NO335429B1 - Farmasøytisk preparat omfattende RNA, anvendelse derav for fremstilling av et medikament, et sett derav for inhibering av genekspresjon og invitro-fremgangsmåter inhibering av genekspresjon. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse gjelder spesifikk inhibering av genekspresjon i pattedyr ved å bringe målgenet i forbindelse med et dobbelttrådet RNA (dsRNA).

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder inhibering av genekspresjon. Nærmere bestemt gjelder den inhibering av genekspresjon i pattedyr ved anvendelse av dobbelttrådet RNA (dsRNA).

Fordelene ved å kunne inhibere ekspresjonen av et spesifikt gen eller en gruppe av gener i pattedyr er åpenbare. Mange sykdommer (for eksempel kreft, endokrine forstyrrelser, immunforstyrrelser osv.) oppstår grunnet unormal ekspresjon av et gitt gen eller en gruppe av gener i et pattedyr - inhibering av genet, eller gruppen, kan derfor anvendes for å behandle disse tilstandene. På tilsvarende måte kan sykdom oppstå grunnet ekspresjon av en mutant form av et protein, og her vil det være fordelaktig å kunne eliminere ekspresjonen av det mutante allel. I tillegg kan slik genspesifikk inhibering anvendes for behandling av virussykdommer som for eksempel skyldes retrovirus som HIV, hvor virale gener integreres i vertsgenomet og uttrykkes.

I tillegg kan eliminering eller inhibering av ekspresjonen av et gitt gen anvendes for å undersøke og manipulere tidlige begivenheter i ikke-human embryoutviklingen. Den mest verdifulle informasjon vil erholdes dersom funksjonen til genet av interesse kan forstyrres i spesifikke embryoceller og på definerte tidspunkt. I en slik situasjon kan de klassiske gen-"utslåings"-teknikker ikke benyttes i musemodellen, siden disse eliminerer genfunksjonen universelt i hele embryoet. Dersom et gen anvendes flere ganger i rom og tid for styring av utviklingsprosesser, vil videre eliminering av genets rolle ved konvensjonell gen-"utslåing" hindre forståelse av annet enn den første begivenhet. Selv om man er interessert i å studere det absolutt første tidspunkt under utviklingen hvor et gen fungerer, kan bidraget av maternale transkripter og disses translasjonsprodukter maskere virkningene av genutslåingen. Eksisterende "knockouf-teknologi er også ekstremt arbeidskrevende. Den nødvendiggjør først å fremstille et avbrutt gensegment som er merket på egnet måte for å tillate seleksjon av homologe rekombinasjonsbegivenheter i dyrkede embryonale stamceller. Slike celler må så inkorporeres i blastocyster og de resulterende, kimære dyr anvendes for å etablere rene avlslinjer før homozygote mutanter kan erholdes.

Det er kjent at ekspresjonen av gener kan inhiberes spesifikt med dobbelttrådet RNA i visse organismer. Dobbelttrådet RNA-interferens (RNAi) av genekspresjonen ble først vist i Caenorhabditis elegans (Fire et al. Nature 391, 806-811 (1998); W099/32619), og har nylig blitt vist å være effektiv i lavere eukaryoter, innbefattet Drosiphila melanogaster (Kennerdell. & Carthew, Cell 95, 1017-1026 (1998)), Trypanosoma brucei (Ngo, et al. Proe Nati Acad Sei USA 95, 14687-14692 (1998)), planarianer (Sanchez Alvarado & Newmark, Proe Nati Acad Sei USA 96, 5049-5054 (1999)) og planter (Waterhouse, et al. Proe Nati Acad Sei USA 95, 13959-13964 (1998)). Anvendelse av denne tilnærming har også blitt benyttet i sebrafiskembryoer, men med begrenset suksess (Wargelius, et al. Biochem Biophys Res Commun 263, 156-161 (1999)).

WO 99/49029 Al omhandler en metode for a modulere genekspresjon i et vev, organ eller celle ved a introdusere nukleinsyremolekyler omfattende flere kopier av en nukleinsyresekvens, i samme eller motsatt orientering, som er hovedsaklig identisk med malsekvensen. Med flere kopier menes her to eller flere i en orientering som muliggjør dannelse av sekundærstruktur. Videre beskrives flere ulike ekspresjonskonstrukter for bruk i metoden og viser at metoden kan brukes i ulike celletyper, deriblant embryonale stamceller, eksemplene omfatter bade planter og mammalske celler. Et preparat som omfatter to separate, komplementære RNA-tråder er ikke omtalt

Til nå har det ikke blitt rapportert at RNAi kan anvendes i pattedyr, og videre tror man innen faget at RNAi ikke vil fungere hos pattedyr. I denne sammenheng har det blitt uttrykt bekymring for at fremgangsmåtene som anvendes for invertebratsystemer og plantesystemer sannsynligvis ikke vil være effektive i pattedyr (se oversikt av Fire (Fire Trends Genet 15, 358-363 (1999)). Dette skyldes at akkumulering av (dsRNA) i pattedyrceller kan føre til en generell blokkering av proteinsyntesen. Akkumulering av svært små mengder dobbelttrådet RNA (dsRNA) i pattedyrceller etter virusinfeksjon fører til interferonresponsen (Marcus, Interferon 5, 115-180 (1983)), som fører til en generell blokkering av translasjonen og påbegynnelse av apoptose (Lee & Esteban Virology 199, 491-496 (1994)). En del av interferonresponsen er aktivering av en dsRNA-responderende proteinkinase (PKR) (Clemens, Int J Biochem Cell Biol 29, 945-949 (1997)). Dette enzym fosforylerer og inaktiverer translasjonsfaktor EIF2a som respons på dsRNA. Følgen av dette er en global undertrykkelse av translasjonen, som i sin tur utløser apoptose. Wagner & Sun (Nature 391, 806-811 (1998)) foreslår at RNAi ikke vil fungere hos pattedyr, siden det ikke har noen virkning når det anvendes som kontroll i eksperimenter med "antisens"-RNA.

"Antisens"-RNA har blitt forsøkt brukt for reduksjon av genekspresjonen i embryoer fra en rekke arter. Mens denne tilnærming hadde betydelig suksess i Drosophila, har den vært skuffende i sebrafisk, Xenopus og museembryoer. I Xenopus forelå noen begrensninger for anvendelse av "antisens"-tilnærmingen. Dette antas å skyldes en fremtredende RNA-smeltende aktivitet (Bass, & Weintraub, Cell 48, 599-605 (1987)), utøvd av den dsRNA-spesifikke adenosin deaminase (dsRAD), og tyder på at RNAi sannsynligvis ikke vil kunne anvendes med hell.

I museembryoet har "antisens" RNA hatt springende og begrenset suksess for reduksjon av genekspresjon, særlig mellom tocellestadiet og firecellestadiet (Bevilacqua, et al. Proe Nati Acad Sei USA 85, 831-835 (1988)). Disse forfattere var bekymret for at den delvise inhibering av p- glucuronidase i deres eksperimenter også kunne reflektere en smeltingsaktivitet som virket på "sens"/"antisens"-duplekser, og de undersøkte derfor stabiliteten av Ø- glucuronidase- dsRtiA mikroinjisert i museblastomerer. De rapporterte ingen virkninger på RNA-stabilitet, men denne ble bare fulgt over et tidsrom på 5 timer. Det foreligger således ingen antydninger i denne artikkel om at dsRNA kan vedvare i pattedyrceller tilstrekkelig lenge til å interferere med genekspresjon. I tillegg rapporterte de ingen virkninger på ekspresjonen av p- glucuronidase etter injeksjon av dsRNA. Denne artikkel foreslår derfor ikke at dsRNA kan inhibere genekspresjon i pattedyrceller.

W099/32619 forslår at dsRNA kan anvendes for inhibering av genekspresjon i pattedyr. Det eneste eksperimentelle bevis i dette dokument viser imidlertid at RNAi fungerer i C. elegans, det foreligger ingenting som viser at det kunne fungere i pattedyr. Faktisk har senere publikasjoner av oppfinnerne angitt for W099/32619 (Fire, Trends Genet 15, 358-363 (1999); (Montgomery & Fire, Trends Genet 14, 255-258 (1998)) uttalt at RNAi kun kan fås til å fungere i pattedyr dersom PKR-responsen kan nøytraliseres eller på én eller annen måte unngås, selv om ingen forslag gis i W099/32619 for hvordan dette kunne oppnås. Disse senere publikasjoner antyder at oppfinnerne av W099/32619 ikke selv tror at man har fått RNAi til å fungere i pattedyr, og at de heller ikke tror det er mulig.

Det foreligger således en oppfatning innen faget om at RNAi ikke kan fås til å fungere i pattedyr. I motsetning til denne antagelse har oppfinnerne nå vist at det er mulig å interferere med spesifikk genekspresjon i museoocyttet og musezygoten etter mikroinjeksjon av et egnet dsRNA. De har vist eksperimentelt at RNAI kan fenokopiere virkningene av å forstyrre den maternale ekspresjon av c-mos-genet i oocytten for å overvinne meiosestansen ved metafase II, eller den zygotiske ekspresjon av E-cadherin for å forhindre utvikling av blastocysten, som observert i de tilsvarende "knockout"-mus. Oppfinnerne har vist at injeksjonen av et dsRNA er spesifikt for det tilsvarende gel, det gir ingen generell translasjonsstans, siden embryoer fortsetter å utvikle seg og ingen tegn på celledød kan observeres. Oppfinnerne har således vist at RNAi kan være effektivt i pattedyrceller.

I følge et første aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det omfatter RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur hvor nukleotidsekvensen av den dobbelttrådete strukturen er minst 90%, 95% eller 100% identisk med i det minste en del av et målgen i en pattedyrcelle eller er i stand til å hybridisere med en del av målgen-transkriptet under følgende betingelser; 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 MM EDTA, hybridisering ved 50°C eller 70°C i 12-16 timer, etterfulgt av vasking, og som er avledet fra et endogent templat, hvori nevnte RNA omfatter to separate komplementære RNA-tråder, og hvori nevnte dobbelttrådete struktur har en lengde på minst 25 baser; sammen med en farmasøytisk akseptabelt bærer,

hvor det angjeldende RNA ikke er avledet fra genet som koder for p-glucuronidase og hvor pattedyrcellen er en somatisk celle, en ikke-human oocytt eller en embryonisk stamcelle fra et ikke-humant pre-implantasjon embryo.

Ifølge en annen side ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en in-vitro fremgangsmåte for å inhibere ekspresjonen av et målgen i en pattedyrcelle som omfatter: innføring i cellen av et RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur med en nukleotidsekvens som er minst 80 % identisk med i det minste en del av målgenet og som er avledet fra et endogent templat, og

bekreftelse av inhibering av ekspresjonen av målgenet.

dsRNA som er anvendbart ifølge oppfinnelsen er avledet fra et "endogent templat". Et slikt templat kan være hele eller en del av en nukleotidsekvens som er endogen for pattedyret, det kan være en DNA-gensekvens eller et cDNA dannet fra et mRNA isolert fra pattedyret, for eksempel ved revers transkriptase. Dersom templatet er hele eller en del av en DNA-gensekvens foretrekkes det at den er fra en, flere eller alle exoner i genet. I tillegg kan hele eller en del av et virusgen danne et endogent templat dersom det uttrykkes i pattedyret på en slik måte at interferonresponsen ikke induseres, for eksempel ekspresjon fra et provirus integrert i vertscellekromosomet. Således skiller dsRNA ifølge foreliggende oppfinnelse seg fra viralt dsRNA og syntetisk polyrIC, som begge har blitt vist å indusere PKR som fører til apoptose i pattedyrceller.

Mens dsRNA er avledet fra et endogent templat, foreligger det ingen begrensninger når det gjelder måten det syntetiseres på. Det kan således syntetiseres in vitro eller in vivo ved anvendelse av manuelle og/eller automatiserte fremgangsmåter. In wtro-syntese kan være kjemisk eller enzymatisk, for eksempel ved anvendelse av klonet RNA polymerase (f.eks. T, 17, SP6) for transkripsjon av det endogene DNA (eller cDNA)-templat eller en blanding av begge.

In vivo kan dsRNA syntetiseres ved anvendelse av rekombinante teknikker som er velkjente innen faget (se f.eks. Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. utgave (1989); DNA CLONING, bind I og II (D. N Glover red. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait red, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDISATION (B.D. Hames & S.J. Higgins red. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B.D. Hames & SJ. Higgins red. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney red. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); serien, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller og M.P. Calos red. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology bind 154 og bind 155 (Wu og Grossmann, hhv. red.), Mayer og Walker, red. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, 2. utgave (Springer-Verlag, N.Y.) og HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, bind I-IV (D.M. Weir og CC. Blackwell red. 1986).

Således kan bakterieceller transformeres med en ekspresjonsvektor som omfatter DNA-templatet som dsRNA skal avledes fra. Alternativt kan cellene til pattedyret hvor inhibering av genekspresjonen er nødvendig transformeres med en ekspresjonsvektor eller ved andre midler. Bireaksjonell transkripsjon av én eller flere kopier av templatet kan skje ved endogen RNA polymerase fra den transformerte celle eller ved en klonet RNA polymerase (for eksempel T3, T7, SP6) som kodes av ekspresjonsvektoren eller en annen ekspresjonsvektor. Anvendelsen og fremstilling av en ekspresjonskonstruksjon er kjent innen faget (se WO98/32016; US patentskrifter nr. 5 593 874, 5 698 425, 5 712 135, 5 789 214 og 5 804 693). Inhibering av genekspresjonen kan styres ved spesifikk transkripsjon i et organ, et vev eller en celletype, av miljøbetingelser (for eksempel injeksjon, stress, temperatur, kjemisk) og/eller styring av transkripsjonen til et visst utviklingsstadium eller en viss alder, særlig dersom dsRNA synetiseres in vivo i pattedyr. dsRNA kan også tilføres spesifikke vev eller celletyper ved anvendelse av kjente gentilførselssystemer. Kjente eukaryote vektorer omfatter pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl og pSG. Tilgjengelige fra Stratagene, og pSVK3, pBPV, pMSG og pSVL, tilgjengelige fra Pharmacia. Disse vektorene opplistes kun som illustrasjoner på de mange kommersielt tilgjengelige og velkjente vektorene som er tilgjengelige for fagfolk.

Dersom det syntetiseres utenfor pattedyrcellen kan RNA renses før innføring i cellen. Rensingen kan skje ved ekstraksjon med et løsemiddel (foreksempel fenol/kloroform) eller et resin, utfelling (for eksempel i etanol), elektroforese, kromatografi eller en kombinasjon av disse. Rensingen kan imidlertid føre til tap av dsRNA, og kan derfor være minimal eller ikke utføres i det hele tatt. RNA kan tørkes for lagring eller løses i en vandig løsning som kan inneholde buffere eller salter for å fremme hybridisering og/eller stabilisering av RNA-trådene.

dsRNA som er anvendbart i foreliggende oppfinnelse omfatter dsRNA som inneholder én eller flere modifiserte baser og dsRNA med en ryggrad som er modifisert for stabilitet eller av andre grunner. Foreksempel kan fosfodiesterbindingene i naturlig RNA modifiseres slik at de omfatter minst et nitrogen- eller svovelheteroatom. Videre kan dsRNA som omfatter uvanlige baser, for eksempel inosin, eller modifiserte baser, for eksempel tritylerte baser, for bare å nevne to eksempler, anvendes i oppfinnelsen. Det vil forstås at et bredt utvalg av modifikasjoner som fyller mange anvendbare formål har blitt innført i RNA og er kjente blant fagfolk. Begrepet dsRNA som det anvendes heri omfatter slike kjemisk, enzymatisk eller metabolsk modifiserte former av dsRNA, forutsatt at det er avledet fra et endogent templat.

Den dobbelttrådede struktur kan dannes av en enkelt selvkomplementær RNA-tråd eller av to atskilte, komplementære RNA-tråder. RNA-dupleksdannnelsen kan initieres enten inne i eller utenfor pattedyrcellen.

dsRNA omfatter en dobbelttrådet struktur hvis sekvens er "i det vesentlige identisk" med i det minste en del av målgenet. "Identitet" er som kjent innen faget slektskapet mellom to eller flere polynukleotid (eller polypeptid)-sekvenser, bestemt ved å sammenligne sekvensene. Innen faget betyr identitet også graden av sekvensslektskap mellom polynukleotidsekvenser, bestemt ved tilpasning mellom strenger av slike sekvenser. Graden av identitet kan lett beregnes. (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., red. Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., red. Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Del I, Griffin, A.M., og Griffin, H.G. red., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; og Sequence Analysis Primer,

Gribskov, M. og Devereux, J., red. M. Stockton Press, New York, 1991). Selv om det foreligger en rekke fremgangsmåter for å bestemme graden av identitet mellom to polynukleotidsekvenser, er begrepet velkjent blant fagfolk. (Sequence Analysis in Molecular Biology von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. og Devereux, J., red. M Stockton Press, New York, 1991; og Carillo, H., og Lipman, D., SIAM J. Applied Match., 48: 1073 (1988). Fremgangsmåter som hyppig anvendes for å bestemme graden av identitet mellom sekvenser omfatter fremgangs-måtene beskrevet i Carillo, H., og Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Foretrukne fremgangsmåter for bestemmelse av grad av identitet er utformet for å gi den høyeste grad av tilpasning mellom de analyserte sekvenser. Fremgangsmåter for bestemmelse av grad av identitet er kodet i datamaskinprogrammer. Datamaskinprogram-fremgangsmåter for bestemmelse av identitet mellom to sekvenser omfatter GCG-programpakken (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, og FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403 (1990)). En annen programvarepakke som er velkjent innen faget for utførelse av denne fremgangsmåten er programmet CLUSTAL. Dette sammenligner sekvensen av to polynukleotider og finner den optimale sammenstilling ved å innsette gap i hver av sekvensene etter behov. Graden av identitet for en optimal sammenstilling kan også beregnes ved å anvende en programvarepakke som BLASTx. Dette programmet sammenstiller det lengste strekket mellom sekvenser som ligner hverandre og tilskriver en verdi til tilpasningen. For enhver sammenligning av mønstre, kan flere områder med likhet finnes, alle med en forskjellig poengsum. En fagmann vil vite at to polynukleotider med forskjellig lengde kan sammenlignes over hele lengden av det lengste fragment. Alternativt kan små områder sammenlignes. Normal sammenlignes mønstre med samme lengde for at en anvendbar sammenligning kan gjøres.

Det foretrekkes at det er 100 % sekvensidentitet mellom det inhibitoriske RNA og målgendelen. Imidlertid kan dsRNA med 70 %, 80 % eller mer enn 90 % eller 95 % sekvensidentitet anvendes i foreliggende oppfinnelse, og således kan sekvensvariasjoner som kan forventes ut fra genetisk mutasjon, stammepolymorfi eller evolusjonær divergens tolereres.

Dupleksområdet i RNA kan ha en nukleotidsekvens som kan hybridisere med en del av målgentranskripet (f.eks. 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50 °C eller 70 °C hybridisering i 12-16 timer, fulgt av vask).

Mens den optimale lengde av dsRNA kan variere ut fra målgen og eksperimentelle betingelser, kan dupleksområdet i RNA være minst 25, 50, 100, 200, 300, 400 eller flere baser langt.

Som anvendt heri betyr "målgen" generelt et polynukleotid som omfatter et område som koder for et polypeptid eller et polynukleotidområde som regulerer replikasjon, transkripsjon, translasjon eller andre prosesser som er viktige for ekspresjon av polypeptidet, eller et polynukleotid som omfatter både et område som koder for et polypeptid og et område operativt koblet til dette som regulerer ekspresjonen. Målgener kan være cellulære gener som foreligger i genomet eller virale og provirale gener som ikke utløser interferonresponsen, for eksempel retrovirale gener. Målgenet kan være et proteinkodende gen eller et ikke-proteinkodende gen, for eksempel et gen som koder for ribosomale RNA'er, spleisosom-RNA, tRNA osv.

Det foretrekkes at dsRNA er i det vesentlige identisk med hele målgenet, dvs. den kodende del av genet. Imidlertid kan dsRNA være i det vesentlige identisk med en del av målgenet. Størrelsen av denne del avhenger av det gitte målgen og kan bestemmes av fagfolk ved å variere størrelsen av dsRNA og observere hvorvidt ekspresjonen av genet har blitt inhibert.

I foreliggende oppfinnelse kan dsRNA anvendes for å inhibere et målgen som forårsaker eller kan forårsake sykdom, dvs. at dette dsRNA kan anvendes for fremstilling av et medikament for behandling eller forebyggelse av sykdom. Ved forebyggelse av sykdom kan målgenet være et gen som er nødvendig for initiering eller opprettholdelse av sykdommen, eller et gen som har blitt vist å være forbundet med høyere fare for å få sykdommen.

Ved behandling av sykdom kan dsRNA bringes i forbindelse med cellene eller vevet som fremviser sykdommen. For eksempel kan dsRNA som er i det vesentlige identisk med hele eller en del av et mutert gen forbundet med kreft eller et gen som uttrykkes i høyt nivå i tumorceller, for eksempel aurorakinase, bringes i forbindelse med eller innføres i en kreftcelle eller et tumorgen. Eksempler på cancere, hvor et medikament etter foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å forebygge eller behandle, omfatter faste tumorer og leukemier, innbefattet apudom, koristom, brankiom, ondartet karsinoidsyndrom, karsinoid hjertesykdom, karsinom (f.eks. Walkers karsinom, basalcellekarsinom, basoskvamøst karsinom, Brown-Pearce karsinom, Ehrilich-tumor, in s/tu-karsinom, Krebs 2-karsinom, Merkel-cellekarsinom, musinøst karsinom, "non-small ceN"-lungekarsinom, "oat cell"-karsinom, scirruskarsinom, bronkiolært karsinom, bronkogent karsinom, platecellekarsinom og transisjonscelle-karsinom), histiocyttisk forstyrrelse, leukemi (f.eks. B-celleleukemi, blandet celleleukemi, nullcelleleukemi, T-celleleukemi, kronisk T-celleleukemi, HTLV-II-assosiert leukemi, akutt lymfocyttisk leukemi, kronisk, lymfocyttisk leukemi, mastcelleleukemi og myeloid leukemi), ondartet histiocytosis, Hodgkins sykdom, immunoproliferativ small, non-Hodgkin lymfom, plasmacytom, reticuloendoteliose, melanom, chondroblastom, chondrom, chondrosarkom, fibrom, fibrosarkom, kjempecelletumorer, histiocytom, lipom, liposarkom, mesoteliom, myxom, myxosarkom, osteoma, osteosarkom, Ewing sarkom, synoviom, adenofibrom, adenolymfom, karsinosarkom, chordom, cranio-pharyngiom, dysgerminom, hamartom, mesenchymom, mesonefrom, myosarkom, ameloblastom, cementom, odontom, teratom, thymom, trofoblastisk tumor, adenokarsinom, adenom, cholangiom, cholesteatom, cylindrom, cystadenokarsinom, cystadenom, granulosa celletumor, gynandroblastom, hepatom, hidradenom, islet celletumor, Leydig celletumor, papillom, Sertoli-celletumor, theca celletumor, leiomyom, leiomyosarkom, myoblastom, mymom, myosarkom, rhabdomyom, rhabdomyosarkom, ependymom, ganglioneurom, gliom, medulloblastom, meningiom, neurilemmom, neuroblastom, neuroepiteliom, neruofibrom, neurom, paragangliom, paragangliom nonkromaffin, angiokeratom, angiolymfoid hyperplasi med eosinofili, skleroserende angiom, angiomatosis glomangiom, hemangioendoteliom, hemangiopericytom, hemangiosarkom, lymfangiom, lymfangiomyom, lymfangiosarkom, pinealom, karsinosarkom, chondrosarkom, cystosarkom, phyllodes, fibrosarkom, hemangiosarkom, leimyosarkom, leukosarkom, liposarkom, lymfangiosarkom, myosarkom, myxosarkom, ovariekarsinom, rhabdomyosarkom, sarkom (f.eks. Ewing-sarkom, eksperimentelt sarkom, Kaposi sarkom og mastcelle sarkom), neoplasier (f.eks. beinneoplasi, brystneoplasi, neoplasi i fordøyelsessystemet, colorektal neoplasi, lever neoplasi, bukspyttkjertel neoplasi, hypfyseneoplasi, testikkelneoplasi, orbitalneoplasi, neoplasi i hodet og hals, neoplasi i sentralnervesystemet, akustisk neoplasi, bekken neoplasi, neoplasi i luftveiene og urogenital neoplasi) neurofibromatose og cervisk dysplasi og andre tilstander hvor celler har blitt immortalisert eller transformert. Oppfinnelsen kan anvendes i kombinasjon med andre behandlingsformer, f.eks. kjemoterapi, kryoterapi, hypertermi, strålebehandling o.l.

Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes vedfremstilling av et medikament for behandling og forebyggelse av andre sykdommer, særlig sykdommer forbundet med ekspresjon eller overekspresjon av et gitt gen eller gitte gener. For eksempel kan ekspresjon av gener forbundet med immunresponsen inhiberes for å behandle/forebygge autoimmune sykdommer som rheumatoid artritt, "graft-versus-host"-sykdom osv. Ved slik behandling kan dsRNA anvendes sammen med immunsuppressive medikamenter. De hyppigst anvendte immunsuppresive medikamenter i dag omfatter kortikosteroider og kraftigere inhibitorer, f.eks. metotreksat, sulfasalazin, hydroksyklorkuin, 6-MP/azatioprin og syklosporin. Alle disse medikamentene har imidlertid alvorlige bivirkninger forbundet med toksisitet, og det er et stort behov for medikamenter som kan føre til redusert anvendelse av disse. Andre immunsuppressive medikamenter omfatter behandling med mildere, men mindre kraftige ikke-steroider, f.eks. aspirin og ibuprofen, og en ny reagensklasse basert på mer spesifikke immunmodulatorfunksjoner. Denne siste klassen omfatter interleukiner, cytokiner, rekombinante adhesjonsmolekyler og monoklonale antistoffer. Anvendelse av dsRNA for å inhiberte et gen forbundet med immunresponsen i en fremgangsmåte for immunsuppressiv behandling kan øke virkningen av immunsuppressjonen, og nærmere bestemt, tillate redusert tilførsel av andre medikamenter som kan ha toksisk virkning eller andre uheldige virkninger.

De påfølgende klasser av mulige målgener er eksempler på genene som foreliggende oppfinnelse kan anvende for å inhibere: utviklingsgener (f.eks. adhesjonsmolekyler, cyklinkinaseinhibitorer, medlemmer av Wnt-familien, medlemmer av Pax-familien, medlemmer av Winged helix-familien, medlemmer av Hox-familien, cytokiner/lymfokiner og disses reseptorer, vekst/differensieringsfaktorer og disses reseptorer, neurotransmittere og disses reseptorer), onkogener (f.eks. ABLI, BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETS1, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TALI, TCL3 og YES), tumorsuppressorgener (f.eks. APC, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF1, NF2, RB1, TP53 OG WT1), og enzymer (f.eks. ACP desaturaser og hydroksylaser, ADP-glykosepyroforylaser, ATPaser, alkoholdehydrogenaser, amylaser, amyloglukosidaser, katalaser, cullulaser, syklooksygenaser, dekarboksylaser, dekstrinaser, DNA og RNA-polymeraser, galaktosidaser, glukanaser, glukoseoksidaser, GTPaser, helikaser, hemicellulaser, integraser, invertaser, isomeraser, kinaser, laktaser, lipaser, lioksygenaser, lysozymer, pektinesteraser, peroksidaser, fosfataser, fosfolipaser, fosforylaser, polygalakturonaser, proteinaser og peptidaser, pullanaser, rekombinaser, reverse transkriptaser, topoisomeraser og xylanaser).

I en foretrukket utførelse av den første side ved oppfinnelsen er dsRNA ikke avledet fra p-glukuronidase. I en annen side tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en in- vitro fremgangsmåte for inhibering av ekspresjonen av et målgen i en pattedyrscelle kjennetegnet ved at den omfatter: innføre i cellen et RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur hvor nukleotidsekvensen av den dobbelttrådete strukturen er minst 90%, 95% eller 100% identisk med i det minste en del av et målgen i en pattedyrcelle eller er i stand til å hybridisere med en del av målgen-transkriptet under følgende betingelser; 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 MM EDTA, hybridisering ved 50°C eller 70°C i 12-16 timer, etterfulgt av vasking, og er avledet fra et endogent templat, hvor hvor det angjeldende RNA ikke er avledet fra genet som koder for p-glucuronidase, og hvor pattedyrcellen er en somatisk celle, en ikke-human oocytt eller en embryonisk stamcelle fra et ikke-humant pre-implantasjon embryo.

Inhibering av ekspresjonen av et målgen kan bekreftes ved å observere eller påvise fravær eller en observerbar reduksjon i nivået av protein som kodes av et målgen (dette kan f.eks. påvises ved hjelp av et spesifikt antistoff eller andre teknikker som er kjente blant fagfolk) og/eller mRNA-produkt fra et målgen (dette kan f.eks. påvises ved hybridiseringsundersøkelser) og/eller fenotype forbundet med ekspresjon av genet. I forbindelse med medisinsk behandling kan bekreftelse av inhibering av ekspresjonen av et målgen oppnås ved å observere en endring i en pasients sykdomstilstand, f.eks. reduserte symptomer, remisjon, en endring i sykdomstilstanden osv. Inhiberingen er fortrinnsvis spesifikk, dvs. at ekspresjonen av målgenet inhiberes uten åpenbare virkninger på andre gener i cellen.

Mengden dsRNA som tilføres til et pattedyr for effektiv geninhibering vil variere innenfor brede grenser avhengig av en rekke faktorer, innbefattet tilførselsvei, pattedyrets alder, størrelse og tilstand, genet som skal inhiberes, sykdommen eller forstyrrelsen som skal behandles osv. De foreliggende oppfinnere har funnet at ved injeksjon av 10 pl i en oocytt eller en celle i det tidlige embryo er løsninger med dsRNA i en konsentrasjon i området fra 0,01 til 40 mg/ml, fortrinnsvis 0,1 til 4 mg/ml og mest foretrukket 0,1 til 2 mg/ml effektive. dsRNA kan således tilføres for å tilveiebringe 0,1 til 400 pg, fortrinnsvis fra 1 til 40 pg, og mest foretrukket fra 1 til 20 pg, i hver celle.

Cellen som har målgenet kan være en kimcelle eller en somatisk celle, totipotent eller pluripotent, en celle som deler seg, eller som ikke deler seg, en epitelcelle, en immortalisert celle eller en transformert celle eller lignende. Cellen kan være en stamcelle eller en differensiert celle. Celletyper som er differensierte omfatter adipocytter, fibroblaster, myocytter, kardiomyocytter, endotelceller, neuroner, gliaceller, blodceller, megakaryocytter, lymfocytter, makrofager, neutrofile celler, eosinofile celler, basofile celler, mastceller, leukocytter, granulocytter, keratinocytter, kondrocytter, osteoblaster, osteoklaster, hepatocytter og celler i endokrine eller exokrine kjertler. Cellen kan være enhver enkeltcelle i det tidlige embryo og kan være en blastocytt. Alternativt kan den være en oocytt.

Det er kjent at pattedyrsceller kan respondere på ekstracellulært dsRNA og derfor kan ha en transportmekanisme for dsTNA (Asher et al., Nature 223 715-717 (1969)). dsRNA kan således tilføres ekstracellulært i et hulrom, det interstitielle rom, i sirkulasjonen til et pattedyr eller tilføres oralt. Fremgangsmåter for oral tilførsel omfatter direkte sammenblanding av RNA med pattedyrets føde, så vel som genmodifikasjonstilnærminger hvor en art som anvendes som for modifiseres slik at den uttrykker RNA og så fores til pattedyret som skal behandles. For eksempel kan forbakterier som Lactococcus lactis transformeres slik at de danner dsRNA W093/17117, WO97/14806). Den vaskulære eller ekstravaskulære sirkulasjon, blodsystemet, lymfesystemet og cerebrospinalvæsken er seter hvor RNA kan injiseres.

RNA kan innføres intracellulært i cellen. Fysiske fremgangsmåter for innføring av nukleinsyrer kan også anvendes i denne sammenheng. dsRNA kan tilføres ved anvendelse av mikroinjeksjonsteknikkene beskrevet i Zernicka-Goetz, et al. Development 124, 1133-1137 (1997) og Wianny et al. Chromosoma 107, 430-439 (1998).

Andre fysiske fremgangsmåter for intracellulær innføring av nukleinsyrer omfatter bombardering med partikler dekket med RNA, f.eks. genpistolteknologien hvor dsRNA er immobilisert til gullpartikler og skytes direkte inn i sårsetet. Oppfinnelsen tilveiebringer således anvendelse av et RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur med en nukleotidsekvens som i det vesentlige er identisk med i det minste en del av et målgen i en pattedyrscelle, og som er avledet fra et endogent templat, i en genpistol for inhibering av målgenets ekspresjon. Videre tilveiebringes et preparat som er egnet for genpistol-behandling som omfatter et RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur med en nukleotidsekvens som i det vesentlige er identisk med i det minste en del av et målgen i en pattedyrscelle, og som er avledet fra et endogent templat, og gullpartikler. En alternativ fysisk fremgangsmåte omfatter elektroporering av cellemembraner i nærvær av RNA. dsRNA kan innføres i embryonale celler ved elektroforering ved anvendelse av betingelser som tilsvarer dem som generelt anvendes for dyrkede celler. De nøyaktige betingelser for elektroporeringen avhenger av innretningen som anvendes for å gi elektrosjokket og dimensjonene av kammeret som anvendes for å holde embryoene. Denne fremgangsmåte tillater RNAi i stor skala. Enhver kjent genterapiteknikk kan anvendes for tilførsel av RNA. En viruskonstruksjon pakket i en viruspartikkel vil gi både effektiv innføring av en ekspresjonskonstruksjon i cellen og transkripsjon av RNA som kodet av ekspresjons-konstruksjonen. Andre fremgangsmåter for innføring nukleinsyrer i celler som er kjente innen faget kan anvendes, f.eks. lipidformidlet bærertransport, kjemikalieformidlet transport, f.eks. kalsiumfosfat o.l. RNA kan således innføres sammen med bestanddeler som utøver én eller flere av følgende aktiviteter: forhøyet RNA-opptak av cellen, fremmet hybridisering av duplextrådene, stabilisering av de hybridiserte tråder, eller på annet vis, forhøyet inhibering av målgenet. Et transgent pattedyr som uttrykker RNA fra en rekombinant konstruksjon kan fremstilles ved å innføre konstruksjonen i en zygote, en embryonal stamcelle eller en annen multipotent celle avledet fra et egnet pattedyr.

Oppfinnelsen tilveiebringer også et RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur med en nukleotidsekvens som i det vesentlige er identisk med i det minste en del av et målgen i en pattedyrcelle og som er avledet fra endogent templat, for anvendelse innen medisinen.

I en annen side ved oppfinnelsen tilveiebringes anvendelse av et RNA for fremstilling av et middel, f.eks. et medikament, for inhibering av ekspresjonen av et målgen i en pattedyrcelle, hvor det angjeldende RNA omfatter en dobbelttrådet struktur med en nukleotidsekvens som i det vesentlige er identisk med i det minste en del av målgen, og som er avledet fra et endogent templat.

Medikamentet vil vanligvis tilføres i form av et sterilt, farmasøytisk preparat som normalt vil omfatte et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff. Således tilveiebringer oppfinnelsen også et farmasøytisk preparat som omfatter RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur med en nukleotidsekvens som i det vesentlige er identisk med i det minste en del av målgen i en pattedyrcelle, og som er avledet fra et endogent templat, sammen med et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff.

Dette farmasøytiske preparat kan foreligge i enhver egnet form (avhengig av den ønskede tilførselsmåte). Preparatet kan foreligge i enhetsfoseform, vil generelt foreligge i en forseglet beholder og kan tilveiebringes som en del av et sett. Et slikt sett vil normalt (om enn ikke nødvendigvis) omfatte anvendelsesinstruksjoner. Den kan omfatte et større antall enhetsdoseformer.

Det farmasøytiske preparat kan tilpasses tilførsel via enhver egnet tilførselsvei, f.eks. oral, innbefattet bukal eller sublingual), rektal, nasal, topisk (innbefattet bukkal, sublingual eller transdermal), vaginal eller parenteral (innbefattet subkutant, intramuskulær, intravenøs eller intradermal) tilførsel. Slike preparater kan fremstilles ved enhver fremgangsmåte som er kjent innen farmasien, f.eks. ved å blande den aktive bestanddel med bærerstoffer og/eller eksipienser under sterile betingelser.

Farmasøytiske preparater tilpasset oral tilførsel kan foreligge som separate enheter, f.eks. kapsler eller tabletter, som pulvere eller granulater, som løsninger, siruper eller suspensjoner (i vandige eller ikke-vandige væsker, eller som spiselige skum, eller som emulsjoner). Egnede eksipienser for tabletter eller harde gelatinkapsler omfatter laktose, maisstivelse eller maisstivelsesderivater, stearinsyre eller stearinsyresalter. Egnede eksipienser for anvendelse med myke gelatinkapsler omfatter f.eks. vegetabilske oljer, voks, fett, halvfaste eller flytende polyoler osv.

For fremstilling av løsninger eller siruper kan eksipiensene som anvendes omfatte f.eks. vann, polyoler og sukkere. For fremstilling av suspensjoner kan oljer (f.eks. vegetabilske oljer) anvendes for å gi olje-i-vann- eller vann-i-olje-suspensjoner. Farmasøytiske preparater tilpasset topisk tilførsel kan utformes som salver, kremer, suspensjoner, lotioner, pulvere, løsninger, pastaer, geler, sprayer, aerosoler eller oljer. For infeksjon i øye eller andre ytre vev, f.eks. munn og hud, tilføres preparatene fortrinnsvis som en lokal salve eller krem. Ved utforming i en salve kan den aktive bestanddel anvendes sammen med enten en parafinbasert eller vannblandbar salvebasis. Alternativt kan den aktive bestanddel utformes i en krem med en olje-i-vann-krembasis, eller en vann-i-olje-basis. Farmasøytiske preparater tilpasset topisk tilførsel til øyet omfatter øyedråper, hvor den aktive bestanddel er oppløst eller suspendert i et egnet bærerstoff, fortrinnsvis et vandig løsemiddel. Farmasøytiske preparater tilpasset topisk tilførsel i munnen omfatter sugepiller, pastiller og munnvask.

Farmasøytiske preparater tilpasset rektal tilførsel kan foreligge som stikkpiller eller klysterer.

Farmasøytiske preparater tilpasset nasal tilførsel, hvor bærerstoffet er et fast stoff, omfatter et grovt pulver med en partikkelstørrelse som f.eks. ligger innenfor området 20 til 500 um, tilført på samme måte som snus inntas, dvs. ved hurtig inhalering gjennom nesen fra en beholder av pulveret holdt nær nesen. Egnede preparater, hvor bærerstoffet er en væske for tilførsel som en nesespray, eller som nesedråper, omfatter vandige løsninger eller løsninger i olje av den aktive bestanddel.

Farmasøytiske preparater tilpasset tilførsel ved inhalering omfatter støv eller tåker av fine partikler som kan dannes ved hjelp av forskjellige typer aerosolbeholdere med utmålt dose, nebulisatorer eller insufflatorer.

Farmasøytiske preparater tilpasset vaginal tilførsel kan foreligge som pessarer, tamponger, kremer, geler, pastaer, skum eller spraypreparater.

Farmasøytiske preparater tilpasset parenteral tilførsel omfatter vandige og ikke-vandige, sterile injeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostatiske midler og oppløste stoffer som gjør preparatet i det vesentlige isotonisk med blodet til den påtenkte mottaker, og vandige eller ikke-vandige, sterile suspensjoner som kan omfatter suspensjonsmidler og tykningsmidler. Eksipienser som kan anvendes for injiserbare løsninger omfatter vann, alkoholer, polyoler, glyserol og vegetabilske oljer. Preparatene kan foreligge i endosebeholdere eller flerdosebeholdere, f.eks. forseglede ampuller, og kan lagres i frysetørket (lyofilisert) form som bare krever tilsetning av det sterile, flytende bærerstoff, f.eks. injeksjonsvann, umiddelbart før bruk. Ekstemporært fremstilte injeksjonsløsninger og - suspensjoner kan fremstilles fra sterile pulvere, granulater og tabletter.

De farmasøytiske preparatene kan inneholde konserveringsmidler, solubiliseirngsmidler, stabilisatorer, fuktningsmidler, emulsjonsmidler, søtemidler, fargestoffer, duftstoffer, salter (forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse kan i seg selv foreligge i form av et farmasøytisk akseptabelt salt, buffere, belegningsmidler eller antioksidanter. De kan også inneholde terapeutisk aktive midler, i tillegg til forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse.

Doser av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan variere innfor vide grenser, avhengig av sykdommen eller forstyrrelsen som skal behandles, alder og tilstand til individet som skal behandles osv., og en lege vil til sist bestemme egnede doser. Denne dose kan gjentas så ofte som nødvendig. Dersom bivirkninger oppstår, kan mengde og/eller hyppighet av doseringen reduseres ifølge normal klinisk praksis.

Foreliggende oppfinnelse kan anvendes alene eller som en bestanddel av et sett som omfatter minst ett av reagensene som er nødvendig for utførelse av in vitro eller in vivo-innførsel av RNA i individer. Foretrukne bestanddeler er dsRNA og en bærer som fremmer innførsel av dsRNA. Et slikt sett kan også omfatte instruksjoner som tillater en bruker av settet å utføre oppfinnelsen.

Ifølge ytterligere en side ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et sett for inhibering av ekspresjon av et målgen i en pattedyrcelle, kjennetegnet ved at det omfatter;

RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur hvor nukleotidsekvensen av den dobbelttrådete strukturen er minst 90%, 95% eller 100% identisk med i det minste en del av et målgen i pattedyrcellen eller er i stand til å hybridisere med en del av målgen-transkriptet under følgende betingelser; 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 MM EDTA, hybridisering ved 50°C eller 70°C i 12-16 timer, etterfulgt av vasking, og er avledet fra et endogent templat, hvor nevnte RNA omfatter to separate komplementære RNA-tråder, og hvor nevnte dobbelttrådete struktur har en lengde på minst 25 baser;

og

en bærer som fremmer innføring av RNA i pattedyrcellen,

hvor det angjeldende RNA ikke er avledet fra genet som koder for p-glucuronidase, og hvor pattedyrcellen er en somatisk celle, en ikke-human oocytt eller en embryonisk stamcelle fra et ikke-humant pre-implantasjon embryo.

Foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å manipulere genekspresjonen i non-human oocytten for behandling av infertilitet. Den kan også anvendes for å regulere de kromosomale disjunksjonsprosesser in non-human pattedyr. Hos mennesker er det økt forekomst av kromosomal ikke-disjunksjon hos mødre med alder over 35 år som fører til avkom med Downs syndrom og spontan abort. En rekke molekyler som regulerer cellesyklus og som fremmer flere sider ved progresjonen av syklusen er nå kjente, innbefattet cyklinavhengige kinaser, cykliner, polokinase, aurorakinase, min A kinase, proteinfosfatase, bestanddeler av det anafasepromoterende kompleks og dettes regulerende molekyler, proteosombestanddeler, SCF-komplekset, centrosombestanddeler, kinetochorbestanddeler, strukturelle, kromosomale proteiner, DNA-replikasjonsenzymer, DNA-rekombinasjonsproteiner og DNA-reparasjons-proteiner. Oppfinnelsen kan anvendes i ikke-humane pattedyr for å modulere ekspresjonen av ett eller flere av de ovenfor nevnte proteiner for å sikre korrekt kromosom-segregasjon.

Oppfinnelsen kan også anvendes for å manipulere cellesyklusstadiene for mottakerzygoter med fjernet kjerne og donorceller som tilveiebringer kjerner for kloning av pattedyr (se WO97/07668). Erfaringer med kloning av sau og mus viser et behov for optimalisering av mottakereggets cellesyklusstadium før fjerning av kjernen og for erholdelse av kjerner fra celler i et spesifikt cellesyklusstadium, ofte, men ikke nødvendigvis, G0-celler. Anvendelse av foreliggende oppfinnelse for å stanse ett eller flere av cellesyklusmolekylene angitt ovenfor kan benyttes for dette formål.

Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for å styre genekspresjonsmønsteret i pluripotente celler for å danne spesifikt differensierte celletyper for anvendelse ved transplantasjon for erstatning av sykt, eller på annet vis, ikke funksjonelt vev. Et eksempel på pluripotente celler er embryonale stamceller (ES-celler) fra ikke-humane preimplantasjonsembryoer. Det er velkjent innen faget at ES-celler fra mus kan innføres i blastocysten, hvoretter de inkorporeres i det utviklende embryo, utvikles og differensierer til alle kroppscelletyper og - strukturer. ES-celler kan også induseres til å differensiere in vitro til et bredt utvalg av celletyper etter fjerning av spesifikke vekstfaktorer fra dyrkningsmediet. Det forventes at ES-cellelinjer kan etableres fra alle pattedyr, og faktisk har fremgangsmåter for etablering av humane ES-cellelinjer allerede blitt etablert. Differensiering av pluripotente celletyper til spesifikke celletyper krever at visse genekspresjonsveier er avskrudd mens andre er påskrudd. Foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å fjerne nøkkel proteiner i slike regulatoriske veier for å styre ES-celler og andre embryonale celler til å differensieres til spesifikke celletyper. Oppfinnelsen kan derfor anvendes for å interferere med ekspresjonen av utviklingsgener (f.eks. dem nevnt heri) for å styre celledifferensieringen langs foretrukne veier. Det er også kjent at visse celletyper fullfører sin differensiering etter at de har gått ut av celledelingssyklusen. Oppfinnelsen kan derfor også anvendes for å inhibere cellesyklus-regulerende molekyler, f.eks. dem angitt ovenfor. Disse dsRNA kan anvendes direkte eller uttrykkes fra regulerbare promotere for å nå de siste stadier av celledifferensieringen.

Beskrivelsen omtaler også en pattedyrcelle som inneholder en ekspresjonskonstruksjon som koder for et RNA som danner en dobbelttrådet struktur med en nukleotidsekvens som i det vesentlige er identisk med i det minste en del av et målgen, og som er avledet fra et endogent templat, så vel som et transgent pattedyr som inneholder en slik celle.

Anvendt heri omfatter begrepet "behandling/terapi" enhver fremgangsmåte som kan være gunstig for et menneske eller ikke-menneskelig dyr, og "omfatte/ha" omfatter hva som helst som kun har en angitt egenskap, så vel som alt som har denne egenskap, men som også har en eller flere andre egenskaper.

EKSEMPLER

Foreliggende oppfinnelse vil nå beskrives videre i de påfølgende eksempler. Det vises her til de vedlagte figurer: Figur 1: MmCFP dsRNA hindrer spesifikt mMGFP-ekspresjon i MmGFP-transgene embryoer

(a-c) Representative embryoer fra 131 embryoer erholdt fra 11 separate parringer mellom Fl-hunner og MmGFP-transgene hanner. MmGFP-transgene embryoer i 4 - 6-cellestadiet (a), morula (b), blastocyster (c). Et tilsvarende GFP-ekspresjonsmønster ble erholdt etter injeksjon av "antisens"-W/r?GFP- RNA. (d-f)

Representative embryoer fra 147 MmGFP-transgene embryoer som var injisert med MmCFP dsRNA på encellestadiet. Embryoer fra 4 - 6-cellestadiet (d), morula (e), blastocyst (f), (g-i) representative embryoer fra 18 MmGFP-transgene embryoer som var injisert med c- mos-dsRNA i encellestadiet. Embryoer fra 6-cellestadiet (g) morula (h), blastocyst (i). Stolpene angir 20 um. Skraveringen angir grønn fluorescens.

Figur 2: Forstyrring av ekspresjon av injisert, syntetisk MmGFP mRNA.

(a), wildtype-morulae injisert med MmGFP mRNA alene, (b), sammen med E- cadherin dsRNA og (c) sammen med MmGFP dsRNA ved encellestadiet. Stolpene angir 20 um. Skraveringen angir grønn fluorescens.

Figur 3: Injeksjon av E- cadherin dsRNA til zygoten reduserer E-cadherin-ekspresjonen og forstyrrer utviklingen av de injiserte embryoer.

I (a), immunfluorescensfarging av E-cadherin i embryor injisert i encellestadiet med MmGFP dsRNA og dyrket i fire dager in vitro inntil blastodyststadiet. (b), immunfluorescensfarging av E-cadherin i embryoer injisert i encellestadiet med E- cadherin dsRNA og dyrket i fire dager in vitro. Bemerk den endrede utvikling av disse embryoer. Stolpene angir 20 [ im. (c) Western-blotanalyse av E-cadherin-ekspresjonen i zygoter, ikke-injiserte morulae (oppsamlet på encellestadiet og dyrket in vitro i tre dager), morulae injisert i encellestadiet med 2 mg ml"<1>av GFP dsRNA og dyrket in vitro i tre dager, morulaeinjisert i encellestadiet med 2 mg ml"<1>E- cadherin- dsRNA og dyrket in vitro i tre dager. I alle tilfeller ble proteiner ekstrahert fra 15 embryoer. Dette eksperiment har blitt gjentatt tre ganger med samme resultat. Reduksjonen i signalet etter E- cadherin dsRNA-injeksjon var tillnærmet 6,5 ganger. Stolpen angir 20 [ im. Skraveringen angir kjemiluminescens.

Figur 4: Injeksjon av c-mos-dsRNA i umodne oocytter inhiberer c-mos-ekspresjonen og forårsaker partenogenetisk aktivering.

(a-d) Eksempler på partenogenetisk aktiverte egg erholdt etter injeksjon av c- mos-dsRNA i oocytter i germinalvesikkelstadiet. (a), Kontroll-oocytt stanset i metafase II, (b), encellet embryo (den hvite pilen viser til pronukleus), (c), tocellet embryo, (d), firecellet embryo. Stolpen angir 20 um. (e), Western-blota na lyse av c-mos-ekspresjonen i oocytter stanset i metafase II, oocytter injisert i germinalvesikkelstadiet med 2 mg ml"<1>MmCFP dsRNA og dyrket in vitro i 12 timer, oocytter injisert i germinalvesikkelstadiet med 2 mg ml"<1>c- mos dsRNA og dyrket in vitro i 12 timer. I alle tilfeller ble proteiner ekstrahert fra

35 oocytter. Dette eksperiment har blitt gjentatt to ganger med samme resultat.

Figur 5: Inhibering av genekspresjon etter injeksjon av dobbelttrådet RNA er begrenset til den klonale linje som er avledet fra den injiserte celle.

Immunfluorescensfarging av E-cadherin i embryor injisert i en celle ved tocellestadiet med E- cadherin dsRNA og syntetisk MmGFP-mRNA. Feltene på venstre side viser enkanals fluorescens (rød) som viser E-cadherin. Bemerk at fargingen er markant redusert i avkommet fra den injiserte celle. Disse avkomscellene vises i de tilsvarende, sekundære (grønne) kanaler å være celler som uttykker MmGFP.

Fremgangsmåter

Oppsamling og dyrking av oocytter og embryoer

Umodne oocytter stanset i meiosens profase I ble oppsamlet fra ovarier f ra 4 - 6 uker gamle Fl (CBAxC57Bl)-mus i FHM-medium (Speciality media, Inc. Lavalette, N.J.) tilsatt bovint serumalbumin (BSA) (4mg ml"<1>). Fl-hunnmus ble indusert til superovulasjon ved intraperitoneale injeksjoner av gonadotrofin fra drektig hoppeserum (PMSG, 5 i.u.) og humant choriongonadotrofin (hCG) med 48 - 52 timers mellomrom. Befruktede, encellede embryoer ble erholdt fra parede hunder 20 - 24 timer etter hCG.

RNA- syntese og microinjeksjoner

Templatene som ble anvendt for RNA-syntese var lineariserte plasmider, Full-lengde MmGFP cDNA (714bp) ble klonet i plasmidet T7TS (Zernicka-Goetz, et al. Development 124, 1133-1137 (1997)). Et Kpnl/Hindlll-fragment av c-mos-cDNA (550bp) (Colledge et al., Nature 370, 665 - 68 (1994)) ble klonet i Bluescript pSK. Et cDNA som tilsvarer exon4- exon8 av E-cadherin (580bp) (Larue et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92, 855 - 859 (1995)) ble klonet i Bluescript pKS. RNA ble syntetisert ved anvendelse av T3 eller T7 polymerase og settet Megascripts (Ambion). DNA-templatene ble fjernet ved DNAse-behandling. RNA-produktene ble ekstrahert med fenol/kloroform og utfelt med eta noi.

For hybridisering ble ekvimolare mengder av "sens"- og "antisens"-RNA blandet i hybridiseirngsbuffer (10 mM Tris pH7,4, EDTA 0,1 mM) til en sluttkonsentrasjon på 2 uM av hvert, oppvarmet i 10 minutter ved 68 °C og inkubert ved 37 °C i 3 - 4 timer. For å unngå nærvær av kontaminerende, enkelttrådet RNA i dsRNA-prøvene ble preparatene behandlet med 2 ug/ml RNase Tl (Calbiochem) og 1 ug/ml RNase A (Sigma) i 30 min ved 37 °C. dsRNA ble så behandlet med 140 ug/ml proteinase K (Sigma) ekstrahert med fenol/kloroform og utfelt med etanol. Dannelse av dsRNA ble bekreftet ut fra migrasjonen i en agarosegel: for hvert dsRNA var gel mobiliteten forskjøvet sammenlignet med ssRNA. For sammenligning av "antisens"- RNA og dobbelttrådet RNA ble like RNA-masser anvendt i infeksjonen.

RNA ble fortynnet med vann til en sluttkonsentrasjon på fra 2 til 4 mg ml"<1>. Det effektive konsentrasjonsområdet illustreres best ut fra c-mos-eksperimentet (tabell 2), grunnet denne biologiske fenotypes sensitivitet. mRNA ble mikroinjisert inn i cytoplasmaet til oocyttene eller embryoene ved anvendelse av et system med en konstant gjennomstrømming (Transjector, Eppendorf) som beskrevet (Zernicka-Goetz i Cell lineage and fate determination (red. Moody, S.A.) 521 - 527. (Academic Press, San Diego, CA, 1999). Hver oocytt eller hvert embryo ble injisert med tilnærmet 10pl dsRNA. Forbedret penetrering ble oppnådd ved anvendelse av negativ kapasitet. Etter mikroinjeksjonen ble oocyttene og embryoene dyrket i KSOM (Speciality media, Inc. Lavalette, N.J.)-medium tilsatt 4 mg ml"<1>BSA ved 37 °C i en 5 % C02-atmosfære. MmGFP-transgene embryoer ble observert ved konfokal mikroskopi (Biorad 1024 skannende hode på Nikon Eclipse 800 mikroskop).

Immunblottings- og immunfargingsanalyse

For immunblotanalyse ble prøvene fraksjonert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese, og proteinene ble overført til en Hybond nitrocellulosemembran (Amersham). Membranene var preinkubert i TBST-buffer (20 mM Tris-HCI, pH 8,2,

150 mM NaCI, 0,1 % Tween-20 tilsatt 5 % (vekt/vol) fettfri tørrmelk over natten for blokkering av uspesifikk binding av antistoffer. De ble så inkubert med anti-E-cadheirn-antistoffet (DECMA-1) eller anti-mos-antistoffet (SantaCruz Biotechnology) i 1 time, vasket med TBST og inkubert med det peroksidasekonjugerte sekundærantistoff (SantaCruz Biotechnology) i 1 time og igjen vasket i TBST. Antistoffene var fortynnet i TBST tilsatt 5 % (vekt/vol) fettfri tørrmelk. Sekundærantistoffet ble påvist ved forsterket kjemiluminescens (Amersham). For immun-fluorescensanalyse med E-cadherin-antistoff av monterte preparater ble embryonene fiksert i 2 % paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur, fulgt av permeabilisering med 0,1 % Triton X-100 i 10 minutter. Etter preinkubering i 2 % BSAi PBS i 30 minutter ble embyoene inkubert med anti-E-cadherin-antistoffet i 1 time ved 37 °C og med et Texas-Red-konjugert anti-rotteantistoff fra geit (Jacksom ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa., USA) i 1 time ved 37 °C. Embryoene ble observert ved anvendelse av et biorad 1024 laserscannende konfokalt mikroskop.

Eksempel 1 - dsRNA forhindrer grfp-transgen ekspresjon

For å fastslå hvorvidt dsRNA kan anvendes for å forhindre genekspresjon i museembryoer, utviklet foreliggende oppfinnere et ekperimentelt analysesystem som benyttet en transgen musestamme som uttrykker MmGFP under kontroll forlengelsesfaktor 1 a UEiFa)-promoteren (Zernicka-Goetz, M. i Cell lineage and fate determination (red. Moody, S. A.) 521 - 527 (Academic Press, San Diego, CA. 1999). Denne linjen byr på den fordel at GFP-ekspresjonen lett kan visualiseres i levende embryoer, og siden funksjonen ikke er essensiell, kunne vi måle eventuelle uspesifikke uheldige virkninger av dsRNA på embryoutviklingen. For å unngå komplikasjonene forbundet med vedvarende nærvær av maternale genprodukter ble det anvendt heterozygote embryoer hvor transgenet var paternalt avledet. Påbegynnende GFP-ekspresjon i disse embryoer observeres ved fremkomst av grønne celler etter initering av zygotisk transkripsjon i tocellestadiet.

Foreliggende oppfinnere viste at injeksjon av MmGFP dsRNA i den encellede zygote forhindret fremskomst av grønn fluorescens ved 2 - 4-cellestadiet (fig. 1). Etter injeksjonen ble embryoene dyrket in vitro i 3 - 4 dager til blastocyststadiet. Mens ikke-injiserte embryoer uttrykte MmGFP på den forventede måte (fig. la - c) viste alle embryoer som var injisert med Mn dsRNA en dramatisk reduksjon av den grønne fluorescens i dette tidsrommet (fig. Id - f), mens en mindre andel (6,8 %) viste rester av grønn fluorescens. Embryoene viste normal utvikling før og etter implantering, noe som viser at injeksjon av dsRNA ikke er toksisk.

Interferensen med genekspresjonen er spesifikk, for da det ble injisert et ubeslektet dsRNA som tilsvarte et segment av c-mos-transkriptet i MmGFP-transgene embryoer, førte dette ikke til redusert grønn fluorescens (fig lg - i). På tilsvarende måte førte injeksjon av dsRNA som tilsvarte et segment av E-cadherin-transskriptet i transgene zygoter (59 observerte embryoer) ikke til redusert, grønn fluorescens og førte ikke til stans av proteinsyntesen via dsRNA-kinase, selv om slike embryoers genotype var unormal (resultater ikke vist, se nedenfor). Vi fant også at transgene zygoter injisert med "antisens"-MnRNA bibeholder den grønne fluorescens ved alle pre-implantasjonsstadier (37 embryoer observert - resultater ikke vist).

Det ble også forsøkt å fastslå hvorvidt ekspresjon av MmGFP fra full-lengde MmGFP mRNA med "cap" kunne hindres ved samtidig injeksjon av MmGFP dsRNA. Det ble funnet at den grønne fluorescens ble kraftig redusert eller fjernet i embryoer injisert på denne måte (fig. 2d). Dette var i motsetning til embryoer injisert med "sens"- MmGFP-RNA eller samtidig injisert med både "sens"- MmGFP-mRNA og "irrelevant" dsRNA for E-cadherin (fig. 2 a - b). dsRNA kan således interferere både med ekspresjonen av et kromosomalt lokalisert gen og av syntetisk mRNA innført ved mikroinjeksjon.

Eksempel 2 - Fenokopiering av et E-cadherin-"knockout"-individ

De spesifikke virkninger på utviklingen av injeksjon av E-cadherin-dsRNA ble anslått. E-cadherin uttrykkes både maternalt og zygorisk under preimplantasjonsutviklingen. Ødeleggelse av E- cadherin- genet ved anvendelse av homolog rekombinansjon for fjerning av områder i molekylet som er nødvendige for den adhesive funksjon fører til en alvorlig preimplantasjonsdefekt. Disse embryoene kan i utgangspunktet gjennomgå komprimering grunnet nærvær av maternalt uttrykt E-cadherin. De viser imidlertid en defekt i kavitasjonen og danner aldri normale blastocyster (Larue et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 91, 8263 - 8267 (1994), Rietmacher, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 92, 855 - 859 (1995)).

Det ble observert at etter injeksjon av E- cadherin-dsRNA var fenotypen identisk med fenotypen til null-mutantembryoer. således utviklet embryoene seg i utgangspunktet normalt frem til morulaens komprimeringsstadium (resultater ikke vist). Imidlertid var bare tilnærmet 30 % i stand til kavitasjon og dannet de såkalte "cyster", men dannet ikke normale blastocyster (Larue et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 91, 8263 - 8267 (1994)) (tabell 1). I motsetning til dette gjennomgikk det store flertall ikke-injiserte embryoer eller kontrollembryoer injisert med MmCFP dsRNA kavitasjon og dannet normale blastocyster (tabell 1).

<*>N.A.: ikke relevant. Middelverdi ± standardavvik.<a>signifikant forskjellig fra resultater med GFP-dsRNA ved anvendelse av x2-analysen (p<0,05).

Analyse av E-cadherin-ekspresjonen ved immunfarging og immunblotting viser at ekspresjonen av E-cadherin reduseres dramatisk etter injeksjon etter E- cadherin- dsRNA (fig. 3b, c). I motsetning til dette ble ingen reduksjon av E-cadherin-ekspresjonen observert i embryoer injisert med MmGFP-dsRNA, for hvilke E-cadherin-ekspresjonsnivået tilsvarte nivået i ikke-injiserte kontrollembryoer (fig. 3 c). E-cadherin-nivået ved morulastadiet i embryoer injisert med E- cadherin- dsRNA er lavere enn i nylig befruktede embryoer før injeksjon fig. 3 c). Dette gjenværende E-cadherin-protein kan i stor grad gjenspeile vedvarende maternalt uttrykt protein hvis syntese oppfører i løpet av to-cellestadiet (Sefton, et al., Develpment 115, 313 -

318 (1992)). Dette gjenværende, maternale protein foreligger til det sene blastocyststadium i homozygote null-embryoer (Larue et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA., 91, 8263 - 8267 (1994)).

Foreliggende oppfinnere konkluderer at injeksjon av E- cadherin- dsRtiA fører til en slående reduksjon av E-cadherin-proteinnivået og følgelig en fenotype som tilsvarer fenotypen til null-mutantembryo.

Eksempel 3 - dsRNA-interferens i oocytter

For å fastslå hvorvidt dsRNA kan anvendes for å interferere med maternalt uttrykte gener søkte vi etter et modellgen med en særpreget "knockouf-fenotype. c-mos er en nødvendig bestanddel av cytostatisk faktor, som er ansvarlig for å stanse den modnende oocytt i metafasen i den andre meiotiske celledeling. I c- mos -/- -mus opprettholder mellom 60 og 75 % av oocyttene ikke denne metafase I-stans og innleder partenogenetisk utvikling (Colledge et al., Nature 370, 65 - 68 (1994), Hashimoto, et al., Nature 370, 68 - 71 (1994)). c-mos-mRNA foreligger i fullt utvokste, umodne oocytter, og translasjonen innledes fra maternale templater når meiosen gjenopptas etter germinalvesikkelnedbrytningen (Verihac, et al. Development 122, 815 - 822 (1996)). Således kan injeksjon av c-mos-dsRNA tillate oss å analyser hvorvidt dsRNA kan interferere med ekspresjonen av maternalt mRNA.

Da foreliggende oppfinnere injiserte c-mos-dsRNA i oocytter opprettholdt tilnærmet 63 % ikke stansen i metafase II (tabell 2). Av disse innledet 78% partenogenetisk utvikling og utviklet seg til embryoer i 2 - 4-cellestadiet (fig. 4 a, b, c). Resten gjennomgikk fragmen-tering. Begge disse begivenheter skjer med tilsvarende hyppighet i null-mutantoocytter (Colledge, et al., Nature 370, 65 - 68 (1994)). I motsetning til dette gjennomgikk bare 1-2 % av kontroloocyttene, som enten var ikke-injisert eller injisert med MmCFP dsRNA, spontan aktivering (tabell 2). Det ble fortsatt observert at 42 % av de injiserte oocytter ikke gjennomgikk metafase II-stans når konsentrasjonen ble redusert av injisert av c-mos-dsRNA 20 ganger til 0,1 mg/ml (tabell 2). Dette er en konsentrasjon som er signifikant høyere enn hva som antas å være effektivt i C. elegans og planter, hvor det påståes at en virkning kan oppnås med noen få molekyler dsRNA pr celle.

Foreliggende oppfinnere bekreftet at c-mos-dsRNA interfererer med c- mos-ekspresjonen ved immunblottanalyse utført 12 timer etter injeksjon av oocytter i terminalvesikkelstadiet, før de fenotypeiske konsekvenser av manglende ekspresjon blir åpenbare (fig. 4 e). Således interfererer injeksjon av c-mos-dsRNA i oocytten spesifikt med c-mos-aktivitet og ligner følgende av en målstyrt delesjon av c- mos ved homolog rekombinasjon. Disse eksperimenter viser at dsRNA kan blokkere ekspresjonen av maternalt erholdte genprodukter.

Eksempel 4 - virkningene av RNAi arves klonalt i museembryoet

For å anslå hvorvidt det vil være mulig å fjerne ekspresjon av spesifikke gener i definerte cellelinjer i det tidlige museembryo ble dsRNA for E- cadherin mikroinjisert i en celle i et museembryo i to-cellestadiet, sammen med syntetisk mRNA for MmGFP for å merke den injiserte celle. Ekspresjonsnivået for E-cadherin og MmGFP ble fulgt etter hvert som disse embryoene utviklet seg. Ekspresjonen av E-cadherin var spesifikt redusert i celler avledet fra cellen injisert med E- cadherin- dsRfiA, hvor klonen var merket ved ekspresjon av MmGFP-translatert fra det injiserte mRNA i samme celle. I tidlige museembryoer overføres således virkningen av dsRNA ikke til naboceller. dsRNAi kan således anvendes i embryoer for å regulere genekspresjonsmønsteret differensielt mellom cellelinjer med forskjellig skjebne.

Diskusjon

Oppfinnerne viste at dsRNA kan anvendes som en spesifikk inhibitor av genaktivitet i museoocytter og preimplantasjonsembryoer eller tidlige embryoer. Fremgangsmåtens spesifisitet ble vist ved enkeltvis å inhibere ekspresjonen av 3 forskjellige gener: c- mos i oocytten og E- cadherin eller et gfp-transgen i det tidlige ebryo. Når det gjelder de to endogene musegener, fører dette til fenotyper som tilsvarer fenotypene til null-mutanter. Eksperimtene følge foreliggende oppfinnelse vedrørende hindring av ekspresjonen av g/p-transgenet tyder på at RNAi i seg selv ikke påvirker det normale utviklingsforløp.

To av eksperimentene ifølge foreliggende oppfinnelse understøtter hypotesen om at RNAi virker i musen ved enten å indusere degradering av RNA-målet eller ved å inhibere dets translasjon. Det blir først vist at injeksjon av MmGFP dsRNA inhiberer ekspresjonen av samtidig injisert " sens"- MmCFP mRNA. Deretter injiserte vi dsRNA mot c- mos i oocytter før germinalvesikkelen brytes ned, stadiet hvor c-mos-mRNA har blitt akkumulert, men ennå ikke transatert. c-mos translateres når germinalvesikkelen brytes ned, slik at oocyttene stanses i metafse II i den andre meiotiske deling. Det ble funnet avt c-mos-dsRNA forhindrer funksjonen til c- mos, slik at oocyttene går gjennom metafase II og gjennomgår patenogenetisk aktivering. I alle tilfeller vedvarer virkningene av RNAi i tilstrekkelig lang tid til at det oppnås samme fenotype som for tap av genfunksjonen. Dersom dsRNA innføres i tidlige blastocyster forblir det effektivt inntil tidlige postimplantasjonsstadier. Klonal nedarving av RNAi-virkningen tyder på at den kan rettes mot et genaktivitetsmønster i en spesifikk cellelinje. Siden RNAi fungerer i periimplantasjonsutviklingen, kan det endelig forventes at RNAi kan føre til stans i ekspresjonen av målgener i ebryonale stamceller avledet fra museembryoer i dette utviklingstrinn, og dette kan forenkle styrt differensiering av disse til spesifikke celletyper.

Claims (20)

1. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur hvor nukleotidsekvensen av den dobbelttrådete strukturen er minst 90%, 95% eller 100% identisk med i det minste en del av et målgen i en pattedyrcelle eller er i stand til å hybridisere med en del av målgentranskriptet under følgende betingelser; 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 MM EDTA, hybridisering ved 50°C eller 70°C i 12-16 timer, etterfulgt av vasking, og som er avledet fra et endogent templat, hvor nevnte RNA omfatter to separate komplementære RNA-tråder, og hvor nevnte dobbelttrådete struktur har en lengde på minst 25 baser; sammen med en farmasøytisk akseptabelt bærer, hvor det angjeldende RNA ikke er avledet fra genet som koder for p-glucuronidase og hvor pattedyrcellen er en somatisk celle, en ikke-human oocytt eller en embryonisk stamcelle fra et ikke-humant pre-implantasjon embryo.

2. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert vedat målgenet er et endogent gen.

3. Farmasøytisk preparat ifølge krav 1, karakterisert vedat målgenet er et viralt gen.

4. Anvendelse av et RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur hvor nukleotidsekvensen av den dobbelttrådete strukturen er minst 90%, 95% eller 100% identisk med i det minste en del av et målgen i en pattedyrcelle eller er i stand til å hybridisere med en del av målgen-transkriptet under følgende betingelser; 400 mM NaCI,

40 mM PIPES pH 6,4, 1 MM EDTA, hybridisering ved 50°C eller 70°C i 12-16 timer, etterfulgt av vasking, og som er avledet fra et endogent templat, hvor nevnte RNA omfatter to separate komplementære RNA-tråder, og hvor nevnte dobbelttrådete struktur har en lengde på minst 25 baser, for fremstilling av et medikament for å inhibere ekspresjon av et målgen i en pattedyrcelle, hvor målgenet forårsaker, eller kan forårsake, sykdom og hvor pattedyrcellen er en somatisk celle, en ikke-human oocytt eller en embryonisk stamcelle fra et ikke-humant pre-implantasjon embryo.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor målgenet er et endogent gen.

6. Anvendelse ifølge krav 4, hvor målgenet er et viralt gen.

7. Anvendelse ifølge krav 4, hvor genet er BCL2.

8. Anvendelse ifølge krav 4, krav 5, krav 6 eller krav 7, hvor pre-implantasjon embryoet er en blastocytt.

9. Sett for inhibering av ekspresjon av et målgen i en pattedyrcelle,karakterisert vedat det omfatter; RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur hvor nukleotidsekvensen av den dobbelttrådete strukturen er minst 90%, 95% eller 100% identisk med i det minste en del av et målgen i pattedyrcellen eller er i stand til å hybridisere med en del av målgen-transkriptet under følgende betingelser; 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 MM EDTA, hybridisering ved 50°C eller 70°C i 12-16 timer, etterfulgt av vasking, og er avledet fra et endogent templat, hvor nevnte RNA omfatter to separate komplementære RNA-tråder, og hvor nevnte dobbelttrådete struktur har en lengde på minst 25 baser; og en bærer som fremmer innføring av RNA i pattedyrcellen, hvor det angjeldende RNA ikke er avledet fra genet som koder for p-glucuronidase, og hvor pattedyrcellen er en somatisk celle, en ikke-human oocytt eller en embryonisk stamcelle fra et ikke-humant pre-implantasjon embryo.

10. Sett ifølge krav 9, hvor målgenet er et viralt gen, genet er BCL2 og hvor pre-implantasjon embryoet er en blastocytt

11. In Wtro-fremgangsmåte for å inhibere ekspresjon av et målgen i en pattedyrcelle,karakterisert vedat den omfatter (a) innføre i cellen et RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur hvor nukleotidsekvensen av den dobbelttrådete strukturen er minst 90%, 95% eller 100% identisk med i det minste en del av et målgen i en pattedyrcelle eller er i stand til å hybridisere med en del av målgen-transkriptet under følgende betingelser; 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 MM EDTA, hybridisering ved 50°C eller 70°C i 12-16 timer, etterfulgt av vasking, og er avledet fra et endogent templat, hvor nevnte RNA omfatter to separate komplementære RNA-tråder, og hvor nevnte dobbelttrådete struktur har en lengde på minst 25 baser; og (b) verifisere inhibering av ekspresjon av målgenet, hvor pattedyret er en somatisk celle, en ikke-human oocytt eller en embryonisk stamcelle fra et ikke-humant pre-implantasjon embryo.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor målgenet er et endogent gen.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor målgenet er et viralt gen.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 11, 12 eller 13, hvor RNA blir fremstilt utenfor cellen.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvor RNA injiseres inn i cellen.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14 eller 15, hvor RNA fremstilles rekombinant.

17. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 11-16, hvor det dobbelttrådete RNA ikke er avledet fra genet som koder for p-glucuronidase.

18. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 11-17, hvor målgenet forårsaker, eller kan forårsake, sykdom.

19. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 11-18, hvor pre-implantasjon embryoet er en blastocytt.

20. In Wtro-fremgangsmåte for å inhibere ekspresjon av et målgen i en pattedyrcelle,karakterisert vedat den omfatter; innføre i cellen et RNA som omfatter en dobbelttrådet struktur hvor nukleotidsekvensen av den dobbelttrådete strukturen er minst 90%, 95% eller 100% identisk med i det minste en del av et målgen i en pattedyrcelle eller er i stand til å hybridisere med en del av målgen-transkriptet under følgende betingelser; 400 mM NaCI, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 MM EDTA, hybridisering ved 50°C eller 70°C i 12-16 timer, etterfulgt av vasking, og er avledet fra et endogent templat, hvor nevnte RNA omfatter to separate komplementære RNA-tråder, og hvor nevnte dobbelttrådete struktur har en lengde på minst 25 baser, hvor det dobbelttrådete RNA ikke er avledet fra p-glucuronidase, og hvor pattedyrcellen er en somatisk celle, en ikke-human oocytt eller en embryonisk stamcelle fra et ikke-humant pre-implantasjon embryo.