contraste, liquidos inyectables que incluyen liquidos farmaceutica y fisiol6gicamente aceptables, que incluyen agua, soluci6n salina fisiol6gica, soluciones de sales equilibradas, tampones, dextrosa acuosa, glicerol, etanol, aceite de sesamo, combinaciones de los mismos, o similares. El medio tambien puede contener materiales convencionales como complemento de productos farmaceuticos, por ejemplo, sales farmaceuticamente aceptables para ajustar la presi6n

osm6tica, tampones, conservantes, etc. El vehiculo y la composici6n pueden ser esteriles, y la formulaci6n se adapta a la forma de administraci6n.

Para composiciones s6lidas (por ejemplo, formas en polvo, pildora, comprimido o capsula), los vehiculos s6lidos no t6xicos, convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almid6n, sacarina s6dica, celulosa, carbonato de magnesio o estearato de magnesio. Ademas de los vehiculos biol6gicamente neutros, las composiciones farmaceuticas que se van a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes reguladores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitan.

La composici6n puede ser una soluci6n liquida, una suspensi6n, una emulsi6n, comprimido, pildora, capsula, formulaci6n de liberaci6n sostenida o polvo. La composici6n se puede formular con agentes ligantes y vehiculos tradicionales, tales como los trigliceridos.

Una composici6n o un farmaco de la invenci6n es util para inducir y/o estimular una acci6n biol6gica de IL-15 a traves de la ruta de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma. Es mas particularmente util para inducir y/o estimular una respuesta inmune innata (celulas NK), y/o una inmunidad adaptativa (linfocitos T, y en particular linfocitos T CDS+ de memoria).

De acuerdo con una realizaci6n muy ventajosa de la presente invenci6n, dicho farmaco puede estar destinado a la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento del desarrollo o la presencia de tumores. Dicho tumor puede ser, por ejemplo, un melanoma, un linfoma, un carcinoma (por ejemplo, carcinoma cervical), un cancer de mama, un cancer de ovario, un tumor pancreatico. Ventajosamente, dicho farmaco antitumoral es una vacuna antitumoral que actua a mediante la transpresentaci6n. Un farmaco antitumoral de la invenci6n puede comprender adicionalmente, al menos un antigeno tumoral. Dicho al menos un antigeno tumoral puede estar en forma soluble, o estar enlazado a un compuesto de la invenci6n (por covalencia o por otra forma de enlace). Dicho al menos un antigeno tumoral se proporciona ventajosamente en forma de celulas dendriticas cargadas con un antigeno tal como, por ejemplo, celulas dendriticas modificadas geneticamente que expresan dicho al menos un antigeno tumoral.

Los antigenos tumorales son antigenos que son presentados por moleculas del MHC I en la superficie de las celulas tumorales. Los antigenos tumorales tambien pueden estar en la superficie del tumor en forma de, por ejemplo, un receptor mutado, en cuyo caso sera reconocido por los linfocitos B. A veces, los antigenos tumorales pueden estar presentados solo por celulas tumorales y nunca por las normales. En ese caso, se denominan antigenos especificos de tumores (TSA), o antigenos de trasplante especificos de tumores (TSTA), o antigenos de rechazo de tumores (TRA), y por lo general son el resultado de una mutaci6n especifica del tumor. Los TSA suelen aparecer cuando un virus infeccioso ha causado que la celula se vuelva inmortal y que exprese el antigeno del virus. Los TSA no inducidos por virus son los idiotipos de BCR en linfomas de linfocitos B o TCR en linfomas de linfocitos T.

Mas comunes son los antigenos que estan presentados por celulas tumorales y celulas normales, y se denominan antigenos asociados a tumores (TAA). Los TAA se encuentran sobre celulas tumorales y sobre celulas normales durante la vida fetal (antigenos onco-fetales), despues del nacimiento en 6rganos seleccionados, o en muchas celulas, pero con una concentraci6n mucho mas baja que en las celulas tumorales. Los oncogenes se pueden expresar en virus que causan cancer. La mayoria de los oncogenes estan presentes realmente en la celula hospedadora, en donde actuan en el crecimiento regulado de la celula. Cuando es transducido por el virus y se expresa bajo el control del promotor virico, el producto genico de la celula hospedadora, es decir, el producto del proto-oncogen, contribuye al crecimiento incontrolado de las celulas tumorales. Dado que las proteinas codificadas los proto-oncogenes se expresan normalmente en las celulas normales, su hiperexpresi6n en las celulas tumorales las clasifica como antigenos asociados a tumores. Los linfocitos T citot6xicos que reconocen esos antigenos pueden ser capaces de destruir las celulas tumorales antes de que proliferen o sufran metastasis. Las celulas tumorales sin embargo, pueden regular a la baja la expresi6n de la clase I del MHC. A menudo carecen de moleculas coestimuladoras, tales como las moleculas B7 o de adhesi6n que son necesarias para que puedan interactuar con linfocitos T CDS+. Algunas celulas tumorales inhiben activamente la respuesta inmune mediante la producci6n de una citocina supresora, tal como TGFbeta, que inhibe la inmunidad celular.

Ejemplos de antigenos tumorales comprenden en particular:

-: reguladores del ciclo celular, tales como la quinasa 4 dependiente de ciclina (melanoma),

-: transductores de senales, tales como la beta-catenina (melanoma),

-: reguladores de la apoptosis, tales como la caspasa-S (carcinoma de celulas escamosas),

-: proteinas testiculares, tales como los antigenos MAGE (melanoma, mama, tumores de glioma), por ejemplo, MAGE-1 (numero de orden P43355), MAGE-2 (numero de orden P43356), MAGE-3 (numero de orden P43357), MAGE-4 (numero de orden P4335S), MAGE-6 (numero de orden P43360), MAGE-S (numero de orden P43361), MAGE-9 (numero de orden P43362), MAGE-10 (numero de orden P43363), MAGE-11 (numero de orden P43364), MAGE -12 (numero de orden P43365),

-: compuesto que participa en la sintesis de melanina (melanoma), tal como la tirosinasa (numero de orden P14679),

-: idiotipos BCR, tales como el idiotipo Ig de superficie (linfoma),

-: receptores de la tirosina quinasa, tales como Her-2/neu, MUC-1 (cancer de mama y de ovario),

-: mucinas hipoglicosiladas, tales como MUC-1 (tumores de mama y pancreatico),

-: productos de genes viricos, tales como VPH E6 y E7 (carcinoma cervical).

Una composici6n o un farmaco de la invenci6n pueden estar destinados a la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa (infecci6n con un microorganismo, tal como virus, bacteria, levadura, hongo, etc.)

Una composici6n o un farmaco de la invenci6n pueden estar destinados a la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento de una inmunodeficiencia (por ejemplo, una inmunodeficiencia inducida como un efecto secundario por un tratamiento particular, como un tratamiento antitumoral o un tratamiento anterior a un trasplante, o inducida por un virus, tal como el VIH).

Una composici6n o un farmaco de la invenci6n pueden estar destinados a la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento de SCID-X (inmunodeficiencia combinada grave, ligada al cromosoma X, que esta ligada a una disfunci6n de IL-15Rgamma).

La formulaci6n de una composici6n farmaceutica que comprende al menos uno de los productos de la invenci6n recoge las competencias del experto en la tecnica. Lo mismo es valido para los detalles de la administraci6n de dicha composici6n. El medico que trata al paciente tendra que tener en cuenta, entre otros parametros, la edad, el estado general y el grado de la enfermedad. Los compuestos terapeuticamente utiles, identificados de acuerdo con el metodo de la invenci6n, se pueden administrar a un paciente a traves de cualquier metodo apropiado para el compuesto en particular, por ejemplo, por via oral, intravenosa, parenteral, transdermica, transmucosa, o por cirugia

o implantaci6n (por ejemplo, estando el compuesto en forma de una matriz s6lida o semis6lida biol6gicamente compatible y reabsorbible) en el lugar donde se desea el efecto del compuesto o cerca del mismo. Un experto en la materia determina que las dosis terapeuticas son apropiadas, y estan en funci6n del peso corporal.

La invenci6n tambien se refiere a un metodo de tratamiento con un compuesto, mediante terapia y/o paliaci6n y/o prevenci6n en un paciente o un animal no humano que lo necesite.

La presente invenci6n se refiere tambien a un metodo para tratar un paciente que lo requiera (tratamiento mediante terapia y/o paliaci6n y/o prevenci6n), mediante la administraci6n de un producto, una composici6n o un farmaco de la invenci6n.

La presente invenci6n se refiere tambien a un procedimiento para inducir y/o estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma, caracterizado porque comprende:

-: poner en contacto celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma con al menos uno de los siguientes elementos:

: o un compuesto de la invenci6n,

: o un acido nucleico de la invenci6n,

: o un vector de la invenci6n,

: o una celula hospedadora de la invenci6n,

en donde la proliferaci6n y/o la activaci6n de dichas celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma esta inducida y/o estimulada. Dicho contacto se lleva a cabo en condiciones que permiten la proliferaci6n y/o la activaci6n de dichas celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma. Estas condiciones comprenden principalmente la duraci6n del tiempo, y las condiciones ambientales (temperatura, atm6sfera, medio de cultivo). El ajuste de estas condiciones corresponde a las competencias de la persona experta en la materia. La presente invenci6n tambien se refiere a un procedimiento in vitro para inducir y/o estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de celulas positivas para IL15Rbeta/gamma, caracterizado porque comprende:

-: proporcionar una muestra celular que comprende celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma,

-: poner en contacto dicha muestra con al menos uno de los siguientes elementos:

: o un compuesto de la invenci6n,

: o un acido nucleico de la invenci6n,

: o un vector de la invenci6n,

: o una celula hospedadora de la invenci6n,

durante un periodo de tiempo y bajo condiciones ambientales que permiten a dicho contacto inducir y/o estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de dichas celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma.

La presente invenci6n se refiere tambien a un procedimiento para producir celulas NK y/o linfocitos T activados, caracterizado porque comprende:

-: poner en contacto celulas NK y/o linfocitos T en reposo, con al menos uno de los siguientes elementos:

: o un compuesto de la invenci6n,

: o un acido nucleico de la invenci6n,

: o un vector de la invenci6n,

: o una celula hospedadora de la invenci6n,

durante un periodo de tiempo y bajo unas condiciones ambientales que permiten a dicho contacto inducir la activaci6n de dichas celulas NK y/o linfocitos T en reposo, comprendidos en dicha muestra.

La presente invenci6n se refiere tambien a un procedimiento in vitro para la producci6n de celulas NK y/o linfocitos T activados, caracterizado porque comprende:

-: proporcionar una muestra celular que comprende celulas NK y/o linfocitos T en reposo,

: o un compuesto de la invenci6n,

: o un acido nucleico de la invenci6n,

: o un vector de la invenci6n,

: o una celula hospedadora de la invenci6n,

En el procedimiento para inducir y/o estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de las celulas positivas para IL15Rbeta/gamma, y en el procedimiento para la producci6n de celulas NK y/o linfocitos T activados, las celulas puestas en contacto pueden ser lineas celulares. Tambien pueden ser alternativamente, celulas ex vivo recogidas de un organismo (por ejemplo, un paciente humano), y destinadas a ser devueltas a este u a otro organismo (por ejemplo, al mismo paciente), despues del tratamiento in vitro.

Por lo tanto, la presente invenci6n abarca la realizaci6n ex vivo de dichos procedimientos y su aplicaci6n en el curso de un tratamiento mediante terapia y/o paliaci6n y/o prevenci6n.

En la presente solicitud, el cod6n de "detenci6n" (TAG, TGA o TAA) no suele declararse que este comprendido en la CDS.

La expresi6n "que comprende", que es sin6nimo de "que incluye" o "que contiene", es una expresi6n abierta, y no excluye ningun elemento, ingrediente o etapa del metodo adicional, no mencionado, mientras que la expresi6n "que consiste en", es una expresi6n cerrada, que excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente adicional que no se mencione explicitamente. La expresi6n "que consiste esencialmente en" es una expresi6n parcialmente abierta, que no excluye elemento(s), etapa(s) o ingrediente(s) adicional(es), no mencionado(s), siempre y cuando este(os) elemento(s) etapa(s) o ingrediente(s) adicional(es) no afecte materialmente a las propiedades basicas y novedosas de la invenci6n. La expresi6n "que comprende" (o "comprende(n)") por lo tanto, incluye la expresi6n "que consiste en" ("consiste(n)"), asi como la expresi6n "que consiste esencialmente en" ("consiste(n) esencialmente en"). En consecuencia, La expresi6n "que comprende" (o "comprende(n)") significa, en la presente solicitud, que abarca mas particularmente la expresi6n "que consiste en" ("consiste(n) en"), y la expresi6n "que consiste esencialmente en" ("consiste(n) esencialmente en").

El termino "significativamente" se usa en esta memoria en su sentido habitual, en el campo de la estadistica (por ejemplo, la prueba t, la prueba z, el valor de chi cuadrado, o la relaci6n F, etc.), es decir, para comparar un valor con otro, y determinar si estos valores difieren entre si. El termino "significativamente" por lo tanto, abarca el hecho de que el experto podra tener en cuenta la desviaci6n estandar (si existe), que mide la cantidad de dispersi6n de los

datos en una distribuci6n de frecuencias. El valor p deseado se suele fijar a un nivel alfa de 5%, o al nivel alfa mas estricto del 1%.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustraci6n, y no a modo de limitaci6n.

Ejemplos

Procedimientos experimentales

Cultivo de eelulas y eitoeinas

La IL-15 humana recombinante (RIL-15) procedia de Peprotech Inc (Rocky Hill, NJ). La linea de celulas de leucemia mieloide Mo-7 (linea celular humana que expresa IL-15RW/V pero no IL-15Ra), y la linea celular humana TF-1 de eritroleucemia (linea celular que expresa IL-15Ra e IL-15RV, pero no IL-15RW; ATCC CRL-2003) se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal termoinactivado (FCS), glutamina 2 mM y 1 ng/ml de GM-CSF (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). Las celulas TF1-W (22) se cultivaron en el mismo medio suplementado con 250 Ig/ml de geneticina. La linea celular humana de linfoma de linfocitos T Kit 225 (linea celular dependiente de IL2) se cultiv6 en medio RPMI 1640 que contiene 6% de FCS, glutamina 2 mM, 10 ng/ml de rIL-2 (Chiron, Emeryville, CA). La linea de celulas 32DW de rat6n que expresa la cadena IL-15RV end6gena de rat6n y la cadena IL-15RW humana transfectada (linea celular 32D disponible en la ATCC CRL-11346) se cultiv6 en RPMI, 10% de FCS, 0,4 ng/ml de m-IL-3, 10 Ig/ml de b-mercaptoetanol, 250 g/ml de geneticina.

sIL-15Ra-IL2, sIL-15Ra-sushi-IL-2 y sIL-15Ra-sushi

sIL-15Ra-IL-2 se expresaba en celulas CHO y se prepar6 tal y como se ha descrito (23). Se realiz6 una construcci6n similar en la que el dominio sushi de IL-15Ra (aminoacidos 1-66 de la secuencia codificadora madura) estaba ligado a una molecula de IL-2 humana (sIL-15Ra-sushi-IL-2). El dominio sushi de IL15Ra se amplific6 con PCR. Los productos de la PCR se purificaron, se digirieron con BamHI y HindIII (Fermentas, Vilnius, Lituania) y se ligaron en el vector de expresi6n pQE30. La expresi6n se llev6 a cabo en celulas de E. coli SG13009 bajo inducci6n con IPTG. Despues de la lisis celular, se lavaron los cuerpos de inclusi6n, se solubilizaron en guanidina HCl 6 mM, fosfato s6dico 20 mM, pH 7,4, imidazol 20 mM, cloruro s6dico 150 mM y DTT 1 mM. IL-15Ra-sushi se atrap6 en una columna de Ni-NTA de agarosa (Qiagen), equilibrada con el tamp6n de solubilizaci6n y glutati6n reducido 1 mM y glutati6n oxidado 0,2 mM. Se repleg6 a traves de un gradiente de 6 a 0 M de guanidina HCl en tamp6n de la columna (24) y se eluy6 con imidazol 250 mM.

Proteinas de fusian RLI e ILR

Las construcciones de las proteinas de fusi6n se muestran en la Fig. 2E. El dominio sushi de IL-15Ra humano (aa 177) y de IL-15 humana, se separaron a traves del enlazador 20 (SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ, SEQ ID NO: 50) para RLI, o el enlazador 26 (SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ, de SEQ ID NO: 52) para ILR. Una secuencia que codifica el epitopo Flag y el sitio de uni6n al factor Xa (D�KDDDDKIEGR, de SEQ ID NO: 54, para RLI; TTRD�KDDDDKIEGR, de SEQ ID NO: 56, para ILR) se anadi6 entre el peptido senal (sp) y las secuencias codificadoras. El sp end6geno de IL-15Ra humano (SEQ ID NO: 5) se utiliz6 para RLI, y el sp de preprolactina bovina (SEQ ID NO: 5S) para ILR. Estas construcciones se insertaron entre los sitios BamHI y HindIII del vector de expresi6n pFastBac 1 (InVitrogen), para generar dos vectores de expresi6n que se recombinaron en el ADN de baculovirus, empleando el sistema de expresi6n "Bac to Bac" (InVitrogen). Los baculovirus recombinantes se utilizaron para infectar celulas SF9 (ATCC CRL-1711), y las proteinas de fusi6n se expresaron en medio SF 900 II (GibcoTM Invitrogen Corp.) y se recogieron 4 dias despues de la infecci6n. Las concentraciones de las proteinas de fusi6n se midieron con ELISA con el mAb 247 anti-IL-15 (R&D Systems) como anticuerpo de captura, y el conjugado anti-Flag M2-peroxidasa (Sigma, St Louis, MO) como anticuerpo revelador.

Estudios de resonaneia plasmadiea superfieial (SPR)

Estos experimentos se realizaron con un biosensor BIACore 2000 (BIACore, Uppsala, Suecia). rIL-15 se uni6 covalentemente a chips del sensor CM5, y se control6 la uni6n de concentraciones crecientes de sIL-15Ra-IL-2, sIL-15Ra-sushi-IL-2 o sIL-15Ra-sushi. El analisis de los sensorgramas se realiz6 utilizando un programa de evaluaci6n de cineticas de BIAlogue.

Ensayos de proliferaeian

Las respuestas proliferativas de celulas Mo-7, TF-1W y Kit 225, frente a rIL-15, rIL-2, RLI o ILR se midieron mediante la incorporaci6n de [3H]-timidina, tal y como se describe (19), despues de 4 horas en medio privado de citocina, 4S h de cultivo y 16 h con [3H]-timidina.

Apoptosis

El ensayo con anexina V se realiz6 empleando un cit6metro de flujo FACScan y el equipo de reactivos para detectar la apoptosis Annexin V-FITC (BD Biosciences Pharmingen, Francia). Despues de la privaci6n de citocinas, las

celulas se sembraron en placas de multiples pocillos con 5.105 celulas/pocillo en 1 ml y se cultivaron en un medio suplementado con reactivos diferentes (rIL-15, rIL-15Ra-sushi y proteina de fusi6n RLI). Los datos fueron adquiridos y analizados con el uso del programa CellQuest.

Ensayos de ligaeian e internalizaeian

La marcaci6n con [125I]-yodo de rIL-15 humana, sIL-15Ra-sushi y la proteina de fusi6n RLI, y posteriores experimentos de ligaci6n, se realizaron tal y como se ha descrito previamente (19). Para la internalizaci6n, las celulas se equilibraron a 4OC con sIL-15Ra-sushi o RLI marcado, y la temperatura cambi6 a 37OC. A diferentes intervalos de tiempo, dos muestras se lavaron y se centrifugaron. Uno de los sedimentos de las celulas se trat6 con tamp6n de glicina-HCl 0,2 M, pH 2,5, mientras que el otro se trat6 con PBS pH 7,4 a 4OC durante 5 min. Despues de la centrifugaci6n, se determin6 la uni6n total del ligando a partir del sedimento de las celulas tratadas con PBS, mientras que se determin6 la uni6n de la membrana y las fracciones internalizadas, respectivamente, a partir del material sobrenadante y del sedimento de las celulas tratadas con pH acido.

sIL-15Ra-Sushi�: sIL-15Ra-Sushi + marcado con Flag-Factor Xa se expresaba en medio de celulas de insectos SF9 (ATCC CRL-1711), SF 900 II (InVitrogen, Cergy-Pontoise, Francia), tal y como se ha descrito para las proteinas de fusi6n RLI e ILR. El material sobrenadante se concentr6 por precipitaci6n con sulfato de amonio al 90% de saturaci6n y se carg6 en una columna de inmunoafinidad de agarosa anti-Flag (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia). La pureza de sIL-15Ra-Sushi+ era del 100% con una masa molecular aparente de 12 kDa, tal y como se determin6 mediante SDS-PAGE despues de la yodaci6n con el metodo de cloramina-T, tal y como se ha descrito anteriormente (Lehours y col. Eur. Cytokine Netw. 11 (2000), 207-5). Su concentraci6n se determin6 mediante el ensayo a base de proteinas con acido bicinconinico (BCA) (Pierce, Perbio Science, Brebi�res, Francia).

Resultados

La unian de IL-15Ra a IL-15 se debe prineipalmente al dominio sushi

Un estudio previo (25) ha mostrado que la eliminaci6n del dominio "sushi" codificado por el ex6n 2 de IL-15R, daba lugar a una anulaci6n completa de la uni6n de IL-15 a IL-15Ra anclado a la membrana, lo que sugiere que el dominio sushi era indispensable para la uni6n. Con el fin de medir directamente la contribuci6n del dominio sushi a la uni6n de IL-15, se prepararon formas solubles de IL-15Ra que contenian el dominio extracelular completo o solo el dominio sushi N-terminal y se someti6 a ensayo la uni6n de IL-15 en un ensayo de competici6n y mediante el uso de la tecnologia de resonancia plasm6dica superficial (SPR). Tal y como se muestra en la Fig. 1A, una proteina de fusi6n sIL-15Ra-IL-2 producida en celulas CHO, y que comprendia todo el dominio extracelular de IL-15Ra unido a una molecula de IL-2 humana (usada como marcador para la purificaci6n), se uni6 a IL-15 de alta afinidad (kon = 3,7 105 M-1s-1; koff = 1,4 10-5 s-1, Kd = 3S pM). Una construcci6n similar que unia el dominio sushi de IL-15Ra de IL-2 humana, tambien se unia a IL-15 (Fig. 1 B), pero con una afinidad 10 veces menor, debido principalmente a una recuperaci6n mas rapida de la constante de disociaci6n (kon = 3,1 105 M-1s-1; koff = 1,3 10-4 s-1, Kd = 420 pM). Un dominio sushi soluble tambien se produjo en E. coli. Este sIL-15Ra-sushi se unia tambien a IL-15 con una afinidad menor (kon = 2,5 105 M-1s-1; koff = 3,S 10-4 s-1, Kd = 1,5 nM) (Fig. 1C). Estos resultados indican que el dominio sushi es el responsable de una parte importante de la afinidad para la uni6n de IL-15, pero que no reconstituye totalmente la uni6n de alta afinidad mostrada por el dominio extracelular de longitud completa. Tal y como se muestra en la Figura 1E, un dominio sushi soluble que se extendia a los 13 primeros aminoacidos codificados por el ex6n 3, denominado regi6n bisagra, mostraba una afinidad por la uni6n cuatro veces mayor, en comparaci6n con sIL-15RaSushi-IL-2, que contiene un dominio sushi sin extender, y una afinidad solo tres veces menor que la de IL-15Ra soluble de longitud completa, mientras que las tres estructura artificiales se produjeron en sistemas eucari6ticos que tenian capacidades similares de plegamiento. Estos resultados indican que el dominio sushi extendido hasta la regi6n bisagra, reconstituye casi en su totalidad la uni6n con alta afinidad que muestra el dominio extracelular de longitud completa. Los resultados del analisis de los sensorgramas, dando las constantes de afinidad para IL-15 (KD), calculadas para diversas proteinas solubles IL-15Ra, y la constante de la prueba estadistica (Chi 2), se muestran en la tabla 3 a continuaci6n:

Tabla 3:

KD (pM): Chi 2

sIL-15R-IL-2: 34 0,1S3

Sushi15-IL-2: 42S 0,159

Sushi15+: 102 0,443

Proteinas de IL-15Ra solubles inhiben la unian de IL-15 a IL-15Ra anelado a la membrana

En las tres formas solubles de IL-15Ra se someti6 a ensayo su capacidad para competir por la uni6n de IL-15 radioyodada, a IL-15Ra expresado por la linea celular humana TF-1, que expresaba tambien la cadena IL-15RV, pero no la cadena IL-15RW (Fig. 1D). Las tres proteinas inhibian completamente la uni6n de IL-15 a las celulas TF-1, con CI50

respectivas que eran similares a las Kds medidas por la tecnologia SPR: 100 pM (sIL-15R(-IL-2), 270 pM (sIL-15Rasushi-IL-2) y 1,3 nM (sIL-15Ra-sushi).

sIL-15Ra-sushi aumenta la proliferaeian eelular impulsada por IL-15 a traves del eomplejo IL-15Rl/y

Puesto que el dominio sushi soluble se producia facilmente en E. coli, con un alto rendimiento, se seleccion6 para todos los demas estudios. En primer lugar, se someti6 a ensayo sobre lineas celulares que expresan solo el complejo IL-15RW/V (la linea celular humana Mo-7, y la linea celular de rat6n 32DW que expresa la cadena IL-15RV end6gena de rat6n y la cadena IL-15RW humana transfectada). Como era de esperar, la linea celular Mo-7 proliferaba en respuesta a concentraciones nanomolares de rIL-15 o rIL-2 (Fig. 2A y 2B). Inesperadamente, la adici6n en el ensayo de una concentraci6n fija de sIL-15Ra-sushi (10 nM) aument6 la respuesta proliferativa que se desplaz6 a aproximadamente 4 veces mas inferior que las concentraciones de rIL-15. Por si mismo, sIL-15Ra-sushi no inducia una respuesta proliferativa. Sobre 32DW, se obtuvieron resultados similares con un desplazamiento de aproximadamente 10 veces. La especificidad se determin6 por el hecho de que sIL-15Ra-sushi no afectaba a la proliferaci6n impulsada por rIL-2 de las celulas Mo-7 (Fig. 2B). La Fig. 2C muestra que sIL-15Ra-sushi dependiente de la dosis, con una CI50 (3,5 nM) similar a su Kd para IL-15, potenciaba el efecto de una concentraci6n fija de rIL-15 (1 nM) que aislada, induce unicamente un pequeno efecto proliferativo.

Proteinas de fusian RLI e ILR son potentes induetores de la proliferaeian eelular a traves del eomplejo IL-15Rl/y

Con el fin de evaluar si el efecto sinergico de sushi sobre la bioactividad de IL-15 se podria transferir a una sola molecula, se elaboraron estructuras artificiales moleculares que codificaban IL-15 que se unia a las proteinas de fusi6n y el dominio sushi. Para las dos estructuras artificiales, se introdujo un enlazador flexible entre el extremo Cterminal de IL-15 y el extremo N-terminal del dominio sushi (ILR) o viceversa (RLI) (Fig. 2E). Los modelos moleculares que ilustran las estructuras de estas proteinas se muestran en la Fig. 2F. Estas dos proteinas de fusi6n fueron sometidas a ensayo para estudiar la proliferaci6n de las celulas Mo-7. Tal y como se muestra en la Fig. 2D, ambas proteinas inducian la inducci6n dependiente de la dosis de la proliferaci6n de las celulas Mo-7, con CE50 que eran similares (aproximadamente 25 pM) y mucho menores que las CE50 de rIL-15 aislada (3 nM), o de una mezcla equimolar de rIL-15 y sIL-15Ra-sushi (0,9 nM). Estos resultados confirman tambien el efecto sinergico de sIL-15Rasushi sobre la acci6n de IL-15, e indican que la estabilizaci6n del complejo IL-15: sIL-15Ra-sushi con un enlazador covalente, aumenta notablemente esta acci6n sinergica.

sIL-15Ra-sushi aumenta la preveneian indueida eon IL-15 de la apoptosis y RLI evita de forma efieaz la apoptosis eelular

Despues de la retirada de citocinas, la fracci6n de celulas Mo-7 apopt6ticas aument6 de 10% a S0% en 4S horas (Fig. 3A, graficos a y b). Cuando se anadia en el momento cero, rIL-15 (5 nM) reducia esta apoptosis al 70% (Fig. 3A, el grafico c). sIL-15Ra-sushi aislado (10 nM) no tuvo ningun efecto (Fig. 3Ab). Sin embargo, potenciaba marcadamente el efecto anti-apopt6tico de rIL-15 (35% de apoptosis a las 4S h) (Fig. 3A, el grafico c). El efecto sinergico de sIL-15Ra-sushi sobre la prevenci6n de la apoptosis de IL-15, se confirm6 por analisis de la cinetica (Fig. 3B) y por curvas de respuesta a la dosis (Fig. 3C). rIL-15 actuaba con una CI50 de aproximadamente 1,5 nM, un valor de acuerdo con la saturaci6n de los receptores de IL-15W/V. Esta CI50 era aproximadamente 10 veces menor (170 pM) en presencia de sIL-15Ra-sushi 10 nM. La proteina de fusi6n RLI impide intensamente la apoptosis (Fig. 3B). Sobre una base molar, que era incluso mas activa que la asociaci6n de IL-15: sIL-15Ra-sushi, con una CI50 de aproximadamente 40 pM (Fig. 3C).

sIL-15Ra-sushi inerementa la unian de IL-15 a eelulas Mo-7 y la proteina de fusian RLI se une y es internalizada en las eelulas Mo-7

Como era de esperar, las celulas Mo-7 se unen a IL-15 con una afinidad intermedia (Kd = 13,5 nM), con una capacidad maxima de uni6n de S00 sitios/celula (Fig. 4A). La adici6n de sIL-15Ra-sushi (10 nM) aument6 la afinidad de la uni6n de IL-15 (Kd = 7 nM) sin afectar significativamente a la capacidad maxima de la uni6n (11S0 sitios/celula). Cuando se utiliza la proteina de fusi6n RLI radio-yodada (Fig. 4B), encontramos que se unia a un numero similar de sitios de receptores (730 sitios/celula), y la afinidad de la uni6n (Kd = 7S0 pM) era significativamente mayor que la de IL-15. La Fig. 4C muestra que RLI se puede internalizar de forma eficaz y rapida. La fracci6n de radiactividad unida a las celulas cay6 en aproximadamente 20 minutos y estaba acompanada por un aumento concomitante de la radioactividad intracelular.

sIL-15Ra-sushi no afeeta a la proliferaeian eelular impulsada por IL-15, ni a la inhibieian de la apoptosis a traves del eomplejo de alta afinidad de IL-15Ra/l/y

La linea celular de linfoma humano Kit 225 expresa las cadenas a, W y V de IL-15R end6geno, y la linea celular TF1W humana expresa las cadenas IL-15Ra end6gena y V, mas la cadena IL-15RW humana transfectada. En consecuencia, estas lineas celulares proliferan como respuesta a bajas concentraciones, picomolares, de IL-15, tal y como se muestra en la Fig. 5A y 5B (CE50 = 19 pM y 21 pM, respectivamente). A diferencia de lo encontrado en las celulas Mo-7 o 32DW, la adici6n de concentraciones equimolares de sIL-15Ra-sushi a IL-15, no afectaba

significativamente a la curva de respuesta a la dosis de IL-15 en ambos tipos de celulas. La proteina de fusi6n ILR era tan activa como rIL-15 en las dos lineas celulares. La RLI tambien era tan activa como rIL-15 en las celulas Kit 225, pero era aproximadamente 16 veces mas eficaz (CE50 = 1,2 pM) que rIL-15 sobre las celulas TF-1W. Los efectos de sIL-15Ra-sushi y de RLI se analizaron adicionalmente sobre la apoptosis de celulas TF-1W, inducida por la privaci6n de citocinas. Los histogramas se muestran en la Figura 5C (graficos a, b, c y d), mientras que las cineticas y las curvas de respuesta a la dosis se muestran en la Figura 5D y 5E, respectivamente. La dosis de rIL-15 y el tiempo inhibian dependientemente la apoptosis de TF-1W. sIL-15Ra-sushi aislado no tenia ningun efecto y no cambi6 el efecto de IL-15. La proteina de fusi6n ILR era tan activa como rIL-15, mientras que RLI tenia un efecto protector que era aproximadamente tres veces superior al de rIL-15 (IC50 = 2,5 pM para RLI, en lugar de 6,5 pM para rIL-15 o sIL-15Ra-sushi mas rIL-15).

Unian de IL-15, sIL-15Ra-sushi y RLI a eelulas TF-1l

En tanto que IL-15Ra-sushi no afectaba a la proliferaci6n con IL-15 de TF-1W, se analiz6 su efecto sobre la uni6n de IL-15 que se habia analizado en un amplio rango de concentraciones (Figura 6A). El analisis de Scatchard de la curva de saturaci6n de la uni6n, indicaba la presencia de dos clases de sitios de uni6n de IL-15, compatibles con la presencia de un pequeno numero de sitios de uni6n de alta afinidad (complejos IL-15Ra/W/V, Kd = 22 pM, Bmax = 100 sitios/celula), mas cantidades mas elevadas de sitios de uni6n con afinidad intermedia (complejos IL-15RW/V, Kd = 30 nM, 2S00 sitios/celula). sIL-15Ra-sushi inducia un aumento de la uni6n de IL-15 que, segun el analisis de Scatchard, se debia principalmente a un aumento de la afinidad de la uni6n de IL-15 hacia el componente con afinidad intermedia (Kd = 3,5 nM). A fin de someter a ensayo mas especificamente el efecto de sIL-15Ra sobre el componente de alta afinidad, se analiz6 su efecto a bajas concentraciones de IL-15 marcada radiactivamente. Tal y como se muestra en la Figura 6B, sIL-15Ra-sushi, en concentraciones de hasta 25 nM, no afectaba a la uni6n de IL15 con bajas concentraciones de IL-15 (200 pM) que se dirigia principalmente a la diana del receptor de alta afinidad (Fig. 6B). La uni6n de sIL-15Ra-sushi radiomarcado a las celulas TF-1W (Fig. 6C), revel6 un componente especifico de la uni6n que era estrictamente dependiente de la presencia de rIL-15. En presencia de rIL-15 1 nM, la Kd que reflejaba la uni6n de sIL-15Ra-sushi, era de 3,5 nM, un valor compatible con su afinidad hacia IL-15, con una capacidad maxima de uni6n (3300 sitios/celula), compatible con el numero de sitios de uni6n con afinidad intermedia de IL-15. Tal y como se muestra en la Fig. 6D, sIL-15Ra-sushi radiomarcado se internaliz6 de manera eficaz. La proteina de fusi6n RLI radiomarcada tambien esta unida a celulas TF-1W (Fig. 6E). Un solo componente especifico de la uni6n se observ6 con una Kd de 250 pM y una capacidad maxima (4000 sitios/celula), una vez mas comparable con la cantidad de sitios de uni6n con afinidad intermedia de IL-15. Una vez unido, la RLI tambien se internaliz6 de manera eficaz (Fig. 6F).

Diseusian

Se ha mostrado anteriormente que la deleci6n del ex6n 2 de IL-15Ra humano, anula completamente la uni6n de IL15, lo que indica el papel prescindible del dominio sushi en el reconocimiento de citocinas (25). La presente invenci6n muestra que la eliminaci6n de la cola C-terminal (exones 3 a 5) de la parte extracelular de IL-15Ra (en el contexto de la proteina de fusi6n sIL-15Ra-sushi) da como resultado que su afinidad por la uni6n sea 10 veces menor hacia IL-15, tal y como se observa con SPR, y que su afinidad disminuya 3,5 veces, tal y como se observa en un ensayo de competici6n. En terminos termodinamicos, una afinidad 10 veces menor se calcul6 para que correspondiera a una perdida del 10% de la energia libre de la interacci6n de IL-15 con IL-15Ra. Asi, el dominio estructural N-terminal codificado por el ex6n 2 (dominio sushi) es portador de la mayoria (90%), pero no toda la capacidad de uni6n a IL-15. Datos recientes procedentes de nuestro laboratorio indican que el dominio codificado por el ex6n 3 tambien contribuye a la uni6n de IL-15. sIL-15Ra-sushi producido en E. coli tenia una afinidad que era 3 a 4 veces menor que la de sIL-15Ra-sushi-IL-2 producida en celulas CHO. Esta diferencia no puede explicarse por diferencias en el estado de glicosilaci6n de las dos proteinas, porque el dominio sushi no contiene ningun sitio potencial para glicosilaciones ligadas a N u O (2). Por lo tanto, probablemente es debido a diferencias en los plegamientos estructurales de las dos proteinas. Aunque compite con IL-15 para unirse a IL-15Ra de la membrana, sIL-15Ra-sushi se encontr6 que ejerce efectos agonistas mediante una mejora de la acci6n de IL-15 traves del complejo IL-15W/V. Estudios sobre celulas que expresan s6lo receptores de IL-15 con afinidad intermedia (Mo-7, 32DW) o receptores de IL-15 con afinidad alta e intermedia (TF-1W, Kit 225), mostraron que la acci6n agonista de sIL15Ra-sushi estaba dirigida especificamente al complejo IL-15RW/V: (i) no tenia ningun efecto en ausencia de IL-15,

(ii) se unia a celulas TF-1W en presencia de IL-15 con una unica clase de afinidad de los sitios de uni6n, cuya densidad era comparable a la de los sitios de uni6n con afinidad intermedia hacia IL-15, (iii) sobre celulas Mo-7 y TF1W, incrementaba la afinidad de IL-15 hacia el complejo IL-15RW/V, a la vez que no afectaba a la uni6n de IL-15 con el complejo de alta afinidad sobre celulas TF-1W, (iv) mejoraba la eficacia de la acci6n biol6gica de IL-15 (proliferaci6n, prevenci6n de la apoptosis) a traves de IL-15RW/V sobre celulas Mo-7, pero no tenia ningun efecto sobre los mismos efectos biol6gicos que mediaban a traves del receptor de alta afinidad sobre las celulas TF-1W.

La funcionalidad de esta acci6n agonista estaba apoyada ademas por el hecho de que sIL-15Ra-sushi, una vez unido, junto con IL-15 a IL-15RW/V sobre las celulas Mo-7, se internalizaba de forma eficaz en las celulas. Su potencia se reforz6 en el contexto de las proteinas de fusi6n IRL y RLI: (i) RLI se unia a IL-15RW/V con una afinidad casi 20 veces mejor que la de la propia IL-15. (Ii) La uni6n de RLI fue seguida por una rapida internalizaci6n de la proteina de fusi6n. (iii) Las proteinas de fusi6n RLI o ILR eran mucho mas potentes que IL-15 en los ensayos

funcionales. Las curvas de respuesta a la dosis de las dos proteinas de fusi6n sobre celulas Mo-7, eran comparables a las de IL-15 a traves del receptor de alta afinidad sobre celulas Kit 225 o celulas TF-1W, lo que indica que estas proteinas de fusi6n reconstituian casi completamente la respuesta de alta afinidad en celulas que s6lo expresan el receptor con afinidad intermedia. Los resultados indican por lo tanto, que sIL-15Ra-sushi e IL-15 forman un complejo que incrementa de forma cooperativa sus afinidades de uni6n hacia el receptor IL-15RW/V. Por el contrario, sIL-15Rasushi no es capaz de afectar a la uni6n de IL-15 y a la bioactividad, una vez que esta ultima ya esta asociada con el complejo del receptor de la membrana de alta afinidad. Aunque sIL-15Ra-sushi aun puede unirse a IL-15 que ya participa en este complejo de alta afinidad, sin embargo, no se puede excluir y se pudo someter a ensayo la disponibilidad de las celulas que expresan principalmente el receptor de alta afinidad, es decir, las celulas que expresan niveles similares de las tres subunidades del receptor.

Nuestro laboratorio ha mostrado anteriormente que sIL-15Ra expresado en celulas COS o producido de forma natural en celulas positivas para IL-15Ra, se comporta como un fuerte antagonista mediante la uni6n a IL-15 con alta afinidad (Kd = 166 pM) y la inhibici6n de la proliferaci6n inducida con IL-15 de celulas Kit 225, con concentraciones bajas (CI50 entre 3 y 10 pM) (19). Estos resultados estan en discrepancia con la presente invenci6n que muestra que sIL-15Ra-sushi no tiene ningun efecto sobre la proliferaci6n de las celulas Kit 225 o de las celulas TF-1W, y es agonista en celulas Mo-7. Otro resultado contrastante es un informe reciente que muestra que una mezcla de rIL-15 con una quimera homodimera de sIL-15Ra recombinante humano (que carece del ex6n 3)-Fc, podria inducir un efecto anti-apopt6tico en las celulas Mo-7, mientras que rIL-15 sola en la misma dosis, no tenia ningun efecto (26). En un intento de explicar estas diferencias de la acci6n, se propone un modelo en la Figura 7 de la presente solicitud de patente. En el contexto de la respuesta de IL-15 de alta afinidad, sIL-15Ra actua como un competidor de IL-15Ra de la membrana para el reclutamiento de IL-15 (Fig. 7A). El complejo de sIL-15Ra con IL-15, por el contrario, es capaz de asociarse con IL-15RW/V de la membrana y mejorar el efecto biol6gico de IL-15 (Fig. 7B). Para explicar la ausencia de efecto inhibidor de sIL-15Ra-sushi en el contexto del receptor de alta afinidad, hay dos alternativas (Fig. 7C). De acuerdo con la primera alternativa, sIL-15Ra-sushi tiene una afinidad menor hacia IL-15 (Kd = 1,5 nM, en este documento) que la que tiene sIL-15Ra (Kd = 160 pM) (19), y por lo tanto no es capaz de competir eficazmente con IL-15Ra de la membrana sobre celulas Kit 225 o celulas TF-1W. De acuerdo con la segunda alternativa, sIL15Ra-sushi puede competir con IL-15Ra de la membrana para unirse a IL-15 y formar complejos con IL-15RW/V de forma similar a los formados en las celulas Mo-7. Dichos complejos son menos eficaces, ya que necesitan mayores concentraciones de IL-15 para que se activen (CI50 = 750 pM en lugar de 20 pM para los receptores de alta afinidad, Figuras 2 y 5). Sin embargo, dado el hecho de que IL-15RW/V esta en exceso frente a IL-15Ra en las celulas Kit 225

o TF-1W, la menor eficacia de estos complejos se podia compensar con su mayor densidad (alrededor de 3.000 receptores de afinidad intermedia en lugar de 100 receptores de alta afinidad en las celulas TF-1W, cf. Fig. 6). Esto daria como resultado ningun cambio observable en terminos de efectos biol6gicos. Nuestra observaci6n de que sIL15Ra-sushi no afecta a la uni6n a IL-15 de alta afinidad en celulas TF-1W (Fig. 6 B) esta, sin embargo, a favor de la primera alternativa.

Las diferencias funcionales entre sIL-15Ra y sIL-15Ra-sushi indican que la cola C-terminal de sIL-15Ra tiene un papel crucial para competir con IL-15Ra de la membrana y, por lo tanto, para la acci6n antagonista de sIL-15Ra. Esta cola impediria la asociaci6n de IL-15Ra soluble con IL-15RW/V o permitiria dicha asociaci6n, pero dando como resultado una conformaci6n inadecuada de IL-15RW/V para su funcionamiento. Un mecanismo similar ha sido propuesto en el caso de una cadena V comun soluble (27). La actividad inhibidora de esta cadena V soluble (que se corresponde a toda la parte extracelular de la cadena V) fue anulada por la eliminaci6n de su parte C-terminal o por mutaciones del motivo WSXWS, dos regiones que no participan en la uni6n a citocinas. Los efectos agonistas de sushi son una reminiscencia de los efectos agonistas descritos para receptores solubles de la extensa familia de citocinas IL-6 (es decir, sIL-6R, sIL-11R, sCNTFR y la subunidad IL-12p40) (2S). Sin embargo, tal acci6n agonista en el caso de IL-15R no se podia prever, ya que todos los receptores solubles descritos hasta ahora, de la familia Vc, (sIL-2Ra, sIL-2RW, sIL-4R), y sIL-15Ra mismo, se comportan como antagonistas de citocinas (19,29). Por ello, los presentes resultados identifican el dominio sushi soluble de IL-15Ra como un agonista inesperado y eficaz dentro de esta familia.

El concepto de transenalizaci6n de citocinas se ha utilizado en primer lugar en el caso de IL-6, en donde IL-6R soluble ha mostrado mejorar la sensibilidad de las celulas sensibles a IL-6, frente a la acci6n de IL-6 y hacer que las celulas expresen gp130, pero no IL-6R de la membrana sensible a IL-6 (30). Este concepto se ha extendido a otros miembros de la familia de citocinas gp130 (IL-11R, CNTFR, CLC) (31-34). En el caso de IL-15, se ha mostrado un mecanismo de transpresentaci6n de citocinas (12), en el que la IL-15 producida por monocitos/celulas dendriticas se asocia a IL-15Ra de la membrana, expresado por las mismas celulas y puede estimular la proliferaci6n de celulas presenciales IL-15RW/V+IL -15Ra-. Informes recientes han sugerido que la transpresentaci6n es un mecanismo dominante in vivo, que requiere la expresi6n de IL-15 e IL-15Ra por las mismas celulas (13,14, 35, 36). Tiene cierta similitud con el concepto transenalizaci6n, en el que el complejo IL-15/IL-15Ra transpresentado puede sensibilizar las celulas IL-15RW/V+IL -15Ra-,frente a concentraciones fisiol6gicas de IL-15. En este sentido, IL-15Ra de la membrana actua como un agonista de la acci6n de IL-15, aumentando su avidez por el complejo IL-15RW/V y la eficacia de la senalizaci6n (12). Nuestros datos muestran que sIL-15Ra-sushi se comporta de manera similar y sensibiliza las celulas IL-15RW/V+ IL-15Ra-a la acci6n de IL-15. Esto sugiere que el dominio sushi de IL-15Ra de la membrana es crucial para la transpresentaci6n. Hemos mostrado que sIL-15Ra producido por celulas que expresan

IL-15Ra y que incluye toda la parte extracelular de IL-15Ra, es inhibidor de la acci6n de IL-15 (19). Es probable que constituya mecanismo de retroalimentaci6n negativa que limita los efectos biol6gicos de IL-15. En contraste, sIL15Ra-sushi descrito en este estudio, muestra un efecto agonista. Si dicha sushi soluble es generada por celulas que expresan IL-15Ra, esta podria participar en el mecanismo de transpresentaci6n de IL-15. La existencia de tales dominios sushi solubles producidos de forma natural, aun no se ha descrito, pero se apoya en el hecho de que (i) se han descrito diferentes isoformas de IL-15Ra de la membrana, incluyendo algunas que carecen de la cola (codificada por los exones 3 a 5), que unen el dominio sushi con el dominio transmembranal (3,25,37), y (ii) se ha demostrado la generaci6n de hom6logos solubles para algunas de ellas, mediante eliminaci6n (19). Por lo tanto, sIL15Ra y sIL-15Ra-sushi podrian tener efectos reguladores opuestos, y de este modo, participar ambos en el ajuste de la magnitud y la duraci6n de la acci6n biol6gica de IL-15.

La presente invenci6n tambien muestra que el uso de un enlazador flexible para producir una proteina de fusi6n tal como ILR o RLI, es un enfoque valido en el caso de IL-15. Se ha generado un modelo molecular de IL-15 con el dominio sushi (Fig. 2) que ha ayudado a disenar un enlazador flexible que permite enlazar el extremo C-terminal de IL-15 con el extremo N-terminal de sushi (proteina de fusi6n ILR) o viceversa (proteina de fusi6n RLI). El modelo tambien predijo que el enlazador no enmascara las areas de IL-15 que se han mostrado estar implicadas en la uni6n a las cadenas IL-15RW y V. Tal y como se ha mencionado anteriormente, las dos proteinas de fusi6n han resultado ser mucho mas activas que IL-15 y la combinaci6n de IL-15 con sIL-15Ra-sushi, en activar el complejo IL-15RW/V en celulas Mo-7. En las celulas TF-1W, y en el contexto de la activaci6n del receptor de alta afinidad, la proteina de fusi6n ILR era tan activa como IL-15 y la proteina de fusi6n RLI era incluso 10 veces mas activa, con una CE50 tan baja como 1,2 pM, para inducir la proliferaci6n celular. Debido a su alta actividad, estas proteinas de fusi6n hiper-IL15 parece que constituyen unas herramientas valiosas para la expansi6n de subgrupos de linfocitos, y especialmente aquellos (celulas NK, linfocitos T CDS de memoria) para los que se ha sugerido que la transpresentaci6n de IL-15 es el procedimiento de activaci6n fisiol6gica (13). Por lo tanto, son moleculas muy eficaces en estrategias terapeuticas destinadas a curar pacientes con cancer, inmunodeficiencias o enfermedades infecciosas.

Refereneias bibliografieas

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Tabla 4: lista de SEQ ID NO: hIL-15Ralfa = IL-15Ralfa humano hIL-2 = IL-2 humana

SEQ ID NO:

1: ADNc de hIL-15Ralfa (1610 pb)

2: CDS de hIL-15Ralfa (S3..SS3 de SEQ ID NO: 1)

3: Proteina de hIL-15Ralfa (267 aa)

4: CDS del peptido senal de hIL-15Ralfa (S3..172 de SEQ ID NO:1)

5: Peptido senal de hIL-15Ralfa (1..30 de SEQ ID NO:3)

6: CDS de mat peptide de hIL-15Ralfa (173..SS3 de SEQ ID NO:1)

7: mat peptide de hIL-15Ralfa (31..267 de SEQ ID NO: 3)

S: Ex6n 1 de hIL-15Ralfa (1..170 de SEQ ID NO: 1)

9: Ex6n 2 de hIL-15Ralfa (171..365 de SEQ ID NO: 1)

10: Ex6n 3 de hIL-15Ralfa (366..464 de SEQ ID NO: 1)

11: Ex6n 4 de hIL-15Ralfa (465..665 de SEQ ID NO: 1)

12: Ex6n 5 de hIL-15Ralfa (666..69S de SEQ ID NO: 1)

13: CDS del dominio sushi de hIL-15Ralfa; desde C1 hasta C4 (179..361 de SEQ ID NO: 1)

14: Dominio sushi de hIL-15Ralfa; desde C1 hasta C4 (33..93 de SEQ ID NO: 3)

15: CDS de [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa] (173..361 de SEQ ID NO: 1)

16: [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa] (31..93 de SEQ ID NO: 3)

17: CDS de [t + dominio sushi de hIL-15Ralfa] (176..361 de SEQ ID NO: 1)

1S: [t + dominio sushi de hIL-15Ralfa] (32..93 de SEQ ID NO: 3)

19: CDS de la regi6n bisagra de hIL15-Ralfa (362..403 de SEQ ID NO: 1)

20: Regi6n bisagra de hIL15-Ralfa (94..107 de SEQ ID NO: 3; irdpalvhqrpapp)

21: CDS de [dominio sushi de hIL-15Ralfa + i] (179..364 de SEQ ID NO: 1)

22: [dominio sushi de hIL-15Ralfa + i] (33..94 de SEQ ID NO: 3)

23: CDS de [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i] (173..364 de SEQ ID NO: 1)

24: [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i] (31..94 de SEQ ID NO: 3)

25: CDS de [t + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i] (176..364 de SEQ ID NO: 1)

26: [t + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i] (32..94 de SEQ ID NO: 3)

27: CDS de [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i + rd] (173..370 de SEQ ID NO: 1)

2S: [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i + rd] (31..96 de SEQ ID NO: 3)

29: CDS de [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i + rd + 11 aa codificados por el ex6n 3] (173..403 de SEQ ID NO: 1)

30: [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i + rd + 11 aa codificados por el ex6n 3] (31..107 de SEQ ID NO: 3)

31: CDS de la regi6n rica en sitios de glicosilaci6n de hIL-15Ralfa (404..709 de SEQ ID NO: 1)

32: Regi6n rica en sitios de glicosilaci6n de hIL-15Ralfa (10S..209 de SEQ ID NO: 3)

33: Secuencia que codifica la parte codificada por el ex6n 3 de la regi6n rica en sitios glicosilaci6n de IL-15Ralfa humano (404..464 de SEQ ID NO: 1)

34: Parte codificada por el ex6n 3 de la regi6n rica en sitios de glicosilaci6n de IL-15Ralfa humano (10S..127 de SEQ ID NO: 3)

35: CDS de [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i + todos los aa codificados por el ex6n3] (173..464 de SEQ ID NO: 1)

36: [it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i + todos los aa codificados por el ex6n3] (31..127 de SEQ ID NO: 3)

37: CDS de un fragmento de un hIL-15Ralfa extracelular soluble (S3..697 de SEQ ID NO: 1)

3S: Fragmento de un hIL-15Ralfa extracelular soluble (1..205 de SEQ ID NO: 3)

39: CDS de un hIL-15Ralfa extracelular soluble (S3..709 de SEQ ID NO: 1)

40: Un hIL-15Ralfa extracelular soluble (1..209 de SEQ ID NO: 3)

41: CDS de un fragmento de un hIL-15Ralfa extracelular soluble, con peptido senal delecionado (173..697 de SEQ ID NO: 1)

42: Fragmento de un hIL-15Ralfa extracelular soluble, con peptido senal delecionado (31..205 de SEQ ID NO: 3)

43: CDS de un hIL-15Ralfa extracelular soluble, con peptido senal delecionado (173..709 de SEQ ID NO: 1)

44: Un hIL-15Ralfa extracelular soluble, con peptido senal delecionado (31..209 de SEQ ID NO: 3)

45: ADNc de hIL-15 (1496 pb)

46: Proteina precursora de hIL-15 (162 aa)

47: CDS de hIL-15 madura de tipo silvestre (517..S5S de SEQ ID NO: 45)

4S: hIL-15 madura de tipo silvestre (49..162 de SEQ ID NO: 46)

49: Secuencia de acido nucleico del enlazador 20

50: Secuencia de aminoacidos del enlazador 20

51: Secuencia de acido nucleico del enlazador 26

52: Secuencia de aminoacidos del enlazador 26

53: Secuencia de acido nucleico del marcador Flag y del sitio de uni6n a Xa

54: Secuencia de aminoacidos del marcador Flag y del sitio de uni6n a Xa

55: Secuencia de acido nucleico del marcador Flag y del sitio de uni6n a Xa

56: Secuencia de aminoacidos del marcador Flag y del sitio de uni6n a Xa

57: CDS del peptido senal de la preprolactina bovina

5S: Peptido senal de la preprolactina bovina

59: Secuencia de acido nucleico de la proteina de fusi6n RLI

60: Proteina de fusi6n RLI

61: Secuencia de acido nucleico de la proteina de fusi6n ILR

62: Proteina de fusi6n ILR

63: ADNc de hIL-2 (1047 pb)

64: CDS de hIL-2 madura (355..753 de SEQ ID NO: 63)

65: hIL-2 madura (133 aa)

66: Secuencia de acido nucleico de un fragmento de hIL-15Ralfa que contiene sushi, marcado con IL-2 [peptido senal de hIL-15Ralfa + it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i + rd + enlazador lq + hIL-2]

67: Fragmento de hIL-15Ralfa que contiene sushi, marcado con IL-2 [peptido senal de hIL15Ralfa + it + dominio sushi de hIL-15Ralfa + i + rd + enlazador lq + hIL-2]

6S: Secuencia de acido nucleico de un fragmento de hIL-15Ralfa extracelular, marcado con IL-2 [peptido senal de hIL-15Ralfa + fragmento de la regi6n extracelular de hIL-15Ralfa + enlazador lq + hIL-2]

69: Fragmento de hIL-15Ralfa extracelular, marcado con IL-2 [peptido senal de hIL-15Ralfa + fragmento de la regi6n extracelular de hIL-15Ralfa + enlazador lq + hIL-2]

70: Cebador directo de la cadena beta (GAGAGACTGGATGGACCC)

71: Cebador inverso de la cadena beta (AAGAAACTAACTCTTAAAGAGGC)

72: ADNc de IL-15Ralfa de rat6n (Mus musculus) (792 pb)

73: Proteina de IL-15Ralfa de rat6n (263 aa)

74: Regi6n extracelular de IL-15Ralfa de rat6n (1..205 de SEQ ID NO: 73)

75: Dominio sushi de IL-15Ralfa de rat6n (36..96 de SEQ ID NO: 73)

76: Regi6n bisagra de IL-15Ralfa de rat6n (97..109 de SEQ ID NO: 73)

77: Regi6n de la cola de IL-15Ralfa de rat6n (110..205 de SEQ ID NO: 73)

7S: ADNc de IL-15Ralfa de chimpance (Pan troglodytes) (1035 pb)

79: Proteina de IL-15Ralfa de chimpance (344 aa)

S0: Regi6n extracelular de IL-15Ralfa de chimpance (1..2S6 de SEQ ID NO: 79)

S1: Dominio sushi de IL-15Ralfa de chimpance (13..73 de SEQ ID NO: 79)

S2: Regi6n bisagra de IL-15Ralfa de chimpance (74..SS de SEQ ID NO: 79)

S3: Regi6n de la cola de IL-15Ralfa de chimpance (S9..2S6 de SEQ ID NO: 79)

S4: ADNc de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (765 pb)

S5: Proteina de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (254 aa)

S6: Regi6n extracelular de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (1..1S2 de SEQ ID NO: S5)

S7: Dominio sushi de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (24..S4 de SEQ ID NO: S5)

SS: Regi6n bisagra de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (S5..96 de SEQ ID NO: S5)

S9: Regi6n de la cola de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus (97..1S2 de SEQ ID NO: S5)

90: Ex6n 3 de IL-15Ralfa de Mus musculus

91: Ex6n 3 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes

92: Ex6n 3 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus

93: Parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa humano

94: Parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa de Mus musculus

95: Parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes

96: Parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus

97: Parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa de Mus musculus

9S: Parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa Pan troglodytes

99: Parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus

100: Cebador directo para la cadena gamma (5' GAAGAGCAAG CGCCATGTTG 3')

101: Cebador inverso para la cadena gamma (5' TCAGGTTTCAGGCTTTAGGG 3')

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuesto, para estimular la via de senalizaci6n de IL-15Rbeta/gamma, para inducir con ello y/o estimular la activaci6n y/o la proliferaci6n de las celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma, tales como celulas NK y/o linfocitos T, caracterizado porque comprende al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, directa o indirectamente

5 ligada por covalencia a por lo menos un polipeptido que contiene el dominio de sushi de la regi6n extracelular de una IL-15Ralfa, en donde:

-

dicha al menos una entidad que se une IL-15Rbeta/gamma es IL-15, o es un fragmento, un mimetico o un agonista de IL-15, en donde dicho fragmento, mimetico o agonista de IL-15, tiene una afinidad para unirse a IL-15Rbeta/gamma que no es significativamente inferior a la de una IL-15 natural, y

10 -la secuencia de aminoacidos de dicho al menos un polipeptido que contiene sushi:

•

es la secuencia de aminoacidos de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, o

•

es la secuencia de aminoacidos de un fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, en donde dicho fragmento conserva el dominio sushi de dicha regi6n extracelular de IL-15Ralfa, en donde dicho dominio sushi se define como el que comienza en el primer residuo de cisteina codificado por el ex6n 2 (C1), y

15 termina en el cuarto residuo de cisteina codificado por el ex6n 2 (C4), estando los residuos C1 y C4 ambos incluidos en dicho dominio sushi, o

• es una secuencia variante de aminoacidos que tiene una identidad de al menos S5% con la secuencia de aminoacidos de tal regi6n extracelular de IL-15Ralfa, o de un fragmento tal de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, en toda la longitud de esta secuencia de aminoacidos de la regi6n extracelular o del

20 fragmento de la regi6n extracelular, con la condici6n de que cada uno de los cuatro residuos de cisteina (C1, C2, C3 y C4) de dicho dominio sushi se hayan conservado en dicha secuencia variante.
2.

Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 1, caracterizado porque dicho IL-15Ralfa es un IL-15Ralfa humano, o un IL-15Ralfa de mono, o un IL-15Ralfa de murido, o un IL-15Ralfa de conejo, o un IL-15Ralfa de cerdo.
3.

Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque la secuencia

25 de aminoacidos de dicha regi6n extracelular de IL-15Ralfa es la secuencia de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 40, la regi6n extracelular de IL-15Ralfa de Pan troglodytes de SEQ ID NO: S0, la regi6n extracelular de IL-15Ralfa de Mus musculus de SEQ ID NO: 74, o la regi6n extracelular de IL-15Ralfa de SEQ ID NO: S6.
4. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la secuencia

30 de aminoacidos de dicho dominio sushi es la secuencia del dominio sushi de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 14, del dominio sushi de IL-15Ralfa de Pan troglodytes de SEQ ID NO: S1, del dominio sushi de IL-15Ralfa de Mus musculus de SEQ ID NO: 75, o del dominio sushi de IL-15Ralfa de SEQ ID NO: S7.
5. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa comprende:

35 -la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa que esta codificada por los exones 2 y 3 de dicho IL-15Ralfa,

o de

-

un fragmento de tal parte codificada por el ex6n 2-3, que ha conservado dicho dominio sushi.
6. Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 5, caracterizado porque dicha secuencia codificada por el ex6n 2 es:

40 -la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa humano extracelular, que es la secuencia de SEQ ID NO: 24,

-

la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa extracelular de Pan troglodytes, que es la secuencia de SEQ ID NO: 9S,

-

la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa extracelular de Mus musculus, que es la secuencia de SEQ ID NO: 97,

45 -la parte codificada por el ex6n 2 de IL-15Ralfa extracelular de Rattus norvegicus, que es la secuencia de SEQ ID NO: 99.
7. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, caracterizado porque dicha secuencia codificada por el ex6n 3 es:

-

la parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa humano, que es la secuencia de SEQ ID NO: 93,

-

la parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa de Pan troglodytes, que es la secuencia de SEQ ID NO: 95, -la parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa de Mus musculus, que es la secuencia de SEQ ID NO: 94, -la parte codificada por el ex6n 3 de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus, que es la secuencia de SEQ ID NO:
96. 5 S. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque dicho

fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa consiste en: -la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa que esta codificada por el ex6n 2 de dicho IL-15Ralfa, o -un fragmento de tal parte codificada por el ex6n 2 que ha conservado dicho dominio sushi.
9. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque dicho

10 fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa comprende la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa que esta codificada por el ex6n 2 de dicho IL-15Ralfa, y comprende ademas al menos un aminoacido de la secuencia codificada por el ex6n 3 de dicho IL-15Ralfa.
10. Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 9, caracterizado porque dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa consiste en:

15 -la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa que esta codificada por los exones 2 y 3 de dicho IL-15Ralfa, o

-

la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa que esta codificada por el ex6n 2 de dicho IL-15Ralfa, y un fragmento de la parte de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa, que esta codificada por el ex6n 3 de dicho IL15Ralfa.

20 11. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa es un fragmento de IL-15Ralfa que comprende adicionalmente:

- la regi6n bisagra de dicho IL-15Ralfa o -un fragmento de tal regi6n bisagra, en donde la secuencia de aminoacidos de dicha regi6n bisagra de IL-15Ralfa es:

25 -la secuencia bisagra de IL-15Ralfa humano de SEQ ID NO: 20, -la secuencia bisagra de IL-15Ralfa de Pan troglodytes de SEQ ID NO: S2, -la secuencia bisagra de IL-15Ralfa de Mus musculus de SEQ ID NO: 76, o -la secuencia bisagra de IL-15Ralfa de Rattus norvegicus de SEQ ID NO: SS.
12. Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 11, caracterizado porque dicho al menos polipeptido que 30 contiene sushi es el polipeptido de SEQ ID NO: 30.
13.

Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 11, caracterizado porque la secuencia de aminoacidos de dicho fragmento de la regi6n de bisagra de IL-15Ralfa humano comprende i o ir o ird.
14.

Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 13, caracterizado porque dicho al menos un polipeptido que contiene sushi es el polipeptido de SEQ ID NO: 22, 24, 26, 2S.

35 15. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 9-11, caracterizado porque dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa humano comprende adicionalmente:

-

la parte codificada por el ex6n 3 de la regi6n rica en sitios de glicosilaci6n de IL-15Ralfa humano, siendo dicha parte codificada por el ex6n 3, la secuencia de SEQ ID NO: 34, o

-

un fragmento de SEQ ID NO: 34.

40 16. Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 15, caracterizado porque dicho al menos un polipeptido que contiene sushi es el polipeptido de SEQ ID NO: 36.
17. Compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 5-7, 9-11, 13, 15, caracterizado porque dicho fragmento de la regi6n extracelular de IL-15Ralfa comprende adicionalmente:

-

una parte de IL-15Ralfa extracelular que esta codificada por uno o varios exones extracelulares de IL

15Ralfaque distintos de los exones 1, 2, 3, o

-

un fragmento de tal parte.

1S. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque comprende un peptido senal, ligado directa o indirectamente a dicho al menos un polipeptido que contiene sushi o a dicha al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma.
19.

Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-1S, caracterizado porque dicha IL-15 es una IL-15 humana.
20.

Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 19, caracterizado porque la secuencia de aminoacidos de dicha IL-15 humana es la secuencia de SEQ ID NO: 4S.
21.

Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque dicha al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, no se une a IL-2Ralfa.
22.

Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque dicho al menos un polipeptido que contiene sushi esta ligado directamente a dicha al menos una entidad que se une a IL15Rbeta/gamma.
23.

Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado porque dicho al menos un polipeptido que contiene sushi esta ligado indirectamente a dicha al menos una entidad que se une a IL15Rbeta/gamma.
24.

Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 23, caracterizado porque dicho al menos un polipeptido que contiene sushi esta ligado a dicha al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma, a traves de un enlazador peptidico que comprende al menos uno, pero menos de 30 aminoacidos.
25.

Compuesto de acuerdo con la reivindicaci6n 24, caracterizado porque la secuencia de aminoacidos de dicho enlazador peptidico es la secuencia de SEQ ID NO: 50 o NO: 52.
26.

Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizado porque dicho al menos un polipeptido que contiene sushi esta en una posici6n N-terminal en relaci6n a dicha al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma.
27.

Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizado porque dicho al menos un polipeptido que contiene sushi esta en una posici6n C-terminal en relaci6n a dicha al menos una entidad que se une a IL-15Rbeta/gamma.

2S. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 9-12, 1S-21, 23-25, 26, caracterizado porque su secuencia de aminoacidos es la secuencia de SEQ ID NO: 60.
29.

Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, 9-12, 1S-21, 23-25, 27, caracterizado porque su secuencia de aminoacidos es la secuencia de SEQ ID NO: 62.
30.

Acido nucleico que codifica un compuesto que es para estimular la via de senalizaci6n de IL15Rbeta/gamma, para inducir de este modo y/o estimular la activaci6n y/o la proliferaci6n de celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma, tales como celulas NK y/o linfocitos T, caracterizado porque codifica el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-29, de acuerdo con el c6digo genetico universal, teniendo debidamente en cuenta su degeneraci6n.
31.

Vector, caracterizado porque comprende al menos un acido nucleico de la reivindicaci6n 30.
32.

Celula hospedadora, transformada o transfectada con un acido nucleico de la reivindicaci6n 30, y/o con un vector de la reivindicaci6n 31.
33.

Celula hospedadora de acuerdo con la reivindicaci6n 32, caracterizada porque es una celula de mamifero.
34.

Adyuvante para composici6n inmunoterapeutica, caracterizado porque comprende al menos un elemento entre los siguientes elementos:

-

un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-29,

-

un acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 30,

-

un vector de acuerdo con la reivindicaci6n 31,

-

una celula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32-33.
35. Adyuvante de acuerdo con la reivindicaci6n 34, caracterizado porque mejora la respuesta de memoria de CDS.
36. Composici6n farmaceutica, caracterizada porque comprende al menos un elemento entre los siguientes elementos: 5 -un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-29, -un acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 30,

-un vector de acuerdo con la reivindicaci6n 31, -una celula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32-33.
37. Farmaco, caracterizado porque comprende al menos un elemento entre los siguientes elementos: 10 -un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-29,

-

un acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 30,

-

un vector de acuerdo con la reivindicaci6n 31,

-

una celula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32-33.

3S. Farmaco de acuerdo con la reivindicaci6n 37, caracterizado porque se trata de una composici6n de vacuna 15 preventiva y/o paliativa y/o terapeutica.
39.

Farmaco de acuerdo con la reivindicaci6n 37 o 3S, caracterizado porque esta destinado a la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento del desarrollo o de la presencia de un tumor.
40.

Farmaco de acuerdo con la reivindicaci6n 39, caracterizado porque comprende adicionalmente al menos un antigeno tumoral.

20 41. Farmaco de acuerdo con la reivindicaci6n 37 o 3S, caracterizado porque esta destinado a la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento de una enfermedad infecciosa.
42. Farmaco de acuerdo con la reivindicaci6n 37 o 3S, caracterizado porque esta destinado a la prevenci6n y/o la paliaci6n y/o el tratamiento de una inmunodeficiencia.
43. Farmaco de acuerdo con la reivindicaci6n 37 o 3S, caracterizado porque esta destinado a la prevenci6n y/o 25 la paliaci6n y/o el tratamiento de una inmunodeficiencia combinada grave, ligada al cromosoma X.
44. Procedimiento in vitro para inducir y/o estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de celulas positivas para IL15Rbeta/gamma, caracterizado porque comprende:

-

proporcionar una muestra celular que comprende celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma, -poner en contacto dicha muestra con al menos uno de los siguientes elementos:

30 -un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-29, -un acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 30, -un vector de acuerdo con la reivindicaci6n 31,

-

una celula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32-33,

durante un periodo de tiempo y bajo condiciones ambientales que permitan a dicha puesta en contacto inducir y/o 35 estimular la proliferaci6n y/o la activaci6n de dichas celulas positivas para IL-15Rbeta/gamma.
45. Procedimiento in vitro para la producci6n de celulas NK y/o linfocitos T activados, caracterizado porque comprende:

-

proporcionar una muestra celular que comprende celulas NK y/o linfocitos T en reposo,

-

poner en contacto dicha muestra con al menos uno de los siguientes elementos: 40 -un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-29, -un acido nucleico de acuerdo con la reivindicaci6n 30,

-

un vector de acuerdo con la reivindicaci6n 31,

-

una celula hospedadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32-33,

durante un periodo de tiempo y bajo condiciones ambientales que permitan a dicha puesta en contacto inducir la

activaci6n de dichas celulas NK y/o linfocitos T en reposo, comprendidos en dicha muestra.