CN115925904B - 一种新冠病毒单克隆中和抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新冠病毒单克隆中和抗体及其应用，涉及生物技术领域；该新冠病毒单克隆中和抗体，轻链氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，重链氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明从康复者体内筛选人源单克隆抗体，用于新冠感染的治疗或相关检测产品的开发，筛选到的单克隆抗体W6经过体外测试，证明其对新冠RBD蛋白具结合作用，对新冠多种突变株假病毒具有中和活性，在新冠野生型活病毒检测同样具有中和活性。本发明的单克隆中和抗体为人源抗体，用于人类感染新冠治疗时可以降低免疫原性，单抗对多种假病毒具有中和活性，具有广谱中和的潜力，可应对新冠病毒的突变导致的感染。

Description

一种新冠病毒单克隆中和抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新冠病毒单克隆中和抗体及其应用。

背景技术

抗体作为新冠特异性治疗药物，已在新冠感染治疗中发挥了重要作用。当前新冠病毒已产生多种突变株，目前对于新冠突变株的治疗和检测均需要特异性单克隆抗体，尤其是用于新冠治疗需要抗体具有中和病毒的能力。

在大多数人体中，病毒感染会诱导机体产生中和抗体，从而清除体内的病毒。一般来说在无特效药的情况下，可以利用含有中和抗体的康复者恢复期血浆进行紧急救治。然而康复者恢复期血浆治疗有着明显不足：1)康复者数量少，获取到的血浆量少；2)自然感染状态下，血浆中和抗体滴度很低，难以提供足够的保护效果；3)血浆中物质较多，可能会产生一些严重的不良反应。利用全人源的单克隆中和抗体有望克服这些缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种新冠病毒单克隆中和抗体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的单克隆中和抗体，对新冠多种突变株假病毒具有中和活性，在新冠野生型活病毒检测同样具有中和活性，可用于新冠感染的治疗或相关检测产品的开发。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种新冠病毒单克隆中和抗体其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供一种编码上述的新冠病毒单克隆中和抗体的DNA分子，编码轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，编码重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种重组载体，包含上述的DNA分子。

本发明还提供一种重组细胞，包含上述的DNA分子或重组载体。

本发明还提供上述的新冠病毒单克隆中和抗体、DNA分子、重组载体或重组细胞在制备抗新冠病毒的药物中的应用。

本发明还提供一种抗新冠病毒的药物，包含上述的新冠病毒单克隆中和抗体、重组载体或重组细胞。

本发明还提供上述的新冠病毒单克隆中和抗体、DNA分子、重组载体或重组细胞在制备检测新冠病毒的产品中的应用。

本发明还提供一种检测新冠病毒的产品，包含上述的新冠病毒单克隆中和抗体、重组载体或重组细胞。

本发明公开了以下技术效果：

本发明从康复者体内筛选人源单克隆抗体，用于新冠感染的治疗或相关检测产品的开发，筛选到的单克隆抗体W6经过体外测试，证明其对新冠RBD蛋白具结合作用，对新冠多种突变株假病毒具有中和活性，在新冠野生型活病毒检测同样具有中和活性。本发明的单克隆中和抗体为人源抗体，用于人类感染新冠治疗时可以降低免疫原性，单抗对多种假病毒具有中和活性，具有广谱中和的潜力，可应对新冠病毒的突变导致的感染。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为SARS-CoV-2感染康复者血清对Spike蛋白结合活性检测；

图2为流式细胞术分选S/RBD特异性记忆B细胞；其中，A为活细胞圈门，B为B细胞圈门，C为可以分泌lgG抗体的记忆B细胞圈门，D为S蛋白抗原特异性记忆B细胞圈门；

图3为抗体表达上清对新冠S和RBD蛋白结合活性检测；

图4为抗体与新冠病毒RBD蛋白竞争结合ACE2检测；

图5为W6抗体对新冠WT、B.1.1.7和B.1.351RBD蛋白结合活性检测；

图6为SPR实验检测W6抗体对RBD蛋白结合强度；其中，A为W6对WTRBD突变株，B为W6对B.1.1.7RBD突变株，C为W6对B.1.351RBD突变株，D为W6对B.1.351RBDE484K突变株；

图7为W6抗体对多种新冠突变株假病毒中和活性检测；

图8为W6抗体对新冠活病毒中和活性检测。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1.方法

从多个新冠病毒感染康复者体内获得抗原特异性记忆B细胞。利用单B细胞克隆技术获得抗体基因，并将其构建到表达载体上。利用哺乳动物细胞表达***进行抗体表达，研究表达的抗体对抗原的结合活性和对病毒的中和活性。

(1)抗原特异性B细胞的分选

首先取新冠病毒感染康复者的恢复期的抗凝血，利用淋巴细胞分离液，分离出人的外周血单核细胞(PBMC)。将分离到的PBMC利用荧光标记抗体进行染色，通过B细胞表面MarkerCD3^-、CD20⁺、CD27⁺、IgG⁺分选出单个记忆B细胞，然后利用B细胞表面BCR可以与病毒抗原蛋白结合的原理分离抗原特异性记忆B细胞。

(2)单细胞PCR及抗体克隆表达：利用流式细胞术分选出的单个记忆B细胞，经过裂解提取总RNA，然后逆转录后形成cDNA。通过单细胞PCR技术，使用抗体家族混合引物扩增出抗体重、轻链可变区基因序列。扩增出的抗体重、轻链可变区基因通过同源重组构建到表达载体中，然后利用哺乳动物细胞进行抗体的表达。

利用RT-PCR从单个B细胞中分离抗体可变区基因：

采用Promega公司生产的逆转录试剂盒配置细胞裂解液，分装至96孔板后，将细胞离心，加入反转试剂后反转成cDNA，反转录完成后置于-80℃冻存；

利用人抗体基因特异性引物通过巢式PCR，以B细胞cDNA为模板，扩增抗体的重、轻链可变区基因，50μL体系中含有5μL cDNA、HotStarTaq Plus酶、dNTPs、和0.5μM特异性引物，按以下条件进行PCR扩增：预变性94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，35个循环；72℃ 7min；获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

回收目的片段，送样测序，测序结果与IMGT数据库(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)进行比对，得到抗体可变区基因片段。

构建单克隆抗体的表达载体：

利用同源重组引物分别在抗体重链可变区基因的两端和轻可变区基因的两端加入同源重组臂，使用双酶将含有人抗体重、轻链IgG1恒定区的表达质粒线性化，产生同源重组臂；将加入同源重组臂的可变区基因片段和线性化的质粒通过同源重组的方式连接起来，构成完整的表达载体，将重组产物转化进TOP10大肠杆菌感受态中，扩增质粒。

单克隆抗体的表达与纯化：

将上述得到的单克隆抗体重、轻链表达质粒按照1:1比例加入到Opti-Mem转染培养基中，充分混合后加入DNA4倍质量的转染试剂PEI，混合后，室温避光放置30min，随后加入到293T细胞中；

孵育6h后去除转染体系，加入FreeStyle^TM293表达培养基，使用AKTA蛋白纯化***，采用亲和纯化(Protein A)的方法纯化表达的抗体上清，得到单克隆抗体，具体步骤为：

1)将表达的抗体上清以2500×g室温离心10min，去除沉淀物；

2)将装有Protein A的亲和纯化柱用10倍体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分流洗；

3)将表达上清以5mL/min的流速通过纯化柱；

4)使用20倍纯化柱体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分洗涤纯化柱；

5)用0.1M pH＝3.0-3.5的柠檬酸缓冲液洗脱纯化柱，直至洗脱峰降至平衡状态，用1M pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH为7.0；

6)使用浓缩离心柱浓缩纯化后的单克隆抗体，用PBS作为抗体保存的缓冲液，最后用BSA蛋白浓度检测方法测定浓缩后的抗体浓度。

(3)抗体功能验证：表达出的抗体利用ELISA实验验证其对病毒抗原的结合活性。然后利用假病毒报告***和新冠病毒进行抗体中和活性的验证。利用悬浮细胞表达***进行抗体的大量表达，通过AKTA蛋白纯化***进行抗体的纯化。获得高纯度的抗体后，通过定量检测抗体对抗原结合的EC50和对病毒中和的IC50。

2.结果

(1)通过对病毒感染康复者血清灭活后，利用ELISA实验检测其对S蛋白的结合活性，结果显示11位康复者体内产生了对新冠S蛋白的结合抗体，其中有6位康复者的血清效价较高。结果如图1。

(2)采集感染康复者外周血，分离PBMC。利用细胞表面Marker CD3^-、CD20⁺、CD27⁺、IgG⁺分选出记忆B细胞；利用S/RBD His+分选出抗原特异性记忆B细胞(图2)。

(3)分选出的记忆B细胞利用单细胞PCR技术扩增出抗体可变区基因。将抗体可变区基因克隆到抗体表达载体上。利用293细胞系进行抗体的分泌表达。对抗体表达上清通过ELISA实验结果表明，有7株抗体表达上清对新冠病毒RBD与Spike都具有结合活性(图3)。

(4)通过ELISA竞争实验对筛选到的抗体与新冠RBD蛋白竞争结合受体ACE2能力检测。结果显示，W6抗体可以与新冠病毒RBD蛋白竞争结合ACE2(图4)。

(5)对W6抗体进行大量表达纯化后，利用ELISA实验检测W6抗体对新冠野生型，英国(B.1.1.7，N501Y)和南非(B.1.351，K417N，E484K，N501Y)突变株RBD检测，W6 EC50(206.4ng/mL，203.9ng/mL，200ng/mL)。结果见图5。

(6)利用SPR实验抗体W6对WT RBD、B.1.1.7 RBD、B.1.351 RBD、B.1.351 RBDE484K突变株结果表明，W6对B.1.7突变株RBD结合活性增强1.5-2.6倍，尤其是对于B.1.351突变株E484K位点突变的RBD蛋白结合能力最强(图6)。

(7)抗体W6对多种突变株假病毒具有中和活性，IC50分别是0.35、3.4、2.2、2.6、11.1μg/mL，表明W6抗体具有一定的广谱中和活性(图7)。

(8)将纯化后的抗体梯度稀释后加入到1000PFU活病毒共孵育，然后加入到易感细胞中。结果表明抗体W6对活病毒的中和IC50为0.003mg/mL，具有很好的中和活性，尤其是W6抗体对野生型活病毒具有完全的中和效果(图8)。

W6抗体的轻、重链可变区氨基酸与核酸序列：

轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.1)为：

NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTGSSGSIASNYVQWYQQRPGSAPTTVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSYDSSNWVFGGGTKLTVL；

重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.2)为：

EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGQLGPWVGVDYWGQGTLVTVSS；

轻链可变区核酸序列(SEQ ID NO.3)为：

aattttatgctgactcagccccactctgtgtcggagtctccggggaagacggtaaccatctcctgcaccggcagcagtggcagcattgccagcaactatgtgcagtggtaccagcagcgcccgggcagtgcccccaccactgtgatctatgaggataaccaaagaccctctggggtccctgatcggttctctggctccatcgacagctcctccaactctgcctccctcaccatctctggactgaagactgaggacgaggctgactactactgtcagtcttatgatagcagcaattgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctag；

重链可变区核酸序列(SEQ ID NO.4)为：

gaggtgcagctggtgcagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagtagctattggatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtggccaacataaagcaagatggaagtgagaaatactatgtggactctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggtcagctcggcccttgggtgggtgttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcag。

本发明获得的新冠中和抗体，其用途为新冠感染的治疗及其相关检测产品的开发。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种新冠病毒单克隆中和抗体，其特征在于，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码如权利要求1所述的新冠病毒单克隆中和抗体的DNA分子，其特征在于，编码轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，编码重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的DNA分子。

4.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的重组载体。

5.一种如权利要求1所述的新冠病毒单克隆中和抗体、权利要求2所述的DNA分子、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组细胞在制备抗新冠病毒的药物中的应用。

6.一种抗新冠病毒的药物，其特征在于，包含权利要求1所述的新冠病毒单克隆中和抗体。

7.一种如权利要求1所述的新冠病毒单克隆中和抗体、权利要求2所述的DNA分子、权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的重组细胞在制备检测新冠病毒的产品中的应用。

8.一种检测新冠病毒的产品，其特征在于，包含权利要求1所述的新冠病毒单克隆中和抗体。

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