CN116134140A - 长效作用的il-15及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供了IL‑15变体和包含IL‑15变体的异二聚体IL‑15/IL‑15Rα‑Fc融合蛋白、其产生方法及其用途。所提供的IL‑15变体和融合蛋白可作为治疗癌症的有效药剂。

Description

长效作用的IL-15及其用途

交叉引用

本申请要求2020年9月1日提交的国际专利申请PCT/CN2020/112834的优先权，其全部内容通过提述并入本文。

序列表

本申请包含序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请一般涉及包含IL-15的融合蛋白。更具体地说，本申请涉及IL-15-Fc融合蛋白、异二聚体IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白、制备所述蛋白的方法以及其用途。

背景技术

以抗PD-(L)1疗法为代表的癌症免疫疗法已被批准用于多种类型的癌症，并给癌症患者带来了巨大的临床益处。然而，许多患者对获批的PD-(L)1单一疗法不应答。基于细胞因子的疗法可以作为单一或组合治疗剂克服这种治疗障碍并满足巨大的未满足的医疗需求。

然而，尽管重组促炎症细胞因子(IL-2、IFNα等)被批准用于癌症治疗已有数十年，但其疗效往往受到限制，主要原因是半衰期短和毒性大。IL-15是一种对抗病毒和抗肿瘤免疫很重要的IL-2家族促炎症细胞因子，参与许多免疫细胞(尤其是杀伤性T/NK细胞)的增殖和生存，而不诱导免疫抑制性Treg的活化，也不诱导T/NK细胞死亡。IL-15在单核细胞和树突细胞中产生，主要与存在于同一细胞中的IL-15受体α(IL-15Rα)一起以膜结合的异二聚体复合物的形式呈现。它的作用是通过IL-15/IL-15Rα复合物向表达IL-2Rβ和γ受体的NK细胞和CD8+T细胞的反式呈递而实现的。

IL-15已在多种临床试验中得到测试。然而，由于半衰期短和毒性大，它在癌症免疫治疗中的潜力仍然受到很大限制。仍然需要开发新的IL-15变体、缀合物、融合蛋白或复合物来提高治疗效果。

本公开提供了具有增强的PK/PD谱的效力降低的IL-15变体，其可作为一种新型的免疫治疗剂，特别是与其他治疗方案相结合时具有更好的抗肿瘤疗效。

发明概述

广义而言，本公开的这些和其他目标针对提供具有改善功效的蛋白的化合物、方法、组合物和制品。本公开提供的益处广泛地适用于治疗和诊断领域，并且可以与能够与各种靶标反应的抗体联合使用。

在某些方面，本公开提供了IL-15变体，其中与野生型IL-15蛋白相比，IL-15变体在刺激免疫细胞增殖方面的效力降低。在一些实施方案中，IL-15变体在刺激例如NK、CD8+T细胞和/或CD45+淋巴细胞的增殖方面的效力降低。在一些实施方案中，IL-15变体具有与SEQ ID No:1相比包括一个或多个取代的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文公开的IL-15变体具有与SEQ ID No:1相比包括一个或多个突变的氨基酸序列，其中突变可发生在SEQ ID No:1所示氨基酸序列的第7、8、9、10、11、30、32、61、64、65、66、68、69、108和/或112位。突变可以是取代或***一个或多个氨基酸。具体来说，所述一个或多个突变可以选自下组：

(a)S7N、S7Q、S7A、S7D、S7E、S7F、S7G、S7H、S7I、S7K、S7L、S7M、S7P、S7R、S7T、S7V、S7W和S7Y取代；

(b)D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30E、D30Q、H32N、D61Q和N65Q取代；

(c)I68A、I68V、I68F、I68G、I68K、I68R、I68L、I68M、I68Q、I68D、I68E、I68H、I68N、I68P、I68S、I68T、I68W和I68Y取代；

(d)L69A、L69V、L69D、L69E、L69F、L69G、L69H、L69I、L69K、L69M、L69N、L69P、L69Q、L69R、L69S、L69T、L69W和L69Y取代；

(e)Q108N和N112Q取代；

(f)在螺旋A的氨基酸序列中的***，其中螺旋A的氨基酸序列由SEQ ID No:1的第1至17位组成；和

(g)在螺旋C的氨基酸序列中的***，其中螺旋C的氨基酸序列由SEQ ID No:1的第57至77位的氨基酸组成。

在一些进一步的实施方案中，所述***是***一个氨基酸，它破坏了螺旋A和IL-2Rβ之间、螺旋A和IL-2Rγ之间或螺旋C和IL-2Rβ之间形成的氢键、盐桥和/或范德华相互作用。具体来说，***发生在I6和S7之间，S7和D8之间，D8和L9之间，L9和K10之间，K10和K11之间，K11和I12之间，H60和D61之间，D61和T62之间，E64和N65之间，N65和L66之间，I67和I68之间，I68和L69之间，和/或L69和A70之间。

本文公开的***的氨基酸可以包括非极性氨基酸如Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Phe、Pro，极性氨基酸如Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln，带电荷氨基酸如Asp、Glu、Lys、Arg、His，以及非天然的氨基酸如合成氨基酸。

优选地，***的氨基酸是Ala或Gly。

在一些实施方案中，与SEQ ID No:1相比，IL-15变体包含包括一个或多个选自下组的取代的氨基酸序列：S7N、S7Q、D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30E、D30Q、H32N、D61Q、N65Q、I68A、I68V、I68F、I68G、I68K、I68R、L69A、L69V、Q108N和N112Q。

在一些具体的实施方案中，IL-15变体包含包括一个或多个选自下组的取代的氨基酸序列：S7N、D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30Q、D61Q、N65Q、I68A、I68F、I68G、I68K、I68R、L69A、L69V和Q108N。例如，IL-15变体可以包含以下氨基酸序列，其包括一个选自下组的取代：S7N、D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30Q、D61Q、N65Q、I68A、I68F、I68G、I68K、I68R、L69A、L69V和Q108N。另外，IL-15变体可以包含以下氨基酸序列，其包括至少两个(如两个、三个或更多个)选自下组的取代：S7N、D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30Q、D61Q、N65Q、I68A、I68F、I68G、I68K、I68R、L69A、L69V和Q108N。

在一些实施方案中，本文所公开的IL-15变体包括两个或更多个选自S7N、K10Q、I68A和L69V的取代。在一些实施方案中，本文公开的IL-15变体包括S7N+K10Q+I68A、K10Q+I68A+L69V、S7N+K10Q+L69V、S7N+I68A+L69V、S7N+K10Q、S7N+I68A、S7N+L69V、K10Q+I68A、K10Q+L69V或I68A+L69V取代。

在一些实施方案中，刺激NK和/或CD8+T细胞增殖的效力是通过FACS在增殖实验中测量的。该增殖测定可使用Ki-67和/或pSTAT5等作为标志物或指标。

在某些方面，本公开提供了融合蛋白，其包含本文公开的IL-15变体可操作地连接于非IL-15部分。在一些实施方案中，所述非IL-15部分是抗原结合结构域或Fc结构域。

在一些实施方案中，本公开提供了融合蛋白，其包含IL-15结构域可操作地连接于单链Fc结构域，其中IL-15结构域包括本文公开的IL-15变体。在一些实施方案中，单链Fc结构域包括人IgG Fc，如人IgG1 Fc或IgG2 Fc或IgG4 Fc或其变体。在一些实施方案中，IL-15结构域通过接头例如肽接头可操作地连接于非IL-15部分(例如Fc结构域)，所述肽接头例如(G4S)n，n＝1-5。在一些实施方案中，接头是GGGGS或(G4S)₂。

在某些方面，本公开提供了一种异二聚体融合蛋白，其包含：

(A)第一链，所述第一链包括与Fc结构域的一条链可操作地连接的IL-15结构域，其中IL-15结构域包括本文公开的IL-15变体；和

(B)第二链，所述第二链包括与Fc结构域的另一条链可操作地连接的IL-15Rα结构域。

在一些实施方案中，IL-15Rα结构域包括野生型IL-15Rα、IL-15Rα变体或其保留IL-15结合活性的任何片段，或由其组成。在一些实施方案中，IL-15Rα结构域包括SEQ IDNo:2中列出的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，Fc结构域包括人IgG Fc，如人IgG1 Fc或IgG2 Fc或IgG4 Fc或其变体。例如，与野生型人Fc相比，Fc变体的每条链可包括一个或多个取代，以促进异二聚体化。在一些具体的实施方案中，Fc变体包括：对于一条链，SEQ ID No:3或与SEQ ID No:3至少80％相同的氨基酸序列，以及对于另一条链，SEQ ID No:4或与SEQ ID No:4至少80％相同的氨基酸序列。

在一些其他的实施方案中，Fc变体包括：对于一条链，SEQ ID No:5或与SEQ IDNo:5具有至少80％同一性的氨基酸序列，以及对于另一条链，SEQ ID No:6或与SEQ ID No:6具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在又一些其他的实施方案中，Fc变体包括：对于一条链，SEQ ID No:25或与SEQ IDNo:25具有至少80％同一性的氨基酸序列，以及对于另一条链，SEQ ID No:26或与SEQ IDNo:26具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，用于构建本文所公开的异二聚体融合蛋白的Fc变体包括：

(a)由SEQ ID No:3组成的第一链和由SEQ ID No:4组成的第二链；或

(b)由SEQ ID No:5组成的第一链和由SEQ ID No:6组成的第二链。

在一些实施方案中，IL-15结构域和/或IL-15Rα结构域通过接头例如肽接头可操作地连接于Fc结构域，所述肽接头例如(G4S)n，其中n＝1-5。

在一些实施方案中，本公开的异二聚体融合蛋白的第一链包括SEQ IDNo：7、9、11、13、15、17、19、21或23中所示的氨基酸序列，和/或第二链包括SEQ ID No：8、10、12、14、16、18、20或24中所示的氨基酸序列。

在某些方面，本公开提供了核酸分子，其包括编码本文公开的IL-15变体或融合蛋白的核酸序列。

在某些方面，本公开提供了包括如本文所公开的核酸分子的载体和包含该载体的宿主细胞。

在某些方面，本公开提供了药物组合物，其包括如本文所公开的异二聚体融合蛋白和药学上可接受的载剂。

在某些方面，本公开提供了免疫缀合物，其包括与药剂缀合的本文所公开的IL-15变体或异二聚体融合蛋白。所述药剂可以是多肽、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。

在某些方面，本公开提供了一种生产本文所公开的异二聚体融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

-在本文公开的宿主细胞中表达所述异二聚体融合蛋白；和

-从宿主细胞中分离出所述异二聚体融合蛋白。

在某些方面，本公开提供了一种调节受试者中免疫应答的方法，其包括向受试者施用本公开的异二聚体融合蛋白或药物组合物。在一些实施方案中，所述免疫应答是NK细胞或CD8+T细胞相关的免疫应答。

在某些方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者中癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的异二聚体融合蛋白或药物组合物。

在一些实施方案中，该方法进一步包括施用另外的抗肿瘤疗法，例如细胞免疫疗法，包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、T细胞受体T细胞(TCR-T)疗法、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和NK细胞疗法，以及靶向疗法和化疗。在一些具体的实施方案中，所述另外的抗肿瘤疗法是细胞免疫疗法。另外的抗肿瘤疗法的施用可以在施用本文公开的异二聚体融合蛋白或药物组合物之前、之后或同时进行。

所述癌症可以是实体瘤癌症或血液癌症。在一些实施方案中，癌症选自例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾细胞癌、肝癌、***癌、胃癌、胰腺癌、NSCLC、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

在某些方面，本公开提供了如本文所公开的异二聚体融合蛋白在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。

在某些方面，本公开提供了如本文所公开的异二聚体融合蛋白用于治疗或预防癌症。

在某些方面，本公开提供了用于治疗或诊断癌症的试剂盒，其包含容器，所述容器包含如本文所公开的异二聚体融合蛋白。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优点将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些选择的概念，这些概念将在下面的发明详述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。

附图简述

图1a说明了根据本公开的一些实施方案的异二聚体IL-15/Rα-Fc融合蛋白的结构。

图1b说明了用与两种不同的Fc形式融合的WT IL-15/Rα处理后，人CD8+T细胞(a)和NK细胞(b)中Ki67的表达百分比。

图2说明了用指定的IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，人CD8+T细胞(a，c，e)和NK细胞(b，d，f)中Ki67表达的百分比。

图3说明了在将PBMC与指定的变体IL15/Rα-Fc融合蛋白孵育30分钟后，NK细胞(CD3-CD56+)中的STAT5磷酸化。

图4说明了用指定的IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，小鼠CD8+T细胞(a，c)和NK细胞(b，d)中Ki67的表达百分比。

图5-6说明了用指定的IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，人CD8+T细胞(a)和NK细胞(b)中Ki67的表达百分比。

图7说明了用指定的IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，小鼠CD8+T细胞(a)和NK细胞(b)中Ki67的表达百分比。

图8说明了用指定的V47形式的IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，人(a)CD8+T细胞和(b)NK细胞中Ki67表达的百分比。

图9说明了用指定的V47形式的IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，食蟹猴CD8+T细胞(a)和NK细胞(b)中Ki67表达的百分比。

图10说明了静脉内注射后食蟹猴中试验品的血清浓度。

图11说明了用试验品处理后，通过食蟹猴外周血中总CD45+淋巴细胞(a)、CD8+T细胞(b)和NK细胞(c)的细胞计数的倍数变化测量的药效学效应。

图12说明了用试验品处理后，通过食蟹猴外周血中CD8+T细胞(a)和NK细胞(b)中Ki-67增殖标志物的百分比所测量的药效学效应。

图13说明了处理后食蟹猴外周血中Th1(IL-2、TNF、IFN-γ)和Th2(IL-4、IL-5、IL-6)炎性细胞因子的水平。

图14说明了用指定的IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后食蟹猴的血清白蛋白水平。

图15说明了对IL-15处理食蟹猴的临床应答：体温(a)、体重(b)、平均动脉压(MAP；c)，按单个猴显示。"V0006"和"V0061"分别代表W369-E17-TxU1-V0006.uIgG1V47和W369-E17-TxU1-V0061.uIgG1V47处理。

图16说明了IL-15分子输注后食蟹猴的血常规检查。白细胞(WBC；a)、淋巴细胞(b)、单核细胞(c)、嗜碱性粒细胞(BASO；d)和嗜中性粒细胞(NEUT；e)。

图17说明了用V805形式的IL-15/Rα变体处理后，人CD8+T细胞(a)和NK细胞(b)上Ki67表达的百分比。

图18显示了用V805形式的IL-15/Rα变体处理后，食蟹猴CD8+T细胞(a、b)和NK细胞(c、d)上Ki67表达的百分比。

图19说明了IL-15的晶体结构以及IL-15变体与受体的可能模式：(A).野生型IL-15与其受体相互作用的晶体结构。突出了关键的相互作用：D8(IL-15螺旋A)和H133/Y134(受体β)之间的两个氢键，以及S7(IL-15螺旋A)和E135(受体β)之间的一个氢键；(B).IL-15变体v0001(Ala***S7和D8之间)的计算机模型。Ala残基被***IL-15螺旋A，以中断与其受体的相互作用：Ala在第8位的***可能潜在地破坏D8(IL-15螺旋A)和H133/Y134(受体β)之间形成的两个原始氢键，并削弱S7(IL-15螺旋A)和E135(受体β)之间的原始氢键；(C).野生型IL-15与其受体相互作用的晶体结构。突出了关键的相互作用：N64(IL-15螺旋C)和R42/Q70(受体β)之间有三个氢键，E65(IL-15螺旋C)和R42(受体β)之间有一个盐桥；(D).IL-15变体v0005(Ala***E64和N65之间)的计算机模型。在第65位点的Ala***可能潜在地影响N64和E65(IL-15螺旋)的位置，并破坏它们与R42和Q70(受体β)的所有原始相互作用。

发明详述

虽然本公开可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是例示本公开原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。

除非在本文中另外定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“该/所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有点。

通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,第6版,W.B.Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow和Lane Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。

定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

如本文所用的术语“IL-15”是指白细胞介素-15，旨在包括IL-15的任何形式，例如，1)天然未加工的IL-15分子、全长IL-15蛋白或天然存在的IL-15变体；2)在细胞内加工产生的IL-15的任何形式；或3)全长或经修饰形式。野生型IL-15是四α螺旋束细胞因子家族的14-15kDa的成员，参与天然杀伤(NK)细胞分化、T细胞功能和宿主对细胞内病原体的应答。人野生型IL-15的氨基酸序列的一个例子显示在SEQ ID No:1中。在本公开中，术语“IL-15”或“IL-15结构域”包括野生型IL-15和IL-15变体。

如本文所用的术语“IL-15Rα”或“IL-15受体α”是指IL-15的高亲和力受体，它与IL-15结合并在IL-15Rβ和γc(共同γ链)存在时转导信号。全长人IL-15Rα是一种1型跨膜蛋白，具有信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质尾部。如本公开中使用的，术语“IL-15Rα”或“IL-15Rα结构域”包括野生型IL-15Rα和IL-15Rα变体及其片段。如本领域所知的，IL-15Rα蛋白包含一个“sushi结构域”，它是该受体的保留IL-15结合活性的最短区域(如SEQ ID No:2所示)。在一些实施方案中，“sushi结构域”即如SEQ ID No:2所示的肽被用于构建IL-15/Rα-Fc融合蛋白。

术语“变体”，就多肽或蛋白质而言，是指包括对天然蛋白质序列的一个或多个氨基酸突变的生物活性多肽。任选地，一个或多个氨基酸突变包括在氨基酸序列中某些位置的氨基酸取代和/或***。优选地，变体与相应的天然序列多肽具有至少约80％的氨基酸序列同一性。这样的变体包括，例如，在多肽的N端和/或C端添加一个或多个氨基酸(天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸)残基的多肽。用于本公开的变体可以通过本领域众所周知的各种方法来制备，例如对编码天然蛋白的DNA中的核苷酸进行定点诱变或噬菌体展示技术，从而产生编码变体的DNA，随后在重组细胞培养中表达该DNA。在本文公开的某些实施方案中，IL-15变体与野生型IL-15蛋白相比包括一个或多个取代。

如本文所用的术语“Fc”与关于抗体使用的含义相同，指的是抗体的以下部分，其包括第一重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定区通过二硫键与第二重链的第二和第三恒定区结合。Fc区也可以包括部分或全部的铰链区。抗体的Fc区负责各种效应器功能如ADCC和CDC，但不具有抗原结合功能。在本公开中，术语“Fc”包括野生型Fc和Fc变体。

术语“修饰”，就本文所用的氨基酸残基/位置而言，是指与起始氨基酸序列相比主要氨基酸序列的变化，其中变化来自涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变。例如，典型的修饰包括用另一种氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)某残基(或在所述位置取代)，以及在与所述残基/位置相邻处***一个或多个氨基酸。“氨基酸取代”或其变型是指用不同的氨基酸残基替换预定(起始)氨基酸序列中的现有氨基酸残基。一般来说，与包含起始(或“野生型”)氨基酸序列的多肽相比，该修饰导致变体多肽的至少一种物理生物化学活性的改变。例如，在IL-15变体中，被改变的物理生物化学活性可以是结合亲和力、结合能力和/或对靶分子的结合效果。如本文所使用的，氨基酸序列中的两个或更多个取代可以在每个取代之间用“+”或“/”表示。例如，像S7N和K10Q这样的双重取代可以表示为“S7N/K10Q”或“S7N+K10Q”等等。

本文所用的术语“融合蛋白”是指具有两个(或更多个)部分可操作地连接在一起的多肽，其中每个部分是具有不同性质的多肽。该特性可以是一种生物特性，如体外或体内的活性。该特性也可以是简单的化学或物理特性，如与靶抗原的结合、对反应的催化作用等。两部分可以通过单一肽键直接连接，或通过含有一个或多个氨基酸残基的肽接头连接。一般来说，这两个部分和接头将彼此处于读码框内。在某些实施方案中，融合蛋白的两部分是IL-15蛋白结构域和Fc结构域，或IL-15Rα蛋白结构域和Fc结构域。这两个融合蛋白可以缔合在一起以形成异二聚体。从广义上讲，当在本说明书中提到“融合蛋白”时，根据上下文，它可以指包含IL-15的单链融合蛋白或异二聚体融合蛋白。

如本文所用，术语“异二聚体”、“异二聚体融合蛋白”、“异二聚体IL-15融合蛋白”或“IL-15/Rα-Fc融合蛋白”可互换使用，它是指包含两条链的异二聚体蛋白，每条链均包括Fc结构域的多肽，IL-15结构域可能与IL-15Rα结构域在同一链或在另一链上。在一些实施方案中，第一条链是IL-15蛋白结构域和Fc结构域的融合蛋白，第二条链是IL-15Rα蛋白结构域和Fc结构域的融合蛋白。这样的异二聚体融合蛋白在结构上类似于抗体，可视为将抗体的Fab部分用通过IL-15与IL-15Rα之间的相互作用形成的IL-15/IL-15Rα复合物替换。

术语“可操作地连接”是指两个或更多个目的生物序列并列在一起，无论是否有间隔物或接头，它们之间的关系允许它们以意图的方式发挥作用。当用于多肽时，意指多肽序列以这样的方式连接，即使得连接的产物具有意图的生物功能。例如，抗体可变区可以与恒定区可操作地连接，以便提供具有抗原结合活性的稳定产物。该术语也可用于多核苷酸。例如，当编码多肽的多核苷酸与调节序列(如启动子、增强子、沉默子序列等)可操作地连接时，意指多核苷酸序列以允许从该多核苷酸进行受调控的表达的方式连接。

如本文所用的术语“EC₅₀”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀可以以“nM”为单位表示。

如本文所用，术语“分离的”是指通过人工手段从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然环境变化，或者该物质被从天然环境中分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从这种天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人工或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。

如本文所用，术语“载体”是指可以在其中***多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许***其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，***瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报告基因。另外，载体可以包含复制起点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞***。宿主细胞包括但不限于培养的细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠，小鼠，豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO，BHK，NSO，SP2/0，YB2/0；或人组织或杂交瘤细胞，酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，还涵盖这种细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，因此这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。

如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.编),1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informaticsand Genome Projects,(Smith,D.W.编),1993,New York:Academic Press；ComputerAnalysis of Sequence Data,第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编),1994,NewJersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in MolecularBiology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等人,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染以及化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等人,1981,Gene 13:197。在本发明的一个具体实施方案中，将人IL-15基因转染入293F细胞。

如本文所用，术语“荧光激活细胞分析”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且可以对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACSStar Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，Fla.)的Epics C和来自Cytomation(Colorado Springs，Colo.)的MoFlo。

如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选或另外地，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内例如动物模型中在评估，如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的。

术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。

如本文所用，术语“癌症”是指引发医学病况的任何肿瘤或恶性细胞生长，可以是增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤如白血病。

本文在治疗病况的情况中使用的术语“治疗”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病情进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病情消退，病情改善和病情治愈。还包括了作为预防措施(即预防、防护)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。

如本文所用，术语“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、组合物或剂量形式的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。例如，当与治疗疾病或病症例如癌症联合使用时，“有效量”是指活性剂、药物或抗体或其抗原结合部分有效治疗所述疾病或病症的量或浓度。

如本文所用，关于哺乳动物中的某种疾病状况的术语“预防”、“防止”或“阻止”是指预防或延迟疾病的发作或预防其临床或亚临床症状的表现。

如本文所用，术语“药学上可接受”是指媒介物、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载剂和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载剂和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如GennaroAR编辑的Remington's Pharmaceutical Sciences，第19版.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲剂；表面活性剂，包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂，包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性的免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至生物体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，短小棒状杆菌，脂多糖，细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。

IL-15、IL-15Rα蛋白结构域和IL-15/IL-15Rα复合物

在某些方面，本公开提供了IL-15变体，其与野生型IL-15蛋白例如人类野生型IL-15蛋白相比包括一个或多个修饰，例如***和/或取代。本公开进一步提供了IL-15-Fc融合蛋白，包括IL15蛋白结构域与Fc结构域融合。IL15蛋白结构域可包括SEQ ID No:1所示的野生型IL-15蛋白，或包括与野生型IL-15蛋白相比包含一个或多个修饰(如***和/或取代)的IL-15变体。

残基在本文中用单字母的氨基酸代码继之以IL-15的氨基酸位置来表示，例如，S7是SEQ ID NO:1中第7位的丝氨酸残基。取代在本文中用单字母的氨基酸代码继之以IL-15氨基酸位置然后是取代的单字母的氨基酸代码来表示，例如，S7N是SEQ ID NO:1的第7位丝氨酸残基被天冬酰胺残基取代。

在一些实施方案中，与SEQ ID No:1相比，IL-15变体具有至少一个氨基酸取代或至少一个氨基酸***。在一些实施方案中，一个或多个取代或***发生在SEQ ID No:1中所示的氨基酸序列的第7、8、9、10、11、30、32、61、64、65、66、68、69、108和/或112位。在一些实施方案中，一个或多个取代发生在位于IL-15与IL-15Rβ和γ链之间的相互作用界面处的氨基酸上，如对应于SEQ ID No:1的第7、8、10、30、61、65、68、69、108、112位。在其他一些实施方案中，一个或多个***发生在位于IL-15螺旋A与IL-2Rβ/γ之间，或螺旋C与IL-2Rβ之间的相互作用界面的位置处，使得该***能够破坏氢键、盐桥和/或范德华相互作用。本发明人已经鉴定了可能对与受体相互作用起关键作用的一些位置，如对应于SEQ IDNO:1的第7、8、10、11、61、65、68和69位。因此，***的位置可以选自以下：I6和S7之间，S7和D8之间，D8和L9之间，L9和K10之间，K10和K11之间，K11和I12之间，H60和D61之间，D61和T62之间，E64和N65之间，N65和L66之间，I67和I68之间，I68和L69之间，和/或L69和A70之间，特别是S7和D8之间，D8和L9之间，L9和K10之间，K10和K11之间，E64和N65之间，以及N65和L66之间，所述位置根据SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。优选地，所述***是***一个氨基酸，且***的氨基酸可以包括非极性氨基酸如Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Phe、Pro，极性氨基酸如Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln，带电荷氨基酸如Asp、Glu、Lys、Arg、His，以及非天然的氨基酸。在一些实施方案中，***的氨基酸是Ala、gly或Ser。通过在氨基酸序列中引入一个或多个修饰，本文所公开的IL-15变体提供了与IL-15Rβ/γ链结合的亲和力降低，导致刺激免疫细胞的效力降低，从而降低体内的毒性。

在一些实施方案中，IL-15变体包括在SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的第7、8、10、30、32、61、65、68、69、108和/或112位进行一个或多个取代(如11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个取代)。在每个位置，氨基酸可以被半胱氨酸和原来的氨基酸以外的任何氨基酸所取代。例如，在一些实施方案中，IL-15变体包括在SEQ IDNo：1所示的氨基酸序列的第7位的取代，原氨基酸丝氨酸(S)可以被半胱氨酸和丝氨酸以外的任何氨基酸，如丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)取代。在一些实施方案中，IL-15变体包括在SEQID No:1中所示的氨基酸序列的第68位的取代，原来的氨基酸异亮氨酸(I)可以被半胱氨酸和异亮氨酸以外的任何氨基酸，如A、D、E、F、G、H、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y取代。在一些实施方案中，IL-15变体包括在SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的第69位的取代，原来的氨基酸亮氨酸(L)可以被半胱氨酸和亮氨酸以外的任何氨基酸，如A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y取代。

在一些实施方案中，IL-15变体包括在第7位的取代和在第10、68和/或69位的一个或多个取代。在一些实施方案中，IL-15变体包括在第10位的取代和在第第68和/或69位的一个或多个取代。在一些实施方案中，IL-15变体包括在第68位和/或第69位的取代。

在一些实施方案中，与SEQ ID No：1相比，IL-15变体包括选自包含以下的组的一个或多个取代：

(a)S7N、S7Q、S7A、S7D、S7E、S7F、S7G、S7H、S7I、S7K、S7L、S7M、S7P、S7R、S7T、S7V、S7W、S7Y；

(b)D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30E、D30Q、H32N、D61Q、N65Q；

(c)I68A、I68V、I68F、I68G、I68K、I68R、I68L、I68M、I68Q、I68D、I68E、I68H、I68N、I68P、I68S、I68T、I68W、I68Y；

(d)L69A、L69V、L69D、L69E、L69F、L69G、L69H、L69I、L69K、L69M、L69N、L69P、L69Q、L69R、L69S、L69T、L69W、L69Y；

(e)Q108N、N112Q；和

(f)其任何组合。

在一些实施方案中，与SEQ ID No:1相比，IL-15变体包括一个或多个选自包含以下的组的***：

(a)S7和D8之间的***；(b)D8和L9之间的***；(c)L9和K10之间的***；(d)K10和K11之间的***；(e)E64和N65之间的***；和(f)N65和L66之间的***。优选地，***的氨基酸为Ala。

在一些实施方案中，IL-15变体包括至少两个(例如两个、三个、四个、五个或甚至更多个)选自包含以下的组的取代：S7N、S7Q、D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30E、D30Q、H32N、D61Q、N65Q、I68A、I68V、I68F、I68G、I68K、I68R、I68L、I68M、I68Q、L69A、L69V、Q108N和N112Q。

在一些具体的实施方案中，IL-15变体包括以下取代中的一种：S7N+K10Q+I68A、K10Q+I68A+L69V、S7N+K10Q+L69V、S7N+I68A+L69V、S7N+K10Q、S7N+I68A、S7N+L69V、K10Q+I68A、K10Q+L69V以及I68A+L69V。

IL-15Rα蛋白结构域可包括野生型IL-15Rα蛋白、IL-15Rα变体或其保留IL-15结合活性的任何片段。在一些实施方案中，IL-15Rα蛋白结构域包括野生型IL-15Rα蛋白或其与IL-15结合的片段，如SEQ ID No:2所示。在一些实施方案中，IL-15Rα变体与SEQ ID No:2相比有一个或多个修饰，例如***、取代和/或缺失。

IL-15蛋白结构域可以以不同的方式与IL-15Rα蛋白结构域缔合来形成IL-15R/IL-15Rα复合物。在一些实施方案中，IL-15蛋白结构域和IL-15Rα蛋白结构域通过配体-配体相互作用，即两个结构域之间的结合亲和力进行自组装。在一些其他实施方案中，这两个结构域通过接头，优选肽接头共价连接。在一些进一步的实施方案中，将两个结构域工程化为包括一个或多个半胱氨酸氨基酸，从而在两个结构域之间形成一个或多个二硫键。

Fc结构域

如上所述，单链的IL15-Fc融合蛋白和IL15Rα-Fc蛋白各包括Fc结构域的一条链，它们缔合在一起形成Fc结构域，类似于抗体中的Fc区。

Fc结构域可以是野生型Fc或Fc变体。野生型Fc可以是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc。在一些实施方案中，野生型Fc是人IgG1 Fc。与野生型Fc(如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc)相比，Fc变体包括一个或多个氨基酸残基的修饰(如取代、***和/或缺失)。在一些实施方案中，与野生型人IgG1 Fc相比，Fc变体包括一个或多个氨基酸残基的修饰(如取代、***和/或缺失)。

Fc变体中包含的所述一个或多个氨基酸修饰可改变与一种或多种FcγR受体的结合，改变与FcRn受体的结合等。在某些实施方案中，融合蛋白的Fc结构域包括一个或多个氨基酸取代以改善对新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合。这样的变体可以延长药代动力学半衰期，因为它在酸性pH值下与FcRn结合，这使得它可以摆脱在溶酶体中的降解，然后被易位并释放出细胞外。工程化抗体及其抗原结合片段以提高与FcRn的结合亲和力的方法在本领域是众所周知的，例如见Vaughn,D.等人,Structure,6(1):63-73,1998；Kontermann,R.等人，Antibody Engineering,Volume 1,Chapter 27:Engineering of the Fc regionfor improved PK,由Springer出版,2010；Yeung,Y.等人,Cancer Research,70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等人,J.Immunology,176:346-356(2006)。

Fc结构域的两条链可以通过二硫键缔合在一起。在一些实施方案中，Fc结构域包括Fc区的界面中的一个或多个氨基酸修饰(例如取代)，以促进和/或推动异二聚化。例如，Fc结构域的两条链被设计成包括“把手-入-孔”结构以促进异二聚化，这包括在第一Fc多肽中引入一个突起(“把手”)，在第二Fc多肽中引入一个空腔(“孔”)，其中突起可以被定位在空腔中以促进第一和第二Fc多肽的相互作用，形成异二聚体或复合物。产生具有这些修饰的抗体的方法在本领域是已知的，例如美国专利第5,731,168号中所述。具体来说，Fc结构域可以包括至少一个“把手”(突起)和至少一个“孔”(空腔)，其中“把手”和“孔”的存在增强了复合物或异二聚体的形成(更多细节见WO 2005/063816)。在一些实施方案中，本文公开的Fc结构域包括第一和第二Fc多肽链，其中第一和第二多肽各自包括相对于野生型人IgG1Fc的一个或多个突变。IL-15结构域可以与包含“把手”突变的Fc结构域的一条链融合，而IL-15Rα结构域则与包含“孔”突变的另一条链融合，或者反之亦可。在至少一个实施方案中，“孔”突变是Y349C、T366S、L368A和/或Y407V，而“把手”突变是S354C和/或T366W。

在某些实施方案中，融合蛋白的Fc结构域包括一个或多个改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的氨基酸取代。Fc区CH2结构域的某些氨基酸残基可以被取代，以提供降低的ADCC活性。

在某些实施方案中，Fc结构域还包括三重突变M252Y/S254T/T256E(“YTE”)。据报道，这种三重突变导致与人新生儿Fc受体(FcRn)的结合增加了约10倍，并且含有YTE的人IgG在食蟹猴中的血清半衰期增加了近4倍(Oganesyan V.等人,Mol Immunol.2009年5月；46(8-9)：1750-5)。在一些进一步的实施方案中，Fc结构域包括另外的突变以增强Fc和人FcRn之间的相互作用。在一些具体的实施方案中，Fc结构域除了“YTE”三重突变外，还包括C220S、G236R和/或L328R取代。据报道双重“G236R/L328R”或“RR”取代会降低与FcγR的结合亲和力和Fc效应器功能(ADCC、CDC、ADCP)。

当述及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号***”或“EU索引”(例如在Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版),USDept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU编号”或“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文中另外说明，否则对Fc区恒定结构域中残基编号的提述都指的是通过EU编号***的残基编号。

在一些具体的实施方案中，Fc变体包括两条链，其中第一条链的氨基酸序列与SEQID No:3具有至少80％，例如80％、85％、90％、95％或更高(例如100％)的序列同一性，和/或第二条链的氨基酸序列与SEQ IDNo:4具有至少80％，例如80％、85％、90％、95％或更高(例如100％)的序列同一性。在一些具体的实施方案中，Fc变体的第一链包括或组成为SEQID No:3中所示的氨基酸序列，并且Fc变体的第二链包括或组成为SEQ ID No:4中所示的氨基酸序列。

在一些具体的实施方案中，Fc变体包括两条链，其中第一条链的氨基酸序列与SEQID No:5具有至少80％，例如80％、85％、90％、95％或更高(例如100％)的序列同一性，和/或第二条链的氨基酸序列与SEQ IDNo:6具有至少80％，例如80％、85％、90％、95％或更高(例如100％)的序列同一性。在一些具体的实施方案中，Fc变体的第一链包括或组成为SEQID No:5中所示的氨基酸序列，并且Fc变体的第二链包括或组成为SEQ ID No:6中所示的氨基酸序列。

关于序列同一性的表述“至少80％”可包括例如80％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(即相同)。两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

另外地或备选地，本公开的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用Altschul等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本公开的融合蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用空位BLAST，如Altschul等人,(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402中所述的。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

IL-15-Fc融合蛋白和异二聚体IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白

在某些方面，本公开提供了包括IL-15蛋白结构域和Fc结构域的单链IL-15-Fc融合蛋白，以及包括IL-15Rα蛋白结构域和Fc结构域的IL-15Rα-Fc融合蛋白。进一步地，这两种融合蛋白可以异二聚化，形成包含两条链的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白。构成异二聚体IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白的IL-15结构域、IL-15Rα结构域和Fc结构域的每一个均可以为野生型形式或如上所述的相应的变体。

如本文所用，术语“长效作用”是指提供了延长的药代动力学(PK)谱的IL-15-Fc融合蛋白(单体或异二聚体)，其包含与免疫球蛋白Fc区可操作地连接的IL-15变体，延长的药代动力学(PK)谱表现为例如更长的血清半衰期、增加的Cmax、更低的血清清除率和改善的药物暴露(AUC)，或对淋巴细胞扩增，特别是NK和CD8+T细胞的增殖具有明显和延长的药效学(PD)效应。

在一些实施方案中，本文公开的异二聚体IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括IL-15结构域与Fc结构域的一条链融合，第二条链包括IL-15Rα结构域与Fc结构域的另一条链融合。在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα结构域与Fc结构域可操作地连接。优选地，IL-15/IL-15Rα结构域与Fc结构域的N端可操作地连接。

在其他一些实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括IL-15结构域和IL-15Rα结构域与Fc结构域的一条链融合，第二条链包括Fc结构域的另一条链。例如，IL-15结构域可以与IL-15Rα结构域可操作地连接(任选地通过接头)，并进一步与Fc结构域的一条链可操作地连接，例如从N端到C端为IL15-IL15Rα-Fc或IL15Rα-IL15-Fc，其中“-”代表可操作地连接。

在一些实施方案中，IL-15/IL-15Rα结构域直接与Fc结构域相连，即没有接头；更经常的是，IL-15/IL-15Rα结构域通过接头与Fc结构域相连，如具有一个或多个氨基酸残基的肽接头。该接头应提供足够的柔性，使两端的两个结构域能够发挥其各自的功能。本领域有许多合适的接头且可以用于本文中。在一些实施方案中，接头是(G4S)n，其中n可以是1-5(如1、2、3、4或5)。

在一些实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括IL-15结构域与IgG1 Fc结构域的一条链可操作地连接，第二条链包括IL-15Rα蛋白结构域与IgG1 Fc结构域的另一条链可操作地连接，并且IL-15结构域包括上述的IL-15变体。在一些示例性的实施方案中，IL-15变体包括一个或多个选自下组的突变：

(a)S7N、S7Q、S7A、S7D、S7E、S7F、S7G、S7H、S7I、S7K、S7L、S7M、S7P、S7R、S7T、S7V、S7W和S7Y取代；

(b)D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30E、D30Q、H32N、D61Q和N65Q取代；

(c)I68A、I68V、I68F、I68G、I68K、I68R、I68L、I68M、I68Q、I68D、I68E、I68H、I68N、I68P、I68S、I68T、I68W和I68Y取代；

(d)L69A、L69V、L69D、L69E、L69F、L69G、L69H、L69I、L69K、L69M、L69N、L69P、L69Q、L69R、L69S、L69T、L69W和L69Y取代；

(e)Q108N和N112Q取代；

(f)螺旋A的氨基酸序列中的***，其中螺旋A的氨基酸序列由SEQ ID No:1的第1至17位组成(例如，在S7和D8之间，D8和L9之间，L9和K10之间，K10和K11之间)；和

(g)螺旋C的氨基酸序列中的***，其中螺旋C的氨基酸序列由SEQ ID No:1的第57至77位的氨基酸组成(例如，在E64和N65之间，以及在N65和L66之间)；和

(h)其任何组合。

在一些具体的实施方案中，IL-15结构域包括选自下组的IL-15变体：

与SEQ ID No:1相比，包含S7N取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含D8E取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含D8S取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含D8T取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含D8Q取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含K10Q取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含D30Q取代的IL-15变体；与SEQ IDNo:1相比，包含D61Q取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含N65Q取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含I68A取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含L69A取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含L69V取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含Q108N取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含S7N/K10Q/I68A取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含K10Q/I68A/L69V取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含S7N/K10Q/L69V取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含S7N/I68A/L69V取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含S7N/K10Q取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含S7N/I68A取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含S7N/L69V取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含K10Q/I68A取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含K10Q/L69V取代的IL-15变体；与SEQ IDNo:1相比，包含I68A/L69V取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含I68F取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含I68G取代的IL-15变体；与SEQ ID No:1相比，包含I68K取代的IL-15变体；和与SEQ ID No:1相比，包含I68R取代的IL-15变体。

在一些进一步的实施方案中，如上所述的IgG1 Fc结构域可在一条链中包括SEQID No:3，在另一条链中包括SEQ ID No:4(称为“V47”形式)；或者，如上所述的IgG1 Fc结构域可在一条链中包括SEQ ID No:5，在另一条链中包括SEQ ID No:6(称为“V42”形式)。例如，在某些实施方案中，IL-15变体与SEQ ID No:3所示的Fc结构域的一条链可操作地连接，而IL-15Rα蛋白结构域与SEQ ID No:4所示的Fc结构域的另一条链可操作地连接；在一些其他实施方案中，IL-15变体与SEQ ID No:4所示的Fc结构域的一条链可操作地连接，而IL-15Rα蛋白结构域与SEQ ID No:3所示的Fc结构域的另一条链可操作地连接；在某些实施方案中，IL-15变体与SEQ ID No:5所示的Fc结构域的一条链可操作地连接，而IL-15Rα蛋白结构域则与SEQ ID No:6所示的Fc结构域的另一条链可操作地连接；在一些其他实施方案中，IL-15变体与SEQ ID No:6中所示的Fc结构域的一条链可操作地连接，而IL-15Rα蛋白结构域与SEQ ID No:5中所示的Fc结构域的另一条链可操作地连接。

在一些示例性的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括含有D8E取代的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V47形式)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域的另一条链(V47形式)可操作地连接。或者，Fc结构域可以是V42形式。

在一些示例性的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括含有D8S取代的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V47)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V47)的另一条链可操作地连接。或者，Fc结构域可以是V42形式。

在一些示例性的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括含有N65Q取代的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V47)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V47)的另一条链可操作地连接。或者，Fc结构域可以是V42形式。

在一些示例性的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括含有L69A取代的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V47)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V47)的另一条链可操作地连接。或者，Fc结构域可以是V42形式。

在一些示例性的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括含有Q108N取代的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V47)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V47)的另一条链可操作地连接。或者，Fc结构域可以是V42形式。

在一些示例性的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括含有S7N+K10Q+I68A取代的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V47)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V47)的另一条链可操作地连接。或者，Fc结构域可以是V42形式。

在一些示例性的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括包含S7N+I68A+L69V取代的IL-15变体与IgG1Fc结构域(V47)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1Fc结构域的另一条链(V47)可操作地连接。或者，Fc结构域可以是V42形式。

在一些示例性的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括包含S7N+I68A取代的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V47)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1Fc结构域的另一条链(V47)可操作地连接。或者，Fc结构域可以是V42形式。

在一些示例性的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括含有I68A+L69V取代的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V47)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1Fc结构域(V47)的另一条链可操作地连接。或者，Fc结构域可以是V42形式。

在一些具体的实施方案中，本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括SEQ ID No:7、9、11、13、15、17、19、21或23中所示的氨基酸序列，和/或第二条链包括SEQ ID No:8、10、12、14、16、18、20或24中所示的氨基酸序列。

在一些示例性的实施方案中，本文所公开的IL-15-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括包含S7和D8之间的***的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V805)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V805)的另一条链可操作地连接。

在一些示例性的实施方案中，本文所公开的IL-15-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括包含D8和L9之间的***的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V805，等同于V47 Fc形式)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V805)的另一条链可操作地连接。

在一些示例性的实施方案中，本文所公开的IL-15-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括包含L9和K10之间的***的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V805)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V805)的另一条链可操作地连接。

在一些示例性的实施方案中，本文所公开的IL-15-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括包含K10和K11之间的***的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V805)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V805)的另一条链可操作地连接。

在一些示例性的实施方案中，本文所公开的IL-15-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括包含E64和N65之间的***的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V805)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V805)的另一条链可操作地连接。

在一些示例性的实施方案中，本文所公开的IL-15-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括包含N65和L66之间的***的IL-15变体与IgG1 Fc结构域(V805)可操作地连接，第二条链包括野生型IL-15Rα蛋白与IgG1 Fc结构域(V805)的另一条链可操作地连接。

在一些具体的实施方案中，本文公开的IL-15-Fc融合蛋白包括两条链，第一条链包括SEQ ID No：25、27、29、31、33或35中所示的氨基酸序列，和/或第二条链包括SEQ IDNo：26、28、30、32、34或36中所示的氨基酸序列。

本文公开的IL-15变体和IL-15-Fc融合蛋白的特性

本公开提供了效力降低、PK/PD增强的IL-15变体和包含这些IL-15变体的IL-15-Fc融合蛋白。这些IL-15变体显示出降低的效力/毒性、延长的PK、增强的PD，并导致食蟹猴中的持续淋巴细胞扩增，因此可作为一种新的免疫治疗剂，具有更优的抗肿瘤功效。

这些IL-15变体和IL-15-Fc融合蛋白的功能可以用多种方式评估，如体外或体内试验。

在一些实施方案中，IL-15变体和IL-15-Fc融合蛋白的效果是通过免疫细胞增殖测定来评估的，例如使用免疫效应细胞的Ki-67细胞内染色。Ki67是一种与细胞增殖严格相关的蛋白质，CD8+T和NK细胞上Ki67的百分比可通过FACS测量，这指示其在刺激CD8+T和NK细胞中的活性。其他免疫细胞也可用于评估对细胞增殖的影响，如CD45+淋巴细胞等。

在一些实施方案中，IL-15变体和IL-15-Fc融合蛋白的效果是通过量化由某些因子的磷酸化如STAT5磷酸化测量的信号传导通路来评估的。

在一些实施方案中，IL-15变体和IL-15-Fc融合蛋白的效果是通过评估通过细胞因子产生测量的T细胞活性来评价的。如实施例所示，在用本文公开的IL-15变体处理后，没有观察到炎症细胞因子(如IL-2、TNF、IFN-γ(Th1)和IL-4(Th2))的明显变化。

在一些实施方案中，IL-15变体和IL-15-Fc融合蛋白的效果是通过评价淋巴细胞扩增(白细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞的计数)来评估的。

本公开的包含IL-15的融合蛋白至少提供了以下特性之一：

(a)在刺激免疫细胞增殖，如CD8+T细胞和NK细胞增殖方面具有更适度的效力；

(b)延长的药代动力学特征且没有明显的ADA产生；

(c)在药效学研究中显示延迟但更高的淋巴细胞增殖；

(d)炎症细胞因子的产生没有明显增加；或

(e)在体内没有明显的毒性。

编码IL-15变体和融合蛋白的核酸分子

在某些方面，本公开涉及一种的核酸分子，其包含编码本文所公开的IL-15变体或异二聚体Fc融合蛋白的核酸序列。

本公开的核酸可以用标准的分子生物学技术获得。编码IL-15变体的分离核酸可以与编码Fc结构域的另一个DNA分子可操作地连接。同样，编码IL-15Rα结构域(野生型、变体或其保留IL15结合活性的任何片段)的核酸可以与另一个编码Fc结构域的DNA分子可操作地连接。包含这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增获得。

一旦获得编码IL-15、IL-15Rα和Fc结构域的DNA片段，这些DNA片段可以通过标准的重组DNA技术进行进一步操作，例如如本领域已知的纳入表达载体中。在一些实施方案中，编码这些DNA片段的核酸各自包含在单独的表达载体中，一般在不同或相同的启动子控制下。在一些其他实施方案中，编码这些DNA片段的核酸可操作地连接并包含在单一表达载体中，处于同一启动子的控制下。如在此背景中使用的术语“可操作地连接”是指两个DNA片段的连接使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在阅读框内。

载体和宿主细胞

编码IL-15变体或包含IL-15的融合蛋白的DNA可以放入一个或多个表达载体中，然后转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或否则不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，以获得重组宿主细胞中所需蛋白的合成。参见例如PCT公开WO 87/04462。

一般来说，编码融合蛋白的一条或所有链的核酸序列可以用本领域已知的方法克隆到合适的表达载体中，与合适的启动子可操作地连接。例如，在适当的条件下，核苷酸序列和载体可以与限制性酶接触以在每个分子上产生互补的末端，这些末端可以相互配对并用连接酶连接在一起。或者，可以将合成的核酸接头连接到基因的末端。这些合成的接头含有对应于载体中特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于生产抗体的宿主细胞的类型。

有多种启动子可用于表达本文所述的抗体，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子，病毒LTR如Rous肉瘤病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR，猿猴病毒40(SV40)早期启动子，大肠杆菌lac UV5启动子和单纯疱疹tk病毒启动子。可以使用包括操纵子的阻遏子的可调控启动子。

本公开的宿主细胞可以是任何适合表达本公开的融合蛋白的细胞，例如细菌细胞、酵母、哺乳动物细胞。用于表达本公开的融合蛋白的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.ScLUSA 77:4216-4220，与DHFR可选择标志物一起使用，例如如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.MoI.159:601-621描述的)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。

具体地，对于使用NSO骨髓瘤细胞，另一种表达***是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达***。当编码抗体的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段时间使其足以在宿主细胞中表达融合蛋白或将融合蛋白分泌到宿主细胞生长的培养基中，从而产生融合蛋白。融合蛋白可以用标准的蛋白质纯化方法从培养基中回收。

药物组合物

在一些方面，本公开涉及药物组合物，其包含如本文所公开的异二聚体融合蛋白和药学上可接受的载剂。

组合物的组分

药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如抗体。本公开的药物组合物还可以与另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用。药学上可接受的载剂可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域其他已知的组分，组分的多种组合或更多。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨糖醇、丁基甲基苯甲醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开的，组合物可包含一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸，从而还原可能被氧化的抗体或其抗原结合片段。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强蛋白稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本公开提供了包含融合蛋白和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本公开进一步提供了多种方法，其中将融合蛋白与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合，从而可以防止融合蛋白氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

为了进一步说明，药学上可接受的载剂可以包括例如含水媒介物，例如氯化钠注射液，林格氏注射液，等渗右旋糖注射液，无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性媒介物如植物来源的固定油，棉籽油，玉米油，芝麻油或花生油，抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80)，隔绝剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载剂的抗微生物剂可以添加到包含酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。

施用、制剂和剂量

本公开的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服、静脉内、动脉内、皮下、肠胃外、鼻内、肌内、颅内、心内、心室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、局部、经皮和鞘内、或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。可以根据意图的应用和治疗方案选择合适的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂(包括包衣片剂)，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。

适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液，混悬液)。这类液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗载剂的实例包括氯化钠注射液，林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量，时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期，清除率等)的经验考虑。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。备选地，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用途径，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病况的严重程度，以及患者的种类、性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终将由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

通常，本公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白可以以各种范围施用。这些包括每剂约100μg/kg体重至约10mg/kg体重；每剂约100μg/kg体重至约1mg/kg体重；每剂约1μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂约100μg/kg体重至约200μg/kg体重；每剂约200μg/kg体重至约300μg/kg体重；每剂约300μg/kg体重至约400μg/kg体重；每剂约400μg/kg体重至约0.5mg/kg体重；以及每剂约0.5mg/kg体重至约1mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量为至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重或至少约10mg/kg体重。

无论如何，本公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病况、所治疗受试者的年龄、所治疗病况的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。

在某些优选的实施方案中，涉及本公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用多剂量的所选药物产品。更具体地说，本公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用。就此而言，应理解的是，可以基于患者应答和临床实践来改变剂量或者调整间隔。

在给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病情的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善；测量间接肿瘤标志物(例如用于***癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或***减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤病情的类型、肿瘤病情的阶段、肿瘤病情是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。

用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度被认为适合施用的本文所公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，该浓度可由本领域的技术人员根据经验确定，例如从约10μg/ml到约10mg/ml。

本公开的应用

本公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白、药物组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如免疫应答的增强。例如，可以将这些分子体外或离体施用于培养的细胞，或例如体内施用于人受试者，以增强各种情况下的免疫力。免疫应答可以被调节，例如被增强、刺激或上调。

例如，受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。所述方法特别适用于治疗具有可通过增强免疫应答(例如NK/T细胞介导的免疫应答)治疗的病症的人类患者。在一个具体的实施方案中，所述方法特别适合于体内治疗癌症。为了实现免疫力的增强，可以将IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白单独地或与另一疗法组合施用。当IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白与另一种药剂一起施用时，两者可以以任何顺序施用或同时施用。

治疗包括癌症和感染性疾病在内的病症

在一些方面，本公开提供了治疗哺乳动物中病症或疾病的方法，其包括向需要治疗的受试者(例如人)施用治疗有效量的如本文公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白。所述病症或疾病可以是癌症。

可以使用本公开提供的方法治疗或预防多种癌症，无论是恶性的还是良性的，以及是原发性的还是继发性的。癌症可以是实体瘤或血液恶性癌。这些癌症的实例包括肺癌如支气管癌(例如非小细胞肺癌，鳞状细胞癌，小细胞癌，大细胞癌和腺癌)，肺泡细胞癌，支气管腺瘤，软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌如粘液瘤、纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤，软骨瘤，软骨母细胞瘤，软骨粘液样纤维瘤，骨样骨瘤，巨细胞瘤，软骨肉瘤，多发性骨髓瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，尤因氏肿瘤(尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)，间变性星形细胞瘤，星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，脊索瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，脑膜瘤，垂体腺瘤，松果体瘤，骨瘤，血管母细胞瘤，颅咽管瘤，脊索瘤，生殖细胞瘤，畸胎瘤，皮样囊肿和血管瘤；消化***中的癌症如结肠癌，平滑肌瘤，表皮样癌，腺癌，平滑肌肉瘤，胃腺癌，肠脂肪瘤，肠神经纤维瘤，肠纤维瘤，大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤，血管瘤，肝细胞癌，纤维板层癌，胆管癌，肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌，肾细胞癌，肾上腺样瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液***癌症如急性淋巴细胞(成淋巴细胞)白血病，急性骨髓性(髓细胞性，骨髓，成髓细胞性，骨髓单核细胞性)白血病，慢性淋巴细胞性白血病(例如Sezary综合征和毛细胞性白血病)，慢性髓细胞性(髓性，骨髓性，粒细胞性)白血病，霍奇金氏淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，蕈样霉菌病和骨髓增殖性病症(包括骨髓增生性病症如真性红细胞增多症，骨髓纤维化，血小板增多症和慢性粒细胞白血病)；皮肤癌如基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，卡波西肉瘤和佩吉特氏病；头和颈癌；与眼相关的癌症，如视网膜母细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖***癌症如良性***增生，***癌和睾丸癌(例如***瘤，畸胎瘤，胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖***癌症如子宫癌(子宫内膜癌)，***(***)，卵巢癌(卵巢肿瘤)，外阴癌，***癌，输卵管癌和***；甲状腺癌(包括***状，滤泡状，间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病，骨髓瘤，非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤。在一个具体的实施方案中，癌症是结肠癌。

在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于，B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级别/滤泡性NHL；中级别扩散性NHL；高级别免疫母细胞NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小型非裂核性细胞NHL；大块病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；和移植后淋巴增生性病症(PTLD)，以及与瘢痣病相关的异常血管增生，水肿(例如与脑肿瘤相关的)，B细胞增殖性病症和Meig综合征。更具体的例子包括但不限于复发或难治性NHL，前线低级别NHL，III/IV期NHL，化疗耐受性NHL，前体B成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病和/或幼淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结外边缘区-MALT淋巴瘤，***边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡性淋巴瘤，中级/滤泡性NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)，中级弥漫性NHL，弥漫性大B细胞淋巴瘤，侵袭性NHL(包括侵袭性前线NHL和侵袭性复发NHL)，自体干细胞移植后复发或难治的NHL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，高级免疫母细胞NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级小型非裂核性细胞NHL，大块病NHL，伯基特淋巴瘤，前体(外周)大颗粒淋巴细胞白血病，蕈样霉菌病和/或Sezary综合征，皮肤(皮肤的)淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症的实例进一步包括但不限于，B细胞增殖性病症，其进一步包括但不限于，淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞白血病。这种淋巴瘤和淋巴细胞白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小的未裂核性细胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)，弥漫性混合细胞淋巴瘤，免疫母细胞性淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞淋巴瘤，Waldenstrom巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性淋巴细胞白血病CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞幼淋巴细胞性白血病，i)浆细胞赘生物，浆细胞性骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤和/或j)霍奇金氏病。

在一些实施方案中，本文公开的包含IL-15的融合蛋白可用于治疗或预防感染性疾病，该感染性疾病可能是由病毒、细菌、真菌或寄生生物感染所致。在一些其他实施方案中，本文公开的包含IL-15的融合蛋白可用于治疗或预防免疫缺陷或淋巴细胞减少。

刺激免疫应答而不引起细胞毒性

在一些方面，本公开还提供增强(例如刺激)受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用本公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，使受试者中的免疫应答增强而不产生不想要的副作用。例如，受试者是哺乳动物。在一个具体的实施方案中，受试者是人。

术语“增强免疫应答”或其语法变化意味着刺激、诱发、增加、改善或增强哺乳动物免疫***的任何应答。免疫应答可以是细胞应答(即细胞介导的，如细胞毒性T淋巴细胞介导的)或体液应答(即抗体介导的应答)，并且可以是主要或次要免疫应答。增强免疫应答的实例包括增加的CD4⁺辅助T细胞活性和细胞溶解性T细胞的产生。可以使用本领域技术人员已知的许多体外或体内测量来评估免疫应答的增强，所述测量包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞测定，细胞因子释放(例如IL-2产生或IFN-γ产生)，肿瘤消退，携带肿瘤的动物的存活，抗体产生，免疫细胞增殖，细胞表面标志物的表达和细胞毒性。典型地，本公开的方法与未治疗的哺乳动物或没有使用本文公开的方法治疗的未治疗的哺乳动物的免疫应答相比，增强了哺乳动物的免疫应答。在一个实施方案中，免疫应答是细胞因子产生，特别是IFN-γ产生或IL-12产生。在另一个实施方案中，免疫应答是增强的B细胞增殖。

本文公开的IL-15融合蛋白可以作为单一疗法单独使用，或者更经常地，可以与细胞免疫疗法、靶向疗法、化疗或放疗组合使用。

与细胞免疫疗法的组合使用

在一些实施方案中，本文公开的IL-15融合蛋白与细胞免疫疗法(也称为过继性细胞疗法)组合使用。众所周知，细胞免疫疗法是一种利用人体免疫***的细胞来消除癌症的治疗方式。其中一些方法涉及直接分离我们自身的免疫细胞，并简单地扩大它们的数量(例如，通过在体外激活和扩大患者的免疫细胞并输注到患者中进行)，而其他方法则涉及对免疫细胞进行基因工程化(通过基因疗法)以增强它们的抗癌能力。细胞免疫疗法可以以不同方式部署，包括但不限于肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)疗法、工程化T细胞受体(TCR-T)疗法、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法、CAR NK细胞疗法、天然杀伤(NK)细胞疗法。

与靶向疗法和化疗组合使用

本文公开的异二聚体融合蛋白可作为唯一的活性成分或与佐剂联合或与其他药物如抗癌剂、免疫调节剂或其他抗炎剂联合施用，例如用于治疗或预防上述疾病。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于治疗抗体、细胞毒性剂、细胞抑制剂、抗血管生成剂、减积剂、放疗和放射治疗剂、靶向抗癌剂、BRM、癌症疫苗、细胞因子、激素疗法、放射疗法和抗转移剂以及免疫治疗剂。

例如，本文所述的异二聚体融合蛋白可与多种单克隆抗体结合使用，如针对肿瘤相关抗原或通路的抗体，如针对PD-1/PD-L1、TIM-3、LAG-3、VEGF、HER2、CTLA-4；针对白细胞受体，如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86或其配体的抗体；CD3衔接抗体、NK衔接抗体；实现ADCC的抗肿瘤相关抗原；针对TNF的单克隆抗体等等。这些抗体可以包括但不限于：abciximab、adalimumab、alefacept、alemtuzumab、basiliximab、belimumab、bezlotoxumab、canakinumab、塞妥珠单抗(certolizumabpegol)、西妥昔单抗、daclizumab、denosumab、efalizumab、golimumab、inflectra、ipilimumab、ixekizumab、natalizumab、纳武单抗、olaratumab、omalizumab、palivizumab、帕尼单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、利妥昔单抗、tocilizumab、曲妥珠单抗、secukinumab和ustekinumab。

抗体可以是单特异性或多特异性的。例如，抗体可以是三特异性抗体(TrAb或TrioMab)，它有两个用于抗原结合的可变片段和一个用于招募免疫细胞的Fc成分。TrAb的一个例子是用于治疗EpCam阳性胃肿瘤和卵巢肿瘤的Catumaxomab。抗体也可以是双特异性T细胞衔接抗体(BiTE)，如Blinatumomab、MEHD7945A、ABT-122、XmAb5871等。

在一些实施方案中，本文所述的异二聚体融合蛋白可与以下组合使用：免疫调节化合物，例如具有CTLA4的至少一部分胞外结构域或其突变体的重组结合分子；粘附分子抑制剂，例如LFA-1拮抗剂、ICAM-1或ICAM-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；促炎症细胞因子的阻断剂、IL-1阻断剂；趋化因子阻断剂；或化疗剂。

为了本公开的目的，“化疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这类化学试剂通常针对细胞生长或***所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和***的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝***。通常，化疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成癌性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这类药剂通常是组合使用的，并且组合使用通常是最有效的，例如在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。可以与本公开的融合蛋白组合使用的抗癌剂(作为缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于例如紫杉醇、吉西他滨、顺铂、多柔比星、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、康普瑞汀、亚叶酸等。

例如，本文所述的异二聚体融合蛋白可与DMARD结合使用，如金盐、柳氮磺胺吡啶、抗疟药、甲氨蝶呤、D-青霉胺、硫唑嘌呤、霉酚酸、环孢素A、他克莫司、西罗莫司、米诺环素、来氟米特、糖皮质激素；钙素酶抑制剂，如环孢素A或FK506；淋巴细胞再循环的调节剂，如FTY720和FTY720类似物；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573或TAFA-93；具有免疫抑制特性的子囊霉素(ascomycin)，例如ABT-281、ASM981等；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；来氟米特；米佐利宾；霉酚酸；霉酚酸酯；15-脱氧精胍菌素或其免疫抑制同系物、类似物或衍生物。

将理解的是，在上述选定的实施方案中，这种抗癌剂可包括缀合物，并可在施用前与所公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白缔合。更具体地说，在某些实施方案中，选定的抗癌剂将与工程化的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白的未配对半胱氨酸连接，以提供本文所述的工程化缀合物。因此，这种工程化的缀合物被明确认为是在本公开的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含上述不同治疗剂的缀合物一起施用。

很容易理解的是，与本文公开的IL-15融合蛋白组合使用的抗癌剂或免疫调节剂应与IL-15融合蛋白相容，即不会降低、干扰或消除本文公开的IL-15融合蛋白的效果，优选能提供协调甚至协同的效果。

作为多特异性抗体中的免疫增强成分/部分

本文所公开的IL-15融合蛋白和异二聚体融合蛋白可与抗原特异性结合部分缔合以形成多特异性抗体复合物。例如，抗原结合部分(例如包括重链可变区和轻链可变区)可与IL-15蛋白结构域的N端或C端融合。这样的多特异性抗体复合物不仅对靶抗原具有高亲和力，而且具有IL-15促进免疫细胞增殖的效力。

与放射疗法组合使用

本公开还提供了IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射，X-射线，UV-照射，微波，电子发射等)的组合。还涵盖了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且所公开的融合蛋白可以与靶向性抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个序贯剂量施用。

药物包装和试剂盒

还提供了包含含有一个或多个剂量的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲剂，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者，在一些实施方案中，组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐水溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。

本公开还提供了用于产生融合蛋白以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的组合物。在其他优选实施方案中，容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含融合蛋白的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化疗剂或放疗药物；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。

更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需药剂的不同容器。在提供组合治疗的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。或者，试剂盒的融合蛋白和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌的药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。涵盖溶剂也可以提供于另一个容器中。

如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用IL-15/IL-15Rα-Fc融合蛋白和任何任选组分的工具，例如一种或多种针，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过这些工具可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本公开的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注射或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。

序列表汇总

下表A提供了所包含的序列的汇总。融合蛋白W369-E17-TxU1-V00XX.uIgG1V42、W369-E17-TxU1-V00XX.uIgG1V47或W327151-TXU1.P1-V000X.uIgG1V805的名称在整个说明书中可以分别简化为V00XX.uIgG1V42(或V00XX-V42)、V00XX.uIgG1V47(或V00XX-V47)和V000X.uIgG1V805(或V000X-V805)，X指示具体的变体编号。

表A

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本公开，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本公开。这些实施例不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1：材料、IL-15变体和融合蛋白的准备

1.1材料的准备

表1提供了实施例中使用的商品化材料的信息。

表1

1.2IL-15变体、融合蛋白和BMK的产生

构建针对BMK和IL15/IL15Rα-Fc变体的表达载体

两种异二聚体IL15/IL15Rα-Fc融合蛋白XENP24306和XENP20818在US20180118805A1中公开(其全部内容通过引用纳入本文)，被用作以下实验的基准。XENP24306利用包括D30N/E64Q/N65D突变的IL-15变体，而XENP20818利用野生型IL-15蛋白。根据US20180118805A1(Seq.382-387和Seq.52-57)合成了XENP24306(称为"W369-BMK1")和XENP20818(称为"W369-BMK2")的DNA片段，并将其亚克隆到pcDNA3.4表达载体，然后用于转染生产蛋白质。

还合成了编码表2所列IL-15变体、IL15Rα、V47 Fc形式或V42 Fc形式的DNA片段，并将其亚克隆到分别的表达载体中，然后转染用于蛋白生产。生成的异二聚体融合蛋白的结构如图1a所示。为简单起见，这些异二聚体IL-15融合蛋白的命名也可以在整个说明书中缩写为"V00XX.uIgG1V42"、"V00XX.uIgG1V47"或"V00XX.uIgG1V805"的形式。

表2：IL-15异二聚体融合蛋白

HEK 293细胞中的小规模蛋白质表达

将Expi293细胞(Thermofisher，A14635)用如上所述构建的质粒进行转染，按照制造商建议的方案培养5天。收集上清液并通过SDS-PAGE进行分析，或过滤并用蛋白A柱进行目标蛋白纯化。纯化的Fc标记的蛋白质的浓度通过在280nm处的吸光度来确定。通过SDS-PAGE和SEC-HPLC分别检测其大小和纯度，然后储存在-80℃。

通过SEC-HPLC检测纯度

使用Agilent 1260Infinity HPLC通过SEC-HPLC测试异二聚体蛋白的纯度。使用50mM磷酸钠、0.15M氯化钠、pH 7.0的缓冲液，将50μL的蛋白质溶液注入TSKgelSuperSW3000柱上。运行时间为20分钟。柱上的峰保留时间在280nm处监测。使用ChemStation软件(V2.99.2.0)对数据进行分析。

实施例2：体外表征

2.1人/小鼠/食蟹猴PBMC中的Ki-67增殖测定

如上所述，产生了含有不同IL15变体与V47、V42或V805 Fc形式融合的异二聚体IL15/IL15Rα-Fc融合蛋白，并筛选出效力减弱的变体。简而言之，用与V47/V42/V805 Fc形式融合的野生型IL15或IL-15变体以指定的浓度处理人的PBMC。处理后4天，用抗CD3、抗CD8和抗CD56对PBMC进行染色，为CD8+T细胞(CD3+/CD8+)和NK细胞(CD3-/CD56+)设门控，然后用抗Ki67和Foxp3/转录因子染色缓冲液组对细胞内Ki67进行染色。淋巴细胞首先在SSC和FSC的基础上进行门控。然后根据CD3、CD8和CD56的表达对淋巴细胞进行门控，以鉴定CD8+T和NK细胞。使用FACS测量CD8+T和NK细胞上Ki67的百分比。对小鼠脾脏细胞和食蟹猴PBMC分别进行同样的程序，并测量CD8+T和NK细胞上Ki67的百分比。

野生型IL-15诱导了CD8+T细胞和NK细胞的强烈增殖。在处理人PBMC后，通过Ki-67增殖测量的(图1b)结果显示，含有野生型(wt)IL-15部分的两个Fc变体V42和V47，即V0001.uIgG1V42和V0001.uIgG1V47，显示了相当的CD8+T细胞和NK细胞增殖，类似于W369-BMK2，，表明将另外的突变(“G236R/L328R”和“M252Y/S254T/T256E”)引入Fc v47对IL-15部分效力的影响很小。

图2和图4-9说明了用指定浓度的不同IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，CD8+T细胞和NK细胞中Ki67的表达百分比。表3-4显示了通过FACS获得的EC50值。如结果所示，与W369-BMK2(IL-15wt)相比，V0003、V0005-V0009、V0011、V0014-V0016、V0018-V0020、V0058-V0069、V0088和V0091(V42形式或V47形式两种情况)的效力有不同程度的降低，其中V0007和V0008在刺激CD8+T和NK细胞方面变得几乎没有活性。

图17-18和表5说明了V805 Fc形式的融合蛋白的相应结果。

表3A.用IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，人和小鼠CD8+T细胞和NK细胞上Ki67表达百分比的EC50的倍数变化

表3B.用IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，人和小鼠CD8+T细胞和NK细胞的Ki67表达百分比的EC50的倍数变化

表4.用IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，人CD8+T细胞和NK细胞上Ki67表达百分比的EC50的倍数变化

表5A.用IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，人CD8+T细胞和NK细胞上Ki67表达百分比的EC50的倍数变化

表5B.用IL-15/Rα-Fc融合蛋白处理后，食蟹猴CD8+T细胞和NK细胞上Ki67表达百分比的EC50的倍数变化

2.2pSTAT5增殖测定

IL-15和IL-15Rα的反式呈递驱动STAT5的磷酸化，并随后驱动NK细胞和T细胞的增殖。因此，通过CD8+T和NK细胞在与指定的IL-15/Rα-Fc变体孵育30分钟后，分析STAT5的磷酸化情况。处理结束后，立即用BD Phosflow固定缓冲液I固定PBMC然后与预冷的BDPhosflow孵育。使用渗透缓冲液III进行透化处理。孵育后，用抗CD3、抗CD56和抗pSTAT5在室温对细胞染色30-40分钟。首先根据SSC和FSC对淋巴细胞进行门控，然后基于CD3和CD56的表达进行门控以鉴定NK细胞。最后，确定不同细胞群中STAT5的磷酸化水平。

用V0005、V0006、V0009、V0015、V0018和V0020处理后，NK细胞的STAT5磷酸化程度有不同程度的降低(图3)，与通过Ki-67测定的NK增殖相当一致。

2.3结构建模

IL-15变体的同源模型是使用已解析的IL-15晶体结构(PDB：4GS7)为模板，在Discovery Studio中构建的。生成了10个模型，并根据DOPE评分在Discovery Studio中挑选出最佳模式。与α、β和γ受体的相互作用模型是通过在PyMol中把IL-15变体模型叠加到现有的复合物晶体结构(PDB：4GS7)上获得的。所有的结构都在PyMol中进行了可视化和分析。结果显示在图19中。

IL-15的四重复合物包含其专有的IL-15Rα和与IL-2共享的信号传导受体IL-2Rβ和Rγ。IL-15结构包含四个螺旋(A、B、C和D)，由不同的环连接(Ring,Aaron M.等人."Mechanistic and structural insight into the functional dichotomy between IL-2and IL-15."Nature immunology 13.12(2012):1187-1195)。螺旋A由SEQ ID NO:1中1至17位的氨基酸('NWVNVISDLKKIEDLIQ')组成；螺旋B由SEQ ID NO：1中第32至53位的氨基酸('HPSCKVTAMKCFLLELQVISLE')组成；螺旋C由SEQ IDNO:1的第57至77位的氨基酸('ASIHDTVENLIILANNSLSSN')组成；和螺旋D由SEQ ID NO:1的第95至113位的氨基酸('IKEFLQSFVHIVQMFINT')组成。

研究发现，N端螺旋(螺旋A)与IL-2Rβ和Rγ两者相互作用，第三螺旋(螺旋C)与IL-2Rβ相互作用，而C端螺旋(螺旋D)与Rγ相互作用(Ring,Aaron M.等人.“Mechanistic andstructural insight into the functional dichotomy between IL-2and IL-15.”Nature immunology 13.12(2012):1187-1195)。具体地，N65与IL-2Rβ的R42、Q70和Y134形成三个氢键，D8与IL-2Rβ的H133和Y134形成两个氢键；K10与IL-2Rβ的E136形成盐桥；D61与IL-2Rβ的K71形成盐桥；S7与IL-2Rβ的E136形成一个氢键；K11呈递其侧链的脂肪族部分用于与IL-2Rβ的H133的范德华相互作用；I68和L69与IL-2Rβ的T73和V75形成范德华相互作用。

在IL-15上涉及受体结合的关键位置***一个额外的丙氨酸残基，可能会破坏或削弱原有的关键相互作用(如氢键、盐桥等)，降低IL-15的结合亲和力以及其相应的生物效力(如刺激T/NK细胞增殖的能力)。图19显示了两个例子。IL-15变体(v0001)的模型表明，在第8位***丙氨酸能潜在地破坏D8(IL-15螺旋A)和H133/Y134(受体β)之间形成的两个原有氢键，并削弱S7(IL-15螺旋A)和E135(受体β)之间形成的原有氢键。同样，IL-15变体(v0005)的模型表明，在第65位***丙氨酸能潜在地破坏N64(IL-15螺旋C)和R42/Q70(受体β)之间的氢键，并打破E65(IL-15螺旋C)和R42(受体β)之间的盐桥。

在螺旋A/C中***其他氨基酸，如非极性氨基酸(Gly、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Phe、Pro)、极性氨基酸(Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln)和带电荷氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His)和甚至非天然氨基酸也可能影响IL-15的效力。这可以用两个潜在的机制来解释：(A)破坏螺旋A/C的稳定性，从而影响结合；(B)推动螺旋A/C中其他残基的位置，从而与原始氨基酸的关键相互作用不再匹配。

实施例3：体内表征

选择食蟹猴作为研究对象，因为食蟹猴被证明是进行PK/PD和毒性研究的合适物种。该研究是按照CFDA的非临床药物评价良好实验室规范设计的。

猴子被单独饲养在不锈钢板条笼里。动物房保持12/12小时的光照/黑暗周期(光照/黑暗周期在第0天因给药后8小时取血样而中断)，温度范围为16-26℃(60.8-78.8℉)，相对湿度范围为40-70％。每天提供由北京KeAoXieLi Feed Company Ltd供应的饲料，饲料量与动物的大小和年龄相适应。每天给猴子喂食两次，间隔约6小时。给药日的第一次喂食是在给药后约0.5小时提供。前一天剩余的任何食物在喂食前被丢弃。水是由自动饮水机提供的。饮食或水中不存在预期会干扰本研究结果的任何污染物。

将2至3岁、开始用药时体重为2.90kg至4.01kg的四只雄猴和四只雌猴纳入研究。在给药前的开始阶段，每只猴子都通过项圈标签和笼卡上的标识识别。在分配到剂量组后，给每只猴子分配一个独特的测试号，该号与项圈标签一起在其笼卡上标明。

试验品为W369-BMK1、W369-BMK2、W369-E17-TxU1-V0006.uIgG1V47和W369-E17-TxU1-V0061.uIgG1V47，如上所述的产生并表征。

3.1体内研究设计

隔离期为29天(在给药前阶段之前)。给药前阶段是开始给药前27天。静脉内施用是预定的临床施用途径。

在用药前评估的基础上选择食蟹猴，并根据体重随机分配到各组(n＝2，一雄一雌)。在第0天给猴子静脉内注射W369-BMK1(0.6mpk)、W369-BMK2(0.3mpk)、W369-E17-TxU1-V0006.uIgG1V47(0.6mpk)和W369-E17-TxU1-V0061.uIgG1V47(0.6mpk)，用永久性墨水标记注射部位，在研究期间密切监测注射区的组织。

如所示的，对所有猴子进行了以下观察和测量。

死亡率和临床观察

从隔离区释放后，每天进行一次死亡率检查。在给药前和非给药日，每天进行两次临床观察。

在给药日，临床观察在给药前和给药完成后的0.5、1和4小时进行记录。临床观察包括但不限于：外表、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性质和注射部位的局部反应。

体重

在给药前阶段期间测定一次，并在研究的前2周每周测定两次。

食物消耗

在给药前每天测定两次。在研究的前2周内每天测定一次，禁食期除外(估计为总的每日给与量的0、25、50、75或100％)。

体温

在给药前(第0天)和给药后4h、第1天(24h)、第2天(48h)、第3天(72h)、第4天(96h)、第5天(120h)、第6天(144h)、第7天(168h)、第8天(192h)、第10天(240h)、第12天(288h)和第14天(336h)在直肠测量体温。

血液学和临床生物化学

在给药前(第-4天)和给药后4h、第2天(48h)、第4天(96h)、第6天(144h)、第8天(192h)、第12天(264h)、第14天(336h)收集所有存活猴子的血液进行血液学和临床化学评估。在含有EDTA-K2的试管中收集0.5mL血液用于血液学检查，在没有添加物的试管中收集1.0mL血液用于血清化学测定。

血液学：给药前(第-4天)、给药后4h、第2天(48小时)、第4天(96小时)、第6天(144小时)、第8天(192小时)、第12天(264小时)、第14天(336小时)

临床生物化学：用药前(第-4天)、给药后4h、第2天(48小时)、第4天(96小时)、第6天(144小时)、第8天(192小时)、第12天(264小时)、第14天(336小时)

3.2药代动力学(PK)

3.2.1血液取样

评估所有猴子对试验品的***暴露。在给药前(第-4天)和给药后4h、第1天(24h)、第3天(72h)、第5天(120h)、第7天(168h)、第10天(240h)、第12天(288h)、第14天(336h)、第19天(456h)、第26天(624h)采集血样。在每个时间点，从眼底静脉丛中收集约0.5毫升的血液以采集血清。采血时要特别小心。血液样品被收集到带有添加的EDTA的试管中，并放置在冰上直到对其进行处理。所有的样品都在采集后2小时内处理。

为了进行免疫学分析，在给药前(第-4天)和给药后第7天(168h)、第14天(336h)、第26天(624h)，从所有存活的猴子身上采集约0.5mL血液以收获血清。以3,500 rpm和4摄氏度的条件离心15分钟来收获血清，并在转移之前冷冻保存在大约-70摄氏度或更低的温度。

3.2.2通过ELISA测量药物血清浓度

简言之，ELISA板上涂有1μg/mL山羊抗人IgG Fc(Southern Biotech，L1518-TB09)。Fc-Fc方法描述如下：洗涤和阻断后，加入连续稀释的血清样品，然后用生物素标记的山羊抗人IgG Fc(Southern Biotech，SB-2049-08)作为检测抗体。将HRP-链霉亲和素(Life-SNN1004)和TMB底物(Solarbio，PR1200)用于显色。用多孔板阅读器(Spectra

M5e)在450-540纳米处测量孔的吸光度。根据标准样品生成标准曲线，用SoftMax对血清样品进行分析。结果显示在图10中。

3.2.3通过ELISA测量抗药物抗体(ADA)

用1μg/mL的W369-BMK1、W369-BMK2、W369-E17-TxU1-V0006.uIgG1V47和W369-E17-TxU1-V0061.uIgG1V47包被ELISA板。洗涤和封闭后，加入连续稀释的血清样品，然后用小鼠抗猴IgG-HRP(SB-4700-05)作为检测抗体。然后使用TMB底物(Solarbio，PR1200)进行显色。吸光度的测量同上。以给药前的血清作为基线。结果显示在表7中。

3.2.4数据分析

通过对单个数值的比较以及在适当的情况下对各区间的比较，对数据进行与药物有关的效应的评估。任何发现的意义都是由负责的研究员根据有关科学家的先前经验来确定的。通过使用Phoenix WinNonlin软件(8.1版，Pharsight，Mountain View，CA)对血清浓度进行了非区间药代动力学分析。应用线性/对数梯形规则获得PK参数，数据以均值±SD表示。

试验品的药代动力学在食蟹猴中进行了评估。如图10和表6所示，与野生型IL-15(BMK2)相比，BMK1、V0006和V0061的效力降低明显导致血清半衰期延长。具体来说，体外效力越低(V0061<V0006<BMK1<BMK2)，血清半衰期就越长(V0061>V0006>BMK1>BMK2)。一致的是，较低的效力也增加了Cmax和药物暴露(AUC)，而没有引起毒性，如在并行研究或ADA生产中测量的(表7)。因此，延长的PK曲线可能有助于延长药物暴露和改善药效学。

表6.通过非区室分析(WinNonlin)测定的PK参数

^at1/2用7天-19天的时间点计算.

^bt1/2用4小时-24小时的时间点计算.

表6.通过ELISA测定的ADA产生

ADA标准：OD比(S/N)<2,-；2～5,+；5～10,++；≥10,+++.

3.3药效学(PD)

3.3.1PBMC采集

评估对于试验品，在所有猴中淋巴细胞的增殖情况。在给药前(第-4天)和给药后4h、第1天(24h)、第2天(48h)、第3天(72h)、第4天(96h)、第5天(120h)、第6天(144h)、第7天(168h)、第8天(192h)、第10天(240h)、第12天(288h)、第14天(336h)、第19天(456h)、第26天(624h)采集血样。在每个时间点，从眼底静脉丛采集约1.0mL血液，以收获外周血单核细胞(PBMC)。

将血液样品在室温用10mL ACK裂解液处理5分钟，以450g离心5分钟以收集底部细胞，作为PBMC。用10ml PBS清洗一次后，将细胞重悬在0.4ml PBS中，针对细胞表面标志物CD45、CD3、CD8、CD16或另外的细胞内标志物Ki-67进行染色，并进行流式细胞术分析。

3.3.2流式细胞术

将按上述制备的200微升PBMC在2微升纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32(2.4G2)封闭非特异性结合后，进行细胞表面染色分析。加入2μl的各种缀合荧光色素的单克隆抗体，混合均匀后在黑暗中静置30分钟进行染色。用PBMC清洗一次，并重悬在100μl PBS中。然后在FACS Calibur流式细胞仪(CantoII，BD)上测定，用Flowjo软件分析数据。

对于Ki-67染色，另外100μl染色的PBMC通过Foxp3转录染色缓冲液渗透30分钟。加入2μl的PE-CY7小鼠抗人Ki-67以染色30分钟，然后在FACS Calibur流式细胞仪上测定。在将PBMC与这些变体孵育后，通过Ki-67测定来测量指示的IL-15融合蛋白对人(图8)和食蟹猴(图9)的CD8+T细胞和NK细胞增殖的效力。

值得注意的是，这些变体在人和食蟹猴PBMC中的效力降低程度是一致的，这表明食蟹猴可作为一个有效的替代模型来研究这些IL-15变体在人中的PK/PD效应。

3.3.3细胞因子释放检测

在给药前(第-4天)和给药后1h、4h、8h、第1天(24h)、第3天(72h)、第7天(168h)、第10天(240h)、第14天(336h)采集血液样品。在每个时间点，从眼底静脉丛中收集约0.2毫升的血液以收获血清。使用NHP CBA Th1/Th2细胞因子试剂盒(BD Biosciences)测量血清细胞因子。

已知IL-15对各种免疫细胞表现出广泛的活性，并在体外和体内诱导淋巴细胞扩增。如图11a所示，用野生型IL-15(BMK2)处理食蟹猴导致更早(在第6天达到峰值)但低得多的淋巴细胞增殖(与给药前相比，最大增加约8.4倍)。相比之下，所有其他三种IL-15变体的效力降低，显示出延迟(大约在第8天或更晚达到峰值)但更高的淋巴细胞扩增水平(BMK1、V0006和V0061的平均倍数分别为14.7、5.8和12)。对NK和CD8+T细胞也观察到同样的趋势(图11b，c)：例如，在NK细胞增殖方面，BMK2(wt IL-15)的峰值在第6天为10倍，但BMK1、V0006和V0061的平均倍数增加在第8天分别为48、10和25倍。具体来说，具有最大效力降低的IL-15变体v0061对NK和CD8+T细胞显示出最明显和最持久的PD效应，导致NK/T细胞计数水平在第14天后比给药前水平高出数倍，而在大多数其他治疗组中，NK/T细胞计数已经下降到给药前水平。

与上述观察一致，如图12所示，NK/CD8+T的Ki-67增殖标志物在用BMK2(wt IL-15)治疗的动物中比用效力降低的变体更早达到峰值(第4天，对于BMK1、v0006、v0061为第6天)。

实施例4：探索性毒性研究

为了研究效力降低的IL-15变体对于以前观察到的促炎症细胞因子的毒性的影响，进行了一系列探索性的毒性研究。

4.1炎症细胞因子的释放

如图13所示，所有组在施用后IL-2、TNF、IFN-γ(Th1)和IL-4(Th2)没有明显变化。在BMK2组，施用后8-24小时观察到IL-5(嗜中性粒细胞)的短暂增加，1-72小时观察到IL-6(炎症)的短暂增加，与之前的毒性研究发现一致。所有效力降低的IL-15变体没有显示出明显的炎症细胞因子的产生。

4.2临床观察

接受BMK2(wt IL-15)的猴子在前4天内显示白蛋白明显减少(图14)，表明有潜在的肝损伤。相反，三种效力降低的变体都没有引起这种明显的变化。此外，各组之间的平均体重或任何其他与剂量有关的临床或行为观察均无显著差异(图15)。

4.3血液学和血液生物化学

如图16所示，除了预期观察到的IL-15诱导的短暂淋巴细胞扩增(白细胞、淋巴细胞、单核细胞和基底细胞的计数)之外，所有处理组都没有观察到其他异常。血液生物化学读数也在正常范围内(表8)，表明所有处理组都没有明显的毒性问题。

表8.施用一个剂量的IL-15后食蟹猴的代表性血液学特征(给药前和第19天)

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

                         序列表

<110>  上海药明生物技术有限公司

<120>  长效作用的IL-15及其用途

<130>  IEC206037PCT

<160>  36

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  114

<212>  PRT

<213>  智人

<400>  1

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser

<210>  2

<211>  65

<212>  PRT

<213>  智人

<400>  2

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg

65

<210>  3

<211>  231

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  Fc结构域一条链(V47)

<400>  3

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1               5                   10                  15

Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

            20                  25                  30

Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val

        35                  40                  45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

    50                  55                  60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65                  70                  75                  80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

                85                  90                  95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

            100                 105                 110

Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

        115                 120                 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr

    130                 135                 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145                 150                 155                 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

                165                 170                 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

            180                 185                 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

        195                 200                 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

    210                 215                 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

225                 230

<210>  4

<211>  231

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  Fc结构域另一条链(V47)

<400>  4

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1               5                   10                  15

Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

            20                  25                  30

Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val

        35                  40                  45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

    50                  55                  60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65                  70                  75                  80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

                85                  90                  95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

            100                 105                 110

Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

        115                 120                 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

    130                 135                 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145                 150                 155                 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

                165                 170                 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

            180                 185                 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

        195                 200                 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

    210                 215                 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

225                 230

<210>  5

<211>  231

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  Fc结构域，一条链(V42)

<400>  5

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1               5                   10                  15

Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

            20                  25                  30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

        35                  40                  45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

    50                  55                  60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65                  70                  75                  80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

                85                  90                  95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

            100                 105                 110

Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

        115                 120                 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr

    130                 135                 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145                 150                 155                 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

                165                 170                 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

            180                 185                 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

        195                 200                 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

    210                 215                 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

225                 230

<210>  6

<211>  231

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  Fc结构域，另一条链(V42)

<400>  6

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1               5                   10                  15

Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

            20                  25                  30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

        35                  40                  45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

    50                  55                  60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65                  70                  75                  80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

                85                  90                  95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

            100                 105                 110

Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

        115                 120                 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

    130                 135                 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145                 150                 155                 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

                165                 170                 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

            180                 185                 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

        195                 200                 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

    210                 215                 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

225                 230

<210>  7

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0005-V47, 一条链

<400>  7

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Glu Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

        115                 120                 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val

    130                 135                 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

                165                 170                 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

        195                 200                 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225                 230                 235                 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

                245                 250                 255

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

            260                 265                 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

        275                 280                 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305                 310                 315                 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                325                 330                 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  8

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0005-V47, 另一条链

<400>  8

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  9

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0006-V47, 一条链

<400>  9

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Ser Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

        115                 120                 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val

    130                 135                 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

                165                 170                 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

        195                 200                 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225                 230                 235                 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

                245                 250                 255

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

            260                 265                 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

        275                 280                 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305                 310                 315                 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                325                 330                 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  10

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0006-V47, 另一条链

<400>  10

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  11

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0015-V47, 一条链

<400>  11

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Gln Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

        115                 120                 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val

    130                 135                 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

                165                 170                 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

        195                 200                 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225                 230                 235                 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

                245                 250                 255

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

            260                 265                 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

        275                 280                 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305                 310                 315                 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                325                 330                 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  12

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0015-V47, 另一条链

<400>  12

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  13

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0018-V47, 一条链

<400>  13

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ile Ala Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

        115                 120                 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val

    130                 135                 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

                165                 170                 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

        195                 200                 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225                 230                 235                 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

                245                 250                 255

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

            260                 265                 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

        275                 280                 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305                 310                 315                 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                325                 330                 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  14

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0018-V47, 另一条链

<400>  14

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  15

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0020-V47, 一条链

<400>  15

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Asn Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

        115                 120                 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val

    130                 135                 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

                165                 170                 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

        195                 200                 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225                 230                 235                 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

                245                 250                 255

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

            260                 265                 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

        275                 280                 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305                 310                 315                 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                325                 330                 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  16

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0020-V47, 另一条链

<400>  16

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  17

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0058-V47, 一条链

<400>  17

Asn Trp Val Asn Val Ile Asn Asp Leu Gln Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ala Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

        115                 120                 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val

    130                 135                 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

                165                 170                 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

        195                 200                 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225                 230                 235                 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

                245                 250                 255

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

            260                 265                 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

        275                 280                 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305                 310                 315                 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                325                 330                 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  18

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0058-V47, 另一条链

<400>  18

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  19

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0061-V47, 一条链

<400>  19

Asn Trp Val Asn Val Ile Asn Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ala Val Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

        115                 120                 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val

    130                 135                 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

                165                 170                 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

        195                 200                 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225                 230                 235                 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

                245                 250                 255

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

            260                 265                 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

        275                 280                 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305                 310                 315                 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                325                 330                 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  20

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0061-V47, 另一条链

<400>  20

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  21

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0063-V47, 一条链

<400>  21

Asn Trp Val Asn Val Ile Asn Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ala Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

        115                 120                 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val

    130                 135                 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

                165                 170                 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

        195                 200                 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225                 230                 235                 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

                245                 250                 255

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

            260                 265                 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

        275                 280                 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305                 310                 315                 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                325                 330                 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  22

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0063-V47, 另一条链

<400>  22

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  23

<211>  350

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0067-V47, 一条链

<400>  23

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ala Val Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

        115                 120                 125

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val

    130                 135                 140

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

                165                 170                 175

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

            180                 185                 190

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

        195                 200                 205

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

    210                 215                 220

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

225                 230                 235                 240

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

                245                 250                 255

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

            260                 265                 270

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

        275                 280                 285

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

    290                 295                 300

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

305                 310                 315                 320

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

                325                 330                 335

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  24

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0067-V47, 另一条链

<400>  24

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  25

<211>  351

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0001.uIgG1V805, 一条链

<400>  25

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Ala Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu

1               5                   10                  15

Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val

            20                  25                  30

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu

        35                  40                  45

Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val

    50                  55                  60

Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

65                  70                  75                  80

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

                85                  90                  95

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

            100                 105                 110

Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

        115                 120                 125

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser

    130                 135                 140

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg

145                 150                 155                 160

Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

                165                 170                 175

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

            180                 185                 190

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

        195                 200                 205

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

    210                 215                 220

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

225                 230                 235                 240

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

                245                 250                 255

Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

            260                 265                 270

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

        275                 280                 285

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

    290                 295                 300

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

305                 310                 315                 320

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

                325                 330                 335

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  26

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0001.uIgG1V805, 另一条链

<400>  26

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  27

<211>  351

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0002.uIgG1V805, 一条链

<400>  27

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Ala Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu

1               5                   10                  15

Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val

            20                  25                  30

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu

        35                  40                  45

Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val

    50                  55                  60

Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

65                  70                  75                  80

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

                85                  90                  95

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

            100                 105                 110

Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

        115                 120                 125

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser

    130                 135                 140

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg

145                 150                 155                 160

Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

                165                 170                 175

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

            180                 185                 190

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

        195                 200                 205

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

    210                 215                 220

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

225                 230                 235                 240

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

                245                 250                 255

Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

            260                 265                 270

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

        275                 280                 285

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

    290                 295                 300

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

305                 310                 315                 320

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

                325                 330                 335

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  28

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0002.uIgG1V805, 另一条链

<400>  28

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  29

<211>  351

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0003.uIgG1V805, 一条链

<400>  29

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Ala Lys Lys Ile Glu Asp Leu

1               5                   10                  15

Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val

            20                  25                  30

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu

        35                  40                  45

Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val

    50                  55                  60

Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

65                  70                  75                  80

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

                85                  90                  95

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

            100                 105                 110

Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

        115                 120                 125

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser

    130                 135                 140

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg

145                 150                 155                 160

Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

                165                 170                 175

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

            180                 185                 190

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

        195                 200                 205

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

    210                 215                 220

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

225                 230                 235                 240

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

                245                 250                 255

Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

            260                 265                 270

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

        275                 280                 285

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

    290                 295                 300

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

305                 310                 315                 320

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

                325                 330                 335

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  30

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0003.uIgG1V805, 另一条链

<400>  30

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  31

<211>  351

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0004.uIgG1V805, 一条链

<400>  31

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Ala Lys Ile Glu Asp Leu

1               5                   10                  15

Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val

            20                  25                  30

His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu

        35                  40                  45

Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val

    50                  55                  60

Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

65                  70                  75                  80

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

                85                  90                  95

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

            100                 105                 110

Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

        115                 120                 125

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser

    130                 135                 140

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg

145                 150                 155                 160

Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

                165                 170                 175

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

            180                 185                 190

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

        195                 200                 205

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

    210                 215                 220

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

225                 230                 235                 240

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

                245                 250                 255

Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

            260                 265                 270

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

        275                 280                 285

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

    290                 295                 300

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

305                 310                 315                 320

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

                325                 330                 335

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  32

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0004.uIgG1V805, 另一条链

<400>  32

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  33

<211>  351

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0005.uIgG1V805, 一条链

<400>  33

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Ala Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

65                  70                  75                  80

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

                85                  90                  95

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

            100                 105                 110

Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

        115                 120                 125

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser

    130                 135                 140

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg

145                 150                 155                 160

Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

                165                 170                 175

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

            180                 185                 190

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

        195                 200                 205

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

    210                 215                 220

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

225                 230                 235                 240

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

                245                 250                 255

Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

            260                 265                 270

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

        275                 280                 285

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

    290                 295                 300

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

305                 310                 315                 320

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

                325                 330                 335

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  34

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0005.uIgG1V805, 另一条链

<400>  34

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

<210>  35

<211>  351

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0006.uIgG1V805, 一条链

<400>  35

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Ala Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn

65                  70                  75                  80

Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn

                85                  90                  95

Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile

            100                 105                 110

Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr

        115                 120                 125

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser

    130                 135                 140

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg

145                 150                 155                 160

Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

                165                 170                 175

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

            180                 185                 190

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

        195                 200                 205

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

    210                 215                 220

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

225                 230                 235                 240

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

                245                 250                 255

Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

            260                 265                 270

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

        275                 280                 285

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

    290                 295                 300

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

305                 310                 315                 320

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

                325                 330                 335

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

            340                 345                 350

<210>  36

<211>  301

<212>  PRT

<213>  人工序列

<220>

<223>  V0006.uIgG1V805, 另一条链

<400>  36

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn

        35                  40                  45

Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

    50                  55                  60

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

65                  70                  75                  80

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Val Phe

                85                  90                  95

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro

            100                 105                 110

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

        115                 120                 125

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

    130                 135                 140

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

                165                 170                 175

Lys Val Ser Asn Lys Ala Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

            180                 185                 190

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

    210                 215                 220

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

225                 230                 235                 240

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

                245                 250                 255

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

            260                 265                 270

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

        275                 280                 285

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

    290                 295                 300

Claims (38)

1.一种IL-15变体，其中与野生型IL-15相比，所述IL-15变体在刺激免疫细胞增殖(如NK细胞和/或CD8+T细胞增殖)方面的效力降低并且具有包含一个或多个选自下组的突变的氨基酸序列：

(a)S7N、S7Q、S7A、S7D、S7E、S7F、S7G、S7H、S7I、S7K、S7L、S7M、S7P、S7R、S7T、S7V、S7W和S7Y取代；

(b)D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30E、D30Q、H32N、D61Q和N65Q取代；

(c)I68A、I68V、I68F、I68G、I68K、I68R、I68L、I68M、I68Q、I68D、I68E、I68H、I68N、I68P、I68S、I68T、I68W和I68Y取代；

(d)L69A、L69V、L69D、L69E、L69F、L69G、L69H、L69I、L69K、L69M、L69N、L69P、L69Q、L69R、L69S、L69T、L69W和L69Y取代；

(e)Q108N和N112Q取代；

(f)在螺旋A的氨基酸序列中的***，其中螺旋A的氨基酸序列由SEQ IDNo:1的第1至17位组成；和

(g)在螺旋C的氨基酸序列中的***，其中螺旋C的氨基酸序列由SEQ IDNo：1的第57至77位的氨基酸组成。

2.权利要求1的IL-15变体，其中所述氨基酸序列包含一个或多个选自下组的取代：S7N、D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30Q、D61Q、N65Q、I68A、I68F、I68G、I68K、I68R、L69A、L69V和Q108N。

3.权利要求1的IL-15变体，其中所述氨基酸序列包含一个选自下组的取代：S7N、D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30Q、D61Q、N65Q、I68A、I68F、I68G、I68K、I68R、L69A、L69V和Q108N。

4.权利要求1的IL-15变体，其中所述氨基酸序列包括至少两个(如两个或三个)选自下组的取代：S7N、D8E、D8S、D8T、D8Q、K10Q、D30Q、D61Q、N65Q、I68A、I68F、I68G、I68K、I68R、L69A、L69V和Q108N。

5.权利要求1或4的IL-15变体，其中所述氨基酸序列包括选自S7N、K10Q、I68A和L69V的两个或更多个取代。

6.权利要求5的IL-15变体，其中所述氨基酸序列包括：

(a)S7N/K10Q、S7N/I68A、S7N/L69V、K10Q/I68A、K10Q/L69V或I68A/L69V的双重取代；或

(b)S7N/K10Q/I68A、K10Q/I68A/L69V、S7N/K10Q/L69V或S7N/I68A/L69V的三重取代。

7.权利要求1的IL-15变体，其中所述***是一个氨基酸的***，该***破坏了螺旋A和IL-2Rβ之间、螺旋A和IL-2Rγ之间或螺旋C和IL-2Rβ之间形成的氢键、盐桥和/或范德华相互作用。

8.权利要求7的IL-15变体，其中所述***发生在I6和S7之间，S7和D8之间，D8和L9之间，L9和K10之间，K10和K11之间，K11和I12之间，H60和D61之间，D61和T62之间，E64和N65之间，N65和L66之间，I67和I68之间，I68和L69之间，和/或L69和A70之间。

9.权利要求7或8的IL-15变体，其中***的氨基酸包含非极性氨基酸如Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Met、Trp、Phe、Pro，极性氨基酸如Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln，带电荷氨基酸如Asp、Glu、Lys、Arg、His，以及非天然氨基酸。

10.权利要求9的IL-15变体，其中***的氨基酸是Ala。

11.前述权利要求中任一项的IL-15变体，其中刺激NK细胞和/或CD8+T细胞增殖的效力是通过FACS在增殖测定中测量的。

12.权利要求11的IL-15变体，其中所述增殖测定使用Ki-67和/或pSTAT5作为标志物。

13.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白包括前述权利要求中任一项的IL-15变体可操作地连接于非IL-15部分。

14.权利要求13的融合蛋白，其中所述非IL-15部分是抗原结合结构域或Fc结构域。

15.权利要求14的融合蛋白，其中所述Fc结构域是人IgG Fc，如人IgG1Fc或IgG2 Fc或IgG3 Fc或IgG4 Fc，或其变体。

16.权利要求13-15中任一项的融合蛋白，其中所述IL-15变体通过接头例如肽接头可操作地连接到所述非IL-15部分，所述肽接头为例如(G4S)n，其中n＝1-5。

17.一种异二聚体融合蛋白，其包含：

(A)第一条链，该链包含IL-15结构域可操作地连接于Fc结构域的一条链，其中所述IL-15结构域包括权利要求1-12中任一项的IL-15变体；和

(B)第二条链，该链包含IL-15Rα结构域可操作地连接于Fc结构域的另一条链。

18.权利要求17的异二聚体融合蛋白，其中所述IL-15Rα结构域包含或组成为野生型IL-15Rα蛋白、IL-15Rα变体或其保留IL-15结合活性的任何片段，例如SEQ ID No:2中所示的片段。

19.权利要求17或18的异二聚体融合蛋白，其中所述Fc结构域包括人IgG Fc，如人IgG1Fc或IgG2 Fc或IgG3 Fc或IgG4 Fc，或其变体。

20.权利要求19的异二聚体融合蛋白，其中Fc变体的每条链与野生型人Fc相比包括一个或多个取代以促进异二聚化，所述取代为例如把手入孔结构。

21.权利要求20的异二聚体融合蛋白，其中所述Fc变体：

(a)在一条链中包含与SEQ ID No:3具有至少80％的同一性的氨基酸序列，和在另一条链中包含与SEQ ID No:4具有至少80％的同一性的氨基酸序列；或

(b)在一条链中包含与SEQ ID No:5具有至少80％同一性的氨基酸序列，和在另一条链中包含与SEQ ID No:6具有至少80％的同一性的氨基酸序列。

22.权利要求17-21中任一项的异二聚体融合蛋白，其中所述IL-15结构域和/或IL-15Rα结构域通过接头例如肽接头可操作地连接到Fc结构域，所述肽接头为例如(G4S)n，其中n＝1-5。

23.权利要求17-22中任一项的异二聚体融合蛋白，其中第一链包括SEQ ID No:7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35中所示的氨基酸序列，和/或第二链包括SEQID No:8、10、12、14、16、18、20、24、26、28、30、32、34或36中所示的氨基酸序列。

24.权利要求23的异二聚体融合蛋白，其中：

(a)第一链包括SEQ ID No:9中所示的氨基酸序列，和第二链包括SEQ IDNo:10中所示的氨基酸序列；或

(b)第一条链包括SEQ ID No:19中所示的氨基酸序列，和第二条链包括SEQ ID No:20中所示的氨基酸序列。

25.一种分离的核酸分子，其包括编码权利要求1-12中任一项的IL-15变体的核酸序列。

26.包含权利要求25的核酸分子的载体。

27.包含权利要求26的载体的宿主细胞。

28.一种药物组合物，其包含权利要求17-24中任一项的异二聚体融合蛋白和药学上可接受的载剂。

29.一种免疫缀合物，其包含权利要求1-12中任一项的IL-15变体或权利要求17-24中任一项的异二聚体融合蛋白缀合于药剂，所述药剂如多肽、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。

30.一种用于生产权利要求17-24中任一项的异二聚体融合蛋白的方法，其包括以下步骤：

-在包含编码异二聚体融合蛋白的一条链或两条链的载体的宿主细胞中表达所述异二聚体融合蛋白；和

-从宿主细胞培养物中分离出所述异二聚体融合蛋白。

31.一种调节受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用权利要求17-24中任一项的异二聚体融合蛋白或权利要求28的药物组合物，任选地该免疫应答与NK细胞或CD8+T细胞有关。

32.一种用于治疗或预防受试者中的癌症或感染性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求17-24中任一项的异二聚体融合蛋白或权利要求28的药物组合物。

33.权利要求32的方法，其进一步包括施用另外的抗肿瘤疗法，例如细胞免疫疗法，包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)疗法、T细胞受体(TCR)疗法、嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法和NK细胞疗法，以及靶向疗法和化疗。

34.权利要求32或33的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾细胞癌、肝癌、***癌、胃癌、胰腺癌、NSCLC、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

35.权利要求32或33的方法，其中所述感染性疾病是由病毒、细菌、真菌或寄生生物感染引起的。

36.权利要求17-24中任一项的异二聚体融合蛋白在制备用于预防、治疗和/或管理病症(例如癌症、感染性疾病、免疫缺陷或淋巴细胞减少症)的药物中的用途，其中所述病症受益于增强IL-15介导的功能。

37.权利要求17-24中任一项的异二聚体融合蛋白，其用于治疗或预防癌症或感染性疾病。

38.一种用于治疗或诊断癌症的试剂盒，包括包含权利要求17-24中任一项的异二聚体融合蛋白或权利要求29的免疫缀合物的容器。

Images