PT1495053E

PT1495053E - Agentes de ligação específica a angiopoietina-1 e angiopoietina-2

Info

Publication number: PT1495053E
Application number: PT02780442T
Authority: PT
Inventors: Johnathan Daniel Oliner
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2012-07-17
Also published as: IL161021A; NO332593B1; PL373911A1; ES2439221T3; KR20100049682A; JP4637480B2; KR20040051606A; EA200400510A1; US7521053B2; AU2011200824B2; IL161021A0; MXPA04003345A; EP1495053B1; HUP0500994A3; WO2003030833A2; HK1072775A1; JP2005506067A; EP1495053A4; JP2012210216A; EP2272869A2

Description

DESCRIÇÃO "AGENTES DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA A ANGIOPOIETINA-1 E ANGIOPOIETINA—2"

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório U.S. com o N° de Série 60/328604, apresentado em 11 de Outubro de 2001, o qual é aqui incorporado por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a agentes de ligação específica que reconhecem e se ligam à angiopoietina-2 (Ang-2). Mais especificamente, a invenção refere-se à produção, utilização de diagnóstico e utilização terapêutica de anticorpos monoclonais e policlonais, e os seus fragmentos, os quais se ligam especificamente a Ang-2.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A angiogénese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes, é essencial para muitos processos fisiológicos e patológicos. Normalmente, a angiogénese está fortemente regulada por factores pró- e anti-angiogénicos, mas no caso de doenças, tais como cancro, doenças neovasculares oculares, artrite e psoríase, o processo pode correr mal. Folkman, J., Med. Nat., 1:27-31 (1995). 1

Existe uma variedade de doenças que se sabe estarem associadas com a angiogénese desregulada ou indesejada. Tais doenças incluem, mas não estão limitadas a, neovascularização ocular, tais como retinopatias (incluindo retinopatia diabética), degeneração macular relacionada com a idade, psoriase, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doença inflamatória, tais como uma doença inflamatória reumatóide ou reumática, especialmente artrite (incluindo artrite reumatóide), ou outros distúrbios inflamatórios crónicos, tais como asma crónica, aterosclerose arterial ou pós-transplantação, endometriose e doenças neoplásicas, por exemplo, os denominados tumores sólidos e tumores líquidos (ou hematopoiéticos) (tais como leucemias e linfomas). Outras doenças associadas com a angiogénese indesejada serão evidentes aos especialistas na técnica.

Embora muitos sistemas de transdução de sinal tenham sido implicados na regulação da angiogénese, um dos sistemas mais bem caracterizados e mais selectivos às células endoteliais envolve o receptor de tirosina cinase Tie-2 (referido como "Tie-2" ou "Tie-2R" (também referido como "ORK") ; o Tie-2 murino é também referido como "tek") e os seus ligandos, as angiopoietinas (Gale, N. W. e Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13:1055-1066 [1999]). Existem 4 angiopoietinas conhecidas; angiopoietina-1 ("Ang-1") até angiopoietina-4 ("Ang-4"). Estas angiopoietinas são também referidas como "ligandos de Tie-2". (Davis, S., et al., Cell, 87:1161-1169 [1996]; Grosios, K., et al.,

Cytogenet Cell Genet, 84:118-120 [1999]; Holash, J., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [1999]; Koblizek, T. I., et al. , Current Biology, 8:529-532 [1998]; Lin, P., et al., Proc Natl Acad Sei USA, 95:8829-8834 [1998]; Maisonpierre, P. C., et al., Science, 277:55-60 [19 9 7] ;

Papapetropoulos, o A., et al., Lab Invest, 79:213-223 [1999]; 2

Sato, T. N., et al., Nature, 375:70-74 [1998]; Shyu, K. G., et al., Circulation, 98:2081-2087 [1998]; Suri, C., et al.,

Cell, 87:1171-1180 [1996]; Suri, C., etal., Science, 282:468-471 [1998]; Valenzuela, M. do D., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96:1904-1909 [1999]; Witzenbichler, B., et al., J Biol Chem, 273:18514-18521 [1998] ). Enquanto a ligação de Ang-1 a Tie-2 estimula a fosforilação do receptor em células endoteliais cultivadas, observou-se que Ang-2 tem um efeito agonista e antagonista da fosforilação do receptor Tie-2 (Davis, S., et al., [1996], supra; Maisonpierre, P.C., et al., [1997], supra; Kim, I., J.H. Kim, et al., Oncogene 19(39): 4549-4552 (2000); Teichert-

Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, et al., Cardiovascular

Research 49(3): 659-70 (2001)).

Os fenótipos de silenciamentos de Tie-2 e Ang-1 em murganho são semelhantes e sugerem que a fosforilação de Tie-2 estimulada por Ang-1 medeie a remodelação e estabilização de vasos em desenvolvimento in utero, através da manutenção da adesão de células de suporte/células endoteliais (Dumont, D. J., et al., Genes & Development, 8:1897-1909 [1994]; Sato, T. N., et al., Nature, 376:70-74 [1995]; Suri, C., et al., [1996], supra). Pensa-se que o papel de Ang-1 na estabilização de vasos seja conservado no adulto, onde é expresso extensamente e constitutivamente (Hanahan, D., Science, 277:48-50 [1997];

Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 159:391-400 [1999]).

Pelo contrário, a expressão de Ang-2 está principalmente limitada aos locais de remodelação vascular, onde se pensa que bloqueia a função de Ang-1, induzindo assim um estado de plasticidade vascular que conduz a angiogénese (Hanahan, D., [1997], supra; Holash, J., et al., Science, 284:1994-1998 [1999] ; Maisonpierre, P. C., et al., [1997], supra). 3

Numerosos estudos publicados demonstraram, supostamente, a expressão de Ang-2 selectiva aos vasos, em estados de doença associados com a angiogénese. Estes estados patológicos incluem, por exemplo, psoriase, degeneração macular e cancro (Bunone, G., et al., American Journal of Pathology, 155:1967-1976 [1999]; Etoh, T., et al., Câncer Research, 61:2145-2153 [2001]; Hangai, M., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42:1617-1625 [2001]; Holash, J., et al., [1999] supra; Kuroda, K., et al. , Journal of Investigative Dermatology, 116:713-720 [2001]; Otani, A., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40:1912-1920 [1999]; Stratmann, A., et al., American

Journal of Pathology, 153:1459-1466 [1998]; Tanaka, S., et al., J Clin invest, 103:34-345 [1999]; Yoshida, Y., et al.,

International Journal of Oncology, 15:1221-1225 [1999]; Yuan, K., et al., Journal of Periodontal Research, 35:165-171 [2000];

Zagzag, D., et al., [1999] supra). A maioria destes estudos focalizou-se no cancro, em que muitos tipos de tumores parecem apresentar expressão de Ang-2 vascular. Contrariamente à sua expressão em angiogénese patológica, a expressão de Ang-2 em tecidos normais é extremamente limitada (Maisonpierre, P. C., et al., [1997], supra; Mezquita, J., et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 260:492-498 [1999]). No adulto normal, os três principais locais de angiogénese são o ovário, placenta e útero; estes são os tecidos primários em tecidos normais (i. e., não cancerosos) em que foi detectado ARNm de Ang-2.

Determinados estudos funcionais sugerem que a Ang-2 pode estar envolvida na angiogénese tumoral. Ahmad et al. (Câncer

Res., 61:1255-1259 [2001]) descrevem a sobreexpressão de Ang-2 e mostram que está supostamente associada com um aumento do crescimento tumoral num modelo de xenoenxerto de murganho. Ver 4 também Etoh et al., supra, e Tanaka et al., supra, em que são apresentados dados que supostamente associam a sobreexpressão de Ang-2 com a hipervascularidade tumoral. Contudo, contrariamente, Yu et al. (Am. J. Path., 158:563-570 [2001]) apresentam dados que mostram que a sobreexpressão de Ang-2 no carcinoma pulmonar de Lewis e em células de carcinoma mamário TA3, supostamente prolongou a sobrevivência de murganhos injectados com os transfectantes correspondentes.

Nos últimos anos, várias publicações sugeriram Ang-1, Ang-2 e/ou Tie-2 como um alvo possível para a terapia anticancerosa. Por exemplo, as Patentes U.S. N° 6166185, 5650490 e 5814464 divulgam, cada, o conceito de anticorpos ligantes anti-Tie-2 e corpos receptores. Lin et al. (Proc. Natl. Acad. Sei USA, 95:8829-8834 [1998]) injectaram um adenovírus que expressa Tie-2 solúvel em murganhos; o Tie-2 solúvel supostamente diminuiu o número e tamanho dos tumores desenvolvidos pelos murganhos. Num estudo relacionado, Lin et al. (J. Clin. Invest., 100 :2072-2078 [1997]) injectaram uma forma solúvel de Tie-2 em ratos; este composto supostamente reduziu o tamanho do tumor nos ratos. Siemeister et al. (Câncer Res., 59:3185-3189 [1999]) geraram linhas celulares de melanoma humano que expressam o domínio extracelular de Tie-2, injectaram estas linhas celulares em murganhos nude e concluíram que a Tie-2 solúvel resultou supostamente numa "inibição significativa" do crescimento tumoral e da angiogénese tumoral. Face a esta informação e dado que Ang-1 e Ang-2 se ligam ambos a Tie-2, não é claro a partir destes estudos se Ang-1, Ang-2 ou Tie-2 seriam um alvo atractivo para terapia anticancerosa. A fusão de determinados péptidos numa proteína plasmática estável, tal como uma região constante de Ig, para melhorar a 5 semi-vida destas moléculas foi descrita, por exemplo, na publicação do PCT WO 00/24782, publicado em 4 de Maio de 2000. A fusão de uma proteína ou de um seu fragmento a uma proteína plasmática estável, tal como uma região constante de Ig, para melhorar a semi-vida destas moléculas tem sido descrita de várias formas (ver, por exemplo, a patente U.S. 5480981; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, (1995); Fisher et al., N. Engl. J. Med., 334:1697-1702, (1996); Van Zee, K. et al., J. Immunol., 156:2221-2230, (1996); Patente U.S. 5808029, concedida em 15 de Setembro de 1998; Capon et al., Nature, 337:525-531, (1989); Harvill et al., Immunotech., 1:95-105, (1995); documento WO 97/23614, publicado em 3 de Julho de 1997; documento PCT/US 97/23183, apresentado em 11 de Dezembro de 1997; Linsley, J. Exp. Med., 174:561-569, (1991); documento WO 95/21258, publicado em 10 de Agosto de 1995) . O documento WO 0057901 sugere a diminuição da permeabilidade vascular por administração de um anticorpo neutralizante de Arg-2.

Uma terapia anti-Ang-2 eficaz pode beneficiar uma vasta população de doentes de cancro porque a maioria dos tumores sólidos requer que a neovascularização cresça além de 1-2 mm de diâmetro. Tal terapia pode ter uma aplicação mais ampla também noutras doenças associadas com a angiogénese, tais como retinopatias, artrite e psoríase.

Existe uma necessidade não desenvolvida de identificação de novos agentes que reconhecem especificamente e se ligam a Ang-2. Tais agentes seriam úteis para rastreio de diagnóstico e intervenção terapêutica em estados patológicos que estão associados com a actividade de Ang-2. 6

Desta forma, é um objectivo da presente invenção proporcionar agentes de ligação especifica de Ang-2 que modulam a actividade de Ang-2.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção é definida nas reivindicações. A divulgação proporciona um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a referida cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada seleccionada do grupo consistindo de 526 HC (SEQ ID N° 1); 528 HC (SEQ ID N° 3); 531 HC (SEQ ID N‘ 3 5) r 533 HC (SEQ ID N° 7); 535 HC (SEQ ID N° 9) ; 536 HC (SEQ ID N° 11); 537 HC (SEQ ID N° 13); 540 HC (SEQ ID N° 15) r 543 HC (SEQ ID N° 17) ; 544 HC (SEQ ID N° 19) ; 545 HC (SEQ ID N° 21) ; 546 HC (SEQ ID N° 23); 551 HC (SEQ ID N° 25) r 553 HC (SEQ ID N° 27) ; 555 HC (SEQ ID N° 29) ; 558 HC (SEQ ID N° 31) ; 559 HC (SEQ ID N° 33) ; 565 HC (SEQ ID N° 35) ; Fl- -C6 HC (SEQ ID N° 37); FBI-A7 HC (SEQ ID N° 39) ; FD- -B2 HC (SEQ ID N° 41); FE-B7 HC (SEQ ID N° 43) ; FJ- Gll HC (SEQ ID N° 45); FK-E3 HC (SEQ ID N° 47) ; G1D4 HC (SEQ ID N° 49) ; GC1E8 HC (SEQ ID N° 51); H1C12 HC (SEQ ID N° 53); IA1-1E7 HC (SEQ ID N° 55); IF-IC10 HC (SEQ ID N° 57); IK-2E2 HC (SEQ ID N° 59); IP-2C11 HC (SEQ ID N° 61); e os seus fragmentos de ligação a antigénio; e a referida cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve seleccionada do grupo consistindo de: kapa 526 (SEQ ID N° 2); kapa 536 (SEQ ID N° 12); kapa 543 (SEQ ID N° 18); kapa 544 (SEQ ID N° 20); kapa (SEQ ID N° 28); kapa 555 (SEQ ID N° 32); kapa 565 (SEQ ID N° 44); kapa FJ-G11 (SEQ ID N° 48); kapa IA1-1E7 551 (SEQ ID N° 26); kapa 553 (SEQ ID N° 30) ; kapa 558 (SEQ ID N° 36); kapa FE-B7 (SEQ ID N° 46); kapa FK-E3 (SEQ ID N° 56); kapa IP-2C11 7 (SEQ ID N° 62) ; 528 lambda (SEQ ID N° 4); 531 lambda (SEQ ID N° 6) ; 533 lambda (SEQ ID N° 8); 535 lambda (SEQ ID N° 10) ; 537 lambda (SEQ ID N° 14); 540 lambda (SEQ ID N° 16) ; 545 lambda (SEQ ID N° 22); 546 lambda (SEQ ID N° 24) ; 559 lambda (SEQ ID N° 34); F1-C6 lambda (SEQ ID N° 38) ; FB1-A7 lambda (SEQ ID N° 40); FD-B2 lambda (SEQ ID N° 42) ; G1D4 lambda (SEQ ID N° 50); GC1E8 lambda (SEQ ID N° 52) ; H1C12 lambda (SEQ ID N° 54); IF-IC10 lambda (SEQ ID N° 58) ; IK-2E2 lambda (SEQ ID N° 60); e os seus fragmentos de ligação a antigénio φ A divulgação também proporciona um agente de ligação especifica compreendendo, pelo menos, um péptido seleccionado do grupo consistindo de: SEQ ID N° 1; SEQ ID N '° 3 ; SEQ ID N° 5; SEQ : ID N° 7; SEQ ! ID N O 9; SEQ ID N° ii; SEQ ID N° 13; SEQ ID N° 15; SEQ ID N° 17; SEQ ID N° 19; SEQ ID N° 21; SEQ ID N° 23; SEQ ID N° 25; SEQ ID N° 27; SEQ ID N° 29; SEQ ID N° 31; SEQ ID N° 33; SEQ ID N° 35; SEQ ID N° 37; SEQ ID N° 39; SEQ ID N° 41; SEQ ID N° 43; SEQ ID N° 45; SEQ ID N° 47; SEQ ID N° 49; SEQ ID N° 51; SEQ ID N° 53; SEQ ID N° 55; SEQ ID N° 57; SEQ ID N° 59; SEQ ID N° 61; SEQ ID N° 2; SEQ ID N° 12; SEQ ID N° 18; SEQ ID N° 20; SEQ ID N° 26; SEQ ID N° 28; SEQ ID N° 30; SEQ ID N° 32; SEQ ID N° 36; SEQ ID N° 44; SEQ ID N° 46; SEQ ID N° 48; SEQ ID N° 56; SEQ ID N° 62; SEQ ID N° 4; SEQ ID N° 6; SEQ ID N° 8; SEQ ID N° 10; SEQ ID N° 14; SEQ ID N° 16; SEQ ID N° 22; SEQ ID N 0 24; SEQ ID N° 34; SEQ ID N° 38; SEQ ID N° 40; SEQ ID N° 42; SEQ ID N° 50; SEQ ID N 0 52; SEQ ID N° 54 ; SEQ ID N í° ! 58; e SEQ ID N° 60, e os seus fragmentos.

Deverá ser entendido que o agente de ligação especifica pode ser, por exemplo, um anticorpo, tais como um anticorpo policlonal, monoclonal, quimérico, humanizado ou um totalmente humano. 0 anticorpo também pode ser um anticorpo de cadeia única. A divulgação refere-se ainda a um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal de acordo com a invenção.

Será também entendido que a divulgação se refere a conjugados como aqui descritos. 0 conjugado pode ser, por exemplo, um agente de ligação especifica (tal como um anticorpo) da invenção. A invenção refere-se ainda a moléculas de ácidos nucleicos que codificam o anticorpo da invenção, assim como um vector compreendendo essa molécula de ácido nucleico, assim como um célula hospedeira contendo o vector.

Adicionalmente, a invenção proporciona um método de preparação de um agente de ligação especifica compreendendo, (a) transformar uma célula hospedeira com, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo da Reivindicação 1; (b) expressar a molécula de ácido nucleico na referida célula hospedeira; e (c) isolar o referido anticorpo. A invenção proporciona ainda um método de preparação de um anticorpo compreendendo: (a) transformar uma célula hospedeira com, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo de acordo com a invenção; (b) expressar a molécula de ácido nucleico na referida célula hospedeira; e (c) isolar o referido anticorpo.

Além disso, a invenção refere-se ao anticorpo reivindicado para utilização num método de inibição de angiogénese indesejada num mamífero por administração de uma quantidade 9 terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção. A invenção também proporciona o anticorpo reivindicado para utilização num método de tratamento de cancro num mamífero por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção.

Deverá ser entendido que a invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo de acordo com a invenção e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica compreende um anticorpo de acordo com a invenção e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável. A invenção proporciona o anticorpo reivindicado para utilização num método de modulação ou inibição da actividade da angiopoietina-2 por administração de um ou mais anticorpos da invenção. A invenção refere-se ainda ao anticorpo reivindicado para utilização num método de modulação de, pelo menos um, de permeabilidade vascular ou derrame plasmático num mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo de acordo com a invenção. A invenção também se refere ao anticorpo reivindicado para utilização num método de tratamento de, pelo menos, uma de doença neovascular ocular, hemangioblastoma, hemangioma, doença inflamatória, distúrbios inflamatórios crónicos, endometriose, doença neoplásica, doença relacionada com os ossos ou psoríase num mamífero, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção.

Além disso, a invenção refere-se ao anticorpo reivindicado para utilização num método de tratamento de cancro num mamífero, 10 compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção e um agente quimioterapêutico. Será entendido pelos especialistas na técnica que o agente de ligação especifica e o agente quimioterapêutico não necessitam ser administrados simultaneamente. A divulgação também proporciona um agente de ligação especifica compreendendo a região determinante de complementaridade 1 (CDR 1 ) de qualquer de: 526 HC (SEQ ID N° D ; 528 HC (SEQ ID N° 3); 531 HC (SEQ ID N° 5); 533 HC (SEQ ID N° 7) ; 53 5 HC (SEQ ID Nc ' 9); 536 HC (SEQ ID N° 11); 537 HC (SEQ ID N° 13) ; 540 HC (SEQ ID N° 15); 543 HC (SEQ ID N° 17) ; 544 HC (SEQ ID N° 19) ; 545 HC (SEQ ID N° 21) ; 546 HC (SEQ ID N° 23); 551 HC (SEQ ID N° 25); 553 HC (SEQ ID N° 27) ; 555 HC (SEQ ID N° 29) ; 558 HC (SEQ ID N° 31) ; 559 HC (SEQ ID N° 33); 565 HC (SEQ ID N° 35); F1-C6 HC (SEQ ID N° 37; ) ; FB1-A7 HC (SEQ ID N° 39); FD-B2 HC (SEQ ID N° 41) ; FE- B7 HC (SEQ ID N° 43); FJ -Gll HC (SEQ ID N° 45) ; FK-E3 HC (SEQ ID N° 47); GID4 HC (SEQ ID N° 49); GCIE8 HC (SEQ ID N° 51) ; HLC12 HC (SEQ ID N° 53); IA1 -IE7 HC (SEQ ID N° 55) ; IF-IC10 HC (SEQ ID N° 57) ; IK -2E2 HC (SEQ ID N° 59) ; IP-2C11 HC (SEQ ID N° 61); kapa 526 (SEQ ID N° 2); kapa 536 (SEQ ID ] N° 12); kapa 543 (SEQ ID N° 18); kapa 544 (SEQ ID N° 20 ); kapa 551 (SEQ ID N° 26); kapa 553 (SEQ ID N° 28) ; kapa 555 (SEQ ID N° 30); kapa 558 (SEQ ID N° 32) ; kapa 565 (SEQ ID N° 36); kapa FE-B7 (SEQ ID N° 44) ; kapa FJ-G11 (SEQ ID N° 46); kapa FK-E3 (SEQ ID N° 48) ; kapa IA1-1E7 (SEQ ID N° 56); kapa IP-2C11 (SEQ ID N° 62) ; 528 lambda (SEQ ID N° 4); 531 lambda (SEQ ID N° 6) ; 533 lambda (SEQ ID N° 8); 535 lambda (SEQ ID N° 10) ; 537 lambda (SEQ ID N° 14); 540 lambda (SEQ ID N° 16) ; 545 lambda (SEQ ID N° 22); 546 lambda (SEQ ID N° 24) ; 559 lambda (SEQ ID N° 34); F1-C6 lambda 11 (SEQ ID N° 38); FB1-A7 lambda (SEQ ID N° 40); FD-B2 lambda (SEQ ID N° 42); G1D4 lambda (SEQ ID N° 50); GC1E8 lambda (SEQ ID N° 52); H1C12 lambda (SEQ ID N° 54); IF-IC10 lambda (SEQ ID N° 58); e IK-2E2 lambda (SEQ ID N° 60).

A divulgação refere-se específica compreendendo complementaridade (SEQ ID N° 533 HC (SEQ ID N° 543 HC (SEQ ID N° 553 HC (SEQ ID N° F1-C6 HC (SEQ ID N° (SEQ ID N° GC1E8 HC (SEQ ID N° (SEQ ID N° (SEQ ID N° kapa 544 (SEQ ainda a um a região qualquer 531 HC (SEQ ID N° 540 HC (SEQ ID N° 551 HC (SEQ ID N° 565 HC (SEQ ID N°

(CDR 2) de (SEQ ID N° 3) : 535 HC (SEQ ID N° 13) 544 HC (SEQ ID N° 23) 555 HC (SEQ ID N° 33) : FB1-A7 HC agente de ligação determinante de de: 526 HC (SEQ ID N° 5); 9); 536 HC (SEQ ID N° 15); 19); 545 HC (SEQ ID N° 25); 29); 558 HC (SEQ ID N° 35); 39); FD-B2 HC FJ-G11 HC (SEQ ID N° 49); 53); IA1-1E7 HC IK-2E2 HC kapa 526 kapa 543 (SEQ ID N° 18); 551 (SEQ ID N° 26); kapa 553 2 1) ; 528 HC (SEQ ID N° 7); 11); 537 HC (SEQ ID N° 17) 21); 546 HC (SEQ ID N° 27) 31); 559 HC (SEQ ID N° 37) 41) 45) (SEQ ID N° 51); H1C12 HC (SEQ ID N° 55); IF-IC10 HC (SEQ ID N° 57); 59); IP-2C11 HC (SEQ ID N° 61); 2) ; kapa 536 (SEQ ID N° 12); (SEQ ID N° 20); kapa

; FE-B7 HC (SEQ ID N° 43); ; FK-E3 HC (SEQ ID N° 47); G1D4 HC ID N° 28); kapa (SEQ ID N° 32) f kapa 565 (SEQ ID N° 44) r kapa FJ-G11 (SEQ ID N° 48) r kapa IA1-1E7 (SEQ ID N° 62) r 528 lambda (SEQ ID N° 6); 533 lambda (SEQ ID N° 10) r 537 lambda (SEQ ID N° 16) r 545 lambda (SEQ ID N° 24) / 559 lambda (SEQ ID N° 38) / FB1-A7 lambda 555 (SEQ ID N° 30); kapa 558 (SEQ ID N° 36); kapa FE-B7 (SEQ ID N° 46); kapa FK-E3 (SEQ ID N0 56) ; kapa IP-2C11 (SEQ ID N° 4); 531 lambda (SEQ ID N° 8); 535 lambda (SEQ ID N° 14); 540 lambda (SEQ ID N° 22); 546 lambda (SEQ ID N° 34); F1-C6 lambda (SEQ ID N° 40); FD-B2 lambda 12 (SEQ ID N° 42); G1D4 lambda (SEQ ID N° 50); GC1E8 lambda (SEQ ID N° 52); H1C12 lambda (SEQ ID N° 54); IF-IC10 lambda (SEQ ID N° 58); e IK-2E2 lambda (SEQ ID N° 60). 3 I) ; 528 HC (SEQ ID N° 7) ; II) ; 537 HC (SEQ ID N° 17); 21); 546 HC (SEQ ID N° 27); 31); 559 HC (SEQ ID N° 37) 41); FE-B7 45); FK-E3 HC (SEQ ID N° 47); G1D4 HC (SEQ ID N° 51); H1C12 HC (SEQ ID N° 55); IF-IC10 HC (SEQ ID N° 57); 59); IP-2C11 HC (SEQ ID N° 61); 2); kapa 536 (SEQ ID N° 12); (SEQ ID N° 20); kapa ainda a um a região (CDR 3) de qualquer (SEQ ID N° 3); 531 HC 535 HC (SEQ ID N° (SEQ ID N° 13); 540 HC ; 544 HC (SEQ ID N° (SEQ ID N° 23); 551 HC ; 555 HC (SEQ ID N° (SEQ ID N° 33); 565 HC ; FB1-A7 HC (SEQ ID N° HC (SEQ ID N° 43) A divulgação refere-se específica compreendendo complementaridade (SEQ ID N° 533 HC (SEQ ID N° 543 HC (SEQ ID N° 553 HC (SEQ ID N° F1-C6 HC (SEQ ID N° (SEQ ID N° GC1E8 HC (SEQ ID N° (SEQ ID N°

(SEQ ID N° kapa 544 (SEQ

agente de ligação determinante de de: 526 HC

(SEQ ID N° 5); 9); 536 HC

(SEQ ID N° 15); 19) ; 545 HC

(SEQ ID N° 25); 29); 558 HC

(SEQ ID N° 35); 39); FD-B2 HC F7-G11 HC (SEQ ID N° 49); 53); IA1-1E7 HC IK-2E2 HC kapa 526 kapa 543 (SEQ ID N° 18); 551 (SEQ ID N° 26); kapa 553 (SEQ ID N° 30); kapa 558 ID N° 2< kapa 555 (SEQ ID N° 32) r kapa 565 (SEQ ID N° 44) r kapa FJ-G11 (SEQ ID N° 48) r kapa IA1-1E7 (SEQ ID N° 62) r 528 lambda (SEQ ID N° 6); 533 lambda (SEQ ID N° 10) r 537 lambda (SEQ ID N° 16) r 545 lambda (SEQ ID N° 24) r 559 lambda (SEQ ID N° 38) r FB1-A7 lambda (SEQ ID N° 42) r G1D4 lambda (SEQ ID N° 36); kapa FE-B7 (SEQ ID N° 46); kapa FK-E3 (SEQ ID N° 56); kapa IP-2C11 (SEQ ID N° 4); 531 lambda (SEQ ID N° 8); 535 lambda (SEQ ID N° 14); 540 lambda (SEQ ID N° 22); 546 lambda (SEQ ID N° 34); 0 1 H lambda (SEQ ID N° 40); Fa-b2 lambda (SEQ ID N° 50); GC1E8 lambda 13 (SEQ ID N° 52); H1C12 lambda (SEQ ID N° 54); IF-IC10 lambda (SEQ ID N° 58); e IK-2E2 lambda (SEQ ID N° 60). A invenção proporciona ainda uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo de acordo com a invenção.

Além disso, a divulgação refere-se a um método de detecção do nível de angiopoietina-2 numa amostra biológica através de (a) colocar em contacto um agente de ligação específica da invenção com a amostra; e (b) determinar a extensão de ligação do agente de ligação específica à amostra. A divulgação também se refere a um método de detecção do nível de angiopoietina-2 numa amostra biológica através de (a) colocar em contacto um anticorpo da invenção com a amostra; e (b) determinar a extensão de ligação do anticorpo à amostra. A divulgação também se refere a um método de inibição de angiogénese indesejada num mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido ou de uma composição como aqui descrita. A divulgação também se refere a um método de modulação da angiogénese num mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido ou de uma composição como aqui descrita. A divulgação refere-se ainda a um método de inibição de crescimento tumoral caracterizado por angiogénese indesejada num mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido ou de uma composição como aqui descrita. Adicionalmente, a divulgação refere-se a um método de tratamento de cancro num mamífero compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido ou de uma composição como aqui descrita, e um agente quimioterapêutico. Numa forma de realização preferida, o agente quimioterapêutico 14 é, pelo menos, um de 5-FU, CPT-11 e Taxotere. Contudo, deve ser entendido que podem ser utilizados outros agentes quimioterapêuticos adequados e outras terapias do cancro.

Deverá ser entendido que os agentes de ligação especifica da invenção podem ser utilizados para tratar uma variedade de doenças associadas com a angiogénese desregulada ou indesejada. Tais doenças incluem, mas não estão limitadas a, neovascularização ocular, tais como retinopatias (incluindo retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade), psoríase, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doença inflamatória, tais como uma doença inflamatória reumatóide ou reumática, especialmente artrite (incluindo artrite reumatóide), ou outros distúrbios inflamatórios crónicos, tais como asma crónica, aterosclerose arterial ou pós-transplantação, endometriose e doenças neoplásicas, por exemplo, os denominados tumores sólidos e tumores líquidos (tal como leucemias). Doenças adicionais que podem ser tratadas por administração dos agentes de ligação específica serão evidentes aos especialistas na técnica. Tais doenças adicionais incluem, mas não estão limitadas a, obesidade, permeabilidade vascular, derrame plasmático e distúrbios relacionados com os ossos, incluindo osteoporose. Assim, a invenção refere-se ainda a métodos de tratamento destas doenças associadas com angiogénese desregulada ou indesejada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 representa um gráfico de tamanho do tumor (eixo dos y) versus tempo (eixo dos x) em murganhos com tumor tratados com um anticorpo anti-Ang-2 (clone 533, 537 ou 544) da invenção, 15 com um anticorpo de controlo, ou com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Os detalhes estão descritos nos exemplos.

As figuras 2A, 2B e 2C representam dados de mapeamento de epitopos (0.D. 370) para Ang-2 de tamanho total humano (hAng-2), para o N-terminal de hAng-2 e para o C-terminal de hAng-2, respectivamente, para os pepticorpos TN8-Con4-C, L1-7-N e 12-9-3-C de acordo com a invenção, assim como para os pepticorpos de controlo, Tie2-Fc, C2B8 ou 5B12. Os detalhes estão descritos nos exemplos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os títulos das secções são aqui utilizados apenas para fins organizacionais e não devem ser interpretados, de modo algum, como limitativos dos elementos essenciais descritos.

Podem ser utilizadas técnicas convencionais para a produção de moléculas de ADN recombinante, proteínas e anticorpos, assim como para a cultura de tecidos e transformação de células. As reacções enzimáticas e as técnicas de purificação são, tipicamente, realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como habitualmente realizadas na técnica, utilizando processos convencionais, tal como aqueles apresentados em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]), ou como aqui descritos. A menos que sejam proporcionadas definições específicas, a nomenclatura utilizada em relação aos processos laboratoriais e às técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química farmacêutica e clínica aqui descritas, é aquela bem conhecida e habitualmente utilizada no campo técnico. As técnicas convencionais podem ser 16 utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e distribuição farmacêutica, e tratamento de doentes.

Definições

Como utilizados de acordo com a presente divulgação, os seguintes termos, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos com base nos seguintes significados: 0 termo "Ang-2" refere-se ao polipéptido apresentado na Figura 6 da Patente U.S. N° 6166185 ("Tie-2 ligand-2") ou os seus fragmentos, assim como polipéptidos relacionados que incluem variantes alélicas, variantes de splice, derivados, variantes de substituição, deleções e/ou inserções, péptidos e polipéptidos de fusão, e homólogos interespécies. 0 polipéptido Ang-2 pode ou não incluir resíduos terminais adicionais, e. g., sequências líder, sequências alvo, metionina amino terminal, resíduos de metionina amino terminal e lisina, e/ou sequências marcadoras ou proteínas de fusão, dependendo do modo como é preparado. A expressão "biologicamente activo" quando utilizada em relação a Ang-2 ou a um agente de ligação específica a Ang-2 refere-se a um péptido ou polipéptido que tem, pelo menos, uma actividade característica de Ang-2 ou de um agente de ligação específica a Ang-2. Um agente de ligação específica a Ang-2 pode ter actividade agonista, antagonista ou neutralizante ou bloqueadora em relação a, pelo menos, uma actividade biológica de Ang-2. 17 A expressão "agente de ligação específica" refere-se a uma molécula, de um modo preferido, uma molécula proteica que se liga a Ang-2 (e às suas variantes e derivados, como aqui definidas) com uma maior afinidade do que outras angiopoietinas. Um agente de ligação específica pode ser uma proteína, péptido, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido ou um composto de baixo peso molecular que se liga, de um modo preferido, a Ang-2. Numa forma de realização preferida, o agente de ligação específica de acordo com a presente invenção, é um anticorpo, tais como um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal (mAb), um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado com CDR, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo biespecífico, um anticorpo catalítico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo anti-idiotípico (anti-Id) e anticorpos que podem ser marcados na forma solúvel ou ligada, assim como os seus fragmentos, variantes ou derivados, isoladamente ou em combinação com outras sequências de aminoácidos, proporcionadas por técnicas conhecidas. Tais técnicas incluem, mas não estão limitadas a, clivagem enzimática, clivagem química, síntese peptídica ou técnicas recombinantes. Os agentes de ligação específica anti-Ang-2 da presente invenção são capazes de se ligarem a porções de Ang-2 que modulam, e. g., inibem ou promovem a actividade biológica de Ang-2 e/ou de outras actividades associadas a Ang-2. A expressão "anticorpos policlonais" refere-se a uma mistura heterogénea de anticorpos que reconhecem e se ligam a diferentes epitopos no mesmo antigénio. Os anticorpos policlonais podem ser obtidos a partir de preparações de soro em bruto ou podem ser purificados utilizando, por exemplo, cromatografia de afinidade de antigénio ou cromatografia de afinidade de

Proteína A/Proteína G. 18 A expressão "anticorpos monoclonais" refere-se a uma colecção de anticorpos codificados pela mesma molécula de ácido nucleico que são produzidos, opcionalmente, por um único hibridoma ou outra linha celular ou por um mamífero transgénico de modo que cada anticorpo monoclonal venha a reconhecer, tipicamente, o mesmo epitopo no antigénio. 0 termo "monoclonal" não está limitado a qualquer método particular para preparar o anticorpo, nem a expressão está limitado a anticorpos produzidos em espécies particulares, e. g., murganho, rato, etc. A expressão "anticorpos quiméricos" refere-se a anticorpos em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a uma sequência correspondente num anticorpo derivado de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse particular de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencente a uma outra classe ou subclasse de anticorpo. Estão também incluídos fragmentos de tais anticorpos que apresentam a actividade biológica desejada (i. e., a capacidade de se ligarem especificamente a Ang-2) . Ver, Patente U.S. N° 4816567 e Morrison et al., Proc Acad natl Sei (USA), 81:6851-6855 [1985]. A expressão "anticorpo enxertado com CDR" refere-se a um anticorpo em que a CDR de um anticorpo de uma espécie ou isotipo particular é introduzida recombinantemente na estrutura de um outro anticorpo da mesma espécie ou isotipo, ou diferente. A expressão "anticorpo multiespecífico" refere-se a um anticorpo que tem regiões variáveis que reconhecem mais do que um epitopo num ou mais antigénios. Uma subclasse deste tipo de anticorpo é um "anticorpo biespecífico" que reconhece dois epitopos distintos no mesmo ou diferentes antigénios. 19

Os anticorpos "catalíticos" referem-se a anticorpos em que uma ou mais unidades citotóxicas, ou mais genericamente uma ou mais unidades biologicamente activas, estão ligadas ao agente de ligação de direccionamento. A expressão "anticorpo humanizado" refere-se a um tipo específico de anticorpo enxertado com CDR em que a região estrutural do anticorpo é derivada de um humano, mas cada CDR é substituída com aquela derivada de uma outra espécie, tal como uma CDR de murino. 0 termo "CDR" é definido infra. A expressão anticorpo "totalmente humano" refere-se a um anticorpo em que a CDR e a estrutura são derivados de uma ou mais moléculas humanas de ADN. 0 termo anticorpo "anti-idiotípico" refere-se a qualquer anticorpo que se liga especificamente a outro anticorpo que reconhece um antigénio. A produção de anticorpos anti-idiotípicos pode ser realizada através de qualquer dos métodos aqui descritos para a produção de anticorpos específicos para Ang-2, excepto que esses anticorpos são produzidos a partir, e. g., de imunização de um animal com um anticorpo específico para Ang-2 ou um seu fragmento de ligação a Ang-2, em vez de do próprio polipéptido Ang-2 ou de um seu fragmento. 0 termo "variantes" como aqui utilizado, inclui aqueles polipéptidos em que resíduos de aminoácidos são introduzidos, removidos e/ou substituídos na sequência de aminoácidos de ocorrência natural (ou, pelo menos, conhecida) para o agente de ligação. As variantes da invenção incluem proteínas de fusão como descritas abaixo. 20

Os "derivados" incluem aqueles agentes de ligação que foram modificados quimicamente de alguma forma distinta de variantes de inserção, deleção ou substituição. "Liga-se especificamente a Ang-2" refere-se à capacidade de um agente de ligação específica (tal como um anticorpo ou um seu fragmento), da presente invenção, de reconhecer e ligar um polipéptido Ang-2 humano maduro, de tamanho total ou tamanho parcial, ou um seu ortólogo, de modo que a sua afinidade (como determinada por, e. g., ELISA de afinidade ou ensaios BIAcore, como aqui descritos) ou a sua capacidade de neutralização (como determinada, e. g., por ensaios ELISA de neutralização, como aqui descritos, ou ensaios semelhantes) seja, pelo menos, 10 vezes tão grande, mas opcionalmente 50 vezes tão grande, 100, 250 ou 500 tão grande, ou mesmo, pelo menos, 1000 vezes tão grande como a afinidade ou capacidade de neutralização da mesma para qualquer outra angiopoietina ou outro péptido ou polipéptido. A expressão "domínio de ligação a antigénio" ou "região de ligação a antigénio" refere-se a essa porção do agente de ligação específica (tal como uma molécula de anticorpo) que contém os resíduos de aminoácidos do agente de ligação específica (ou outras unidades) que interactuam com um antigénio e conferem no agente de ligação a sua especificidade e afinidade para o antigénio. Num anticorpo, o domínio de ligação a antigénio é geralmente referido como a "região determinante de complementaridade, ou CDR". O termo "epitopo" refere-se àquela porção de qualquer molécula, capaz de ser reconhecida e ligada por um agente de ligação especifica, e. g., um anticorpo, numa ou mais das regiões de ligação a antigénio do agente de ligação. Os epitopos 21 consistem habitualmente de agrupamentos superficiais quimicamente activos de moléculas, tais como, por exemplo, cadeia laterais de aminoácidos ou hidratos de carbono, e têm caracteristicas estruturais tridimensionais especificas, assim como caracteristicas de carga específicas. Os epitopos, como aqui utilizados, podem ser contíguos ou não contíguos. Além disso, os epitopos podem ser miméticos no sentido de compreenderem uma estrutura tridimensional que é idêntica ao epitopo utilizado para produzir o anticorpo, contudo não compreendem nenhum ou apenas alguns dos resíduos de aminoácidos encontrados no Ang-2 utilizado para estimular a resposta imune de anticorpo. A expressão "epitopo inibidor e/ou neutralizante" é um epitopo que quando ligado por um agente de ligação específica, tal como um anticorpo, resulta na perda (ou, pelo menos, na diminuição) da actividade biológica da molécula, célula ou organismo contendo tal epitopo, in vivo, in vitro ou in situ. No contexto da presente invenção, o epitopo neutralizante está localizado sobre ou está associado com uma região biologicamente activa de Ang-2. Alternativamente, a expressão "epitopo activador" é um epitopo que quando ligado por um agente de ligação específica da invenção, tal como um anticorpo, resulta na activação ou, pelo menos, na manutenção de uma conformação biologicamente activa de Ang-2. A expressão "fragmento de anticorpo" refere-se a um péptido ou polipéptido que compreende menos do que um anticorpo completo, intacto. Os anticorpos completos compreendem duas porções ou fragmentos funcionalmente independentes: um fragmento de ligação a antigénio conhecido como "Fab" e um fragmento cristalizável carboxi-terminal conhecido como o fragmento "Fc". 0 fragmento Fab inclui o primeiro domínio constante da cadeia 22 pesada e leve (CHI e CL1) em conjunto com as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves que se ligam ao antigénio específico. Cada das regiões variáveis da cadeia pesada e leve inclui três regiões determinantes de complementaridade (CDR) e os resíduos de aminoácidos estruturais que separam os CDR individuais. A região Fc compreende a segunda e terceira regiões constantes da cadeia pesada (CH2 e CH3) e está envolvida em funções efectoras, tais como activação do complemento e ataque por células fagocíticas. Em alguns anticorpos, as regiões Fc e Fab estão separadas por uma "região de charneira" de anticorpo e, dependendo de como o anticorpo de tamanho total é clivado proteoliticamente, a região de charneira pode estar associada com o fragmento Fab ou Fc. Por exemplo, a clivagem de um anticorpo com a protease papaína resulta na região de charneira associada com o fragmento Fc resultante, enquanto clivagem com a protease pepsina proporciona um fragmento em que a charneira está associada com ambos os fragmentos Fab, simultaneamente. Porque os dois fragmentos Fab estão, de facto, ligados covalentemente, após clivagem com pepsina, o fragmento resultante é denominado fragmento F(ab')2.

Um domínio Fc pode ter uma semi-vida sérica relativamente longa, enquanto um Fab tem vida curta [Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989)] . Quando expresso como parte de uma proteína de fusão, um domínio Fc pode transmitir uma semi-vida mais longa ou incorporar tais funções como ligação ao receptor Fc, ligação à Proteína A, fixação do complemento e, talvez, mesmo transferência placentária para a proteína na qual está fundida. A região Fc pode ser uma região Fc de ocorrência natural ou pode ser alterada para melhorar determinadas qualidades, tais como qualidades terapêuticas ou tempo de circulação. 23 A expressão "região variável" ou "domínio variável" refere-se a uma porção das cadeias leves e/ou pesadas de um anticorpo, tipicamente, incluindo, aproximadamente, os aminoácidos 120 a 130 amino-terminais na cadeia pesada e cerca de 100 a 110 aminoácidos amino-terminais na cadeia leve. As regiões variáveis diferem, tipicamente, extensivamente na sequência de aminoácidos mesmo entre anticorpos da mesma espécie. A região variável de um anticorpo determina, tipicamente, a ligação e a especificidade de cada anticorpo particular para o seu antigénio particular. A variabilidade na sequência está concentrada naquelas regiões referidas como as regiões determinantes de complementaridade (CDR), enquanto as regiões mais altamente conservadas no domínio variável são denominadas regiões estruturais (FR). As CDR das cadeias leves e pesadas contêm os aminoácidos que são largamente responsáveis pela interacção directa do anticorpo com antigénio, contudo, os aminoácidos nas FR podem afectar significativamente a ligação/reconhecimento do antigénio, como aqui discutido infra. A expressão "cadeia leve" quando utilizada com referência a um anticorpo, refere-se colectivamente a dois tipos distintos, denominados kapa (k) ou lambda (1) com base na sequência de aminoácidos dos domínios constantes. A expressão "cadeia pesada" quando utilizada com referência a um anticorpo, refere-se colectivamente a cinco tipos distintos, denominados alfa, delta, épsilon, gama e mu, com base na sequência de aminoácidos do domínio constante da cadeia pesada. A combinação de cadeias pesadas e leves origina cinco classes conhecidas de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo quatro subclasses conhecidas de IgG, designadas como IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. A expressão "ocorrência natural", quando utilizada em relação a materiais biológicos, tais como moléculas de ácidos nucleicos, polipéptidos, células hospedeiras, e semelhantes, refere-se àqueles que são encontrados na natureza e não são modificados por um ser humano. 0 termo "isolado" quando utilizado com relação a Ang-2 ou a um agente de ligação especifica a Ang-2, refere-se a um composto que está livre de, pelo menos, um polipéptido ou composto contaminante que é encontrado no seu ambiente natural e, de um modo preferido, substancialmente livre de quaisquer outros polipéptidos contaminantes de mamífero que interfiram com a sua utilização terapêutica ou de diagnóstico. 0 termo "maduro", quando utilizado com relação a Ang-2, anticorpo anti-Ang-2 ou a qualquer outro agente proteico de ligação específica a Ang-2, refere-se a um péptido ou polipéptido que carece de uma sequência líder ou de sinal. Quando um agente de ligação da invenção é expresso, por exemplo, num célula hospedeira procariótica, o péptido ou polipéptido "maduro" pode também incluir resíduos de aminoácidos adicionais (mas ainda carece de uma sequência líder), tais como uma metionina amino-terminal ou um ou mais resíduos de metionina e lisina. Um péptido ou polipéptido produzido deste modo pode ser utilizado com ou sem estes resíduos de aminoácidos adicionais, sem que tenham sido removidos.

As expressões "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz", quando utilizadas com relação a um agente de ligação específica a Ang-2, referem-se a uma quantidade de um agente de ligação específica que é útil ou necessária para suportar uma alteração observável no nível de uma ou mais actividades biológicas de Ang-2. A alteração pode 25 ser um aumento ou uma diminuição no nivel de actividade de Ang-2. De um modo preferido, a alteração é uma diminuição na actividade de Ang-2.

Agentes de ligação específica e Anticorpos

Como aqui utilizada, a expressão "agente de ligação especifica" refere-se a uma molécula que tem especificidade para reconhecer e ligar Ang-2 como aqui descrito. Os agentes de ligação especifica adequados incluem, mas não estão limitados a, anticorpos e os seus derivados, polipéptidos e moléculas pequenas. Os agentes de ligação especifica adequados podem ser preparados utilizando métodos conhecidos na técnica. Um agente de ligação especifica a polipéptido Ang-2, exemplificativo da presente divulgação, é capaz de ligação a uma determinada porção do polipéptido Ang-2 e, de um modo preferido, de modulação da actividade ou função do polipéptido Ang-2.

Os anticorpos que se ligam especificamente a polipéptidos Ang-2 estão dentro do âmbito da presente invenção. Os anticorpos podem ser policlonais, incluindo policlonais monoespecíficos, monoclonais (mAb), recombinantes, quiméricos, humanizados, tal como enxertados com CDR, humanos, de cadeia única, catalíticos, multiespecíficos e/ou biespecíficos, assim como os seus fragmentos, variantes e/ou derivados.

Os anticorpos policlonais dirigidos para um polipéptido Ang-2 são habitualmente produzidos em animais (e. g., coelhos, hámsteres, cabras, carneiros, cavalos, porcos, ratos, gerbilos, cobaios, murganhos ou qualquer outro mamífero adequado, assim como outras espécies que não de mamíferos) por meio de injecções subcutâneas ou intraperitoneais múltiplas de polipéptido Ang-2 26 ou de um seu fragmento, com ou sem um adjuvante. Tais adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, adjuvante completo e incompleto de Freund, géis minerais, tal como hidróxido de aluminio, e substâncias tensioactivas, tais como lisolecitina, polióis pluronic, polianiões, péptidos, emulsões em óleo; hemocianina do caramujo e dinitrofenol, BCG (bacilos Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são adjuvantes potencialmente úteis em humanos. Pode ser útil conjugar um polipéptido antigénico a uma proteína veículo que seja imunogénica nas espécies a serem imunizadas, tais como a hemocianina do caramujo, soro, albumina, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja. Além disso, agentes aglutinantes, tais como alúmen, são utilizados para aumentar a resposta imune. Após imunização, é retirado sangue aos animais e o soro é ensaiado para o título de anticorpo anti-polipéptido Ang-2 que pode ser determinado utilizando os ensaios aqui descritos nos "Exemplos". Os anticorpos policlonais podem ser utilizados nos soros, dos quais foram detectados, ou podem ser purificados a partir dos soros, utilizando, por exemplo, cromatografia de afinidade de antigénio ou cromatografia de afinidade de Proteína A ou G.

Os anticorpos monoclonais dirigidos a polipéptidos Ang-2 podem ser produzidos utilizando, por exemplo, mas sem limitação, o método tradicional de "hibridoma" ou a técnica mais recente de "apresentação de fagos". Por exemplo, os anticorpos monoclonais da invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma como descrito em Kohler et ai., Nature 256:495 [1975]; a técnica do hibridoma de células B humanas [Kosbor et ai., Immunol Today 4:72 (1983); Cote et ai., Proc Acad natl Sei (USA) 80: 2026-2030 (1983); Brodeur et ai., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, (1987)] e a técnica de EBV-hibridoma [Cole et ai., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R Liss Inc, Nova 27

Iorque, N.I., pp 77-96, (1985)]. São também proporcionadas pela invenção, linhas celulares de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais reactivos com polipéptidos Ang-2.

Quando é utilizada a técnica do hibridoma, podem ser utilizadas linhas celulares de mieloma. Tais linhas celulares adequadas para utilização em processos de fusão de produção de hibridoma são, de um modo preferido, não produtoras de anticorpos, têm elevada eficiência de fusão, e deficiências enzimáticas que as torna incapazes de crescer em determinados meios selectivos que suportam apenas o crescimento das células fundidas desejadas (hibridomas). Por exemplo, as linhas celulares utilizadas em fusões de murganho são Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag41, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC1l-x45-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bui; as linhas celulares utilizadas em fusões de rato são R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhas celulares úteis para fusões celulares são U-266, GM1500-GRG2, LICR-L0N-HMy2 e UC729-6. Os hibridomas e outras linhas celulares que produzem anticorpos monoclonais estão contemplados como sendo novas composições da presente invenção. A técnica de apresentação de fagos pode também ser utilizada para produzir anticorpos monoclonais de qualquer espécie. De um modo preferido, esta técnica é utilizada para produzir anticorpos monoclonais totalmente humanos em que um polinucleótido que codifica um único fragmento de anticorpo Fab ou Fv é expresso à superfície de uma partícula fágica [Hoogenboom et al., J Mol Biol 227: 381 (1991); Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991); ver também Patente U.S. N° 5885793)]. Cada fago pode ser "rastreado" utilizando ensaios de ligação como aqui descritos para identificar aqueles fragmentos de anticorpo que têm afinidade para Ang-2. Assim, estes processos 28 mimetizam a selecção imune através da apresentação de repertórios de fragmentos de anticorpo na superfície do bacteriófago filamentoso e selecção subsequente dos fagos através da sua ligação a Ang-2. Um tal processo é descrito no Pedido PCT N° PCT/US98/17364, apresentado em nome de Adams et al., o qual descreve o isolamento de fragmentos de anticorpo funcionalmente agonísticos e de elevada afinidade para receptores MPL e MSK, utilizando uma tal abordagem. Nesta abordagem, um reportório completo de genes de anticorpo humano podem ser produzidos por clonagem de genes V humanos naturalmente rearranjados a partir de linfócitos de sangue periférico como previamente descrito [Mullinax et al., Proc Acad natl Sei (USA) 87: 8095-8099 (1990)].

Uma vez identificadas as sequências de um polinucleótido que codificam cada cadeia do anticorpo monoclonal de tamanho total ou o(s) fragmento(s) Fab ou Fv da invenção, podem ser utilizadas células hospedeiras, eucarióticas ou procarióticas, para expressar os polinucleótidos do anticorpo monoclonal utilizando técnicas recombinantes bem conhecidas e praticadas rotineiramente na técnica. Alternativamente são produzidos animais transgénicos em que um polinucleótido que codifica o agente de ligação específica desejado é introduzido no genoma de um animal recipiente, tais como, por exemplo, um murganho, um coelho, uma cabra ou uma vaca, de um modo que permita a expressão das moléculas polinucleotídicas que codificam um anticorpo monoclonal ou outro agente de ligação específica. Num aspecto, os polinucleótidos que codificam o anticorpo monoclonal ou outro agente de ligação específica pode ser ligado a sequências reguladores específicas mamárias e os polinucleótidos quiméricos podem ser introduzidos na linha germinal do animal alvo. O animal transgénico resultante produz depois o anticorpo desejado no seu leite [pollock et al., J Immunol Meth 29 231:147-157 (1999); Little et al., Immunol Today 8:364-370 (2000)]. Além disso, podem ser utilizadas plantas para expressar e produzir agentes de ligação especifica a Ang-2, tal como anticorpos monoclonais, por transfecção de plantas adequadas com os polinucleótidos que codificam os anticorpos monoclonais ou outros agentes de ligação especifica.

Noutra forma de realização da presente invenção, um anticorpo monoclonal ou policlonal, ou os seus fragmentos, que seja derivado de uma espécie que não a humana, pode ser "humanizado" ou "quimerizado". Os métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica (ver Patentes U.S. N° 5859205, 5585089 e 5693762). A humanização é realizada, por exemplo, utilizando métodos descritos na técnica [Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)] por substituição de, pelo menos, uma porção, e. g., de um roedor, da região determinante de complementaridade (CDR) para as regiões correspondentes de um anticorpo humano. A invenção também proporciona variantes e derivados destes anticorpos humanos, como aqui discutidos e bem conhecidos na técnica.

Estão também abrangidos pela invenção, anticorpos totalmente humanos que se ligam a polipéptidos Ang-2, assim como os seus fragmentos, variantes e/ou derivados. Tais anticorpos podem ser produzidos utilizando a técnica de apresentação de fagos acima descrita. Alternativamente, animais transgénicos (e. g., murganhos) que são capazes de produzir um reportório de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulinas endógenas, podem ser utilizados para produzir tais anticorpos. Isto pode ser realizado por imunização do animal com um antigénio Ang-2 ou os seus fragmentos, em que os fragmentos 30

Ang-2 têm uma sequência de aminoácidos que é única para Ang-2. Tais imunogénios podem ser opcionalmente conjugados a um veiculo. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc Acad natl Sei (USA), 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno, 7: 33 (1993). Num método, tais animais transgénicos são produzidos por incapacitação dos loci endógenos que ai codificam as cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, e introdução de loci que codificam proteínas das cadeias pesadas e leves humanas no seu genoma. Os animais parcialmente modificados que são aqueles que têm menos do que o complemento total destas modificações, são depois cruzados para obter um animal que tem todas as modificações desejadas do sistema imune. Quando administrado um imunogénio, estes animais transgénicos são capazes de produzir anticorpos com regiões variáveis humanas, incluindo sequências de aminoácidos humanas (em vez de, e. g., murino) que são immunoespecíficas para os antigénios desejados. Ver os pedidos PCT N° PCT/US96/05928 e PCT/US93/06926. Métodos adicionais são descritos na Patente U.S. N° 5545807, pedidos PCT N° PCT/US91/245, PCT/GB89/01207 e nos documentos EP 546073B1 e EP 546073A1. Os anticorpos humanos podem também ser produzidos por expressão de ADN recombinante em células hospedeiras ou por expressão em células de hibridoma como aqui descrito. A transgénese é realizada numa variedade de modos diferentes. Ver, por exemplo, Bruggeman et al., Immunol Today 17:391-7 (1996). Numa abordagem, um minilocus é construído de modo que segmentos génicos numa configuração de linha germinal sejam colocados artificialmente perto uns dos outros. Devido a limitações de tamanho (i. e., tendo habitualmente menos de 30 kb) , o minilocus resultante conterá um número limitado de segmentos génicos que diferem, mas é ainda capaz de produzir um grande reportório de anticorpos. Os miniloci contendo apenas 31 sequências de intensificadores, transgénico.

ADN incluindo humanas, são totalmente funcionais promotores e no murganho

Quando é desejado um maior número de segmentos génicos no animal transgénico, são utilizados cromossomas artificiais de levedura (YAC). Os YAC podem variar desde várias centenas de kilobases até 1 Mb e são introduzidos no genoma de murganho (ou outro animal apropriado) por microinjecção directamente num ovo ou por transferência do YAC em linhas celulares estaminais embrionárias (ES) . Em geral, os YAC são transferidos em células ES por lipofecção do ADN purificado ou por fusão de esferoplastos de levedura em que o ADN purificado é transportado em micelas e a fusão é realizada de modo semelhante aos protocolos de fusão do hibridoma. A selecção das células ES desejadas após transferência de ADN é realizada por inclusão no YAC de qualquer dos marcadores de selecção conhecidos na técnica.

Como outra alternativa, são utilizados vectores do bacteriófago PI que são amplificados num hospedeiro bacteriano de E. coli. Enquanto estes vectores transportam habitualmente menos ADN introduzido do que um YAC, os clones são prontamente cultivados com rendimento suficientemente alto para permitir microinjecção directa num ovo de murganho. Foi demonstrado que a utilização de um cocktail de diferentes vectores PI conduz a níveis elevados de recombinação homóloga.

Uma vez identificado, um murganho transgénico apropriado (ou outro animal apropriado), utilizando qualquer das técnicas conhecidas no campo técnico para detectar níveis séricos de um anticorpo circulante (e. g., ELISA), o animal transgénico é cruzado com um murganho em que o locus Ig endógeno foi 32 interrompido. 0 resultado proporciona progenia em que essencialmente todas as células B expressam anticorpos humanos.

Ainda como outra alternativa, a totalidade do locus Ig animal é substituída com o locus Ig humano, em que o animal resultante expressa apenas anticorpos humanos. Numa outra abordagem, porções do locus do animal são substituídas com regiões específicas e correspondentes no locus humano. Em determinados casos, os animais que resultam deste processo podem expressar anticorpos quiméricos, em oposição de anticorpos totalmente humanos, dependendo da natureza da substituição no locus Ig de murganho.

Os anticorpos humanos podem também ser produzidos por exposição de esplenócitos humanos (células B ou T) a um antigénio in vitro, depois reconstituindo as células expostas num murganho imunocomprometido, e. g., SCID ou nod/SCID. Ver Brams et al., J Immunol, 160: 2051-2058 [1998]; Carballido et al., Nat Med, 6:103-106 [2000]. Numa abordagem, o enxerto de

tecido fetal humano em murganhos SCID (SCID-hu) resulta em hematopoiese a longo prazo e no desenvolvimento de células T humanas [McCune et al., Science 241:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem Immunol 8:243-248 (1996)]. Qualquer resposta imune humoral nestes murganhos quiméricos é completamente dependente do co-desenvolvimento de células T nos animais [Martensson et al., Immunol 83:1271-179 (1994)]. Numa abordagem alternativa, linfócitos de sangue periférico humano são transplantados intraperitonealmente (ou de outro modo) em murganhos SCID [Mosier et al., Nature 335:256-259 (1988)]. Quando as células transplantadas são tratadas com um agente de iniciação, tal como enterotoxina estafilocócica A (SEA) [Martensson et al., Immunol 84: 224-230 (1995)], ou anticorpos monoclonais CD40 anti-humanos 33 [Murphy et al.r Blood 86:1946-1953 (1995)], sao detectados níveis mais elevados da produção de células B.

Alternativamente, é criado um reportório de cadeia pesada humana totalmente sintético a partir de segmentos génicos V não rearranjados por montagem de cada segmento VH humano com segmentos D de nucleótidos aleatórios, em conjunto, com um segmento J humano [Hoogenboom et al., J Mol Biol 227:381-388 (1992)]. Do mesmo modo, um reportório de cadeia leve é construído por combinação de cada segmento V humano com um segmento J [Griffiths et al., EMBO J 13:3245-3260 (1994)]. Os nucleótidos que codificam o anticorpo completo (i. e., cadeias pesadas e leves) são ligados como um fragmento Fv de cadeia única e este polinucleótido é ligado a um nucleótido que codifica uma pequena proteína de revestimento do fago filamentoso. Quando esta proteína de fusão é expressa na superfície do fago, um polinucleótido que codifica um anticorpo específico é identificado por selecção utilizando um antigénio imobilizado.

Ainda noutra abordagem, fragmentos de anticorpo são montados como dois fragmentos Fab por fusão de uma cadeia a uma proteína fágica e secreção da outra no periplasma bacteriano [Hoogenboom et al., Nucl Acid Res 19:4133-4137 [1991]; Barbas et al., Proc Acad natl Sei (USA) 88:7978-7982 (1991)]. A produção em grande escala de anticorpos quiméricos, humanizados, enxertados com CDR e totalmente humanos, ou os seus fragmentos, é, tipicamente, realizada por métodos recombinantes. Uma ou mais moléculas de polinucleótido que codificam as cadeias pesadas e leves de cada anticorpo ou dos seus fragmentos, podem ser introduzidas em células hospedeiras e expressas utilizando materiais e processos aqui descritos. Numa forma de realização 34 preferida, os anticorpos são produzidos em células hospedeiras de mamífero, tais como células CHO. Os detalhes de tal produção são descritos abaixo.

Parceiros de Fusão de Agentes de Ligação Específica

Numa forma de realização adicional da invenção, os polipéptidos compreendendo os domínios variáveis das sequências de aminoácidos dos anticorpos Ang-2, tal como uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos como aqui descrita ou uma região variável de cadeia leve com uma sequência de aminoácidos como aqui descrita, podem ser fundidos no N-terminal ou C-terminal de um ou mais domínios de uma região Fc de IgG humana. Quando construído em conjunto com uma proteína terapêutica, tal como o Fab de um anticorpo específico para Ang-2, um domínio Fc pode proporcionar uma semi-vida mais longa ou incorporar tais funções como ligação ao receptor Fc, ligação à Proteína A, fixação de complemento e talvez mesmo transferência placentária [Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989)].

Num exemplo, as regiões de anticorpo de charneira, CH2 e CH3 podem estar fundidas no N-terminal ou C-terminal dos polipéptidos do agente de ligação específica, tais como um fragmento Fv ou Fab anti-Ang-2 (obtido, e. g., a partir de uma biblioteca de apresentação de fagos) utilizando métodos conhecidos pelo especialista na técnica. A proteína de fusão resultante pode ser purificada através da utilização de uma

coluna da afinidade de Proteína A ou Proteína G. Verificou-se que os péptidos e as proteínas fundidas a uma região Fc apresentam uma semi-vida substancialmente maior in vivo do que os correspondestes não fundidos. Também, uma fusão a uma região Fc permite dimerização/multimerização do polipéptido de fusão. A 35 região Fc pode ser uma região Fc de ocorrência natural, ou pode ser alterada para melhorar determinadas qualidades, tais como qualidades terapêuticas, tempo de circulação, diminuição de problemas de agregação, etc. Outros exemplos conhecidos na técnica incluem aqueles em que a região Fc, a qual pode ser de humano ou de outra espécie, ou pode ser sintética, é fundida ao N-terminal de CD30L para tratar a doença de Hodgkin, linfoma anaplásico e leucemia de células T (Patente U.S. N° 5480981), a região Fc é fundida ao receptor de TNF para tratar o choque séptico [Fisher et al.r N Engl J Med, 334: 1697-1702 (1996)] e a região Fc é fundida ao receptor Cd4 para tratar a SIDA [Capon et al. , Nature, 337: 525-31 (1989)].

Os anticorpos catalíticos são outro tipo de molécula de fusão e incluem anticorpos ao qual uma ou mais unidades citotóxicas, ou mais genericamente uma ou mais unidades biologicamente activas, estão ligadas ao agente de ligação específica. Ver, por exemplo, [Rader et al., Chem Eur J 12:2091-2095 (2000)]. Os agentes citotóxicos deste tipo melhoram a citotoxicidade mediada por anticorpo e incluem tais unidades como citocinas que estimulam directa ou indirectamente a morte celular, radioisótopos, fármacos quimioterapêuticos (incluindo profármacos), toxinas bacterianas (por exemplo, exotoxina de pseudomonas, toxina da difteria, etc.), toxinas vegetais (por exemplo, ricina, gelonina, etc.), conjugados químicos (e. g., toxinas maitansinóides, caliqueamicina, etc.), radioconjugados, conjugados enzimáticos (conjugados de RNase, terapia de enzima/profármaco dirigida a anticorpo [ADEPT)]) e semelhantes. Num aspecto, o agente citotóxico pode ser "ligado" a um componente de um anticorpo biespecífico ou multiespecífico através da ligação deste agente a um dos locais de reconhecimento de antigénio alternativo no anticorpo. Como uma alternativa, as citotoxinas proteicas podem ser expressas como 36 proteínas de fusão com o agente de ligação específica, após ligação de um polinucleótido que codifica a toxina a um polinucleótido que codifica o agente de ligação. Ainda noutra alternativa, o agente de ligação específica pode ser modificado covalentemente para incluir a citotoxina desejada.

Os exemplos de tais proteínas de fusão são polipéptidos imunogénicos, proteínas com longas semi-vidas circulantes, tais como regiões constantes de imunoglobulina, proteínas marcadoras, proteínas ou polipéptidos que facilitam a purificação do polipéptido do agente de ligação específica desejado, e sequências de polipéptidos que promovem a formação de proteínas multiméricas (tal como motivos de fecho de leucinas que são úteis na formação/estabilidade de dímeros).

Este tipo de variante de inserção tem habitualmente toda ou uma porção substancial da molécula nativa, ligada ao N- ou C-terminal, a todo ou a uma porção do segundo polipéptido. Por exemplo, as proteínas de fusão empregam, tipicamente, sequências líder de outra espécie para permitir a expressão recombinante de uma proteína num hospedeiro heterólogo. Uma outra proteína de fusão útil inclui a adição de um domínio imunologicamente activo, tal como um epitopo de anticorpo, para facilitar a purificação da proteína de fusão. A inclusão de um local de clivagem na ligação de fusão, ou perto dela, facilitará a remoção do polipéptido estranho após purificação. Outras fusões úteis incluem a ligação de domínios funcionais, tais como sítios activos de enzimas, domínios de glicosilação, sinais de direccionamento celular ou regiões transmembranares.

Existem vários sistemas de expressão de proteínas de fusão comercialmente disponíveis que podem ser utilizados na presente invenção. Os sistemas particularmente úteis incluem, mas não 37 estão limitados, ao sistema da glutationo-S-transferase (GST) (Pharmacia), ao sistema da proteína de ligação a maltose (NEB, Beverley, MA), ao sistema FLAG (IBI, New Haven, CT), e ao sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA) . Estes sistemas são capazes de produzir polipéptidos recombinantes que contêm apenas um pequeno número de aminoácidos adicionais, os quais não vão provavelmente afectar a capacidade antigénica do polipéptido recombinante. Por exemplo, o sistema FLAG e o sistema 6xHis adicionam apenas sequências curtas, ambas as quais são conhecidas por serem pouco antigénicas e não afectarem adversamente o enrolamento do polipéptido na sua conformação nativa. Outra fusão N-terminal que está contemplada como sendo útil é a fusão de um dipéptido Met-Lys na região N-terminal da proteína ou péptidos. Tal fusão pode produzir aumentos benéficos na expressão ou actividade da proteína.

Uma construção de fusão particularmente útil pode ser uma em que um péptido do agente de ligação específica é fundido a um hapteno para aumentar a imunogenicidade de uma construção de fusão do agente de ligação específica que é útil, por exemplo, na produção de anticorpos anti-idiotípicos da invenção. Tais construções de fusão para aumentar a imunogenicidade são bem conhecidas dos especialistas na técnica, por exemplo, uma fusão do agente de ligação específica com um antigénio auxiliar, tal como hsp70, ou sequências peptídicas, tal como da cadeia da toxina da difteria, ou uma citocina, tal como IL-2, serão úteis na indução de uma resposta imune. Noutras formas de realização, pode ser preparada uma construção de fusão que irá aumentar o direccionamento das composições de agente de ligação a antigénio a um local ou célula específica.

Estão também contempladas outras construções de fusão incluindo polipéptidos heterólogos com propriedades desejadas, 38 e. g., uma região constante de Ig para prolongar a semi-vida sérica ou um anticorpo ou um seu fragmento para direccionamento. Outros sistemas de fusão produzem polipéptidos híbridos onde é desejável excisar o parceiro de fusão do polipéptido desejado. Numa forma de realização, o parceiro de fusão é ligado ao polipéptido recombinante do agente de ligação específica através de uma sequência peptidica contendo uma sequência de reconhecimento específico para uma protease. Os exemplos de sequências adequadas são aqueles reconhecidos pela protease do Vírus da Gravura do Tabaco (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ou Factor Xa (New England Biolabs, Beverley, MA). A invenção também proporciona polipéptidos de fusão compreendendo a totalidade ou uma parte de um domínio variável de um anticorpo Ang-2, tal como uma região variável de cadeia pesada com uma sequência de aminoácidos como aqui descrita ou uma região variável de cadeia leve com uma sequência de aminoácidos como aqui descrita, em combinação com factor tecidular truncado (tTF) , um agente de direccionamento vascular consistindo de uma forma truncada de uma proteína de coagulação-indução humana que actua como um agente de coagulação de vasos sanguíneos tumorais. A fusão do tTF ao anticorpo anti-Ang-2, ou aos seus fragmentos, pode facilitar a distribuição de anti-Ang-2 a células alvo.

Variantes de Agentes de Ligação Específica

As variantes de agentes de ligação específica da presente invenção incluem variantes de inserção, deleção e/ou substituição. Num aspecto da invenção, são proporcionadas variantes de inserção em que um ou mais resíduos de aminoácidos suplementam uma sequência de aminoácidos do agente de ligação 39 específica. As inserções podem estar localizadas em um ou em ambos os terminais da proteína, ou podem estar posicionadas em regiões internas da sequência de aminoácidos do agente de ligação específica. As variantes de inserção com resíduos adicionais em um ou em ambos os terminais, podem incluir, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas incluindo marcadores ou tags de aminoácidos. As variantes de inserção incluem polipéptidos do agente de ligação específica em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados a uma sequência de aminoácidos do agente de ligação específica, ou um seu fragmento.

Os produtos de variantes da invenção incluem também produtos maduros do agente de ligação específica. Tais produtos do agente de ligação específica têm sequências líder ou de sinal removidas, contudo a proteína resultante têm resíduos amino-terminais adicionais em comparação com o polipéptido Ang-2 de tipo selvagem. Os resíduos amino-terminais adicionais podem ser derivados de uma outra proteína, ou podem incluir um ou mais resíduos que não são identificáveis como sendo derivados de uma proteína específica. São contemplados produtos do agente de ligação específica com um resíduo de metionina adicional na posição -1 (agente de ligação específica a Met-1), assim como são produtos do agente de ligação específica com resíduos de metionina e lisina adicionais nas posições -2 e -1 (agente de ligação específica a Met~2-Lys_1) . As variantes de agentes de ligação específica que têm resíduos Met, Met-Lys, Lys adicionais (ou um ou mais resíduos básicos em geral) são particularmente úteis para a produção aumentada de proteína recombinante em células hospedeiras bacterianas. A invenção abrange também as variantes de agentes de ligação específica que têm resíduos de aminoácidos adicionais que surgem 40 da utilização de sistemas de expressão específicos. Por exemplo, utilização de vectores comercialmente disponíveis que expressam um polipéptido desejado como parte do produto de fusão da glutationo-S-transferase (GST) proporciona o polipéptido desejado contendo um resíduo de glicina adicional na posição aminoacídica -1, após clivagem do componente de GST do polipéptido desejado. As variantes que resultam da expressão noutros sistemas de vectores estão também contempladas, incluindo aquelas em que marcadores de poli-histidina são incorporados na sequência de aminoácidos, habitualmente no carboxi- e/ou amino-terminal da sequência.

As variantes de inserção também incluem proteínas de fusão como acima descritas, em que os amino- e/ou carboxi-terminais do polipéptido-agente de ligação específica são fundidos com outro polipéptido, um seu fragmento, ou com sequências de aminoácidos que não são habitualmente reconhecidas como sendo parte de qualquer sequência de uma proteína específica.

Noutro aspecto, a invenção proporciona variantes de deleção em que são removidos um ou mais resíduos de aminoácidos num polipéptido do agente de ligação específica. As deleções podem ser efectuadas em um ou em ambos os terminais do polipéptido do agente de ligação específica ou por remoção de um ou mais resíduos na sequência de aminoácidos do agente de ligação específica. As variantes de deleção incluem necessariamente todos os fragmentos de um polipéptido do agente de ligação específica.

Os fragmentos de anticorpo incluem aquelas porções do anticorpo que se ligam a um epitopo no polipéptido antigénico. Os exemplos de tais fragmentos incluem fragmentos Fab e F(ab'>2 produzidos, por exemplo, por clivagem enzimática ou química de 41 anticorpos de tamanho total. Outros fragmentos de ligação incluem aqueles produzidos por técnicas de ADN recombinante, tal como a expressão de plasmídeos recombinantes contendo sequências de ácidos nucleicos que codificam regiões variáveis de anticorpo. A invenção abrange também fragmentos polipeptidicos de um agente de ligação a Ang-2 em que que os fragmentos mantêm a capacidade de se ligarem especificamente a um polipéptido Ang-2. Fragmentos compreendendo, pelo menos, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 ou mais aminoácidos consecutivos de um péptido ou polipéptido da invenção estão aqui compreendidos. Os fragmentos polipeptidicos preferidos apresentam propriedades imunológicas únicas ou especificas para o agente de ligação a antigénio da invenção. Os fragmentos da invenção que têm as propriedades imunológicas desejadas podem ser preparados por qualquer dos métodos bem conhecidos e praticados rotineiramente na técnica.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona variantes de substituição de agentes de ligação especifica da invenção. As variantes de substituição são habitualmente consideradas como sendo "semelhantes" ao polipéptido original ou tendo uma determinada "percentagem de identidade", relativamente ao polipéptido original, e incluem aqueles polipéptidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos de um polipéptido são removidos e substituídos com resíduos alternativos. Num aspecto, as substituições são de natureza conservadora, contudo, a invenção abrange substituições que são também não conservadoras. A identidade e a semelhança de polipéptidos relacionados podem ser prontamente calculadas por métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não estão limitados aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque (1988); Biocomputing: Informatics 42 and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova Iorque (1991); e Carillo et al.r SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

Os métodos preferidos para determinar a semelhança ou percentagem de identidade de dois polipéptidos, são concebidos para produzir o maior emparelhamento entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos preferidos de programas de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados ao, pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer

Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). O programa BLASTX está publicamente disponível do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e as outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra (1990)). O bem conhecido algoritmo Smith Waterman pode também ser utilizado para determinar a identidade.

Determinados esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar no emparelhamento de apenas uma curta região das duas sequências, e esta pequena região alinhada pode ter uma identidade de sequência muito elevada, embora não exista qualquer relação significativa entre as duas sequências de tamanho total. Desta forma, em determinadas formas de realização, o método de alinhamento seleccionado (programa GAP) resultará num alinhamento que 43 abrange, pelo menos, dez porcento do tamanho total do polipéptido alvo a ser comparado, i. e., pelo menos, 40 aminoácidos contíguos no caso em que sequências de, pelo menos, 400 aminoácidos estão a ser comparadas, 30 aminoácidos contíguos no caso em que sequências de, pelo menos, 300 a cerca de 400 aminoácidos estão a ser comparadas, pelo menos, 20 aminoácidos no caso em que sequências de 200 a cerca de 300 aminoácidos estão a ser comparadas e, pelo menos, 10 aminoácidos contíguos no caso em que sequências de cerca de 100 a 200 aminoácidos estão a ser comparadas.

Por exemplo, utilizando o algoritmo computorizado GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipéptidos para os quais a percentagem de identidade de sequência é para ser determinada, são alinhados para emparelhamento óptimo dos seus respectivos aminoácidos ("matched span", como determinado pelo algoritmo). Em determinadas formas de realização, uma penalidade da abertura de lacuna (que é calculada como três-vezes a diagonal média; onde a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação utilizada; a "diagonal" é a contagem ou o número atribuído a cada emparelhamento de aminoácido perfeito pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de lacuna (que é habitualmente um décimo da penalidade de abertura de lacuna), assim como uma matriz de comparação, tais como PAM250 ou BLOSUM 62, são utilizados em conjunto com o algoritmo. Em determinadas formas de realização, uma matriz de comparação padrão (ver Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei USA 89:10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) é também utilizada pelo algoritmo. 44

Em determinadas formas de realizaçao, os parâmetros para uma comparação de sequências polipeptidicas incluem o seguinte:

Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970);

Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., Supra (1992) ;

Penalidade de Lacuna: 12

Penalidade de Comprimento de Lacuna: 4

Limite de Semelhança: 0 O programa GAP pode ser útil com os parâmetros acima. Em determinadas formas de realização, os parâmetros acima mencionados são os parâmetros por defeito para comparações de polipéptidos (juntamente com a ausência de penalidade para lacunas finais) que utilizam o algoritmo GAP.

Em determinadas formas de realização, os parâmetros para comparações de sequências de moléculas polinucleotidicas incluem o seguinte:

Algoritmo: Needleman et al., supra (1970);

Matriz de comparação: emparelhamentos = +10, desemparelhamentos = 0

Penalidade de Lacuna: 50

Penalidade de Comprimento de Lacuna: 3 O programa GAP pode também ser útil com os parâmetros acima. Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros por defeito para comparações de moléculas polinucleotidicas.

Podem ser utilizados outros algoritmos, penalidades de abertura de lacuna, penalidades de extensão de lacuna, matrizes 45 de comparação, limites de semelhança exemplificativos, etc., incluindo aqueles apresentados no manual do Programa, pacote de Wisconsin, versão 9, Setembro de 1997. As escolhas particulares a serem realizads serão evidentes aos especialistas na técnica e dependerão da comparação específica a ser realizada, tais como ADN-para-ADN, proteína-para-proteína, proteína-para-ADN; e adicionalmente, se a comparação for entre pares dados de sequências (em cujo caso GAP ou BestFit são geralmente preferidos) ou entre uma sequência e uma grande base de dados de sequências (em cujo o caso FASTA ou BLASTA são preferidos).

Como aqui utilizados, os vinte aminoácidos convencionais e as suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2a Edição, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)) que é aqui incorporada por referência para qualquer objectivo.

Os aminoácidos podem ter estereoquímica L ou D (excepto para

Gly, que não é L nem D) e os polipéptidos e composições da presente invenção podem compreender uma combinação de estereoquímicas. Contudo, a estereoquímica L é preferida. A invenção também proporciona moléculas invertidas, em que cL sequência de amino-terminal para carboxi-terminal dos aminoácidos está invertida. Por exemplo, 0 inverso de uma molécula que tem a sequência normal X1-X2-X3 seria X3-X2-X1' . A invenção também proporciona moléculas retro- inversas em que, como acima, a sequência amino-terminal para carboxi-terminal de aminoácidos está invertida e os resíduos que são normalmente enantiómeros "L" estão alterados para formar o estereoisómero "D". 46

Os estereoisómeros (e. g., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos a,a-dissubstituídos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionaos podem também ser componentes adequados para polipéptidos da presente invenção. Os exemplos de aminoácidos não convencionais incluem, sem limitação: ácido aminoadípico, beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido aminobutirico, ácido piperidínico, ácido aminocapróico, ácido amino-heptanóico, ácido aminoisobutirico, ácido aminopimélico, ácido diaminobutirico, desmosina, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N-metilisoleucina, n-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina, 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,N,N-trimetillisina, ε-Ν-acetillisina, 0-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina e outros aminoácidos semelhantes (e. g., 4-hidroxiprolina).

De um modo semelhante, salvo indicação em contrário, a extremidade esquerda de sequências polinucleotidicas de cadeia simples é a extremidade 5'; o sentido para a esquerda de sequências polinucleotidicas de cadeia dupla é referido como sentido 5'. 0 sentido da adição 5' para 3' de transcritos nascentes de ARN é referido como o sentido de transcrição; as regiões de sequência na cadeia de ADN que tem a mesma sequência que o transcrito de ARN que são de 5' para a extremidade 5' do transcrito de ARN são referidas como "sequências a montante"; as regiões de sequência na cadeia de ADN que têm a mesma sequência que o transcrito de ARN que são de 3' para a extremidade 3' do transcrito de ARN são referidas como "sequências a jusante".

As substituições conservadoras de aminoácidos podem abranger resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, os quais são, tipicamente, incorporados por síntese peptídica química em vez de síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas invertidas ou reversas de unidades de aminoácidos.

Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: 1) hidrofóbicos: Met, Ala, Vai, Leu, Ile; 2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; 3) acídicos: Asp, Glu; 4) básicos: His, Lys, Arg; 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Por exemplo, as substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma destas classes para um membro de outra classe. Tais resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões do anticorpo humano que são homólogas com anticorpos não humanos ou nas regiões não homólogas da molécula.

Ao fazer tais alterações, de acordo com determinadas formas de realização, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base nas suas características de hidrofobicidade e carga. Estes são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina 48 (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5). A importância do índice hidropático de aminoácidos em conferir função biológica interactiva numa proteína é compreendida na técnica, Kyte et ai., J. Mol. Biol. 157:105-131 (1982). É conhecido que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que têm uma pontuação ou índice hidropático semelhante e ainda retêm uma actividade biológica semelhante. Ao fazer alterações com base no índice hidropático, em determinadas formas de realização, está incluída a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de +2. Em determinadas formas de realização, estão incluídos aqueles que estão dentro de ±1 e, em determinadas formas de realização, estão incluídos aqueles dentro de ±0,5. É também compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade, particularmente nos casos em que o péptido ou proteína biologicamente funcional assim criado, é pretendido para utilização em formas de realização imunológicas, como no presente caso. Em determinadas formas de realização, a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como controlado pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade e antigenicidade, i. e., com uma propriedade biológica da proteína.

Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a estes resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (—0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina 49 (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Ao fazer as alterações com base em valores de hidrofilicidade semelhantes, em determinadas formas de realização, está incluída a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2, em determinadas formas de realização, estão incluídos aqueles que estão dentro de ±1 e, em determinadas formas de realização, estão incluídos aqueles dentro de ±0,5. Pode-se também identificar epitopos de sequências primárias de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Estas regiões são também referidas como "regiões de núcleo epitópico".

Substituições de aminoácidos exemplificativas são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1

Substituições de Aminoácidos

Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Ala Vai, Leu, Ile Vai Arg Lys, Gin, Asn Lys Asn Gin, Glu, Asp Gin Asp Glu, Gin, Asn Glu Cys Ser, Ala Ser Gin Asn, Glu, Asp Asn Glu Asp, Asn, Gin Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gin, Lys, Arg Arg 50 (continuação)

Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Ile Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu Norleucina, Ile, Vai, Met, Ala, Phe Ile Lys Arg, Ácido 1,4-Diamino-butírico, Gin, Asn Arg Met Leu, Phe, Ile Leu Phe Leu, Vai, Ile, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Vai Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

Um especialista será capaz de determinar variantes adequadas de polipéptidos, como aqui apresentados, utilizando técnicas bem conhecidas. Em determinadas formas de realização, um especialista na técnica pode identificar áreas adequadas da molécula que podem ser alteradas sem destruir a actividade, por direccionamento a regiões que não se pensa que sejam importantes para a actividade. Em determinadas formas de realização, podem-se identificar resíduos e porções das moléculas que são conservadas entre polipéptidos semelhantes. Em determinadas formas de realização, mesmo áreas que podem ser importantes para a actividade biológica ou para a estrutura, podem ser submetidas a substituições conservadoras de aminoácidos sem destruir a actividade biológica ou sem afectar de forma adversa a estrutura do polipéptido. 51

Adicionalmente, um especialista pode rever estudos de estrutura-função que identificam resíduos em polipéptidos semelhantes que são importantes para a actividade ou estrutura. Face a uma tal comparação, pode-se prever a importância de resíduos de aminoácidos numa proteína que corresponde a resíduos de aminoácidos importantes para a actividade ou estrutura em proteínas semelhantes. Um especialista na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente semelhantes para tais resíduos de aminoácidos importantes previstos.

Um especialista na técnica pode também analisar a estrutura tridimensional e a sequência de aminoácidos em relação a essa estrutura em polipéptidos semelhantes. Face a uma tal informação, um especialista na técnica pode prever o alinhamento de resíduos de aminoácidos de um anticorpo relativamente à sua estrutura tridimensional. Em determinadas formas de realização, um especialista na técnica pode escolher não fazer alterações radicais a resíduos de aminoácidos previstos como estando à superfície da proteína, uma vez que tais resíduos podem estar envolvidos em interacções importantes com outras moléculas. Além disso, um especialista na técnica pode gerar variantes de teste contendo uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado. As variantes podem ser depois rastreadas utilizando ensaios de actividade conhecidos dos especialistas na técnica. Tais variantes podem ser utilizadas para recolher informação acerca de variantes adequadas. Por exemplo, se se verificar que uma alteração a um resíduo de aminoácido particular resultou em actividade destruída, indesejavelmente reduzida ou inadequada, as variantes com tal alteração podem ser evitadas. Por outras palavras, com base na informação recolhida a partir de tais experiências de rotina, um especialista na técnica pode determinar prontamente os aminoácidos onde 52 substituições adicionais devem ser evitadas, isoladamente ou em combinação com outras mutações.

Muitas publicações cientificas foram dedicadas à previsão da estrutura secundária. Ver Moult J., Curr. Op. In Biotech. 7:422-427 (1996); Chou et ai., Biochemistry 13:222-245 (1974); Chou et ai., Biochemistry 113:211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem. 47:251-276 (1979); e Chou et al., Biophys. J. 26:367-384 (1979). Além disso, estão actualmente disponíveis programas de computador para ajudar na previsão da estrutura secundária. Um método de prever a estrutura secundária é baseado em modelação de homologia. Por exemplo, dois polipéptidos ou proteínas que têm uma identidade de sequência superior a 30%, ou semelhança superior a 40%, têm frequentemente topologias estruturais semelhantes. O recente crescimento da base de dados estrutural de proteínas (PDB) tem proporcionado predictabilidade aumentada de estrutura secundária, incluindo o número de enrolamentos potencial dentro de uma estrutura de polipéptido ou proteína. Ver Holm et al., Nucl. Acid. Res. 27:244-247 (1999). Foi sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376 (1997)) que existe um número limitado de enrolamentos num dado polipéptido ou proteína e que, assim que um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, a previsão estrutural tornar-se-à dramaticamente mais exacta. Métodos adicionais para prever a estrutura secundária incluem "threading" (Jones, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87 (1997); Sippl et al., Struture 4:15-19 (1996)), "profile analysis" (Bowie et al., Science 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym. 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 84:4355-4358 (1987)) e "evolutionary linkage" (ver Holm, supra (1999), e Brenner, supra (1997)). 53

Em determinadas formas de realização, as variantes de anticorpos incluem variantes de glicosilação, em que o número e/ou tipo de local de glicosilação foi alterado comparativamente às sequências de aminoácidos do polipéptido parental. Em determinadas formas de realização, as variantes proteicas compreendem um número maior ou menor de locais de glicosilação N-ligados do que a proteína nativa. Um local de glicosilação N-ligado é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que o resíduo de aminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo de aminoácido, excepto prolina. A substituição de resíduos de aminoácidos para criar esta sequência proporciona um potencial novo local para a adição de uma cadeia de hidrato de carbono ligada a N. Alternativamente, as substituições que eliminam esta sequência irão remover uma cadeia de hidrato de carbono ligada a N existente. É também proporcionado um rearranjo de cadeias de hidrato de carbono ligadas a N em que um ou mais locais de glicosilação ligados a N (tipicamente aqueles que são de ocorrência natural) são eliminados e um ou mais novos locais ligados a N são criados. As variantes de anticorpo preferidas adicionais incluem variantes de cisteína em que um ou mais resíduos da cisteína são suprimidos ou substituídos por outro aminoácido (e. g., serina) comparativamente à sequência de aminoácidos parental. As variantes de cisteína podem ser úteis quando os anticorpos têm que ser re-enrolados numa conformação biologicamente activa, tal como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. As variantes de cisteína têm habitualmente menos resíduos de cisteína do que a proteína nativa e têm, tipicamente, um número par para minimizar interacções resultantes de cisteínas desemparelhadas.

De acordo com determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à 54 oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos proteicos, (4) alteram afinidades de ligação e/ou (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-guímicas ou funcionais em tais polipéptidos. De acordo com determinadas formas de realização, podem ser feitas substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (em determinadas formas de realização, substituições de aminoácidos conservadoras) na seguência de ocorrência natural (em determinadas formas de realização, na porção do polipéptido fora do(s) domínio(s) gue formam contactos intermoleculares). Em determinads formas de realização, uma substituição de aminoácido conservadora, tipicamente, não muda substancialmente as características estruturais da seguência parental (e. g., uma substituição de aminoácido não deve tender a guebrar uma hélice gue ocorra na sequência parental, ou interromper outros tipos de estrutura secundária que caracterizam a sequência parental). Os exemplos de estruturas secundárias e terciárias polipeptídicas, reconhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principies, (Creighton, ed.), W. H. Freeman and Company, Nova Iorque (1984); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds.), Garland Publishing, Nova Iorque, N.I. (1991); e Thornton et ai., Nature 354:105 (1991).

Para variantes de anticorpo, a cadeia pesada pode ter 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos substituídos, enquanto a cadeia leve pode ter 2 ou 1 aminoácido substituído.

Derivados de Agentes de Ligação Específica A invenção também proporciona derivados de polipéptidos do agente de ligação específica. Os derivados incluem polipéptidos do agente de ligação específica que contêm modificações à 55 excepção de inserção, deleção ou substituição de resíduos de aminoácidos. De um modo preferido, as modificações são de natureza covalente e incluem, por exemplo, ligação química com polímeros, lípidos, outras unidades orgânicas e inorgânicas. Os derivados da invenção podem ser preparados para aumentar a semi-vida circulante de um polipéptido do agente de ligação específica ou podem ser concebidos para melhorar a capacidade de direccionamento do polipéptido para células, tecidos ou órgãos desejados. A invenção abrange ainda os agentes de ligação derivados, covalentemente modificados para incluir uma ou mais ligações poliméricas solúveis em água, tais como polietilenoglicol, polioxietilenoglicol ou polipropilenoglicol, como descrito nas Patentes U.S. N° : 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 e 4179337. Ainda outros polímeros úteis, conhecidos na técnica, incluem monometoxi-polietilenoglicol, dextrano, celulose ou outros polímeros baseados em hidratos de carbono, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenoglicol, homopolímeros de propilenoglicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (e. g., glicerol) e álcool polivinílico, assim como misturas destes polímeros. São particularmente preferidos produtos do agente de ligação específica covalentemente modificados com subunidades de polietilenoglicol (PEG). Os polímeros solúveis em água podem ser ligados em posições específicas, por exemplo, no amino-terminal dos produtos do agente de ligação específica ou aleatoriamente ligados a uma ou mais cadeias laterais do polipéptido. A utilização de PEG para melhorar a capacidade terapêutica para o agente de ligação específica e, em particular, para anticorpos humanizados, é descrita na Patente U.S. 6133426 de Gonzales et al., concedida em 17 de Outubro de 2000. 56

Locais Alvo Para Mutagénese de Anticorpo

Podem ser utilizadas determinadas estratégias para manipular propriedades inerentes de um anticorpo especifico para Ang-2, tal como a afinidade do anticorpo para o seu alvo. Estas estratégias incluem a utilização de mutagénese dirigida ou aleatória da molécula polinucleotidica que codifica o anticorpo, para produzir variantes de anticorpo, seguida por um passo de rastreio concebido para recuperar variantes de anticorpo que apresentam a alteração desejada, e. g., afinidade aumentada ou diminuída.

Os resíduos de aminoácidos mais habitualmente visados em estratégias mutagénicas são aqueles nas CDR. Como descrito supra, estas regiões contêm os resíduos que interagem de facto com Ang-2 e outros aminoácidos que afectam a organização espacial destes resíduos. Contudo, também foi demonstrado que os aminoácidos nas regiões estruturais dos domínios variáveis fora das regiões CDR, fazem contribuições substanciais para as propriedades de ligação a antigénio do anticorpo, e podem ser visados para manipular tais propriedades. Ver Hudson, Curr Opin Biotech, 9:395-402 (1999) e referências aí.

Podem ser produzidas bibliotecas de variantes de anticorpo menores e mais eficazmente rastreadas por restrição da mutagénese aleatória ou dirigida a locais nas CDR que correspondem às áreas susceptíveis a "hipermutação" durante o processo de maturação da afinidade somática. Ver Chowdhury e Pastan, Nature Biotech, 17: 568-572 [1999] e referências aí. Os tipos de elementos de ADN conhecidos para definir locais de hipermutação desta forma, incluem repetições directas e invertidas, determinadas sequências de consenso, estruturas secundárias e palindromas. As sequências de ADN de consenso 57 incluem a sequência tetrabásica Purina-G-Pirimidina-A/T do (i.e., A ou G - G - C ou T - A ou T) eo codão de serina AGY (em que Y pode ser um C ou um T).

Assim, uma forma de realização da presente invenção inclui estratégias mutagénicas com o objetivo de aumentar a afinidade de um anticorpo para o seu alvo. Estas estratégias incluem mutagénese da totalidade da cadeia pesada e leve variável, mutagénese apenas das regiões CDR, mutagénese dos locais de hipermutação de consenso dentro das CDR, mutagénese de regiões estruturais, ou qualquer combinação destas abordagens ("mutagénese" neste contexto poderia ser aleatória ou dirigida). A delineação definitiva das regiões CDR e a identificação de resíduos compreendendo o local de ligação de um anticorpo podem ser realizadas através da resolução da estrutura do anticorpo em questão, e do complexo anticorpo-ligando, por técnicas conhecidas dos especialistas no campo técnico, tal como cristalografia de raios X. Vários métodos baseados na análise e na caracterização de tais estruturas cristalinas de anticorpo são conhecidos dos especialistas na técnica e podem ser utilizados, embora não definitivamente, para aproximar as regiões CDR. Os exemplos de tais métodos habitualmente utilizados incluem as definições de Kabat, Chothia, AbM e de contacto. A definição de Kabat é baseada na variabilidade de sequência e é a definição mais habitualmente utilizada para prever regiões CDR [Johnson e Wu, Nucleic Acid Res, 28: 214-8 (2000)]. A definição de Chothia é baseada na posição das regiões estruturais em ansa [Chothia et ai., J Mol Biol, 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989)]. A definição de AbM é um compromisso entre a definição de Kabat e de Chothia. O AbM é um conjunto integrado de programas para modelação 58 estrutural de anticorpos produzido pelo Oxford Molecular Group [Martin et ai., Proc Acad natl Sei (USA) 86 : 9268-9272 (1989); Rees, et al., ABM™, a Computer program for modeling variable regions of antibodies, Oxford, Reino Unido; Oxford Molecular, Ltd.]. 0 conjunto AbM modela a estrutura terciária de um anticorpo a partir da sequência primária utilizando uma combinação de conhecimento de bases de dados e de métodos ab initio. Uma definição adicional, conhecida como a definição de contacto, foi introduzida recentemente [MacCallum et al., J Mol Biol, 5:732-45 (1996)]. Esta definição é baseada numa análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis.

Por convenção, as regiões CDR na cadeia pesada são, tipicamente, referidas como Hl, H2 e H3 e são numeradas por ordem sequencial, partindo do amino-terminal para o carboxi-terminal. As regiões CDR na cadeia leve são, tipicamente, referidas como LI, L2 e L3 e são numeradas por ordem sequencial, partindo do amino-terminal para o carboxi-terminal. A CDR-H1 tem, aproximadamente, 10 a 12 resíduos de comprimento e começa, tipicamente, 4 resíduos após uma Cys de acordo com as definições de Chothia e AbM ou, tipicamente, após 5 resíduos de acordo com a definição de Kabat. A Hl é, tipicamente, seguido por um Trp, tipicamente, Trp-Val, mas também Trp-Ile ou Trp-Ala. O comprimento de Hl é, aproximadamente, 10 a 12 resíduos de acordo com a definição de AbM, enquanto a definição de Chothia exclui os últimos 4 resíduos. A CDR-H2 começa, tipicamente, 15 resíduos após o fim de Hl de acordo com a definição de Kabat e AbM. Os resíduos que precedem H2 são, tipicamente, Leu-Glu-Trp-Ile-Gly mas existe uma variedade de variações. H2 é seguida, tipicamente, pela 59 sequência de aminoácidos Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala. De acordo com a definição de Kabat, o comprimento de H2 é, aproximadamente, 16 a 19 residuos, enquanto a definição de AbM prevê o comprimento como sendo, tipicamente, 9 a 12 residuos. A CDR-H3 começa, tipicamente, 33 residuos após o fim de H2 e é precedida, tipicamente, pela sequência de aminoácidos (tipicamente Cys-Ala-Arg) A H3 é, tipicamente, seguida pela sequência de aminoácidos -Gly. 0 comprimento da H3 pode estar entre 3 a 25 resíduos. A CDR-L1, tipicamente, começa, aproximadamente, no resíduo 24 e seguirá, tipicamente, uma Cys. 0 resíduo após CDR-L1 é sempre um Trp e começará, tipicamente, a sequência Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln ou Trp-Tyr-Leu. 0 comprimento de CDR-L1 é, aproximadamente, 10 a 17 resíduos. A putativa CDR-L1 para os anticorpos da invenção segue exatamente este perfil com um resíduo de Cys seguido por 15 aminoácidos e depois Trp-Tyr-Gln. A CDR-L2 começa, aproximadamente, 16 resíduos após o fim de Ll. Seguirá habitualmente os resíduos Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys ou Ile-Phe. O comprimento de CDR-L2 é, aproximadamente, 7 resíduos. A CDR-L3 começa, tipicamente, 33 resíduos após o fim de L2 e segue, tipicamente, uma Cys. L3 é seguida, tipicamente, pela sequência de aminoácidos Phe-Gly-XXX-Gly. O comprimento de L3 é, aproximadamente, 7 a 11 resíduos.

Foram descritos na técnica vários métodos para modificar anticorpos. Por exemplo, a Patente U.S. 5530101 (de Queen et ai., 25 de Junho de 1996) descreve métodos para produzir 60 anticorpos humanizados em que a sequência da estrutura da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada é 65% a 95% idêntica à sequência da estrutura da região variável da cadeia pesada de imunoglobulina dadora. Cada cadeia de imunoglobulina humanizada irá habitualmente compreender, para além das CDR, aminoácidos da estrutura de imunoglobulina dadora que são, e. g., capazes de interactuar com as CDR para afectar a afinidade de ligação, tal como um ou mais aminoácidos que estão imediatamente adjacentes a uma CDR na imunoglobulina dadora ou aqueles dentro do intervalo de cerca de 3 angstroms, como previsto pela modelação molecular. As cadeias pesadas e leves podem, cada, ser concebidas através da utilização de qualquer um ou todos os vários critérios de posição. Quando combinadas num anticorpo intacto, as imunoglobulinas humanizadas da presente invenção serão substancialmente não imunogénicas em humanos e reterão substancialmente a mesma afinidade que a imunoglobulina dadora para o antigénio, tal como uma proteína ou outro composto contendo um epitopo. Ver também, métodos relacionados na Patente U.S. 5693761 de Queen et al., concedida em 2 de Dezembro de 1997 ("Polynucleotides encoding improved humanized immunoglobulins") ; Patente U.S. 5693762 de Queen, et al., concedida em 2 de Dezembro de 1997 ("Humanized Immunoglobulins"); Patente U.S. 5585089 de Queen, et al. concedida em 17 de Dezembro de 1996 ("Humanized Immunoglobulins").

Num exemplo, a Patente U.S. 5565332 de Hoogenboom et al. concedida em 15 de Outubro de 1996 ("Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach") descreve métodos para a produção de anticorpos, e fragmentos de anticorpo que têm especificidade de ligação semelhante a um anticorpo parental, mas que aumentaram as características humanas. Os anticorpos humanizados são obtidos por arranjo combinatorial da cadeia utilizando, por exemplo, a tecnologia de apresentação de fagos, 61 e um polipéptido compreendendo um domínio variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo não humano específico para um antigénio de interesse é combinado com um reportório de domínios variáveis de cadeia (leve ou pesada) complementares humanos. Os emparelhamentos híbridos que são específicos para o antigénio de interesse são identificados e as cadeias humanas dos emparelhamentos seleccionados são combinadas com um reportório de domínios variáveis complementares humanos (pesados ou leves). Noutra forma de realização, um componente de uma CDR de um anticorpo não humano é combinado com um reportório de partes componentes de CDR para anticorpos humanos. A partir da biblioteca resultante de dímeros de polipéptido de anticorpo, são seleccionados e utilizados híbridos num segundo passo de arranjo combinatorial para humanização. Alternativamente, este segundo passo é eliminado se o híbrido tiver já suficiente caráter humano para ter valor terapêutico. Os métodos de modificação para aumentar o caráter humano são também descritos. Ver também Winter, FEBS Letts 430:92-92 (1998).

Como outro exemplo, a Patente dos Estados Unidos 6054297 de Cárter et al., concedida em 25 de Abril de 2000, descreve um método para preparar anticorpos humanizados por substituição de uma sequência de aminoácidos de CDR para a sequência de aminoácidos correspondente de CDR humana e/ou substituição de uma sequência de aminoácidos de FR para as sequências de aminoácidos correspondentes de FR humanas.

Como outro exemplo, a Patente U.S. 5766886 de Studnicka et al., concedida em 16 de Junho de 1998 ("Modified antibody variable domains") descreve métodos para identificar os resíduos de aminoácidos de um domínio variável de anticorpo que podem ser modificados sem diminuir a afinidade nativa do domínio de ligação a antigénio, enquanto reduzem a sua imunogenicidade em 62 relação a uma espécie heteróloga e métodos para preparar estes domínios variáveis de anticorpo modificado que são úteis para administração a espécies heterólogas. Ver também a Patente U.S. 5869619 de Studnicka, concedida em 9 de Fevereiro de 1999.

Como discutido, a modificação de um anticorpo por qualquer dos métodos conhecidos na técnica é concebida, tipicamente, para atingir uma afinidade de ligação aumentada para um antigénio e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo no recipiente. Numa abordagem, os anticorpos humanizados podem ser modificados para eliminar locais de glicosilação de modo a aumentar a afinidade do anticorpo para o seu antigénio aparentado [Co et al., Mol Immunol 30:1361-1367 (1993)]. As técnicas, tais como "remodelação", "hiperquimerização" e "revestimento/renovação superficial" produziram anticorpos humanizados com maior potencial terapêutico [Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol 81:105 (1998); Roguska et al., Prot Engineer 9:895-904 (1996)]. Ver também a Patente U.S. 6072035 de Hardman et al., concedida em 6 de Junho de 2000 que descreve métodos para remodulação de anticorpos. Enquanto estas técnicas diminuem a imunogenicidade do anticorpo por redução do número de resíduos estranhos, estas não previnem respostas anti-idiotípicas e anti-alotipicas após administração repetida de anticorpos. As alternativas a estes métodos para reduzir a imunogenicidade são descritas em Gilliland et al., J Immunol 62(6): 3663-71 (1999).

Em muitos casos, a humanização de anticorpos resulta numa perda da capacidade de ligação ao antigénio. É deste modo preferível "retro-mutar" o anticorpo humanizado para incluir um ou mais dos resíduos de aminoácidos encontrados no anticorpo original (mais frequentemente de roedor) numa tentativa para restaurar a afinidade de ligação do anticorpo. Ver, por exemplo, Saldanha et al., Mol Immunol 36:709-19 (1999). 63 Não

Análogos do agente de ligação especifica Peptídicos/Miméticos Proteicos

Além disso, estão também contemplados análogos do agente de ligação especifica não peptídicos de péptidos que proporcionam uma estrutura estabilizada ou uma biodegradação diminuída. Os análogos miméticos peptídicos do agente de ligação específica são preparados com base num péptido inhibidor seleccionado por substituição de um ou mais resíduos por unidades não peptídicas. De um modo preferido, as unidades não peptídicas permitem ao péptido reter a sua conformação natural, ou estabilizar uma conformação preferida, e. g., bioactiva, que retém a capacidade para reconhecer e ligar Ang-2. Num aspecto, o análogo/mimético resultante apresenta afinidade de ligação aumentada para Ang-2. Um exemplo de métodos para preparação de análogos miméticos não peptídicos a partir de péptidos do agente de ligação específica é descrito em Nachman et al., Regul Pept 57:359-370 (1995). Se desejado, os péptidos do agente de ligação específica podem ser modificados, por exemplo, através de glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação, ou através da criação de sais de adição de ácido, amidas, ésteres, em particular ésteres C-terminais, e derivados de N-acilo dos péptidos da invenção. Os péptidos do agente de ligação específica podem também ser modificados para criar derivados peptídicos por formação de complexos covalentes ou não covalentes com outras unidades. Os complexos ligados covalentemente podem ser preparados por ligação das unidades químicas a grupos funcionais nas cadeias laterais dos aminoácidos compreendendo os péptidos do agente de ligação específica, ou no N- ou C-terminal.

Em particular, é antecipado que os péptidos do agente de ligação específica podem ser conjugados a um grupo repórter, incluindo, mas não limitado a, um marcador radioactivo, um 64 marcador fluorescente, uma enzima (e. g., que cataliza uma reacção colorimétrica ou fluorimétrica), um substrato, uma matriz sólida ou um veiculo (e. g., biotina ou avidina) . Desta forma, a invenção proporciona uma molécula compreendendo uma molécula de anticorpo, em que a molécula compreende ainda, de um modo preferido, um grupo repórter seleccionado do grupo consistindo de um marcador radioactivo, um marcador fluorescente, uma enzima, um substrato, uma matriz sólida e um veiculo. Tais marcadores são bem conhecidos dos especialistas na técnica, e. g., os marcadores de biotina estão particularmente contemplados. A utilização de tais marcadores é bem conhecida dos especialistas na técnica e é descrita, e. g., na Patente U.S. N° 3817837; Patente U.S. N° 3850752; Patente U.S. N° 3996345 e Patente U.S. N° 4277437. Outros marcadores que serão úteis incluem, mas não estão limitados a, marcadores radioativos, marcadores fluorescentes e marcadores quimioluminescentes. As patentes U.S. que se referem à utilização de tais marcadores incluem, por exemplo, a Patente U.S. N° 3817837; Patente U.S. N° 3850752; Patente U.S. N° 3939350 e Patente U.S. N° 3996345. Qualquer dos péptidos da presente divulgação pode compreender um, dois ou mais de qualquer destes marcadores. Métodos de Preparação de Agentes de Ligação Específica

Os agentes de ligação especifica da presente invenção que são proteínas, podem ser preparados por síntese quimica em solução ou num suporte sólido de acordo com técnicas convencionais. O limite actual para a síntese de fase sólida é cerca de 85-100 aminoácidos de comprimento. Contudo, as técnicas de síntese química podem ser frequentemente utilizadas para 65 ligar quimicamente uma série de péptidos menores para produzir polipéptidos de tamanho total. Vários sintetizadores automáticos estão comercialmente disponíveis e podem ser utilizados de acordo com protocolos conhecidos. Ver, por exemplo, Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chemical Co., (1984); Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232:341-347, (1986); e Barany e Merrifield,

The Peptides, Gross e Meienhofer, eds, Academic Press, Nova Iorque, 1-284; Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739 (1987); e Pat. U.S. N° 5424398), cada aqui incorporada por referência.

Os métodos de síntese peptídica de fase sólida utilizam um copolímero de (estireno-divinilbenzeno) contendo 0,1-1,0 mM de amina/g de polímero. Estes métodos para a síntese peptídica utilizam proteção de butiloxicarbonilo (t-BOC) ou 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) de grupos alfa-amino. Ambos os métodos envolvem sínteses progressivas em que um único aminoácido é adicionado em cada passo, começando a partir do C-terminal do péptido (ver, Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unidade 9). Após conclusão da síntese química, o péptido sintético pode ser desprotegido para remover os grupos bloqueadores de aminoácido t-BOC ou FMOC e clivado do polímero por tratamento com ácido a temperatura reduzida (e. g., HF líquido-10% de anisole durante cerca de 0,25 a cerca de 1 hora a 0 °C) . Após evaporação dos reagentes, os péptidos do agente de ligação específica são extraídos do polímero com uma solução a 1% de ácido acético que é depois liofilizada para produzir o material em bruto. Este pode ser normalmente purificado por técnicas como a filtração em gel em Sephadex G-15 utilizando ácido acético a 5% como um solvente. A liofilização de fracções apropriadas da coluna irá produzir o péptido do agente de ligação específica homogéneo, ou derivados 66 peptídicos que pode, depois, ser caracterizado por técnicas convencionais como a análise de aminoácidos, cromatografia de camada fina, cromatografia liquida de elevado desempenho, espectroscopia de absorção de ultravioleta, rotação molar, solubilidade, e quantificado através da degradação de Edman de fase sólida. A síntese química de anticorpos anti-Ang-2dos derivados, variantes e os seus fragmentos, assim como de outros agentes de ligação a Ang-2 de base proteica, permite a incorporação de aminoácidos de ocorrência não natural no agente.

As técnicas de ADN recombinante são um método conveniente para preparar anticorpos de tamanho total e outros grandes agentes de ligação específica proteicos da presente invenção, ou seus fragmentos. Uma molécula de ADNc que codifica o anticorpo ou fragmento pode ser introduzida num vector da expressão, o qual, por sua vez, pode ser introduzido numa célula hospedeira para a produção de anticorpo ou fragmento. É compreendido que os ADNc que codificam tais anticorpos podem ser modificados para variar do ADNc "original" (traduzido a partir de ARNm) para proporcionar degenereência de codão ou permitir a utilização preferencial de codões em várias células hospedeiras.

Geralmente, uma molécula de ADN que codifica um anticorpo pode ser obtida utilizando processos aqui descritos nos Exemplos. Nos casos em que seja desejável obter moléculas Fab ou CDR que estão relacionadas com a molécula original de anticorpo, pode-se rastrear uma biblioteca adequada (biblioteca de apresentação de fagos; biblioteca de linfócitos, etc.) utilizando técnicas convencionais para identificar e clonar Fab/CDR relacionados. As sondas utilizadas para tal rastreio podem ser sondas Fab de tamanho total ou truncadas que codificam 67 a porção Fab do anticorpo original, sondas contra uma ou mais CDR da porção Fab do anticorpo original ou outras sondas adequadas. No caso em que são utilizados fragmentos de ADN como sonda, as condições de hibridação típicas são aquelas, tal como apresentadas em Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994]). Após hibridação, a transferência sondada pode ser lavada com uma restringência adequada, dependendo em tais factores como tamanho da sonda, homologia esperada da sonda para o clone, o tipo de biblioteca que ser rastreado e o número de clones a ser rastreado. Os exemplos de rastreio de elevada restringência são 0,1 X SSC e 0,1 percento de SDS a uma temperatura entre 50-65 °C.

Uma variedade de sistemas de expressão vector/hospedeiro pode ser utilizada para conter e expressar as moléculas de polinucleótido que codificam os polipéptidos do agente de ligação específica da invenção. Estes sistemas incluem, mas não estão limitados a, microrganismos, tais como bactérias transformadas com vectores de expressão de ADN recombinante de bacteriófagos, plasmídeos ou cosmídeos; leveduras transformadas com vectores de expressão de levedura; sistemas de células de insecto infectadas com vectores de expressão virais (e. g., baculovírus); sistemas de células vegetais transfectads com vectores de expressão virais (e. g., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico de tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão bacteriana (e. g·, plasmídeo Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais.

As células de mamífero que são úteis em produções de proteína recombinante do agente de ligação específica incluem, mas não estão limitadas a, células VERO, células HeLa, linhas celulares de ovário de hamster Chinês (CHO), células COS (tal como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, 68 PC12, Κ562 e 293, assim como linhas celulares de hibridoma, como aqui descritas. As células de mamífero são preferidas para a preparação daqueles agentes de ligação específica, tais como anticorpos e fragmentos de anticorpo que são, tipicamente, glicosilados e requerem re-enrolamento apropriado para a actividade. As células de mamífero preferidas incluem células CHO, células de hibridoma e célula mielóides.

Alguns protocolos exemplificativos para a expressão recombinante das proteínas do agente de ligação específica são aqui descritos abaixo. A expressão "vector de expressão" refere-se a um plasmídeo, fago, vírus ou vector, para expressar um polipéptido a partir de uma sequência de ADN (ARN). Um vector de expressão pode compreender uma unidade transcripcional compreendendo um conjunto de (1) um elemento ou mais elementos genéticos que têm um papel regulador na expressão génica, por exemplo, promotores ou intensificadores, (2) uma estrutura ou sequência que codifica o agente de ligação que é transcrito em ARNm e traduzido em proteína e (3) sequências apropriadas de iniciação e terminação de transcrição. As unidades estruturais pretendidas para utilização em levedura ou sistemas de expressão eucariótica incluem, de um modo preferido, uma sequência líder que permite a secreção extracelular da proteína traduzida por uma célula hospedeira. Alternativamente, nos casos em que a proteína recombinante do agente de ligação específica é expressa sem uma sequência líder ou de transporte, esta pode incluir um resíduo de metionina amino-terminal. Este resíduo pode ou não ser subsequentemente clivado da proteína recombinante expressa para proporcionar a um produto final do agente de ligação específica. 69

Por exemplo, os agentes de ligação específica podem ser recombinantemente expressos em levedura utilizando um sistema de expressão comercialmente disponível, e. g., o sistema de expressão em Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), seguindo as instruções do fabricante. Este sistema baseia-se também na seguência pre-pro-alfa para dirigir a secreção, mas a transcrição da inserção é dirigida pelo promotor da álcool oxidase (A0X1) após indução por metanol. 0 péptido segregado do agente de ligação específica é purificado a partir do meio de crescimento de levedura através, e. g., dos métodos utilizados para purificar o péptido a partir de sobrenadantes bacterianos e de células de mamífero.

Alternativamente, o ADNc gue codifica o péptido do agente de ligação específica pode ser clonado no vector pVL1393 de expressão de baculovírus (PharMingen, San Diego, CA). Este vector pode ser utilizado de acordo com as instruções do fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda em meio sem proteína sF9 e produzir a proteína recombinante. A proteína do agente de ligação específica pode ser purificada e concentrada a partir do meio utilizando uma coluna de heparina-Sepharose (Pharmacia).

Alternativamente, o péptido pode ser expresso num sistema de insecto. Os sistemas de insecto para a expressão de proteína são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Num tal sistema, o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) pode ser utilizado como um vector para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A sequência codificante do péptido do agente de ligação específica pode ser clonada numa região não essencial do vírus, tal como o gene da poliedrina, e colocado sob controlo do 70 promotor da poliedrina. A inserção bem-sucedida do péptido do agente de ligação especifica tornará o gene da poliedrina inactivo e produzirá vírus recombinante gue carece do revestimento proteico. Os vírus recombinantes podem ser utilizados para infectar células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia, nas guais o péptido é expresso [Smith et al., J Virol 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc Nat Acad Sei (USA) 91: 3224-7 (1994)] .

Noutro exemplo, a seguência de ADN gue codifica o péptido do agente de ligação específica pode ser amplificada por PCR e clonada num vector apropriado, por exemplo, pGEX-3X (Pharmacia). 0 vector pGEX é concebido para produzir uma proteína de fusão compreendendo glutationo-S-transferase (GST), codificada pelo vector, e uma proteína do agente de ligação específica codificada por um fragmento de ADN introduzido no local de clonagem do vector. Os iniciadores para a PCR podem ser produzidos de modo a incluir, por exemplo, um local de clivagem apropriado. No caso em que a unidade de fusão do agente de ligação específica é utilizada unicamente para facilitar a expressão ou é, caso contrário, nao desejável como uma ligação ao péptido de interesse, a proteína de fusão recombinante do agente de ligação específica pode ser depois clivada da porção GST da proteína de fusão. A construção pGEX-3X do péptido do agente de ligação específica é transformada em células de E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla CA) e os transformantes individuais isolados e cultivados. 0 ADN plasmídico de transformantes individuais pode ser purificado e parcialmente sequenciado utilizando um sequenciador automático para confirmar a presença da inserção de ácido nucleico que cofifica o agente de ligação específica desejado na orientação apropriada. 71 A expressão de polinucleótidos que codificam anticorpos anti-Ang-2 e os seus fragmentos, utilizando os sistemas recombinantes acima descritos, podem resultar na produção de anticorpos ou seus fragmentos que devem ser "re-enrolados" (para criar correctamente várias pontes bissulfureto) de modo a serem biologicamente activos. Os processos de re-enrolamento típicos para tais anticorpos são aqui apresentados nos Exemplos e na seguinte secção.

Os agentes de ligação específica preparados em células bacterianas podem ser produzidos como corpos de inclusão insolúveis na bactéria, os quais podem ser purificados como se segue. As células hospedeiras podem ser sacrificadas por centrifugação; lavadas em NaCl a 0,15 M, 10 mM de Tris, pH 8, EDTA a 1 mM; e tratadas com 0,1 mg/mL de lisozima (Sigma, St. Louis, MO) durante 15 minutos à temperatura ambiente. O lisado pode ser clarificado por sonicação e os restos celulares podem ser sedimentados por centrifugação durante 10 minutos a 12000 X g. O sedimento contendo o agente de ligação específica é ressuspenso em 50 mM de Tris, pH 8, e EDTA a 10 mM, colocado sobre glicerol a 50% e centrifugado durante 30 min a 6000 X g. O sedimento pode ser ressuspenso em solução de soro fisiológico tamponado em fosfato (PBS) convencional sem Mg++ e Ca++. 0 agente de ligação específica pode ser ainda purificado por fraccionamento do sedimento ressuspenso num gel desnaturante de poliacrilamida e SDS (Sambrook et al., supra). O gel pode ser embebido em KC1 a 0,4 M para visualizar a proteína, a qual pode ser excisada e electroeluída em tampão de gel sem SDS. Se a proteína de fusão de GST for produzido em bactérias, como uma proteína solúvel, esta pode ser purificada utilizando o módulo de purificação de GST (Pharmacia). 72

Os sistemas hospedeiros de mamífero para a expressão da proteína recombinante são bem conhecidos dos especialistas na técnica. As estirpes de células hospedeiras podem ser escolhidas por uma capacidade particular de processamento da proteína expressa ou de produção de determinadas modificações pós-tradução que serão úteis no proporcionamento da actividade da proteína. Tais modificações do polipéptido incluem, mas não estão limitadas a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Diferentes células hospedeiras, tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, assim como linhas celulares de hibridoma, e semelhantes, têm mecanismos celulares específicos e mecanismos característicos para tais actividades pós-tradução e podem ser escolhidas para assegurar a modificação e processamento correctos da proteína estranha introduzida.

Uma variedade de sistemas de selecção pode ser utilizada para recuperar as células que foram transformadas para a produção de proteína recombinante. Tais sistemas de selecção incluem, mas não estão limitados a, timidina-cinase de HSV, genes da hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase e adenina fosforibosiltransferase, em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Também pode ser utilizada resistência ant i-metabolito como a base de selecção para DHFR que confere resistência ao metotrexato; gpt que confere resistência ao ácido micofenólico; neo que confere resistência ao aminoglicósido G418 e confere resistência ao clorossulfurão; e higro que confere resistência à higromicina. Os genes de selecção adicionais que podem ser úteis incluem trpB, que permite que as células utilizem índole em vez de triptofano, ou hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina. Os marcadores que dão uma indicaηão visual para a identificagão de 73 transformantes incluem anticianinas, β-glucuronidase e o seu substrato, GUS, e luciferase e o seu substrato, luciferina.

Purificação e Re-enrolamento de Agentes de Ligação Especifica

Em alguns casos, os agentes de ligação especifica produzidos utilizando os processos acima descritos podem necessitar de ser "re-enrolados" e oxidados numa estrutura terciária apropriada e produzir ligações bissulfureto, de modo a serem biologicamente activos. 0 re-enrolamento pode ser realizado utilizando uma variedade de processos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, a exposição do agente polipeptídico solubilizado a um pH habitualmente acima de 7 na presença de um agente caotrópico. A selecção do agente caotrópico é semelhante às escolhas utilizadas para a solubilização dos corpos de inclusão, contudo um agente caotrópico é utilizado, tipicamente, numa concentração mais baixa. Um agente caotrópico exemplificativo é a guanidina. Na maioria dos casos, a solução de re-enrolamento/oxidação conterá também um agente redutor mais a sua forma oxidada numa razão especifica para produzir um potencial redox particular que permita a ocorrência de rearranjo de bissulfureto para a formação de pontes de cisteína. Alguns pares redox habitualmente utilizados incluem cisteína/cistamina, glutationo/ditiobisGSH, cloreto cúprico, ditiotreitol DTT/ditiano DTT e 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. Em muitos casos, um co-solvente pode ser utilizado para aumentar a eficiência do re-enrolamento. Os co-solventes habitualmente utilizados incluem glicerol, polietilenoglicol de vários pesos moleculares e arginina. 74

Será desejável purificar as proteínas do agente de ligação específica ou as suas variantes da presente invenção. As técnicas de purificação de proteína são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Estas técnicas envolvem, a um nível, o fraccionamento em bruto de fracções polipeptídicas e não polipeptídicas. Após separação do polipéptido do agente de ligação específica das outras proteínas, o polipéptido de interesse pode ser ainda purificado utilizando técnicas cromatográficas e electroforéticas para atingir uma purificação parcial ou completa (ou purificação até à homogeneidade). Os métodos analíticos particularmente adequados para a preparação de um péptido do agente de ligação específico puro são a cromatografia de permuta iónica, cromatografia de exclusão; electroforese em gel de poliacrilamida; focagem isoeléctrica. Um método particularmente eficiente de purificar péptidos é a cromatografia líquida rápida de proteínas ou mesmo a HPLC.

Determinados aspectos da presente invenção referem-se à purificação e, em formas de realização particulares, à purificação substancial de uma proteína ou péptido do agente de ligação específica codificado. A expressão "proteína ou péptido do agente de ligação específica purificada", como aqui utilizada, pretende referir-se a uma composição, isolável de outros componentes, em que a proteína ou péptido do agente de ligação específica está purificada em qualquer grau relativamente ao seu estado obtenível naturalmente. Uma proteína ou péptido do agente de ligação específica purificada também se refere, assim, a uma proteína ou péptido do agente de ligação específica, livre do ambiente na qual pode ocorrer naturalmente.

Geralmente, "purificada" refere-se a uma composição do agente de ligação específica que seja submetida a fraccionamento para remover vários outros componentes e cuja composição retém 75 substancialmente a sua actividade biológica expressa. No caso em que é utilizada a expressão "substancialmente purificada", esta designação refere-se a uma composição do agente de ligação especifica em que a proteina ou péptido do agente de ligação especifica forma o componente principal da composição, tal como constituindo cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou mais, das proteínas na composição.

Os vários métodos para quantificar o grau de purificação do agente de ligação especifica são conhecidos dos especialistas na técnica face à presente divulgação. Estes incluem, por exemplo, determinar a actividade de ligação especifica de uma fracção activa, ou avaliar a quantidade de polipéptidos do agente de ligação especifica dentro de uma fracção por análise de SDS/PAGE. Um método preferido para avaliar a pureza de uma fracção do agente de ligação especifica é por cálculo da actividade de ligação da fracção, para a comparar com a actividade de ligação do extracto inicial e para assim calcular o grau de purificação, aqui avaliado por um "número de vezes de purificação". As unidades de facto utilizadas para representar a quantidade de actividade de ligação serão, naturalmente, dependentes da técnica de ensaio particularmente escolhida para seguir a purificação e se a proteína ou péptido do agente de ligação específica expressa, apresenta ou não uma actividade de ligação detectável. Várias técnicas adequadas para utilização na purificação da proteína do agente de ligação específica são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Estas incluem, por exemplo, a precipitação com sulfato de amónio, PEG, anticorpos (imunoprecipitação) e semelhantes, ou através de denaturação térmica, seguida por centrifugação; passos de cromatografia, 76 tais como cromatografia de afinidade (e. g., Proteína-A-

Sepharose), permuta iónica, filtração em gel, fase reversa, hidroxiapatite e cromatografia de afinidade; focagem isoeléctrica; electroforese em gel; e combinações destas e outras técnicas. Como é habitualmente conhecido na técnica, pensa-se gue a ordem de realização dos vários passos de purificação pode ser alterada, ou que determinados passos podem ser omitidos, e mesmo assim resulta numa método adequado para a preparação de um agente de ligação especifica substancialmente purificado. Não existe um requisito geral de que o agente de ligação especifica seja sempre proporcionado no seu estado mais purificado. De facto, é contemplado que produtos do agente de ligação especifica menos substancialmente purificados terão utilidade em determinadas formas de realização. A purificação parcial pode ser realizada por utilização de menos passos de purificação em combinação, ou por utilização de diferentes formas do mesmo esquema de purificação geral. Por exemplo, é entendido que uma cromatografia em coluna de permuta iónica realizada utilizando um dispositivo de HPLC resultará habitualmente numa maior número de "vezes" de purificação do que a mesma técnica utilizando um sistema de cromatografia de baixa pressão. Os métodos que apresentam um grau inferior de purificação relativa podem ter vantagens na recuperação total do produto proteico do agente de ligação especifica, ou na manutenção da actividade de ligação de uma proteína expressa do agente de ligação específica. É sabido que a migração de um polipéptido pode variar, por vezes significativamente, com diferentes condições de SDS/PAGE [Capaldi et al., Biochem Biophys\Res Coirun, 76: 425 (1977)]. Deste modo, será entendido que sob condições diferentes de 77 electroforese, os pesos moleculares aparentes dos produtos de expressão do agente de ligação específica, purificados ou parcialmente purificados, podem variar.

Ensaios de Ligação

Os ensaios de ligação imunológica utilizam, tipicamente, um agente de captura para ligar especificamente e imobilizar frequentemente o antigénio alvo analito. 0 agente de captura é uma unidade que se liga especif icamente ao analito. Numa forma de realização da presente invenção, o agente de captura é um anticorpo ou um seu fragmento que se liga especificamente a Ang-2. Estes ensaios de ligação imunológica são bem conhecidos na técnica [ver, Asai, ed., Methods in Cell Biology, Vol. 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., Nova Iorque (1993) ] .

Os ensaios de ligação imunológica utilizam frequentemente um agente marcador que sinaliza a existência do complexo ligado formado pelo agente de captura e o antigénio. 0 agente marcador pode ser uma das moléculas que compreendem o complexo ligado; i. e., pode ser o agente de ligação específica marcado ou um anticorpo anti-agente de ligação específica marcado.

Alternativamente, o agente marcador pode ser uma terceira molécula, habitualmente um outro anticorpo, que se liga ao complexo ligado. 0 agente marcador pode ser, por exemplo, um anticorpo anti-agente de ligação específica que contém um marcador. 0 segundo anticorpo, específico para o complexo ligado, pode carecer de um marcador, mas pode ser ligado por uma quarta molécula específica para a espécie de anticorpos que o segundo anticorpo é um membro. Por exemplo, o segundo anticorpo pode ser modificado com uma unidade detectável, tal como a 78 biotina que pode, depois, ser ligada por uma quarta molécula, tal como uma enzima marcada com estreptavidina. Outras proteínas capazes de se ligarem especificamente a regiões constantes de imunoglobulina, tais como a Proteína A ou Proteína G, podem também ser utilizadas como o agente marcador. Estas proteínas de ligação são constituintes normais das paredes celulares das bactérias estreptocócicas e apresentam uma forte reactividade não imunogénica com regiões constantes de imunoglobulina de uma variedade de espécies [ver, genericamente Akerstrom, J Immunol, 135:2589-2542 (1985); e Chaubert, Mod Pathol, 10:585-591 (1997)].

Ao longo dos ensaios, podem ser requeridos passos de incubação e/ou lavagem após cada combinação de reagentes. Os passos de incubação podem variar desde cerca de 5 segundos até diversas horas, de um modo preferido, desde cerca de 5 minutos até cerca de 24 horas. Contudo, o tempo de incubação dependerá do formato do ensaio, analito, volume de solução, concentrações, e semelhantes. Geralmente, os ensaios serão realizados à temperatura ambiente, embora possam ser realizados ao longo de uma gama de temperaturas. A. Ensaios de Ligação Nao Competitiva:

Os ensaios de ligação imunológica podem ser do tipo não competitivo. Estes ensaios têm uma quantidade de analito capturado que é medida directamente. Por exemplo, num ensaio "sanduíche" preferido, o agente de captura (anticorpo) pode ser ligado directamente a um substrato sólido onde é imobilizado. Estes anticorpos imobilizados capturam depois (ligam-se) ao antigénio presente na amostra de teste. A proteína assim imobilizada é depois ligada a um agente marcador, tal como um 79 segundo anticorpo que tem um marcador. Noutro ensaio "sanduíche" preferido, o segundo anticorpo carece de marcador, mas pode ser ligado por uma anticorpo marcado, específico para anticorpos da espécie de que o segundo anticorpo é derivado. 0 segundo anticorpo pode também ser modificado com uma unidade detectável, tal como biotina, à qual uma terceira molécula marcada se pode ligar especificamente, tal como estreptavidina. [ver, Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Captítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NI (1988)]. B. Ensaios de Ligação Competitiva:

Os ensaios de ligação imunológica podem ser do tipo competitivo. A quantidade de analito presente na amostra é medida indirectamente através da medição da quantidade de um analito adicionado deslocado de um agente de captura, ou fora da competição, através do analito presente na amostra. Num ensaio de ligação competitiva preferido, uma quantidade conhecida de analito, habitualmente marcado, é adicionada à amostra e a amostra é depois colocada em contacto com um anticorpo (o agente de captura). A quantidade de analito marcado ligado ao anticorpo é inversamente proporcional à concentração de analito presente na amostra. (ver, Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Capítulo 14, pp. 579-583, supra).

Noutro ensaio de ligação competitiva preferido, o anticorpo é imobilizado num substrato sólido. A quantidade de proteína ligada ao anticorpo pode ser determinada por medição da quantidade de proteína presente num complexo proteína/anticorpo ou, alternativamente, por medição da quantidade de proteína não complexada restante. A quantidade de proteína pode ser detectada por provisão de uma proteína marcada. (ver, Harlow e Lane, 80

Antibodies, A Laboratory Manual, Capítulo 14, pp. 579-583, supra).

Ainda noutro ensaio de ligação competitiva preferido, é utilizada inibição de hapteno. Aqui, um analito conhecido é imobilizado num substrato sólido. Uma quantidade conhecida de anticorpo é adicionada à amostra e a amostra é colocada em contacto com o analito imobilizado. A quantidade de anticorpo ligada ao analito imobilizado é inversamente proporcional à quantidade de analito presente na amostra. A quantidade de anticorpo imobilizado pode ser detectada por detecção da fracção imobilizada do anticorpo ou da fracção que permanece em solução. A detecção pode ser directa no caso em que o anticorpo está marcado ou indirectamente através da adição subsequente de uma unidade marcada que se liga especificamente ao anticorpo como acima descrito. C. Utilização de Ensaios de Ligaçao Competitiva:

Os ensaios de ligação competitiva podem ser utilizados para determinações de reactividade cruzada, para permitir a um especialista determinar se uma proteína ou complexo enzimático que é reconhecido por um agente de ligação específica da invenção é a proteína desejada e não uma molécula de reacção cruzada ou para determinar se o anticorpo é específico para o antigénio e não se liga a antigénios não relacionados. Nos ensaios deste tipo, o antigénio pode ser imobilizado a uma suporte sólido e uma mistura desconhecida de proteínas é adicionada ao ensaio, a qual vai competir com a ligação dos agentes de ligação específica à proteína imobilizada. A molécula competidora também se liga a um ou mais antigénios não relacionados com o antigénio. A capacidade das proteínas para 81 competir com a ligação dos anticorpos dos agentes de ligação especifica ao antigénio imobilizado é comparada à ligação pela mesma proteína que estava imobilizada ao suporte sólido, para determinar a reactividade cruzada da mistura de proteínas. D. Outros Ensaios de Ligação: A presente invenção também proporciona métodos de transferência de Western para detectar ou quantificar a presença de Ang-2 numa amostra. A técnica compreende habitualmente a separação das proteínas das amostras por electroforese em gel com base no peso molecular e a transferência das proteínas para um suporte sólido adequado, tais como um filtro de nitrocelulose, um filtro de nylon ou um filtro de nylon derivatizado. A amostra é incubada com anticorpos ou os seus fragmentos que se ligam especificamente a Ang-2 e o complexo resultante é detectado. Estes anticorpos podem ser marcados directamente ou, alternativamente, podem ser detectados subsequentemente utilizando anticorpos marcados que se ligam especificamente ao anticorpo.

Os ensaios de ligação para detectar aqueles agentes de ligação específica a Ang-2 que perturbam a ligação de Ang-2 ao seu receptor, são aqui apresentados nos Exemplos.

Ensaios de Diagnóstico

Os anticorpos ou os seus fragmentos, da presente invenção são úteis para o diagnóstico de estados ou doenças caracterizadas por expressão de Ang-2 ou subunidades, ou em 82 ensaios para monitorizar doentes em tratamento com indutores de Ang-2, seus fragmentos, agonistas ou inibidores da actividade de Ang-2. Os ensaios de diagnóstico para Ang-2 incluem métodos que utilizam um agente de ligação especifica e um marcador para detectar Ang-2 em fluidos corporais humanos ou em extractos de células ou tecidos. Os agentes de ligação especifica da presente invenção podem ser utilizados com ou sem modificação. Num ensaio de diagnóstico preferido, os agentes de ligação especifica serão marcados por ligação, e. g., um marcador ou uma molécula repórter. É conhecida uma vasta variedade de marcadores e moléculas repórter, alguns dos quais já foram aqui descritos. Em particular, a presente invenção é útil para o diagnóstico de doença humana. É conhecida na técnica uma variedade de protocolos para medir as proteínas Ang-2 utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para a respectiva proteína. Os exemplos incluem imunoensaio de adsorção ligado à enzima (ELISA) , radioimunoensaio (RIA) e separação de células activadas por fluorescência (FACS). É preferido um imunoensaio com base em monoclonais, de dois locais, utilizando anticorpos monoclonais reactivos a dois epitopos não interferentes em Ang-2, mas pode ser utilizado um ensaio de ligação competitiva. Estes ensaios são descritos, por exemplo, em Maddox et al., J Exp Med, 158:1211 [1983] .

De modo a proporcionar uma base para diagnóstico, são habitualmente estabelecidos valores normais ou padrão para a expressão de Ang-2 humana. Esta determinação pode ser realizada por combinação de fluidos corporais ou extractos celulares de indivíduos normais, de um modo preferido, humanos, com um agente de ligação específica, por exemplo, um anticorpo, para Ang-2, sob condições adequadas para a formação de complexos que são bem 83 conhecidas na técnica. A quantidade de formação de complexo padrão pode ser quantificada por comparação da ligação dos agentes de ligação especifica com quantidades conhecidas da proteína Ang-2, com amostras de controlo e de doença. Depois, os valores padrão obtidos das amostras normais podem ser comparados com valores obtidos de amostras de indivíduos potencialmente afectados com doença. 0 desvio entre os valores padrão e do indivíduo sugere um papel para Ang-2 no estado de doença.

Para aplicações de diagnóstico, em determinadas formas de realização, os agentes de ligação específica serão, tipicamente, marcados com uma unidade detectável. A unidade detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, directa ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a unidade detectável pode ser um radioisótopo, tais como 3H, 14C, 32P, 35S ou 1251, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tais como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, tais como fosfatase alcalina, β-galactosidase ou peroxidase de rábano [Bayer et al., Meth Enz, 184: 138-163, (1990)] .

Doenças A presente invenção proporciona um agente de ligação específica que se liga a Ang-2 e é útil para o tratamento de doenças humanas e estados patológicos. Os agentes que modulam a actividade de ligação a Ang-2, ou outra actividade celular, podem ser utilizados em combinação com outros agentes terapêuticos para aumentar os seus efeitos terapêuticos ou para diminuir potenciais efeitos secundários. 84

Num aspecto, a presente invenção proporciona reagentes e métodos úteis para tratar doenças e estados caracterizados por niveis indesejáveis ou aberrantes da actividade de Ang-2 numa célula. Estas doenças incluem cancros, e outros estados hiperproliferativos, tais como hiperplasia, psoriase, dermatite de contacto, distúrbios imunológicos e infertilidade. A presente invenção também proporciona anticorpos para utilização em métodos de tratamento de cancro num animal, incluindo humanos, compreendendo a administração ao animal de uma guantidade eficaz de um agente de ligação especifica gue iniba ou diminua a actividade de Ang-2. A invenção é ainda dirigida a anticorpos para utilização em métodos de inibição do crescimento de células cancerosas, incluindo processos de proliferação celular, invação e metástases em sistemas biológicos. Os métodos incluem a utilização de um composto da invenção como um inibidor do crescimento de células cancerosas. De um modo preferido, os métodos são utilizados para inibir ou reduzir o crescimento de células cancerosas, invação, metástases ou a incidência tumoral em animais vivos, tal como mamíferos. Os métodos da divulgação são também prontamente adaptáveis para utilização em sistemas de ensaio, e. g., o ensaio do crescimento de células cancerosas e das suas propriedades, assim como a identificação de compostos que afectam o crescimento de células cancerosas.

Os cancros tratáveis por métodos da presente divulgação ocorrem, de um modo preferido, em mamíferos. Os mamíferos incluem, por exemplo, humanos e outros primatas, assim como animais de estimação ou de companhia, tais como cães e gatos, animais de laboratório, tais como ratos, murganhos e coelhos, e animais de criação, tais como cavalos, porcos, carneiros e gado bovino. 85

Os tumores ou neoplasmas incluem crescimentos de células em tecidos, em que a multiplicação das células é descontrolada e progressiva. Alguns desses crescimentos são benignos, mas outros são denominados malignos e podem conduzir à morte do organismo. Os neoplasmas malignos ou cancros são distinguidos de crescimentos benignos por, além de apresentarem proliferação celular agressiva, poderem invadir tecidos circundantes e metastizarem. Além disso, os neoplasmas malignos são caracterizados por apresentarem uma grande perda de diferenciação (grande desdiferenciação) e da sua organização relativamente uns aos outros e aos seus tecidos circundantes. Esta propriedade é também denominada "anaplasia".

Os neoplasmas tratáveis pela presente invenção também incluem tumores sólidos, i. e., carcinomas e sarcomas. Os carcinomas incluem aqueles neoplasmas malignos derivados de células epiteliais que se infiltram (invadem) os tecidos circundantes e originam metástases. Os adenocarcinomas são carcinomas derivados de tecido glandular ou que formam estruturas glandulares reconhecíveis. Uma outra vasta categoria de cancros inclui sarcomas, que são tumores cujas células estão embebidas numa substância fibrilar ou homogénea, tal como tecido conjuntivo embriónico. A invenção permite também o tratamento de cancros dos sistemas mielóide ou linfóide, incluindo leucemias, linfomas e outros cancros que não se apresentam, tipicamente, como uma massa tumoral, mas estão distribuídos em sistemas vasculares ou linforreticulares. 0 tipo de cancro ou células tumorais susceptíveis ao tratamento de acordo com a invenção inclui, por exemplo, tumor produtor de ACTH, leucemia linfocítica aguda, leucemia não linfocítica aguda, cancro do córtex suprarrenal, cancro da bexiga, cancro cerebral, cancro da mama, cancro do cólo do 86 útero, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocitica crónica, cancro colorrectal, linfoma cutâneo de células T, cancro do endométrio, cancro esofágico, sarcoma de Ewing, cancro da vesícula biliar, leucemia das células pilosas, cancro da cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cancro dos rins, cancro do fígado, cancro dos pulmões (célula pequena e não pequena), efusão peritoneal maligno, efusão pleural maligna, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiplo, neuroblastoma, glioma, linfoma não Hodgkin, osteossarcoma, cancro dos ovários, cancro dos ovários (da célula germinal), cancro pancreático, cancro do pénis, cancro da próstata, retinoblastoma, cancro da pele, sarcoma dos tecidos moles, carcinomas das células escamosas, cancro do estômago, cancro dos testículos, cancro da tiróide, neoplasmas trofoblásticos, cancro uterino, cancro vaginal, cancro da vulva e tumor de Wilms. A invenção é aqui particularmente ilustrada em referência ao tratamento de determinados tipos de cancros definidos experimentalmente. Nestes tratamentos ilustrativos, foram utilizados modelos convencionais do estado da técnica, in vitro e in vivo. Estes métodos podem ser utilizados para identificar agentes que se espera serem eficazes em regimes de tratamento in vivo. Contudo, será entendido que o método não está limitado ao tratamento destes tipos de tumor, mas que se estende a qualquer tumor sólido derivado de qualquer sistema de órgãos. Os cancros cuja capacidade de invasão ou metástases está associada com a expressão ou actividade de Ang-2 são especialmente susceptíveis a inibição ou mesmo indução de regressão.

0 método pode também ser praticado por inclusão de um agente de ligação especifica da invenção, tal como um anticorpo, em combinação com outro agente quimioterapêutico anticanceroso, tal como qualquer agente quimioterapêutico convencional. A 87 combinação de um agente de ligação especifica com esses outros agentes pode potenciar o protocolo quimioterapêutico. Numerosos protocolos quimioterapêuticos podem estar presentes na mente do médico assistente como sendo capazes de incorporação no método. Qualquer agente quimioterapêutico pode ser utilizado, incluindo agentes alquilantes, antimetabolitos, hormonas e antagonistas, radioisótopos, assim como produtos naturais. Por exemplo, o composto da invenção pode ser administrado com antibióticos, tais como doxorrubicina e outros análogos de antraciclina, mostardas de azoto, tais como ciclofosfamida, análogos de pirimidina, tais como 5-fluorouracilo, cisplatina, hidroxiureia, taxol e os seus derivados naturais e sintéticos, e semelhantes. Como outro exemplo, no caso de tumores mistos, tal como adenocarcinoma da mama, em que os tumores incluem células dependentes de gonadotrofina e independentes de gonadotrofina, o composto pode ser administrado em conjunto com leuprolida ou goserelina (análogos peptidicos sintéticos de LH-RH). Outros protocolos antineoplásicos incluem a utilização de um composto de tetraciclina com outra modalidade de tratamento, e. g., cirurgia, radiação, etc., também referida aqui como "modalidades antineoplásicas adjuntas". Assim, o método pode ser utilizado com tais regimes convencionais com o benefício de reduzir efeitos secundários e de aumentar a eficácia. A presente invenção proporciona assim composições úteis para o tratamento de uma vasta variedade de cancros, incluindo tumores sólidos e leucemias. Os tipos de cancro que podem ser tratados incluem, mas não estão limitados a: adenocarcinoma da mama, próstata e cólon; todas as formas de carcinoma broncogénico dos pulmões; mielóide; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndrome carcinóide maligna; doença cardíaca carcinóide; carcinoma (e. g., Walker, células basais, basoescamoso, Brown- 88

Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, célula de Merkel, pulmão mucinoso, de célula não pequena, células em grão de aveia, célula papilar, esquirroso, brônquico, broncogénico, escamoso, e células transicionais); distúrbios histiocíticos; leucemia; histiocitose maligna; Doença de Hodgkin; carcinoma de pequenas células do pulmão imunoproliferativo; linfoma não Hodgkin; plasmacitoma; reticuloendoteliose; melanoma; condroblastoma; condroma; condrossarcoma; fibroma; fibrossarcoma; tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; lipossarcoma; mesotelioma; mixoma; mixossarcoma; osteoma; osteossarcoma; cordoma; craniofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miossarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor tofoblástico. Além disso, os seguintes tipos de cancros podem também ser tratados: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclindroma; cistadenocarcinoma; cistadenoma; tumor de células granulosas; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumor de células dos ilhéus; tumor de células de Leydig; papiloma; tumor de células de Sertoli; tumor de células teçais; leiomioma; leiomiossarcoma; mioblastoma; mioma; miossarcoma; rabdomioma; rabdomiossarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma; paraganglioma não cromafim; angioceratoma; hiperplasia angiolinfóide com eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatose; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangiossarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiossarcoma; pinealoma; carcinossarcoma; condrossarcoma; cistossarcoma filode; fibrossarcoma; hemangiossarcoma; leiomiossarcoma; leucossarcoma; lipossarcoma; linfangiossarcoma; miossarcoma; mixossarcoma; carcinoma dos ovários; rabdomiossarcoma; sarcoma; neoplasmas; nerofibromatose; e displasia do cólo do útero. 89

Outro aspecto da presente invenção são os materiais da presente invenção para prevenir e/ou tratar qualquer estado hiperproliferativo da pele, incluindo psoriase e dermatite de contacto, ou de outras doenças hiperproliferativas. Foi demonstrado que doentes com psoriase e dermatite de contacto têm actividade de Anq-2 elevada nestas lesões [Ogoshi et al., J. Inv. Dermatol., 110:818-23 (1998)]. De um modo preferido, os agentes de ligação especifica, específicos para Ang-2, serão utilizados em combinação com outros agentes farmacêuticos para tratar humanos que expressam estes sintomas clínicos. Os agentes de ligação específica podem ser distribuídos utilizando qualquer dos vários veículos através de vias de administração aqui descritas e outras que são bem conhecidas dos especialistas na técnica.

Outros aspectos da presente divulgação incluem o tratamento de várias retinopatias (incluindo retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade) nas quais a angiogénese está envolvida, assim como distúrbios/doenças do aparelho reproductivo feminino, tais como endometriose, fibróides uterinas e outros desses estados associados com a proliferação vascular disfuncional (incluindo crescimento microvascular do endométrio) durante o ciclo reproductivo feminino.

Ainda, outro aspecto da presente divulgação, refere-se ao tratamento de crescimento vascular anómalo, incluindo malformações arteriovenosas cerebrais (AVM), lesão e reparação da mucosa gastrointestinal, ulceração da mucosa gastro-duodenal em doentes com uma história de úlcera péptica, incluindo isquemia resultante de acidente vascular cerebral, um vasto espectro de distúrbios vasculares pulmonares na doença hepática 90 e hipertensão portal em doentes com hipertensão portal não hepática.

Outro aspecto da presente divulgação é a prevenção de cancros, utilizando as composições proporcionados pela presente invenção. Tais reagentes incluirão agentes de ligação especifica contra Ang-2.

Composições Farmacêuticas

As composições farmacêuticas de agentes de ligação específica a Ang-2 estão dentro do âmbito da presente invenção. As composições farmacêuticas compreendendo anticorpos estão descritas em detalhe, por exemplo, na Patente U.S. 6171586, de Lam et ai., concedida em 9 de Janeiro de 2001 . Tais composições compreendem uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de um agente de ligação especifica, tais como um anticorpo, ou um seu fragmento, variante, derivado ou fusão como aqui descrita, em mistura com um agente farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização preferida, as composições farmacêuticas compreendem agentes de ligação especifica antagonistas que modulam, parcialmente ou totalmente, pelo menos uma actividade biológica de Ang-2 em mistura com um agente farmaceuticamente aceitável. Tipicamente, os agentes de ligação especifica estarão suficientemente purificados para administração a um animal. A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, limpidez, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou libertação, adsorçao ou penetração da composição. Os materiais 91 de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, outros ácidos orgânicos); agentes de volume (tais como manitol ou glicina), agentes quelantes [tais como ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA)]; agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); agentes de enchimento; monossacáridos; dissacáridos e outros hidratos de carbono (tais como glucose, manose ou dextrinas); proteínas (tais como albumina, gelatina ou imunoglobulinas séricas); corantes; agentes aromatizantes e diluentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de baixo peso molecular; cntra-iões formadores de sal (tal como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcónio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabenos, propilparabenos, cloro-hexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogénio); solventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcar (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; agentes tensioactivos ou agentes molhantes (tais como pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos, tais como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes de aumento de estabilidade (sacarose ou sorbitol); agentes de aumento de tonicidade (tal como halogenetos de metal alcalino (de um modo preferido, cloreto de sódio ou potássio, manitol, sorbitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). 92 A composição farmacêutica óptima será determinada por um especialista na técnica dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato da distribuição e dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de eliminação in vivo do agente de ligação específica. 0 veículo ou transportador primário numa composição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou transportador adequado pode ser água para injecção, solução de soro fisiológico ou líquido cefalorraquidiano artificial, suplementado possivelmente com outros materiais comuns em composições para administração parentérica. Soro fisiológico tamponado a pH neutro ou soro fisiológico misturado com albumina sérica são veículos exemplificativos adicionais. Outras composições farmacêuticas exemplificativas compreendem tampão Tris de cerca de pH 7,0-8,5, ou tampão de acetato de cerca de pH 4,0-5,5, que podem ainda incluir sorbitol ou um seu substituto adequado. Numa forma de realização da presente invenção, as composições de agente de ligação podem ser preparadas para armazenamento por mistura da composição seleccionada que tem o grau de pureza desejado com agentes de formulação opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) na forma de um bolo liofilizado ou de uma solução aquosa. Além disso, o produto do agente de ligação pode ser formulado como um liofilizado, utilizando excipientes apropriados, tal como sacarose.

As composições farmacêuticas podem ser seleccionadas para distribuição parentérica. Alternativamente, as composições podem ser seleccionadas para inalação ou para distribuição entérica, tais como oralmente, auricularmente, oftalmicamente, rectalmente 93 ou vaginalmente. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro do conhecimento da técnica.

Os componentes da formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis ao local de administração. Por exemplo, os tampões são utilizados para manter a composição a pH fisiológico ou a um pH ligeiramente mais baixo, tipicamente, dentro de uma gama de pH desde cerca de 5 a cerca de 8.

Quando a administração parentérica é contemplada, as composições terapêuticas para utilização nesta invenção podem ser na forma de uma solução aquosa apirógena, parentericamente aceitável, compreendendo o agente de ligação especifica desejado num veiculo farmaceuticamente aceitável. Um veiculo particularmente adequado para injecção parentérica é água destilada estéril em que um agente de ligação é formulado como uma solução isotónica estéril, correctamente preservada. Contudo uma outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tais como microesferas injectáveis, partículas bioerodíveis, compostos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), esferas ou lipossomas, que proporcionam uma libertação controlada ou sustida do produto que pode depois ser distribuído através de uma injecção de depot. 0 ácido hialurónico pode também ser utilizado e isto pode ter o efeito de promover a duração sustida na circulação. Outros meios adequados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos implantáveis de distribuição de fármaco.

Noutro aspecto, as formulações farmacêuticas adequadas para administração parentérica podem ser formuladas em soluções aquosas, de um modo preferido, em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer ou 94 soro fisiológico tamponado fisiologicamente. As suspensões aquosas de injecção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como a carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Adicionalmente, as suspensões dos compostos activos podem ser preparadas como suspensões oleosas de injecção apropriadas. Os veiculos ou solventes lipofílicos adequados incluem óleos gordos, tal como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, tais como oleato de etilo, triglicéridos ou lipossomas. Os polímeros amino policatiónicos não lipidicos podem também ser utilizados para distribuição. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizadores ou agentes adequados para aumentar a solubilidade dos compostos e permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

Noutra forma de realização, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, um agente de ligação pode ser formulado como um pó seco para inalação. As soluções de inalação de moléculas de ácidos nucleicos ou polipéptidos podem também ser formuladas com um propulsor para distribuição por aerossol. Ainda noutra forma de realização, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar é ainda descrita no Pedido PCT N° PCT/US94/001875, o qual descreve a distribuição pulmonar de proteinas quimicamente modificadas.

Está também contemplado que determinadas formulações podem ser administradas oralmente. Numa forma de realização da presente invenção, as moléculas de agente de ligação que são administradas desta forma podem ser formuladas com ou sem aqueles veiculos utilizados habitualmente na preparação de formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser concebida para libertar a porção activa da formulação no tracto gastrointestinal quando a biodisponibilidade for maximizada e a degradação pré-sistémica 95 for minimizada. Podem ser incluídos agentes adicionais para facilitar a absorção da molécula de agente de ligação. Podem também ser utilizados diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes.

As composições farmacêuticas para administração oral podem também ser formuladas utilizando veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica, em dosagens adequadas para administração oral. Tais veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões, e semelhantes, para ingestão pelo doente.

As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas através de combinação de compostos activos com excipientes sólidos e o processamento da mistura resultante de grânulos (opcionalmente, após moagem) para obter comprimidos ou núcleos de drageia. Podem ser adicionados auxiliares adequados, se desejado. Os excipientes adequados incluem agentes de enchimento proteicos ou de hidratos de carbono, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol e sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata ou outras plantas; celulose, tais como metilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose ou carboximetilcelulose de sódio; gomas, incluindo goma-arábica e tragacanto; e proteínas, tais como gelatina e colagénio. Se desejado, podem ser adicionados agentes de desintegração ou solubilização, tais como polivinilpirrolidona reticulada, ágar, e ácido algínico ou um seu sal, tal como alginato de sódio. 96

Os núcleos de drageia podem ser utilizados em conjunto com revestimentos adequados, tal como soluções concentradas de açúcar, que podem também conter goma-arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Os corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimido ou drageia para identificação do produto ou para caracterizar a quantidade do composto activo, i. e., dosagem.

As preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente também incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, assim como cápsulas moles seladas, feitas de gelatina e um revestimento, tais como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter ingredientes activos misturados com enchimentos ou aglutinantes, tais como lactose ou amidos, lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, líquido ou polietilenoglicol líquido com ou sem estabilizadores.

Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de agente de ligação numa mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para o fabrico de comprimidos. Ao dissolver os comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Os excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. 97

Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes aos especialistas na técnica, incluindo formulações que envolvem moléculas do agente de ligação em formulações de distribuição sustida ou controlada. As técnicas para formular uma variedade de outros meios de distribuição sustida ou controlada, tais como veículos lipossomais, micropartículas bioerodíveis ou esferas porosas e injecções de depot, são também conhecidos pelos especialistas na técnica. Ver por exemplo, o documento PCT/US93/00829 que descreve a libertação controlada de micropartículas poliméricas porosas para a distribuição de composições farmacêuticas. Exemplos adicionais de preparações de libertação sustida incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, e. g., películas ou microcápsulas. As matrizes de libertação sustida podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidas (documentos U.S. 3773919, EP 58481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato [Sidman et al., Bíopolymers, 22:547-556 (1983)], poli(2-hidroxietil-metacrilato) [Langer et al., J Biomed Mater Res, 15:167-277, (1981)] e [Langer et al., Chem Tech, 12:98-105(1982)], etilenovinilacetato (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133988). As composições de libertação sustida incluem também lipossomas, os quais podem ser preparados através de qualquer de vários métodos conhecidos na técnica. Ver, e. g., Eppstein et al., Proc Acad natl Sei (USA), 82:3688-3692 (1985); documentos EP 36676; EP 88046; EP 143949. A composição farmacêutica a ser utilizada para administração in vivo deve ser, tipicamente, estéril. Isto pode ser realizado por filtração através de membranas de filtração estéril. Nos casos em que a composição está liofilizada, pode ser realizada esterilização utilizando este método antes ou depois da liofilização e reconstitução. A composição para administração parentérica pode ser armazenada na forma liofilizada ou em 98 solução. Além disso, as composições parentéricas são habitualmente colocadas num recipiente que tem uma entrada de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou um frasquinho que tem uma tampa perfurável por uma aqulha hipodérmica de injecção.

Uma vez formulada a composição farmacêutica, esta pode ser armazenada em frasquinhos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas numa forma pronta a utilizar ou numa forma (e. g., liofilizada) que requer reconstitução antes da administração.

Numa forma de realização especifica, a presente invenção é dirigida a kits para produzir uma unidade de administração de dose unitária. Os kits podem, cada um, conter um primeiro recipiente que tem uma proteína seca e um segundo recipiente que tem uma formulação aquosa. Estão também incluídos no âmbito desta invenção, kits contendo seringas pré-cheias de câmara única ou multicâmara (e. g., seringas líquidas e lyosyringes) .

Uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica a ser utilizada terapeuticamente depende, por exemplo, do contexto terapêutico e dos objectivos. Um especialista na técnica entenderá que os níveis de dosagem apropriados para o tratamento, irão assim variar, dependendo em parte, da molécula a ser distribuída, da indicação para a qual a molécula de agente de ligação está a ser utilizada, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho de órgão) e do estado (idade e saúde geral) do doente. Desta forma, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico óptimo. Uma dosagem típica pode variar desde cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 99 100 mg/kg ou mais, dependendo dos factores acima mencionados. Noutras formas de realização, a dosagem pode variar desde 0,1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg; ou 1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg; ou 5 mg/kg até cerca de 100 mg/kg.

Para gualguer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, tais como murganhos, ratos, coelhos, cães ou porcos. Um modelo animal pode também ser utilizado para determinar a gama de concentração e a via de administração apropriadas. Tal informação pode ser depois utilizada para determinar doses e via de administração úteis em humanos. A dosagem exacta será determinada com base em factores relacionados com o indivíduo gue reguer o tratamento. A dosagem e a administração são ajustadas para proporcionar níveis suficientes do composto activo ou para manter o efeito desejado. Os factores que podem ser tomados em consideração incluem a gravidade do estado de doença, a saúde geral do indivíduo, a idade, peso e género do indivíduo, tempo e frequência de administração, combinação ou combinações de fármacos, sensibilidades de reacção e resposta à terapia. As composições farmacêuticas de acção longa podem ser administradas cada 3 a 4 dias, todas as semanas ou de duas em duas semanas, dependendo da semi-vida e da taxa de eliminação da formulação particular.

A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da molécula de agente de ligação na formulação utilizada. Tipicamente, uma composição é administrado até ser alcançada uma dosagem que consiga o efeito desejado. A composição pode assim ser administrada como uma dose única ou como doses múltiplas (com concentrações/dosagens iguais ou diferentes) ao longo do tempo ou como uma infusão contínua. O 100 refinamento adicional da dosagem apropriada é feito rotineiramente. As dosagens apropriadas podem ser verificadas através da utilização de dados da resposta à dose apropriados. A via da administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, e. g., oralmente, através de injecção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intraportal, intralesional, por meio intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérico, tópico, sublingual, uretral, vaginal ou rectal, por sistemas de libertação sustida ou por dispositivos de implantação. Sempre que desejado, as composições podem ser administradas por injecção de bolus ou continuamente por infusão ou por dispositivo de implantação.

Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode ser administrada localmente através de implantação de uma membrana, esponja ou de um outro material apropriado, sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Nos casos em que é utilizado um dispositivo de implantação, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado e a distribuição da molécula desejada pode ser através de difusão, bolus de libertação temporizada ou administração continua.

Em alguns casos, pode ser desejável utilizar composições farmacêuticas num modo ex vivo. Em tais casos, as células, tecidos ou órgãos que foram removidos a partir do doente são expostos às composições farmacêuticas, após o que as células, tecidos e/ou órgãos são implantados, subsequentemente, de volta ao doente. 101

Noutros casos, um agente de ligação que é um polipéptido pode ser distribuído por implantação de determinadas células que foram geneticamente manipuladas, utilizando métodos tais como aqueles aqui descritos, para expressar e segregar o polipéptido. Tais células podem ser células animais ou humanas, e podem ser autólogas, heterólogas ou xenogénicas. Opcionalmente, as células podem ser imortalizadas. De modo a diminuir a possibilidade de uma resposta imunológica, as células pode ser encapsuladas para evitar a infiltração de tecidos circundantes. Os materiais de encapsulação são, tipicamente, membranas ou invólucros poliméricos semi-permeáveis biocompatíveis que permitem a libertação do(s) produto(s) proteicos mas previnem a destruição das células pelo sistema imune do doente ou por outros factores prejudiciais dos tecidos circundantes.

Terapia de Combinação

Os agentes de ligação específica da invenção podem ser utilizados em combinação com outros agentes terapêuticos no tratamento de patologias de Ang-2. Estes outros agentes terapêuticos incluem, por exemplo, tratamento por radiação, agentes quimioterapêuticos, assim como outros factores de crescimento. 0 tratamento de quimioterapia pode utilizar agentes antineoplásicos incluindo, por exemplo, agentes alquilantes incluindo: mostardas de azoto, tais como mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan e clorambucilo; nitrosoureias, tais como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (metil-CCNU); etileniminas/metilmelamina, tais como trietilenomelamina (TEM), trietileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); sulfonatos de alquilo, tal 102 como busulfan; triazinas, tal como dacarbazina (DTIC); antimetabolitos incluindo análogos de ácido fólico, tais como metotrexato e trimetrexato, análogos de pirimidina, tais como 5- fluorouracilo, fluorodesoxiuridina, gencitabina, arabinósido de citosina (AraC, citarabina), 5-azacitidina, 2,2'-difluorodesoxicitidina, análogos de purina, tais como 6- mercaptopurina, β-tioguanina, azatioprina, 2'-desoxicoformicina (pentostatina), eritro-hidroxinoniladenina (EHNA), fosfato de fludarabina e 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, 2-CdA); produtos naturais incluindo fármacos antimitóticos, tais como paclitaxel, alcaloides de vinca incluindo vinblastina (VLB) , vincristina e vinorelbina, taxotere, estramustina e fosfato de estramustina; epipodofilotoxinas, tais como etopósido e tenipósido; antibióticos, tais como actimomicina D, daunomicina (rubidomicina), doxorrubicina, mitoxantrona, idarrubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C e actinomicina; enzimas, tal como L-asparaginase; modificadores da resposta biológica, tais como interferão-alfa, IL-2, G-CSF e GM-CSF; agentes variados incluindo complexos de coordenação de platina, tais como cisplatina e carboplatina, antracenodionas, tal como mitoxantrona, ureia substituída, tal como hidroxiureia, derivados de metil-hidrazina incluindo N-metil-hidrazina (MIH) e procarbazina, supressores adrenocorticóides, tais como mitotano (ο,ρ'-DDD) e aminoglutetimida; hormonas e antagonistas incluindo antagonistas adrenocorticosteróides, tais como prednisona e equivalentes, dexametasona e aminoglutetimida; progestina, tais como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona e acetato de megestrol; estrogénio, tais como equivalentes de dietilestilbestrol e etinilestradiol; antiestrogénio, tal como tamoxifeno; androgénios incluindo propionato de testosterona e fluoximesterona/equivalentes; antiandrogénios, tais como flutamida, análogos da hormona 103 libertadora de gonadotrofina e leuprolida; e antiandrogénios não esteróides, tal como flutamida. A terapia de combinação com factores de crescimento pode incluir citocinas, linfocinas, factores de crescimento ou outros factores hematopoiéticos, tais como M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFO, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietina, factor da célula estaminal e eritropoietina. Outros composições podem incluir angiopoietinas conhecidas, por exemplo, Ang-1, -2, -4, -Y e/ou o polipéptido humano de tipo Ang, e/ou factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Os factores de crescimento incluem angiogenina, proteína-1 morfogénica do osso, proteína-2 morfogénica do osso, proteína-3 morfogénica do osso, proteína-4 morfogénica do osso, proteína-5 morfogénica do osso, proteina-β morfogénica do osso, proteína-7 morfogénica do osso, proteína-8 morfogénica do osso, proteína-9 morfogénica do osso, proteína-10 morfogénica do osso, proteína-11 morfogénica do osso, proteína-12 morfogénica do osso, proteína-13 morfogénica do osso, proteína-14 morfogénica do osso, proteína-15 morfogénica do osso, receptor-IA de proteina morfogénica do osso, receptor-IB de proteina morfogénica do osso, factor neurotrófico derivado do cérebro, factor neutrófico ciliar, receptor do factor neutrófico ciliar, factor-1 quimiotáctico de neutrófilos induzido por citocina, factor-2 quimiotáctico de neutrófilos induzido por citocina, factor de crescimento da célula endotelial, endotelina-1, factor de crescimento epidérmico, atractante de neutrófilos derivado de epitélio, factor-4 de crescimento do fibroblasto, factor-5 de crescimento do fibroblasto, factor-6 de crescimento do fibroblasto, factor-7 de crescimento do fibroblasto, factor-8 de crescimento do fibroblasto, factor-8b de crescimento do fibroblasto, factor-8c 104 de crescimento do fibroblasto, factor-9 de crescimento do fibroblasto, factor-10 de crescimento do fibroblasto, factor acídico de crescimento do fibroblasto, factor básico de crescimento do fibroblasto, receptor-1 de factor neutrófico derivado de linha celular glial, receptor-2 de factor neutrófico derivado de linha celular glial, proteína relacionada com o crescimento, proteína-2 relacionada com o crescimento, proteína-3 relacionada com o crescimento, factor de crescimento epidérmico de ligação à heparina, factor de crescimento do hepatócito, receptor do factor de crescimento do hepatócito, factor I de crescimento do tipo insulina, receptor do factor de crescimento do tipo insulina, factor II de crescimento do tipo insulina, proteína de ligação ao factor de crescimento do tipo insulina, factor de crescimento do queratinócito, factor inibidor da leucemia, receptor-1 do factor inibidor da leucemia, receptor do factor de crescimento do nervo, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor de crescimento da placenta, factor-2 de crescimento da placenta, factor de crescimento da célula endotelial derivado de plaquetas, factor de crescimento derivado de plaquetas, cadeia A do factor de crescimento derivado de plaquetas, factor AA de crescimento derivado de plaquetas, factor AB de crescimento derivado de plaquetas, cadeia B do factor de crescimento derivado de plaquetas, factor BB de crescimento derivado de plaquetas, receptor-1 do factor de crescimento derivado de plaquetas, receptor-2 do factor de crescimento derivado de plaquetas, factor estimulante de crescimento da célula pre-B, factor da célula estaminal, receptor do factor da célula estaminal, factor-1 de crescimento transformante, factor-2 de crescimento transformante, factor-3 de crescimento transformante, factor-1,2 de crescimento transformante, factor-4 de crescimento transformante, factor-5 de crescimento transformante, factor-1 de crescimento transformante do lactente, proteína I de ligação do factor de 105 crescimento transformante, proteína II de ligação do factor de crescimento transformante, proteína III de ligação do factor de crescimento transformante, receptor de tipo I do factor de necrose tumoral, receptor de tipo II do factor de necrose tumoral, receptor do activador de plasminogénio de tipo urocinase, factor de crescimento endotelial vascular e proteínas quiméricas e seus fragmentos biologicamente ou imunologicamente activos.

Agentes Imunoterapêuticos

Os agentes imunoterapêuticos baseiam-se habitualmente na utilização de células e moléculas efectoras imunes para direccionar e destruir células cancerosas. Os efectores imunes podem ser, por exemplo, um anticorpo da presente invenção que reconheça algum marcador na superfície de uma célula alvo. 0 anticorpo isoladamente pode servir como um efector de terapia ou pode recrutar outras células para efectuar, de facto, a morte celular. 0 anticorpo pode também ser conjugado a um fármaco ou toxina (agente quimioterapêutico, radionúclido, cadeia de ricina A, toxina da cólera, toxina de pertussis, etc.) e pode assim servir meramente como um agente de direccionamento.

De acordo com a presente invenção, as formas mutantes de Ang-2 podem ser visadas por immunoterapia com anticorpos ou conjugados de anticorpos da invenção. Está particularmente contemplado que as composições de anticorpo da invenção podem ser utilizadas numa abordagem de terapia combinada em conjunto com terapia direccionada de Ang-2. 106 A imunoterapia passiva provou ser particularmente eficaz contra uma variedade de cancros. Ver, por exemplo, o documento WO 98/39027.

Os seguintes exemplos são pretendidos apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados, de forma alguma, como limitativos do âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Expressão de Ang-2 em Tecido Normal e Patológico A expressão de Ang-2 foi examinada em tecido normal e patológico utilizando hibridação in situ. Fragmentos de sequências de Ang-2 humanas (número de acesso Genbank: AF004327, nucleótidos 1274-1726) e de murino (número de acesso Genbank: AF004326, nucleótidos 1135-1588) foram amplificados por transcriptase reversa-PCR a partir de ADNc de pulmão fetal humano ou murino, clonados no plasmídeo pGEM-T e verificados por sequenciação. Sondas de ARN antisentido marcadas com 33P foram transcritas a partir de moldes plasmídicos linearizados utilizando 33P-UTP e ARN polimerase. Os blocos de tecidos fixos em formaldeido, embebidos em parafina, foram seccionados a 5 pm e recolhidos em lâminas carregadas. Antes da hibridação in situ, os tecidos foram permeabilizados com HC1 0,2 M, seguida por digestão com proteinase K e acetilação com trietanolamina e anidrido acético. As secções foram hibridadas com a sonda radiomarcada, de um dia para o outro, a 55 °C, depois submetidas a digestão com RNase e uma lavagem de elevada restringência em cerca de 0,1X SSC a 55 °C. As lâminas foram mergulhadas em emulsão Kodak NTB2, expostas a 4 °C durante 2-3 semanas, 107 reveladas e contra-coradas. As secções foram examinadas com campo escuro e iluminação convencional para permitir avaliação simultânea da morfologia do tecido e do sinal de hibridação.

Os resultados indicaram que em humano pós-natal normal, a expressão de Ang-2 está restrita aos poucos tecidos contendo vasculatura angiogénica, tais como ovário, placenta e útero. Não foi detectável qualquer expressão de Ang-2 no coração, cérebro, rim, fígado, pulmão, pâncreas, baço, músculo, amígdalas, timo, apêndice, nódulos linfáticos, vesícula biliar, próstata ou testículos de humano adulto normal. Em murganhos com cinco semanas de idade (mas não em macacos ou humanos adultos), os rins apresentaram expressão proeminente de Ang-2 nos vasa recta. Para determinar se esta expressão foi um vestígio do desenvolvimento embriónico, esta experiência foi repetida em rins derivados de murganhos com até um ano de idade, utilizando a sonda Ang-2 de murino e as condições acima descritas. Foi observado que a expressão de Ang-2 diminui durante o desenvolvimento pós-natal, mas era ainda evidente nos rins de murganhos de um ano de idade. A expressão de Ang-2 foi também virtualmente detectada em todos os tipos de tumor testados, incluindo, tumores humanos primários, tais como carcinoma do cólon (5 casos), carcinoma da mama (10 casos), carcinoma do pulmão (8 casos), glioblastoma (1 caso), tumores humanos metastáticos, tais como carcinoma da mama (2 casos), carcinoma do pulmão (2 casos) e carcinoma dos ovários (2 casos) que metastizaram para o cérebro, e modelos de tumor de roedor, tais como C6 (glioma de rato) , HT29 (carcinoma de cólon humano), Colo-205 (carcinoma de cólon humano), HCT116 (carcinoma de cólon humano), A431 (carcinoma epidermóide humano), A673 (rabdomiossarcoma humano), HT1080 (fibrossarcoma humano), PC-3 (carcinoma de próstata humana), B16F10 (melanoma 108 de murino), MethA (sarcoma de murino) e metástases de carcinoma do pulmão de Lewis. Adicionalmente, a expressão de Ang-2 foi detectada em novos vasos que crescem num bujão de Matrigel em resposta a VEGF e num modelo de hipoxia de murganho de retinopatia da prematuridade. EXEMPLO 2

Produção de Proteína mAng-2 Recombinante e de anti-Soro Policlonal de Coelho anti-Ang-2 0 ADNc de Ang-2 de murino, marcado com His, de tamanho total foi obtido por PCR (Clontech Advantage PCR Kit, Cat. N° K1905-01) a partir de uma biblioteca de ADNc de embrião de murino de 15 dias (Marathon-Ready-ADNc, Cat. N° 7459-1, Clonetech, Inc.) utilizando iniciadores de PCR para Ang-2 humano de tamanho total. 0 produto de PCR foi ligado a um vector de expressão do promotor CMV e o plasmideo resultante foi transfectado em células de fibrossarcoma humano HT1080 (obtido a partir da ATCC) utilizando FuGENEô Transfection Reagent (Roche, Cat. N° 1814443). Os clones estáveis foram isolados por selecção de G418. ELISA marcado com anti-His e transferência de Western foram utilizados para rastrear para clones que expressam mAng-2-his. 0 polipéptido mAng-2 recombinante foi purificado a partir de meios condicionados (C.M.) destas células. 0 C.M. contendo mAng-2-His foi purificado por um protocolo de cromatografia em dois passos. Resumidamente, os meios condicionados foram titulados para pH 8,9 por adição de tampão Tris a pH 9,5 até cerca de 20 mM de concentração do final. Adicionalmente, o 109 detergente CHAPS foi adicionado até cerca de 5 mM de concentração final. 0 C.M. foi depois aplicado directamente numa coluna Q-sepharose ff de permuta aniónica (Pharmacia). A coluna foi depois lavada com cerca de 10 mM de Tris a pH 8,0 contendo cerca de 50 mM de NaCl. O mAng-2-His recombinante foi eluido num único passo utilizando 10 mM de Tris a pH 8,0 contendo cerca de 350 mM de NaCl e cerca de 5 mM de CHAPS. O eluato da coluna Q-sepharose foi ajustado até cerca de 4 mM de imidazole e aplicado numa coluna de afinidade de metal imobilizado (Ni-NTA superflow [Qiagen]). A proteína ligada foi eluída com PBS contendo cerca de 5 mM de CHAPS e cerca de 100 mM de imidazole. O eluato foi depois concentrado até, aproximadamente, 1,0 mg/mL, seguido por diálise contra PBS. A pureza de mAng-2-His foi maior do que 90 porcento, como medida por coloração de Coomassie de SDS-PAGE.

Os coelhos foram imunizados com cerca de 0,2 mg de mAng-2/injecção numa tentativa para produzir anticorpos. Os coelhos foram injectados com cerca de 1 mL de Hunter's TiterMax® (Sigma) e mAng-2 numa razao 1:1. Quatro semanas mais tarde, cada coelho recebeu uma injecção de repetição ou reforço; duas semanas após esta, receberam o seu reforço seguinte e na semana sete, os soros foram recolhidos e avaliados quanto ao título contra mAng-2. Se o título do soro era elevado, recolhas de 50 mL eram recolhidas numa base semanal durante seis semanas consecutivas. Contudo, se o título do soro era baixo, era dado aos coelhos um reforço adicional, e recolhas de 50 mL eram recolhidas numa base semanal durante seis semanas consecutivas, começando na semana 9. Após seis recolhas consecutivas, os coelhos foram deixados a descansar durante seis semanas. Se mais soros fossem requeridos, os coelhos eram novamente reforçados um mês após a última recolha. 110

Utilizando ELISA de neutralização (descrito infra), foi observado que anti-soros policlonais de coelho anti-mAng-2, de dois coelhos, 5254 e 5255, neutralizavam a interacção mAng-2:Tie2. EXEMPLO 3

Ensaios Moleculares Para Avaliar os Anticorpos Anq-2

Foram desenvolvidos ensaios moleculares (ELISA de afinidade, ELISA de neutralização e BIAcore) para avaliar a ligação directa de anticorpos a Ang-2 e a membros da família relacionada, e o efeito dos anticorpos na interacção Ang-2:Tie2. Estes ensaios in vitro e baseados em células são descritos como se segue. A. ELISA de Afinidade

Para o rastreio inicial de anticorpos anti-Ang-2 candidatos, foram utilizados polipéptidos purificados de Ang-2 humano (R and D systems, Inc; número de catálogo 623-AN; Ang-2 é proporcionado como uma mistura de 2 versões truncadas) ou Ang-2 de murino (preparado como acima descrito) . Para ensaios de ligação de confirmação, o Ang-2 humano foi obtido a partir de meios condicionados de células 293T humanas transfectadas com ADN Ang-2 humano de tamanho total e cultivado em DMEM sem soro contendo cerca de 50 microgramas por mL de albumina de soro bovino (BSA).

Utilizando placas de microtitulação, foram adicionados, aproximadamente, 100 microlitros por poço de Ang-2 a cada poço e 111 as placas foram incubadas cerca de 2 horas, após as quais, as placas foram lavadas com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) contendo cerca de 0,1 porcento de Tween-20 quatro vezes. Os poços foram depois bloqueados utilizando cerca de 250 microlitros por poço de cerca de 5 porcento de BSA em PBS e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante cerca de 2 horas. Após incubação, o excesso de solução de bloqueamento foi rejeitado e foram adicionados cerca de 100 microlitros de anticorpo anti-Ang-2 candidato a cada poço num série de diluição que começa a uma concentração de cerca de 40 nanomolar e depois diluição em série de 4 vezes em PBS contendo cerca de 1 porcento de BSA. As placas foram depois incubadas, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Após incubação, as placas foram lavadas com PBS contendo cerca de 0,1 porcento de Tween-20. A lavagem foi repetida mais quatro vezes, após o que foram adicionados cerca de 100 microlitros por poço de IgG(Fc)-HRP anti-humana de cabra (Pierce Chemical Co., catálogo N° 31416) previamente diluída a 1:5000 em PBS contendo 1 porcento de BSA (albumina de soro bovino). As placas foram incubadas, aproximadamente, 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram depois lavadas cinco vezes em PBS contendo cerca de 0,1 porcento de Tween-20, após o que foram adicionados cerca de 100 microlitros por poço de TMB (3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina, Liquid Substrate System; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, número de catálogo T8665) e as placas foram incubadas cerca de 5-15 minutos até a cor azul ser revelada. A absorvência foi depois lida num espectrofotómetro a cerca de 370 nm. 112 Β. ELISA de Neutralizaçao

Foram preparadas placas de microtitulação, às quais o polipéptido Ang-2 humano foi ligado como descrito para ELISA de afinidade. Os anticorpos anti-Ang-2 candidatos foram preparados em diluições em série como descrito para ELISA de afinidade acima, numa solução de PBS contendo cerca de 1 porcento de BSA e cerca de 1 nM de Tie2 (proporcionada como uma molécula Tie2-Fc, em que a porção Tie2 contém apenas a porção extracelular solúvel da molécula; R and D Systems, número de catálogo 313-TI). Após serem adicionados cerca de 100 microlitros da solução de anticorpo/Tie2 a cada poço, as placas foram incubadas, de um dia para o outro, à temperatura ambiente e depois lavadas cinco vezes em PBS contendo cerca de 0,1 porcento de Tween-20. Após lavagem, foram adicionados cerca de 100 microlitros por poço de anticorpo anti-Tie2 (Pharmingen Inc., catálogo N° 557039) para uma concentração final de cerca de 1 micrograma por mL e as placas foram incubadas cerca de 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados cerca de 100 microlitros por poço de anti-murganho-IgG-HRP de cabra (Pierce Chemical CO., catálogo N° 31432) numa diluição de 1:10000 em PBS contendo cerca de 1 porcento de BSA. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante cerca de 1 hora, após a qual foram lavadas cinco vezes com PBS contendo cerca de 0,1 porcento de Tween-20. Foram depois adicionados cerca de 100 microlitros por poço de substrato TMB (acima descrito) e a cor foi deixada a revelar. A absorvência foi depois lida num espectrofotómetro a 370 nm. C. BIAcore de Afinidade

Uma análise de afinidade de cada anticorpo Ang-2 candidato, foi realizada num BIAcore® 2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) 113 com PBS e 0, 005 porcento de tensioactivo P20 (BIAcore, Inc.) como tampão de funcionamento. A Proteína G recombinante (Repligen, Needham, MA) foi imobilizada num Chip sensor CM5 de grau de investigação (Biacore, Inc.) através de grupos de amina primária utilizando o Amine Coupling Kit (Biacore, Inc.), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante.

Os ensaios de ligação foram realizados através primeiro da ligação de cerca de 100 Ru de cada anticorpo anti-Ang-2 candidato à Proteína G imobilizada, após o que várias concentrações (0 - 100 nM) de huAng-2 ou mAng-2 foram depois injectadas sobre a superfície do anticorpo ligado, a um caudal de cerca de 50 uL/min durante cerca de 3 minutos. Os parâmetros da cinética de ligação do anticorpo, incluindo ka (constante de velocidade de associação), kd (constante de velocidade de dissociação) e KD (constante de equilíbrio de dissociação), foram determinados utilizando o programa de computador BIA Evaluation 3.1 (BIAcore, Inc.). Constantes de equilíbrio de dissociação mais baixas indicaram uma maior afinidade do anticorpo para Ang-2. EXEMPLO 4

Produção de Anticorpos Anq-2 Totalmente Humanos Por Apresentação de Fagos

Foram produzidos anticorpos Ang-2 totalmente humanos por rastreio de uma biblioteca Fab de apresentação de fagos da Target Quest (Target Quest, Inc.) contra um polipéptido Ang-2 humano (R and D Systems Inc., catálogo 623-AN), de acordo com o seguinte protocolo. 114

Ang-2 humano foi imobilizado na superfície de esferas magnéticas de poliestireno por dois métodos: (1) revestimento directo de Ang-2 a 50 ug/mL a 4 °C, de um dia para o outro; e (2) captura indirecta de Ang-2 por anticorpo anti-Ang-2 de cabra a 50 ug/mL a 4 °C, de um dia para o outro. A superfície da esfera foi bloqueada com 2% de leite em PBS (MPBS). A biblioteca de fagos Fab humano foi pré-seleccionada para remover clones de fagos reactivos a esferas magnéticas sem revestimento ou ao anticorpo anti-Ang-2 de cabra. As esferas magnéticas revestidas com Ang-2 foram depois incubadas com fagos da biblioteca à temperatura ambiente durante 1,5 hora. Após o passo de ligação de fagos, a superfície foi lavada 6 vezes com MPBS contendo cerca de 0,1 porcento de Tween 20, seguida por lavagem 6 vezes com PBS contendo cerca de 0,1 porcento de Tween 20, seguida 2 vezes com PBS. Os fagos ligados foram eluídos primeiro com cerca de 100 ug/mL de Tie2-Fc humano (R and D Systems, Minneapolis, MN) e depois com cerca de 100 mM de trietanolamina. Os fagos eluídos foram infectados em células E. coli TG1, amplificados e recuperados para a ronda seguinte de selecção. A pressão de selecção foi aumentada nas rondas sucessivas através de incorporação de lavagens mais restringentes e redução do número de fagos de entrada. Após 3 rondas de selecção, foram identificados 18 clones Fab de ligação a Ang-2 únicos, todos os quais virtualmente reconheceram Ang-2 humano, Ang-2 de murganho e Ang-2 de rato, como medido utilizando o ensaio de ELISA de afinidade acima descrito., aproximadamente, dez porcento destes fagos também se ligam a Ang-1 humano. Estes clones foram convertidos em anticorpos IgGl como descrito abaixo.

Para obter um fago único adicional, uma segunda ronda de seleção foi conduzida utilizando a mesma biblioteca, mas um protocolo ligeiramente diferente. Neste protocolo, Ang-2 humano foi plaqueado em tampão NaHCCh a pH 9,6 em imunotubos Nunc 115 maxisorp a cerca de 4 °C, de um dia para o outro. Ang-2 foi plaqueado a cerca de 1,5, 0,74 e 0,3 ug/mL para as rondas 1, 2, e 3 de rastreio, respectivamente. A superfície do imunotubo foi bloqueada utilizando cerca de 2 porcento de leite em PBS (MPBS), antes de ser incubada com cerca de 2 biliões de partículas fágicas (cerca de 50 cópias de cada fago único na biblioteca) a partir da mesma biblioteca de apresentação de fagos referida acima (Target Quest) , em cerca de 4 mL de 2% de MPBS. Após o passo de incubação dos fagos, a superfície foi lavada 20 vezes com PBS mais cerca de 0,1 porcento de Tween 20, seguida 20 vezes com PBS. Os fagos ligados foram eluídos utilizando 1 uM de hAng-2 ou 1 uM de Tie2 humano (R and D Systems, acima descrito). Os fagos eluídos foram infectados em células E. coli TG1 (proporcionadas com a biblioteca de fagos), amplificados e recuperados para a ronda seguinte de rastreio. Foram identificados dezesseis clones Fab de ligação a Ang-2 únicos, através de amplificação por PCR de todos os fagos a que hAng-2 ou Tie2 se ligaram, e estes clones foram analisados por digestão de restrição. O ADN de cada clone foi sequenciado. A sequência codificante para a região variável de cada cadeia pesada de cada fago foi amplificada com iniciadores complementares. Os iniciadores foram concebidos de modo a incorporarem um local HindIII, um local Xbal, uma sequência de Kozak e uma sequência de sinal (o péptido traduzido é

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC; SEQ ID N°: 69) na extermidade 5' da região variável, enquanto um local BsmBI foi adicionado na extremidade 3' do produto de PCR. Como um exemplo de como as cadeias pesadas foram clonadas, o ADN fágico molde para o clone 544 (SEQ ID N° 19) foi amplificado utilizando os iniciadores 2248-21 (GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TCA GGT CCA GCT GGT GCA G; SEQ ID N°: 70) que adicionou os últimos 7 aminoácidos da sequência de sinal e 2502-31 (ATT ACG TCT CAC AGT TCG TTT GAT 116 CTC CAC; SEQ ID N°: 71) que adicionou o local BsmBI na extermidade da região variável. 0 produto resultante foi amplificado pelos iniciadores 2148-98 (CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TAT TGT GGT TGA GAG GTG CCA GAT; SEQ ID N° : 72) que adicionou nove aminoácidos ao péptido de sinal (AQLLGLLLL; SEQ ID N° : 73) e 2502-31, e depois 2489-36 (CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT CCC CGC TCA GCT CCT GGG; SEQ ID N°: 74) e 2502-31. O iniciador 2489-36 adicionou, a partir de 5' para 3', o local HindIII, o local Xbal, a sequência de Kozak e os primeiros 6 aminoácidos da sequência de sinal. Os produtos de PCR foram digeridos com Xbal e BsmBI, e depois clonados num vector de expressão de mamífero contendo a região constante IgGl humana. Este vector contém um promotor SV40 e selecção de DHFR.

As cadeias leves de cada fago eram da classe kapa ou lambda. Para cada cadeia leve, foram concebidos iniciadores complementares para adicionar, a partir de 5' para 3', um local HindIII, um local Xbal, uma sequência de Kozak e uma sequência de sinal (apresentada acima). Aquelas cadeias que tinham regiões codificantes sem erros foram clonadas como produtos de tamanho total. Como um exemplo, a cadeia leve do clone fágico 536 (SEQ ID N° 11) foi amplificada como uma região codificante de tamanho total utilizando o iniciador 2627-69 (GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TGA CAT TGT GAT GAC TCA GTC TCC; SEQ ID N°: 75), que adicionou os últimos sete aminoácidos da sequência de sinal, e o iniciador 2458-54 (CTT GTC GAC TTA TTA ACA CTC TCC CCT GTT G; SEQ ID N° : 76) que adicionou um local Sall após o codão de terminação. Este produto de PCR foi depois amplificado como previamente referido com iniciadores 5' adicionais, 2148-98 e 2489-36, respectivamente, emparelhados com o iniciador 2458-54, para terminar a adição da sequência de sinal e dos locais de clonagem. As cadeias leves de tamanho total foram clonadas como 117 fragmentos Xbal-Sall no vector de expressão de mamífero acima descrito.

Determinados clones lambda tinham erros nas suas regiões constantes quando comparados à sequência da região constante humana natural. Para corrigir estas discrepâncias, foi realizada PCR de sobreposição utilizando ADN que codifica para uma região constante lambda perfeita e uma região variável derivada de fago. Estes clones foram também clonados como fragmentos Xbal-Sall como acima descrito.

No caso em que regiões variáveis kapa foram clonadas separadamente das suas regiões constantes, um local BsmBI foi adicionado à extremidade 3' do produto de PCR. Após digestão do produto de PCR com Xbal e BsmBI, a região variável de cadeia kapa foi clonada num vector de expressão contendo a região constante kapa humana.

As construções emparelhadas de cadeia leve e pesada de cada fago convertido foram co-transfectadas em células CHO utilizando o Calcium Phosphate Transfection Kit (Invitrogen Corp.) habitualmente de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Os meios foram mudados 14-16 horas após a transfecção e as células foram passadas em placas de cultura de tecidos para selecção, após cerca de 48 horas de acordo com as recomendações do fabricante. As células transfectadas foram isoladas por selecção de HT durante, aproximadamente, 3 semanas, após as quais as colónias de células CHO foram tripsinizadas e combinadas num "agrupamento" de células transfectadas. 0 meio condicionado de pequena-escala foi recolhido após 48 horas e ensaiado para a produção de anticorpos por análise de transferência de Western utilizando anticorpo Fc anti-humano, 118 anticorpo kapa anti-humano ou anticorpo lambda anti-humano. As populações celulares seleccionadas foram depois passadas sob pressão selectiva utilizando técnica estéril convencional de cultura de tecidos, até serem obtidas células suficientes para inocular quatro frascos cilíndricos de 850 cm2 com 2xl07 células viáveis, cada um, e foram preparados stocks de linhas celulares congeladas utilizando DMSO. Após inoculação, as células foram mantidas em frascos cilíndricos com meio DMEM contendo cerca de 10 porcento de soro (Gibco/BRL, Inc) suplementado com glutamina e aminoácidos não essenciais. As células foram mantidas durante dois a três dias até ser alcançada uma confluência celular de, aproximadamente, 80%. Neste momento, os meios nos frascos cilíndricos foram mudados para uma mistura de meios sem soro (50 porcento de DMEM, 50 porcento de F12, Gibco) suplementada com glutamina e aminoácidos não essenciais. Os meios condicionados foram recolhidos após sete dias, sendo adicionado meio sem soro recém-preparado durante uma ou duas colheitas adicionais.

Os anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade de Proteína G directamente a partir do meio condicionado, utilizando processos convencionais. A eluição a partir da coluna de Proteína G foi realizada utilizando tampão a pH baixo (cerca de pH 3), após o que a proteína do anticorpo eluída foi neutralizada utilizando 1 M de Tris, pH 8,5, e depois concentrada utilizando concentradores centrífugos com limite de peso molecular de 10 kD. O tampão do stock de anticorpo concentrado foi depois trocado para PBS.

Trinta e um anticorpos foram produzidos e cada consiste em duas cadeias pesadas e 2 cadeias leves (kapa ou lambda) como designadas na seguinte Tabela 2. 119

Tabela 2

Cadeia Pesada de Anticorpo Cadeia Leve de Anticorpo 526 HC* 526 kapa 528 HC* 528 lambda 531 HC* 531 lambda 533 HC* 533 lambda 535 HC* 535 lambda 536 HC* 536 kapa 537 HC* 537 lambda 540 HC* 540 lambda 543 HC* 543 kapa 544 HC* 544 kapa 545 HC* 545 lambda 546 HC* 546 lambda 551 HC* 551 kapa 553 HC* 553 kapa 555 HC* 555 kapa 558 HC 558 kapa 559 HC 559 lambda 565 HC* 565 kapa F1-C6 HC F1-C6 lambda FBI-A7 HC FB1-A7 lambda FD-B2 HC FD-B2 lambda FE-B7 HC FE-B7 kapa FJ-G11 HC FJ-G11 kapa FK-E3 HC FK-E3 kapa G1D4 HC* G1D4 lambda GC1E8 HC GC1E8 lambda H1C12 HC H1C12 lambda IA1-1E7 HC IA1-1E7 kapa 120 (continuação)

Cadeia Pesada de Anticorpo Cadeia Leve de Anticorpo IF-IC10 HC IF-IC10 lambda IK-2E2 HC IK-2E2 lambda IP-2C11 HC IP-2C11 kapa * Testado para ligação a hAng-2, mAng-2 e h.Ang-1, como aqui descrito.

As seguintes quatro tabelas apresentam as sequências e as SEQ ID N° das cadeias pesadas e leves (kapa e lambda) dos 31 anticorpos anti-Ang-2 convertidos de fagos em anticorpos IgGl de tamanho total. As regiões determinantes de complementaridade (CDR) dos anticorpos monoclonais foram previstos utilizando a base de dados VBASE que utiliza a técnica descrita por Kabat et al. em: Sequences of Proteins of Immunological Interest (publicação NIH N° 91-3242; U.S. Dept. Health and Human Services, 5a ed.). As regiões Fab foram alinhadas a sequências na base de dados com a sequência da linha germinal mais próxima (ver: http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/restricted/ ALIGNMENTS.html) e depois comparadas visualmente com essas sequências. As CDR para cada região variável (cadeia pesada ou leve) são apresentadas na Tabela 7. 121

Tabela 3

Regiões Variáveis de Cadeia Pesada

Anticorpo HC Sequência 526 HC (SEQ ID N° 1) evqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgk GLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYCARDLLDYDILTGPYAYWGQGTLVTVSS 528 HC (SEQ ID N° 3) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ glewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrs edtavyycargvvgdfdwlsffdywgqgtlvtvss 531 HC (SEQ ID N° 5) evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgq glewmggiipilgianyaqkfqgrvtitadkstntaymeltslts ddtavyycardredtamvfnywgqgtlvtvss 533 HC (SEQ ID N° 7) evqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgk glewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslra edtavy yc ardlldydiltg ygy wgqgtlvtvss 535 HC (SEQ ID N° 9) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGO GLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRS edtavyycaafspftetdafdiwgqgtmvtvss 536 HC (SEQ ID N° 11) evqlvqsgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgk glewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslra edtavyycardlldydiltgygywgqgtlvtvss 537 HC (SEQ ID N° 13) qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgq glewmggiipilgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsglgs edtavyycargssdaavagmwgqgtlvtvss 540 HC (SEQ ID N° 15) qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgq glewmggiipilgianyaqkfqgrvtitadkftstaymelsslgs edtavyycaravpgtedafdiwgqgtmvtvss 543 HC (SEQ ID N° 17) qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgq glewmgriipilgianyaqkfqgrvtitadkststaymelsslrs edtavyycarpyydfwsgpggmdvwgqgttvtvss 544 HC (SEQ ID N° 19) qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasggtfssyaiswvrqapgq glewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrs edtavyycarfesgywgdafdiwgqgtmvtvss 545 HC (SEQ ID N° 21) qvqlqesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgk glewvavisydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnsl raedtavyycakgpvdfdygdyaidywgqgtlvtvss 546 HC (SEQ ID N° 23) evqlvdsggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgk glewvsaisgsggstyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslr aedt a v y yc aketisfstfsg yfd y w aqgtlvt vss 551 HC (SEQ ID N° 25) qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfssyaiswvrqapgq glewmggiipifgtanyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrs edtavyycargydfwsgysldafdiwgqgtmvtvss 553 HC (SEQ ID N° 27) qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsyamhwvrqapg qrlewmgwinagngntkysqkfqgrvtitrdtsastaymelsg lrsedtavyycargvddyggnswafdiwgqgtmvtvss 122 (continuação)

Anticorpo HC

Sequência 555 HC (SEQ ID N° 29) QVQLQESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGK GLEWV AVIS YDGSN KYY ADS VKGRFTISRDNS KNTLYLQMN SL RAEDTAVYYCARSASDHYYDSSGYYSDAFDIWGQGTMVTVSS 558 HC (SEQ ID N° 31) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPGK GLEWIGEINHSGSTNFNPSLKSRITISVDTSNNQFSLKLSSVTAAD T AA Y Y C ARGHDW GMGIGGA AYDIW GQGTMVTVSS 559 HC (SEQ ID N° 33) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTESSMHWVRQAPG KGLEWMGGFDPEHGETIYAQKFQGRLTMTEDTSTDTAYMELSS LRSEDTAVYFCARGVQVTSGYHYFDHWGQGTLVTVSS 565 HC (SEQ ID N° 35) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ GLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRS EDTAVYYCARSPIYYDILTGIDAFDIW GQGTMVTVSS F1-C6 HC (SEQ ID N° 37) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQ GLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRS EDTAVYYCARDPIPSGWYFDLWGRGTLVTVSS FB1-A7 HC (SEQ ID N° 39) QVQLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGK GLEW V AVIWYDGSNKY Y ADS VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL R AEDT AVYY CAREVGNY YDSSGYGYWGQGTLVTVSS FD-B2 HC (SEQ ID N° 41) QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDTVSSNSAAWNWIRQSPS RGLEWLGRTY YRSKWY SDY AVSLRGRITINLDTDTSKNQFSLQL NSVTPEDTAVYYCARDRGGYIDSWGQGTLVTVSS FE-B7 HC (SEQ ID N° 43) EVQLVESGGGLGQPGGSLRLSCAATGFSLDDYEMNWVRQAPGR GLEWVSYIIGSGKT1FYADSVKGRFT1SRDNGKNSVYLQMNSLR AEDTAIYYCARGGGSAYYLNTSDIWGQGTMVTVSS FJ-G11 HC (SEQ ID N° 45) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQ glewmgwisayngntnyaqklqgrvtmttdtststaymelrs LRSDDTAVYYCARDRGIAARSAYYYGMDVWGQGTTVTVSS FK-E3 HC (SEQ ID N° 47) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDLNWVRQASG QGLEWMGWMNPTSGNTGYAQKFQGRITMTRNTSISTAYMELRS LRSDDTAVYYCARDPPSGGWEFDYWGQGTLVTVSS G1D4 HC (SEQ ID N° 49) qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfsshaiswvrqapgq glewmgriipilgianyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrs edtavyycatsrlewllyldywgqgtlvtvss GC1E8 HC (SEQ ID N° 51) qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsygiswvrqapgq glewmgwisayngntnyaqklqgrvtmttdtststaymevrs lrsddtavyycarggspyggyaypfdywgqgtlvtvss H1C12 HC (SEQ ID N° 53) evqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgk glewvsyisssgstiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslra edtavyycardlldydiltgygywgqgtlvtvss IA1-1E7 HC (SEQ ID N° 55) qvqlqqwgagllkpsetlsltcavyggsfsgyywswirqspgk glewigeinhsgstnfnpslksritisvdtsnnqfslklssvtaad tavyycarghdwgmgiggaaydiwgqgtmvtvss IF-IC10 HC (SEQ ID N° 57) qvqlvesggglvqpggslrlscaasgftffstyamtwvrqapg kglewvsvirsnggtdyadfvkgrftisrdnskntlylqmngl raedtavyycmtdyywgqgtlvtvss 123 (continuação)

Anticorpo HC Sequência IK-2E2 HC (SEQ ID N° 59) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGK GLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTJSRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCAKETISFSTFSGYFDYWGQGTLVTVSS IP-2C11 HC (SEQ ID N° 61) qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsydinwvrqatgq GLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSS LRSEDT AVY YC AKE1A V AGTRY GMDVWGQGTTVTVSS

Tabela 4

Regiões Variáveis de Cadeia Kapa

Anticorpo LC Sequência 543 kapa (SEQ ID N° 18) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKP GQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLK1SRVEAEDVGV YYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK 544 kapa (SEQ ID N° 20) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLNWYLQKP gqspqiliylgsnrasgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgv YYCMQGLQTPPTFGQGTKLEIK 551 kapa (SEQ ID N° 26) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKP GQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCMQ ALQTPLTFGGGTK VEIK 553 kapa (SEQ ID N° 28) DIVMTQSPLSLPVTPGEPAS1SCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKP GQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFTGSGSATDFTLRISRVEAEDVGV YYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK 555 kapa (SEQ ID N° 30) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKP GQSPQLLIYLASNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGV yycmqtlqepitfgpgtkvdik 558 kapa (SEQ ID N° 32) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSSLAWYQQKPGQAP RLLVYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ HY GSSPRTFGQGTKVEIK 565 kapa (SEQ ID N° 36) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSSLAWYQQKPGQAP RLLVYAASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQ HYGSSPRTFGQGTKVEIK FE-B7 kapa (SEQ ID N° 44) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSKGDNYLDWYLQKP GQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGV YYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK FJ-G11 kapa (SEQ ID N° 46) DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGKTYLDWYLQR PGQSPQLLMYTTSSRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG VY Y CMQ ATQFPYTFGQGTKLEIK FK-E3 kapa (SEQ ID N° 48) DIVMTQTPLSSTVTLGQPASISCRSSQSLVHEDGNTYLNWLHQRP GQPPRLLIY KISKRFSG VPDRFSGSG A GTDFTLKISR VEPEDVG VY YCMQSTRFPRTFGQGTKLEIK 124 (continuação)

Anticorpo LC Sequência IA1-1E7 kapa (SEQ ID N° 56) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKAGQAP RLLIYDTSTRATGIADRFSGSGSGTDFTLTISRLEAEDSAVYYCQQ YDFSPLTFGGGTKVEIK IP-2C11 kapa (SEQ ID N° 62) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISTFLAWYQQKPGQAPRL LIYDASNRATGIPGRFSGSGSGTDFTLTISNLEPEDFAVYYCQHRI NWPLTFGGGTKVEIK

Tabela 5

Regiões Variáveis de Cadeia Lambda

Anticorpo LC Sequência 528 lambda (SEQ ID N° 4) SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGYTYTSWFQQKPGQSPVL VIFQDFKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAW DSTT AV VFGTGTKVTVL 531 lambda (SEQ ID N° 6) QSVLTQPPSVSAAPGQKVTVSCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTA PKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTS ATLGITGLQTGDEADY Y C GTWDSSLSAFWVFGGGTKLTVL 533 lambda (SEQ ID N° 8) SYELTQPPSVSVSPGQTAR1TCSGDALPKQYAYWYQQKPGQAPV LVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSA DSSHVVFGGGTKLTVL 535 lambda (SEQ ID N° 10) QSVLTQPPSVSAAPGQKVT1SCSGSNSNIGNNFVSWYQQLPGTAP KLLVYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYC GTWDSSLSAAEVVFGGGTKLTVL 537 lambda (SEQ ID N° 14) QSVLTQPPSVSAAPGQDVTISCSGNNSNIGNNYVSWYQQVPGTA PKLLVYDNHKRPSG1SDRFSGSKSDTSATLD1TGLQPGDEADYYC GTWDTSLSANWVFGGGTKLTVL 540 lambda (SEQ ID N° 16) QSVLTQPPSVSAAPGQKVT1SCSGSSSNIGANYVSWYQQLPGTAP KLLIYNNNKRPSGIPDRFSGSKSDTSATLGITGLQTGDEADYYCG AWDSSLSASWVFGGGTKLTVL 545 lambda (SEQ ID N° 22) qsvltqpssvsgapgqrvtisctgqssnigagydvhwyqqfpgr APKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQPEDEADYY CQSYDSRLSGSVFGGGTKLTVL 546 lambda (SEQ ID N° 24) QSVLTQPSSVSEAPRQRVTISCSGSASNIGANGVSWYHQVPGKA PRLLLSHDGLVTSGVPDRLSVSKSGTSASLAISGLHSDDEGDYYC AVWDDSLNAVVFGGGTKLTVL 559 lambda (SEQ ID N° 34) QSALTQPPSASGSPGQSITISCTGTNSDIGSYPFVSWYQRHPGKAP KLLIYDVSNRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCS SFTMNSFVIFGGGTKLTVL F1-C6 lambda (SEQ ID N° 38) QSVLTQPPSVSEAPRQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAP KLLrYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCA TWDDSLSGWVFGGGTKLTVL 125 (continuação)

Anticorpo LC Sequência FB1-A7 lambda (SEQ ID N° 40) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSGGGIGSSFVHWFQQRPGSSP TTVIFDDNQRPTGVPDRFSAAIDTSSSSASLT1SGLTAEDEADYYC QSSHST A V VFGGGTKLTVL FD-B2 lambda (SEQ ID N° 42) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGS1ATNYVQWYQQRPGSSP ATVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDTSSNSASLT1SGLTTEDEADYFC QS Y GDNNW VFGGGTKLTVL G I D4 lambda (SEQ ID N° 50) NFMLTQPHSVSESPGKTVIIPCTRSSGSIASNYVQWYQKRPGSAP SIVIYEDKQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYC QSYNSRGVMFGGGTKLTVL GC1E8 lambda (SEQ ID N° 52) NFMLTQPHSVLESAGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQQRPGTSP TNV1FEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYFC QS Y DSNIW VFGGGTKLTVL H1C12 lambda (SEQ ID N° 54) QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQHLPGTAP KLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIAGLQAEDEADYYC QSYDSSLSGSLVFGGGTKLTVL IF-IC10 lambda (SEQ ID N° 58) NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSGGSIASNYVQWYQQRPGSA PTTVIYEDNQRPSGWDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYY CQSYDSSTWVFGGGTKLTVL IK-2E2 lambda (SEQ ID N° 60) QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWFQQHPGK APKLMIYKVNNRPSGLSNRFSGSQSGNTASLT1SGLQAEDEADY YCSSYTSSSTLGFGGGTKLTVL

Tabela 6

Regiões Constantes (CR) Humanas

Anticorpo CR Sequência Região 1 constante lambda humana (SEQ ID N° 63) GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWK ADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSY SCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Região 2 constante lambda humana (SEQ ID N° 64) GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWK ADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYS CQ VTHEGST VEKT V APTECS 126 (continuação)

Anticorpo CR Sequência Região 3 constante lambda humana (SEQ ID N° 65) GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWK ADSSP VKAG VETTTPSKQSNNKY AASSYLSLTPEQWKSHKS Y S CQVTHEGSTVEKTV APTECS Região 7 constante lambda humana (SEQ ID N° 66) GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAW KADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRS Y SCRVTHEGSTVEKTVAPAECS Região constante kapa humana (SEQ ID N° 67) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAJDYEKHKVY ACE VT HQGLSSP VTKSFNRGEC Região constante IgGl humana (SEQ ID N° 68) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT K.PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Tabela 7

Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR) de Cadeias Pesadas (HC) e Cadeias Leves (LC) de Anticorpos Ang-2 CDR 1 CDR 2 CDR 3 Anticorpo Resíduos Resíduos Resíduos Ab 526 HC 26-36 50-66 96-113 Ab 526 KC 23-46 54-62 93-102 Ab 528 HC 26-36 50-66 96-113 Ab 52 8 L c 22-34 56-76 87-98 Ab 531 HC 26-36 50-66 96-110 Ab 531 LC 22-36 58-78 89-102 127 (continuação) CDR 1 CDR 2 CDR 3 Ab 533 HC 26-36 50-66 96-112 Ab 533 LC 22-34 56-76 87-97 Ab 535 HC 26-36 50-66 96-111 Ab 535 LC 22-36 58-78 89-103 Ab 536 HC 26-36 50-66 96-112 Ab 536 KC 23-40 54-62 93-102 Ab 537 HC 26-36 50-66 96-109 Ab 537 LC 22-36 58-78 89-102 Ab 540 HC 26-36 50-66 96-110 Ab 540 LC 22-36 58-78 89-102 Ab 543 HC 26-36 50-66 96-113 Ab 543 KC 23-40 54-62 93-102 Ab 544 HC 26-36 50-66 96-111 Ab 544 KC 23-40 54-62 93-102 Ab 545 HC 26-36 50-66 96-113 Ab 545 LC 22-37 59-79 90-102 Ab 546 HC 26-36 50-66 96-113 Ab 546 LC 22-36 58-78 89-101 Ab 551 HC 26-36 50-66 96-114 Ab 551 KC 23-40 54-62 93-102 Ab 553 HC 26-36 50-66 96-113 Ab 553 KC 23-40 54-62 93-102 Ab 555 HC 26-36 50-66 96-118 Ab 555 KC 23-40 54-62 93-102 Ab 558 HC 26-36 50-65 95-113 Ab 558 KC 23-36 50-58 89-98 Ab 559 HC 26-36 50-66 96-112 Ab 559 LC 22-37 59-79 90-101 Ab 565 HC 26-36 50-66 96-115 Ab 565 KC 23-36 50-58 89-98 128 (continuação) CDR 1 CDR 2 CDR 3 Ab F1-C6 HC 26-36 50-66 96-110 Ab F1-C6 LC 22-36 58-78 89-101 Ab FB1-A7 HC 26-36 50-66 96-112 Ab FB1-A7 LC 22-36 58-80 91-101 Ab FD-B2 HC 26-38 52-69 101-112 Ab FD-B2 LC 22-36 58-80 91-101 Ab FE-B7 HC 26-36 50-66 96-112 Ab FE-B7 KC 23-40 54-62 93-102 Ab FJ-G11 HC 26-36 50-66 96-115 Ab FJ-G11 KC 23-41 55-63 94-103 Ab FK-E3 HC 26-36 50-66 96-110 Ab FK-E3 KC 23-40 54-62 93-102 Ab G1D4 HC 26-36 50-66 96-110 Ab G1D4 LC 22-36 58-80 91-101 Ab GC1E8 HC 26-36 50-66 96-113 Ab GC1E8 LC 22-36 58-80 91-101 Ab H1C12 HC 26-36 50-66 96-112 Ab H1C12 LC 22-36 58-78 89-102 Ab IA1-1E7 HC 26-36 50-65 95-113 Ab IA1-1E7 KC 23-36 50-58 89-98 Ab IF-IC10 HC 26-37 51-66 96-102 Ab IF-IC10 LC 22-36 58-80 91-101 Ab IK-2E2 HC 26-36 50-66 96-113 Ab IK-2E2 LC 22-37 59-79 90-101 Ab IP-2C11 HC 26-36 50-66 96-112 Ab IP-2C11 KC 23-35 49-57 88-97

Dezessete dos anticorpos e um controlo negativo de IgGl (referido como RDB1) foram testados utilizando ELISA de 129 afinidade e de neutralização (como descrito no Exemplo 3 acima), assim como o ensaio de neutralização BIAcore para determinar a sua afinidade, neutralização e capacidades de especificidade. Os resultados são apresentados abaixo (Tabela 8) e foram calculados utilizando processos convencionais.

Tabela 8 EC50 e IC50 do Anticorpo Ang-2 hAng-2 mAng-2 hAng-1 Anticorpo IC50 (nM) EC50 (nM) IC50 (nM) EC50 (nM) IC50 (nM) EC50 (nM) Ab 536 0,08 0,005 0,05 0,01 114,65 30 Ab 56 5 0,26 0,26 Sem inibição Ab 546 037 1,09 Sem inibição Ab 5 43 0,51 0,24 Sem inibição Ab 533 0,3 0,08 Sem inibição Ab 53 7 0,56 0,62 Sem inibição Ab 540 070 1,53 Sem inibição Ab 544 0,97 1,82 23,32 Ab 5 45 1, 04 0,02 1,30 0, 05 8,31 2 Ab 52 8 1,37 0, 73 Sem inibição Ab G1D4 1,39 060 69, 48 130 (continuação) hAng-2 mAng-2 hAng-1 Anticorpo IC50 (nM) EC50 (nM) IC50 (nM) EC50 (nM) IC50 (nM) EC50 (nM) Ab 551 1, 41 2,88 Sem inibição Ab 553 1 47 1, 41 Sem inibição Ab 52 6 1,83 0,27 243,15 Ab 531 2, 15 1,67 Sem inibição Ab 555 2,21 1, 76 Sem inibição Ab 535 2,81 2,45 Sem inibição RDB1 Sem inibição Sem ligação Sem inibição Sem ligação Sem inibição Sem ligação

Dois utilizando anticorpo BIAcore, resultados anticorpos, clone 536 e clone 545, foram avaliados a análise BIAcore acima descrita. A ligação do foi determinada como acima descrita, para o ensaio com baixas KD indicando maiores afinidades, e os são apresentados na seguinte Tabela 9. 131

Tabela 9

Afinidades do anticorpo para hAng-2 e mAng-2 hAng-2 mAng-2 Ab KD (nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) ka (1/MS) kd (1/s) Ab 536 0,12 3,2 x 105 3,8 x 10^5 0, 15 6,2 x 105 9,5 x 10“5 Ab 545 1,2 3,3 x 10" 3,9 x 10~4 0, 9 5,9 x 10" 5,3 x 10“4 EXEMPLO 5

Estudos de Eficácia Terapêutica Utilizando Anticorpos Anti-Ang-2

As farmacocinéticas de anticorpos policlonais anti-Ang-2 de coelho, purificados com Proteína-G, foram examinadas em murganhos. Vinte e quatro murganhos foram tratados com anticorpo policlonal anti-Ang-2 de coelho (1 mg por murganho).Quatro animais tratados foram sacrificados em cada dos seguintes momentos pós-injecção do anticorpo: 1 hora, 6 horas, 1 dia, 3 dias, 7 dias e 14 dias.

Os resultados indicaram que a IgG total de coelho tinha uma semi-vida de circulação sérica de, aproximadamente, 19 dias, enquanto o componente de IgG anti-Ang-2 da IgG total tinha uma semi-vida de, aproximadamente, oito dias. 132

Para avaliar a eficácia terapêutica, a murganhos (10 animais/grupo) contendo xenoenxertos tumorais A431 foram administradas 10 doses (cerca de 10 mg de IgG por murganho por dose) intraperitonealmente do anticorpo policlonal anti-mAng-2, purificados com Proteina G, nos dias 1, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15 e 18 após o xenoenxerto. O tamanho tumoral foi medido nos dias 7, 12, 15, 19 e 21. O peso corporal foi medido nos dias 0, 7, 15 e 21, e não foi afectado pelo tratamento. Os resultados indicaram gue o anticorpo policlonal anti-Ang-2 inibiu o crescimento do xenoenxerto tumoral A431 em cerca de 50 porcento com p=0,008 versus controlos do antissoro policlonal purificado não imune (10 mg de IgG por murganho por dose) e veiculo (PBS), por medidas repetidas de ANOVA.

Para testar a eficácia dos anticorpos monoclonais anti-Ang-2 totalmente humanos, in vivo, murganhos (10 animais/grupo) contendo xenoenxertos tumorais A431 foram tratados intraperitonealmente com clone 533, 537 ou 544 do anticorpo anti-Ang-2, ou com controlos negativos de PBS ou IgGl-kapa humana. A dosagem foi cerca de 420 ug de proteína por murganho para a primeira dose, cerca de 140 ug de proteína por murganho para cada das três doses seguintes e cerca de 55 ug de proteína por murganho para cada das quatro doses seguintes, para um total de 8 doses por murganho. Os volumes tumorais e os pesos corporais foram registados duas vezes por semana. No final do estudo, os animais foram sacrificados e os seus soros foram recolhidos para medição dos níveis de anticorpo por ELISA. Os tumores e um painel de tecidos normais foram recolhidos de todos os grupos. 133

Verificaram-se diferenças notáveis no crescimento tumoral entre os grupos tratados com anti-Ang-2 e os de controlo, como mostrado na Figura 1. Todos os três tratamentos de anti-Ang-2 inibiram o crescimento tumoral em comparação com os controlos (p <005 vs. controlo de hlgGl em todos os tratamentos utilizando medidas repetidas de ANOVA para todos os 3 anticorpos). Pelo contrário, os tumores em grupos de controlo continuaram a crescer numa taxa muito maior.

Exemplo 6

Mapeamento de Epitopo

Proteinas Ang-2 humanas (hAng-2) de tamanho total (aminoácidos 1-495), N-terminal (aminoácidos 1-254) e C-terminal (aminoácidos 255-495) foram clonadas num vector de expressão de mamífero accionado por CMV com marcadores 6xHis no C-terminal. As três construções resultantes, mais um controlo do vector foram transientemente expressas em células 293T. Os meios condicionados foram depois recolhidos das células transfectadas e o nível de expressão de Ang-2 nos meios foi estimado por ELISA anti-6xhis e transferência de Western. 134 0 epitopo de ligação dos anticorpos e pepticorpos anti-Ang-2 foi determinado pela sua capacidade de ligação às três versões de hAng-2 humano por ELISA, de acordo com o seguinte protocolo: uma placa de ensaio de alta ligação de 96 poços foi revestida com 100 pL de meio condicionado por poço e incubada a 37 °C durante 1 hora. O meio condicionado foi aspirado e a placa foi bloqueada com 200 pL por poço de 5% de BSA em PBS, à temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de bloqueamento foi depois aspirada. Foram adicionados 100 pL por poço de anticorpo, pepticorpo ou Tie2-Fc a 1 pg/mL em 1% de BSA em PBS e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. Os poços foram lavados 4 vezes com 200 pL de 0,1% de Tween em PBS. Foram adicionados 100 pL por poço de IgG anti-humana de cabra ou IgG anti-murganho de cabra, conjugadas com HRP e incubados à temperatura ambiente durante 45 minutos. Os poços foram depois lavados com 200 pL de 0,1% de Tween em PBS 4 vezes. Foram depois adicionados 100 pL por poço de substrato TMB. A O.D. foi lida a 370 nm.

Os resultados são apresentados na Figura 2A, Figura 2B e Figura 2C. 135 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> AMGEN INC.

<120> AGENTES DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA A ANGIOPOIETINA-2 <130> A-722A <140> AINDA NÃO ATRIBUÍDO <141> 2002-10-11 <150> U.S. 60/328604 <151> 2001-10-11 <160> 76 < 170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Glu vai Gin Leu vai Gl u Ser Gly Gly Gly vai vai Gl n pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Al a Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met HÍS Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn ser Leu Tyr 65 70 75 80 136

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Al a Glu ASp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Pro Tyr Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr val ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp ile vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro a! a ser lie Ser Cys Arg ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp phe Thr Leu Lys ile 65 70 75 80 Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95 Leu Gin Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens 137 <4Ο0> 3

Gin vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser vai Lys vai ser cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe ser ser Tyr 20 25 30

Ala Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg vai Thr ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly vai vai Gly Asp Phe Asp Trp Leu ser Phe Phe Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 120

<210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Vai Ser pro Gly Gin 1 5 10 15 Thr Al a ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Thr Tyr Thr 20 25 30 Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro vai Leu val Ile Phe 35 40 45 Gin Asp Phe Lys Arg pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr ile Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Asp Ser Thr Thr Ala Val 85 90 95 Vai Phe Gly Thr Gly Thr Lys vai Thr val Leu 100 105 138 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Glu val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Gl U val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 ser vai Lys val Ser cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Π e Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Glu Asp Thr Ala Met Val Phe Asn Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Leu val Thr val Ser Ser 115 120

<210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Gin Ser val Leu Thr Gin Pro Pro ser val Ser Ala Ala Pro Gly Gl n 1 5 10 15 Lys val Thr val Ser Cys Ser Gly Ser ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 139

Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg pro ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe ser 50 55 60

Gly Ser Lys ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95

Ser Ala Phe Trp vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110

<210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Glu vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Gly Gly val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Al a Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly ser Thr ile Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens 140 <4 Ο 0>

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro ser Val Ser val ser Pro Gly Gin 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr cys ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gin Tyr Al a 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro val Leu val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly val Gin Al a Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Ala Asp Ser Ser HiS val val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu 100 105 <21 0> 9 <21 1> 121 <212> PRT <213> Homo sapien <40 0> 9 Gin vai Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gl y ser 1 5 10 15 Ser Vai Lys Val Ser Cys Lys Al a Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Al a Phe Ser Pro Phe Thr Glu Thr ASp Ala Phe Asp ile Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Met Val Thr val Ser Ser 115 120 141

<210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Gl η ser vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 1 5 10 15 Lys vai Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn lie Gly Asn Asn 20 25 30 Phe vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 val Tyr ASp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly ile Pro ASP Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly lie Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80 Thr Gly ASp Glu Ala ASp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 ser Ala Al a Glu val val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu 100 105 110 <21 0> 11 <21 1> 122 <21 2> PRT <213> Homo sapien: 3 <40 0> 11 Glu vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Val val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 142

Gly Met His Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45

Ser Tyr Ile 50 Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 55 60 Lys Gly Arg 65 Phe Thr Ile ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 70 75 80

Leu Gin Met Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp 100 105 110

Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr vai ser Ser 115 120 <210> 12

<211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Asp ile vai Met Thr Gin ser Pro Leu Ser Leu Pro vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr 35 Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 40 45 Pro Gin Leu 50 Leu ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala ser Gly vai Pro 55 60 Asp Arg Phe 65 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 70 75 80 Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp vai Gly Vai Tyr Tyr cys Met Gin Gly 85 90 95

Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 143

<210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13

Gin vai Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser vai Lys vai Ser cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala ile Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly lie Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Gly Ser Glu ASP Thr Ala val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Ser ASp Ala Ala val Ala Gly Met Trp Gly Gin Gl y 100 105 110 Thr Leu Vai Thr val Ser Ser 115

<210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 14

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser val Ser Ala Ala Pro Gly Gin 1 5 10 15 Asp val Thr Ile Ser Cys ser Gly Asn Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Val Tyr Asp Asn HlS Lys Arg Pro Ser Gly ile Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 144

Gly ser Lys Ser ASp Thr Ser Ala 65 70 Pro Gly Asp Gl u Ala 85 Asp Tyr Tyr ser Ala Asn T rp 100 val Phe Gly Gly <21 0> 15 <21 1> 120 <21 2> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 15 Gin vai Gin Leu val Gin Ser Gly 1 5 Ser vai Lys vai Ser cys Lys Ala 20 Ala ile Ser Trp val Arg Gin Ala 35 40 Gly Gly ile ile pro ile Leu Gly 50 55 Gin Gly Arg vai Thr ile Thr Ala 65 70 Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser 85 Ala Arg Ala vai Pro Gly Thr Glu 100 Gly Thr Met vai Thr Val Ser Ser 115 120 <21 0> 16 <21 1> 111 <21 2> PRT <213> Homo sapien; 5

Thr Leu Asp ile Thr Gly Leu Gin 75 80 cys Gly Thr Trp Asp Thr Ser Leu 90 95

Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 105 110

Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 10 15

Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 45 lie Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 60

Asp Lys Phe Thr ser Thr Ala Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys 90 95

Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin 105 110 145 A ο 0> 16 Gl η Ser vai Leu Thr Gin Pro pro Ser Vai Ser Ala A1 a Pro Gly Gin 1 5 10 15 Lys Vai Thr ile Ser cys Ser Gly Ser Ser ser Asn Ile Gly Ala Asn 20 25 30 Tyr vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 He Tyr Asn Asn Asn Lys Arg pro ser Gly Ile ΡΓΟ ASP Arg Phe ser 50 55 60 Gl y Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Thr Leu Gly ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80 Thr Gly ASp Gl u Ala Asp Tyr Tyr cys Gly Ala Trp Asp ser ser Leu 85 90 95 Ser Ala Ser Trp vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu 100 105 110 <21 0> 17 <21 1> 123 <21 2> PRT <213> Homo , sapien. 5 <40 0> 17 Gin vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys pro Gly ser 1 5 10 15 ser vai Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala lie ser Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg lie Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu ser Ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg pro Tyr 100 Tyr Asp phe Trp ser 105 Gly Pro Gly Gly Met 110 Asp vai Trp Gly Gin 115 Gly Thr Thr Vai Thr 120 Vai Ser Ser 146 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 ASP Ile vai Met Thr Gin Ser pro Leu Ser Leu pro val Thr pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu ASP Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gl n Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95 Leu Gin Thr Pro Leu Thr phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 100 105 110 <21 0> 19 <21 1> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 19 Gin vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser vai Lys Vai Ser Cys Lys Al a Ser Gly Gly Thr phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala He Ser Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 147

Gly Gly Ile He Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg vai Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg Phe Glu Ser Gly Tyr Trp Gly ASp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gin Gly Thr Met vai Thr vai Ser Ser 115 120

<210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu HÍS Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 pro Gin lie Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp val Gly val Tyr Tyr cys Met Gin Gly 85 90 95 Leu Gl n Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 21 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens 148 <4Ο0> 21

Gin val Gin Leu Gin G1 u ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala a1 a 20 Gly Met Hi s Trp val Arg Gin Ala 35 40 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly ser 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 65 70 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala 85 Ala Lys Gly Pro val Asp Phe Asp 100 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 115 120 <210> 22 <211> 111 <212> PRT <213> Homo , sapiens <40 0> 22 Gin Ser val Leu Thr Gin pro Ser 1 5 Arg val Thr ile Ser Cys Thr Gly 20 Tyr Asp val His Trp Tyr Gin Gin 35 40 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg 50 55 Ser Gly AS Ser Lys ser Gly 7Π Thr Ser val Ser ser

Gly Gly vai vai Gin Pro Gly Arg 10 15

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp vai 45

Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser vai 60

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Tyr Gly Asp Tyr Ala Ile Asp Tyr 105 110

Ser val ser Gly Ala Pro Gly Gin 10 15

Gin ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 25 30

Phe pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu 45

Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 60

Ala Ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 75 80

Gin Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 85

Leu ser Gly Ser vai Phe Gly Gly 100

Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Arg 90 95

Gly Thr Lys Leu Thr val Leu 105 110 149 <210> 23 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Glu vai Gin Leu val Asp ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Gl u Trp val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Thr Ile Ser Phe Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Ala Gin Gl y Thr Leu val Thr val Ser Ser 115 120

<210> 24 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens 150 <400> 24

Gin ser vai Leu Thr Gin Pro Ser 1 5

Arg vai Thr lie ser cys 5er Gly

Ser vai Ser Glu Ala Pro Arg Gin 10 15

Ser Ala ser Asn Ile Gly Ala Asn 25 30

Gly vai Ser Trp Tyr His Gin vai B5 40

Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu 45

Leu ser His Asp Gly Leu vai Thr 50 55

Ser Gly vai Pro Asp Arg Leu Ser 60

Vai ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala 65 70 ser Leu Ala ile Ser Gly Leu His 75 80

Ser Asp Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr 85 cys Ala vai Trp Asp Asp Ser Leu 90 95

Thr Lys Leu Thr Vai Leu 105 110

Asn Ala vai Vai Phe Gly Gly Gly 100

<210> 25 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Gin vai Gin Leu vai Gin Ser Gly 1 5 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala 20 Ala Ile Ser Trp vai Arg Gin Ala 35 40 Gly Gly 50 ile Ile pro Ile Phe 55 Gly G1 n Gly Arg vai Thr ile Thr Ala 65 70 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85 Al a Arg Gly Tyr ASp Phe Trp Ser 100 ile Trp Gl y Gin Gly Thr Met vai 115 120 Thr vai Ser Ser

Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ser 10 15

Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 45

Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 60

Asp Glu Ser Thr ser Thr Ala Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 90 95

Gly Tyr ser Leu Asp Ala Phe Asp 105 110 151 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Asp Ile vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro vai Thr Pro Gl y 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Hi S Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu ASp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gl y Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala ser Gly val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95 Leu Gin Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110

<210> 27 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Gin val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp val Arg Gl n Ala Pro Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gl y Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gin Lys Phe 50 55 60 152

Gin Gly Arg vai Thr ile Thr Arg ASp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg Gly vai ASp Asp Tyr Gly Gly Asn Ser Trp Ala Phe Asp ile 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Met vai Thr vai Ser Ser 115 120 <21 0> 28 <21 1> 112 <21 2> PRT <213> Homo sapiem <40 0> 28 Asp Ile vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro vai Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser cys Arg Ser Ser Gl n Ser Leu Leu His ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gl n Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Al a Ser Gly vai Pro 50 55 60 Asp Arg phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp vai Gly vai Tyr Tyr cys Met Gin Ala 85 90 95 Leu Gl n Thr pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105 110 <21 0> 29 <21 1> 128 <21 2> PRT <213> Homo sapiem 153 <400> Gin Vai 1 29 Gl n Leu Gin 5 Glu Ser Gly Gly Gly Vai 10 Vai Gin pro Gly 15 Arg Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala ser 25 Gly Phe Thr Phe ser 30 Ser Tyr Ala Met HlS 35 Trp vai Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp val Ala vai 50 Ile Ser Tyr ASP Gly Ser 55 Asn Lys Tyr Tyr 60 Ala ASp Ser val Lys Gly 65 Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala vai Tyr Tyr 95 cys Ala Arg Ser Ala 100 Ser ASP His Tyr Tyr 105 Asp Ser Ser Gly Tyr 110 Tyr Ser Asp Ala Phe 115 Asp Ile Trp Gly Gin Gly 120 Thr Met Vai Thr val 125 Ser Ser <210> 30 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp ile 1 vai Met Thr 5 Gin Ser Pro Leu Ser 10 Leu Pro val Thr pro 15 Gly Glu ΡΓΟ Al a Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gin Ser Leu Leu 30 HlS Ser Asn Gly Tyr 35 Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr 40 Leu Gin Lys Pro 45 Gly Gin ser Pro Gin 50 Leu Leu Ile Tyr Leu Ala 55 Ser Asn Arg Ala 60 ser Gly val pro Asp Arg 65 Phe Ser Gly Ser 70 Gly Ser Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Arg Ile 80 Ser Arg vai Glu Ala 85 Gl u Asp vai Gly vai Tyr Tyr cys Met Gin Thr 90 95

Leu Gin lie Pro lie Thr phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp lie Lys 100 105 110 154

<210> 31 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 31

Gin vai Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gl u 1 5 10 15 Thr Leu ser Leu Thr cys Ala val Tyr Gly Gly ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu lie Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Phe Asn Pro ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Thr ile Ser val Asp Thr ser Asn Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr cys Ala 85 90 95 Arg Gly Hi s Asp Trp Gly Met Gly ile Gly Gly Ala Ala Tyr Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Met val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 32 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 32

Gl u Ile val Leu Thr Gl n Ser Pro Gly Thr Leu ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser val ser Ser Ser 20 25 30 155

Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala pro Arg Leu Leu 35 40 45

Vai Tyr Ala Ala Ser ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin His Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105

<210> 33 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Gin vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Vai Ser cys Lys val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu ser 20 25 30 ser Met Hi S Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly phe Asp Pro Glu Hi S Gly Glu Thr ile Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Leu Thr Met Thr Gl u Asp Thr Ser Thr Asp Thr Al a Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Al a Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Vai Gin Vai Thr Ser Gly Tyr Hi s Tyr Phe Asp Hi s Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Val Ser Ser 115 120 156

<210> 34 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 C Λ O 34 Gin Ser Ala Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gin 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Asn Ser Asp Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 pro phe Val Ser Trp Tyr Gl n Arg Hi S pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu ile Tyr Asp val Ser Asn Arg pro Ser Gly val ser ASp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gin Ala Glu ASp Glu Gly Asp Tyr Tyr cys Ser Ser Phe Thr Met Asn 85 90 95 Ser Phe val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu 100 105 110

<210> 35 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

Gin val Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys val Ser Cys Lys Ala ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala ile Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly lie ile Pro xle Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gin Lys phe 50 55 60

Gin Gly Arg val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 157

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg ser pro ile Tyr Tyr Asp ile Leu Thr Gly ile Asp Ala phe 100 105 no Asp Ile τ rp Gl y Gin Gly Thr Met val Thr val Ser ser 115 120 125

<210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36

Glu lie vai Leu Thr Gin Ser pro Gly Thr Leu ser Leu ser pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala ser Gin Ser vai Ser ser Ser 20 25 30

Ser Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 vai Tyr Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin His Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu lie Lys 100 105

<210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens 158 <400> 37

Gin val 1 Gin Leu Val 5 Gin ser Gly Ser val Lys val 20 Ser cys Lys Ala Ala Ile Ser 35 Trp val Arg Gin Ala 40 Gly Arg 50 ile Ile Pro ile Leu 55 Gly Gin Gly 65 Arg Val Thr ile 70 Thr Ala Met Glu Leu ser Ser 85 Leu Arg ser Ala Arg Asp Pro 100 Ile Pro Ser Gly Gly Thr Leu 115 val Thr Val Ser Ser 120 <210> 38 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gin ser 1 val Leu Thr 5 Gin Pro Pro Arg val Thr Ile 20 Ser Cys Ser Gly Ala val Asn 35 Trp Tyr Gin Gin Leu 40 Ile Tyr 50 Tyr Asp Asp Leu Leu 55 Pro Gly Ser 65 Lys Ser Gly Thr 70 Ser Ala Ser Glu A5P Glu Ala 85 ASP Tyr Tyr Ser Gly Trp val 100 Phe Gly Gly Gly

Ala Glu val Lys Lys Pro Gly ser 10 15 ser Gly Gly Thr phe Ser ser Tyr 25 30 pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 45 ile Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 60

Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 90 95

Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg 105 110

Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gin 10 15

Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn 25 30 pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 45

Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 60 ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 75 80

Cys Ala Thr Trp Asp Asp ser Leu 90 95

Thr Lys Leu Thr Val Leu 105 110 159

<210> 39 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 39

Gin vai Gin Leu vai Gl u Ser Gly Gly Gly Leu val Lys Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met HiS Trp vai Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Gl u Trp Val 35 40 45 Ala vai lie Trp Tyr Asp Gly ser Asn Lys Tyr Tyr Ala ASP Ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg Glu vai Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr T rp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr val Ser Ser 115 120

<210> 40 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Asn Phe Met Leu Thr Gl n Pro His Ser val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Gly Gly Gly Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Phe val His Trp Phe Gin Gin Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr val 35 40 45 160

Ile Phe Asp Asp Asn Gin Ara Pro Thr Gly vai pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60

Ala Ala Ile Asp Thr Ser ser Ser ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80

Leu Thr Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Ser His Ser 85 90 95

Thr Ala val vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu 100 105 110

<210> 41 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41

Gin val Gin Leu Gl n Gin Ser Gly Pro Gly Leu val Lys pro Ser Gl n 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gin Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Al a 50 5b 60 val Ser Leu Arg Gly Arg ile Thr ile Asn Leu Asp Thr Asp Thr Ser 65 70 75 80 Lys Asn Gin phe Ser Leu Gin Leu Asn ser val Thr Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala val Tyr Tyr cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Tyr ile Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Gin Gly Thr Leu val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 42 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens 161 <4Ο0> 42

Asn Phe Met Leu Thr Gin pro His ser vai Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15

Thr Vai Thr lie Ser cvs Thr Arg ser Ser Gly Ser Ile Ala Thr Asn 20 25 30

Tyr val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly ser Ser Pro Ala Thr vai 35 40 45

Ile Tyr Glu Asp Asn Gin Arg Pro Ser Gly val Pro Asp Arg Phe 5er 50 55 60

Gly ser ile Asp Thr ser ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80

Leu Thr Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Ser Tyr Gly Asp 85 90 95

Asn Asn Trp val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu 100 105 110

<210> 43 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43

Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu Gly Gl n Pro Gl y Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe ser Leu Asp ASp Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 ser Tyr Ile ile Gly Ser Gly Lys Thr ile Phe Tyr Ala Asp ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn ser val Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Leu Asn Thr ser Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gin Gly 115 Thr Met val Thr val 120 Ser Ser 162 <210> 44

<211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 44 Asp ile vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu pro Ala Ser ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu HÍS Ser 20 25 30 Lys Gly Asp Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu ile Tyr Leu Gly Ser His Arg Ala Ser Gly val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys ile 65 70 75 80 Ser Arg val Glu Ala Glu Asp val Gly val Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95 Leu Gin Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 45 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο Ο> 45

Gin vai Gin Leu vai Gin ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 163

Glv ile líer Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Leu 50 55 60

Gin Gly Arg vai Thr Met Thr Thr Asp Thr ser Thr ser Thr Ala Tyr 65 70 75 B0

Met Glu Leu Arg ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys 85 90 95

Ala Arq Asp Arg Gly ile Ala Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110

Asd val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 46 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Asp ile val Met Thr Gin Thr Pro Leu ser Leu pro val Thr Pro Gly 15 10 15

Glu Pro Ala ser lie ser cys Arg Ser ser Gin ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30

Asp Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Arg Pro Gly Gin 35 40 45

Ser Pro Gin Leu Leu Met Tyr Thr Thr ser Ser Arg Ala ser Gly val 50 55 60 pro Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80

Ile Ser Arg val Glu Ala Glu Asp val Gly val Tyr Tyr Cys Met Gin 85 90 95

Ala Thr Gin Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 lio

Lys 164 <210> 47 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47

Gin vai Gin Leu vai Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser vai Lys vai ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 50 Asp Leu Asn Trp vai Arg Gin Ala ser Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 55 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gl y Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 Gin Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp pro Pro Ser Gly Gly T rp Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 Gl y Thr Leu vai Thr vai Ser Ser 115 120 <21 0> 48

<211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48

Asp ile val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Ser Thr Vai Thr Leu Gly 15 10 15

Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser ser Gin ser Leu vai His Glu 20 25 50

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu His Gin Arg pro Gly Gin pro 55 40 45 165

Pro Arg Leu Leu ile Tyr Lys Ile 50 55 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gl y Ala 65 70 ser Arg val Gl u pro Gl u Asp val 85 Thr Arg Phe Pro Arg Thr Phe Gly 100 <210> 49 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Gin val Gl n Leu val Gin Ser Gly 1 5 Ser val Lys val Ser Cys Lys Ala 20 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gin Ala 35 40 Gly Arq lie Ile Pro Ile Leu Gly 50 55 Gin Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala 65 70 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85 Ala Thr Ser Arg Leu Glu Trp Leu 100 Gly Thr Leu val Thr val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens

Ser Lys Arg Phe ser Gly vai Pro 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 75 80

Gly vai Tyr Tyr cys Met Gin ser 90 95

Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 105 110

Ala Gl u val Lys Lys Pro Gly Ser 10 15 Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser His 25 30 Pro Gly Gl n Gly Leu Glu Trp Met 45 Ile Ala ASn Tyr Ala Gin Lys Phe 60 Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 75 80 Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 90 95 Leu Tyr Leu ASp Tyr Trp Gly Gin 105 110 16 6 <40 Λ O 50 Asn phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser vai Ser Gl u Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr vai lie Ile Pro Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Tyr vai Gin Trp Tyr Gin Lys Arg pro Gly Ser Ala Pro Ser Ile val 35 40 45 Ile Tyr Gl u Asp Lys Gin Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asn Ser 85 90 95 Arg Gly Vai Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110 <210> 51 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51

Gin val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu val Lys Lys pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser val Lys val ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Leu 50 55 60 Gin Gly Arg val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Al a Tyr 65 70 75 80 Met Gl u val Arg Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Gly Gly Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Ala Tyr Pro Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr val ser Ser 115 120 167 <210> 52

<211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 as η Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser val Leu Glu Ser Ala Gly Lys 1 5 10 15 Thr vai Thr Ile Ser cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Tyr val Gin Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Thr Ser Pro Thr Asn val 55 40 45 lie phe Glu Asp Asn Gin Arg Pro Ser Gly val pro ASP Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe cys Gin Ser Tyr Asp Ser 85 90 95 Asn Ile Trp val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 53 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapien; 5 <40 0> 53 Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly val val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 168

Gl y Met Hi S Trp vai Arg Gl n Al a pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 Ser Tyr ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp ! Ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Al a Lys Asn Ser l _eu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gl u Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp 100 105 110 Gly Gl n Gly Thr Leu Vai Thr vai Ser Ser 115 120 <21 .0> 54 <211> 11 1 <21 .2> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 54 Gin ser vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser vai Ser Ala Ala pro Gly Gin 1 5 10 15 Lys vai Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr vai Ser Trp Tyr Gin His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys ser Gly Thr ser Ala Ser Leu Ala Ile Ala Gly Leu Gin 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala ASp Tyr Tyr Cys Gin ser Tyr Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Ser Leu vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu 100 105 110 <21 .0> 55 <21 .1> 123 <21 .2> PRT <213> Homo sapiens 169 <400> 55

Gin vai Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala vai Tyr Gly Gly ser Phe ser Gly Tyr 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn phe Asn Pro ser Leu Lys 50 55 60

Ser Arg ile Thr Ile Ser vai Asp Thr Ser Asn Asn Gin Phe ser Leu 65 70 75 80

Lys Leu ser Ser vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Gly His Asp Trp Gly Met Gly Ile Gly Gly Ala Ala Tyr Asp Ile 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Met vai Thr vai ser ser 115 120

<210> 56 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56

Glu Ile vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser vai Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gl n Gin Lys Ala Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Thr ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Ala Asp Arg Phe Ser 50 55 60 170

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 <210> 57 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 57 Gin Val Gin Leu val Glu Ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala 20 Tyr Ala Met Thr T rp val Arg Gin 35 40 val Ser val lie Arg Ser Asn Gly 50 55 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg 65 70 Leu Gin Met Asn Gly Leu Arg Ala 85 Met Thr Asp Tyr Tyr Trp Gly Gin 100 <210> 58 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens val Glu lie Lys 105

Cys Gin Gin Tyr Asp Phe Ser Pro 90 95

Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Gly Phe Thr Phe Phe Ser Thr 25 30

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 45

Gly Thr Asp Tyr Ala Asp Phe val 60

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 90 95

Gly Thr Leu val Thr val Ser Ser 105 110 171 <400> 58 Asn Phe 1 Met Leu Thr Gin 5 Pro Thr Vai Thr Ile 20 Ser Cys Thr Tyr vai Gin 35 Trp Tyr Gin Gin ile Tyr 50 Glu Asp Asn Gin Arg 55 Gly Ser 65 ile Asp Ser Ser 70 ser Leu Lys Thr Glu Asp Glu 85 Ala Ser Thr Trp val 100 Phe Gly Gly <210> 59 <211> 123 <212> PRT <213> Homo . sapiens <400> 59 Glu val 1 Gin Leu Leu 5 Glu ser Ser Leu Arg Leu 20 Ser cys Ala Ala Met ser 35 Trp val Arg Gin Ser Ala 50 Ile Ser Gly Ser Gly 55 Lys Gly 65 Arg Phe Thr Ile 70 Ser Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Lys Glu Thr 100 Ile Ser Phe Trp Gly Gin 115 Gly Thr Leu val

His Ser vai Ser Glu Ser pro Gly Lys 10 15

Glv ser Gly Gly ser lie Ala Ser Asn 25 30

Arg Pro Gly Ser Ala Pro Thr Thr Vai 40 45 pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser 60

Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile ser Gly 75 80

Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser 90 95

Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu 105 110

Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 10 15 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30 Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 40 45 Gly Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser val Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Ala Glu Asp 90 Thr Ala val Tyr Tyr 95 Cys Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 105 110 Thr Val Ser Ser 172 <210> 60 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 60

Gin Ser Ala Leu Thr Gin Pro Ala Ser val Ser Gly Ser Pro Gly Gin 1 5 10 15 Ser lie Thr lie ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr vai Ser Trp Phe Gin Gin His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met lie Tyr Lys vai Asn Asn Arg Pro Ser Gly Leu Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gin Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Leu Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu 100 105 110 <210> 61 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 61

Gin val Gin Leu val Gin Ser Gly a1 a Glu val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser val Lys val ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp val Arg Gin Ala Thr Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 173

Gin Gly Arg vai Thr Met Thr Arg 65 70

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 85

Ala Lys Glu Ile Ala Vai Ala Gly 100

Gly Gin Gly Thr Thr vai Thr Vai 115 <210> 62 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 62

Asn Thr Ser II e Ser Thr Al a Tyr 75 80 Glu Asp Thr Al a vai Tyr Tyr Cys 90 95 Thr Arg Tyr Gl y Met Asp Vai Trp 105 110 Ser Ser

Glu Ile vai Leu Thr Gin ser Pro 1 5 Glu Arg Ala Thr Leu 20 Ser Cys Arg Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 50 55 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai 100

Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15

Ala Ser Gin ser ile ser Thr Phe 25 30

Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu ile 45

Gly Ile Pro Gly Arg Phe ser Gly 60

Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 75 80

Gin His Arg ile Asn Trp Pro Leu 90 95

Glu Ile Lys 105

<210> 63 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens 174 <40 0> 63 Gly Gin Pro Lys Ala Asn Pro Thr val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu val Cys Leu lie ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 vai Lys Ala Gly vai Glu Thr Thr Lys pro Ser Lys Gin ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Al a ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin τ rp Lys 65 70 75 80 ser His Arg ser Tyr Ser Cys Gin val Thr His Glu Gly Ser Thr val 85 90 95 Glu Lys Thr vai Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <21 0> 64 <21 1> 106 <21 2> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 64 Gly Gin pro Lys Ala Ala pro Ser val Thr Leu Phe pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala val Thr val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 vai Lys Al a Gly val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr vai Ala Pro Thr Gl u cys Ser 100 105 175 <210> 65 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65

Gly Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser vai Thr Leu Phe Pro Pro Ser ser 15 10 15

Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu vai Cys Leu ile Ser Asp 20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala vai Thr vai Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser pro 35 40 45

Vai Lys Ala Gly vai Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin ser Asn Asn 50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys 65 70 75 80 ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gin vai Thr His Glu Gly Ser Thr vai 85 90 95

Glu Lys Thr vai Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

<210> 66 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 6 6

Gly Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Vai Thr Leu Phe pro pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Gl u Leu Gl n Ala Asn Lys Ala Thr Leu Vai Cys Leu Vai Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala vai Thr Vai Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 vai Lys Vai Gly vai Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn 50 55 60 176

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr pro Glu Gin Trp Lys 65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr ser Cys Arg vai Thr His Glu Gly Ser Thr Vai 85 90 95

Glu Lys Thr vai Ala Pro Ala Glu Cys ser 100 105

<210> 67 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67

Arg Thr vai Ala Ala Pro Ser vai Phe lie Phe pro Pro ser Asp Glu 15 10 15

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser vai vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30

Tyr pro Arg Glu Ala Lys vai Gin Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60

Thr Tyr ser Leu ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80

Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser ser 85 90 95

Pro vai Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

<210> 68 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens 177 <400> 68

Ala 1 Ser Thr Lys Gly 5 Pro Ser Val Phe Pro 10 Leu Ala Pro Ser Ser 15 Lys Ser Thr ser Gly 20 Gly Thr Ala Ala Leu 25 Gly Cys Leu val Lys 30 ASp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr val ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly vai Hi S Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser ser Vai vai Thr Val Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Hi s Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr cys 130 135 140 vai vai vai ASp val ser Hi S Glu Asp pro GlU val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr vai Asp Gly val Glu val HIS Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val ser val Leu Thr val Leu 180 185 190 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro ser Asp ile Ala val Gl u Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu ASp Ser Asp Gly ser Phe Phe 275 280 285 178

Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 val Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu Hi5 Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gin Lys ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 69 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 6 9

Met Asp Met Arg val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys 20

<210> 70 <211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 70 gtggttgaga ggtgccagat gtcaggtcca gctggtgcag 40

<210> 71 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 71 attacgtctc acagttcgtt tgatctccac 30 179

<210> 72 <211> 48 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 72 ccgctcagct cctggggctc ctgctattgt ggttgãgãgg^cgccagat 48”

<210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73

Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5

<210> 74 <211> 54 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 74 cagcagaagc ttctagacca ccatggacat gagggtcccc gctcagctcc tggg 54

<210> 75 <211> 45 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 75 gtggttgaga ggtgccagat gtgacattgt gatgactcag tctcc 45 180 <210> 76 <211> 31

<212> ADN <213> Ηοιηο sapiens <400> 76 cttgtcgact tattaacact ctcccctgtt g 31

Lisboa, 11 de Julho de 2012 181

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo isolado compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, cuja referida região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 11 que tem não mais de cinco substituições de aminoácidos e cuja referida região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 12 que tem não mais de duas substituições de aminoácidos e em que o referido anticorpo se liga e inibe a angiopoietina-2 (Ang-2) e a angiopoietina-1 (Ang-1).
2. Anticorpo isolado da reivindicação 1, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.
3. Anticorpo isolado das reivindicações 1 ou 2, em que o referido anticorpo é totalmente humano.
4. Composição farmacêutica compreendendo o anticorpo isolado da reivindicação 3 e um agente de formulação farmaceuticamente aceitável.
5. Molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-3.
6. Vector compreendendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 5.
7. Célula hospedeira isolada contendo o vector de acordo com a reivindicação 6. 1
8. Conjugado compreendendo o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1-3.
9. Método de preparação de um anticorpo compreendendo: (a) transformar uma célula hospedeira com, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5; (b) expressar a molécula de ácido nucleico na célula hospedeira; e (c) isolar o anticorpo, em que a célula hospedeira não é uma célula humana.
10. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para utilização na inibição da angiogénese indeseja.
11. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para utilização no tratamento do cancro.
12. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para utilização na inibição da actividade da angiopoietina-2.
13. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para utilização no tratamento de, pelo menos, uma doença neovascular ocular, hemangioblastoma, hemangioma, doença inflamatória, distúrbios inflamatórios crónicos, endometriose, doença neoplásica, doença relacionada com os ossos ou psoriase. 2
14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 e um agente quimioterapêutico para utilização no tratamento do cancro. Lisboa, 11 de Julho de 2012 3