CN103333247B - 新型抗vegfr2的单克隆抗体及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用噬菌体抗体库技术筛选并利用基因工程方法制备的新型抗VEGFR2的单克隆抗体或其片段，并公开了包含编码该单克隆抗体或其片段的多核苷酸的载体、宿主细胞、制备和纯化的方法及用途。该单克隆抗体或其片段用于制备治疗由肿瘤新生血管生成引起的疾病中的用途；所述的疾病包括但不局限于下列肿瘤：非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性胃腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌。

Description

新型抗VEGFR2的单克隆抗体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种新型的抗VEGFR2的单克隆抗体及其制备与用途，属于生物工程技术领域。

背景技术

血管生成是指已存的血管(毛细血管和小静脉)通过出芽或***的方式产生新的血管，生理与病理条件下，如胚胎发生，女性生殖周期，炎症反应，伤口愈合，肿瘤发生等过程都进行着血管生成。1971年，Folkman首先建立了血管生成和肿瘤生长之间的联系，发现许多肿瘤如果不进行血管生成，只能长到几毫米大小，若抑制血管生成，肿瘤细胞虽仍在高速增殖，但同时进行着快速的细胞凋亡，新生血管处于刺激剂与拮抗剂的平衡之中。抑制肿瘤血管生成，可抑制肿瘤的生成与转移，这在许多临床试验中得到证实。抗肿瘤血管生成疗法(tumor anti-angiogenesis therapy)比较其它肿瘤治疗方法有许多优势，如很少产生耐药性，副作用小，效率高。

抑制肿瘤血管生成的较好靶位点是肿瘤内皮细胞，通过封闭其表面的促血管生成因子的受体，诱导内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞的生长迁移，可高效地破坏新生血管形成。血管内皮生长因子(VEGF)是已知最重要的血管生成因子，是内皮细胞高度特异的促有丝***原和促血管通透性因子。已被鉴定的相应受体为VEGFR-1(Flt-1，fms样酪氨酸激酶)，VEGFR-2(又称为KDR/Flk-1，激酶***嵌合受体、胎肝激酶-1)，VEGFR-3(Flt-4)，神经纤维蛋白-1(neuropilin-1)，神经纤维蛋白-2。VEGFR2是血管内皮细胞上的主要VEGF受体，为糖蛋白，胞外区含有七个免疫球蛋白样区(含配体结合域和受体二聚化结构域)，胞内***了酪氨酸激酶催化结构域，主要在内皮细胞上表达，其它如巨核细胞、视网膜远祖细胞、间充质干细胞，一些肿瘤细胞如黑色素瘤细胞、脑瘤和某些白血病细胞等。VEGF和VEGFR2受体作为关键的血管内皮细胞特异因子信号传导途径分子参与肿瘤新生血管的建成。VEGF的主要生物学功能都是通过VEGFR2实现的。VEGFR2和VEGF结合后发生二聚体化，并且胞内的酪氨酸残基自身磷酸化，从而激活并将细胞膜/细胞质激酶级联反应信号传递到细胞核。可引发内皮细胞的一系列变化，包括血管内皮细胞增殖、存活、细胞骨架重排、细胞迁移以及基因表达等，并最终引起血管增生。通过封闭此信号途径的抗体，小分子化合物已经找到很多，临床试验表现了良好的治疗效果。

噬菌体抗体库技术是在噬菌体展示基础上发展起来的，是迄今为止发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。使用该技术已经陆续构建成功免疫抗体库、大然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库，也用于筛选出高特异的功能性抗体和改进抗体的品质。噬菌体表面展示是一种基因表达筛选技术，即将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面。这样外源蛋白或多肽的基因型和表现型统一在同一噬菌体颗粒内，通过表型筛选就可以获得其编码基因。经研究发现，外源蛋白在P3和P8蛋白的N末端融合表达不会影响噬菌体的完整性和活性。按照展示在噬菌体颗粒表面的抗体片段种类的不同，噬菌体抗体库主要有scFv抗体库和Fab抗体库两种。Fab抗体仅包括VHCH1和VK CK(或VL CL)，scFv是抗体的VH和VK(或VL)通过linker连接成的小分子抗体。Fab和scFv分子小，结构简单，易于穿过组织，表达效率高，有利于肿瘤等疾病的治疗。但这两种形式也分别具有各自的特点，Fab含有两条链，具有难组装、产量低的缺点；scFv的主要问题是易于形成二聚体，但是较易合成，耐受性好。

建立噬菌体抗体库的目的是为了有效的获得针对各种抗原的人源抗体。噬菌体抗体库技术的最大优点是直接将表达型与其基因型联系在一起，再利用其配体的特异性亲和力，将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来，主要包括以下几个方面：

1)该技术不经免疫，绕过杂交瘤技术，省时省力，省去了细胞融合的步骤，避免了因杂交瘤不稳定而需要反复亚克隆的繁琐程序。

2)扩大了筛选容量，用杂交瘤技术一般筛选能力在上千个克隆以内，而抗体库可筛选10⁶以上个克隆。

3)抗体库技术直接克隆到抗体的基因，既免去了杂交瘤分泌抗体不稳定之虞，又便于进一步构建各种类型的基因工程抗体，抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。

4)对于一些难于制备的抗体，如针对弱免疫原、毒性抗原的抗体，人源抗体等的制备可以得到解决。

5)该技术可直接改善抗体的性能：通过体外模拟体内抗体亲和力成熟的过程，获得高亲和力的抗体；还可根据需要加入不同的标签或者通过构建小分子抗体如单链抗体、双特异性抗体以及抗体融合蛋白用于检测分析和导向治疗等不同的要求。

抗体库的筛选方法可分为：(1)液相抗原的筛选，可较好地保持抗原的天然构象；(2)完整细胞的筛选，适用于难以纯化的或未知的抗原，但此法细胞膜成分复杂，难度较大；(3)组织筛选，用于一些难以获得单个细胞的组织进行特异性抗体的筛选。噬菌体抗体库的筛选包括淘选和鉴定。淘选即将抗体库与选择的抗原共同孵育，经过“亲和-吸附-洗脱-扩增”的步骤筛选出目的抗体。一般需要3～4轮的淘选，才能得到优质抗体。鉴定包括ELISA鉴定、mirrorball鉴定。

噬菌体抗体库技术的建立是基因工程抗体研究领域的一次重大突破，为重组抗体在设计、筛选及生产等方面的不断革新及改进提供了高效可靠的方法，极大地推动了重组抗体在科研、临床诊断及治疗等方面的应用。通过噬菌体抗体库技术筛选出来的这类抗体已广泛应用于临床，如阿达木单抗(humira)为英国Cambridge Antibody Technology(CAT)与美国雅培公司联合研制的抗人肿瘤坏死因子(TNF)的人源化单克隆抗体，2003年1月首次在美国上市，随后相继在德国、英国和爱尔兰获准上市，用于缓解抗风湿性药物(DMARD)治疗无效的结构性损伤的中至重度类风湿性关节炎(RA)成年患者的体征与症状。2011年3月美国FDA批准了人类基因组科学公司(Human Genome Sciences，HGS)和葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline，GSK)联合开发的全人源单克隆抗体belimumab(商品名Benlysta)，用于***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis，SLE)的治疗。

本发明是利用上述噬菌体展示抗体库的技术和高通量筛选的方法，筛选出高亲和力的针对VEGFR-2(KDR)的全人源抗体，此抗体可应用于由肿瘤新生血管生成导致的疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型抗VEGFR2的单克隆抗体或其片段，编码该单克隆抗体或其片段的多核苷酸的载体、宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及临床应用。由本发明涉及的抗体基因可变区的序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于临床上由于肿瘤新生血管生成所导致的适应症的使用。这些适应症包括但不局限于下列肿瘤：非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、神经胶质瘤、结直肠癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性胃腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌。

本发明是利用噬菌体展示抗体库的技术筛选出高亲和力的针对VEGFR-2(KDR)的抗体。首先建立噬菌体抗体库，通过固相抗原结合淘洗、MIRRORBALL鉴定，最终筛选出6个单克隆抗体，这6个单克隆均表现出较高的抗体亲和力，能够体外抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞增殖，具有很好的生化和生物学活性。

筛选出的6个抗VEGFR2抗体的重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6所示；轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12所示，具体如下：

SEQ ID NO1：

QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGGYYDSSGYYRSGYWYFDLWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO2：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMESLRADDTAVYYCARDLSWNYDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO3：

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASAFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDLWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO4：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLGGTNWYFDLWGRGTLVTVSS

SEQ ID NO5：

QVQLVQSGGGVVQTGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDHSSGWNLDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO6：

QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGWGGYGDYLDAFDIWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO7：

ETTLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISKWLAWYQQRPGKVPRLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQASVFPVTFGGGTKVDIK

SEQ ID NO8：

EIVLTQSPSILSASVGDRVTITCRASQSISTLLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLQSGVSSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFASYFCQQASVFPVTFGGGTKVDIK

SEQ ID NO9：

DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYEASNLDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDI

SEQ ID NO10：

ETTLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISKWLAWYQQRPGKVPRLLIYSASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQASVFPVTFGGGTKVDIK

SEQ ID NO11：

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGRAPKLLIYGASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYFCQQAHSFPPTFGGGTKVEIK

SEQ ID NO12：

DIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSSYPLTFGQGTKVDIK

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种新型的抗VEGFR2的单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段的重链可变区具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6所示的氨基酸序列；

本发明同时提供了一种新型的抗VEGFR2的单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段的轻链可变区具有SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12所示的氨基酸序列；

本发明同时提供了一种新型的抗VEGFR2的单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体或其片段的蛋白序列如下所示：

a)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

b)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

c)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；

d)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；

e)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；

f)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

本发明所述的单克隆抗体包括可变区和恒定区，所述的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种，优选为人IgG1。

本发明所述的单克隆抗体片段包括单链抗体(scFv)、Fab、Fab’、(Fab’)₂、scfv-FC的形式。

本发明所述的单克隆抗体或其片段是全人源的。

本发明提供了包含编码所述单克隆抗体或其片段的DNA分子的载体，所述的载体是pSNEO或pFUSEIgG1 FC。

本发明提供了一种转染上述载体的宿主细胞；所述的宿主细胞为CHO细胞。

本发明提供了所述单克隆抗体或其片段的方法，该方法为使用编码所述单克隆抗体或其片段的DNA表达载体转染宿主细胞，获得含有所述单克隆抗体或其片段的细胞培养上清液，并经纯化制备目的蛋白。

本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有作为活性成分的单克隆抗体或其片段以及一种或几种药学上可接受的缓冲剂或表面活性剂。

缓冲剂成分包括能调节pH的任何生理可用物质，例如柠檬酸盐、醋酸盐。组氨酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐及各自的酸或混合物。通常使用的缓冲剂成分是柠檬酸盐和/或其游离酸。

表面活性剂是可以在药物组合物中用作表面活性剂的任何赋形剂，如聚乙烯山梨聚糖酯类(Tweens)等。

所述的药物组合物通过注射剂的方式施用；所述的注射剂通过腹膜内注射、皮下注射和静脉注射的方式施用。本发明提供了所述单克隆或其片段用于制备治疗由肿瘤新生血管生成引起的疾病，具体包括但不局限于下列肿瘤：非小细胞肺癌，转移性非小细胞肺癌，神经胶质瘤，结直肠癌，肝细胞癌，转移性肝细胞癌，HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性胃腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌。

附图说明

图1为ELISA检测噬菌体多克隆抗体结合VEGFR2

图2为AKTA纯化来自抗体基因转染细胞的培养上清示意图

图3为SDS-PAGE鉴定一步亲和柱层析纯化的抗体

图4为抗体结合靶点特异性ELISA分析

图5为抗体亲和力和动力学参数分析传感图

图6为展示抗体可抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖

具体实施方式

本发明的实施方案通过下列实施例举例说明。然而，应当理解，本发明的实施方案不限于这些实施例的特定细节，因为对于本领域的普通技术人员来说，其他的变化是已知的，或根据直接公开的内容和附属的权利要求是显而易见的。因此，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本文引用的参考文献以其全文通过引用并入本文。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、抗体库的构建与筛选分离

1、抗体库的构建

本发明中所用单链抗体库是人的天然抗体库，其主要构建流程是：

(1)从外周血或脾、***等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并反转录为cDNA；

(2)根据已有的抗体基因序列库(如Kabat database，V-base，IMGT等)设计抗体重链和轻链引物序列(重链引物序列如表1所示；轻链引物序列如表2所示)，通过PCR技术扩增不同的VH和VK基因片段，通过linker区拼接成全长scFv单链抗体；

表1、扩增重链可变区VH的引物

K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T

表2、扩增轻链可变区VK，VL的引物

K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，S＝G/C，W＝A/T

(3)将单链抗体scFv连接到噬菌体载体上；

(4)表达载体电击转化TG1宿主菌，得到库容量为5.8×10⁹的全套抗体库，通过扩增纯化得到噬菌体展示抗体库的滴度为3×10¹¹CFU/mL；

(5)通过测序分析检验噬菌体展示抗体库的多样性和正确率。

2、抗体库的筛选分离

(1)噬菌体抗体库的富集筛选：以VEGFR2为抗原包被免疫孔，采用2％的M-PBS封闭。向免疫管中加入10¹¹的噬菌体抗体库进行抗体抗原结合，PBS(吐温20)洗去未结合的噬菌体。100mM三乙胺(TEA)洗脱抗体，将洗脱下来的抗体重新感染TG1细胞，进行洗脱产物的扩增，PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选，抗原量依此降低，洗涤强度依此增强，第三轮的洗脱产物测滴度。

(2)多克隆ELISA检测：以VEGFR2为抗原包被ELISA板，将每轮富集后的噬菌体库分别稀释到10⁹cfu/ml，然后加入ELISA板进行孵育。洗板后，加入anti-fd monoclonal antibody/HRP(抗-fd单抗/辣根过氧化酶)进行孵育，TMB(四甲基联苯胺)显色试剂盒显色。结果如图1所示，表明与特异抗原结合的多克隆抗体得到不断地富集。

(3)单克隆噬菌体鉴定

第三轮的洗脱产物测滴度，挑99个单克隆制噬菌体做mirrorball检测，将链霉亲和素化微珠(购自Invitrogen公司)、生物素化VEGFR2、单克隆噬菌体上清、兔抗FD噬菌体抗体(购自Jackson公司)、羊抗兔-FITC二抗(购自Jackson公司)加进384孔板，孵育过夜读数，结果显示阳性53个，弱阳性20个，阴性26个。测定了38个抗体序列，得到6个独特单克隆抗体，可变区序列分别如SEQ ID NO：1-12所示。

实施例2、抗体的克隆与表达

1、抗体的克隆与转染

将筛选的可变区序列为SEQ ID NO：1-12所组成的单链抗体采用常规基因克隆的方法，克隆到FC融合真核表达载体pFUSEIgG1FC或pSNEO表达全长抗体的载体中。通过酶切和测序的方法鉴定抗体基因的正确***，然后进行转染和抗体分泌表达。

转染前一天，消化后将1×10⁵/mL细胞密度的293细胞接种于6孔板中，培养过夜，至50-80％汇集度最佳。培养基放入37℃水浴中孵育30min，2个eppendorf试管中各加入200μL无血清培养基，分别加入1-2ug DNA和2μl或4ul PEI(聚乙烯亚胺聚合物)工作液(DNA/PEI＝1∶2)，混匀室温孵育5min，将PEI稀释液快速加入DNA稀释液中，立即涡旋15sec，室温孵育30min到1h(无浑浊)，轻轻弃细胞培养液(尽量保留细胞)，加入700μL培养基，将PEI、DNA混合液快速/逐滴、轻柔地沿壁加入细胞中，培养4-6h，换成2mL的新鲜的培养基，培养48h，取少量上清做ELISA，检测转染效率，剩下继续培养2-4天。

2、抗体表达细胞株的构建和表达

可使用谷氨酰胺合成酶GS表达***或者二氢叶酸还原酶DHFR表达体系。构建细胞株的方法如下：

采用经典的脂质体(Lipofectamine2000)转染方法将目的质粒转入到CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞，Chinese Hamser Ovary)中。培养基为无蛋白无血清无动物成分，培养条件是36-38℃，8-10％CO₂的潮湿无菌环境。转染24小时后，细胞接种到96孔板、不含谷氨酰胺但含有50微摩尔浓度MSX(L-蛋氨酸亚砜胺)的CD-CHO培养基中。每四天更换一次培养基。通过14天的培养和筛选，活细胞长成显微镜可见的克隆。转移48个克隆到24孔板中继续培养8天。使用FC ELISA的方法测定克隆的PCD(pg/cell/day)；选取PCD最好的8个克隆继续放大到30毫升中培养并测定PCD。其中最好的4个克隆进一步稀释成为单细胞选取亚克隆。大概21天后，测定第二轮筛选亚克隆的PCD。最高PCD的3个克隆作为候选细胞株建立细胞库。

3、抗体的纯化和SDS-PAGE分析：

通过细胞转染或培养稳定表达抗体的细胞系，其培养上清含有需要的全抗体或抗体融合蛋白。采用GE公司的蛋白A亲和层析柱，可特异地分离出需要的蛋白，如图2所示。取纯化后的蛋白，采用还原条件的SDS-PAGE方法，分析纯化产物，鉴定了抗体的性质和纯度，还原条件下重链为50KD，轻链为25KD，结果如图3所示。

实施例3、抗体的生化和生物学功能的鉴定

1、抗体的结合特异性检测

采用下面描述的ELISA方法测定抗体的结合特异性。用包被缓冲液分别稀释VEGFR2或其它重组蛋白至终浓度1μg/ml，100μl/孔，4℃孵育过夜。弃掉包被液，用PBS满孔洗涤3次，在干净纸巾上拍干。加封闭液不少于300μL/孔，37℃保温2h。弃掉封闭液，用PBST(磷酸盐缓冲液，0.05％的吐温)满孔洗涤3次。取转染48h的细胞上清液300μL，1000r/pm，离心5min，取上清100μL/孔。37℃孵育1h。弃掉样品液，用PBST清洗3次。用封闭液稀释检测抗体，稀释比例为1∶50000，100μL/孔，37℃孵育1h。弃液，用PBST满孔洗涤3次。加入TMB底物显色试剂，100μL/孔，室温避光反应15min。2M H₂SO₄终止反应，50μL/孔。酶标仪中450nm处读取OD数值，结果如图4所示，分离的抗体结合VEGFR2，但不结合其它重组蛋白如VEGF、VEGFR1、EGFR、HER2、TNFR1、GP120。

2、抗体的亲和力检测

使用Biacore X100PLUS测定scfv-FC抗体的亲和力。具体方法如下：使用GE公司的人抗体捕获试剂盒将抗人的抗体偶联到CM5芯片上，测定待测抗体的RU响应值，根据结果确定合适的抗体浓度，通常在100-200RU为宜。然后测试抗原VEGFR2的浓度，确定抗原浓度范围和接触时间。最后使用kinetics/affinity方法，测定测试抗体的动力学参数和亲和力。图5是测定一个抗体的传感图，分析得出此抗体与VEGFR2的Ka值是1.6×10⁵，Kd值是8.3×10^-5，抗体具有很好的亲和力，KD值是4.9×10^-10。

3、抗体的细胞抑制活性

筛选的抗体与HUVEC(人脐静脉内皮细胞)细胞株表面受体VEGF-R2结合，使得VEGF不能结合到VEGFR2上，从而抑制VEGF诱导的HUVEC细胞的增殖，通过CCK-8试剂盒(购自日本同仁化学研究所)检测HUVEC的增殖抑制。

取对数生长期的HUVEC细胞，胰蛋白酶消化后，以含1％FBS的ECM培养基重悬细胞，调整细胞浓度至5×10⁴个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔90μL，以含1％FBS的ECM培养基预稀释scfv-FC抗体至0.3uM/mL，对比稀释，每孔10uL，37℃，5％CO₂条件下培养12h，用含0.5％FBS的ECM培养基配制浓度为5ug/mL的rhVEGF165溶液，每孔1uL，混匀。继续孵育4天，每孔10uLCCK-8，4h后用酶标仪450nm检测。图6是一个典型抗体的抑制VEGF刺激的HUVEC细胞增殖活性结果，IC₅₀约为22nM。

Claims (11)

1.一种新型的抗VEGFR2的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其片段的蛋白序列如下所示：

a)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

b)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；

c)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；

d)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；

e)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；

f)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述的单克隆抗体包括可变区和恒定区，所述的恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的任意一种。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述的单克隆抗体的恒定区为人IgG1。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述的单克隆抗体的片段为单链抗体(scFv)、Fab、Fab′、(Fab′)₂、scfv-FC。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其片段是全人源的。

6.一种表达载体，所述载体包含编码权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体或其片段的DNA分子，所述的载体是pSNEO或pFUSEIgG1FC。

7.一种宿主细胞，所述的宿主细胞经由权利要求6所述的载体转染而来，所述的宿主细胞为CHO细胞。

8.一种制备权利要求1-5任一项所述单克隆抗体或其片段的方法，所述方法为使用编码权利要求1-5任一项所述单克隆抗体或其片段的DNA表达载体转染宿主细胞，获得含有所述单克隆抗体或其片段的细胞培养上清液，并经纯化制备目的蛋白。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或其片段以及一种或几种药学上可接受的缓冲剂或表面活性剂。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物通过注射剂的方式施用；所述的注射剂通过腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射和静脉注射的方式施用。

11.权利要求1-5中任一项的单克隆抗体或其片段用于制备治疗由肿瘤新生血管生成引起的疾病的药物的用途；所述的疾病为：非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性胃腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌。