CN110862967A - 一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系silk-nk - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK‑NK。本发明提供了一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK‑NK的制备方法，包括如下步骤：将含有IL‑15蛋白和IL‑15Rα的IL‑15结合区的蛋白复合物以膜结合的方式表达于NK‑92细胞系的表面，然后用无IL‑2的培养基进行培养，得到的克隆化细胞系即为自然杀伤细胞系SILK‑NK。该细胞系可在完全不添加IL‑2的培养基中稳定传代扩增，并且能够保持NK‑92的杀伤活性，因此成为具有临床应用价值的工程细胞系，可用于肿瘤的过继免疫治疗。

Description

一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK
技术领域
本发明涉及肿瘤的过继免疫治疗领域，具体涉及一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK及其制备方法。
背景技术
NK(Nature Killer)细胞是免疫***中一类重要的细胞毒性杀伤细胞，它能够释放穿孔素和细胞因子诱导癌症细胞凋亡。NK细胞对靶细胞的识别不具有MHC限制性和肿瘤相关抗原依赖性，因此具有比T细胞更广谱的抗肿瘤能力。NK细胞的非MHC限制性使得它可以支持异体移植，并且能够杀伤那些通过降低MHC分子表达来躲避T细胞杀伤的癌细胞。NK细胞不会大量分泌IL-6，因此不会造成强烈的细胞因子风暴。但是NK细胞在血液细胞中只占10％左右，需要繁琐的血细胞分离与富集过程，而且NK细胞的转染效率较低，也增加了其基因修饰的难度。
NK-92是一株来源于非霍奇金淋巴瘤病人的NK细胞系，它具有NK细胞的优点并克服了NK细胞的缺点。它既拥有MHC非限制性和肿瘤相关抗原非依赖性的广谱抗肿瘤能力，又非常易于大规模培养，而且更容易进行基因操作。更重要的是，NK-92输注病人的临床一期数据已经显示了很高的安全性，即使在1×1010/m2的剂量条件下都未出现严重的不良反应。
NK细胞的增殖和激活需要细胞因子，尤其白细胞介素-2(IL-2)或IL-15。IL-2会刺激Treg细胞增殖，并诱发T细胞凋亡，在临床应用中存在一定的毒副作用。IL-15与IL-2的功能有很多相同的地方，且IL-15是负责NK发育、分化、维持而不可缺少的细胞因子。表达IL-15的NK-92细胞系表现出了更强的增殖能力和癌细胞杀伤能力，但仍然不能摆脱对IL-2的依赖。
发明内容
本发明的目的是提供一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK及其制备方法，以改变NK-92细胞的生物学特性，摆脱对IL-2的依赖，提高增殖和杀伤能力，使NK-92细胞更适于临床应用。
第一方面，本发明要求保护一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK的制备方法。
本发明所提供的不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK的制备方法，可包括如下步骤：将含有IL-15蛋白和IL-15Rα的IL-15结合区的蛋白复合物以膜结合的方式表达于NK-92细胞系的表面，然后用无IL-2的培养基进行培养，得到的克隆化细胞系即为自然杀伤细胞系SILK-NK。
进一步地，所述蛋白复合物自N端到C端依次由IL-15Rα的IL-15结合区、跨膜区和IL-15蛋白组成(如图1所示)。
其中，所述跨膜区可为但不限于CD8α跨膜区。在本发明的具体实施例方式中，所述跨膜区为CD8α跨膜区。
更进一步地，所述IL-15Rα的IL-15结合区的氨基酸序列可为SEQ ID No.1，或者为与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。所述CD8α跨膜区的氨基酸序列可为SEQ ID No.2，或者为与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。所述IL-15蛋白的氨基酸序列可为SEQ ID No.3，或者为与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。
更加具体的，所述蛋白复合物的氨基酸序列可为SEQ ID No.4，或者为与SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。
进一步地，所述方法可包括如下步骤：将所述蛋白复合体的编码基因***到慢病毒表达载体，然后利用所得到的重组慢病毒载体包装出慢病毒(如通过将所得的重组慢病毒载体与包装质粒共转染293T细胞的方式制备得到所述慢病毒)，用所述慢病毒感染所述NK-92细胞系，在无IL-2的培养基中培养并通过有限稀释的方法得到所述克隆化细胞系。
在本发明的具体实施方式中，所述无IL-2的培养基具体为含有终浓度为2.5％(体积百分含量)的血清替代物(如货号：HPCFDCGL50，Helios公司产品)的GT-T551-H3培养基(如货号：WK593S，TAKARA公司产品)。
其中，所述蛋白复合体的编码基因中，编码所述IL-15Rα的IL-15结合区的核苷酸序列可为SEQ ID No.5的第1-216位，或者为与SEQ ID No.5的第1-216位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述IL-15Rα的IL-15结合区的序列。所述蛋白复合体的编码基因中，编码所述CD8α跨膜区的核苷酸序列可为SEQID No.5的第217-423位，或者为与SEQ ID No.5的第217-423位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述CD8α跨膜区的序列。所述蛋白复合体的编码基因中，编码所述IL-15蛋白的核苷酸序列可为SEQ ID No.5的第490-831位，或者为与SEQ ID No.5的第490-831位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述IL-15蛋白的序列。
具体地，所述蛋白复合体的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.5，或者为与SEQ ID No.5具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述蛋白复合体的序列。
第二方面，本发明要求保护由前文所述方法制备得到的不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK。
所述自然杀伤细胞系SILK-NK的STR表型为
Amelogenin：X,Y
CSF1PO：11,12
D13S317：9,12
D16S539：11,12
D5S818：12,13
D7S820：10,11
THO1：6,9.3
TPOX：8
vWA：18
D21S11：31.2,32。
其mRNA反转录PCR可检测到IL-15及IL-15Rα的IL-15结合区的表达。
其形态为悬浮的克隆团或分散细胞。
进一步地，所述自然杀伤细胞系SILK-NK具体为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.15583的细胞系。
第三方面，前文所述的自然杀伤细胞系SILK-NK在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(A1)制备用于肿瘤过继免疫治疗的产品；
(A2)制备用于细胞治疗的相关产品。
如对所述自然杀伤细胞系SILK-NK进行基因改造使其表达一个嵌合抗原受体，利用此嵌合抗原受体的靶向性介导该细胞系对表达靶抗原的癌细胞进行特异性杀伤。对所述自然杀伤细胞系SILK-NK进行基因改造使其表达一个嵌合抗原受体，通过将这种改造过的细胞给病人输注来进行细胞治疗。
本发明通过尝试将IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区复合物同时表达于NK-92，建立一种称作SILK-NK的新型杀伤细胞(Specific Interleukin Linked Killer,SILK-NK)，利用IL-15Rα的IL-15结合区作为IL-15的超级激活剂，用IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区组成的复合体来激活NK-92细胞并提高NK-92细胞的癌细胞杀伤能力。此复合体一方面以膜结合的形式顺式(cis-presented)刺激NK-92，使其在没有添加细胞因子的培养环境下得以增殖，另一方面反式(trans-presented)刺激宿主自体T细胞、NK细胞的增殖与激活，提高其自身抗肿瘤能力。
本发明从NK细胞分化发育过程中起调节作用的细胞因子入手，因为1.IL-15在人体内多种组织都有表达，对NK细胞的分化发育过程起着重要作用；2.NK-92是未分化成熟的NK细胞，细胞表面能够表达IL-15受体；3.IL-15的毒副作用显著小于IL-2；4.IL-15Rα的IL-15结合区能够作为IL-15活性的激活剂。所以，本发明采用表达膜结合的IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区复合体的病毒载体感染NK-92细胞，以期获得表达膜结合IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区复合体的NK-92细胞，通过IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区复合体的反式和顺势激活作用，使NK-92细胞的培养完全摆脱对IL-2的依赖，提高NK-92细胞的增殖能力、杀伤能力以及降低毒副作用，显著提高其在临床上的使用潜力。
本发明的有益效果：现有技术使NK-92表达IL-15可以提高NK-92的细胞杀伤毒性，但其NK-92细胞仍不能摆脱对IL-2的依赖。本发明在NK-92细胞稳定表达膜结合的IL-15与IL-15Rα的IL-15结合区的复合体，利用IL-15Rα的IL-15结合区对IL-15的超级激动剂作用，可以使NK-92细胞在无IL-2的培养条件下长期增殖并拥有更高的杀伤活性，有利于大规模培养和临床应用。
保藏说明
建议分类命名：人自然杀伤细胞系
参椐的生物材料(株)：SILK
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年04月03日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15583
附图说明
图1为本发明的蛋白复合体结构图。A：IL-15Rα的IL-15结合区，B：跨膜区，C：IL-15。
图2为本发明的蛋白复合体的编码核酸序列结构示意图。A：IL-15Rα的IL-15结合区，B：跨膜区，C：IL-15。
图3为本发明的装载了IL-15Rα-TM-P2A-IL-15核酸序列的慢病毒载体图谱。
图4为本发明的SILK-NK-D8细胞与NK-92细胞的形态照片。A是NK-92细胞，B是SILK-NK-D8细胞。
图5为本发明的SILK-NK-D8细胞与NK-92在不同培养时间点测定的3天增值倍数的比较。A是NK-92加100U/mL IL-2培养的3天增值倍数曲线图；B是SILK-NK-D8无IL-2培养的3天增值倍数曲线图。
图6为本发明的RT-PCR鉴定IL-15及IL-15Rα的IL-15结合区的mRNA表达的电泳图。A是NK-92细胞，B是SILK-NK-D8细胞。P1是引物1+引物2，P2是引物3+引物4。
图7为本发明的NK-92和SILK-NK-D8细胞对表达GFP的K562细胞的杀伤实验。荧光显示K562细胞。
图8为本发明的NK-92和SILK-NK-D8细胞对表达萤火虫荧光素酶的K562细胞的杀伤实验。A是NK-92细胞，B是SILK-NK-D8细胞。
图9为本发明的SILK-NK-D8细胞的STR分析结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
NK-92细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，培养基为可用于培养T淋巴细胞和NK细胞的GT-T551-H3培养基(货号：WK593S，TAKARA公司产品)，添加血清替代物(货号：HPCFDCGL50，Helios公司产品))至其终浓度为2.5％(体积百分含量)。
293T培养基为DMEM添加10％(体积百分含量)胎牛血清。
pLTR-abg019：南京尔宾堇生物技术有限公司，货号abg019。
pCMV-dR8.2质粒：Addgene，货号8455。
pCMV-VSV-G质粒：Addgene，货号8454。
表达GFP和荧光素酶的K562细胞系K562-GFP-Luc：南京尔宾堇生物技术有限公司，货号562-GL。
实施例1、不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK的制备及鉴定
一、pLTR-IL15Rα-IL15慢病毒表达载体的构建
如图2和图3所示，IL-15Rα-TM-P2A-IL-15的DNA序列(SEQ ID No.5)合成自南京金斯瑞生物科技股份有限公司，两端加上了BamHI(5’)和MluI(3’)，合成的序列与pLTR-abg019质粒分别用BamH I和Mlu I双酶切后连接并转化DH5α感受态细菌，用IL-15Rα的IL-15结合区序列内的上游引物(SEQ ID No.6)和IL-15序列内的下游引物SEQ ID No.7)做菌落PCR鉴定阳性克隆后测序鉴定得到目的表达质粒pLTR-IL15Rα-IL15。
重组质粒pLTR-IL15Rα-IL15的结构描述为：将pLTR-abg019质粒的酶切位点BamHI和Mlu I之间的小片段替换为SEQ ID No.5所示DNA片段后得到的重组质粒。
SEQ ID No.5为IL-15Rα-TM-P2A-IL-15蛋白复合体的编码基因序列，其中第1-216位为IL-15Rα的IL-15结合区的编码基因，第217-423位为CD8α跨膜区的编码基因，第490-831位为IL-15蛋白的编码基因。SEQ ID No.5编码SEQ ID No.4所示的蛋白质。其中，SEQ IDNo.4的第1-72位为所述IL-15Rα的IL-15结合区的氨基酸序列(即SEQ ID No.1)；SEQ IDNo.4的第73-141位为所述CD8α跨膜区的氨基酸序列(即SEQ ID No.2)；SEQ ID No.4的第164-277位为所述IL-15蛋白的氨基酸序列(即SEQ ID No.3)。
二、pLTR-IL15Rα-IL15质粒包装病毒
将步骤一构建的重组载体pLTR-IL15Rα-IL15、包装质粒pCMV-dR8.2和pCMV-VSV-G以15：10：1的比例(质量比)用PEI(1μg/μl)转染293T细胞。
具体实施为：第0天传代293T细胞8×106个细胞至T75培养瓶；第1天：1mlOpti-MEM中加入三种质粒pLTR-IL15Rα-IL15：pCMV-dR8.2：pCMV-VSV-G＝15μg：10μg：1μg，混匀后加入78μl PEI，震荡混匀后室温放置15分钟，之后加入到培养293T的T75培养瓶中，轻柔摇晃混匀。转染后12-16小时换新鲜培养基。转染后48小时即第3天收集培养基，0.45μM滤膜过滤去除细胞得到病毒原液。病毒原液添加1/3体积的40％PEG，混匀后4℃放置过夜。第二天离心，4℃，1800g，45分钟，弃上清后用病毒原液1/10体积的NK-92培养基(添加终浓度为100U/ml IL-2)重悬病毒沉淀，得到10倍浓缩的病毒悬液。
三、感染NK-92细胞
取3×105NK-92细胞用1mL步骤二制备得到的10倍浓缩病毒重悬并添加8μg/mlpolybrane，转移到24孔板一个孔中，32℃，1500g离心45分钟后转移到二氧化碳培养箱培养，3小时后离心去上清，换添加终浓度为100U/ml IL-2的NK-92培养基；第二天再重复一次感染后换添加终浓度为100U/ml IL-2的NK-92培养基，之后保持3天传代一次。2周后传代时培养基不再添加IL-2，继续培养两周，活下来的细胞即为得到的目的细胞SILK-NK(Specific Interleukin Linked Killer)。得到的细胞在96孔板做梯度稀释，鉴定出5个单克隆细胞系：A6，A9，D8，F6，F7，后续实施例中是用的克隆D8(后续称为SILK-NK-D8)。
SILK-NK-D8于2018年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.15583，建议分类命名为人自然杀伤细胞系；参椐的生物材料(株)为SILK。
四、细胞形态与增殖
如图4，SILK-NK-D8具有和NK-92类似的细胞形态，倾向于形成松散的克隆团，如图5所示，SILK-NK-D8在不添加IL-2的培养基中可以达到2-3天倍增的增殖速率，与NK-92相同。
五、外源基因表达鉴定
SILK-NK-D8和NK-92分别提取总RNA，用Oligo(dT)18做反转录得到cDNA，用针对IL-15Rα的IL-15结合区的引物(P1是引物1+引物2，P2是引物3+引物4)做PCR，如图6所示，1％琼脂糖胶电泳显示SILK-NK-D8有约500bp大小的阳性条带而NK-92没有。
引物1：5’-atgtccgtggaacacgcagac-3’(SEQ ID No.6)；
引物2：5’-cttgaggtcg gagatgacgt tc-3’(SEQ ID No.7)；
引物3：5’-cccagtctcaaatgcattagagacc-3’(SEQ ID No.8)；
引物4：5’-ggtgtcatggatgctggcg-3’(SEQ ID No.9)。
六、细胞杀伤能力检测
用表达GFP和荧光素酶的K562细胞系K562-GFP-Luc做靶细胞，SILK-NK-D8和NK-92分别以10:1,5:1,1:1的比例与1×104靶细胞在96孔板100μl体系中孵育，24小时后检测GFP荧光和荧光素酶。结果如图7和图8所示，SILK-NK-D8与NK-92对K562细胞有相同的杀伤活性。
SILK-NK-D8细胞做STR检测，结果如图9所示，STR表型为
“Amelogenin：X,Y
CSF1PO：11,12
D13S317：9,12
D16S539：11,12
D5S818：12,13
D7S820：10,11
THO1：6,9.3
TPOX：8
vWA：18
D21S11：31.2,32”。
其mRNA反转录PCR可检测到IL-15及IL-15Rα的IL-15结合区的表达。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于上述具体实施方试中的内容，必须要根据权利要求和说明书范围来确定其技术性范围。
<110> 天津天锐生物科技有限公司
<120> 一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK
<130> GNCLN181010
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 72
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln
65 70
<210> 2
<211> 69
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 3
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Lys Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 4
<211> 277
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
65 70 75 80
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
85 90 95
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
100 105 110
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
115 120 125
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Gly Ser Gly
130 135 140
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
145 150 155 160
Pro Gly Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu
165 170 175
Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser
180 185 190
Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu
195 200 205
Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp
210 215 220
Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn
225 230 235 240
Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Lys
245 250 255
Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met
260 265 270
Phe Ile Asn Thr Ser
275
<210> 5
<211> 837
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
atcacgtgcc ctccccccat gtccgtggaa cacgcagaca tctgggtcaa gagctacagc 60
ttgtactcca gggagcggta catttgtaac tctggtttca agcgtaaagc cggcacgtcc 120
agcctgacgg agtgcgtgtt gaacaaggcc acgaatgtcg cccactggac aacccccagt 180
ctcaaatgca ttagagaccc tgccctggtt caccaaacca cgacgccagc gccgcgacca 240
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 300
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga catctacatc 360
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 420
tgcggaagcg gcgccaccaa cttctccctg ctgaagcaag ctggcgacgt ggaagagaac 480
cccggcccca actgggtgaa cgtcatctcc gacctcaaga agatcgagga cctgatccag 540
agcatgcaca tcgacgccac cctgtatacc gagagcgacg tgcacccctc ctgtaaagtg 600
accgccatga agtgcttcct gctggagctg caggtgatca gcctggagag cggcgacgcc 660
agcatccatg acaccgtgga gaacctgatc atcctggcca ataacagcct gagctccaac 720
ggcaacgtga ccgagagcgg ctgcaaggaa tgcgaggagc tggagaagaa gaacattaag 780
gagttcctgc agagcttcgt ccacatcgtg cagatgttca ttaacacctc ctaatga 837
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
atgtccgtgg aacacgcaga c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
cttgaggtcg gagatgacgt tc 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
cccagtctca aatgcattag agacc 25
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ggtgtcatgg atgctggcg 19

Claims (10)

1.一种不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK的制备方法，包括如下步骤：将含有IL-15蛋白和IL-15Rα的IL-15结合区的蛋白复合物以膜结合的方式表达于NK-92细胞系的表面，然后用无IL-2的培养基进行培养，得到的克隆化细胞系即为自然杀伤细胞系SILK-NK。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白复合物自N端到C端依次由IL-15Rα的IL-15结合区、跨膜区和IL-15蛋白组成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述IL-15Rα的IL-15结合区的氨基酸序列为SEQ ID No.1，或者为与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列；
和/或
所述跨膜区为CD8α跨膜区；
进一步地，所述CD8α跨膜区的氨基酸序列为SEQ ID No.2，或者为与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列；
和/或
所述IL-15蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3，或者为与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。
4.根据权利要求3述的方法，其特征在于：所述蛋白复合物的氨基酸序列为SEQ IDNo.4，或者为与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性，或者经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的序列。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将所述蛋白复合体的编码基因***到慢病毒表达载体，然后利用所得到的重组慢病毒载体包装出慢病毒，用所述慢病毒感染所述NK-92细胞系，在无IL-2的培养基中培养并通过有限稀释的方法得到所述克隆化细胞系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蛋白复合体的编码基因中，编码所述IL-15Rα的IL-15结合区的核苷酸序列为SEQ ID No.5的第1-216位，或者为与SEQ ID No.5的第1-216位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述IL-15Rα的IL-15结合区的序列；和/或
所述蛋白复合体的编码基因中，编码所述CD8α跨膜区的核苷酸序列为SEQ ID No.5的第217-423位，或者为与SEQ ID No.5的第217-423位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述CD8α跨膜区的序列；和/或
所述蛋白复合体的编码基因中，编码所述IL-15蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.5的第490-831位，或者为与SEQ ID No.5的第490-831位具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述IL-15蛋白的序列；
进一步地，所述蛋白复合体的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5，或者为与SEQ IDNo.5具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上同源性且编码所述蛋白复合体的序列。
7.由权利要求1-6中任一所述方法制备得到的不依赖细胞因子培养的自然杀伤细胞系SILK-NK。
8.根据权利要求7所述的自然杀伤细胞系SILK-NK，其特征在于：所述自然杀伤细胞系SILK-NK的STR表型为
Amelogenin：X,Y
CSF1PO：11,12
D13S317：9,12
D16S539：11,12
D5S818：12,13
D7S820：10,11
THO1：6,9.3
TPOX：8
vWA：18
D21S11：31.2,32；
其mRNA反转录PCR能检测到IL-15及IL-15Rα的IL-15结合区的表达。
9.根据权利要求7或8所述的自然杀伤细胞系SILK-NK，其特征在于：所述自然杀伤细胞系SILK-NK为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.15583的细胞系。
10.权利要求7-9中所述的自然杀伤细胞系SILK-NK在如下任一中的应用：
(A1)制备用于肿瘤过继免疫治疗的产品；
(A2)制备用于细胞治疗的相关产品。
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