CN111372950A - Vegfr-抗体轻链融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了抗体融合蛋白，其包含与抗体轻链的C‑末端融合的血管内皮生长因子受体(VEGFR)。还提供了制备和使用这些抗体融合蛋白的方法。

Description

VEGFR-抗体轻链融合蛋白
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2017年10月12日提交的美国专利申请62/571,773的优先权权益，该申请的内容全文以引用方式并入本文。
提交序列表的ASCII文本文件
将以下以ASCII文本文件提交的内容全文以引用方式并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：754392000240SEQLIST.TXT，记录日期：2018年9月24日，大小：105KB)。
技术领域
本发明涉及包含与抗体轻链的C-末端融合的血管内皮生长因子受体(VEGFR)组分的抗体融合蛋白，以及它们的制备和使用方法。
背景技术
血管内皮生长因子(VEGF)在血管生成中起到重要作用。VEGF与其在血管内皮细胞上表达的酪氨酸激酶受体(VEGFR)的结合触发了参与血管内皮细胞增殖和新生血管生长的细胞反应。然而，VEGF的过表达导致疾病。肿瘤组织趋于具有较高的VEGF表达水平，这刺激肿瘤血管生成以为生长的实体肿瘤提供营养。血管生成还允许肿瘤与宿主的血管床接触，这可提供肿瘤细胞转移的途径。VEGF的过表达还可导致非肿瘤性病症，诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管瘤、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、慢性炎症和眼部新生血管障碍(例如，糖尿病性视网膜病、晶体后纤维增生症、新生血管性青光眼和年龄相关性黄斑变性(AMD))。因此，用于有效***性肿瘤和非肿瘤性障碍(诸如眼部新生血管障碍)的一种可能的机制是抑制或基本上降低VEGF蛋白的内皮增生和血管生成活性。
配体与其受体之间的相互作用通常具有高亲和力，从而达到纳摩尔至皮摩尔的范围。受体的细胞外结构域(ECD)或ECD的功能部分已成功用作“配体陷阱”以用于治疗目的(Claesson-Welsh L.,Nat Med.2008年11月；14(11)：1147-1148；Wiesmann C.等人，Cell.1997年11月28日；91(5):695-704；Harding TC等人，Sci Transl Med.2013年3月27日；5(178):178ra39)。
已经开发了包含VEGFR组分的重组融合蛋白来治疗与VEGF表达相关联的疾病，诸如癌症和AMD。这些融合蛋白通过将VEGFR片段与免疫球蛋白Fc片段的N-末端或免疫球蛋白Fc片段的一部分融合来产生，并且被认为是“VEGF陷阱”。参见，例如US6100071、US7087411和US7521049。VEGFR片段将与内源性VEGF结合并且灭活内源性VEGF，从而提供用于降低或抑制内源性VEGF活性，并且继而降低或抑制内皮细胞增殖和血管生成的手段。VEGF陷阱(阿柏西普(Aflibercept))可以比贝伐单抗(VEGF中和抗体，50pM)更高的亲和力(0.5pM)捕获VEGF。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和公布的专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入本文。
发明内容
本发明涉及抗体融合蛋白，其包含与抗体轻链的C-末端(诸如，抗体轻链恒定结构域(CL结构域)的C-末端)融合的VEGFR组分，及其制备和使用方法。
本申请的一个方面提供抗体融合蛋白，其包含：1)包含轻链的抗体，和2)VEGFR组分，其中所述VEGFR组分与抗体轻链的C-末端(诸如抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，VEGFR组分包含第一VEGFRFlt1的免疫球蛋白样(Ig-样)结构域2(Flt1d2)。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含第二VEGFR Flk1的Ig-样结构域3(Flk1d3)。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含第三VEGFR Flk1的Ig-样结构域4(Flk1d4)。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10- 12M、约10-10M至约10-12M)。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头连接。在一些实施方案中，接头为肽接头，诸如包含SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列的肽接头。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgG-来源分子、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab-scFv、F(ab’)2-scFv2、Fab-scFv-Fc、对接和锁定(Dock and Lock)、scFv、二-scFv、双体抗体、双体抗体-Fc、双体抗体-CH3、和细胞内抗体。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定结构域(CL结构域)、并且VEGFR组分与抗体CL结构域的C-末端(例如抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体，诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，所述抗体是单特异性的。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，所述抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，所述抗体特异性识别免疫检查点分子。在一些实施方案中，免疫检查点分子是刺激性免疫检查点分子。在一些实施方案中，免疫检查点分子是抑制性免疫检查点分子。在一些实施方案中，所述抑制性免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CD47、CXCR4、CSF1R、LAG-3、TIM-3、HHLA2、BTLA、CTLA-4、TIGIT、VISTA、B7-H4、CD160、2B4和CD73。在一些实施方案中，抑制性免疫检查点分子为PD-1。在一些实施方案中，所述抗体包括：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链的重链-CDR1(HC-CDR1)、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的轻链-CDR1(LC-CDR1)、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000041
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000042
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，抑制性免疫检查点分子为PD-L1。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000043
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为德瓦鲁单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000044
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，抑制性免疫检查点分子为CTLA-4。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000051
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，所述抗体特异性识别肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原为HER2。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000052
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:26、27或28的氨基酸序列。在一些实施方案中，肿瘤抗原为EGFR(HER1)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为西妥昔单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000053
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQID NO:31的氨基酸序列。
在根据上述抗体融合蛋白中任一者的一些实施方案中，所述抗体特异性识别血管生成因子。在一些实施方案中，血管生成因子为血管生成素-2(Ang2)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为尼伐单抗(Nesvacumab)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为TNFα。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000061
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为IL-17α。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000062
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
还提供了药物组合物，其包含上述抗体融合蛋白中的任一种和任选的药学上可接受的载体。
本申请的另一方面提供了一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的上述药物组合物或抗体融合蛋白中的任一种。在一些实施方案中，癌症为实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症为肺癌、肝癌、皮肤癌(例如，黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、***癌、结直肠癌或膀胱癌。在一些实施方案中，该方法还包括使个体经受附加的癌症治疗。在一些实施方案中，药物组合物或抗体融合蛋白全身施用，诸如静脉内施用(i.v.)。在一些实施方案中，药物组合物或抗体融合蛋白局部施用，诸如肿瘤内施用。在一些实施方案中，所述个体为人。
本申请的另一方面提供了一种治疗患有非肿瘤性障碍的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的上述药物组合物或抗体融合蛋白中的任一种。在一些实施方案中，非肿瘤性障碍与VEGF过表达相关联。在一些实施方案中，非肿瘤性障碍选自类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管瘤、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、慢性炎症或和眼部新生血管障碍。在一些实施方案中，药物组合物全身施用，诸如静脉内施用(i.v.)。在一些实施方案中，非肿瘤性障碍为眼部新生血管障碍，诸如AMD或糖尿病性视网膜病。在一些实施方案中，眼部新生血管障碍与脉络膜新生血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿相关联。在一些实施方案中，药物组合物或抗体融合蛋白的施用选自滴眼液、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球筋膜囊下注射和眼球筋膜囊下植入中的一种，诸如玻璃体内注射。在一些实施方案中，所述个体为人。
还提供了分离的核酸，其编码上述抗体融合蛋白中任一种；载体，其包含上述分离的核酸中的任一种；分离的宿主细胞，其包含上述分离的核酸或载体中的任一种；试剂盒，其包含上述抗体融合蛋白、分离的核酸、载体或分离的宿主细胞中的任一种。
本申请的另一方面提供了一种制备上述抗体融合蛋白中的任一种的方法，所述方法包括在有效表达所编码的抗体融合蛋白的条件下培养包含上述分离的核酸或载体中的任一种的宿主细胞，或培养上述分离的宿主细胞中的任一种；以及从所述宿主细胞获得表达的抗体融合蛋白。在一些实施方案中，该方法还包括产生包含上述分离的核酸或载体中任一种的宿主细胞。
附图说明
图1示出了示例性VEGFR-抗体轻链融合蛋白，其包含单特异性全长抗体和两种VEGFR组分，其中每种VEGFR组分与抗体轻链的每个轻链的C-末端融合。在另选的形式中，两种VEGFR组分可不同，可包含三个或更多个Ig-样结构域，和/或可包含Flt-1或Flk-1的任何Ig-样结构域。
图2示出了示例性VEGFR-抗体轻链融合蛋白，其包含双特异性全长抗体和两种VEGFR组分，其中每种VEGFR组分与抗体轻链的每个轻链的C-末端融合。在另选的形式中，两种VEGFR组分可不同，可包含三个或更多个Ig-样结构域，和/或可包含Flt-1或Flk-1的任何Ig-样结构域。
图3示出了示例性的两种VEGFR-抗体轻链融合蛋白，其各自包含单特异性全长抗体和与抗体的一个轻链的C-末端融合的一种VEGFR组分。与VEGF二聚体结合使两种VEGFR-抗体轻链融合蛋白接近。在另选的形式中，两种VEGFR-抗体轻链融合蛋白可不同，其各自可包含三个或更多个Ig-样结构域，和/或可包含Flt-1或Flk-1的任何Ig-样结构域。
图4示出了示例性的两种VEGFR-抗体轻链融合蛋白，其各自包含双特异性全长抗体和与抗体的一个轻链的C-末端融合的一种VEGFR组分。与VEGF二聚体结合使两种VEGFR-抗体轻链融合蛋白接近。在另选的形式中，两种VEGFR-抗体轻链融合蛋白可不同，其各自可包含三个或更多个Ig-样结构域，和/或可包含Flt-1或Flk-1的任何Ig-样结构域。
图5示出了示例性的两种VEGFR-抗体轻链融合蛋白，其各自包含Fab和与Fab的轻链的C-末端融合的一种VEGFR组分。与VEGF二聚体结合使两种VEGFR-抗体轻链融合蛋白接近。在另选的形式中，两种VEGFR-抗体轻链融合蛋白可不同，其各自可包含三个或更多个Ig-样结构域，和/或可包含Flt-1或Flk-1的任何Ig-样结构域。
具体实施方式
本发明提供抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含与抗体轻链的C-末端融合的VEGFR组分(下文称为“VEGFR-抗体轻链融合蛋白”)，其制备方法，及其用于治疗疾病诸如癌症和非肿瘤性障碍(诸如，眼部新生血管障碍，例如糖尿病性视网膜病和AMD)的用途。
例如，与在重链上具有C-末端融合的抗体相比，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白可具有基本上无聚集的高稳定性、增加的血清半衰期和皮下生物利用率，保留ADCC和CDC活性，这使得其能够更有效并以更低的剂量递送抗体融合蛋白。本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白还可保留与VEGF和由亲本抗体识别的抗原两者的高结合亲和力。
因此，本申请的一个方面提供抗体融合蛋白，其包含：1)包含轻链的抗体，和2)VEGFR组分，其中所述VEGFR组分与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。
还提供了包含VEGFR-抗体轻链融合蛋白的组合物(诸如药物组合物)、试剂盒和制品，其制备方法，以及使用VEGFR-抗体轻链融合蛋白治疗疾病(诸如癌症、非肿瘤性障碍，例如眼部新生血管障碍)的方法。
I.定义
如本文所用，“血管生成”、“血管生成的”或“新生血管形成”是指新血管的形成、生长和/或发育。
本文所用的术语“新生血管障碍”是指一种障碍，其特征在于改变的或不受调节的血管生成，而不是伴随致癌性或肿瘤性转化的障碍，即癌症。新生血管障碍的示例包括牛皮癣、类风湿性关节炎和眼部新生血管障碍，诸如糖尿病性视网膜病和AMD。
本文所用的术语“眼部新生血管障碍”是指一种障碍，其特征在于患者眼部中改变或不受调节的血管生成。示例性眼部新生血管障碍包括视神经盘新生血管形成、虹膜新生血管形成、视网膜新生血管形成(RNV)、脉络膜新生血管形成(CNV)、角膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、青光眼、角膜翳、翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿、AMD、血管性视网膜病、视网膜变性、葡萄膜炎、视网膜的炎性疾病、和增殖性玻璃体视网膜病变。
“脉络膜新生血管形成”(CNV)是指由脉络膜毛细血管产生的血管的异常发育、增殖和/或生长。血管通常延伸穿过Bruch膜、RPE层和/或视网膜下腔。
“黄斑变性相关病症”是指其中黄斑变性或丧失功能活性的多种障碍和病症中的任一种。功能活性的退化或丧失可由于例如细胞死亡、减少的细胞增殖和/或正常生物功能的丧失而产生。黄斑变性可导致和/或表现为黄斑细胞和/或细胞外基质的结构完整性的改变、正常细胞和/或细胞外基质结构的改变、和/或黄斑细胞功能的丧失。细胞可以为正常存在于黄斑中或其附近的任何细胞类型，包括RPE细胞、感光细胞和/或毛细血管内皮细胞。AMD是主要的黄斑变性相关病症。其他黄斑变性相关病症包括Best黄斑营养不良、眼底营养不良症、Mallatia Leventinese和多英氏蜂窝状视网膜营养不良。
“眼植入物”是指具有适当尺寸、形状和/或构型并且由合适的材料制成，使得其可置于眼中但不导致对眼部的生理或功能的不可接受的干扰的装置或结构。优选地，眼植入物的放置不显著破坏视力。眼植入物通常为固体或半固体制品，并且通常是宏观的，即肉眼可见的。
术语“血管生成抑制剂”和“抗血管生成剂”在本文中可互换使用，其是指能够抑制或减少与血管生成相关的一种或多种过程的试剂，所述血管生成包括但不限于内皮细胞增殖、内皮细胞存活、内皮细胞迁移、前体细胞分化成内皮细胞和毛细血管形成。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分地降低、抑制或干扰一种或多种抑制性免疫检查点分子的分子，其可抑制T-细胞活化和功能。
如本文所用，术语“刺激性免疫检查点分子的活化剂”是指刺激、活化或增加由刺激性免疫检查点分子介导的免疫应答的强度的分子。
如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。就本发明的目的而言，有利的或期望的临床结果包括但不限于以下结果中的一种或多种：减轻疾病导致的一种或多种症状、降低疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延缓疾病恶化)、预防或延缓疾病传播(例如，癌细胞转移)、预防或延缓疾病复发、延缓或减缓疾病进展、改善疾病状态、提供疾病缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延缓疾病的进展、提高生活质量和/或延长寿命。“治疗”还涵盖降低癌症或眼部新生血管障碍的病理后果。本发明的方法设想了治疗的任何一个或多个这些方面。
术语“预防”和类似的词语诸如“预防的”，“预防性”等指示用于预防、抑制或降低疾病或病症(例如癌症、新生血管障碍(诸如眼部新生血管障碍))复发的可能性的方法。其还涉及延缓疾病或病症的复发或延缓疾病或病症的症状的复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病症复发之前降低疾病或病症的强度、效果、症状和/或负担。
如本文所用，“延缓”癌症或新生血管障碍(诸如眼部新生血管障碍)的发展意指延缓、阻碍、减慢、减缓、稳定和/或延迟疾病的发展。这种延缓效果持续的时间可不同，具体取决于病史和/或被治疗的个体。“延缓”癌症或新生血管障碍(诸如眼部新生血管障碍)的发展的方法是当与不使用该方法相比时，降低给定时间范围内疾病发展的可能性和/或降低给定时间范围内的疾病程度的方法。此类比较通常基于临床研究，其使用统计学上显著的个体数。癌症的发展可使用标准方法检测，所述标准方法包括但不限于：计算机化轴向断层摄影(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、腹部超声、凝血试验、动脉造影或活检。发展还可指癌症或新生血管障碍(诸如眼部新生血管障碍)进展，其最初可以为不可检测的，并且包括发生、复发和发作。
本文所用的术语“有效量”是指足以治疗特定障碍、病症或疾病，诸如改善、缓解、减轻和/或延缓其症状中的一种或多种的药剂或药剂的组合的量。参见癌症，有效量包括足以引起肿瘤收缩和/或减少肿瘤生长速率(诸如抑制肿瘤生长)或预防或延缓其他不希望的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量为足以延缓发展的量。在一些实施方案中，有效量为足以预防或延缓复发的量。有效量可在一次或多次施用中进行施用。药物或组合物的有效量可：(i)降低癌细胞的数量；(ii)降低肿瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、减缓、减慢并优选阻止癌细胞浸润到周边器官中；(iv)抑制(即，在一定程度上减慢并优选阻止)肿瘤癌细胞转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关联的一种或多种症状。参见眼部新生血管障碍，有效量包括足以治疗、抑制、延缓和/或预防新生血管障碍或其症状的量，例如足以实现下列中的一者或多者的量：(i)抑制或预防玻璃疣形成；(ii)导致玻璃疣数量和/或尺寸减小(玻璃疣消退)；(iii)导致减少或预防脂褐素沉积；(iv)抑制或预防视力丧失或减慢视力丧失的速度；(v)抑制脉络膜新生血管形成或减慢脉络膜新生血管形成的速率；(vi)导致特征在于脉络膜新生血管形成的消融灶的尺寸和数量减少；(vii)抑制脉络膜新生血管形成或减慢视网膜新生血管形成的速率；(Viii)导致特征在于视网膜新生血管形成的消融灶的尺寸和/或数量减少；(ix)改善视敏度和/或对比敏感性；(x)减少黄斑水肿和/或减少异常黄斑厚度；(xi)抑制或预防感光细胞或RPE细胞萎缩或细胞凋亡，或降低感光细胞或RPE细胞萎缩或细胞凋亡的速率；(xii)抑制或预防非渗出性黄斑变性发展为渗出性黄斑变性。
如本文所用，“个体”或“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物、或灵长类。在一些实施方案中，所述个体为人。
术语“抗体”或“抗体部分”以最广泛的意义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
基础的4-链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基础异源四聚体单元连同被称为J链的附加多肽组成，并且包含10个抗原结合位点，然而IgA抗体包含2-5个基础4-链单元，其可聚合以与J链组合形成多价组合体。在IgG的情况下，4-链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，然而两个H链通过一个或多个二硫键彼此连接，这取决于H链同种型。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每个H链在N-末端处具有可变结构域(VH)，之后是α和γ链中每一个的三个恒定结构域(CH)和μ和ε同种型的四个CH结构域。每个L链在N-末端处具有可变结构域(VL)，之后是其另一端处的恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链(CH1)的第一恒定结构域对齐。据信特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单一抗原结合位点。对于不同种类的抗体的结构和特性，参见例如，Basic andClinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw(编辑)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第71页和第6章。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将来自任何脊椎动物物种的L链分配给两种明显不同类型(被称为κ和λ)中的一种。取决于其重链(CH)的恒定结构域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配到不同的类别或同种型。存在五种类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能的相对微小的差异，γ和α类进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
“分离的”抗体(或构建体)是已从其生产环境的组分(例如，天然的或重组的)中鉴定、分离和/或回收的抗体。优选，分离的多肽不与来自其生产环境的所有其它组分缔合。其生产环境的污染组分，诸如得自重组转染细胞的，是通常可干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，所述多肽将纯化：(1)至大于95重量％抗体，如例如通过Lowry法所确定的，并且在一些实施方案中，至大于99％重量；(2)至足以通过使用旋转杯测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至使用考马斯蓝或优选地银染色，在非还原或还原条件下由SDS-PAGE获得的均质性。分离的抗体(或构建体)包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境中的至少一个组分将不存在。然而，通常，分离的多肽、抗体或构建体将通过至少一个纯化步骤制备。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域一般是抗体的最可变部分(相对于同一类的其它抗体)并且包含抗原结合位点。
术语“可变的”指抗体之间可变结构域的某些区段在序列方面区别很大的事实。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性不均匀分布在可变结构域的整个跨度内。相反，它集中在轻链和重链可变结构域两者中被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，其主要采用β-片构型，通过三个CDR连接，其形成环连接，并且在一些情况下形成β-片结构的一部分。每个链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且与来自其它链的CDR一起，有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见，Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第五版，NationalInstitute of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指得自基本上同质抗体的抗体，即除了可以微量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体相同。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单一抗原位点。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于其通过杂交瘤培养合成，不被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体的特征在于得自基本上同质的抗体群，并且不应被理解为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明的待使用的单克隆抗体可通过多种技术来制备，包括，例如杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein，Nature，256:495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow等人，Antibodies:ALaboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，于：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))中，重组DNA法(参见，例如，美国专利4,816,567)，噬菌体展示技术(参见，例如，Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)，以及用于在动物中产生人抗体或人样抗体的技术，所述动物具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部(参见，例如，WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362:255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immunol.7:33(1993)；美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016；Marks等人，Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368:856-859(1994)；Morrison，Nature 368:812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnol.14:845-851(1996)；Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用，以指呈其基本上完整形式的抗体，如与抗体片段相对。具体地讲，全长4-链抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以为天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一个或多个效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的示例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；DART；线性抗体(参见美国专利5,641,870，实施例2；Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(诸如scFv)，和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生被称为“Fab”片段的两个相同抗原结合片段，和残余的“Fc”片段，命名反映了易于结晶的能力。Fab片段由整个L链连同H链的可变区结构域(VH)和一个重链(CH1)的第一恒定结构域组成。每个Fab片段相对于抗原结合是单价的，即其具有单一抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单一大F(ab')2片段，其大致对应于两个二硫键连接的具有不同抗原结合活性的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端处具有一些附加残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中用于Fab'的名称，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离的硫醇基团。F(ab')2抗体片段最初以Fab'片段对形式产生，其在所述片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两个H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列确定，所述区域也被存在于特定类型细胞中的Fc受体(FcR)识别。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的部分，该部分具有相对于免疫球蛋白的另一部分(即，包含抗原结合位点的可变结构域)更保守的氨基酸序列。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称CH)以及轻链的CHL(或CL)结构域。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将来自任何哺乳动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分配给两种明显不同类型(被称为kappa(“κ”)和lambda(“λ”))中的一种。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠散发六个高变环(来自H链和L链各3个环)，其有助于氨基酸残基的抗原结合并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的Fv的一半)具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
也缩写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接到单一多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含介于VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成抗原结合的期望结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
本文所述的抗体的“功能性片段”包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合区或可变区或保留或具有修饰的FcR结合能力的抗体Fc区。抗体片段的示例包括线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“双抗体”是指通过利用短接头(约5-10个残基)在VH和VL结构域之间构建sFv片段(参见前段)，使得V结构域的链间配对而不是链内配对被实现，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段来制备的小抗体片段。双特异性抗体是两个“交叉”sFv片段的异源二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更详细地描述于下列文献中：例如，EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。
本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，然而链的剩余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性即可(美国专利4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。“人源化抗体”用作“嵌合抗体”的子集。
“人源化”形式的非人(例如，美洲驼或骆驼科)抗体是包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的CDR(下文所定义)的残基被来自具有期望的特异性、亲和力、和/或能力的非人物种(供体抗体)，诸如小鼠、大鼠、兔子、骆驼、美洲驼、羊驼或非人灵长类动物的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架(“FR”)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含不存于受体抗体或供体抗体中的残基。可进行这些修改以进一步改善抗体性能，诸如结合亲和力。一般来讲，人源化抗体将包含至少一个，并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白序列的那些，并且全部或基本上全部的FR区域是人免疫球蛋白序列的那些，但FR区域可包括一个或多个单独的FR残基取代基，所述取代基改善抗体性能，诸如结合亲和力、异构化、免疫原性等。FR中的这些氨基酸取代基的数量通常在H链中不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还将包含通常为人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。对于其他细节，参见，例如，Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见，例如，Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；和美国专利6,982,321和7,087,409。
“人抗体”是具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列和/或使用如本文公开的用于制备人抗体的技术中的任一种所制备的抗体。人抗体的该定义明确地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的多种技术，包括噬菌体展示文库来制备人抗体。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的是描述于下列文献中的方法：Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.，147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已被修饰以产生响应于抗原攻击的此类抗体，但其内源性基因座已被禁用，例如免疫异源小鼠(参见，例如，关于XENOMOUSETM技术的美国专利6,075,181和6,150,584)。还可参见，例如，Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)，其关于经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的区域，其序列是高变的和/或形成在结构上限定的环。一般来讲，单结构域抗体包含三个HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)和HVR3(或CDR3)。HVR3(或CDR3)展示出三个HVR的最大多样性，并且据信在赋予抗体良好特异性方面起到独特的作用。参见，例如，Hamers-Casterman等人，Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人，Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
术语“互补性决定区”或“CDR”用于指高变区，如由Kabat***所定义的。参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)。
多个HVR描述处于使用中并且被本文所涵盖。Kabat互补决定区域(CDR)基于序列可变性，并且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。Chothia指代结构环的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表KabatHVR与Chothia结构环之间的折衷，并且通过Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR基于可用的复合晶体结构的分析。来自这些HVR中的每一个的残基在下表1中示出。
表1：HVR描述
Figure BDA0002502291250000181
HVR可包含如下所示的“扩展的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)以及89-97或89-96(L3)，和VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)以及93-102、94-102或95-102(H3)。就这些定义中的每一个而言，可变结构域残基根据Kabat等人(同上)编号。
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变型形式，是指Kabat等人(同上)中用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号***。使用该编号***，实际的线性氨基酸序列可包含较少或附加氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或***可变结构域的FR或HVR中。例如，重链可变结构域可包括H2的残基52后的单一氨基酸***(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的***的残基(例如，根据Kabat，残基82a、82b和82c等)。给定抗体的残基的Kabat编号可通过在抗体序列的同源性区域与“标准”Kabat编号序列的比对来确定。
除非另外指明，否则免疫球蛋白重链中的残基的编号是如Kabat等人(同上)中的EU索引编号。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”残基是除了本文所定义的HVR残基之外的那些可变结构域残基。
“人共有框架”或“受体人框架”是代表选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列时最常出现的氨基酸残基的框架。一般来讲，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。一般来讲，序列的亚组是Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)中的亚组。示例包括对于VL而言，所述亚组可以为亚组κI、κII、κIII或κIV，如Kabat等人，同上。另外，对于VH而言，亚组可以为亚组I、亚组II、或亚组III，如Kabat等人中所述。另选地，人共有框架可来源于上述亚组，其中特定残基(诸如人框架残基)通过将供体框架序列与各种人框架序列的集合进行比对，基于其与供体框架的同源性来选择。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或者其可包含预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中，预先存在的氨基酸变化数是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一种或多种改变的抗体，与不具有那些改变的亲本抗体相比，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。在一些实施方案中，亲和力成熟的抗体具有对靶抗原的纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域中已知的程序来制备。例如，Marks等人，Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH-结构域和VL-结构域混编的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变例如由以下文献描述：Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994)；Schier等人Gene169:147-155(1995)；Yelton等人J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；以及Hawkins等人，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
如本文所使用的，术语“特异性地结合”、“特异性识别”或“对…具有特异性”是指可测量且可再现的相互作用，诸如靶和抗原结合蛋白之间的结合，其在包括生物分子在内的分子的异质群的存在下对于靶的存在具有决定性。例如，特异性结合靶的抗原结合蛋白(其可以为表位)是以比其结合其他靶更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长持续时间来结合该靶的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，抗原结合蛋白与无关靶的结合程度少于抗原结合蛋白对靶的结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)所测量的。一些实施方案中，特异性结合靶的抗原结合蛋白或特异性结合VEGF的VEGFR组分具有的离解常数(Kd)为≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M。在一些实施方案中，抗原结合蛋白特异性结合蛋白上的表位，该表位在来自不同物种的蛋白中是保守的。在一些实施方案中，特异性结合可包括，但不需要排他性结合。
术语“特异性”是指选择性识别针对抗原特定表位的抗原结合蛋白。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所用，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有多表位特异性(即，能够与一个生物分子上的两个、三个或更多个不同表位特异性结合或能够与两个、三个或更多个不同生物分子上的表位特异性结合)。如本文所用，“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同的抗原结合特异性。除非另外指明，否则列出的双特异性抗体结合的抗原的顺序是任意的。如本文所用，术语“单特异性”表示具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白，所述结合位点各自结合相同抗原的相同表位。
如本文所用，术语“化合价”表示在抗原结合蛋白中存在的结合位点的指定数量。例如，天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”表示在抗原结合蛋白中分别存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
“抗体效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的示例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。“降低或最小化”抗体效应子功能是指其从野生型或未修饰抗体降低至少50％(或者60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％)。抗体效应子功能的确定可由本领域普通技术人员容易地确定和测量。在一个优选的实施方案中，互补结合、互补依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的抗体效应子功能受到影响。在一些实施方案中，通过消除糖基化的恒定区中的突变来消除效应子功能，例如“无效应子突变”。在一个方面，无效应突变是CH2区中的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields等人，J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001)。另选地，导致效应子功能降低或消除的附加突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。另选地，可通过生产技术，诸如在宿主细胞中表达来降低或消除效应子功能，所述细胞不糖基化(例如，大肠杆菌)或其中导致改变的糖基化模式，所述模式在促进效应子功能方面无效或不太有效(参见，Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278(5):3466-3473(2003)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指细胞毒性形式，其中分泌的Ig结合到某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上，使得这些细胞毒性效应子细胞能够与携带抗原的靶细胞特异性结合，并且随后利用细胞毒素杀死靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是通过该机制杀死靶细胞所必需的。用于介导ADCC、NK细胞的原代细胞仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达概述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)。为评估感兴趣的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所述的。用于此类测定的可用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。作为另外一种选择或除此之外，感兴趣的分子的ADCC活性可以体内评估，例如在动物模型中，诸如在Clynes等人，PNAS USA 95:652-656(1998)中所公开的。
本文术语“Fc区”用于限定免疫球蛋白重链的C-末端区，其包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能有所不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226或Pro230的氨基酸残基延伸至其羧基末端。Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号***，残基447)可例如在抗体的制备或纯化期间移除，或通过将编码抗体重链的核酸重组工程化来移除。因此，完整抗体的组成可包括其中移除所有K447残基的抗体群，其中不移除K447残基的抗体群，和具有带或不带K447残基的抗体的混合物的抗体群。适用于本文所述抗体的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在的情况下裂解靶细胞。经典补体途径的激活通过补体体系的第一组分(C1q)与结合到其同源抗原的抗体(合适的亚类)结合而引发。为了评估补体激活，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的。具有改变的Fc区氨基酸序列以及增加或减小的C1q结合能力的抗体变体描述于美国专利6,194,551B1和WO99/51642中。那些专利公布的内容具体地以引用方式并入本文。还可参见，Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
“结合亲和力”一般是指分子(例如，抗体，VEGFR)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原，VEGF)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员之间的1:1相互作用。结合亲和力可由Kd、Koff、Kon或Ka指示。如本文所用，术语“Koff”旨在是指抗体(或抗原结合结构域)从抗体/抗原复合物解离(或VEGFR从VEGF/VEGFR复合物解离)的速率常数，如由动力学选择设置所测定的，其以s-1为单位表示。如本文所用，术语“Kon”旨在是指抗体(或抗原结合结构域)与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物(或VEGFR与VEGF缔合以形成VEGF/VEGFR复合物)的速率常数，其以M-1s-1为单位表示。与本文所用，术语平衡解离常数“KD”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用(或VEGFR-VEGF相互作用)的解离常数，并描述了平衡时占据存在于抗体分子的溶液中的全部抗体结合结构域中的一半所需的抗原浓度(或平衡时占据存在于VEGFR的溶液中的全部VEGFR中的一半所需的VEGF浓度)并且等于Koff/Kon，其以M为单位表示。Kd的测量假设所有结合剂都在溶液中。在将抗体拴系到细胞壁的情况下，例如在酵母表达体系中，相应的平衡速率常数表示为EC50，这提供了Kd的良好近似值。亲和力常数，Ka为解离常数Kd的倒数，其以M-1为单位表示。
解离常数(KD或Kd)用作示出抗体对抗原(或VEGFR对VEGF)的亲和力的指标。例如，简单的分析通过以下方法是可能的：使用利用多种标记试剂标记的抗体的Scatchard方法，以及使用作为非处方药的BiacoreX(由Amersham Biosciences制造)，测量试剂盒，或类似试剂盒，根据试剂盒随附的用户手册和实验操作方法。可使用这些方法导出的KD值以M(Mol)为单位表示。与靶特异性结合的抗体或其抗原结合片段(或与VEGF特异性结合的本文所述的VEGFR组分)可具有例如为≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(Kd)。
抗体或抗原结合结构域(或本文所述的VEGFR组分)的结合特异性可通过本领域已知的方法进行实验测定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore测试和肽扫描。
半最大抑制浓度(IC50)是物质(诸如抗体或VEGFR)在抑制特定生物功能或生化功能方面的有效性的量度。其指示需要多少特定药物或其他物质(抑制剂，诸如抗体或VEGFR)来抑制一半给定的生物过程或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物。该值通常表示为摩尔浓度。IC50与激动剂药物或其他物质(诸如抗体)的EC50相当。EC50还表示在体内获得50％的最大效应所需的血浆浓度。如本文所用，“IC50”用于指示在体外中和50％的抗原生物活性所需的抗体的有效浓度(或中和50％的VEGF生物活性所需的VEGFR组分的有效浓度)。IC50或EC50可通过生物测定法进行测量，诸如通过FACS分析抑制配体结合(竞争结合测定法)、基于细胞的细胞因子释放测定法或扩增发光邻近均质测定法(AlphaLISA)。
关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列和引入缺口(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，但不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是核酸分子，所述核酸分子从通常与其产生的环境相关联的至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离。优选，分离的核酸不与和生产环境相关联的所有组分缔合。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子呈不是其存在于自然中的形式或设置的形式。因此，分离的核酸分子与天然存在于细胞中的编码本文所述的多肽和抗体的核酸区分开来。分离的核酸包括：包含在通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但该核酸分子在染色体外或在不同于其天然染色***置的染色***置处存在。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列处于功能相关时，其“可操作地连接”。例如，如果其被表达为参与分泌多肽的原前蛋白前，则前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作连接；如果其影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或者如果其被定位以便有利于翻译，则核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。一般来讲，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且在阅读阶段。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制位点处连接来完成。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自复制核酸结构的载体以及结合到其已引入其中的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导它们可操作地连接于其上的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指由此将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已被外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代目标细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的子代，而不考虑传代数。子代的核酸内容物可能不与亲本细胞完全相同，但可包含突变。与原始转化细胞中所筛选或选择的功能或生物活性相同的突变子代包括在本文之内。
“辅助环境”是指其中个体具有患有癌症病史并且一般(但不一定)对疗法有反应的临床环境，其包括但不限于手术(例如，手术切除)、放疗和化疗。然而，由于他们的癌症病史，这些个体被认为有发展该疾病的风险。“辅助环境”中的治疗或施用是指后续治疗模式。风险程度(例如，当辅助环境中的个体被认为是“高风险”或“低风险”时)取决于多种因素，最常见的是首次治疗时的疾病程度。
“新辅助环境”是指在初始疗法/确定性疗法之前进行所述方法的临床环境。
“生物相容性”是指以所用数量并在所用位置处对受体的细胞基本上无毒的材料，并且在所使用的位置处不会引起或导致对受体身体的显著有害或不利影响，例如，不可接受的免疫或炎性反应、不可接受的疤痕组织形成等。例如，与眼部生物相容的材料不显著干扰眼部的生理或功能。
“可生物侵蚀的”或“可生物降解的”意指材料能够例如通过在生理条件下水解和/或通过天然生物过程，诸如存在于细胞或身体内的酶的作用，和/或通过诸如溶解、分散等过程，在细胞内或受试者身体内物理和/或化学地分解，以形成较小的化学物质，所述较小的化学物质通常可由身体代谢和任选地使用、和/或***或以其他方式处理。优选地，可生物降解的化合物是可生物相容的。其分子量随在体内的时间推移由于单体数的减少而减小的聚合物被认为是可生物降解的。
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指呈允许活性成分的生物活性有效这样的形式，并且不含对制剂将施用的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。此类制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌的或不含所有活的微生物及其孢子。
应当理解，本文所述的本发明的实施方案(诸如“包括”实施方案)包括“由…组成”和/或“基本由…组成”实施方案。
本文提及“约”的值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的变化。例如，关于“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文所用，提及“非”某个值或参数通常意指并描述“除该值或参数之外”的值或参数。例如，该方法不用于治疗X类型的癌症，意指该方法用于治疗除X类型之外的类型的癌症。
本文所用的术语“约X-Y”具有与“约X至约Y”相同的含义。
如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另外明确规定。
II.包含与抗体轻链的C-末端融合的VEGFR组分的抗体融合蛋白
本文所述的抗体融合蛋白包含：1)包含轻链的抗体，和2)VEGFR组分，其中所述VEGFR组分与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。
在一些实施方案中，提供抗体融合蛋白，其包含：1)包含轻链的抗体(诸如全长抗体)，和2)VEGFR组分，其与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含第一VEGFR Flt-1的免疫球蛋白样(Ig-样)结构域2(Flt1d2)。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含第二VEGFR Flk-1的Ig-样结构域3(Flk1d3)。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含第三VEGFR Flk1的Ig-样结构域4(Flk1d4)。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端基本上由下列组成：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端基本上由下列组成：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。在一些实施方案中，抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgG-来源分子、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab-scFv、F(ab’)2-scFv2、Fab-scFv-Fc、对接和锁定(Dock and Lock)、scFv、二-scFv、双体抗体、双体抗体-Fc、双体抗体-CH3、和细胞内抗体。在一些实施方案中，抗体包含轻链恒定结构域(CL结构域)、并且VEGFR组分与抗体CL结构域的C-末端(例如抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(诸如双特异性的)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别免疫检查点分子。在一些实施方案中，免疫检查点分子是刺激免疫检查点分子。在一些实施方案中，免疫检查点分子是抑制性免疫检查点分子(诸如PD-1、PD-L1、PD-L2、CD47、CXCR4、CSF1R、LAG-3、TIM-3、HHLA2、BTLA、CTLA-4、TIGIT、VISTA、B7-H4、CD160、2B4和CD73)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-1。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000281
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000282
)竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000283
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000284
)竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQID NO:15的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-L1。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000285
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000286
)竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为德瓦鲁单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000287
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与德瓦鲁单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000288
)竞争性地结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性地识别CTLA-4。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000291
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000292
)竞争性结合CTLA-4。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性识别肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原为HER2。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000293
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000294
)竞争性结合HER2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:26、27或28的氨基酸序列。在一些实施方案中，肿瘤抗原为EGFR(HER1)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是西妥昔单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000295
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与西妥昔单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000296
)竞争性结合EGFR。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性识别血管生成因子。在一些实施方案中，血管生成因子为Ang2。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为尼伐单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与尼伐单抗竞争性结合Ang2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为TNFα。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000301
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000302
)竞争性结合TNFα。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为IL-17A。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000303
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000304
)竞争性结合IL-17A。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白仅包含一种VEGFR组分。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，第一和/或第二VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，第一和/或第二VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，第一和/或第二VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，第一和/或第二VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第一和/或第二VEGFR组分从N-末端至C-末端基本上由下列组成：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第一和/或第二VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一和/或第二VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第一和/或第二VEGFR组分从N-末端至C-末端基本上由下列组成：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分中的至少一种和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别免疫检查点分子(例如，抑制性免疫检查点分子)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-1(例如，派姆单抗或纳武单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-L1(例如，阿特朱单抗或德瓦鲁单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别CTLA-4(例如，伊匹单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗体特异性地识别HER2(例如，曲妥珠单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别EGFR(HER1)(例如西妥昔单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别血管生成因子。在一些实施方案中，抗体特异性地识别Ang2(例如，尼伐单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别TNFα(例如阿达木单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别IL-17A(例如，伊克珠单抗)。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，其中所述第一VEGFR组分和第二VEGFR组分各自包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flr1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分中的至少一种和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别免疫检查点分子(例如，抑制性免疫检查点分子)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-1(例如，派姆单抗或纳武单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-L1(例如，阿特朱单抗或德瓦鲁单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性识别CTLA-4(例如，伊匹单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性识别肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗体特异性地识别HER2(例如，曲妥珠单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性识别EGFR(HER1)(例如西妥昔单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性识别血管生成因子。在一些实施方案中，抗体特异性识别Ang2(例如，尼伐单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性识别TNFα(例如阿达木单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性识别IL-17A(例如，伊克珠单抗)。
在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头连接。在一些实施方案中，接头为肽接头(例如，SEQ ID NO：1-7和44中的任一种)。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:6或7的氨基酸序列。在一些实施方案中，两种VEGFR组分中的至少一种和抗体轻链的两个C-末端通过接头连接。在一些实施方案中，两种VEGFR组分和抗体轻链的两个C-末端均通过接头连接。在一些实施方案中，两种接头相同。在一些实施方案中，两种接头不同。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别免疫检查点分子的抗体。在一些实施方案中，抗体特异性地识别刺激性免疫检查点分子。在一些实施方案中，抗体特异性识别抑制性免疫检查点分子(诸如PD-1、PD-L1、PD-L2、CD47、CXCR4、CSF1R、LAG-3、TIM-3、HHLA2、BTLA、CTLA-4、TIGIT、VISTA、B7-H4、CD160、2B4和CD73)(该抗体在下文被称为“免疫检查点抑制剂”或“抑制性免疫检查点分子的抑制剂”)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-1(例如，派姆单抗或纳武单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-L1(例如，阿特朱单抗或德瓦鲁单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性识别CTLA-4(例如，伊匹单抗)。
例如，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别免疫检查点分子(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别免疫检查点分子(诸如PD-1、PD-L1或CTLA-4)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-1(例如，派姆单抗或纳武单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-L1(例如，阿特朱单抗或德瓦鲁单抗)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别CTLA-4(例如，伊匹单抗)。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10- 13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；并且其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000361
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与派姆单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；并且其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000362
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与纳武单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flr1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体为派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000371
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000372
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000373
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与派姆单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000381
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与纳武单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-L1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-L1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；并且其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000391
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿特朱单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-L1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ IDNO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；并且其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQID NO:21的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为德瓦鲁单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与德瓦鲁单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-L1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体为阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000412
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体为德瓦鲁单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-L1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000411
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿特朱单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别PD-L1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是德瓦鲁单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000421
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与德瓦鲁单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别CTLA-4，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别CTLA-4，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；并且其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000431
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊匹单抗竞争性结合CTLA-4。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别CTLA-4，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体为伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000441
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊匹单抗竞争性结合CTLA-4。在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别CTLA-4，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000442
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊匹单抗竞争性结合CTLA-4。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别肿瘤抗原(诸如HER2、EGFR)的抗体。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别肿瘤抗原(诸如HER2、EGFR)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ IDNO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，肿瘤抗原为HER2。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别HER2，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别HER2，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；并且其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000461
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与曲妥珠单抗竞争性结合HER2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:26、27或28的氨基酸序列。在一些实施方案中，肿瘤抗原为EGFR(HER1)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别HER1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别HER1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；并且其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为西妥昔单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别肿瘤抗原(诸如HER2、EGFR)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ IDNO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如双特异性的)。在一些实施方案中，肿瘤抗原为HER2。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别HER2，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ IDNO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别HER2，其包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQID NO：8的氨基酸序列；并且其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000481
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与曲妥珠单抗竞争性结合HER2。。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQID NO:26、27或28的氨基酸序列。在一些实施方案中，肿瘤抗原为EGFR(HER1)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别HER1，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别EGFR，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是西妥昔单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000491
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别血管生成因子的抗体。在一些实施方案中，抗体特异性地识别Ang2。在一些实施方案中，抗体特异性地识别TNFα。在一些实施方案中，抗体特异性地识别IL-17A。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别血管生成因子(诸如Ang2、TNFα、IL-17A)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别血管生成因子(诸如Ang2、TNFα、IL-17A)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别Ang2，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别Ang2，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别Ang2，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为尼伐单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与尼伐单抗竞争性结合Ang2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别TNFα，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如，SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如，SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别TNFα，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如，SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如，SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别TNFα，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如，SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如，SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000541
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿达木单抗竞争性结合TNFα。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别IL-17A，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合。在一些实施方案中，接头X和接头Y相同。在一些实施方案中，接头X和接头Y不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别IL-17A，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。因此，在一些实施方案中，本发明提供了抗体融合蛋白，其包含：1)抗体(诸如全长抗体)，其特异性识别IL-17A，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，和2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ IDNO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000561
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊克珠单抗竞争性结合IL-17A。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
抗体融合蛋白特性
抗体融合蛋白稳定性
本发明的VEGFR-抗体轻链融合蛋白可表现出高水平的稳定性。
如本文所用，关于VEGFR-抗体轻链融合蛋白的术语“稳定的”意指在限定条件下储存之后，VEGFR-抗体轻链融合蛋白保留可接受程度的化学结构或生物学功能。即使在储存限定量的时间之后，VEGFR-抗体轻链融合蛋白不保持100％的其化学结构或生物学功能，其也可以是稳定的。在一些实施方案中，在储存限定量的时间之后，维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的结构或功能可被认为是“稳定的”。
稳定性可尤其通过如下方式测量：在限定温度下储存限定量的时间之后，测定保留在制剂(液体或重组的)中的天然(非聚集的或降解的)VEGFR-抗体轻链融合蛋白的百分比。天然VEGFR-抗体轻链融合蛋白的百分比尤其可通过尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻高效液相色谱法[SE-HPLC])测定，使得天然意指非聚集的和未降解的。在一些实施方案中，在给定温度下储存限定量的时间之后，可在制剂中检测到至少约90％(诸如至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的天然形式的VEGFR-抗体轻链融合蛋白。在一些实施方案中，在室温(约25℃)下至少约6小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约22小时、至少约24小时、至少约26小时、至少约28小时、至少约30小时、至少约32小时、至少约34小时、至少约36小时、至少约38小时、至少约40小时、至少约42小时、至少约44小时、至少约46小时、或至少约48小时之后，可在制剂中检测到至少约90％(诸如至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的天然形式的VEGFR-抗体轻链融合蛋白。
稳定性可尤其通过如下方式测量：在限定温度下储存限定量的时间之后，测定制剂(液体或重组的)中以聚集体形式形成的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的百分比，其中稳定性与形成的聚集体百分比成反比。聚集的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的百分比可尤其通过尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻高效液相色谱法[SE-HPLC])测定。在一些实施方案中，在给定温度下储存限定量的时间之后，小于约10％(优选地小于约5％)的VEGFR-抗体轻链融合蛋白以聚集体形式存在于制剂中。在一些实施方案中，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白基本上不具有聚集体，例如，在给定温度下储存限定量的时间之后，例如，在室温(约25℃)下储存至少约6小时、至少约8小时、至少约10小时、至少约12小时、至少约14小时、至少约16小时、至少约18小时、至少约20小时、至少约22小时、至少约24小时、至少约26小时、至少约28小时、至少约30小时、至少约32小时、至少约34小时、至少约36小时、至少约38小时、至少约40小时、至少约42小时、至少约44小时、至少约46小时、或至少约48小时之后，可在制剂中检测到最多约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的呈聚集体形式的VEGFR-抗体轻链融合蛋白。
测量VEGFR-抗体轻链融合蛋白与其靶(抗体抗原和/或VEGF)的结合亲和力也可用于评估稳定性。例如，如果在例如室温(约25℃)下储存限定量的时间(例如，6小时、12小时、24小时、36小时、48小时)之后，VEGFR-抗体轻链融合蛋白中包含的抗体和VEGFR组分两者以所述储存之前抗体的结合亲和力的至少84％、90％、95％或甚至更大的亲和力(分别地)与抗体抗原和VEGF结合，则本发明的VEGFR-抗体轻链融合蛋白可被认为是稳定的。结合亲和力可通过任何方法，例如ELISA或等离子体共振来测定。生物活性可通过抗原或VEGF活性测定法来测定，诸如通过使表达VEGF的细胞与VEGFR-抗体轻链融合蛋白接触来测定。VEGFR-抗体轻链融合蛋白与此类细胞的结合可诸如经由FACS分析直接进行测量。另选地，VEGF体系的下游活性可在VEGFR-抗体轻链融合蛋白的存在下测量，并且与不存在VEGFR-抗体轻链融合蛋白的情况下的VEGF体系的活性进行比较。在一些实施方案中，VEGF对于细胞可以为内源性的。在其他实施方案中，VEGF可在细胞中异位表达(即，异源表达)。
抗体融合蛋白药代动力学
在一些实施方案中，本发明的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的血清半衰期比相应抗体的半衰期长。例如，VEGFR-抗体轻链融合蛋白的pK比相应抗体的pK长。在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白的血清半衰期类似于对应抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，在施用于生物体时，VEGFR-抗体轻链融合蛋白的血清半衰期为至少约15天、约14天、约13天、约12天、约11天、约10天、约9天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天、约24小时、约24小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时或约1小时。
抗体融合蛋白临床特性
在一些实施方案中，相对于包含抗体与融合到重链C-末端的VEGFR组分的VEGFR-抗体融合蛋白，和/或包含抗体与融合到重链的N-末端的VEGFR组分的VEGFR-抗体融合蛋白，和/或包含抗体与融合到轻链的N-末端的VEGFR组分的VEGFR-抗体融合蛋白，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白具有改善的临床特性。在一些实施方案中，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白保留抗体的ADCC和CDC效应子功能，尽管存在附接到抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)的大体积VEGFR组分。在一些实施方案中，与相应抗体的相比，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白表现出抗体的改善的ADCC和/或CDC效应子功能。
可如实施例2所述测试VEGFR-抗体轻链融合蛋白的ADCC。简而言之，将表达可由VEGFR-抗体轻链融合蛋白识别的抗原的癌细胞系(例如，SKBR3人乳腺癌细胞系，其表达可由VEGFR-抗-HER2轻链融合蛋白内的抗HER2抗体部分识别的HER2)与效应子细胞(例如，CD16+NK92细胞)在96孔板中混合在一起。可以工程化癌细胞系以表达报告基因，例如荧光素酶。将不同浓度的VEGFR-抗体轻链融合蛋白添加到每个孔中。温育后，报告基因(例如荧光素酶)活性可使用酶标仪测量。然后可计算EC50(表示ADCC活性)。
C-末端重链融合有时改变Fc区的结构，即使在使用柔性肽接头时也是如此。因此，具有重链融合的抗体融合蛋白相对于完整抗体表现出低CDC。此外，重链融合体的特征在于在不存在抗原结合的情况下的高Fc受体(FcR)结合。这导致相对较短的半衰期。可改变重链融合体的这些特性，例如通过将融合部分去糖基化减少和消除FcR结合和/或通过修饰接头来预防细胞内蛋白水解。然而，去糖基化导致丧失ADCC和CDC，并且接头修饰的构建体仍具有相对低的CDC和亚最佳药代动力学特性。
当将大部分(例如，VEGFR组分)与抗体轻链的C-末端融合时，大体积部分以及抗体轻链本身的折叠可受到影响，从而导致抗体融合蛋白的3D结构的不可预测性，这继而可降低或消除抗体对其一个或多个靶抗原的结合特异性，以及大体积部分的生物活性(例如，VEGFR组分与VEGF的结合特异性)。然而，在本发明中令人惊讶地发现，大体积VEGFR组分(例如，约23.2kDa)可与抗体轻链的C-末端融合，同时仍保持VEGFR与VEGF的结合特异性，以及抗体与其一个或多个抗原靶的结合特异性，即使当两个大体积的VEGFR组分与两个抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合时也是如此。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白可通过在不存在与靶细胞或目标(例如，过表达VEGF的癌细胞或组织)的结合的情况下降低抗体活性来提高抗体细胞特异性。该特征对于选择性掩蔽或减少抗体融合蛋白的细胞毒性，从而保护非靶细胞或正常细胞免受毒性效应，同时仅使靶细胞(例如，过表达VEGF的癌细胞或组织)暴露于毒性效应而言将是特别有用的。在一些实施方案中，包含VEGFR组分的VEGFR-抗体轻链融合蛋白可稳定相同抗体融合蛋白内的VEGF二聚体结合(参见图1和图2中所示的示例)。在一些实施方案中，一种VEGFR-抗体轻链融合蛋白可与附近的另一种进行配对，形成来自两个部分的VEGFR组分的二聚体并稳定VEGF结合(参见图3-5中所示的示例)。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白在具有或不具有接头肽的情况下保留完整抗体和VEGFR组分的功能(例如对VEGF的结合)。在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白不影响抗体Fc区的结构。在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白不干扰抗体的Fc部分与Fc受体(诸如FcγR和FcRn)的结合或抗体与其一个或多个相应靶的结合。在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白不影响抗体部分和免疫***之间的相互作用(效应子功能)。在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白避免重链变形，从而导致在被携带FcR的细胞摄取后的降解减少，然后再循环离开细胞。在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白保留与VEGF和由亲本IgG识别的抗原两者的高结合亲和力。
VEGFR组分
VEGF和VEGFR
已鉴定了新生血管形成过程中的许多关键因素，并且VEGF家族起到主要作用。人类VEGF家族由6个成员组成：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(PIGF)。此外，VEGF-A、VEGF-B和PIGF的多种同种型通过另选的RNA剪接产生(Sullivan等人，MAbs，2002，2(2)：165-75)。VEGF-A是涉及血管生成的主要因素；其结合了VEGFR-1和VEGFR-2两者。通过阻断VEGF-A信号传导来抑制血管生成的策略已经建立了用于治疗特定癌症以及视网膜新生血管性和缺血性疾病的成功疗法(Major等人，JPharmacol Exp Then,1997,283(1):402-10；Willet等人，Nat.Med.2004,10:145-7；Papadopoulos等人，Angiogenesis,2012,15(2):171-85；Aiello等人，PNAS,1995,92:10457-61)。
与有助于血管形成过程的其他生长因子相比，VEGF在其与血管***内的内皮细胞的高特异性方面具有独特性。
除了作为血管生成和血管发生的血管生成因子之外，VEGF还作为多效性生长因子在其他生理过程中表现出多种生物学效应，诸如内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙流入(Ferrara和Davis Smyth(1997)Endocrine Rev.18:4-25)。此外，据报道，VEGF对一些非内皮细胞类型(例如视网膜色素上皮细胞、胰腺导管细胞和施旺细胞(Schwann cell))具有促丝裂效应。参见，例如，Guerrin等人(1995)J.Cell Physiol.164:385-394；Oberg-Welsh等人，(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126:125-132；Arie等人，(1999)J.Neurosci.19:5731-5740。
大量证据还暗示VEGF在涉及病理性血管生成的病症或疾病的发展中的关键作用。VEGF mRNA由大多数检查到的人肿瘤过表达(Berkman等人，J Clin Invest 91:153-159(1993)；Brown等人，Human Pathol.26:86-91(1995)；Brown等人，Cancer Res.53:4727-4735(1993)；Mattern等人，Brit.J.Cancer.73:931-934(1996)；以及Dvorak等人，AmJ.Pathol.146:1029-1039(1995))。另外，VEGF在眼液中的浓度与患有糖尿病和其他局部缺血相关性视网膜病变患者中血管的活性增殖的存在高度相关(Aiello等人，N.Engl.J.Med.331:1480-1487(1994))。此外，研究已证实，VEGF在患者的脉络膜新生血管膜中的定位受AMD影响(Lopez等人，Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37:855-868(1996))。
抗-VEGF单克隆抗体是用于治疗实体肿瘤和各种眼内新生血管疾病的有前景的候选物。虽然VEGF分子在肿瘤细胞中上调，并且其受体在肿瘤浸润的血管内皮细胞中上调，但VEGF及其受体的表达在与血管生成无关的正常细胞中保持较低。抗-VEGF抗体包括但不限于贝伐单抗
Figure BDA0002502291250000611
和Brolucizumab、Vanucizumab(RG7221)和雷珠单抗
Figure BDA0002502291250000612
VEGF是表观分子量为约46kDa的二聚体，其中每个亚基具有约23kDa的表观分子量。已知VEGF的内皮细胞增殖活性由两种高亲和力酪氨酸激酶受体，VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(KDR/Flk-1)介导，其仅存在于血管内皮细胞的表面上。DeVries等人，Science225:989-991(1992)和Terman等人，Oncogene 6:1677-1683(1991)。Flt-1和KDR酪氨酸激酶受体两者均具有七个免疫球蛋白样(Ig-样)结构域，其形成受体的细胞外配体结合区，用于将受体锚定在其中表达该受体的细胞表面上的跨膜结构域和间杂有“激酶***序列”的细胞内催化酪氨酸激酶结构域。虽然KDR受体仅以高亲和力结合VEGF蛋白，但是Flt-1受体还结合胎盘生长因子(PLGF)，这是与VEGF具有显著结构同源性的分子。在细胞外配体结合区中具有七个Ig-样结构域的受体酪氨酸激酶的附加成员是VEGFR-3(Flt-4)，其不是VEGF或PLGF的受体，而是与不同的配体；VH1.4.5结合。VH1.4.5配体在文献中已报道为VEGF相关蛋白(VRP)或VEGF-C。
除了被称为内皮细胞特异性有丝***原之外，VEGF在血管生成生长因子中的独特之处在于其诱导血管对大分子的通透性瞬时增加的能力(因此其原始和替代名称为血管通透性因子，VPF)(参见Dvorak等人，(1979)J.Immunol.122:166-174；Senger等人，(1983)Science 219:983-985；Senger等人，(1986)Cancer Res.46:5629-5632)。通过提供用于内皮细胞迁移的临时基质，增加的血管通透性和所得的血浆蛋白在血管外空间的沉积有助于新血管形成(Dvorak等人，(1995)Am.J.Pathol.146:1029-1039)。高通透性确实是新血管(包括与肿瘤相关的那些血管)的特征性特征。
在一些实施方案中，本发明的VEGFR组分包含来源于Flt-1或KDR受体(或KDR受体的鼠同系物，Flk-1)细胞外配体结合区的一个或多个Ig-样结构域，其介导与VEGF蛋白的结合。在一些实施方案中，本发明的VEGFR组分包含来源于Flt-1和KDR受体两者(或KDR受体的鼠同系物，Flk-1)的细胞外配体结合区的Ig-样结构域，或其功能等同物，从而形成“嵌合VEGFR”组分。
Flt-1、Flt-4或Flk-1的术语“Ig-样结构域”旨在不仅涵盖完整的野生型结构域，而且还涵盖其基本上保留完整结构域的功能特性的***、缺失和/或取代的变体。对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，可获得Ig结构域的许多变体，所述变体将保留与野生型结构域基本上相同的功能特性。
当关于Ig-样结构域“X”使用时，术语“功能等同物”旨在涵盖具有至少一种改变(例如缺失、添加和/或取代)的Ig-样结构域“X”，其保留与野生型Ig结构域“X”基本上相同的功能特性，即与VEGF的基本上等同的结合。应当理解，关于这些受体组分结合和灭活VEGF的能力，可在不脱离本发明实质的情况下，在Ig结构域“X”中进行各种氨基酸取代。因此，可在本发明的VEGFR组分的一个或多个Ig-样结构域中进行点突变和其他更广泛的变化以便赋予有趣的特性，该特性不显著影响VEGFR组分与VEGF结合和抑制VEGF活性的能力。本发明的VEGFR组分的功能特性可通过本领域已知的用于测量所期望特性的任何合适的筛选测定法来测定。其他测定法，例如，与VEGF特异性结合的能力的变化，可通过竞争型VEGF结合测定法来测量。蛋白质特性(诸如热稳定性、疏水性、对蛋白水解降解的易感性、或聚集趋势)的修饰可通过本领域技术人员已知的方法进行测量。另外，参见部分“V.制备方法”下的子部分“1.氨基酸序列变体”。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR组分包含Flt-11或Flk-1的Ig-样结构域。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt-1的Ig-样结构域1(下文称为Flt1d1)、Flt1d2、Flt1d3、Flt1d4、Flt1d5、Flt1d6、Flt1d7，Flk-1的Ig-样结构域1(下文称为Flk1d1)、Flk1d2、Flk1d3、Flk1d4、Flk1d5、Flk1d6或Flk1d7。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR组分包含Flt-11或Flk-1的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个Ig-样结构域。在一些实施方案中，VEGFR组分包含2个、3个、4个、5个、6个或7个Ig-样结构域，其包含来自Flt-1和Flk-1的Ig-样结构域的混合物。例如，在一些实施方案中，VEGFR组分包含来自Flk-1的一个Ig-样结构域和来自Flt-1的两个Ig-样结构域。在一些实施方案中，VEGFR组分包含全部来自Flt-1的2个、3个、4个、5个、6个或7个Ig-样结构域。在一些实施方案中，VEGFR组分包含全部来自Flk-1的2个、3个、4个、5个、6个或7个Ig-样结构域。
在一些实施方案中，VEGFR组分包含来自Flt-1或Flt-1的2个、3个、4个、5个、6个或7个Ig-样结构域，其彼此直接连接。在一些实施方案中，VEGFR组分包含来自Flt-1或Flk-1的2个、3个、4个、5个、6个或7个Ig-样结构域，其经由结构域接头(诸如来自Flt-1或Flk-1的那些，例如连接Flt1d2和Flt1d3的结构域接头)连接。在一些实施方案中，VEGFR组分内的Ig-样结构域通过肽接头(参见，例如下文的肽接头部分)，诸如(GGGGS)n(SEQ ID NO：4)，其中n为1和8之间的整数，例如(GGGGS)3(SEQ ID NO:6)或(GGGGS)6(SEQ ID NO:7)连接。在一些实施方案中，VEGFR组分内的Ig-样结构域通过非肽接头(参见，例如下文的非肽接头部分)，诸如硫酯连接。
在一些实施方案中，VEGFR组分由Flt-1或Flk-1的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个Ig-样结构域组成。在一些实施方案中，VEGFR组分基本上由Flt-1或Flk-1的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个Ig-样结构域组成。在一些实施方案中，VEGFR组分包含不是来自Flt-1或Flk-1的Ig-样结构域的部分。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR组分包含第一VEGFR Flt-1的Ig-样结构域2(Flt1d2)。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含第二VEGFR Flk-1的Ig-样结构域3(Flk1d3)。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含第三VEGFR的Ig-样结构域和/或第四VEGFR的Ig-样结构域，其中Ig-样结构域选自Flk-1的Ig-样结构域4(Flk1d4)、Flk-1的Ig-样结构域1(Flk1d1)、Flk-1的Ig-样结构域5(Flk1d5)、Flk-1的Ig-样结构域4(Flt1d4)和Flt-1的Ig-样结构域5(Flt1d5)。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含第三VEGFR Flk-1的Ig-样结构域4(Flk1d4)。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2和Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分基本上由Flt1d2和Flk1d3组成。在一些实施方案中，VEGFR组分由Flt1d2和Flk1d3组成。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2、Flk1d3和Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分基本上由Flt1d2、Flk1d3和Flk1d4组成。在一些实施方案中，VEGFR组分由Flt1d2、Flk1d3和Flk1d4组成。
在一些实施方案中，本发明的VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含(并且在一些实施方案中由或基本上由下列组成)以下构型的轻链-VEGFR组分融合蛋白(从N-末端至C-末端)，其中L为任选的接头(诸如非肽接头或肽接头)：
FP1：轻链-L-Flk1d3-Flt1d2
FP2：轻链-L-Flk1d4-Flk1d3-Flt1d2
FP3：轻链-L-Flk1d3-Flt1d2-Flk1d1
FP4：轻链-L-Flt1d4-Flk1d3-Flt1d2
FP5：轻链-L-Flk1d5-Flk1d4-Flk1d3-Flt1d2
FP6：轻链-L-Flt1d5-Flt1d4-Flk1d3-Flt1d2
FP1’：轻链-L-Flt1d2-Flk1d3
FP2’：轻链-L-Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4
FP3’：轻链-L-Flk1d1-Flt1d2-Flk1d3
FP4’：轻链-L-Flt1d2-Flk1d3-Flt1d4
FP5’：轻链-L-Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4-Flk1d5
FP6’：轻链-L-Flt1d2-Flk1d3-Flt1d4-Flt1d5
在一些实施方案中，本文所述的Flt-1或Flk-1的一个或多个Ig-样结构域是VEGFR组分的唯一的Ig-样结构域。在一些实施方案中，Flt1d2是VEGFR组分的唯一Ig-样结构域。在一些实施方案中，Flt1d2和Flk1d3是VEGFR组分的唯一Ig-样结构域。在一些实施方案中，Flt1d2、Flk1d3和Flk1d4是VEGFR组分的唯一Ig-样结构域。在一些实施方案中，Flk1d1、Flt1d2和Flk1d3是VEGFR组分的唯一Ig-样结构域。在一些实施方案中，Flt1d2、Flk1d3和Flt1d4是VEGFR组分的唯一Ig-样结构域。在一些实施方案中，Flt1d2、Flk1d3和Flt1d4是VEGFR组分的唯一Ig-样结构域。在一些实施方案中，Flt1d2、Flk1d3、Flk1d4和Flk1d5是VEGFR组分的唯一Ig-样结构域。在一些实施方案中，Flt1d2、Flk1d3、Flt1d4和Flt1d5是VEGFR组分的唯一Ig-样结构域。
可设置接头序列以减少空间位阻，使得VEGFR组分和抗体轻链可假设其最佳三级结构和/或与其靶分子的适当地相互作用。在一些实施方案中，接头L为肽接头(参见下文“肽接头”部分)。在一些实施方案中，接头L包含(GGGGS)n的氨基酸序列，其中n为介于1和8之间的整数，例如(GGGGS)3(SEQ ID NO:6)、或(GGGGS)6(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含第一VEGFR组分和第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分各自包含第一VEGFR Flt1d2。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分各自包含第一VEGFR Flt1d2和第二VEGFR Flk1d3。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分各自从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第一和/或第二VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分各自包含第一VEGFR Flt1d2、第二VEGFR Flk1d3和第三VEGFR Flk1d4。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分各自从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分包含Flt-1或Flk-1的2个Ig-样结构域，第二VEGFR组分包含Flt-1或Flk-1的3个Ig-样结构域。在一些实施方案中，第一VEGFR组分包含Flt-1或Flk-1的3个Ig-样结构域，第二VEGFR组分包含Flt-1或Flk-1的4个Ig-样结构域。在一些实施方案中，第一VEGFR组分包含Flt-1或Flk-1的4个Ig-样结构域，第二VEGFR组分包含Flt-1或Flk-1的5个Ig-样结构域。在一些实施方案中，第一VEGFR组分从N-末端至C-末端包含Flt1d2-Flk1d3，并且第二VEGFR组分从N-末端至C-末端包含Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分包含相同数目的具有不同序列的Ig-样结构域。例如，在一些实施方案中，第一VEGFR组分从N-末端至C-末端包含Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，第二VEGFR组分从N-末端至C-末端包含Flk1d1-Flt1d2-Flk1d3。在一些实施方案中，第一VEGFR组分从N-末端至C-末端包含Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，并且第二VEGFR组分从N-末端至C-末端包含Flt1d2-Flk1d3-Flt1d4。
VEGFR组分尺寸
本发明的VEGFR组分为至少约4kDa。在一些实施方案中，本发明的VEGFR组分为约4kDa至约95kDa、约4kDa至约10kDa、约10kDa至约15kDa、约15kDa至约20kDa、约20kDa至约25kDa、约25kDa至约30kDa、约30kDa至约35kDa、约35kDa至约40kDa、约40kDa至约45kDa、约45kDa至约50kDa、约50kDa至约55kDa、约55kDa至约60kDa、约60kDa至约65kDa、约65kDa至约70kDa、约70kDa至约75kDa、约75kDa至约80kDa、约80kDa至约85kDa、约85kDa至约90kDa、约90kDa至约95kDa、约4kDa至约15kDa、约4kDa至约30kDa、约4kDa至约43kDa、约4kDa至约56kDa、约4kDa至约69kDa、约4kDa至约82kDa、约15kDa至约30kDa、约15kDa至约43kDa、约15kDa至约56kDa、约15kDa至约69kDa、约15kDa至约82kDa、约15kDa至约95kDa、约25kDa至约43kDa、约25kDa至约56kDa、约25kDa至约69kDa、约25kDa至约82kDa、约25kDa至约95kDa、约40kDa至约56kDa、约40kDa至约69kDa、约40kDa至约82kDa、约40kDa至约95kDa、约50kDa至约69kDa、约50kDa至约75kDa、约50kDa至约82kDa、约50kDa至约95kDa、约65kDa至约75kDa、约65kDa至约82kDa、约65kDa至约95kDa、约75kDa至约82kDa、或约75kDa至约95kDa。在一些实施方案中，VEGFR组分为约23.2kDa。
本发明的VEGFR组分的长度为至少约36个氨基酸(aa)。在一些实施方案中，本发明的VEGFR组分的长度为约36个aa至约864个aa、约36个aa至约91个aa、约91个aa至约136个aa、约136个aa至约182个aa、约182个aa至约227个aa、约227个aa至约273个aa、约273个aa至约318个aa、约318个aa至约364个aa、约364个aa至约409个aa、约409个aa至约455个aa、约455个aa至约500个aa、约500个aa至约545个aa、约545个aa至约591个aa、约591个aa至约636个aa、约636个aa至约682个aa、约682个aa至约727个aa、约727个aa至约773个aa、约773个aa至约818个aa、约818个aa至约864个aa、约36个aa至约136个aa、约36个aa至约273个aa、约36个aa至约391个aa、约36个aa至约509个aa、约36个aa至约627个aa、约36个aa至约745个aa、约36个aa至约745个aa、约136个aa至约273个aa、约136个aa至约391个aa、约136个aa至约509个aa、约136个aa至约627个aa、约136个aa至约745个aa、约136个aa至约864个aa、约227个aa至约391个aa、约227个aa至约509个aa、约227个aa至约627个aa、约227个aa至约745个aa、约227个aa至约864个aa、约364个aa至约509个aa、约364个aa至约627个aa、约364个aa至约745个aa、约364个aa至约864个aa、约455个aa至约627个aa、约455个aa至约682个aa、约455个aa至约745个aa、约455个aa至约864个aa、约591个aa至约682个aa、约591个aa至约745个aa、约591个aa至约864个aa、约682个aa至约745个aa、或约682个aa至约864个aa。在一些实施方案中，VEGFR组分的长度为约211aa。
VEGFR结合亲和力
本文所述的VEGFR组分与VEGF的结合特异性可通过本领域已知的方法进行实验测定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore测试和肽扫描。
基于ELISA的结合测定法可如实施例2所述进行。简而言之，可用VEGF(或待测试的抗原，例如PD-1)涂覆ELISA板，然后将不同浓度的VEGFR-抗体轻链融合蛋白(或任何待测试的抗体)添加到每个孔中。在温育和洗涤之后，可添加二级抗体诸如HRP缀合的抗-IgGFc抗体，以检测与VEGF(或待测试的抗原)结合的VEGFR-抗体轻链融合蛋白(或任何待测试的抗体)。将HRP底物加入每个孔中。每个孔的光密度(OD)可使用酶标仪在450nm下测量。然后可计算EC50。
在一些实施方案中，本文所述的VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD或EC50为约10-5M至约10-15M。在一些实施方案中，本文所述的VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-5M至约10-6M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10- 10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-12M至约10-13M、约10-13M至约10-14M、约10-14M至约10-15M、约10-5M至约10-15M、约10-6M至约10-15M、约10-7M至约10-15M、约10-8M至约10-15M、约10-9M至约10-15M、约10-10M至约10-15M、约10-11M至约10-15M、约10-12M至约10-15M、约10-13M至约10-15M、约10-5M至约10-14M、约10-7M至约10-14M、约10-8M至约10-14M、约10-9M至约10-14M、约10-10M至约10-14M、约10-11M至约10-14M、约10-12M至约10-14M、约10-5M至约10-13M、约10-7M至约10-13M、约10-8M至约10-13M、约10-9M至约10-13M、约10-10M至约10-13M、约10-11M至约10-13M、约10-5M至约10- 12M、约10-7M至约10-12M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-5M至约10-11M、约10-6M至约10-11M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-5M至约10-10M、约10-6M至约10-10M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M、约10-5M至约10- 9M、约10-6M至约10-9M、约10-7M至约10-9M、约10-5M至约10-8M,10-6M至约10-8M、或10-5M至约10- 7M。在一些实施方案中，抗体融合蛋白以约0.5pM的亲和力与VEGF结合。在一些实施方案中，抗体融合蛋白以约10nM至约40nM的EC50与VEGF结合。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含与两种抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的第一VEGFR组分和第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分具有相似的结合亲和力。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二EGFR组分具有不同的结合亲和力。
在一些实施方案中，第二VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD大于第一VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD。例如，第二VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD可以为第一VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD的约1-10倍、约10-20倍、约20-30倍、约30-40倍、约40-50倍、约50-60倍、约60-70倍、约70-80倍、约80-90倍、约90-100倍、约100-500倍、或约500-1000倍。
在一些实施方案中，VEGFR组分与抗体轻链的C-末端的融合不影响VEGFR组分与VEGF的结合亲和力。在一些实施方案中，VEGFR组分与抗体轻链的C-末端的融合降低了VEGFR组分与VEGF的结合亲和力，使得融合的VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD可以为未融合的VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD的约1-10倍、约10-20倍、约20-30倍、约30-40倍、约40-50倍、约50-60倍、约60-70倍、约70-80倍、约80-90倍、约90-100倍、约100-500倍或约500-1000倍。
在一些实施方案中，VEGFR组分与抗体轻链的C-末端的融合不影响抗体与其靶抗原的结合亲和力。在一些实施方案中，VEGFR组分与抗体轻链的C-末端的融合降低了抗体与其靶抗原的结合亲和力，使得VEGFR融合的抗体与其靶抗原之间的结合的KD可以为未融合抗体与其靶抗原之间的结合的KD的约1-10倍、约10-20倍、约20-30倍、约30-40倍、约40-50倍、约50-60倍、约60-70倍、约70-80倍、约80-90倍、约90-100倍、约100-500倍或约500-1000倍。
在一些实施方案中，VEGFR组分与抗体轻链的C-末端的融合增加了抗体与其靶抗原的结合亲和力(例如，通过经由相同细胞处的VEGFR-VEGF的结合稳定抗体-抗原的结合)，使得VEGFR融合的抗体与其靶抗原之间的结合的KD可以低于未融合的抗体与其靶抗原之间的结合的KD的约1-10倍、约10-20倍、约20-30倍、约30-40倍、约40-50倍、约50-60倍、约60-70倍、约70-80倍、约80-90倍、约90-100倍、约100-500倍、或约500-1000倍。
因此，在一些实施方案中，VEGFR融合的抗体与抗体靶抗原之间的结合的KD为约10-5M至约10-13M。在一些实施方案中，VEGFR融合的抗体与抗体靶抗原之间的结合的KD为约10- 5M至约10-6M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-12M至约10-13M、约10-5M至约10-13M、约10-6M至约10-13M、约10-7M至约10-13M、约10-8M至约10-13M、约10-9M至约10-13M、约10-10M至约10-13M、约10-11M至约10-13M、约10-5M至约10-12M、约10-6M至约10-12M、约10-7M至约10-12M、约10-8M至约10- 12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-5M至约10-11M、约10-7M至约10-11M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、约10-5M至约10-10M、约10-7M至约10-10M、约10-8M至约10-10M、约10-5M至约10-9M、约10-7M至约10-9M、约10-5M至约10-8M、或约10-6M至约10-8M。在一些实施方案中，VEGFR融合的抗体与抗体靶抗原之间的结合的KD为约10-8M至约10-16M。在一些实施方案中，VEGFR融合的抗体与抗体靶抗原之间的结合的KD为约10-5M至约10-6M、约10-6M至约10-7M、约10-7M至约10-8M、约10-8M至约10-9M、约10-9M至约10-10M、约10-10M至约10-11M、约10-11M至约10-12M、约10-12M至约10-13M、约10-13M至约10-14M、约10-14M至约10-15M、约10-15M至约10-16M、约10-8M至约10-16M、约10-9M至约10-16M、约10-10M至约10-16M、约10-11M至约10-16M、约10-12M至约10-16M、约10-13M至约10-16M、约10-14M至约10-16M、约10-8M至约10-15M、约10-9M至约10-15M、约10-10M至约10-15M、约10-11M至约10-15M、约10-12M至约10-15M、约10-13M至约10-15M、约10-8M至约10-14M、约10-9M至约10-14M、约10-10M至约10-14M、约10-11M至约10-14M、约10-12M至约10-14M、约10- 8M至约10-13M、约10-9M至约10-13M、约10-10M至约10-13M、约10-11M至约10-13M、约10-8M至约10- 12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M、约10-8M至约10-11M、约10-9M至约10-11M、或约10- 8M至约10-10M。在一些实施方案中，VEGFR融合的抗体与抗体靶抗原之间的结合的EC50为约1nM至约30nM。
抗体平台
本发明的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的抗体可具有任何可能的形式。
在一些实施方案中，抗体包含单一多肽链。在一些实施方案中，抗体包含多于一个(诸如2个、3个、4个或更多个中的任一者)多肽链。一个或多个多肽链可具有任何长度，诸如至少约10个、20个、50个、100个、200个、300个、500个或更多个氨基酸长中的任一者。在多链抗体的情况下，编码多肽链的核酸序列可以可操作地连接至相同启动子或不同启动子。
天然抗体，诸如单克隆抗体，是与特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子。在一些实施方案中，抗体为激动性抗体。在一些实施方案中，抗体为拮抗性抗体。在一些实施方案中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为选自Fab、Fab’、F(ab’)2的抗原结合片段，微抗体，以及全长抗体的其他抗原结合子序列或它们的包含轻链恒定结构域的工程化组合。在一些实施方案中，抗体为人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体为一价抗体。在一些实施方案中，抗体为多价抗体，诸如二价抗体或四价抗体。在一些实施方案中，抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，抗体为多特异性抗体。
本发明的抗体(诸如，抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-CTLA-4、抗-HER2、抗-EGFR、抗-Ang2抗体、抗-TNFα抗体、或抗-IL-17A抗体)包含重链和轻链。在一些实施方案中，重链包含VH结构域。在一些实施方案中，重链还包含一个或多个恒定结构域，诸如CH1、CH2、CH3、或它们的任何组合。在一些实施方案中，轻链包含VL结构域。在一些实施方案中，轻链还包含恒定结构域，诸如CL。在一些实施方案中，重链和轻链经由多个二硫键彼此连接。在一些实施方案中，抗体包含Fc，诸如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段。在一些实施方案中，抗体不包含Fc片段。在一些实施方案中，抗体为抗原结合片段，其为Fab。
抗体形式
本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的抗体可具有任何抗体或抗体片段形式，其包含轻链(例如，包含VL-CL结构域的轻链)，诸如全长抗体、IgG-IgG、IgG来源分子、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab’)2-scFv2、Fab-scFv-Fc、微抗体、对接和锁定(Dock and Lock)、scFv、二-scFv、双体抗体、双体抗体-Fc、双体抗体-CH3、胞内抗体、以及全长抗体的其他抗原结合子序列或它们的工程化组合。在一些实施方案中，轻链包含VL和CL结构域。在一些实施方案中，包含轻链的抗体片段包含VL-L-CL(L为任选的接头)。在一些实施方案中，包含轻链的抗体片段包含VH-L1-VL-L2-CL(L1和L2为任选的接头)。在一些实施方案中，包含轻链的抗体片段包含VL1-L1-CL-L2-VL2-L3-VH2、或VL1-L1-CL-L2-VH2-L3-VL2，(L1、L2、L3为任选的接头)。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。对于包含挽救受体结合表位残基并且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。对于多特异性抗体的综述，参见Weidle等人，Cancer Genomics Proteomics,10(1):1-18,2013；Geering和Fussenegger，Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015；Stamova等人，Antibodies,1(2):172-198,2012。抗体片段可通过各种技术制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.Coli)或噬菌体)制备，如本文所述的。
在一些实施方案中，本发明的抗体是全长抗体(例如，具有人免疫球蛋白恒定区)，诸如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM或免疫球蛋白衍生物。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(诸如双特异性的)。多特异性抗体对至少两种不同抗原或表位具有结合特异性(例如，双特异性抗体对两种抗原或表位具有结合特异性)。
多价和/或多特异性抗体
本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的抗体可以呈本领域已知的任何形式(参见，例如，Weidle等人，Cancer Genomics Proteomics,10(1):1-18,2013；Geering和Fussenegger，Trends Biotechnol.,33(2):65-79,2015；Stamova等人，Antibodies,1(2):172-198,2012；Spiess等人，Mol.Immunol.，2015年10月；67(2 Pt A):95-106)。抗体可以为包含Fc区的“IgG-来源分子”的形式类别。例如，抗体可以为但不限于下列的形式：IgG-IgG、Cov-X-Body、Common LC(轻链)、DAF(双作用Fab，其包含具有双特异性的进化的Fvs)、CrossMab、DutaMabTM、
Figure BDA0002502291250000721
LUZ-Y、Fcab、κ-λ抗体、Orthogonal Fab、DT-IgG(双重靶向IgG)、IgG-dsscFv2(二硫键稳定的scFv2)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、scFv-(L)IgG、IgG(L)-scFv、DVD(双可变结构域)、IgG-dsFv(二硫键稳定的Fv)、加工的IgG-dsFv、IgG(L,H)-Fv、V(H)-IgG、V(L)-IgG、IgG(H)-V、IgG(L)-V、杵臼结构(Knobs-into-holes)、电荷对、Fab-臂交换、SEEDbody(链交换工程化结构域)、IgG-scFab(单链Fab)、scFab-dsscFv、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、ZybodyTM、或DVI-IgG。杵臼结构技术可用于例如common LC、CrossMab、IgG-dsFv或IgG-scFab中的不同H-链的异源二聚化。抗体也可以为“Fc-较少双特异性”形式类别，其通常包含经由接头融合在一起的具有不同特异性的单个Fab。例如，抗体可以为但不限于以下形式：F(ab’)2、F(ab’)2-scFv2、Fab-scFv2、Fab-scFv、Fab-scFv-Fc、DNL-F(ab)3(对接和锁定型三价Fab)、scFv、scFv-scFv(例如，
Figure BDA0002502291250000731
)、双体抗体、scBsDb(单链双特异性双体抗体)、DART(双亲和力重靶向分子)、TandAb(四价串联抗体)、scBsTaFv(单链双特异性串联可变结构域)、双体抗体-CH3、Fab-scFv。二价-或三价Fab-scFv或Fab-scFv2形式通过VH-CH1和/或L链与scFvs的融合产生。根据本公开的待使用的抗体可以为前述抗体形式中任一种的化学修饰的衍生物，或者其可包含配体、肽或它们的组合。根据本公开的待使用的抗体还可使用本领域已知的常规技术进一步修饰，例如通过单独或组合地使用一个或多个氨基酸缺失、***、取代、添加和/或重组和/或本领域已知的一种或多种任何其他修饰(诸如翻译后修饰和化学修饰，诸如糖基化和磷酸化)。用于此类修饰的化学/生化或分子生物学方法是本领域已知的，并且尤其在实验室手册中有所描述(参见Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，1989和第三版，2001；Gerhardt等人；Methods for General and MolecularBacteriology；ASM Press，1994；Lefkovits；Immunology Methods Manual:TheComprehensive Sourcebook of Techniques；Academic Press，1997；Golemis；Protein-Protein Interactions:A Molecular Cloning Manual；Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2002)。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305:537(1983))，WO 93/08829，和Traunecker等人，EMBO J.10:3655(1991))，以及“杵臼结构”工程化(参见，例如，美国专利5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下方法来制备：工程化静电转向效应以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利4,676,980和Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链以制备双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；以及制备三特异性抗体，如例如在Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所述的。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“Octopus抗体”(参见，例如，US 2006/0025576A1)。
接头
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白可包含介于VEGFR组分和抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)之间的接头。VEGFR-抗体轻链融合蛋白中所用的一个或多个接头的长度、柔韧性程度和/或其他特性可对以下特性具有一定影响，所述特性包括但不限于对一种或多种特定抗原或表位以及VEGFR组分的亲和力、特异性或亲合力。例如，可选择较长的接头以确保两个相邻结构域彼此在空间上不干扰。在一些实施方案中，接头(诸如肽接头)包含柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)，使得相邻结构域可相对于彼此自由移动。例如，甘氨酸-丝氨酸双峰可以为合适的肽接头。在一些实施方案中，接头为非肽接头。在一些实施方案中，接头为肽接头。在一些实施方案中，接头为不可裂解的接头。在一些实施方案中，接头为可裂解的接头。
其他接头考虑因素包括对所得化合物的物理或药代动力学特性的影响，诸如溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(或多或少稳定的以及计划降解)、刚性、柔韧性、免疫原性、抗体结合的调节、结合到胶束或脂质体中的能力等。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含两种VEGFR组分，其中第一VEGFR组分和第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)通过第一接头连接，并且第二VEGFR组分和第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)通过第二接头连接。在一些实施方案中，第一接头和第二接头相同。在一些实施方案中，第一接头和第二接头不同。在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含两种VEGFR组分，其中仅一种VEGFR组分和抗体轻链的一个C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)通过接头连接。
非肽接头
VEGFR组分和抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)的偶联可通过将结合两个分子的任何化学反应来完成，只要抗体和VEGFR组分分别保留其对应的活性，即与特异性抗原和VEGF的结合即可。这种连接可包括许多化学机制，例如共价键合、亲和力结合、嵌入、配位结合和络合。在一些实施方案中，结合为共价键合。可通过现有侧链的直接缩合或通过掺入外部桥接分子来实现共价结合。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子(诸如VEGFR组分)偶联到本发明的抗体。例如，代表性偶联剂可包括有机化合物，诸如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和己二胺。该列表并非旨在穷尽本领域已知的多种类型的偶联剂，而是较常见的偶联剂的示例(参见，Killen和Lindstrom，Jour.Immun.133:1335-2549(1984)；Jansen等人，Immunological Reviews 62:185-216(1982)；和Vitetta等人，Science 238:1098(1987))。
可应用于本申请中的接头描述于文献中(参见，例如，Ramakrishnan,S.等人，Cancer Res.44:201-208(1984))，其描述了使用MBS(M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)。在一些实施方案中，本文所用的非肽接头包括：(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.，目录号(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基]己酸酯(Pierce Chem.Co.，目录号#21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.，目录号#2165-G)；和(v)缀合至EDC的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem.Co.，目录号#24510)。
上述接头包含具有不同属性的组分，从而导致具有不同生理化学特性的VEGFR-抗体融合蛋白。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳族羧酸酯的磺基-NHS酯更稳定。包含NHS-酯的接头比磺基-NHS酯更不易溶解。此外，接头SMPT包含空间位阻型二硫键，并且可形成具有增加的稳定性的抗体融合蛋白。一般来讲，二硫键比其他键更不稳定，因为二硫键在体外裂解，从而导致可用的抗体融合蛋白较少。具体地讲，磺基-NHS可增强碳二亚胺偶联的稳定性。当与磺基-NHS结合使用时，碳二亚胺偶合物(诸如EDC)形成比单独的碳二亚胺偶联反应更耐水解的酯。
肽接头
肽接头可具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，仅来源于抗体重链铰链区的序列可用作接头。参见，例如，WO1996/34103。
肽接头可具有任何适合的长度。在一些实施方案中，肽接头为至少约下列中的任一者：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100个或更多个氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头不超过约下列中的任一者：100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5个或更少个氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头的长度为下列中的任一者：约1个氨基酸至约10个氨基酸、约1个氨基酸至约20个氨基酸、约1个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约25个氨基酸、约5个氨基酸至约30个氨基酸、约10个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约50个氨基酸、约50个氨基酸至约100个氨基酸、或约1个氨基酸至约100个氨基酸。
此类肽接头的基本技术特征在于所述肽接头不包含任何聚合活性。肽接头的特性，其中包括缺乏二级结构的促进是本领域已知的，并且描述于例如，Dall’Acqua等人(Biochem.(1998)37,9266-9273)，Cheadle等人，(Mol Immunol(1992)29,21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中。在“肽接头”的上下文中特别优选的氨基酸是Gly。此外，优选也不促进任何二级结构的肽接头。结构域彼此的连接可通过例如基因工程提供。用于制备融合的和可操作地连接的双特异性单链构建体并在哺乳动物细胞或细菌中表达它们的方法是本领域所熟知的(例如WO 99/54440，Ausubel,Current Protocols inMolecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.1989和1994，或Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。
肽接头可以是稳定的接头，其不可被蛋白酶裂解，尤其是被基质金属蛋白酶(MMP)裂解。
接头也可以为柔性接头。示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n(SEQ ID NO:1)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括，例如，(GS)n(SEQ ID NO:2)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:3)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:4)和(GGGS)n(SEQ ID NO:5)，其中n为至少一的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸聚合物和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对未结构化的，因此可能能够充当组分之间的中性系链。甘氨酸甚至比丙氨酸进入显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基更少地受到限制(参见，Scheraga,Rev.Computational Chem.11 173-142(1992))。普通技术人员将认识到，抗体融合蛋白的设计可包括全部或部分柔性的接头，使得接头可包括柔性接头部分以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分，以提供期望的抗体融合蛋白结构。
在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过具有足够长度的接头连接在一起，以使得VEGFR组分-轻链能够以允许与VEGF和由抗体特异性识别的抗原结合的方式折叠。除该实施方案之外，此类接头还可包含例如诸如(GGGGS)n的氨基酸序列，其中n为介于1和8之间的整数，例如(GGGGS)3(SEQ ID NO:6；下文被称为“(G4S)3”或“GS3”)，或(GGGGS)6(SEQ ID NO:7；下文被称为“(G4S)6”或“GS6”)。在一些实施方案中，肽接头包含(GSTSGSGKPGSGEGS)n的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)，其中n为介于1和3之间的整数。
特异性识别免疫检查点分子的抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体融合蛋白包含特异性识别免疫检查点分子的抗体(诸如，抗-PD-1、抗-PD-L1、或抗-CTLA-4全长抗体)，以及与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分。特异性识别免疫检查点分子的抗体在本文中可互换地称为“免疫检查点调节剂”。
免疫检查点是在免疫体系中发出(刺激分子)或关闭信号(抑制分子)的分子。免疫检查点蛋白调节并维持自我耐受性以及生理免疫应答的持续时间和幅度。刺激性检查点分子包括但不限于CD27、CD40、OX40、GITR和CD137，其属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族，以及CD28和ICOS，其属于B7-CD28超家族。抑制性检查点分子包括但不限于：程序死亡1(PD-1)、细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3，HAVCR2)、T细胞激活的V-结构域Ig抑制因子(VISTA，B7-H5)、B7-H3、B7-H4(VTCN1)、HHLA2(B7-H7)、B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减子(BTLA)，吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、腺苷A2A受体(A2AR)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、2B4(CD244)及其配体。许多检查点蛋白已被广泛研究，诸如CTLA-4及其配体CD86(B7-1)和CD86，以及PD-1(CD279)及其配体PD-L1(B7-H1，CD274)以及PD-L2(B7-DC，CD273)(参见，例如，Pardoll,Nature Reviews Cancer 12:252-264(2012))。
特异性识别免疫检查点分子的抗体或本发明的“免疫检查点调节剂”可以为免疫检查点抑制剂(抑制性免疫检查点分子的抑制剂)或刺激性免疫检查点分子的活化剂。免疫检查点抑制剂(抑制性免疫检查点分子的抑制剂)在本发明中是特别受关注的，诸如PD-1(CD279)、PD-L1(B7-H1、CD274)、PD-L2(B7-DC、CD273)、LAG-3、TIM-3(HAVCR2)、BTLA、CTLA-4、TIGIT、VISTA(B7-H5)、B7-H4(VTCN1)、CD160(BY55)、HHLA2(B7-H7)、2B4(CD244)、CD73、B7-1(CD80)、B7-H3(CD276)、KIR或IDO的抑制剂。
在一些实施方案中，特异性识别免疫检查点分子的抗体是刺激性免疫检查点分子的活化剂，例如激动剂抗体，例如，抗-CD28、抗-OX40、抗-ICOS、抗-GITR、抗-4-1BB、抗-CD27、抗-CD40、抗-CD3、以及抗-HVEM。
在一些实施方案中，特异性识别免疫检查点分子的抗体是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂靶向T细胞。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂靶向肿瘤细胞。例如，在一些情况下，当肿瘤细胞连接至特异性T细胞受体时，其可关闭激活的T细胞。然而，免疫检查点抑制剂可防止肿瘤细胞附接至T细胞，使得T细胞保持激活(参见，例如，Howard West，JAMA Oncol.1(1):115(2015))。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是靶向抑制性免疫检查点蛋白的抗体(诸如拮抗剂抗体)，其包括但不限于抗-CTLA-4、抗-TIM-3、抗-LAG-3、抗-KIR、抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-CD73、抗-B7-H3、抗-CD47、抗-BTLA、抗-VISTA、抗-A2AR、抗-B7-1、抗-B7-H4、抗-CD52、抗-IL-10、抗-IL-35、以及抗-TGF-β。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂为选自下列的抑制性检查点分子的抑制剂：PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、HHLA2、CD160、CD73、BLTA、B7-H4、TIGIT和VISTA。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是特异性识别PD-1的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是特异性识别PD-L1的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是特异性识别CTLA-4的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是特异性识别至少两种不同抑制性免疫检查点分子的抗体(例如，双特异性抗体)。
CTLA-4
细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4或CD152)是CD28的同源物，并且被称为在活化的T细胞上上调的抑制性免疫检查点分子。CTLA-4还与B7-1和B7-2结合，但具有比CD28更大的亲和力。B7和CTLA-4之间的相互作用抑制了T细胞活化，这构成肿瘤免疫逃逸的重要机制。抗-CTLA-4抗体疗法(诸如伊匹单抗，例如，
Figure BDA0002502291250000791
)已在多种癌症，诸如黑素瘤中示出前景。
可施用于本申请的示例性抗-CTLA-4抗体包括但不限于伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000792
)和特雷莫单抗(以前是替西木单抗，CP-675,206)。
伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000793
)是完全人抗-CTLA-4免疫球蛋白G1(IgG1)单克隆抗体(mAb)，其阻断T细胞活化的下调。伊匹单抗是CTLA-4免疫检查点抑制剂，其阻断由CTLA-4通路诱导的T细胞抑制信号，并增加肿瘤反应性T效应细胞的数量。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别CTLA-4的抗体(诸如全长抗体)(下文中被称为“抗-CTLA-4抗体”)。在一些实施方案中，抗-CTLA-4抗体包括：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-CTLA-4抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-CTLA-4抗体为伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000794
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-CTLA-4抗体与本文所述的抗-CTLA-4抗体中的任一种竞争性结合CTLA-4。
PD-1
PD-1是调节T细胞活化和耐受性的B7/CD28家族共刺激分子的一部分，因此拮抗性的抗-PD-1抗体可用于克服耐受性。PD-1已被定义为B7-4的受体。B7-4可在与免疫细胞上的抑制性受体结合时抑制免疫细胞活化。PD-1/PD-L1途径的参与导致T细胞效应子功能、细胞因子分泌和增殖的抑制。(Turnis等人，OncoImmunology 1(7):1172-1174,2012)。高水平的PD-1与耗尽的或长期刺激的T细胞相关联。此外，增加的PD-1表达与癌症患者的存活率降低相关。用于在免疫细胞中下调PD-1、B7-4以及B7-4与PD-1抑制性信号之间的相互作用的试剂可导致免疫应答增强。可施用于本申请中的示例性抗-PD-1抗体包括但不限于
Figure BDA0002502291250000801
(派姆单抗，MK-3475)和
Figure BDA0002502291250000802
(纳武单抗)。
派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000803
)为用于癌症免疫疗法中的人源化抗体。其靶向程序性细胞死亡1(PD-1)受体。所述药物最初用于治疗转移性黑素瘤。2014年9月4日，美国食品和药品监督管理局(FDA)根据FDA快速通道发展项目批准了
Figure BDA0002502291250000804
其已被批准用于晚期黑色素瘤。2015年10月2日，美国FDA批准
Figure BDA0002502291250000805
用于治疗患者的转移性非小细胞肺癌，所述患者的肿瘤表达PD-L1且用其他化疗试剂治疗失败。
纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000806
)是人IgG4抗-PD-1单克隆抗体。其与伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000807
)联合使用，以研究在非人灵长类中同时抑制PD-1和CTLA-4受体的影响。
Figure BDA0002502291250000808
在单一疗法或与伊匹单抗联合治疗多种肿瘤类型(包括肾细胞癌、黑色素瘤、NSCLC和某些淋巴瘤)时展示出临床疗效。BMS最近公布了免疫联合疗法
Figure BDA0002502291250000809
和伊匹单抗用于治疗黑素瘤的治疗结果。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别PD-1的抗体(诸如全长抗体)(下文中被称为“抗-PD-1抗体”)。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体包括：包含SEQID NO:12的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体为派姆单抗(例如，
Figure BDA00025022912500008010
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体为纳武单抗(例如，
Figure BDA00025022912500008011
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-PD-1抗体与本文所述的抗-PD-1抗体中的任一种竞争性地特异性结合PD-1。
PD-L1
PPD-L1(程序性细胞死亡配体1)也称为分化簇274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)。PD-L1用作PD-1的配体以在特定事件(诸如怀孕、组织***反应、自身免疫疾病和其他疾病状态，诸如肝炎和癌症)中，在抑制免疫***中起主要作用。PD-1受体/PD-L1配体复合物的形成传递抑制性信号，所述抑制性信号减少***中CD8+T细胞的增殖。可施用于本申请的示例性抗-PD-L1抗体包括但不限于，阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000811
)和德瓦鲁单抗(例如，MEDI4736,IMFINZITM)。
阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000812
)是针对PD-L1的IgG1同种型的完全人源化、工程化单克隆抗体。它是FDA批准的用于含铂化疗后的进行性晚期尿路上皮癌(例如，膀胱癌)、和非小细胞肺癌(NSCL)的免疫疗法。
德瓦鲁单抗(例如，IMFINZITM)是人免疫球蛋白G1κ(IgG1κ)单克隆抗体，其阻断PD-L1与PD-1和CD80(B7.1)分子的相互作用。它是FDA批准的用于局部晚期或转移性尿路上皮癌的免疫疗法。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别PD-L1的抗体(诸如全长抗体)(下文中被称为“抗-PD-L1抗体”)。在一些实施方案中，抗-PD-L1抗体包括：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-PD-L1抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-PD-L1抗体为阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000813
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-PD-L1抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-PD-L1抗体包含重链，所述重链包含SEQID NO:21的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-PD-L1抗体为德瓦鲁单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-PD-L1抗体与本文所述的抗-PD-L1抗体中的任一种竞争性地特异性结合PD-L1。
特异性识别肿瘤抗原的抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体融合蛋白包含特异性识别肿瘤抗原的抗体(诸如，抗-HER2或抗-EGFR全长抗体)，以及与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分。
在一些实施方案中，由抗体特异性识别的抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在一些实施方案中，TAA或TSA在癌细胞上表达。在一些实施方案中，TAA或TSA在血癌细胞上表达。在一些实施方案中，TAA或TSA在实体肿瘤的细胞上表达。作为非限制性示例，实体肿瘤癌症的某些形式包括胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、不是非小细胞肺癌的肺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、肝癌、结肠直肠癌、胃癌、脾癌、皮肤癌(诸如黑素瘤)、不是胶质母细胞瘤的脑癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、食道癌等。在一些实施方案中，TAA或TSA为下列中的一种或多种：EphA2、HER2、GD2、磷脂酰肌醇聚糖-3、5T4、8H9、αvβ6整联蛋白、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、κ轻链、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胎儿AchR、叶酸受体a、GD2、GD3、HLA-AIMAGE A1、HLA-A2、IL11Ra、IL13Ra2、KDR、λ、Lewis-Y、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSC1、PSMA、ROR1、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGFR2、癌胚抗原、HMW-MAA、VEGF受体、以及其他示例性抗原，其为存在于肿瘤细胞外基质内的抗原，诸如纤粘蛋白、腱生蛋白或肿瘤坏死区域的瘤胎变体。
在一些实施方案中，由抗体特异性识别的肿瘤抗原为HER2或EGFR(HER1)。
HER2
受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。受体家族包括四个不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
HER2(人表皮生长因子受体2，受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，CD340，p185neu)是由人类中的原癌基因ERBB2编码的蛋白质。它包含细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其可与众多信号传导分子相互作用并且表现出配体依赖性和配体不依赖性活性。HER2可与其他三种受体ErbB1、ErbB3和ErbB4中的任一种异源二聚化，并且被认为是其他ErbB受体的优选的二聚化伴侣。二聚化导致受体胞质结构域内的酪氨酸残基的自磷酸化，并引发多种促进细胞增殖和对抗细胞凋亡的信号传导通路，诸如促***原活化蛋白激酶(MAPK)、信号转导子和转录激活因子(STAT)、蛋白激酶C(PKC)和磷酸肌醇3-激酶(PI3K/Akt)通路。
p185neu最初被鉴定为来自经化学处理大鼠的成神经细胞瘤的转化基因的产物。neu原癌基因的活化形式由编码蛋白的跨膜区域中的点突变(缬氨酸到谷氨酸)产生，从而导致在不存在配体的情况下该蛋白的组成型二聚化。在乳腺癌和卵巢癌中观察到neu的人同系物的扩增，并且与不良预后相关(Slamon等人，Science,235:177-182(1987)；Slamon等人，Science,244:707-712(1989)；参见美国专利4,968,603)。到目前为止，尚未针对人肿瘤报道与neu原癌基因类似的点突变。HER2的过表达(由于基因扩增频繁地但不是均匀地)也已在其他癌中观察到，包括胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和膀胱癌。参见，King等人，Science,229:974(1985)；Yokota等人，Lancet:1:765-767(1986)；Fukushige等人，Mol Cell Biol.,6:955-958(1986)；Guerin等人，Oncogene Res.,3:21-31(1988)；Cohen等人，Oncogene,4:81-88(1989)；Yonemura等人，Cancer Res.,51:1034(1991)；Borst等人，Gynecol.Oncol.,38:364(1990)；Weiner等人，Cancer Res.,50:421-425(1990)；Kern等人，Cancer Res.,50:5184(1990)；Park等人，Cancer Res.,49:6605(1989)；Zhau等人，Mol.Carcinog.,3:254-257(1990)；Aasland等人，Br.J.Cancer 57:358-363(1988)；Williams等人，Pathobiology 59:46-52(1991)；以及McCann等人，Cancer,65:88-92(1990)，等。HER2可在***癌中过表达(Gu等人，Cancer Lett.99:185-9(1996)；Ross等人，Hum.Pathol.28:827-33(1997)；Ross等人，Cancer79:2162-70(1997)；以及Sadasivan等人，J.Urol.150:126-31(1993))。
可施用于本申请的示例性HER2抗体包括但不限于，曲妥珠单抗
Figure BDA0002502291250000831
曲妥珠单抗-美坦新偶联物
Figure BDA0002502291250000832
厄妥索单抗
Figure BDA0002502291250000833
和帕妥珠单抗
Figure BDA0002502291250000834
曲妥珠单抗
Figure BDA0002502291250000841
是五种最畅销的治疗性抗体之一，是人源化抗-HER2受体单克隆抗体，其可显著增加患有HER2-阳性乳腺癌患者的生存率。HER受体是嵌入细胞膜中的蛋白质，并且将来自细胞外部的分子信号(称为EGF的分子)传递到细胞内部，并打开和关闭基因。HER蛋白(人表皮生长因子受体(EGFR))结合人表皮生长因子，并刺激细胞增殖。在一些癌症中，特别是在某些类型的乳腺癌中，HER2过表达，并导致癌细胞不受控制地繁殖。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别HER2的抗体(诸如全长抗体)(下文中被称为“抗-HER2抗体”)。在一些实施方案中，抗-HER2抗体包括：包含SEQID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-HER2抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-HER2抗体为曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000845
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-HER2抗体与本文所述的抗-HER2抗体中的任一种竞争性地特异性结合HER2。
EGFR(HER1)
表皮生长因子受体(EGFR，HER1或ErbB-1)是表皮生长因子家族(EGF家族)成员的跨膜受体。EGFR是受体EGFR(ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)的ErbB家族的成员，它们是介导细胞生长、分化和存活的受体酪氨酸激酶。影响EGFR表达或活性的突变可导致癌症。EGFR可通过其特异性配体例如EGF(转化生长因子α(TGFα))的结合来活化。在活化时，EGFR二聚化刺激其固有的细胞内蛋白-酪氨酸激酶活性，在EGFR的C-末端结构域处的自磷酸化导致一系列信号转导级联，主要是MAPK、Akt和JNK通路，从而导致DNA合成和细胞增殖。
可施用于本申请的示例性抗-EGFR抗体包括但不限于，西妥昔单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000842
)和帕尼单抗(例如，ABX-EGF，
Figure BDA0002502291250000843
)。
西妥昔单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000844
)是一种重组的人/小鼠嵌合单克隆抗体，其特异性结合人EGFR的细胞外结构域。西妥昔单抗由小鼠抗-EGFR抗体的Fv区和人IgG1重链和κ轻链恒定区组成。
Figure BDA0002502291250000851
指示与放射疗法联合用于头颈部的局部或区域晚期鳞状细胞癌的初始治疗。
Figure BDA0002502291250000852
也指示用于治疗K-Ras野生型、EGFR表达、转移性结直肠癌(mCRC)。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别EGFR的抗体(诸如全长抗体)(下文中被称为“抗-EGFR抗体”)。在一些实施方案中，抗-EGFR抗体包括：包含SEQID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-EGFR抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-EGFR抗体为西妥昔单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗EGFR抗体与本文所述的抗-EGFR抗体中的任一种竞争性地特异性结合EGFR。
特异性识别血管生成因子的抗体
在一些实施方案中，本发明的抗体融合蛋白包含特异性识别血管生成因子的抗体(诸如，抗-Ang2、抗-TNFα、或抗-IL-17A全长抗体)，以及与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分。在一些实施方案中，特异性识别血管生成因子的抗体抑制或拮抗血管生成因子功能，并且在本文中可互换地称为“血管生成抑制剂”。
如前所述，血管生成是从现有脉管***生长新血管的过程。其在包括胚胎发育以及组织和伤口修复在内的多个生理过程中起重要作用(Folkman J等人，Angiogenicfactors.Science 1987；235:442-7)。血管生成的生理步骤已被很好地表征，并且涉及细胞外基质的蛋白水解，内皮细胞向管状通道的增殖、迁移和组装，壁细胞募集和分化以及细胞外基质产生(Carmeliet P等人，Nature.2011；473:298-307)。病理血管生成可发生于肿瘤形成、眼部障碍(例如，糖尿病性视网膜病、糖尿病性黄斑水肿或黄斑变性)、关节炎、牛皮癣、纤维性疾病、炎性疾病和动脉硬化中(Polverini PJ.Crit Rev Oral Biol Med.1995；6(3):230-47)。
在一些实施方案中，本发明的血管生成因子包括促血管生成素(ANG，诸如Ang1、Ang2、Ang3)、肝配蛋白(Eph)、成纤维细胞生长因子(FGF，诸如aFGF、bFGF)、神经纤毛蛋白(NRP)、纤溶酶原激活因子(诸如uPA、tPA)、血管生成素、血小板源性生长因子(PDGF)、血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、肿瘤生长因子β(TGF-β)、TGF-α、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮钙粘蛋白(VE-钙粘蛋白)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、缺氧诱导因子(HIF)、***生长因子(CTGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、***(IGF)、Del-1、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子/离散因子(HGF/SF)、瘦素、中期因子、胎盘生长因子、多效蛋白(PTN)、颗粒蛋白前体、增殖蛋白、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、白介素17(IL-17)、白介素18(IL-18)、白介素20(IL-20)、白介素23(IL-23)、化学引诱物诸如C-C基序配体(CCL28、CCL21)、C-X-C基序配体(CXCL1、CXCL5)、巨噬细胞游走抑制因子(MIF)、免疫细胞表面蛋白诸如分化簇(CD)及其受体。据报道，这些因子过表达并在血管生成相关疾病中起关键作用(Elshabrawy等人，Angiogenesis(2015)18:433-448；Brian P.Eliceiri,Circ.Res.2001年11月7日；89(12):1104-10)。
血管生成是一个复杂的生物学过程，其涉及各种生长因子和信号传导受体，并且靶向信号级联中的单一分子可能不为疾病诸如癌症中的不受控血管生成提供有效的临床治疗。因此，越来越需要开发能够以协同方式结合多种关键血管生成因子以有效抑制血管生成和疾病进展的创新疗法，如本申请中所提供的。
在一些实施方案中，特异性识别血管生成因子的抗体或血管生成抑制剂可以是与VEGF配体结合的抗-VEGF抗体(参见，例如，美国专利5,730,977、6,884,879和8,975,381)。在一些实施方案中，血管生成抑制剂可以为抗-Ang2抗体(参见，例如，美国专利6,166,185、7,5210,53和7,973,140)。
促血管生成素-2(Ang2)
促血管生成素-2(Ang2)是存在于血管内皮细胞中的受体Tie2的拮抗配体。据信通过与作为Tie2的激动剂的促血管生成素-1(Ang1)竞争结合Tie2来抑制通过Tie2的信号传导。Ang1，其为激活Tie2受体的配体，用作通过维持血管内皮细胞的屏障功能来维持血管稳定的关键调节剂。血管内皮细胞被活化，通过VEGF或炎症的过表达来展示，并且血管通透性增加。据认为，Ang1通过加速血管内皮细胞的连接完整性来诱导血管内皮细胞的稳定并降低血管通透性，其中活化的血管内皮细胞中增加的Ang2用于通过与Ang1竞争来抑制由Ang1获得的血管内皮细胞的稳定。因此，Ang2抑制Ang1-Tie2结合，所述结合维持血管内皮细胞的稳定性并因此维持信号传导，从而最终经由血管的动态重排来加速血管生成。
在正常的成人中，血管生成的三个主要部位是卵巢、胎盘和子宫，这些是其中已检测到Ang2 mRNA的正常(即，非癌性)组织中的主要组织。据称，许多已公布的研究已经证实在与血管生成相关的疾病状态下的血管选择性Ang2表达。这些病理性病症包括例如牛皮癣、黄斑变性和癌症(Bunone等人，American Journal of Pathology,155:1967-1976(1999)；Etoh,T.等人，Cancer Research,61:2145-2153(2001)；Hangai,M.等人，Investigative Ophthalmology&Visual Science,42:1617-1625(2001)；Holash,J.等人，Investigative Ophthalmology&Visual Science,42:1617-1625(1999)；Kuroda,K.等人，Journal of Investigative Dermatology,116:713-720(2001)；Otani,A.等人，Investigative Ophthalmology&Visual Science,40:1912-1920(1999)；Stratmann,A.等人，American Journal of Pathology,153:1459-1466(1998)；Tanaka,S.等人，J ClinInvest，103:34-345(1999)；Yoshida,Y.等人，International Journal of Oncology,15:1221-1225(1999)；Yuan,K.等人，Journal of Periodontal Research,35:165-171(2000)；Zagzag,D.等人，Experimental Neurology,159:391-400(1999))。这些研究中的大多数关注于癌症，其中许多肿瘤类型似乎显示出血管Ang-2表达。与其在病理血管生成中的表达不同，正常组织中的Ang-2表达极其有限(Maisonpierre,P.C.等人，Science,277:55-60(1997)；Mezquita,J.等人，Biochemical and Biophysical Research Communications,260:492-498(1999))。各种出版物已提出Ang-1、Ang-2和/或Tie-2作为抗癌治疗的可能的靶。
可施用于本申请的示例性抗-Ang2抗体包括但不限于尼伐单抗和Vanucizumab(RG7221)。
尼伐单抗(例如，REGN910)是最初被设计用于治疗癌症的实验性单克隆抗体，其靶向Ang2。截至2017年5月，它正处于用于治疗糖尿病性黄斑水肿的II期临床试验。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别Ang2的抗体(诸如全长抗体)(下文中被称为“抗-Ang2抗体”)。在一些实施方案中，抗-Ang2抗体包括：包含SEQID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-Ang2抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-Ang2抗体为尼伐单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-Ang2抗体与本文所述的抗-Ang2抗体中的任一种竞争性地特异性结合Ang2。
TNFα
肿瘤坏死因子(TNF、TNFα、恶病质或恶病质素)是参与全身炎症的细胞因子，并且是构成急性相反应的细胞因子之一。其主要由活化的巨噬细胞产生，并且也由其他细胞类型，诸如CD4+淋巴细胞、NK细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和神经元产生。TNFα主要参与免疫细胞的调节。其可引起发烧、凋亡细胞死亡、恶病质、炎症，并抑制肿瘤发生和病毒复制，并经由产生IL1和IL6的细胞对败血症作出反应。TNFα可促进体内血管生成。在角膜中，TNFα似乎刺激血管生长。
可施用于本申请的示例性抗-TNFα抗体包括但不限于，阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000881
)、英夫利西单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000882
Figure BDA0002502291250000883
)、赛妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000884
)、戈利木单抗(例如，CNTO148、
Figure BDA0002502291250000885
)、以及依那西普(例如，
Figure BDA0002502291250000886
)。
阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000887
)是一种针对TNFα具有特异性的重组DNA来源的人IgG1单克隆抗体，其用于治疗类风湿性关节炎(RA)、银屑病性关节炎(PsA)、强直性脊柱炎(AS)、克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎、斑块状银屑病(Ps)、化脓性汗腺炎和青少年特发性关节炎(JIA)。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别TNFα的抗体(诸如全长抗体)(在下文中称为“抗TNFα抗体”)。在一些实施方案中，抗-TNFα抗体包括：包含SEQID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-TNFα抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-TNFα抗体为阿达木单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-TNFα抗体与本文所述的抗-TNFα抗体中的任一种竞争性地特异性结合TNFα。
IL-17A
白介素-17A(IL-17，CTLA8)是由活化的T细胞产生的促炎细胞因子，并且调节NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活性。高水平的IL-17A与多种慢性炎性疾病相关，所述慢性炎性疾病包括类风湿性关节炎、牛皮癣和多发性硬化症。还发现IL-17A产生与哮喘严重性之间的正相关性。IL-17A可通过诱导IL-6来增强体内肿瘤生长，这继而激活致癌转录因子STAT3并促进肿瘤存活和血管生成。例如，IL-17A似乎通过促进从癌细胞产生VEGF，从而有利于血管生成，而有利于结直肠癌的发展。
可施用于本申请的示例性抗-IL-17A抗体包括但不限于，伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000891
)，和苏金单抗(例如,
Figure BDA0002502291250000892
)。
伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250000893
)是阻断IL-17A和减少炎症的人源化单克隆抗体。它已被批准用于治疗中度到重度斑块状银屑病。
在一些实施方案中，VEGFR-抗体轻链融合蛋白包含特异性识别IL-17A的抗体(诸如全长抗体)(下文中被称为“抗-IL-17A抗体”)。在一些实施方案中，抗-IL-17A抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-IL-17A抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-IL-17A抗体为伊克珠单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-IL-17A抗体与本文所述的抗-IL-17A抗体中的任一种竞争性地特异性结合IL-17A。
抗体变体
在一些实施方案中，设想本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。抗体的氨基酸序列变体可通过将适当的修饰引入编码抗体的核酸序列中，或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或***和/或取代。为了得到最终构建体，可进行缺失、***和取代的任何组合，前提条件是最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。
a)取代、***、缺失和变体
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的感兴趣的位点包括HVR和FR。保守取代在表1中以“优选的取代”标题示出。更显著的变化以“示例性取代”的标题提供，并且如下文关于氨基酸侧链类别进一步描述的。可将氨基酸取代引入感兴趣的抗体中，并筛选产物以获得期望的活性，例如保留的/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。另外，参见部分“V.制备方法”下的子部分“1.氨基酸序列变体”。
表1：氨基酸取代
原始残基 示例性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn:Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
lie(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln:Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Tip；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu:Met；Phe:Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可根据常见的侧链特性进行分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
取代变体的一种类型涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般来讲，选择用于进一步研究的一种或多种所得变体相对于亲本抗体将具有某些生物特性的修饰(例如改善)(例如，增加的亲和力、减小的免疫原性)和/或将基本上保留的亲本抗体的某些生物特性。示例性替代变体是亲和力成熟的抗体，其可方便地生成，例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，诸如本文所述的那些。简而言之，将一个或多个HVR残基突变，并且变体抗体在噬菌体上显示并针对特定的生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
改变(例如，取代)可在HVR中进行，例如以改善抗体亲和力。此类改变可在HVR“热点”中进行，即，在体胚细胞成熟过程中由以高频率进行突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或SDR(a-CDR))，并且测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建和从二级文库重新选择而进行的亲和力成熟已描述于例如，Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任一种(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入被选择用于成熟的可变基因中。然后，创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中使多个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。参与抗原结合的HVR残基可例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定。具体地讲，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在一些实施方案中，取代、***或缺失可在一个或多个HVR内进行，只要此类改变不显著降低抗体结合抗原的能力即可。例如，可在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文所提供的保守取代)。此类改变可在HVR“热点”或CDR的外部。
用于鉴定可靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述的。在该方法中，鉴定靶残基的一个残基或残基组(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。可在氨基酸位置引入其他取代从而展示出对初始取代的功能敏感性。作为另外一种选择或除此之外，抗原-抗体复合物的晶体结构可识别抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可作为取代的候选物被靶向或消除。可筛选变体以确定它们是否包含期望的特性。
氨基酸序列***包括氨基和/或羧基末端融合，其长度范围从一个残基到包含一百个或更多个残基的多肽，以及单一或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的示例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他***变体包括抗体的N-末端或C-末端与增加抗体血清半衰期的酶(例如ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化变体
在一些实施方案中，改变本文提供的VEGFR-抗体轻链融合蛋白内的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列使得一个或多个糖基化位点产生或移除来方便地完成抗体的糖基化位点的添加或缺失。
在抗体包含Fc区的情况下，可改变与其附接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双天线低聚糖，其通常通过至Fc区的CH2结构域的Asn297的N-键来附接。参见，例如，Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。低聚糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附接到双天线低聚糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本申请的抗体中的低聚糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在一些实施方案中，提供了抗体变体，其具有碳水化合物结构，该碳水化合物结构不含(直接或间接地)附接到Fc区的岩藻糖。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可为1％至80％、1％至65％、5％至65％、或20％至40％。岩藻糖的量通过相对于如通过MALDI-TOF质谱所测量的附接到Asn297的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和，计算Asn297处的糖链内的平均岩藻糖量来确定，如例如WO 2008/077546中所述的。Asn297是指位于Fc区的大约297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体内的微小序列变化，Asn297也可位于位点297的上游或下游的约±3个氨基酸处，即位于位点294和位点300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见，例如美国专利公布US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的公布的示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的示例包括缺乏蛋白岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请US 2003/0157108 A1，Presta,L；以及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其是实施例11)，以及敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗体变体还具有对分低聚糖，例如，其中附接到抗体的Fc区的双天线低聚糖被GlcNAc对分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的示例描述于，例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供了在附接到Fc区的低聚糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于，例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变体
在一些实施方案中，可将一种或多种氨基酸修饰引入本文提供的VEGFR-抗体轻链融合蛋白内的抗体的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其包含在一个或多个氨基酸位点处的氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，本专请设想了一种抗体变体，其具有一些但不具有全部的效应子功能，这使其成为对于其中VEGFR-抗体轻链融合蛋白在体内的半衰期是重要的但某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要的或有害的应用所期望的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC、NK细胞的原代细胞仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)中的第464页表3中。评估感兴趣的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性示例描述于美国专利5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和5,821,337(参见，Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中。另选地，可采用非放射性测定法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA))。用于此类测定的可用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。作为另外一种选择或除此之外，感兴趣的分子的ADCC活性可以体内评估，例如在动物模型中，诸如在Clynes等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所公开的。也可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可使用本领域已知的方法进行(参见，例如，Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一者或多者的取代的那些抗体(美国专利6,737,056)。此类Fc突变体包括具有在氨基酸位点265、269、270、297和327中的两个或更多个处的取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其中残基265和297的取代为丙氨酸(美国专利7,332,581)。
描述了具有改善的或减少的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))
在一些实施方案中，抗体变体包含Fc区，该Fc区具有改善ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如Fc区的位点298、333和/或334处的取代(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，这导致改变的(即，改善的或减少的)C1q结合和/或CDC，例如，如美国专利6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人，J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述的。
在一些实施方案中，抗体变体包含变体Fc区，该变体Fc区包含增加半衰期和/或改善与FcRn的结合的一个或多个氨基酸取代。具有增加的半衰期和改善的与FcRn的结合的抗体，所述FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24:249(1994))，描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。那些抗体包含在其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改善Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在下列Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434的取代(美国专利7,371,826)。
还可参见Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利5,648,260；美国专利5,624,821；以及WO 94/29351，其关于Fc区变体的其他示例。
设想了VEGFR-抗体轻链融合蛋白(诸如与全长抗体融合的VEGFR组分)，其包含本文所述的Fc变体中的任一种或它们的组合。
d)半胱氨酸工程化抗体变体
在一些实施方案中，期望产生半胱氨酸工程化抗体，例如，“硫代Mab”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基在抗体的可触及位点处出现。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位在抗体的可触及位点处，并且可用于将抗体缀合到其他部分，诸如药物部分或接头药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步所述的。在一些实施方案中，下列残基中的任一个或多个可被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体可如例如美国专利7,521,541中所述产生。
III.药物组合物
本申请还提供了药物组合物，其包含如本文所述的抗体融合蛋白中的任一种，所述抗体融合蛋白包含与抗体轻链的C-末端(诸如抗体CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分(诸如，VEGFR-抗-PD-1、VEGFR-抗-PD-L1、VEGFR-抗-CTLA-4、VEGFR-抗-HER2、VEGFR-抗-EGFR、VEGFR-抗-Ang2、VEGFR-抗-TNFα、或VEGFR-抗-IL-17A抗体轻链融合蛋白)，以及任选地药学上可接受的载体。药物组合物可通过将具有期望纯度的本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑(1980))，其呈冻干制剂或水溶液形式。
药物组合物优选为稳定的，其中本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白在储存时基本上保留其物理和化学稳定性和完整性。可用于测量蛋白稳定性的多种分析技术在本领域中可得，并且综述于Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent Lee编辑，Marcel Dekker,Inc.，New York,N.Y.，Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug DeliveryRev.10:29-90(1993)中。稳定性可在选定温度下测量并持续选定的时间段。为了快速筛选，可将制剂在40℃下保持2周至1个月，在此时测量稳定性。当制剂待储存于2-8℃下时，一般来讲，制剂应在30℃或40℃下稳定至少1个月和/或在2-8℃下稳定至少2年。当制剂待在30℃下储存时，一般来讲，制剂应在30℃下稳定至少2年和/或在40℃下稳定至少6个月。例如，储存期间的聚集程度可用作蛋白质稳定性的指标。在一些实施方案中，本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的稳定制剂可包含小于约10％(优选地小于约5％)的以聚集体形式存在于制剂中的VEGFR-抗体轻链融合蛋白。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括缓冲剂，抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、偏亚硫酸氢钠；防腐剂、等渗剂(例如，氯化钠)、稳定剂、金属络合物(例如，锌-蛋白质复合物)；螯合剂诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
生理上可接受的载体的示例包括缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙烯二醇(PEG)、和PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
缓冲剂用于将pH控制在优化治疗效果的范围内，尤其是在稳定性是pH依赖性的时。缓冲剂优选以在约50mM至约250mM范围内的浓度存在。适用于本申请的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲液可包含组氨酸和三甲基胺盐，诸如Tris。
添加防腐剂以延缓微生物生长，并且其通常以0.2重量/体积％至1.0重量/体积％的范围存在。添加防腐剂可例如有助于制备多用途(多剂量)制剂。适用于本申请的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵，苯扎碘铵)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
存在张度剂，有时被称为“稳定剂”，以调节或维持组合物中液体的张度。当与大的带电生物分子如蛋白质和抗体一起使用时，其通常被称为“稳定剂”，因为其可与氨基酸侧链的带电基团相互作用，从而减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其他成分的相对量，张度剂可以介于0.1重量％至25重量％之间，优选1重量％至5重量％之间的任何量存在。优选的张度剂包括多元糖醇，优选三元或更高级糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、***糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
附加赋形剂包括可用作下列中一种或多种的试剂：(1)填充剂、(2)溶解度増强剂、(3)稳定剂和(4)和防止变性或附着于容器壁的试剂。此类赋形剂包括：多元糖醇(上面列举的)；氨基酸，诸如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(诸如肌醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖诸如棉子糖；以及多糖诸如糊精或葡聚糖。
存在非离子表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以有助于增溶治疗剂以及保护治疗性蛋白免受搅拌诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力但不导致活性治疗蛋白质或抗体的变性。非离子表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、
Figure BDA0002502291250000981
多元醇、
Figure BDA0002502291250000982
聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
Figure BDA0002502291250000983
等)-、聚桂醇400、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可使用的阴离子洗涤剂包括十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子洗涤剂包括苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了药物组合物用于体内施用，其必须是无菌的。可通过经由无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。本文的药物组合物通常置于具有无菌入口的容器中，例如，具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用途径根据已知和可接受的方法，例如通过单次或多次推注或以合适的方式长时间输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径注射或输注，局部施用、吸入，或通过持续释放或延长释放方式。在一些实施方案中，药物组合物局部施用，诸如肿瘤内或玻璃体内施用。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的示例包括含有拮抗剂的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品的形式，例如，膜或微胶囊。持续释放基质的示例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
本文的药物组合物还可包含超过一种所治疗的具体适应症所必需的活性化合物，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些。作为另外一种选择或除此之外，所述组合物可包含细胞毒性试剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂或生长抑制剂。这些分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。
活性成分也可包埋在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备，例如，分别在胶体药物递送体系(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米粒子和纳米胶囊)或粗乳中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版中。
本文所公开的抗体融合蛋白可配制为免疫脂质体。包含抗体融合蛋白的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如在Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,77:4030(1980)；和美国专利4,485,045和4,544,545中所述的。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利5,013,556中。
特别有用的脂质体可通过反相蒸发法，利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物生成。脂质体通过具有限定孔径的过滤器挤出，以产生具有期望直径的脂质体。
在一些实施方案中，药物组合物容纳在一次性小瓶(诸如一次性密封小瓶)中。在一些实施方案中，药物组合物容纳在多次性小瓶中。在一些实施方案中，药物组合物散装容纳在容器中。在一些实施方案中，药物组合物是冷冻保存的。
用于治疗眼部新生血管障碍的药物组合物
具体地讲，为了治疗眼部新生血管障碍如糖尿病性视网膜病和AMD，包含VEGFR-抗体轻链融合蛋白(如VEGFR-抗-TNFα、VEGFR-抗-TNFα、或VEGFR-抗-IL-17A抗体轻链融合蛋白)的药物组合物将直接施用于眼部上，例如局部施用。局部施用方法包括但不限于滴眼液、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球筋膜囊下注射或眼球筋膜囊下植入。在一些实施方案中，包含VEGFR-抗体轻链融合蛋白和任选地药学上可接受的载体的药物组合物通过玻璃体内注射施用。
适用于局部施用的组合物是本领域已知的(参见，例如，美国专利申请2005/0059639)。在各种实施方案中，本发明的组合物可包含液体，所述液体包含呈溶液、悬浮液或上述两者的形式的活性剂。如本文所用，液体组合物包括凝胶。优选地，液体组合物是含水的。另选地，该组合物可采取软膏的形式。在一个优选的实施方案中，所述组合物为可原位胶凝的含水组合物，更优选地为可原位胶凝的水溶液。此类组合物可包含胶凝剂，其浓度可有效促进与眼睛或眼睛外部的泪液接触时的胶凝作用。本发明的含水组合物具有眼科相容的pH和重量克分子渗透压浓度。该组合物可包含用于结膜下施用的眼科用贮库制剂，该贮库制剂包含活性剂。包含活性剂的微粒可包埋在生物相容的药学上可接受的聚合物或脂质包封剂中。贮库制剂可适于在延长的时间段内释放所有或基本上所有的活性材料。聚合物或脂质基质(如果存在的话)可适于充分降解，以在释放所有或基本上所有活性剂后从施用位点运输。贮库制剂可以为液体制剂，其包含药学上可接受的聚合物和溶解的或分散的活性剂。在注射时，聚合物例如通过胶凝或沉淀在注射部位形成贮库。该组合物可包含固体制品，所述固体制品可***眼中的合适位置中，诸如介于眼睛和眼睑之间或结膜囊中，***眼睛的腔室中，诸如前房或后房，或者可植入巩膜、脉络膜空间或玻璃体外部的无血管区域中或上，其中制品释放活性剂。适用于以这种方式植入眼中的固体制品通常包含聚合物，并且可以为可生物侵蚀的或不可生物侵蚀的。植入物可以为活性剂可透过的或不可透过的。在一些实施方案中，植入物可定位在无血管区域上，诸如巩膜上，以便允许药物跨巩膜扩散到期望的治疗位点，例如眼部的眼内空间和黄斑。此外，跨巩膜扩散的位点可靠近新生血管的位点，诸如靠近黄斑的位点。
用于提供持续释放的多种聚合物递送载体已用于眼部环境中，并且可用于施用本发明的组合物。可使用可生物降解的各种聚合物，例如生物相容性聚合物。所述聚合物可以为均聚物、共聚物(包括嵌段共聚物)，直链、支链或交联的。可用的聚合物包括但不限于聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚(磷腈)、聚(磷酸酯)、聚己内酯、聚酸酐、乙烯-乙酸乙烯酯、聚原酸酯、聚醚和聚(β-氨基酯)。还可使用肽、蛋白质诸如胶原或白蛋白、多糖诸如脱乙酰壳多糖、藻酸盐、透明质酸(或这些中任一种的衍生物)和树枝状体(例如，PAMAM树枝状体)。制备此类制剂的方法对于本领域的技术人员将是显而易见的。某些材料也可从例如Alza Corporation商购获得。这些聚合物中的任一种或它们的组合可用于本发明的各种实施方案中。
附加的示例性聚合物包括纤维素衍生物诸如羧甲基纤维素、聚碳酸酯或聚脲、交联的聚(乙酸乙烯酯)等，具有4％至80％的酯含量的乙烯-乙烯基酯共聚物诸如乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)共聚物、乙烯-己酸乙烯基酯共聚物、乙烯-丙酸乙烯基酯共聚物、乙烯-丁酸乙烯基酯共聚物、乙烯-戊酸乙烯基酯共聚物、乙烯-三甲基乙酸乙烯酯共聚物、乙烯-二乙基乙酸乙烯基酯共聚物、乙烯-3-甲基丁酸乙烯基酯共聚物、乙烯-3-3-二甲基丁酸乙烯酯共聚物和乙烯-苯甲酸乙烯酯共聚物、或它们的混合物。
已将聚(原酸酯)引入眼部中，并且展示出缓释眼用药物递送的有利特性(Einmahl,S.,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.,43(5),2002)。聚交酯颗粒已被用于在玻璃体内注射此类颗粒的悬浮液之后将试剂靶向视网膜和RPE(Bourges,J-L等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.,44(8),2003)。
制备缓释制剂的方法涉及将VEGFR-抗体轻链融合蛋白与聚合物组分组合或混合以形成混合物。然后可将混合物挤出、压缩、模制等以形成单一组合物。任选地，可使用热和/或压力。然后可对单一组合物进行处理，以形成适于放置在患者眼部中的单个植入物或颗粒。用于将治疗活性剂掺入聚合物基质中的附加方法在本领域中是已知的。聚合物基体可形成为各种形状，诸如棒、盘、晶片等，其可具有一系列不同的尺寸(例如，长度、宽度等)和体积。示例性形状包括球形、圆柱形、螺旋形、盘形或螺旋形、螺纹形、立方形、圆锥形、椭圆形、双凸形、半球形或近半球形等。
IV.治疗疾病的方法
虽然血管内皮细胞增殖在某些情况下是期望的，但血管内皮细胞增殖和血管生成也是多种疾病和障碍的重要组分，所述疾病和障碍包括肿瘤生长和癌细胞转移、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、晶体后纤维增生症、新生血管性青光眼、AMD、血管瘤、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、以及慢性炎症。
如本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白(诸如VEGFR-抗-PD-1、VEGFR-抗-PD-L1、VEGFR-抗-CTLA-4、VEGFR-抗-HER2、VEGFR-抗-EGFR、VEGFR-抗-Ang2、VEGFR-抗-TNFα或VEGFR-抗-IL-17A抗体轻链融合蛋白)、以及它们的组合物(诸如药物组合物)可用于多种应用，诸如诊断、分子测定和治疗中。
本发明的一个方面提供了在对其有需要的个体中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白，以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，该疾病为癌症。在一些实施方案中，该疾病为非肿瘤性疾病或新生血管障碍。在一些实施方案中，该疾病为眼部新生血管障碍，诸如AMD或糖尿病性视网膜病。
本发明部分地设想了VEGFR-抗体轻链融合蛋白、编码它们的核酸分子和/或载体，包含编码它们的核酸分子和/或载体的宿主细胞，其可单独施用或以与另一疗法的任何组合施用，并且在至少一些方面与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用。在一些实施方案中，在施用VEGFR-抗体轻链融合蛋白之前，可将其与本领域熟知的适宜的药物载体和赋形剂混合。根据本公开制备的组合物可用于治疗或延缓癌症或眼部新生血管障碍的恶化。
癌症
在一些实施方案中，提供了一种治疗癌症(诸如实体肿瘤，或具有异常VEGF表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)包含轻链的抗体(诸如，抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-CTLA-4、抗-HER2、抗-EGFR、抗-Ang2、抗-TNFα、或抗-IL-17A全长抗体)，和2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10- 8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗癌症(诸如实体肿瘤，或具有异常的VEGF表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗体(诸如，抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-CTLA-4、抗-HER2、抗-EGFR、抗-Ang2、抗-TNFα、或抗-IL-17A全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ IDNO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgG-来源分子、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab-scFv、F(ab’)2-scFv2、Fab-scFv-Fc、对接和锁定(Dock and Lock)、scFv、二-scFv、双体抗体、双体抗体-Fc、双体抗体-CH3、和细胞内抗体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别免疫检查点分子。在一些实施方案中，抗体特异性地识别刺激性免疫检查点分子。在一些实施方案中，抗体特异性地识别抑制性免疫检查点分子。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-1。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001041
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与派姆单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001042
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与纳武单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-L1。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001043
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿特朱单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是德瓦鲁单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001044
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与德瓦鲁单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性地识别CTLA-4。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001053
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊匹单抗竞争性结合CTLA-4。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性识别肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原为HER2。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001051
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与曲妥珠单抗竞争性结合HER2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ IDNO:26、27或28的氨基酸序列。在一些实施方案中，肿瘤抗原为EGFR(HER1)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为
西妥昔单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001052
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性识别血管生成因子。在一些实施方案中，血管生成因子为Ang2。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为尼伐单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与尼伐单抗竞争性结合Ang2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为TNFα。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001061
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿达木单抗竞争性结合TNFα。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为IL-17A。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001062
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊克珠单抗竞争性结合IL-17A。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，该癌症为实体肿瘤(诸如，肺癌、肝癌、皮肤癌(诸如黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、***癌、结直肠癌或膀胱癌)。在一些实施方案中，药物组合物全身施用(诸如静脉内施用)。在一些实施方案中，药物组合物局部施用(诸如肿瘤内施用)。在一些实施方案中，该方法还包括使个体经受附加的癌症治疗(诸如外科手术、放疗、化疗、免疫疗法、激素疗法、或它们的组合)。在一些实施方案中，所述个体为人。在一些实施方案中，治疗癌症的方法具有以下生物活性中的一种或多种：(1)杀死癌细胞(包括旁观者杀死)；(2)抑制癌细胞的增殖；(3)诱导肿瘤中的免疫应答；(4)降低肿瘤尺寸；(5)减轻患有癌症的个体的一种或多种症状；(6)抑制肿瘤癌细胞转移；(7)延长生存期；(8)延长癌症进展的时间，(9)预防、抑制或降低癌症复发的可能性；以及(10)减少或抑制肿瘤血管生成。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的杀死癌细胞的方法可实现至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％中的任一者或更多的肿瘤细胞死亡率。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的降低肿瘤尺寸的方法可降低肿瘤尺寸的至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的抑制肿瘤癌细胞转移的方法可抑制癌细胞转移的至少约10％(包括例如至少约20％、30％、40％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一者)。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长个体(诸如人)的生存期的方法可将个体的生存期延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月中的任一者。在一些实施方案中，由本文所述的药物组合物介导的延长癌症进展的时间的方法可将癌症进展的时间延长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的任一者。
本文所述的方法适用于治疗多种癌症，包括实体癌症和液体癌症两者。该方法适用于所有阶段的癌症，包括早期癌症、非转移性癌症、原发性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或缓解的癌症。本文所述的方法可在辅助设置或新辅助设置中，作为第一疗法、第二疗法、第三疗法、或与本领域已知的其他类型的癌症疗法(诸如化学疗法、手术、激素疗法、放射、基因疗法、免疫疗法(诸如T-细胞疗法)、骨髓移植、干细胞移植、靶向疗法、冷冻疗法、超声疗法、光动力疗法、射频消融等)的联合疗法(即，该方法可在初次/确定性治疗之前进行)。在一些实施方案中，该方法用于治疗先前已被治疗的个体。在一些实施方案中，癌症对于先前治疗而言是难治的。在一些实施方案中，该方法用于治疗先前未治疗过的个体。
在一些实施方案中，该方法适用于治疗具有异常VEGF表达、活性和/或信号传导的癌症，所述癌症的非限制性的示例包括乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、卵巢癌、子***、子宫内膜癌、卵泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位、纤维肉瘤、绒毛膜癌、头颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞癌、卡波济氏肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、恶性胶质瘤、许旺氏细胞瘤、少突神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、甲状腺癌、肾母细胞瘤、肾细胞癌、***癌、与母斑细胞病相关联的异常血管增生、瘤腺体(诸如与脑肿瘤相关)、以及梅格斯综合征。在一些实施方案中，该方法适用于治疗肺癌、肝癌、皮肤癌(诸如黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、***癌、结直肠癌或膀胱癌。
在一些实施方案中，该方法适用于治疗具有异常CTLA-4表达、活性和/或信号传导的癌症，其非限制性示例包括黑素瘤、***癌、肺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和恶性胶质瘤。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗具有异常CTLA-4或B7-1/B7-2表达、活性和/或信号传导的癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌、实体肿瘤)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)包含轻链的抗-CTLA-4抗体(诸如全长抗体)，以及2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗具有异常的CTLA-4或B7-1/B7-2表达、活性和/或信号传导的癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌、实体肿瘤)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗-CTLA-4抗体(诸如全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗-CTLA-4抗体包括：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗-CTLA-4抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗-CTLA-4抗体为伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001091
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗-CTLA-4抗体与伊匹单抗竞争性结合CTLA-4。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法适用于治疗具有异常PD-1或PD-L1/PD-L2表达、活性和/或信号传导的癌症，其非限制性示例包括血液学癌症和/或实体肿瘤。其生长可使用本发明的抗体抑制的一些癌症包括通常响应免疫疗法的癌症。用于治疗的其他癌症的非限制性示例包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、***癌(例如，激素难治性***癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如，非小细胞肺癌)。另外，本发明包括可使用本发明的抗体抑制其生长的难治性或复发恶性肿瘤。可使用本发明的抗体治疗的其他癌症的示例包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌***癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、***癌、慢性或急性白血病，包括急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经***肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)、以及所述癌症的组合。本发明还可用于治疗转移性癌症，尤其是表达PD-L1的转移性癌症(Iwai等人，(2005)Int.Immunol.17:133-144)。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌，实体肿瘤，具有异常VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常PD-1/PD-L1/PD-L2表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)包含轻链的抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体(诸如全长抗体)，以及2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌、实体肿瘤，具有异常的VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常PD-1/PD-L1/PD-L2表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗-PD-1抗体或抗-PD-L1抗体(诸如全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-1。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001121
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与派姆单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001122
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与纳武单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-L1。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001123
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿特朱单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是德瓦鲁单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001131
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与德瓦鲁单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法适用于治疗具有异常HER2表达、活性和/或信号传导的癌症，其非限制性示例包括乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、唾液腺癌、非小细胞肺癌、肾癌、***癌、甲状腺癌、胰腺癌和***。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌，实体肿瘤，具有异常VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常HER2表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)包含轻链的抗-HER2抗体(诸如全长抗体)，以及2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌、实体肿瘤，具有异常的VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常HER2表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗-HER2抗体(诸如全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001141
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与曲妥珠单抗竞争性结合HER2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:26、27或28的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法适用于治疗具有异常EGFR表达、活性和/或信号传导的癌症。EGFR阳性肿瘤与癌症相关，所述癌症诸如恶性肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、恶性毒瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、许旺氏细胞瘤、脑膜炎、腺癌、黑素瘤、白血病和淋巴样恶性肿瘤。EGFR阳性癌症的非限制性示例包括肺癌、肝细胞癌、胃(gastric)癌或胃(stomach)癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、子***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜和子宫癌、唾液腺癌、肾癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、***癌、***癌、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤以及头颈癌。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌，实体肿瘤，具有异常EGFR(HER1)表达、活性和/或信号传导、和/或异常EGFR表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)包含轻链的抗-EGFR抗体(诸如全长抗体)，以及2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10- 13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌、实体肿瘤，具有异常的EGFR(HER1)表达、活性和/或信号传导、和/或异常EGFR表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗-EGFR抗体(诸如全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是西妥昔单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001161
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法适用于治疗具有异常Ang2表达(诸如高度血管化肿瘤)、活性和/或信号传导的癌症，其非限制性示例包括：神经胶质瘤、肝细胞癌、胃癌、甲状腺瘤、肺癌(诸如非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、结肠癌、***癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、黑素瘤、恶性胶质瘤、子宫内膜癌、肾癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、间皮瘤、恶性毒瘤(sarcomas)、胆管癌、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤和表皮样癌。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌，实体肿瘤，具有异常VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常Ang2表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)包含轻链的抗-Ang2抗体(诸如全长抗体)，以及2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌、实体肿瘤，具有异常的VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常Ang2表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗-Ang2抗体(诸如全长抗体)，其包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为尼伐单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与尼伐单抗竞争性结合Ang2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法适用于治疗具有异常TNFα表达、活性和/或信号传导的癌症，其非限制性示例包括白血病、卵巢癌、乳腺癌和结肠癌。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌，实体肿瘤，具有异常VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常TNFα表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)包含轻链的抗-TNFα抗体(诸如全长抗体)，以及2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌、实体肿瘤，具有异常的VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常TNFα表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗-TNFα抗体(诸如全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001191
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿达木单抗竞争性结合TNFα。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该方法适用于治疗具有异常IL-17A表达、活性和/或信号传导的癌症，其非限制性示例包括乳腺癌、结肠癌、胃癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、肾癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌或***癌。
因此，在一些实施方案中，提供了治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌，实体肿瘤，具有异常VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常IL-17A表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)包含轻链的抗-IL-17A抗体(诸如全长抗体)，以及2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗癌症(诸如恶性肿瘤或腺癌、实体肿瘤，具有异常的VEGF表达、活性和/或信号传导、和/或异常IL-17A表达、活性和/或信号传导的癌症)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗-IL-17A抗体(诸如全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001211
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊克珠单抗竞争性结合IL-17A。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述方法适用于治疗肺癌、肝癌、皮肤癌(诸如黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、***癌、结直肠癌或膀胱癌。
本申请的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可根据预想的具体用途而变化。合适剂量或施用途径的确定完全在普通技术人员的技能范围内。动物实验为确定人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。有效剂量的种间类推可根据由Mordenti,J.和Chappell,W.，“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics”，In Toxicokinetics and NewDrug Development，Yacobi等人编辑，Pergamon Press，New York 1989，第42-46页制定的原理来进行。
当使用本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的体内施用时，取决于给药途径，正常剂量可在约10ng/kg最高达约100mg/kg哺乳动物体重/天或更多，优选地约1mg/kg/天至10mg/kg/天，诸如约1-3mg/kg/天、约2-4mg/kg/天、约3-5mg/kg/天、约4-6mg/kg/天、约5-7mg/kg/天、约6-8mg/kg/天、约6-6.5mg/kg/天、约6.5-7mg/kg/天、约7-9mg/kg/天、约8-10mg/kg/天内变化。在本申请的范围内，不同的制剂对于不同的治疗和不同的病症是有效的，并且旨在治疗特定器官或组织的施用可需要以不同于另一种器官或组织的方式来递送。此外，剂量可通过一次或多个独立的施用或通过连续输注来施用。对于数天或更长时间的重复施用，根据病症，持续治疗直至发生疾病症状的期望的抑制。然而，其它剂量方案可以是有用的。通过常规技术和测定可容易地监测所述治疗的进展。
在一些实施方案中，药物组合物施用单次(例如，快速浓注)。在一些实施方案中，将药物组合物施用多次(诸如下列中的任一者：2、3、4、5、6或更多次)。如果进行多次施用，则它们可通过相同或不同的途径进行，并且可在相同的位点或在另选的位点处进行。药物组合物可每周两次、每周3次、每周4次、每周5次、每天、每天不间断地、每周一次、每周不间断地、每2周一次、每3周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次、每7个月一次、每8个月一次、每9个月一次、每10个月一次、每11个月一次、或每年一次施用。施用之间的间隔时间可以为约24小时至48小时、2天至3天、3天至5天、5天至1周、1周至2周、2周至1个月、1个月至2个月、2个月至3个月、3个月至6个月、或6个月至一年中的任一者。间隔时间也可以是不规则的(例如，随着肿瘤进展)。在一些实施方案中，剂量给药时间表没有中断。在一些实施方案中，药物组合物每4天施用4次。通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
根据已知的方法，诸如以快速浓注形式静脉内施用，或通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、静脉注射(i.v.)、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径连续输注一段时间，将本申请的药物组合物(包括但不限于重构制剂和液体制剂)施用于需要本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白治疗的个体，优选地人。可通过将冻干的本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白溶于稀释剂中使得蛋白质分散于其中来制备重构制剂。适用于本申请的示例性药学上可接受的(对施用于人而言安全且无毒的)稀释剂包括但不限于无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液、或盐和/或缓冲液的水溶液。
在一些实施方案中，药物组合物通过皮下(即，在皮肤下面)施用施用于个体。出于此目的，可使用注射器注射药物组合物。然而，可用其它设备进行药物组合物的施用，诸如注射装置；注射笔；自动注射器装置、无针装置；和皮下贴片递送体系。
在一些实施方案中，药物组合物静脉内施用于个体。在一些实施方案中，药物组合物通过输注，诸如静脉注射施用于个体。用于免疫疗法的输注技术是本领域已知的(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676(1988))。
非肿瘤性障碍
在一些实施方案中，可由本发明治疗的非肿瘤性障碍与VEGF表达无关。在一些实施方案中，可由本发明治疗的非肿瘤性障碍与VEGF表达(诸如VEGF过表达)相关。
VEGF的过表达可导致非肿瘤性病症，诸如类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管瘤、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、慢性炎症和眼部新生血管障碍(例如，糖尿病性视网膜病、晶体后纤维增生症、新生血管性青光眼和AMD)。
因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗非肿瘤性障碍(诸如，眼部新生血管障碍，例如，糖尿病性视网膜病和AMD)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)包含抗体轻链的抗体(诸如，抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-CTLA-4、抗-HER2、抗-EGFR、抗-Ang2、抗-TNFα、或抗-IL-17A全长抗体)，和2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗非肿瘤性障碍(诸如，眼部新生血管障碍，例如，糖尿病性视网膜病和AMD)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗体(诸如，抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-CTLA-4、抗-HER2、抗-EGFR、抗-Ang2、抗-TNFα、或抗-IL-17A全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgG-来源分子、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab-scFv、F(ab’)2-scFv2、Fab-scFv-Fc、对接和锁定(Dock and Lock)、scFv、二-scFv、双体抗体、双体抗体-Fc、双体抗体-CH3、和细胞内抗体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体特异性地识别免疫检查点分子。在一些实施方案中，抗体特异性地识别刺激性免疫检查点分子。在一些实施方案中，抗体特异性地识别抑制性免疫检查点分子。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-1。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001251
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与派姆单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为纳武单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001252
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与纳武单抗竞争性结合PD-1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性地识别PD-L1。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿特朱单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001253
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿特朱单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQID NO:18的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是德瓦鲁单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001261
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与德瓦鲁单抗竞争性结合PD-L1。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性地识别CTLA-4。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为伊匹单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001262
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊匹单抗竞争性结合CTLA-4。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性识别肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原为HER2。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001263
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与曲妥珠单抗竞争性结合HER2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:26、27或28的氨基酸序列。在一些实施方案中，肿瘤抗原为EGFR(HER1)。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是西妥昔单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001271
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与西妥昔单抗竞争性结合EGFR。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQID NO:29的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体特异性识别血管生成因子。在一些实施方案中，血管生成因子为Ang2。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为尼伐单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与尼伐单抗竞争性结合Ang2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为TNFα。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001272
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿达木单抗竞争性结合TNFα。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为IL-17A。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001281
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊克珠单抗竞争性结合IL-17A。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，非肿瘤性障碍与VEGF过表达相关联。在一些实施方案中，非肿瘤性障碍选自类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管瘤、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、慢性炎症或和眼部新生血管障碍(例如，糖尿病性视网膜病变、晶体后纤维增生症、新生血管性青光眼和AMD)。在一些实施方案中，药物组合物全身施用(诸如静脉内施用)。在一些实施方案中，所述个体为人。
在一些实施方案中，由本发明治疗的疾病是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是可表现出多种全身表现的慢性疾病。该疾病具有未知的致病源，并且特征性表现出持续性炎性滑膜炎，其通常涉及对称分布的周围关节。导致软骨破坏、骨侵蚀以及最终关节畸形的补体介导的炎症是该疾病的最重要特征。因此，本文提供的方法可用于治疗类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，由本发明治疗的疾病是牛皮癣。牛皮癣(寻常型牛皮癣)是慢性炎症性皮肤病，其特征在于红色、鳞状、凸起状斑块。该疾病过程由T细胞浸润和相关的细胞因子水平升高驱动，从而导致增加的细胞***和异常分化，导致牛皮癣表型。斑块状牛皮癣在世界范围内患病率为2-3％，并且是具有不同严重程度的慢性、复发性皮肤病症。牛皮癣可对患者的生活质量产生深远的影响，导致与其他主要内科疾病诸如2型糖尿病、高血压、心肌梗塞、抑郁症和关节炎相当的身体和精神功能障碍，其还与严重的并存病相关，包括牛皮癣关节炎、抑郁症、恶性肿瘤、代谢综合征、心血管发病率和死亡率以及自身免疫疾病，诸如炎性肠病(iBD)。
在一些实施方案中，由本发明治疗的疾病是动脉粥样硬化。动脉粥样硬化是动脉壁的疾病，其中层变厚，从而导致通道变窄，因此损害血液流动。动脉粥样硬化可在身体的任何区域中发生，但当其在通向脑干的心脏、脑或血管中发生时，可对受试者造成最大的损害。动脉粥样硬化包括动脉壁的加厚和硬化，或脂肪、胆固醇和形成动脉粥样或斑块的其他物质的积聚。动脉粥样硬化也可由钙化、出血、溃疡、血栓形成和/或创伤引起。
在一些实施方案中，由本发明治疗的疾病是血管瘤。血管瘤是由于血管异常集合而形成的非癌性生长。它们通常存在于皮肤或内部器官上，具体地讲肝脏上，并且通常是先天性的。
在一些实施方案中，由本发明治疗的疾病为慢性炎症，其包括但不限于哮喘、慢性消化性溃疡、肺结核、类风湿性关节炎、慢性牙周炎、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病、慢性鼻窦炎和慢性活动性肝炎。慢性炎症可由未能消除引起急性炎症、自身抗原的自身免疫应答、或持续的低强度慢性刺激的物质而导致的。
眼部新生血管障碍
在一些实施方案中，提供了治疗眼部新生血管障碍(诸如糖尿病性视网膜病和AMD)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含1)包含抗体轻链的抗体(诸如，抗-Ang2、抗-TNFα、或抗-IL-17A全长抗体)，和2)与抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分相同。在一些实施方案中，第一VEGFR组分和第二VEGFR组分不同。在一些实施方案中，VEGFR组分包含Flt1d2。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d3。在一些实施方案中，VEGFR组分还包含Flk1d4。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分从N-末端至C-末端包含：Flt1d2-Flk1d3-Flk1d4，其中VEGFR组分的N-末端与抗体轻链的C-末端融合。在一些实施方案中，VEGFR组分为至少约4kDa(诸如至少约下列中的任一者：4kDa、8kDa、12kDa、17kDa、20kDa、25kDa、27kDa或30kDa)。在一些实施方案中，VEGFR组分-抗体轻链融合多肽从N-末端至C-末端包含：VL-CL-L-Flt1d2-Flk1d3(L为任选的接头)。在一些实施方案中，VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M(诸如约10-8M至约10-13M、约10-8M至约10-12M、约10-9M至约10-12M、约10-10M至约10-12M)。在一些实施方案中，VEGFR组分和抗体轻链的C-末端通过接头(诸如包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列的肽接头)连接。因此，在一些实施方案中，提供了一种治疗眼部新生血管障碍(诸如糖尿病性视网膜病和AMD)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗体(诸如，抗-Ang2、抗-TNFα、或抗-IL-17A全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgG-衍生的分子、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab-scFv、F(ab’)2-scFv2、Fab-scFv-Fc、对接和锁定(Dock and Lock)、scFv、二-scFv、双体抗体、双体抗体-Fc、双体抗体-CH3、和细胞内抗体。在一些实施方案中，抗体为全长抗体。在一些实施方案中，抗体为IgG抗体(诸如IgG1或IgG4抗体，或其变体)。在一些实施方案中，抗体是单特异性的。在一些实施方案中，抗体是多特异性的(例如，双特异性的)。在一些实施方案中，抗体特异性识别血管生成因子。在一些实施方案中，血管生成因子为Ang2。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为尼伐单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与尼伐单抗竞争性结合Ang2。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为TNFα。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体为阿达木单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001311
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与阿达木单抗竞争性结合TNFα。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，血管生成因子为IL-17A。在一些实施方案中，抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施方案中，抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是伊克珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001312
)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体与伊克珠单抗竞争性结合IL-17A。在一些实施方案中，抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，眼部新生血管障碍为AMD。在一些实施方案中，眼部新生血管障碍与脉络膜新生血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿相关联。在一些实施方案中，药物组合物局部施用，诸如滴眼液、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球筋膜囊下注射和眼球筋膜囊下植入。在一些实施方案中，药物组合物通过玻璃体内注射来施用。在一些实施方案中，该方法还包括使个体经受附加的眼科治疗。在一些实施方案中，所述个体为人。在一些实施方案中，治疗眼部新生血管障碍的方法具有以下生物活性中的一种或多种：(1)抑制或预防玻璃疣形成；(2)导致玻璃疣数量和/或尺寸减小(玻璃疣消退)；(3)导致减少或预防脂褐素沉积；(4)抑制或预防视力丧失或减慢视力丧失的速度；(5)抑制脉络膜新生血管形成或减缓脉络膜新生血管形成的速率；(6)引起特征在于脉络膜新生血管形成的消融灶的尺寸和/或数量的减小；(7)抑制脉络膜新生血管形成或减慢视网膜新生血管形成的速率；(8)导致特征在于视网膜新生血管形成的消融灶的尺寸和/或数量减少；(9)改善视敏度和/或对比敏感性；(10)减少黄斑水肿和/或减少异常黄斑厚度；(11)抑制或预防感光细胞或RPE细胞萎缩或细胞凋亡，或降低感光细胞或RPE细胞萎缩或细胞凋亡的速率；(12)抑制或预防非渗出性黄斑变性发展为渗出性黄斑变性。
多种眼部障碍涉及血管生成的改变。可根据本发明的方法治疗的眼部新生血管障碍的非限制性示例包括渗出性AMD、糖尿病性视网膜病、血管样纹、病理性近视、眼组织胞浆菌病综合征、Bruch膜破裂、黄斑水肿(包括糖尿病性黄斑水肿)、肉样瘤病和葡萄膜炎。可由本发明所公开的方法治疗的障碍的附加示例包括萎缩性AMD、圆锥形角膜、Sjogren综合征、近视、眼部肿瘤、角膜移植物排斥、角膜损伤、新生血管性青光眼、角膜溃疡、角膜瘢痕、增生性玻璃体视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜变性、慢性青光眼、视网膜脱离、以及镰状红细胞性视网膜病变。
糖尿病性视网膜病是成人失明的第三大原因(占美国失明的近7％)，其与广泛的血管生成事件相关联。非增生性视网膜病伴有视网膜内的周细胞的选择性损失，并且其损失导致相关的毛细血管扩张和所得的血液流动增加。在扩张的毛细血管中，内皮细胞增殖并形成外膜，其变成微动脉瘤，并且相邻的毛细血管被阻塞，使得围绕这些微动脉瘤的视网膜区域不被灌注。最终，在微动脉瘤的相邻区域之间出现分流血管，并观察到具有微动脉瘤和非灌注视网膜区域的早期糖尿病性视网膜病的临床表现。微动脉瘤渗漏并且毛细血管可渗出，从而导致流出物和出血。一旦确定了背景型糖尿病性视网膜病的初始阶段，病症就持续数年，从而发展为增殖性糖尿病性视网膜病并且在约5％的情况下失明。当视网膜的一些区域继续损失其毛细血管并且变得不灌注时，发生增生性糖尿病性视网膜病，从而导致视网膜的视盘和其他地方上出现新的血管。这些新的血管生长到玻璃体中并容易出血，从而导致前膜出血。在晚期增生性糖尿病性视网膜病中，大量玻璃体出血可填满玻璃体腔的大部分。此外，新的血管伴随着可导致牵引视网膜脱离的纤维组织增生。
糖尿病性视网膜病主要与糖尿病的持续时间相关联；因此，随着人口年龄和糖尿病患者寿命延长，糖尿病性视网膜病的患病率将增加。激光疗法目前用于非增生性和增生性糖尿病性视网膜病两者。对黄斑区域周围的渗漏的微动脉瘤的聚焦激光治疗减少了50％患有临床上显著的黄斑水肿的患者的视力损失。在增生性糖尿病性视网膜病中，全视网膜光凝导致遍布在整个视网膜上的数千个细小烧伤(散布黄斑区域)；该治疗将失明率降低了60％。黄斑水肿和增生性糖尿病性视网膜病的早期治疗可在95％的患者中预防5年失明，而晚期治疗仅可防止50％的失明。因此，早期诊断和治疗至关重要。
另一种涉及新生血管形成的眼部障碍是AMD，这是影响65岁以上的美国人中大约十分之一的疾病。AMD的特征在于黄斑(视网膜中心区)的一系列病理变化，其伴随着视敏度降低，具体地讲影响中心视力。AMD涉及位于感觉视网膜正下方的被称为视网膜色素上皮的单层细胞。这些细胞滋养和支撑与其接触的视网膜部分，即包含视觉色素的感光细胞。视网膜色素上皮位于Bruch膜上，这是一种基底膜复合物，其在AMD时增厚并***。新血管可从下面的脉络膜穿破Bruch膜，所述脉络膜包含丰富的血管床。这些血管继而可在视网膜色素上皮下方以及视网膜色素上皮和感觉视网膜之间渗漏流体或出血。随后的纤维疤痕破坏感光细胞的营养并导致它们死亡，从而导致中心视敏度的丧失。由于血管渗漏和视网膜下水肿或血液，这种年龄相关性黄斑病被称为“湿”型。湿型仅占与年龄相关性黄斑病病例的10％，但导致由于老年人黄斑变性的致盲病例的90％。与年龄相关性黄斑病的“干”型涉及视网膜色素上皮的崩解以及上覆感光细胞的损失。干型降低视力，但通常仅降低至20/50至20/100的水平。
AMD伴随着中央视力的失真，其中对象看起来更大或更小，或者直线看起来变形、弯曲或没有中心段。在湿型AMD中，在黄斑区域中可注意到感觉视网膜的小脱离，但对视网膜下新生血管膜的最终诊断需要荧光素血管造影。在干型中，玻璃疣可干扰黄斑区域中的色素沉着模式。玻璃疣是视网膜色素上皮的基底膜的赘生物，其突出到细胞中，从而导致其向前***；它们作为年龄相关性黄斑病中的风险因素的作用是不清楚的。目前尚不存在针对干型年龄相关性黄斑病的治疗。激光治疗用于湿型年龄相关性黄斑病，并且最初消除新生血管膜，并且防止约50％的患者在18个月时进一步视力丧失。然而，到60个月，仅20％仍有具有显著有益效果。
黄斑水肿与多种眼部障碍有关，包括AMD、糖尿病性视网膜病、炎性病症(如前或后葡萄膜炎)等。黄斑由于从弱化或其他异常的血管渗漏到附近组织中的流体积聚而变厚。血液或其他流体的渗漏以及所得的黄斑厚度的增加可导致视敏度、颜色感知等的急性改变。因此黄斑水肿可导致患有AMD和多种其他眼部障碍的个体所经历的视力障碍和丧失。
在一些实施方案，本发明提供用于治疗或预防AMD或糖尿病性视网膜病的一个或多个方面或症状，包括但不限于新生血管形成(诸如脉络膜新生血管形成或CNV)、血管渗漏和/或视网膜水肿、眼部玻璃疣形成、眼或眼组织炎症、感光细胞丧失、视力(包括视敏度和视野)的丧失和视网膜脱落)的方法，所述方法通过向个体施用有效量的药物组合物来进行，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含1)包含抗体轻链的抗体(诸如抗-Ang2、抗-TNFα、或抗-IL-17A全长抗体)，和2)与抗体轻链的C-末端融合的VEGFR组分；以及任选地药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本发明提供了一种通过向个体施用有效量的药物组合物来治疗或预防AMD或糖尿病性视网膜病中的一个或多个方面或症状的方法，所述药物组合物包含抗体融合蛋白，所述抗体融合蛋白包含：1)抗体(诸如，抗-Ang2、抗-TNFα、或抗-IL-17A全长抗体)，所述抗体包含第一轻链和第二轻链，以及2)第一VEGFR组分和第二VEGFR组分，其中所述第一VEGFR组分任选地经由接头X(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第一抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合，并且第二VEGFR组分任选地经由接头Y(诸如SEQ ID NO:6或7的肽接头)与第二抗体轻链的C-末端(例如，抗体VL-CL结构域的C-末端)融合；其中每个VEGFR组分均包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；以及任选地药学上可接受的载体。还设想了AMD的其他方面的治疗，诸如感光细胞变性、RPE变性、视网膜变性、脉络膜视网膜变性、视锥变性、视网膜功能障碍、响应于曝光(诸如持续曝光)的视网膜损伤、Bruch膜损伤、RPE功能丧失、正常黄斑的细胞和/或细胞外基质的组织结构完整性丧失、黄斑细胞的功能丧失、光感细胞营养不良、黏多醣贮积症、杆-锥营养不良、锥-杆营养不良、前后葡萄膜炎和糖尿病性神经病变。
血管新生障碍的抑制可通过测量血管生成是否减缓或降低的任何公认的方法来评价。这包括直接观察和间接评价，诸如通过评价主观症状或客观生理指标。例如，可基于新生血管形成、微血管病、血管渗漏或血管水肿或它们的任何组合的预防或逆转来评价治疗功效。用于评价抑制眼部新生血管障碍的治疗功效也可根据稳定或改善视敏度来定义。
在本发明方法的一些实施方案中，经由玻璃体内注射用约25-4000μg的本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白治疗具有至少一只视力受损的眼睛的人类受试者。临床症状的改善通过本领域已知的一种或多种方法进行监测，所述方法例如间接检眼镜检查、眼底照相、荧光素血管病变、视网膜电图、外眼检查、裂隙灯显微镜、压平眼压测量法、超声角膜测厚和自动验光。后续剂量可每周或每月施用，例如，以2-8周或1-12个月间隔的频率施用。
V.制备方法
可使用本领域已知的或本文所述的任何方法制备本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白(诸如与全长抗体CL结构域的C-末端融合的VEGFR组分)。
分离的DNA在本文中理解为意指具有或不具有3'-和/或5'-侧翼区的化学合成的DNA、cDNA、染色体或染色体外DNA。优选地，本文所述的期望的VEGFR-抗体轻链融合蛋白通过在重组细胞培养物中的合成来制备。
对于此类合成，首先需要固定编码本发明的VEGFR组分的核酸。可通过以下方法从血管内皮细胞获得编码Flt-1、KDR或Flt-4受体的DNA：(a)由这些细胞制备cDNA文库，(b)由编码Flt-1或KDR受体的标记DNA或其片段(长度最高达或多于100个碱基对)进行杂交分析以检测含有同源序列的文库中的克隆体，以及(c)通过限制性酶分析和核酸测序分析克隆体以鉴定全长克隆体。如果全长克隆体不存在于cDNA文库中，则可使用Flt-1和KDR受体已知的核酸和氨基酸序列信息从各种克隆体回收适当的片段，并且在克隆体共有的限制性位点处连接以组装编码Flt-1或KDR结构域的全长克隆体。另选地，基因组文库可提供期望的DNA。
一旦从文库中鉴定出该DNA并分离，就可以将该DNA连接到适当的表达载体中，所述表达载体可操作地连接至适当的控制序列。此外，一旦克隆到适当的载体中，DNA就可以如上所述的多种方式进行改变以产生其功能上等同的变体。另外，编码各种结构域(诸如细胞内结构域、跨膜结构域和/或各种Ig-样结构域)的DNA可缺失和/或由编码来自其他受体的对应结构域的DNA取代。编码抗体氨基酸序列(诸如免疫球蛋白分子的轻链)的DNA也可与编码VEGFR中的一些或全部的DNA框内融合，从而产生VEGFR轻链C-末端融合分子(下文称为“杂合轻链”)。
许多载体是可用的。载体的选择部分取决于待使用的宿主细胞。一般来讲，优选的宿主细胞具有原核或真核(一般来讲为哺乳动物)来源。当然，一般来讲，对于DNA序列的初始克隆和可用于本发明的载体的构建而言优选原核生物。
1.氨基酸序列变体
应当理解，关于VEGFR组分与VEGF结合和抑制VEGF的活性的能力，在不脱离本发明实质的情况下，可在本发明的VEGFR组分的一个或多个Ig-样结构域中进行各种氨基酸取代。因此，可在本发明的VEGFR组分的一个或多个Ig-样结构域中进行点突变和其他更广泛的变化以便赋予有趣的特性，该特性不显著影响VEGFR组分与VEGF结合和抑制VEGF活性的能力。还可以在本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的抗体部分中进行各种氨基酸取代，以产生期望的活性(也参见“抗体变体”部分)。这些变体可通过本领域通常熟知的方法制备。
a)共价修饰
可对存在于VEGFR组分中的一个或多个Ig-样结构域的各种氨基酸残基进行共价修饰，从而赋予该一个或多个Ig-样结构域新的特性，但不消除与VEGF结合和灭活VEGF的能力。也可对本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的抗体部分进行同价修饰以产生期望的活性，例如保留的/改善的抗原结合、改善的ADCC或CDC。
例如，半胱氨酸残基最常与a-卤代乙酸酯(以及对应的胺)，诸如氯乙酸或氯乙酰胺进行反应，以得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。半胱氨酰残基也可通过与溴三氟丙酮、α-溴-b-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化、对氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应来衍生。
组氨酰基残基通过与焦碳酸二乙酯在pH5.5-7.0下反应来衍生，因为该试剂对于组氨酰基侧链是相对特异性的。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；该反应优选在pH6.0下在0.1M二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其他羧酸酐反应。用这些试剂衍生化具有逆转赖氨酸基残基的电荷的效应。用于衍生化含a-氨基的残基的其他适宜试剂包括亚氨酸酯，诸如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4-戊二酮；以及转氨酶催化的与乙醛酸的反应。
精氨酸残基通过与一种或多种常规试剂反应来修饰，所述常规试剂中包括苯乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化需要该反应在碱性条件下进行，这是由于胍官能团的高pKa。此外，这些试剂可与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基基团反应。
已经对酪氨酰残基本身的具体修饰进行了广泛的研究，特别关注通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标签引入酪氨酰残基中。最常见的是，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰酪氨酰类和3-硝基衍生物。使用125I或131I碘化酪氨酰残基以制备用于放射免疫测定的标记蛋白，上述氯胺T法是合适的。
通过与碳二亚胺(R'-N-C-N-R’)，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺反应，选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰基和谷氨酰基残基转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
双功能试剂的衍生化可用于将本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白与水不溶性载体基质或表面交联，以用于从复合混合物中纯化VEGFR-抗体轻链融合蛋白的方法中。常用的交联剂包括，例如1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟琥珀酰亚胺酯，例如具有4-叠氮基水杨酸的酯、同双官能亚氨酸酯(包括双琥珀酰胺酯诸如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯))和双官能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚氨基-1,8辛烷。衍生化试剂诸如甲基-3-[(对-叠氮基苯基)二硫代]丙亚氨酸酯，产生光可活化中间体，所述中间体在存在光时能够形成交联。另选地，将反应性水不溶性基质(诸如溴化氰活化的碳水化合物和美国专利3,969,2873,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中所述的反应性底物)用于蛋白质固定化。
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基常常脱去酰胺基成为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。另选地，这些残基在温和的酸性条件性下脱去酰胺基。这些残基的任一种形式均落入本发明的范围内。
其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,第79-86页，[1983])，N-末端氨基的乙酰化，以及在一些情况下，C-末端羧基基团的酰胺化。
b)DNA突变
存在于本发明的VEGFR组分中的一个或多个Ig-样结构域的氨基酸序列变体，或存在于本发明中的抗体部分的氨基酸序列变体，也可通过分别在编码VEGFR组分或抗体的DNA中产生突变来制备。此类变体包括，例如VEGFR组分的一个或多个Ig-样结构域或抗体内的氨基酸序列的氨基酸残基的缺失或***或取代。为了得到最终构建体，还可进行缺失、***和取代的任何组合，前提条件是最终构建体具有期望的活性。显然，将在编码该变体的DNA中进行的突变必需不将该序列置于阅读框之外，并且优选地不产生可产生二级mRNA结构的互补区(参见，EP 75,444A)。
在基因水平上，存在于本发明的VEGFR组分中的一个或多个Ig-样结构域的变体(或本发明的抗体变体)通常通过在编码一个或多个Ig-样结构域(或抗体)的DNA中的核苷酸的定点诱变来制备，从而产生编码变体的DNA，并且然后在重组细胞培养物中表达DNA。VEGFR组分变体通常表现出与未改变的嵌合蛋白相同的与VEGF配体结合的定性能力。抗体变体通常表现出与一个或多个靶抗原结合的相同定性能力，更好的抗原结合能力，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
虽然预先确定了用于在VEGFR组分的一个或多个Ig-样结构域中引入氨基酸序列变异的位点，但不需要预先确定突变本身。例如，为了优化给定位点处的突变的性能，可在靶密码子或区域处进行随机诱变，并且筛选表达的嵌合蛋白变体以获得期望的属性(诸如与VEGF配体特异性结合的能力、体内半衰期等)的最佳组合。用于在本文所述融合蛋白的抗体部分中引入氨基酸序列变异的位点可在例如下列处：HVR(例如，改变抗体-抗原结合亲和力)、Fc片段(例如，改善ADCC或CDC)、或抗体的任何可触及位点(例如，用半胱氨酸取代残基以用于缀合)。另外参见“抗体变体”部分。在具有已知序列的DNA中的预先确定位点处进行取代突变的技术为人们所熟知，例如定点诱变。
本文所述的融合蛋白内的VEGFR组分的一个或多个Ig-样结构域或抗体部分的变体的制备据此优选通过编码早期制备的嵌合蛋白或抗体的DNA的定点诱变来实现。定点诱变允许通过使用编码具有期望突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列，以及足够数量的相邻核苷酸来产生Ig-样结构域变体或抗体变体，以提供足够大小和序列复杂性的引物序列，从而在正在穿过的缺失连接片段的两侧上形成稳定的双链。通常，优选长度为约20个至25个核苷酸的引物，其具有在改变序列的连接片段的两侧上的约5个至10个残基。一般来讲，定点诱变的技术是本领域所熟知的，如由出版物所例示的，诸如Adelman等人，DNA 2,183(1983)，其公开内容以引用方式并入本文。
应当理解，定点诱变技术通常采用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。可用于定点诱变的典型载体包括载体，诸如M13噬菌体，如由Messing等人，Third ClevelandSymposium on Macromolecules and Recombinant DNA，编辑A.Walton，Elsevier,Amsterdam(1981)所公开的，其公开内容以引用的方式并入本文。这些噬菌体易于商购获得，并且它们的使用一般是本领域技术人员所熟知的。另选地，包含单链噬菌体复制起点的质粒载体(Veira等人，Meth.Enzymol.,153,3[1987])可用于获得单链DNA。
通常，通过首先获得单链载体来进行据此的定点诱变，所述单链载体在其序列内包括编码相关的VEGFR组分、抗体或VEGFR-抗体轻链融合蛋白的DNA序列。具有期望的突变序列的寡核苷酸引物一般来讲合成制备，例如通过Crea等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),75,5765(1978)的方法来制备。然后该引物由包含单链嵌合蛋白序列的载体退火，并使其经受DNA聚合酶如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段，以完成带有突变的链的合成。因此，形成了异源双链体，其中一条链编码原始的非突变序列，并且第二条链带有期望的突变。然后将该异源双链载体用于转化合适的细胞诸如JM101细胞，并选择克隆体，所述克隆体包括带有突变序列布置的重组载体。
在选择此类克隆体之后，可移除编码变体VEGFR组分、抗体变体或本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的突变DNA，并将其置于用于蛋白质生产的适当载体中，一般为可用于转化适当宿主的类型的表达载体。
c)突变的类型
氨基酸序列缺失通常在约1个至15个残基，更优选地1个至7个残基的范围内，并且通常是连续的。
氨基酸序列***包括具有从一个残基到长度基本上不受限的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。序列内***(即，在Ig-样结构域序列内的***)一般可在约1个至10个残基，更优选地1个至5个残基的范围内。末端***的示例包括信号序列(无论是与宿主细胞异源的还是同源的)与抗体轻链-VEGFR组分融合蛋白的N-末端的融合，以有利于其从重组宿主分泌。
可引入存在于VEGFR组分中的一个或多个Ig-样结构域中的第三组突变是其中一个或多个Ig-样结构域中的至少一个氨基酸残基，并且优选仅一个氨基酸残基已被除去并且在其位置中***不同残基的那些。当期望精细地调节一个或多个Ig-样结构域的特性时，此类取代优选地根据下表2进行。
表2
原始残基 示例性取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys
Asn(N) Gln；His
Asp(D) Glu
Cys(C) Ser
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp
Gly(G) Ala；Pro
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；Gln；Glu
Met(M) Leu；Tyr；Ile
Phe(F) Met；Leu；Tyr
Ser(S) Thr
Thr(T) Ser
Trp(W) Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe
Val(V) Ile；Leu
功能或免疫同一性的显著改变通过选择比表2中的那些更少保守性的取代来进行，即选择在其对维持以下方面的效果方面显著不同的残基：(a)取代区域中的多肽主链结构，例如，作为片状构形或螺旋构形，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，(c)大体积侧链。通常预期产生Ig-样结构域的特性的最大变化的取代将是下列的那些，其中：(a)甘氨酸和/或脯氨酸(P)被另一个氨基酸取代或缺失或***；(b)亲水性残基(例如，丝氨酰基或苏氨酰基)取代疏水性残基(例如，亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰或丙氨酰基)(或被其取代)；(c)半胱氨酸残基取代任何其他残基(或被其取代)；(d)具有正电侧链的残基(例如，赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)取代具有负电电荷的残基(例如谷酰基或天门冬氨酰基)(或被其取代)；(e)具有负电侧链的残基取代具有正电电荷的残基(或被其取代)；或(f)具有大体积侧链的残基(例如，苯基丙氨酸)取代不具有此类侧链的残基(例如甘氨酸)(或被其取代)。
对于推荐用于抗体变体的取代，参见表1和“抗体变体”部分。
预期大多数缺失和***，并且具体地讲取代，不产生本文所述融合蛋白的VEGFR组分的一个或多个Ig-样结构域或抗体部分的特性的根本改变。然而，当在这样做之前难以预测取代、缺失或***的确切效果时，本领域的技术人员将理解，该效果将通过常规筛选测定法来评价。例如，Ig-样结构域变体通常通过编码完整VEGFR组分的核酸的定点诱变来制备，在重组细胞培养物中表达变体核酸，从细胞培养物中纯化抗体轻链-变体VEGFR组分融合蛋白以及检测变体VEGFR组分与VEGF配体特异性结合的能力。可常规用于确定一个或多个Ig-样结构域中的一个或多个具体改变是否影响VEGFR组分与VEGF结合和抑制VEGF活性的能力的结合测定法描述于实施例2和Park等人，J.Biol.Chem.269:25646-25654(1994)的文章中，其以引用方式明确地并入本文。抗体或抗原-结合结构域，或VEGFR组分的结合特异性也可通过本领域已知的方法进行实验测定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore测试和肽扫描。
因此，变体VEGFR组分、或抗体变体或本文所述的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的活性可在合适的筛选测定法中针对所期望的特性进行筛选。例如，与VEGF配体特异性结合的能力的变化可通过竞争型VEGF结合测定法来测量。蛋白质特性(诸如氧化还原或热稳定性、疏水性、对蛋白水解降解的易感性、或与载体聚合或成多聚体的趋势)的修饰由普通技术人员熟知的方法测定。
2.原核细胞中的重组体产生
a)载体构建
编码本申请的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的多核苷酸序列可使用标准重组技术获得。期望的多核苷酸序列可与抗体产生细胞(诸如杂交瘤细胞)分离和测序。另选地，可使用核苷酸合成器或PCR技术合成多核苷酸。一旦获得，就将编码多肽的序列***能够在原核宿主中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可用且已知的多种载体可用于本发明的目的。合适载体的选择将主要取决于待***载体中的核酸大小以及待被该载体转化的特定宿主细胞。每种载体包含多种组分，这取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达，或这两者)及其与其所存在的特定宿主细胞的相容性。载体组分一般包括但不限于：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸***序列和转录终止序列。
一般来讲，包含来源于与宿主细胞相容的物种的复制和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，通常使用pBR322(来源于大肠杆菌物种的质粒)转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，并且因此提供了鉴定转化细胞的简便方式。pBR322、其衍生物或其它微生物质粒或噬菌体也可包含或经修饰以包含可被微生物用于表达内源蛋白质的启动子。用于表达特定抗体的pBR322衍生物的示例详细地描述于Carter等人，美国专利5,648,237中。
另外，包含与宿主微生物相容的复制和控制序列的噬菌体载体可与这些宿主结合用作转化载体。例如，噬菌体诸如GEMTM-11可用于制备重组载体，所述载体可用于转化易感宿主细胞，诸如大肠杆菌LE392。
本申请的表达载体可包含两个或更多个启动子-顺反子对，其编码多肽组分中每一种。启动子是位于调节其表达的顺反子上游(5')的非翻译调节序列。原核启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的变化，例如存在或不存在营养素或温度变化，在其控制下引发顺反子的转录水平的增加。
由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子为人们所熟知。通过限制酶消化从源DNA中除去启动子并将分离的启动子序列***本申请的载体中，可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作地连接。天然启动子序列和许多异源启动子两者均可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们一般允许经表达的靶基因的更多的转录和更高收率。
适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、-半乳糖酶和乳糖启动子体系、色氨酸(trp)启动子体系和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中是功能性的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的其核酸序列已被公开，从而使技术人员能够使用用于提供任何所需限制位点的接头或衔接子可操作地将它们连接到编码靶轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人，(1980)Cell 20:269)。
在一个方面，重组载体内的每个顺反子包含分泌信号序列组分，其指导表达的多肽跨膜转运。一般来讲，信号序列可以是载体的组分，或者其可以是***载体中的靶多肽DNA的一部分。被选择用于本发明的信号序列应当是被宿主细胞识别和处理的(即，由信号肽酶裂解)的信号序列。对于不识别和处理来源于异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列被原核信号序列取代，所述原核信号序列选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热-稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一些实施方案中，用于表达体系的两个顺反子的信号序列是STII信号序列或其变体。
在一些实施方案中，根据本申请的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的产生可在宿主细胞的细胞质中发生，并且因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在一些实施方案中，将多肽组分，诸如编码抗体重链的多肽和编码与VEGFR组分融合的抗体轻链的多肽进行表达、折叠和组装以在细胞质内形成功能抗体融合蛋白。某些宿主菌株(例如，大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而允许表达的蛋白质亚基的正确折叠和组装。Proba和Pluckthun，Gene,159:203(1995)。
本发明提供了表达***，其中可调节表达的多肽组分的定量比率，以便最大化本申请的分泌和正确组装的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的收率。此类调节至少部分地通过同时调节多肽组分的翻译强度来实现。用于调节翻译强度的一种技术公开于Simmons等人，美国专利5,840,523中。其利用顺反子内的翻译起始区(TIR)的变体。对于给定的TIR，一系列氨基酸或核酸序列变体可以系列翻译强度产生，从而提供由此调节该因素以获得特定链的期望表达水平的便利方式。TIR变体可通过常规诱变技术产生，所述技术导致密码子改变，所述密码子改变可改变氨基酸序列，但也优选核酸序列中的沉默改变。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序列的数量或间距的改变，连同信号序列的改变。产生突变信号序列的一种方法是在编码序列开始时产生“密码子库”，其不改变信号序列的氨基酸序列(即，改变是沉默的)。这可通过改变每个密码子的第三核苷酸位置来实现。此外，一些氨基酸诸如亮氨酸、丝氨酸和精氨酸，具有多个第一和第二位置，这可增加制造库的复杂性。该诱变方法详细描述于Yansura等人，(1992)METHODS:A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158。
优选，产生对于其中每个顺反子具有系列TIR强度的一组载体。该有限的组提供了在各种TIR强度组合下，每个链的表达水平以及期望的蛋白产物的收率的比较。TIR强度可通过对报道基因的表达水平进行量化来确定，如Simmons等人，美国专利5,840,523中所述的。基于翻译强度比较，选择期望的单独TIR以在本申请的表达载体构建体中组合。
b)原核宿主细胞
适用于表达本申请的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。可用的细菌示例包括埃希杆菌属(例如，大肠杆菌)、芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌)、肠杆菌、假单胞菌属物种(例如铜绿假单胞菌)、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、志贺氏菌、根瘤菌、透明颤菌或副球菌。在一些实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一些实施方案中，大肠杆菌细胞用作本发明的宿主。大肠杆菌菌株的示例包括菌株W3110(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第2卷，(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987)，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)，及其衍生物，包括菌株33D3，其具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanR(美国专利5,639,635)。其他菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些示例是说明性的而不是限制性的。构建具有限定基因型的上述细菌中任一种的衍生物的方法是本领域已知的，并描述于例如Bass等人，Proteins，8：309-314(1990)中。考虑到复制子在细菌细胞中的可复制性，通常需要选择合适的细菌。例如，当人们所熟知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410用于提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌属物种可适合用作宿主。
通常，宿主细胞应当分泌最少量的蛋白水解酶，并且可以理想地将附加蛋白酶抑制剂掺入细胞培养物中。
c)蛋白质生产
用上述表达载体转化宿主细胞，并在适当修改的常规营养培养基中培养，以用于诱导启动子、选择转化株或扩增编码期望序列的基因。转化是指将DNA引入原核宿主中以使DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合子复制。根据所用的宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。使用氯化钙的钙处理一般用于包含大量细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。所用的另一种技术是电穿孔。
用于产生本申请的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的原核细胞在本领域已知并适用于培养所选宿主细胞的培养基中生长。合适培养基的示例包括luria肉汤(LB)加上必需的营养补充剂。在一些实施方案中，培养基还包含选择剂，其基于构件表达载体选择，以选择性地允许包含表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素添加到培养基中用于表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的生长。
除了碳、氮和无机磷酸盐源之外的任何必要的补充剂也可以单独引入，或作为与另一种补充剂或培养基(例如复合氮源)的混合物形式以适当的浓度被包括。任选地，培养基可包含一种或多种还原剂，所述还原剂选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸酯、二硫赤藓醇和二硫苏糖醇。原核宿主细胞在合适的温度下培养。例如，对于大肠杆菌生长而言，优选的温度范围为约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。培养基的pH可以为约5至约9范围内的任何pH，这主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌，pH优选为约6.8至约7.4，更优选为约7.0。
如果诱导型启动子用于本申请的表达载体中，则在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本申请的一个方面，PhoA启动子用于控制多肽的转录。因此，在磷酸盐限制性培养基中培养转化的宿主细胞用于诱导。优选，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P培养基(参见，例如，Simmons等人，J.Immunol.Methods(2002),263:133-147)。根据所用的载体构建体，可以使用多种其它诱导物，如本领域已知的。
本申请的表达的VEGFR-抗体轻链融合蛋白分泌到宿主细胞的周质中并从宿主细胞的周质中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，其一般通过诸如渗透压休克、超声处理或裂解的方式来进行。一旦细胞被破坏，细胞碎片或整个细胞就可通过离心或过滤移除。蛋白质可例如通过亲和树脂色谱法进一步纯化。另选地，可将蛋白质转移到培养基中并在其中分离。可从培养物中移除细胞，并且将培养上清液过滤并浓缩，以进一步纯化所产生的蛋白质。表达的多肽可使用通常已知的方法，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析，来进一步分离和鉴定。
另选地，蛋白质生产通过发酵过程大量进行。各种大规模补料分批发酵程序可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升容量，优选约1,000至100,000升容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧气和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳/能源)。小规模发酵一般是指发酵罐中的发酵，所述发酵罐的体积容量不超过约100升，并且可在约1升至约100升的范围内。
在发酵过程中，蛋白质表达的诱导通常在细胞已经在合适条件下生长至期望密度(例如OD550为约180-220)之后引发，在该阶段细胞处于早期稳定期。根据所用的载体构建体，可以使用多种诱导物，如本领域已知的和如上所述的。细胞可在诱导之前生长较短的时间段。通常将诱导细胞约12-50小时，但可使用较长或更短的诱导时间。
为改善本申请的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的产量和质量，可改变各种发酵条件。例如，为了改善分泌的多肽的适当组装和折叠，过表达伴侣蛋白，诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣蛋白活性的肽基脯氨酰顺式，反式异构酶)的附加载体可用于共转化宿主原核细胞。伴侣蛋白已经展示出有利于在细菌宿主细胞中产生异源蛋白质的适当折叠和溶解度。Chen等人，(1999)J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等人，美国专利6,083,715；Georgiou等人，美国专利6,027,888；Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.275:17106-17113；Arie等人，(2001)Mol.Microbiol.39:199-210。
为了使表达的异源蛋白质(尤其是蛋白质水解敏感性的那些蛋白质)的蛋白质水解最小化，可将某些缺乏蛋白质水解酶的宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞株以在编码已知的细菌蛋白酶(诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI以及它们的组合)的基因中实现基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株可获得并且描述于以下文献中：例如，Joly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,2773-2777(1998)；Georgiou等人，美国专利5,264,365；Georgiou等人，美国专利5,508,192；Hara等人，Microbial Drug Resistance，2:63-72(1996)。
缺乏蛋白质水解酶并用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株可用作编码本申请VEGFR-抗体轻链融合蛋白的表达体系中的宿主细胞。
d)蛋白质纯化
将本文所制备的VEGFR-抗体轻链融合蛋白进一步纯化以获得基本上均匀的制剂以用于进一步测定和使用。可采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序的示例：免疫亲和或离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上或阳离子交换树脂如DEAE上的色谱，SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一些实施方案中，固定在固相上的蛋白质A用于包含本申请所述Fc区的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的免疫亲和纯化。蛋白质A为411(D细胞壁蛋白，其来自金黄色葡萄球菌，以与抗体Fc区的高亲和力结合)。Lindmark等人(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13。蛋白质A固定于其上的固相优选为包含玻璃或二氧化硅表面的柱，更优选为可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，所述柱已用试剂(例如甘油)涂覆，以试图防止污染物的非特异性粘附。然后洗涤固相，以除去非特异性结合到固相的污染物。最后，通过洗脱从固相回收VEGFR-抗体轻链融合蛋白。
3.真核细胞中的重组体产生
对于真核表达，载体组分一般包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、和增强子元件、启动子和转录终止序列。
a)信号序列组分
用于真核宿主的载体还可以是***物，其编码在成熟蛋白质或多肽的N-末端处具有特异性切割位点的信号序列或其它多肽。选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹病毒糖蛋白(gD)信号。在一些实施方案中，本文所述的重链和/或VEGFR-轻链融合多肽还可在N-末端处包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:41、42或43的氨基酸序列。
将此类前体区的DNA在阅读框中与编码本申请的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的DNA连接。
b)复制起点
一般来讲，复制组分的来源不需要哺乳动物表达载体(通常可仅使用SV40来源，因为其包含早期启动子)。
c)选择基因组分
表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择性标记。典型的选择基因编码的蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型缺陷，或(c)提供从复杂培养基不可获得的关键营养素，例如，编码芽孢杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个示例利用药物来阻止宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，因此在选择方案中得以存活。这种显性选择的示例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的合适选择性标记的另一示例是能够鉴定用于摄取编码本申请抗体的核酸的细胞组分的那些，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过在包含甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如，ATCCCRL-9096)。
另选地，用编码多肽的DNA序列、野生型DHFR蛋白和另一种选择性标记，诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)转化或共转化的宿主细胞(具体地讲包含内源DHFR的野生型宿主)可通过培养基中的细胞生长来选择，所述培养基包含用于选择标记的选择剂，诸如氨基糖苷类抗生素，例如卡那霉素、新霉素或G418。参见，美国专利4,965,199。
d)启动子组分
表达和克隆载体通常包含由宿主生物识别并与编码期望多肽序列的核酸可操作连接的启动子。事实上，所有真核基因均具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基的富AT区。在许多基因转录起始上游70至80个碱基处发现的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以为任何核苷酸。大多数真核生物的3'端为AATAAA序列，其可为向编码序列的3'端添加polyA尾巴的信号。可将所有这些序列***真核表达载体中。
适合与原核宿主一起使用的其它启动子包括phoA启动子、-乳糖酶和乳糖启动子***、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子***、以及杂合启动子，诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌***的启动子还将包含可操作地连接于编码抗体的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录多肽例如受到启动子的控制，所述启动子获自诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛***瘤病毒、鸟类肉瘤病毒、细胞巨化病毒、逆转录酶病毒、乙型肝炎病毒并最优选猿猴病毒40(SV40)的病毒的基因组，获自异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，获自热休克启动子，条件是此类启动子与宿主细胞***相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子可以SV40限制性片段形式便利地获得，所述限制性片段还包含SV40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以HindIII E限制性片段便利地获得。使用牛***状瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的体系公开于美国专利4,419,446中。对该体系的改性描述于美国专利4,601,978中。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下人干扰素cDNA在小鼠细胞中的表达，还可参见Reyes等人，Nature 297：598-601(1982)。另选地，劳氏肉瘤病毒长末端重复序列可用作启动子。
e)增强子元件组分
通常通过将增强子序列***载体中，增加通过高等真核生物对编码本申请VEGFR-抗体轻链融合蛋白的DNA的转录。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常，将使用来自真核细胞病毒的增强子。示例包括复制起点后侧的SV40增强子(100-270bp)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子、以及腺病毒增强子。关于用于激活真核启动子的增强元件，还可参见，Yaniv，Nature 297:17-18(1982)。增强子可以被剪接到载体中多肽编码序列的5'或3'位置，但优选位于启动子的5'位点。
f)转录终止组分
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含转录终止和稳定mRNA所需的序列。此类序列通常得自真核或病毒DNA或cDNA的5'(并偶尔为3')非翻译区。这些区域在编码多肽的mRNA的非翻译部分中含有转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种可用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
g)宿主细胞的选择和转化
用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适的宿主细胞包括本文所述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的示例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆用于悬浮培养基中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977))；小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/íDHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(HepG2)。
宿主细胞利用用于VEGFR-抗体轻链融合蛋白生产的上述表达或克隆载体转化，并在适当修改的常规营养培养基中培养，以诱导启动子，选择转化体，或扩增编码期望序列的基因。
h)培养宿主细胞
用于制备本申请VEGFR-抗体轻链融合蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购获得的培养基，诸如Ham's F10(Sigma)、Minimal Essential Medium((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，描述于Ham等人，Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes等人，Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利注册号30,985中的培养基中的任一种可用作宿主细胞的培养介质。这些培养基中任一种均可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、磷酸钙、磷酸镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等效能源。还可以适当的浓度包含任何其它必要的补充物，所述浓度将是技术人员已知的。培养条件(诸如温度、pH等)是先前与所选用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员将是显而易见的。
i)蛋白质纯化
当使用重组技术时，VEGFR-抗体轻链融合蛋白可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果VEGFR-抗体轻链融合蛋白在细胞内产生，作为第一步，则例如通过离心或超滤移除宿主细胞或裂解片段的颗粒状碎片。Carter等人，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简而言之，在约30分钟内在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯基甲基磺酰氟(PMSF)的存在下将细胞浆解冻。细胞碎片可通过离心除去。在VEGFR-抗体轻链融合蛋白分泌到培养基中的情况下，一般首先使用可商购获得的蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元将来自此类表达体系的上清液浓缩。可在前述步骤中的任一个中包含蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，并且可包括抗生素以防止外源污染物的生长。
由细胞制备的蛋白质组合物可使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。蛋白质A作为亲和配体的适用性取决于存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同种型。蛋白质A可用于纯化基于包含1、2或4个重链的人免疫球蛋白的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人3，推荐蛋白质G(Guss等人，EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所附接的基质通常是琼脂糖，但也可使用其它基质。机械稳定的基质，诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯基)苯允许比由琼脂糖可实现的更快的流量和更短的加工时间。在抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体，其他蛋白质纯化技术也是可用的，诸如离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱、阴离子或阳离子交换树脂上的肝素SEPHAROSETM色谱(诸如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可对包含VEGFR-抗体轻链融合蛋白和污染物的混合物进行低pH疏水作用色谱，其使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选地在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。
VI.制品和试剂盒
还提供了试剂盒和制品，其包含VEGFR-抗体轻链融合蛋白中的任一种(诸如，VEGFR-抗-PD-1融合蛋白、VEGFR-抗-PD-L1融合蛋白、VEGFR-抗-CTLA-4融合蛋白、VEGFR-抗-EGFR融合蛋白、VEGFR-抗-HER2融合蛋白、VEGFR-抗-Ang2融合蛋白、VEGFR-抗-TNFα融合蛋白、VEGFR-抗-IL-17A融合蛋白)，编码其的分离的核酸或载体，或包含编码VEGFR-抗体轻链融合蛋白的分离的核酸或载体的分离的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供一种试剂盒，其包含本文所述的药物组合物中的任一种，并且优选提供其使用说明。
在本申请的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、广口瓶、柔性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。药盒可任选地提供附加组分，诸如缓冲剂和解释性信息。因此，本申请还提供了制品，其包括小瓶(诸如密封小瓶)、瓶子、广口瓶、柔性包装等。
所述制品还可包括容器以及容器上或与容器相关联的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由各种材料(诸如玻璃或塑料)形成。一般来讲，容器保存有效治疗本文所述的疾病或障碍(诸如癌症)的组合物，并且可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装说明书指出所述组合物用于治疗个体的具体病症。标签或包装说明书还包含用于将组合物施用于个体的说明。标签可示出关于重构和/或使用的指示。保存药物组合物的容器可以为多功能小瓶，其允许重构制剂的重复施用(例如，2-6次施用)。包装说明书是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用此类治疗产品的指示、用途、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。另选地，所述制品还可包括第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。所述容器还可包含商业和用户角度所需的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
在本发明的一些实施方案中，制品还可包括用于将药物组合物施用到眼部的一个或多个装置或器械。例如，制品可包括一个或多个针(例如，22、25、27或计量注射针)和/或一个或多个注射器(例如，0.3ml、0.5ml或1.0ml注射器)。针或注射器或两者可包含一种或多种组合物，所述组合物包含VEGFR-抗体轻链融合蛋白的单位剂型。例如，制品可包括针或注射器，所述针或注射器容纳预定体积和/或量的包含VEGFR-抗体轻链融合蛋白的组合物。制品可包含针或注射器，所述针或注射器容纳VEGFR-抗体轻链融合蛋白的缓释制剂，例如眼部植入物。针和注射器可以但不必彼此附接。针和/或注射器可具有可移除的顶盖。提供已加载到将用于施用一种或多种试剂的装置中的一种或多种组合物可提供增加的可靠性、安全性和便利性。
试剂盒或制品可包括药物组合物的多个单位剂量和使用说明书，其以足以在药房(医院药房和配混药房)中储存和使用的量包装。
示例性实施方案
实施方案1：一种抗体融合蛋白，其包含1)包含轻链的抗体，和2)VEGFR组分，其中所述VEGFR组分与所述抗体轻链的C-末端融合。
实施方案2：根据实施方案1所述的抗体融合蛋白，其包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。
实施方案3：根据实施方案2所述的抗体融合蛋白，其中所述第一VEGFR组分和所述第二VEGFR组分相同。
实施方案4：根据实施方案2所述的抗体融合蛋白，其中所述第一VEGFR组分和所述第二VEGFR组分不同。
实施方案5：根据实施方案1-4中任一个所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分包含第一VEGFR Flt1的Ig-样结构域2(Flt1d2)。
实施方案6：根据实施方案中5所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分还包含第二VEGFR Flk1的Ig-样结构域3(Flk1d3)。
实施方案7：根据实施方案6所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列。
实施方案8：根据实施方案中6或7所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分还包含第三VEGFR Flk1的Ig-样结构域4(Flk1d4)。
实施方案9：根据实施方案1-8中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分至少为约4kDa。
实施方案10：根据实施方案1-9中任一项所述的抗体融合蛋白，其中VEGFR组分和VEGF之间的结合的KD为约10-8M至约10-13M。
实施方案11：根据实施方案1-10中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分和所述抗体轻链的C-末端通过接头连接。
实施方案12：根据实施方案11所述的抗体融合蛋白，其中所述接头为肽接头。
实施方案13：根据实施方案12所述的抗体融合蛋白，其中所述接头包含SEQ IDNO：6或7的氨基酸序列。
实施方案14：根据实施方案1-13中任一个所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgG-来源分子、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab-scFv、F(ab’)2-scFv2、Fab-scFv-Fc、对接和锁定(Dock and Lock)、scFv、二-scFv、双体抗体、双体抗体-Fc、双体抗体-CH3、和细胞内抗体。
实施方案15：根据实施方案14中所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含轻链恒定结构域(CL结构域)，并且所述VEGFR组分与所述抗体CL结构域的C-末端融合。
实施方案16：根据实施方案14或15所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体为全长抗体。
实施方案17：根据实施方案16所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体为IgG抗体。
实施方案18：根据实施方案17所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体为IgG1或IgG抗体，或其变体。
实施方案19：根据实施方案1-18中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体为单特异性的。
实施方案20：根据实施方案1-18中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体为多特异性的。
实施方案21：根据实施方案1-20中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体特异性识别免疫检查点分子。
实施方案22：根据实施方案21所述的抗体融合蛋白，其中所述免疫检查点分子为刺激性免疫检查点分子。
实施方案23：根据实施方案21所述的抗体融合蛋白，其中所述免疫检查点分子为抑制性免疫检查点分子。
实施方案24：根据实施方案23所述的抗体融合蛋白，其中所述抑制性免疫检查点分子选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CD47、CXCR4、CSF1R、LAG-3、TIM-3、HHLA2、BTLA、CTLA-4、TIGIT、VISTA、B7-H4、CD160、2B4和CD73。
实施方案25：根据实施方案24所述的抗体融合蛋白，其中所述抑制性免疫检查点分子为PD-1。
实施方案26：根据实施方案25所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:12的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案27：根据实施方案25或26所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
实施方案28：根据实施方案27所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
实施方案29：根据实施方案25所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案30：根据实施方案25或29所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
实施方案31：根据实施方案30所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
实施方案32：根据实施方案24所述的抗体融合蛋白，其中所述抑制性免疫检查点分子为PD-L1。
实施方案33：根据实施方案32所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案34：根据实施方案32或33所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
实施方案35：根据实施方案34所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
实施方案36：根据实施方案32所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案37：根据实施方案32或36所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
实施方案38：根据实施方案37所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
实施方案39：根据实施方案24所述的抗体融合蛋白，其中所述抑制性免疫检查点分子为CTLA-4。
实施方案40：根据实施方案39所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案41：根据实施方案39或40所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
实施方案42：根据实施方案41所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
实施方案43：根据实施方案1-20中任一个所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体特异性识别肿瘤抗原。
实施方案44：根据实施方案43所述的抗体融合蛋白，其中所述肿瘤抗原为HER2。
实施方案45：根据实施方案44所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案46：根据实施方案44或45所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
实施方案47：根据实施方案46所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:26、27或28的氨基酸序列。
实施方案48：根据实施方案43所述的抗体融合蛋白，其中所述肿瘤抗原为EGFR(HER1)。
实施方案49：根据实施方案48所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案50：根据实施方案48或49所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
实施方案51：根据实施方案50所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
实施方案52：根据实施方案1-20中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体特异性识别血管生成因子。
实施方案53：根据实施方案52所述的抗体融合蛋白，其中所述血管生成因子为促血管生成素-2(Ang2)。
实施方案54：根据实施方案53所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案55：根据实施方案53或54所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
实施方案56：根据实施方案55所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
实施方案57：根据实施方案52所述的抗体融合蛋白，其中所述血管生成因子为TNFα。
实施方案58：根据实施方案57所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案59：根据实施方案57或58所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
实施方案60：根据实施方案59所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
实施方案61：根据实施方案52所述的抗体融合蛋白，其中所述血管生成因子为IL-17A。
实施方案62：根据实施方案61所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
实施方案63：根据实施方案61或62所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链，所述轻链包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
实施方案64：根据实施方案63所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体融合蛋白包含重链，所述重链包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，和轻链融合多肽，所述轻链融合多肽包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。
实施方案65：一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1-64中任一个所述的抗体融合蛋白和药学上可接受的载体。
实施方案66：一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施方案65所述的药物组合物。
实施方案67：根据实施方案66所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤。
实施方案68：根据实施方案67所述的方法，其中所述癌症为肺癌、肝癌、皮肤癌(例如，黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、***癌、结直肠癌或膀胱癌。
实施方案69：根据实施方案66-68中任一个所述的方法，其还包括使所述个体经受附加的癌症治疗。
实施方案70：根据实施方案66-69中任一个所述的方法，其中所述药物组合物全身施用。
实施方案71：根据实施方案70所述的方法，其中所述药物组合物静脉内(iv)施用。
实施方案72：根据实施方案66-69中任一个所述的方法，其中所述药物组合物局部施用。
实施方案73：根据实施方案72所述的方法，其中所述药物组合物肿瘤内施用。
实施方案74：一种治疗患有非肿瘤性障碍的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据实施方案65所述的药物组合物。
实施方案75：根据实施方案74所述的方法，其中所述非肿瘤性障碍为与VEGF过表达相关联的。
实施方案76：根据实施方案74或75所述的方法，其中所述非肿瘤性障碍选自类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管瘤、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、慢性炎症和眼部新生血管障碍。
实施方案77：根据实施方案74-76中任一个所述的方法，其中所述药物组合物全身施用。
实施方案78：根据实施方案77所述的方法，其中所述药物组合物静脉内(iv)施用。
实施方案79：根据实施方案74-78中任一个所述的方法，其中所述非肿瘤性障碍为眼部新生血管障碍。
实施方案80：根据实施方案79所述的方法，其中所述眼部新生血管障碍为年龄相关性黄斑变性(AMD)或糖尿病性视网膜病。
实施方案81：根据实施方案80所述的方法，其中所述眼部新生血管障碍为AMD。
实施方案82：根据实施方案80或81所述的方法，其中所述眼部新生血管障碍与脉络膜新生血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿相关联。
实施方案83：根据实施方案79-82中任一个所述的方法，其中所述药物组合物的施用选自滴眼液、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球筋膜囊下注射和眼球筋膜囊下植入中的一种。
实施方案84：根据实施方案83所述的方法，其中所述药物组合物通过玻璃体内注射施用。
实施方案85：根据实施方案66-84中任一项所述的方法，其中所述个体为人类。
实施方案86：一种分离的核酸，其编码根据实施方案1-64中任一个所述的抗体融合蛋白。
实施方案87：一种载体，其包含根据实施方案86所述的分离的核酸。
实施方案88：一种分离的宿主细胞，其包含根据实施方案86所述的分离的核酸，或根据实施方案87所述的载体。
实施方案89：一种试剂盒，其包含实施方案1-64中任一个所述的抗体融合蛋白，根据实施方案86所述的分离的核酸，根据实施方案87所述的载体，或根据实施方案88的分离的宿主细胞。
实施方案90：一种制备抗体融合蛋白的方法，其包括：(a)在有效表达所述抗体融合蛋白的条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案86所述的分离的核酸或根据实施方案87所述的载体，或根据实施方案88所述的分离的宿主细胞；以及(b)从所述宿主细胞获得表达的抗体融合蛋白。
实施方案91：根据实施方案90所述的方法，其中步骤(a)还包括制备宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案86所述的分离的核酸或根据实施方案87所述的载体。
实施例
以下实施例旨在仅对本发明进行举例说明并且因此不应被视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述作为说明且不作为限制来提供。
实施例1：VEGFR-抗体轻链融合蛋白的构建
VEGF陷阱(阿柏西普(Aflibercept))包含与IgG Fc片段的N-末端嵌合融合的VEGFR-2的VEGFR-1-Ig-样结构域3的Ig-样结构域2(Flt1d2-Flk1d3)(下文被称为“VEGFR-Fc”)。该VEGFR-Fc融合蛋白可以比贝伐单抗(VEGF中和抗体，50pM)更高的亲和力(0.5pM)捕获VEGF。
为了构建VEGFR-抗体轻链融合蛋白，Flt1d2-Flk1d3融合氨基酸序列(211aa)从阿柏西普衍生，并且经由任选的肽接头(诸如(GGGGS)3(SEQ ID NO:6；“(G4S)3”或“GS3”)、或(GGGGS)6(SEQ ID NO:7；“(G4S)6”或“GS6”))与如表3中所述的各种抗体的轻链的C-末端融合。然后将构建体在CHO细胞中表达并纯化。
表3：VEGFR-抗体轻链融合蛋白构建体
Figure BDA0002502291250001621
实施例2：对VEGFR-抗体轻链融合蛋白的结合亲和力和ADCC的测试
材料
人VEGF121/VEGF-A蛋白(人VEGF 121同种型(P15692-9)(121个氨基酸，Ala 27-Arg 147))，其具有6×His标签(目录号10008-HNAB)，和人HER2蛋白(人ErbB2的细胞外结构域(NP_004439.2)，641个氨基酸，Thr 23-Thr 652)，其中聚组氨酸标签在C-末端融合(目录号10004-H08H)购自Sino Biological。人PD-1、PD-L1、CTLA-4、EGFR(HER1)、TNFα、Ang2和IL-17A蛋白全部购得。His标签抗体(捕获抗体)购自Qiagen。HRP缀合的抗-IgG Fc抗体(第二抗体)购自Birmingham SouthernBiotech。96孔ELISA板(免疫级TM)购自BrandTech。
基于ELISA的结合测定法
用100μl His标签抗体(捕获抗体，0.4μg/ml)涂覆96孔ELISA板，在室温(RT)下过夜。将经涂覆的板用洗涤缓冲液(具有0.1％Tween 20的pH 7.4 PBS)洗涤三次，并且在室温下用3％BSA的洗涤缓冲液溶液封闭2小时。洗涤三次之后，用VEGF121蛋白(3％BSA的洗涤缓冲液溶液，包含0.4μg/ml VEGF121)或可由全长抗体识别的靶蛋白(3％BSA的洗涤缓冲液溶液，包含0.4μg/ml靶蛋白，例如HER2、CTLA-4或PD-1等)涂覆这些板，并且在室温下温育2小时。洗涤三次之后，将各种浓度的VEGFR-抗体轻链融合蛋白的包含3％BSA的洗涤缓冲液溶液加入涂覆的板中，并使其在室温下温育2小时。包括阿柏西普(VEGFR-Fc融合蛋白)和相应的亲本全长抗体作为阳性对照。例如，将曲妥珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001631
)用作Her2/LC-GS6-VEGFR-IgG1、Her2/LC-GS3-VEGFR-IgG1和Her2/LC-VEGFR-IgG1的阳性抗-HER2抗体对照；将派姆单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001632
)用作mPD-1/LC-GS6-VEGFR-IgG4的阳性抗-PD-1抗体对照；将阿特珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001633
)用作tPD-L1/LC-GS6-VEGFR-nIgG1的阳性抗-PD-L1抗体对照等。在洗涤三次之后，添加HRP缀合的抗-IgG Fc抗体(第二抗体)(用3％BSA的洗涤缓冲液溶液1:6000稀释)，并在室温下温育2小时。洗涤四次之后，将100μl HRP底物加入每个孔中。在显色20分钟后，将终止缓冲液添加到每个孔中。每个孔的光密度(OD)立即使用酶标仪在450nm下测量。如果OD>2.0，则计算EC50；否则，不计算EC50。
如由表4中可以看出，在VEGFR组分和轻链之间具有接头的VEGFR-抗-HER2轻链融合蛋白(Her2/LC-GS3-VEGFR-IgG1、Her2/LC-GS6-VEGFR-IgG1)示出与阳性抗-HER2对照
Figure BDA0002502291250001634
相似的与HER2的结合，以及与阳性对照阿柏西普(VEGFR-Fc)相似的与VEGF(VEGF121)的结合。较长的接头(比较GS6和GS3)似乎赋予与VEGF和由亲本全长抗体识别的抗原(HER2)两者更好的结合，这可能是由于VEGFR组分和全长抗体之间存在较大空间，这使得每个结合部分正常起作用。虽然不具有接头的VEGFR-抗-HER2轻链融合蛋白(Her2/LC-VEGFR-IgG1)仍保持与
Figure BDA0002502291250001635
相似的与HER2的结合亲和力，但其与VEGF(VEGF121)的结合显著降低(“未检测到”)，从而指示接头(和/或接头长度)对于VEGFR组分与VEGF的正确结合至关重要。
表4：VEGFR-抗-HER2轻链融合蛋白与Her2和VEGF的结合亲和力
构建体名称 Her2(EC<sub>50</sub>) VEGF121(EC<sub>50</sub>)
赫塞汀(Herceptin)(抗-Her2抗体) 16.9nM 未检测到
阿柏西普(VEGFR-Fc) ND 12.2nM
Her2/LC-GS3-VEGFR-IgG1 28nM 22.5nM
Her2/LC-GS6-VEGFR-IgG1 21.5nM 19.5nM
Her2/LC-VEGFR-IgG1 30nM 未检测到
为了确定VEGFR-抗体轻链融合是否适用于除
Figure BDA0002502291250001641
以外的其他IgG1治疗性抗体，将多种基于IgG1的单克隆抗体与Flt1d2-Flk1d3在轻链的C-末端处融合(亲本抗体和构建体名称，参见实施例1)。将阿柏西普(VEGFR-Fc)用作阳性VEGF-结合对照。由表5可以看出，所有的VEGFR-IgG1抗体轻链融合蛋白表现出与其亲本VEGFR-Fc融合蛋白(阿柏西普)相似的与VEGF的结合亲和力，从而表明VEGFR-抗体轻链融合适用于不同的基于IgG1的治疗性抗体。
表5：VEGFR-IgG1抗体轻链融合蛋白与VEGF的结合亲和力
构建体名称 VEGF121(EC<sub>50</sub>)
阿柏西普(VEGFR-Fc) 10.5nM
CTLA-4/LC-GS6-VEGFR-IgG1 20.5nM
EGFR/LC-GS6-VEGFR-IgG1 14nM
TNFα/LC-GS6-VEGFR-IgG1 19.5nM
Ang2//LC-GS6-VEGFR-IgG1 13nM
为了确定VEGFR-抗体轻链融合是否适用于基于IgG4的治疗性抗体，诸如抗-PD-1(派姆单抗，例如
Figure BDA0002502291250001644
或纳武单抗，例如
Figure BDA0002502291250001643
)和抗-IL-17A(伊克珠单抗，例如
Figure BDA0002502291250001642
)，将基于IgG4的单克隆抗体与Flt1d2-Flk1d3在轻链的C-末端处融合(亲本抗体和构建体名称，参见实施例1)。由表6可以看出，mPD-1/LC-GS6-VEGFR-IgG4、bPD-1/LC-GS6-VEGFR-IgG4和IL-17A/LC-GS6-VEGFR-IgG4均示出与阿柏西普(VEGFR-Fc)相似的与VEGF(VEGF121)的结合亲和力。mPD-1/LC-GS6-VEGFR-IgG4和bPD-1/LC-GS6-VEGFR-IgG4分别示出与其亲本全长抗体派姆单抗和纳武单抗相似的与PD-1的结合亲和力。IL-17A/LC-GS6-VEGFR-IgG4示出与其亲本全长抗体伊克珠单抗相似的IL-17A结合亲和力。
表6：VEGFR-抗体轻链融合蛋白与VEGF、PD-1和IL-17A的结合亲和力
Figure BDA0002502291250001651
有时治疗性IgG在Fc区内突变以降低Fc效应子功能，例如ADCC。例如，抗-PD-L1抗体阿特珠单抗(例如，
Figure BDA0002502291250001652
)在N-糖基化位点(N219A)处突变以产生去糖基化的IgG1，然而抗-PD-L1抗体德瓦鲁单抗(例如IIMFINZITM)的三个氨基酸(E233A、E234A和F289A)突变以最小化Fc效应子功能。为了测试这些IgG突变是否影响VEGFR-抗体轻链融合蛋白的结合，将Flt1d2-Flk1d3与阿特珠单抗的轻链的C-末端融合(tPD-L1/LC-GS6-VEGFR-nIgG1)或与德瓦鲁单抗的轻链的C-末端融合(aPD-L1/LC-GS6-VEGFR-mIgG1)。由表7可以看出，Fc区中的突变不影响VEGFR-抗-PD-L1抗体轻链融合蛋白与VEGF(VEGF121)或PD-L1的结合(与VEGFR-Fc和对应的亲本抗-PD-L1抗体相比)。
表7：VEGFR-抗体轻链融合蛋白与VEGF和PD-L1的结合亲和力
构建体名称 VEGF121(EC<sub>50</sub>) PD-L1(EC<sub>50</sub>)
阿柏西普(VEGFR-Fc) 21.4nM 未检测到
阿特珠单抗 未检测到 1.9nM
tPD-L1/LC-GS6-VEGFR-nIgG1 26.5nM 2nM
德瓦鲁单抗 未检测到 3.7nM
aPD-L1/LC-GS6-VEGFR-mIgG1 34.5nM 7.5nM
ADCC测试
接下来检查VEGFR-抗体轻链融合蛋白是否表现出与它们的亲本全长抗体相似的Fc效应子功能，例如ADCC。将SKBR3人乳腺癌细胞系(Her2阳性)用作靶细胞，使其显色以携带萤光素酶报告基因。使用CD16+NK92细胞用作效应细胞。将NK92细胞(～6,000个细胞)和SKBR3细胞(～2,000个细胞；包含荧光素酶报告基因)的50μl混合物置于V型96孔板的每个孔中。可将混合物离心以允许形成3D肿瘤(乳腺癌)。然后将含有不同浓度的VEGFR-抗体轻链融合蛋白或对照(阿柏西普或
Figure BDA0002502291250001661
)的50μl培养基添加到每个孔中并且在室温下温育24小时。然后每个孔的荧光素酶活性(OD)使用酶标仪测量。将不添加抗体或VEGFR-Fc的细胞混合物的荧光素酶活性用作对照(100％细胞活力)。计算EC50(表示ADCC活性)。由表8可以看出，我们的测定法中赫赛汀的EC50(8.6nM)比其他研究中记录的那些(373.9nM)小10倍，从而指示我们的ADCC测试的高灵敏度。所有VEGFR-抗-HER2轻链融合蛋白均保留了与亲本
Figure BDA0002502291250001662
抗体相似的ADCC活性(表8)。
表8：VEGFR-抗体轻链融合蛋白在SKBR3细胞上的ADCC活性
构建体名称 Her2(EC<sub>50</sub>)
赫塞汀(Herceptin)(抗-Her2抗体) 8.6nM
阿柏西普(VEGFR-Fc) 未检测到
Her2/LC-GS3-VEGFR-IgG 16nM
Her2/LC-GS6-VEGFR-IgG 12nM
Her2/LC-VEGFR-IgG 15nM
总而言之，以上实施例展示出VEGFR组分可与IgG的轻链的C-末端融合，这可保留与VEGF和由亲本IgG识别的抗原的高结合亲和力。
序列表
SEQ ID NO：1(接头氨基酸序列，n为至少一的整数)
(G)n
SEQ ID NO：2(接头氨基酸序列，n为至少一的整数)
(GS)n
SEQ ID NO：3(接头氨基酸序列，n为至少一的整数)
(GSGGS)n
SEQ ID NO：4(接头氨基酸序列，n为至少一的整数)
(GGGGS)n
SEQ ID NO：5(接头氨基酸序列，n为至少一的整数)
(GGGS)n
SEQ ID NO:6(GS3接头氨基酸序列)
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:7(GS6接头氨基酸序列)
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:8(VEGFR组分氨基酸序列)
TGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKPPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWFEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
SEQ ID NO:9(伊匹单抗(抗-CTLA-4)重链氨基酸序列)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:10(伊匹单抗(抗-CTLA-4)轻链氨基酸序列)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLTYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:11(CTLA-4/LC-GS6-VEGFR；伊匹单抗(抗-CTLA-4)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTTSRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPD GKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTE LNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTOSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDOGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HEK
SEQ ID NO:12(派姆单抗(抗-PD-1)重链氨基酸序列)
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQRREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:13(派姆单抗(抗-PD-1)轻链氨基酸序列)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:14(mPD1/LC-GS6-VEGFR；派姆单抗(抗-PD-1)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTL IPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTA RTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTF VRVHEK
SEQ ID NO:15(纳武单抗(抗-PD-1)重链氨基酸序列)
QVQLVESGGGWQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQRREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：16(纳武单抗(抗-PD-1)轻链氨基酸序列)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:17(bPD1/LC-GS6-VEGFR；纳武单抗(抗-PD-1)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDG KRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTEL NVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVH EK
SEQ ID NO:18(阿特朱单抗(抗-PD-L1)重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNWSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:19(阿特朱单抗(抗-PD-L1)轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:20(tPD-L1/LC-GS6-VEGFR；阿特朱单抗(抗-PD-L1)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDG KRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGILSVGEKLVLNCTARTELN VGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDOGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHE K
SEQ ID NO:21(德瓦鲁单抗(抗-PD-L1)重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:22(德瓦鲁单抗(抗-PD-L1)轻链氨基酸序列)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:23(aPDL1/LC-GS6-VEGFR；德瓦鲁单抗(抗-PD-L1)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPD GKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTE LNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRV HRK
SEQ ID NO:24(曲妥珠单抗(抗-HER2)重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:25(曲妥珠单抗(抗-HER2)轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:26(Her2/LC-GS6-VEGFR；曲妥珠单抗(抗-HER2)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDG KRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTEL NVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDOGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVH EK
SEQ ID NO:27(Her2/LC-GS3-VEGFR；曲妥珠单抗(抗-HER2)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISN ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKH QHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
SEQ ID NO:28(Her2/LC-VEGFR；曲妥珠单抗(抗-HER2)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTTGSDTGRP FVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATV NGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLK TQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK
SEQ ID NO；29(西妥昔单抗(抗-EGFR)重链氨基酸序列)
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:30(西妥昔单抗(抗-EGFR)轻链氨基酸序列)
DILLTQSPVTLSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:31(EGFR/LC-GS6-VEGFR；西妥昔单抗(抗-EGFR)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDG KRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTEL NVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVH EK
SEQ ID NO:32(阿达木单抗(抗-TNFα)重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:33(阿达木单抗(抗-TNFα)轻链氨基酸序列)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:34(TNFα/LC-GS6-VEGFR；阿达木单抗(抗-TNFα)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTL IPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCT ARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDOGLYTCAASSGLMTKKNS TFVRVHE-K
SEQ ID NO：35(尼伐单抗(抗-Ang2)重链氨基酸序列)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDIHWVRQATGKGLEWVSAIGPAGDTYYPGSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARGLITFGGLIAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：36(尼伐单抗(抗-Ang2)轻链氨基酸序列)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYDNSQTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:37(Ang2/LC-GS6-VEGFR；尼伐单抗(抗-Ang2)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYDNSQTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDG KRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTEL NVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVH EK
SEQ ID NO：38(伊克珠单抗(抗-IL-17A)重链氨基酸序列)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEWMGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO：39(伊克珠单抗(抗-IL-17A)轻链氨基酸序列)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:40(IL17α/LC-GS6-VEGFR；伊克珠单抗(抗-IL-17A)轻链融合多肽氨基酸序列；接头为粗体，VEGFR组分具有下划线)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSTGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDT LIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCT ARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVLSPVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDOGLYTCAASSGLMTKKNST FVRVHEK
SEQ ID NO：41(信号肽氨基酸序列)
MEFGLSWLFLVAILKGVQC
SEQ ID NO：42(信号肽氨基酸序列)
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC
SEQ ID NO：43(信号肽氨基酸序列)
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQ ID NO：44(接头氨基酸序列，n为至少一的整数)
(GSTSGSGKPGSGEGS)n
序列表
<110> 免疫苏醒公司
<120> VEGFR-抗体轻链融合蛋白
<130> PD00973A
<140>PCT/US2018/055512
<141> 2018-10-11
<150>US62/571,773
<151>2017-10-12
<160> 44
<170> 用于Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> 1
<223> 可存在于至少一个重复序列中
<400> 1
Gly
1
<210> 2
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(2)
<223> 可存在于至少一个重复序列中
<400> 2
Gly Ser
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(5)
<223> 可存在于至少一个重复序列中
<400> 3
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(5)
<223> 可存在于至少一个重复序列中
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(4)
<223> 可存在于至少一个重复序列中
<400> 5
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 8
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile
1 5 10 15
Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys
20 25 30
Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu
35 40 45
Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys
50 55 60
Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr
65 70 75 80
Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr
85 90 95
His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His
100 105 110
Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala
115 120 125
Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser
130 135 140
Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu Ser Pro Val Asn Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val
195 200 205
His Glu Lys
210
<210> 9
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 10
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val
245 250 255
Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
260 265 270
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr
275 280 285
Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile
290 295 300
Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
305 310 315 320
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
325 330 335
Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val
340 345 350
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
355 360 365
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
370 375 380
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu
385 390 395 400
Ser Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys
405 410 415
Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln
420 425 430
Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn
435 440 445
Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455
<210> 12
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 14
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg
245 250 255
Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr
260 265 270
Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile
275 280 285
Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly
290 295 300
Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala
305 310 315 320
Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly
325 330 335
His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile
340 345 350
Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly
355 360 365
Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly
370 375 380
Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys
385 390 395 400
Leu Val Leu Ser Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser
405 410 415
Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg
420 425 430
Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr
435 440 445
Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455 460
<210> 15
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Arg
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 16
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 17
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu
245 250 255
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
260 265 270
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
275 280 285
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
290 295 300
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
305 310 315 320
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
325 330 335
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val
340 345 350
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
355 360 365
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
370 375 380
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu Ser
385 390 395 400
Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys
405 410 415
Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly
420 425 430
Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser
435 440 445
Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455
<210> 18
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 20
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu
245 250 255
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
260 265 270
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
275 280 285
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
290 295 300
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
305 310 315 320
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
325 330 335
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val
340 345 350
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
355 360 365
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
370 375 380
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu Ser
385 390 395 400
Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys
405 410 415
Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly
420 425 430
Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser
435 440 445
Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455
<210> 21
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
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385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 22
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 23
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val
245 250 255
Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
260 265 270
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr
275 280 285
Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile
290 295 300
Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
305 310 315 320
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
325 330 335
Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val
340 345 350
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
355 360 365
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
370 375 380
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu
385 390 395 400
Ser Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys
405 410 415
Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln
420 425 430
Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn
435 440 445
Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455
<210> 24
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu
245 250 255
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
260 265 270
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
275 280 285
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
290 295 300
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
305 310 315 320
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
325 330 335
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val
340 345 350
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
355 360 365
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
370 375 380
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu Ser
385 390 395 400
Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys
405 410 415
Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly
420 425 430
Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser
435 440 445
Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455
<210> 27
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val
225 230 235 240
Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg
245 250 255
Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr
260 265 270
Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile
275 280 285
Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys
290 295 300
Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr
305 310 315 320
Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val
325 330 335
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
355 360 365
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu
370 375 380
Ser Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys
385 390 395 400
Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln
405 410 415
Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn
420 425 430
Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
435 440
<210> 28
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe
210 215 220
Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly
225 230 235 240
Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val
245 250 255
Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg
260 265 270
Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr
275 280 285
Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu
290 295 300
Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp
305 310 315 320
Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys
325 330 335
Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp
340 345 350
Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val
355 360 365
Leu Ser Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met
370 375 380
Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp
385 390 395 400
Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys
405 410 415
Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
420 425
<210> 29
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu
245 250 255
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
260 265 270
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
275 280 285
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
290 295 300
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
305 310 315 320
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
325 330 335
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val
340 345 350
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
355 360 365
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
370 375 380
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu Ser
385 390 395 400
Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys
405 410 415
Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly
420 425 430
Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser
435 440 445
Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455
<210> 32
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 33
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 34
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu
245 250 255
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
260 265 270
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
275 280 285
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
290 295 300
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
305 310 315 320
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
325 330 335
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val
340 345 350
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
355 360 365
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
370 375 380
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu Ser
385 390 395 400
Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys
405 410 415
Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly
420 425 430
Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser
435 440 445
Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455
<210> 35
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Leu Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Ala Pro Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Ser Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 37
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Ser Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu
245 250 255
Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu
260 265 270
Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu
275 280 285
Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile
290 295 300
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu
305 310 315 320
Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys
325 330 335
Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val
340 345 350
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
355 360 365
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
370 375 380
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Leu Ser
385 390 395 400
Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys
405 410 415
Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly
420 425 430
Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser
435 440 445
Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455
<210> 38
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Met Tyr Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Tyr Phe Thr Gly Thr Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 39
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 40
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Arg Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ile Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gly Ser Asp Thr Gly
245 250 255
Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met
260 265 270
Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn
275 280 285
Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp
290 295 300
Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn
305 310 315 320
Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn
325 330 335
Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr
340 345 350
Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val
355 360 365
Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val
370 375 380
Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys
385 390 395 400
Lys Leu Val Leu Ser Pro Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
405 410 415
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
420 425 430
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
435 440 445
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
450 455 460
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 42
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
20
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(15)
<223> 可存在于至少一个重复序列中
<400> 44
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
1 5 10 15

Claims (40)

1.一种抗体融合蛋白，其包含1)包含轻链的抗体，和2)血管内皮生长因子受体(VEGFR)组分，其中所述VEGFR组分与所述抗体轻链的C-末端融合。
2.根据权利要求1所述的抗体融合蛋白，其包含与第一抗体轻链的C-末端融合的第一VEGFR组分，以及与第二抗体轻链的C-末端融合的第二VEGFR组分。
3.根据权利要求2所述的抗体融合蛋白，其中所述第一VEGFR组分和所述第二VEGFR组分相同。
4.根据权利要求2所述的抗体融合蛋白，其中所述第一VEGFR组分和所述第二VEGFR组分不同。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分包含第一VEGFR Flt1的免疫球蛋白样(Ig-样)结构域2(Flt1d2)。
6.根据权利要求5所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分还包含第二VEGFR Flk1的Ig-样结构域3(Flk1d3)。
7.根据权利要求6所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述VEGFR组分和所述抗体轻链的C-末端通过接头连接。
9.根据权利要求8所述的抗体融合蛋白，其中所述接头包含SEQ ID NO：6或7的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包含轻链恒定结构域(CL结构域)，并且所述VEGFR组分与所述抗体CL结构域的C-末端融合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体为全长抗体。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体特异性识别免疫检查点分子。
13.根据权利要求12所述的抗体融合蛋白，其中所述免疫检查点分子为PD-1。
14.根据权利要求13所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链的重链-CDR1(HC-CDR1)、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链的轻链-CDR1(LC-CDR1)、LC-CDR2和LC-CDR3。
15.根据权利要求13所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
16.根据权利要求12所述的抗体融合蛋白，其中所述免疫检查点分子为PD-L1。
17.根据权利要求16所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
18.根据权利要求16所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
19.根据权利要求12所述的抗体融合蛋白，其中所述免疫检查点分子为CTLA-4。
20.根据权利要求19所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
21.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体特异性识别肿瘤抗原。
22.根据权利要求21所述的抗体融合蛋白，其中所述肿瘤抗原为HER2。
23.根据权利要求22所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-
CDR3；和/或包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
24.根据权利要求21所述的抗体融合蛋白，其中所述肿瘤抗原为EGFR(HER1)。
25.根据权利要求24所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
26.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体特异性识别血管生成因子。
27.根据权利要求26所述的抗体融合蛋白，其中所述血管生成因子为促血管生成素-2(Ang2)。
28.根据权利要求27所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
29.根据权利要求26所述的抗体融合蛋白，其中所述血管生成因子为TNFα。
30.根据权利要求29所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
31.根据权利要求26所述的抗体融合蛋白，其中所述血管生成因子为IL-17A。
32.根据权利要求31所述的抗体融合蛋白，其中所述抗体包括：包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；和/或包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。
33.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-32中任一项所述的抗体融合蛋白和药学上可接受的载体。
34.一种治疗患有癌症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求33所述的药物组合物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述癌症为肺癌、肝癌、皮肤癌(例如，黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、***癌、结直肠癌或膀胱癌。
36.一种治疗患有非肿瘤性障碍的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述非肿瘤性障碍与VEGF过表达相关联。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述非肿瘤性障碍选自类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管瘤、移植的角膜组织和其他组织的免疫排斥、慢性炎症或眼部新生血管障碍。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述非肿瘤性障碍为眼部新生血管障碍。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述眼部新生血管障碍为年龄相关性黄斑变性(AMD)或糖尿病性视网膜病。
40.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述药物组合物通过玻璃体内注射施用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023020592A1 (zh) * 2021-08-18 2023-02-23 丹生医药技术(上海)有限公司 一种TGF-β/VEGF双功能抗体融合蛋白
WO2023083243A1 (zh) * 2021-11-11 2023-05-19 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗il-17/vegf双功能融合蛋白及其用途
WO2023087344A1 (zh) * 2021-11-22 2023-05-25 杭州翰思生物医药有限公司 重组抗体及其应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020536967A (ja) 2017-10-12 2020-12-17 イミュノウェイク インコーポレイテッド Ｖｅｇｆｒ−抗体軽鎖融合タンパク質
EP3891182A4 (en) * 2018-12-03 2022-08-17 Immuneonco Biopharmaceuticals (Shanghai) Co., Ltd RECOMBINATION PROTEIN TARGETING PD-L1 AND VEGF
CN114466868A (zh) * 2020-03-20 2022-05-10 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 一种双特异性融合蛋白及其应用
TW202227509A (zh) * 2020-09-15 2022-07-16 日商參天製藥股份有限公司 針對vegf及ang2之雙特異性結合分子
CN114685674B (zh) * 2020-12-29 2023-09-29 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 一种抗体融合蛋白及其应用
JP2024507397A (ja) * 2021-02-27 2024-02-19 エルミネックス バイオサイエンシズ（スーチョウ）リミティド Ｉｌ－６受容体および血管新生因子を標的にする抗体融合タンパク質
CN117083305A (zh) * 2021-03-25 2023-11-17 南京金斯瑞生物科技有限公司 抗体融合蛋白及其用途
CN118159568A (zh) * 2021-10-21 2024-06-07 杭州阿诺生物医药科技有限公司 一种融合多肽及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102134277A (zh) * 2010-01-22 2011-07-27 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 可溶性VEGFR双功能融合受体VEGFR31-Ig、其制备方法及用途
WO2015109898A1 (zh) * 2014-01-24 2015-07-30 上海恒瑞医药有限公司 VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途

Family Cites Families (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US4968603A (en) 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0463151B1 (en) 1990-01-12 1996-06-12 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
EP0861893A3 (en) 1991-09-19 1999-11-10 Genentech, Inc. High level expression of immunoglobulin polypeptides
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
DK0669836T3 (da) 1992-11-13 1996-10-14 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimære og radioaktivt mærkede antistoffer og humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantigen til behandling af B-cellelymfom
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5730977A (en) 1995-08-21 1998-03-24 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Anti-VEGF human monoclonal antibody
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1997038123A1 (en) 1996-04-05 1997-10-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
ATE419009T1 (de) 1997-10-31 2009-01-15 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
JP4460155B2 (ja) 1997-12-05 2010-05-12 ザ・スクリプス・リサーチ・インステイチユート マウス抗体のヒト化
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2532910T3 (es) 1998-04-02 2015-04-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y fragmentos de los mismos
DK2180007T4 (da) 1998-04-20 2017-11-27 Roche Glycart Ag Glycosyleringsteknik for antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellecytotoxicitet
EP1348715A3 (en) 1998-04-21 2003-11-19 Micromet AG CD19xCD3 specific polypeptides and uses thereof
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101077001B1 (ko) 1999-01-15 2011-10-26 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US7306799B2 (en) 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
EP1272647B1 (en) 2000-04-11 2014-11-12 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
EP2314686B2 (en) 2000-10-06 2023-06-21 Kyowa Kirin Co., Ltd. Cells producing antibody compositions
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
WO2003084569A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition anticorps
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
CA2481657A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
US7749753B2 (en) 2002-04-09 2010-07-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Cells in which activity of the protein involved in transportation of GDP-fucose is reduced or lost
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP1572744B1 (en) 2002-12-16 2010-06-09 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
US7758859B2 (en) 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
BRPI0413977A (pt) 2003-08-27 2006-11-07 Osi Eyetech Inc método para suprimir um distúrbio neovascular, e para tratar um paciente diagnosticado com ou em risco de desenvolver um distúrbio neovascular, composição farmacêutica, e, embalagem farmacêutica
US20050059639A1 (en) 2003-09-11 2005-03-17 Wei Edward T. Ophthalmic compositions and method for treating eye discomfort and pain
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
ME01775B (me) 2003-11-05 2011-02-28 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antitijela sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
ES2579805T3 (es) 2004-09-23 2016-08-16 Genentech, Inc. Anticuerpos y conjugados modificados por ingeniería genética con cisteína
US7973140B2 (en) 2004-12-21 2011-07-05 Medimmune Limited Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
US8168584B2 (en) 2005-10-08 2012-05-01 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating age-related macular degeneration by compstatin and analogs thereof
WO2007048022A2 (en) 2005-10-21 2007-04-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibody-polypeptide fusion proteins and methods for producing and using same
PL1968594T3 (pl) 2005-11-29 2011-03-31 Glaxosmithkline Llc Leczenie zaburzeń neowaskularyzacyjnych oka, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej, rozszerzenie naczyń siatkówki w zespole Hippla i Lindaua, zapalenie błony naczyniowej oka i obrzęk plamki
AU2007227292B2 (en) 2006-03-17 2012-04-12 Biogen Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2009015345A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
CN101575379B (zh) 2008-05-09 2012-05-30 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途
WO2010148321A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Wyeth Llc Slow dissolution method for reconstitution of lyophilized material
MX2013005847A (es) 2010-11-24 2013-12-12 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigeno multiespecificas que eligen como blanco a hgf.
KR101397088B1 (ko) * 2011-06-10 2014-05-19 강원대학교산학협력단 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물
ES2758884T3 (es) * 2011-06-24 2020-05-06 Stephen D Gillies Proteínas de fusión de inmunoglobulina a través de cadena ligera y métodos de uso de ellas
WO2013181087A2 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multimeric complexes with improved in vivo stability, pharmacokinetics and efficacy
EP4029937A1 (en) 2012-10-04 2022-07-20 Research Development Foundation Serine protease molecules and therapies
BR112015023752B1 (pt) 2013-03-15 2023-11-14 Zyngenia, Inc. Domínio de reconhecimento modular (mrd), complexo compreendendo mrd e cetuximabe, usos do complexo para inibir a angiogênese e tratar câncer e composição farmacêutica compreendendo o dito complexo
US9828422B2 (en) 2013-07-29 2017-11-28 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti-Ang2 antibody
CN104341504B (zh) * 2013-08-06 2017-10-24 百奥泰生物科技(广州)有限公司 双特异性抗体
CN104974262B (zh) 2014-04-04 2019-08-09 华博生物医药技术（上海）有限公司 重组双功能融合蛋白及其制法和用途
AU2015303135B2 (en) * 2014-08-15 2021-05-20 Merck Patent Gmbh SIRP-alpha immunoglobulin fusion proteins
BR112017027567A2 (pt) 2015-06-28 2018-09-04 Allgenesis Biotherapeutics Inc. proteínas de fusão para inibir a angiogênese
CN109069638B (zh) 2016-03-24 2022-03-29 璟尚生物制药公司 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
JP2020536967A (ja) 2017-10-12 2020-12-17 イミュノウェイク インコーポレイテッド Ｖｅｇｆｒ−抗体軽鎖融合タンパク質

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102134277A (zh) * 2010-01-22 2011-07-27 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 可溶性VEGFR双功能融合受体VEGFR31-Ig、其制备方法及用途
WO2015109898A1 (zh) * 2014-01-24 2015-07-30 上海恒瑞医药有限公司 VEGF与PDGFRβ双特异性融合蛋白及其用途

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023020592A1 (zh) * 2021-08-18 2023-02-23 丹生医药技术(上海)有限公司 一种TGF-β/VEGF双功能抗体融合蛋白
WO2023083243A1 (zh) * 2021-11-11 2023-05-19 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抗il-17/vegf双功能融合蛋白及其用途
WO2023087344A1 (zh) * 2021-11-22 2023-05-25 杭州翰思生物医药有限公司 重组抗体及其应用

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