JP6445446B2 - 骨転移の治療のための方法及び医薬組成物 - Google Patents

Description

発明の分野：
本発明は、骨転移の治療のための方法及び医薬組成物に関する。

発明の背景：
癌が骨へと広がること、すなわち骨転移は、世界中の１５０万人を超える癌患者に起こり、最も一般的には前立腺癌、肺癌及び乳癌に伴う（Weilbaecher et al., Nat Rev Cancer 2011; 11:411-24）。骨髄に存在する転移性癌細胞は、骨吸収細胞（破骨細胞）及び骨形成細胞（骨芽細胞）の機能を変化させ、骨基質から来るシグナルを乗っ取る（Weilbaecher et al., Nat Rev Cancer 2011; 11:411-24）。骨吸収と骨形成との間の生理学的バランスを破壊することによって、転移性細胞は、骨破壊を促進する。骨髄における転移性細胞が破骨細胞と骨芽細胞の機能を変化させるという認識が、破骨細胞を標的化する療法（ビスホスホネート、デノスマブ）の使用をもたらした。ビスホスホネートは骨吸収破骨細胞の活性を阻害し、かつ、骨転移を有する癌患者において骨破壊を遅延させるための標準的な治療である（Gnant & Clezardin, Cancer Treat Rev 2011; Brown & Coleman, Nat Rev Clin Oncol 2012; 9:110-8）。ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）に特異的に結合する完全ヒト化モノクローナル抗体であるデノスマブは破骨細胞の形成を阻害し、これにより、骨破壊を減少させる（Brown & Coleman, Nat Rev Clin Oncol 2012; 9:110-8）。しかしながら、これらの処置は対症療法的にすぎず、しばしば有害な副作用を伴う。従って、癌細胞が骨髄に定着して転移が形成される初期に癌細胞を標的化する薬物を開発するために、明らかな骨病変の発症以前に起こる分子機序をより良く理解することが重要である。

発明の要約：
本発明は、骨転移の治療のための方法及び医薬組成物に関する。

発明の詳細な説明：
本発明者らは、ＲＯＢＯ受容体が播種性腫瘍細胞（ＤＴＣ）の機能を支援し、これによりこれらの細胞が骨髄で順応しかつ栄えることを可能とすると推測する。骨にのみ転移するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株の亜個体群であるヒトＢ０２乳癌細胞を使用した、遺伝子発現マイクロアレイ分析は、ＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ４が、親細胞で観察されたものと比較して、Ｂ０２細胞において有意に過剰発現されていたことを示した。ＲＯＢＯ２及びＲＯＢＯ３はどちらの細胞株においても発現されていなかった。それ故、Ｂ０２乳癌転移におけるＲＯＢＯ１／ＲＯＢＯ４の機能的役割を、これらの各受容体に標的化するｓｈＲＮＡを使用して評価した。腫瘍抑制遺伝子としてのその役割と一致して、ＲＯＢＯ１のサイレンシングは、インビトロにおいてｓｈＲＯＢＯ１クローンの遊走特性及び浸潤特性を増強し、また、それは動物におけるｓｈＲＯＢＯ１腫瘍異種移植片の増殖を増加させた。さらに、ＲＯＢＯ１のサイレンシングは、エクスビボにおいて骨髄の微小転移の形成を促進した。著しく対照的には、ＲＯＢＯ４のサイレンシングは、インビトロにおいてｓｈＲＯＢＯ４乳癌細胞の遊走及び浸潤を阻止し、インビボにおける同所性腫瘍増殖を減少させ、エクスビボにおける骨髄の微小転移の形成を減少させた。従って、データは、骨髄微小転移形成におけるＲＯＢＯ受容体の以前には知られていなかった機能を明らかとし、ＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ４は逆の機能を有することを明らかとした。

従って、本発明は、必要とする被験体における骨転移を予防又は治療するための方法に使用するための抗ＲＯＢＯ４抗体、抗ＲＯＢＯ４アプタマー、ＲＯＢＯ４デコイポリペプチド、ＲＯＢＯ４発現阻害剤からなる群より選択される物質に関する。

本明細書において互換的に使用される「被験体」及び「患者」という用語は、癌、例えば前立腺癌、乳癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌及び乳癌を患う、哺乳動物、特にヒトを指す。

本明細書において使用される「ＲＯＢＯ４」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、細胞表面膜貫通タンパク質Roundabout４を示す。ＲＯＢＯ４は初めて軸索ガイダンス受容体タンパク質として記載され、そのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列はＧｅｎＢａｎｋＩＤに開示されている［アクセッション番号ＡＦ３６１４７３］。

本明細書において使用される「抗体」は、天然及び非天然の抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びにその一価及び二価フラグメントを含む。さらに、「抗体」は、キメラ抗体、完全合成抗体、一本鎖抗体、及びそのフラグメントを含む。前記抗体はヒト抗体又は非ヒト抗体であり得る。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を低下させるために組換え法によってヒト化されていてもよい。

抗体は、従来の方法に従って調製され得る。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein（Nature, 256:495, 1975）の方法を使用して生成され得る。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウス又は他の適切な宿主動物を、適切な間隔で（例えば１週間に２回、１週間に１回、１か月に２回、又は１か月に１回）抗原性型のＲＯＢＯ４を用いて免疫する。動物に、屠殺１週間以内に抗原の最終「ブースト」を投与し得る。免疫の際に免疫アジュバントを使用することがしばしば望ましい。適切な免疫アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ｒｉｂｉアジュバント、Hunter's Titermax、サポニンアジュバント、例えばＱＳ２１若しくはクイルＡ、又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられる。他の適切なアジュバントは当技術分野において周知である。動物を、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は他の経路によって免疫し得る。所与の動物を、複数の経路によって複数の形態の抗原を用いて免疫し得る。

簡潔に言えば、組換え型のＲＯＢＯ４は、任意の以前に記載されている方法を使用して提供され得る。免疫計画後、リンパ球を、動物の脾臓、リンパ節又は他の臓器から単離し、ポリエチレングリコールなどの物質を使用して適切な骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。融合後、細胞を、記載されているような標準的な方法を使用して、ハイブリドーマの増殖に許容されるが融合対の増殖は許容されない培地に入れる（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）。ハイブリドーマの培養後、細胞上清を、所望の特異性の抗体、すなわち、抗原に選択的に結合する抗体の存在について分析する。適切な分析技術としては、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降法及びウェスタンブロットが挙げられる。他のスクリーニング技術も当技術分野において周知である。好ましい技術は、コンフォメーション的にインタクトな天然に折り畳まれた抗原と抗体との結合を確認する技術、例えば非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降法である。

重要なことには、当技術分野において周知であるように、抗体分子のほんの小さな部分、すなわちパラトープが、抗体とそのエピトープとの結合に関与している。Ｆｃ’及びＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原との結合には関与していない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された又はｐＦｃ’領域を含まないように産生された抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントと称されるが、インタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された又はＦｃ領域を含まないように産生された抗体は、Ｆａｂフラグメントと称されるが、インタクトな抗体分子の一方の抗原結合部位を保持する。さらに加工すると、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖及びＦｄと称される抗体重鎖の一部からなる。Ｆｄフラグメントは抗体特異性の主要な決定基であり（単一のＦｄフラグメントは、抗体の特異性を改変させることなく、１０個以下の異なる軽鎖と会合し得る）、Ｆｄフラグメントは単独でエピトープ結合能を保持する。

抗体の抗原結合部位内には、当技術分野において周知であるように、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び、パラトープの３次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両方において、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１からＣＤＲＳ）によって隔てられた４つのフレームワーク領域（ＦＲ１からＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲＳ領域、より特定すると重鎖ＣＤＲＳは主に、抗体特異性に関与する。

哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域を、元来の抗体のエピトープ特異性を維持しつつ、同種又は異種特異的抗体の類似領域を用いて置換し得ることが当技術分野において現在十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲをヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合させて機能的抗体が産生される「ヒト化」抗体の開発及び使用に最も明瞭に顕現している。

本発明は、特定の実施態様において、ヒト型の抗体を含む組成物及び方法を提供する。本明細書に使用される「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のいくつか、殆ど又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸で置換された抗体を記載する。ヒト化の方法としては、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号及び第５，８５９，２０５号に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されず、これらは、参照により本明細書に組み入れられる。上記の米国特許第５，５８５，０８９号及び第５，６９３，７６１号並びに国際公開公報第９０／０７８６１号もまた、ヒト化抗体の設計に使用され得る４つの見込みある基準を提案する。第１の提案は、アクセプターについて、ヒト化しようとするドナー免疫グロブリンに対して珍しく相同である特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用すること、又は多くのヒト抗体由来の共通フレームワークを使用することであった。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が異常であり、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列にとって典型的である場合、アクセプターではなくむしろドナーアミノ酸を選択し得るということであった。第３の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤＲのすぐ隣の位置に、アクセプターアミノ酸ではなくむしろドナーアミノ酸を選択し得るというものであった。第４の提案は、アミノ酸が抗体の３次元モデルにおいてＣＤＲの３Å以内に側鎖原子を有すると予測され、ＣＤＲと相互作用することができると予測されるフレームワーク位置に、ドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記の方法は当業者がヒト化抗体を作成するために使用することができるいくつかの方法の単なる例である。当業者は、抗体のヒト化のための他の方法も知っているだろう。

ヒト型の抗体の１つの実施態様において、ＣＤＲ領域外のいくつか、殆ど又は全てのアミノ酸が、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されているが、１つ以上のＣＤＲ領域内のいくつか、殆ど又は全てのアミノ酸は不変である。アミノ酸の僅かな付加、欠失、挿入、置換又は修飾は、それらが所与の抗原と抗体が結合する能力を消失しない限り許容可能である。適切なヒト免疫グロブリン分子としては、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭの分子が挙げられる。「ヒト化」抗体は、元来の抗体と類似した抗原特異性を保持する。しなしながら、特定のヒト化法を使用して、抗体の結合の親和性及び／又は特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999（その内容は参照により本明細書に組み入れられる）によって記載されているような「指向的進化」法を使用して増加させ得る。

完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックであるマウスを免疫することによって調製することができる。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５９８，３６９号、第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号、第６，１５０，５８４号、及びその中に引用されている文献（その内容は参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。これらの動物は、内因性（例えばマウス）抗体の産生が機能的に欠失するように遺伝子的に改変されている。動物は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むようにさらに改変され、よって、これらの動物の免疫により、対象の抗原に対する完全なヒト抗体が産生される。これらのマウス（例えばXenoMouse (Abgenix)、 HuMAbマウス (Medarex/GenPharm)) の免疫後、モノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製することができる。これらのモノクローナル抗体はヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、それ故、ヒトに投与した場合にヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘起しない。

ヒト抗体を産生するためのインビトロの方法も存在する。これらは、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号）及びヒトＢ細胞のインビトロでの刺激（米国特許第５，２２９，２７５号及び第５，５６７，６１０号）を含む。これらの特許内容は参照により本明細書に組み入れられる。

従って、当業者には明らかであろうように、本発明はまた、Ｆ（ａｂ’）２ Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦｄフラグメント；キメラ抗体（Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒト又は非ヒト配列によって置換されている）；キメラＦ（ａｂ’）_２フラグメント抗体（ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒト又は非ヒト配列によって置換されている）：キメラＦａｂフラグメン抗体（ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒト又は非ヒト配列によって置換されている）；及びキメラＦｄフラグメント抗体（ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が相同ヒト又は非ヒト配列によって置換されている）を提供する。本発明また、いわゆる一本鎖抗体も含む。

種々の抗体分子及びフラグメントは、ＩｇＡ、分泌ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含むがこれらに限定されない、一般的に知られている免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。ＩｇＧサブクラスも当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない。

別の実施態様において、本発明による抗体は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）すなわち「ＶＨＨ」という用語は、軽鎖を天然的に欠失しているラクダ科哺乳動物に見出すことができる種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨはまた、「ナノボディ（登録商標）」とも呼ばれる。本発明によると、ｓｄＡｂは特にラマｓｄＡｂであり得る。

本明細書において使用される「アプタマー」という用語は、分子認識の点で抗体の代替物を表すクラスの分子である。アプタマーは、実質的にあらゆるクラスの標的分子を高い親和性及び特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列又はオリゴペプチド配列である。従って、「抗ＲＯＢＯ４アプタマー」という用語は、ＲＯＢＯ４に対して指向されるアプタマーを指す。アプタマーは、ランダム配列ライブラリーのSystematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)を通して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビトナトリアル化学合成によって得ることができる。

１つの実施態様において、該物質は、ＲＯＢＯ４のリガンドを捕捉することができ、従ってその活性化を防ぐことのできるＲＯＢＯ４デコイポリペプチドである。典型的には、ＲＯＢＯ４デコイポリペプチドは、ＲＯＢＯ４の細胞外ドメインの全部又は一部を含み、それ故、可溶形のＲＯＢＯ４を含む。適切な可溶形のＲＯＢＯ４は、例えば、膜貫通ドメインが化学的方法、タンパク質分解的方法又は組換え法によって除去された切断短縮形のタンパク質を含み得る。好ましくは、該ポリペプチドは、ＲＯＢＯ４に対して少なくとも８０％相同である。好ましい実施態様において、該ポリペプチドは、例えばPileup配列分析ソフトウェア（Program Manual for the Wisconsin Package, 1996）などの任意の慣用的な分析アルゴリズムによって評価されるように少なくとも９０％相同である。

特定の実施態様において、ＲＯＢＯ４デコイポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合させたＲＯＢＯ４の細胞外ドメインの全部又は一部を含む。該融合タンパク質のＦｃドメインは、以下の少なくとも１つの目的を果たす：該融合タンパク質を産生する細胞からの融合タンパク質の分泌、ＲＯＢＯ４のリガンドを捕捉するように機能する形態（例えば折り畳まれた状態又は凝集状態）でＲＯＢＯ４の細胞外ドメインを与えること、該融合タンパク質のアフィニティ精製、抗体による融合タンパク質の認識、医薬品として使用される場合に融合タンパク質に対して好ましい特性を付与すること。適切な免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。ＩｇＧ及びＩｇＡが好ましく、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１が最も好ましい。該Ｆｃドメインは完全Ｆｃドメイン又はその機能保存的変異体であり得る。Ｆｃの変異体は、それが上記に列挙された機能の少なくとも１つを保持するならば機能保存的である。本発明の融合タンパク質のドメインは、リンカーによって連結されていてもよい。リンカーは約１〜１００、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基からなり得る。

本発明のポリペプチドは、当業者には明らかであろうように、任意の適切な手段によって産生され得る。本発明に従って使用するための十分な量のポリペプチドを産生するために、本発明のポリペプチドを含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、簡便に発現が達成され得る。好ましくは、該ポリペプチドは、組換え手段によって、コード核酸分子からの発現によって産生される。多種多様な宿主細胞においてポリペプチドをクローニング及び発現するための系は周知である。組換え形で発現される場合、該ポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞においてコードされている核酸からの発現によって生成される。特定の系の個々の必要条件に依存して、任意の宿主細胞を使用し得る。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当技術分野において利用できる哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、及び多くのその他が挙げられる。細菌を操作及び増殖させ易いために、細菌もまた組換えタンパク質の産生のための好ましい宿主である。一般的で好ましい細菌宿主は大腸菌（E.coli）である。

特定の実施態様において、本発明の治療法に使用されるポリペプチドは、その治療効力を改善するために改変され得ると考えられる。このような治療化合物の改変を使用して、毒性を減少させるか、循環時間を増加させるか、又は生体内分布を改変させ得る。例えば、重要である可能性のある治療化合物の毒性を、生体内分布を改変させる多種多様な薬物担体ビヒクルと組み合わせることによってかなり減少させ得る。例えばジペプチドの付加は、内因性輸送体を使用することによる循環剤の血液網膜関門を通した眼内への浸透を改善し得る。

薬物の存続性を改善させるための戦略は、水溶性ポリマーの使用である。種々の水溶性ポリマーが、生体内分布を改変させ、細胞による取り込みの様式を改善させ、生理学的障壁を通る透過性を変化させ、体内からの消失速度を改変することが示された。標的化効果又は徐放性効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上の吊り下がった基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成された。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その高い生体適合性及び改変のし易さから、薬物担体として広く使用されている。種々の薬物、タンパク質、及びリポソームへの付着は、滞留時間を改善させ、毒性を低減させることが示された。ＰＥＧを、鎖の末端のヒドロキシル基を通して、及び他の化学的方法を介して活性物質に結合させ得るが；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子あたり最大で２個の活性物質に制限される。異なるアプローチにおいて、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマーは、ＰＥＧの生体適合特性を保持するが１分子あたり多くの付着点を有し（より多くの薬物が負荷される）、多種多様な適用に適するように合成的に設計することができるというさらなる利点を有する、新規な生体材料として検討された。

当業者は、薬物の効果的な改変のためのＰＥＧ化技術を知っている。例えば、ＰＥＧと三機能性モノマー（例えばリジン）の交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーがVectraMed (Plainsboro, N.J.)によって使用された。ＰＥＧ鎖（典型的には２０００ダルトン以下）が、安定なウレタン結合を通して、リジンのａ−及びｅ−アミノ基に連結している。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って厳密に制御されかつ既定された間隔で反応性の吊り下がった基（リジンのカルボン酸基）を与えつつ、ＰＥＧの所望の特性を保持する。反応性の吊り下がった基は、誘導体化、架橋、又は他の分子とのコンジュゲーションのために使用することができる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーの間の切断可能な連結を変化させることによって、安定で長時間循環するプロドラッグを産生するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔、及びコンジュゲートの分子量あたりの薬物の量（ＰＥＧセグメントが小さければ小さいほど、より多くの薬物が負荷される）に影響を及ぼす。一般的には、ブロックコポリマーコンジュゲートの全分子量の増加は、コンジュゲートの循環半減期を増加させるだろう。それにも関わらず、コンジュゲートは容易に分解可能であるか、又は糸球体ろ過限界閾値未満の分子量（例えば、４５kDa未満）を有するかのいずれかでなければならない。

さらに、ポリマー骨格が循環半減期及び生体内分布を維持するのに重要であるので、特異的トリガー、典型的には標的化組織における酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまで、治療剤をプロドラッグ形で維持するために、リンカーを使用し得る。例えば、この種類の組織活性化薬物送達は、特定の生体内分布部位への送達が必要とされ、治療剤が病態部位に又は病態部位の近くに放出される場合に特に有用である。活性化薬物送達に使用するための連結基ライブラリーは当業者には公知であり、酵素動態、活性酵素の普及、及び選択された疾病特異的酵素の切断特異性に基づき得る。このようなリンカーは、治療薬送達のために本明細書に記載されたタンパク質又はタンパク質フラグメントを改変するのに使用され得る。

「ＲＯＢＯ４発現阻害剤」は、ＲＯＢＯ４遺伝子の発現を阻害又は有意に減少させる生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。

本発明に使用するための発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づき得る。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＯＢＯ４ｍＲＮＡに結合し、よってタンパク質の翻訳を妨げるか、又はｍＲＮＡの分解を増加させ、よって細胞中のＲＯＢＯ４のレベル及び従って活性を減少させることによって、ＲＯＢＯ４ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用する。例えば、少なくとも約１５塩基であり、ＲＯＢＯ４をコードするｍＲＮＡ転写物配列の独特な領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば慣用的なホスホジエステル技術によって合成し、例えば静脈内注射又は点滴によって投与することができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号参照)。

低分子阻害的ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）はまた、本発明に使用するための発現阻害剤として機能し得る。ＲＯＢＯ４遺伝子発現は、対象又は細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクター若しくは構築物と接触させることによって減少させることができ、よって、ＲＯＢＯ４の遺伝子発現は、特異的に阻害される（すなわちＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉ）。配列が公知である遺伝子のための、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡコードベクターを選択するための方法は当技術分野において周知である（例えば、Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び第６，５０６，５５９号；並びに、国際特許公開公報第０１／３６６４６号、国際公開公報第９９／３２６１９号及び国際公開公報第０１／６８８３６号を参照されたい）。本発明のｓｉＲＮＡのホスホジエステル結合の全部又は一部は、有利には保護されている。この保護は、一般的には、当技術分野において公知の方法を使用して化学的経路を介して行なわれる。ホスホジエステル結合は、例えば、チオール又はアミン保護基によって又はフェニル基によって保護され得る。本発明のｓｉＲＮＡの５’及び／又は３’末端も有利には、例えば、ホスホジエステル結合を保護するために上記された技術を使用して保護される。ｓｉＲＮＡ配列は、有利には、少なくとも１２個の連続したジヌクレオチド又はその誘導体を含む。

本明細書において使用される、本発明の核酸配列に関する「ｓｉＲＮＡ誘導体」という用語は、エリスロポエチン又はそのフラグメントに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、一例として少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９８％の同一率を有する核酸を指す。

本明細書において使用される２つの核酸配列間の「同一率」は、比較しようとする２つの配列の最善のアラインメントを用いて得られた、比較しようとする２つの配列間の同一核酸の比率を意味し、この比率は純粋に統計学的であり、これらの２つの配列間の相違は、核酸配列上にランダムに広がっている。本明細書において使用される「最善のアラインメント」又は「最適なアラインメント」は、決定された同一率（以下参照）が最高であるアラインメントを意味する。２つの核酸配列間の配列比較は、通常、最善のアラインメントに従って以前にアラインさせたこれらの配列を比較することによって実現され、この比較は比較セグメント上で実現され、これにより、類似性を有する局所領域が同定及び比較される。比較を実施するための最善の配列アラインメントは、手作業による方法の他に、SMITH及びWATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981)によって開発された全体的相同性アルゴリズムを使用することによって、NEDDLEMAN及びWUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970)によって開発された局所相同性アルゴリズムを使用することによって、PEARSON及びLIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988)によって開発された類似性の方法を使用することによって、このようなアルゴリズム（ウィスコンシンジェネティックソフトウェアパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison, WI USA）を使用したコンピューターソフトウェアを使用することによって、ＭＵＳＣＬＥマルチプルアラインメントアルゴリズム（Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004）を使用することによって実現され得る。最善の局所アラインメントを得るために、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウェアを使用することができる。２つの核酸配列間の同一率は、最適にアラインさせたこれらの２つの配列を比較することによって決定され、核酸配列は、これらの２つの配列間に最適なアラインメントを得るために、参照配列に対して付加又は欠失を含むことができる。同一率は、これらの２つの配列間の同一の位置の数を決定し、この数を比較した位置の総数で割り、得られた結果に１００をかけることによって計算され、これにより、これらの２つの配列間の同一率が得られる。

ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）もまた本発明に使用するための発現阻害剤として機能することができる。

リボザイムもまた、本発明に使用するための発現阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することのできる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のヌクレオチド鎖切断を含む。それ故、ＲＯＢＯ４ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒する工学操作されたヘアピン型またはハンマーヘッド型モチーフのリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。あらゆる可能性あるＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は最初に、標的分子を、典型的には以下の配列（ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣ）を含むリボザイム切断部位について走査することによって同定される。一旦同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２０のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものとし得る二次構造などの予測される構造特徴について評価することができる。

発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの両方が、公知の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホルアマダイト化学合成などによる化学合成技術を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボでの転写によって生成し得る。このようなＤＮＡ配列を、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する種々の改変を、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入することができる。可能な改変としては、分子の５’及び／又は３’末端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド骨格内でのホスホジエステラーゼ結合ではなくむしろ、ホスホロチオエート又は２’−Ｏ−メチルの使用が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びリボザイムは、インビボにおいて単独で又はベクターと結合させて送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸の、細胞への、好ましくはＲＯＢＯ４を発現している細胞への導入を促進することのできる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で得られるであろう分解度と比べて分解度を低減させつつ、核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明に有用なベクターとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は組み込みによって操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス源又は細菌源に由来する他のビヒクルが挙げられるがこれらに限定されない。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、これには、以下のウイルスに由来する核酸配列が含まれるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス等のレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びレトロウイルス等のＲＮＡウイルス。命名されていないが当技術分野において公知である他のベクターも容易に使用することができる。

好ましいウイルスベクターは、必須ではない遺伝子が対象の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスとしてはレトロウイルス（例えばレンチウイルス）が挙げられ、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写、その後の宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法試験のために承認されている。最も有用なのは、複製欠損であるレトロウイルスである（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令できるが、感染性粒子は製造できない）。このような遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボにおける遺伝子の高効率の形質導入のための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（外来性遺伝子材料をプラスミドに組み込む工程、パッケージング細胞株をプラスミドでトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株により組換えレトロウイルスを産生する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、及び標的細胞をウイルス粒子で感染させる工程を含む）は、Kriegler, 1990及びMurry, 1991に提供される。

特定の適用のための好ましいウイルスは、アデノウイルス及びアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスであり、これらは遺伝子療法のヒトへの使用にすでに承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。実際に１２個の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が知られており、各々が異なる組織指向性を有する（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。組換えＡＡＶは、依存性パルボウイルスＡＡＶ２に由来する（Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07）。アデノ随伴ウイルス１〜１２型を、複製欠損となるように工学操作することができ、多種多様な細胞型及び細胞種に感染させることができる（Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27）。それはさらに、熱及び脂質溶媒に対する安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い形質導入頻度；並びに、重複感染阻害がなく、従って、複数回の形質導入が可能となるなどの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスを、ヒト細胞ＤＮＡに部位特異的に組み込むことができ、これにより、レトロウイルス感染に特徴的な挿入突然変異及び挿入遺伝子発現のばらつきの可能性が最小限となる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００回を超える継代に及び組織培養中で続けられ、このことは、アデノ随伴ウイルスゲノム組込みが、相対的に安定した事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外で機能することができる。

他のベクターはプラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において十分に記載されており、当業者には公知である。例えば、Sambrook et al., 1989を参照されたい。過去数年間において、プラスミドベクターは、抗原をコードする遺伝子をインビボで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。それらは、多くのウイルスベクターと同じ安全性の懸念を有さないために、ワクチンに特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性であるプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内に作動可能にコードされた遺伝子からのペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは当業者には周知である。さらに、プラスミドは、制限酵素及びライゲーション反応を使用してカスタム設計され、これにより、特定のＤＮＡフラグメントを除去及び付加することができる。プラスミドは、多種多様な経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路によって注射され得る。プラスミドは、水溶液中で与えられ得るか、金粒子上に乾燥させ得るか、又は別のＤＮＡ送達システム（リポソーム、デンドリマー、コクリエート及びマイクロカプセル封入を含むがこれらに限定されない）と会合させ得る。

好ましい実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸配列は、異種調節領域、例えば異種プロモーターの制御下にある。

本発明の物質は、以下に定義されているような、医薬組成物の形態で投与され得る。好ましくは前記物質を治療有効量で。「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で疾病を処置するのに十分な量の物質を意味する。前記物質又はそれを含む医薬組成物の全１日量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されると理解される。任意の特定の被験体のための具体的な治療有効投与量レベルは、処置される疾患及び疾患の重度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物；被験体の年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食事；使用される具体的な物質の投与時刻、投与経路、及び***速度；処置期間；使用される具体的な物質と組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに、医学分野において周知の同様な因子を含む、多種多様な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで該物質の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで次第に用量を増加させることは十分に当業者の技能範囲内である。しかしながら、該物質の１日量は、１日あたり１人の成人あたり０．０１〜１，０００mgまで幅広い範囲で変化し得る。好ましくは、該組成物は、処置しようとする被験体への投与量の症候による調整のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの物質を含む。医薬品は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含む。有効量の薬物は、通常、１日あたり０．０００２mg/kgから約２０mg/kg（体重）、特に１日あたり約０．００１mg/kgから７mg/kg（体重）の投与量レベルで供給される。

特定の実施態様において、本発明の物質は、ビスホスホネート及び／又は抗ＲＡＮＫＬ抗体（例えばデノスマブ）と組み合わせて使用され得る。

従って、本発明の物質は、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、又はビヒクルをさらに含む医薬組成物へと製剤化され得る。１つの実施態様において、本発明は、上記したような本発明の物質、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント又はビヒクルを含む、医薬組成物に関する。１つの実施態様において、本発明は、有効量の本発明の物質又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント又はビヒクルを含む、医薬組成物である。薬学的に許容される担体は、例えば、目的の投与形に関して適切に選択され、かつ従来の薬務に一致する、薬学的な希釈剤、賦形剤又は担体を含む。

薬学的に許容される担体は、前記物質の生物学的活性を過度に阻害しない不活性成分を含み得る。薬学的に許容される担体は、被験体への投与時に、生体適合性、例えば、無毒性、非炎症性、非免疫原性であるべきであるか、又は他の望ましくない反応若しくは副作用を欠くべきである。標準的な医薬製剤技術が使用され得る。

本明細書において使用される薬学的に許容される担体、アジュバント又はビヒクルは、所望の特定の剤形に適した、任意及び全ての溶媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散助剤又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などを含む。Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)は、薬学的に許容される組成物の製剤化に使用される様々な担体、及びその調製のための公知の技術を開示する。任意の慣用的な担体媒体が、例えば任意の望ましくない生物学的作用を生じることによって、又はさもなくば薬学的に許容される組成物の任意の他の成分（群）と有害な様式で相互作用することによって、本明細書に記載の化合物と不適合性でない限り、その使用は本発明の範囲内であると考えられる。

薬学的に許容される担体として作用することのできる材料のいくつかの例としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えばヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えばtwin80、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、又はソルビン酸カリウム）、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質（例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム又は亜鉛塩）、コロイド状シリカ、トリケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックコポリマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、羊毛脂、糖、例えば乳糖、ブドウ糖、及びショ糖；デンプン、例えばコーンスターチ及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバター及び坐剤ワックス；油、例えばピーナッツ油、綿実油；ベニバナ油；ゴマ油；オリーブ油；コーン油及び大豆油；グリコール；例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；アガー；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール、及びリン酸緩衝溶液、並びに、他の無毒性の適合性の潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムが挙げられるがこれらに限定されず、並びに、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤も、製剤者の判断に従って組成物中に存在していてもよい。

本明細書に記載の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸に、鼻腔内、頬側に、膣内に、又は埋め込まれたレザーバーを介して、処置される疾病の重度に依存して投与され得る。本明細書において使用される「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内注射又は注入技術を含むがこれらに限定されない。

本明細書に記載の組成物の無菌注射剤形は、水性又は油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、当技術分野において公知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射調製物はまた、無毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール溶液であり得る。使用され得る許容されるビヒクル又は溶媒には、水、リンガー液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒又は懸濁化媒体として慣用的に使用される。この目的のために、合成モノ又はジグリセリドを含む、任意の無菌の不揮発性油を使用し得る。脂肪酸、例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体が、天然の薬学的に許容される油、例えばオリーブ油又はヒマシ油、特にそのポリオキシエチル化形の油と同様に注射液の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液はまた、乳剤及び懸濁剤をはじめとする薬学的に許容される剤形の製剤化に一般的に使用される、長鎖アルコールの希釈剤又は分散剤（例えばカルボキシメチルセルロース）又は類似の分散剤を含み得る。薬学的に許容される固体剤形、液体剤形又は他の剤形の製造に一般的に使用される、他の一般的に使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ及び他の乳化剤又はバイオアベイラビリティ増強剤もまた、製剤化のために使用され得る。

本明細書に記載の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤又は液剤を含むがこれらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用される担体は、乳糖及びコーンスターチを含むがこれらに限定されない。潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもまた、典型的には添加される。カプセル剤形での経口投与のために有用な希釈剤としては、乳糖及び乾燥トラガカントが挙げられる。水性懸濁液が経口使用のために必要とされる場合、前記物質は、乳化剤及び懸濁化剤と配合される。所望であれば、特定の甘味剤、香味剤又は着色剤も添加され得る。

あるいは、本明細書に記載の医薬組成物は、直腸投与のために坐剤の剤形で投与され得る。これらは、前記物質を適切な非刺激性の賦形剤（これは室温で固体であるが、直腸の温度では液体であり、それ故、直腸内で融解して薬物を放出する）と混合することによって調製され得る。このような材料としては、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない。

本発明のさらなる態様は、ｉ）癌患者から得られた試料中のＲＯＢＯ４発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルを既定の参照レベルと比較する工程、ｉｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルが既定の参照レベルよりも高い場合には、該患者は骨転移を有する高いリスクを有すると結論付ける工程を含む、該癌患者が骨転移を有するリスクがあるかどうかを試験する方法に関する。

本明細書において使用される「試料」という用語は、患者の原発性腫瘍から単離された試料を指し得るか、又は、患者から得られた血液試料から単離された循環中の腫瘍細胞の収集物からなり得る。

ＲＯＢＯ４の発現レベルの決定は、多種多様な周知の方法のいずれかによって評価され得る。

例えば、ＲＯＢＯ４をコードする遺伝子の発現は、該遺伝子のｍＲＮＡ転写物又はｍＲＮＡ前駆体、例えば新生ＲＮＡの発現を分析することによって評価される。該分析は、患者から得られた試料中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを調製し、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをプローブとハイブリダイズさせることによって評価され得る。調製されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡは、サザン又はノザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析、例えば定量ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）、及びプローブアレイ、例えばGene Chip（登録商標）DNAアレイ（AFFYMETREX）を含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用され得る。有利には、ＲＯＢＯ４をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現レベルの分析は、例えばＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号に示された実験態様）、リガーゼ連鎖反応（BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991）、自己維持配列複製（GUATELLI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.57, p: 1874-1878, 1990）、転写増幅システム（KWOH et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989）、Ｑ−βレプリカーゼ（LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988）、ローリングサークル複製（米国特許第５，８４３，０３３号）、又は任意の他の核酸増幅法によるなどの、核酸増幅プロセス、続いて、当業者に周知の技術を使用した増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数存在する場合には、核酸分子の検出に特に有用である。本明細書において使用される増幅プライマーは、遺伝子（それぞれプラス鎖及びマイナス鎖、又はその逆）の５’又は３’領域にアニーリングすることができ、かつその間の短い領域を含む、一対の核酸分子であると定義される。一般的に、増幅プライマーは、約１０から３０ヌクレオチド長であり、約５０〜２００ヌクレオチド長の領域にフランキングする。適切な条件下で適切な試薬を用いて、このようなプライマーは、プライマーによってフランキングされるヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能とする。

別の好ましい態様において、試料中のＲＯＢＯ４の発現レベルは、ＲＯＢＯ４を発現する癌細胞の数及び／又は癌細胞の表面におけるＲＯＢＯ４のレベルを決定することによって評価され得る。細胞表面における特異的表面マーカーの発現を検出するための標準的な方法は、当技術分野において周知である。典型的には、癌細胞表面においてＲＯＢＯ４のレベルを測定することからなる工程は、癌細胞の個体群を回収すること、及び、ＲＯＢＯ４に対して指向される少なくとも１つの鑑別的な結合パートナーを使用することからなり得、癌細胞は、結合パートナーによってＲＯＢＯ４に結合している。本明細書において使用される「ＲＯＢＯ４に対して指向される結合パートナー」は、高い親和性でＲＯＢＯ４に結合することのできる任意の分子（天然又は非天然）を指す。該結合パートナーは、抗体、アプタマー及びペプチドを含むがこれらに限定されない。結合パートナーは、ＲＯＢＯ４に対して特異的に指向された、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る抗体であり得る。

本発明のポリクローナル抗体又はそのフラグメントは、例えばブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びマウスからとりわけ選択された宿主動物に、適切な抗原又はエピトープを投与することによって既知の方法に従って産生され得る。当技術分野において公知の様々なアジュバントを使用して抗体産生を増強することができる。本発明を実施するのに有用な抗体は、ポリクローナルであってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。本発明のモノクローナル抗体又はそのフラグメントは、培養液中の継代細胞株による抗体分子の産生を与える任意の技術を使用して調製及び単離され得る。産生及び単離のための技術としては、元来のハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の結合パートナー、例えば抗体又はアプタマーを、検出可能な分子又は物質、例えば優先的には蛍光分子又は放射性分子、又は当技術分野において公知の任意の他の標識で標識し得る。一般的にシグナルを与える（直接的に又は間接的にいずれかで）標識は当技術分野において公知である。本明細書において使用される抗体又はアプタマーに関して「標識された」という用語は、検出可能な物質、例えばフルオロフォア［例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はヨードシアニン（Ｃｙ５）］又は放射性物質を抗体又はアプタマーにカップリング（すなわち物理的に連結）させることによる直接的な抗体又はアプタマーの標識、並びに、検出可能な物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的な標識を包含することを意味する。本発明の抗体又はアプタマーは、当技術分野において公知の任意の方法によって放射性分子で標識され得る。例えば、放射性分子としては、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８などのシンチグラフィー研究のための放射性原子が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、抗体はすでにフルオロフォアにコンジュゲート（例えばＦＩＴＣにコンジュゲート及び／又はＰＥにコンジュゲート）している。

前記のアッセイは、固相支持体への結合パートナー（すなわち抗体又はアプタマー）の結合を含み得る。固相表面は、結合パートナーでコーティングされたマイクロタイタープレートであり得る。試料をインキュベートした後、ＲＯＢＯ４を発現する癌細胞は、結合パートナーに特異的に結合した。あるいは、固相表面は、ビーズ、例えば活性化ビーズ、磁気応答性ビーズであり得る。ビーズは、ガラス、プラスチック、ポリスチレン、及びアクリルを含むがこれらに限定されない種々の材料から作製され得る。さらに、ビーズは、好ましくは蛍光標識されている。好ましい実施態様において、蛍光ビーズは、Becton Dickinson Biosciences, (San Jose, California)から入手可能なTruCount（登録商標）チューブに含まれるものである。本発明によると、フローサイトメトリー法が、細胞表面におけるＲＯＢＯ４レベルを測定する好ましい方法である。該方法は当技術分野において周知である。例えば、それ故、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が使用され得る。

１つの実施態様において、既定の参照値は、骨転移発生に関する、指標値であり得るか、又は１つ以上のリスク予測アルゴリズムから導かれ得るか、又はコンピューターで算出された指数であり得る。既定の参照値は、個体群の研究から導かれた数又は値に対する相対的なものであり得る。このような既定の参照値は、数学的アルゴリズム及びコンピューターで算出された転移発生指数から得られた、個体群の統計分析及び／又はリスク予測データから導かれ得る。本発明の１つの実施態様において、既定の参照値は、骨転移を発生しなかった１人以上の被験体から得られた対照試料におけるＲＯＢＯ４の発現レベルから導かれる。別の実施態様において、各被験体を、このような試験の後、診断的に関連した期間をかけてモニタリング及び／又は周期的に再検査し（「縦断的研究」）、骨転移の不在が継続されていることを確認する。このような期間は、参照値を決定した最初の試験日から、１年間、２年間、２〜５年間、５年間、５〜１０年間、１０年間、又は１０年間以上であり得る。さらに、適切に預けられた歴史的な被験体試料におけるＲＯＢＯ４の発現レベルの遡及的な測定が、これらの既定参照値の確立に使用され得、よって必要とされる研究時間が短縮され得る。典型的には、骨転移を有するリスクのある患者におけるＲＯＢＯ４のレベルは、骨転移を決して発生しない患者から得られた参照値よりも高いと見なされる。

本発明はまた、ｉ）被験体から得られた試料中のＲＯＢＯ４発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルを既定の参照レベルと比較する工程、ｉｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルが既定の参照レベルよりも高い場合に、被験体が骨転移を有するリスクが高いと結論付ける工程、及びｉｖ）骨転移を有するリスクが高い被験体に、抗ＲＯＢＯ４抗体、抗ＲＯＢＯ４アプタマー、ＲＯＢＯ４デコイポリペプチド、ＲＯＢＯ４発現阻害剤からなる群より選択される物質を投与する工程を含む、被験体が骨転移を有するリスクがあるかどうかを試験することを含む、それを必要とする被験体における骨転移を予防又は治療する方法に関する。

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。

原発性乳腺腫瘍におけるＲＯＢＯ４発現は、無再発生存期間の悪い予後に関連している。（Ａ）カプランマイヤーは、ＲＯＢＯ１状態に従って、２５４人の乳癌患者における無再発生存率を推定する。（Ｂ）（Ａ）と同様であるが、症例はＲＯＢＯ４の状態に従って分類されている。（Ｃ）ＲＯＢＯ４の状態による、１３７人のリンパ節陽性（ｐＮ＋）乳癌患者における無再発生存率。（Ｄ）（Ｃ）と同様であるが、無骨転移生存率について。 Ｓｈ−又はＳｃ−Ｒｏｂｏ４トランスフェクタントを、動物の尾動脈に接種した。腫瘍細胞の接種後の２８日目に、骨病変をＸ線検査、組織学的検査及びＴＲＡＰ染色によって分析した。各群における骨病変の代表的な画像を、左手側に示す。定量データを右手側に示す。 ＭＣＳＦ＋ＲＡＮＫＬ、及びＲＯＢＯ１又はＲＯＢＯ４についてサイレンシングされた乳癌細胞からの馴化培地で処置されたマウス骨髄細胞のインビトロにおける破骨細胞の形成。成熟破骨細胞は、多核ＴＲＡＰ陽性細胞として定量された。各群についての成熟破骨細胞の代表的な画像が示されている。 （Ａ）細胞遊走アッセイ。ＲＯＢＯ１（左側）又はＲＯＢＯ４（右側）についてサイレンシングされた乳癌細胞を、多孔性の膜を有するインサートにローディングし（上のチャンバー）、化学誘引物質（血清）をコンパニオンプレートのウェル（下のチャンバー）に入れた。３７℃で６時間インキュベートした後、非遊走細胞を除去し、インサートの表面下上の遊走細胞を固定し、染色し、顕微鏡下で計数した。 （Ｂ）細胞浸潤アッセイ。細胞浸潤のために、インサートを基底膜マトリゲルでコーティングした。３７℃で２４時間インキュベートした後、非浸潤細胞を除去し、残りの実験を（Ａ）に記載の通りに実施した。 （Ｃ）骨指向性Ｂ０２乳癌細胞の浸潤に対する、漸増濃度の抗Ｒｏｂｏ１（左）又は抗Ｒｏｂｏ４抗体（右）の効果。挿入図：アイソタイプの一致した陰性対照抗体と比較した、最高濃度の抗Ｒｏｂｏ１及び抗Ｒｏｂｏ４抗体の効果。 （Ａ）Ｓｈ−Ｒｏｂｏ１／４トランスフェクタント又は親Ｂ０２乳癌細胞の動脈内接種から７日後、動物を、図に示されているように、選別し、後肢を回収し、骨髄を洗い流した。骨髄培養細胞を、抗生物質の選択下に置き、抗生物質耐性の腫瘍細胞の選択的増殖を可能とした。腫瘍細胞のコロニーを固定し、染色し、計数した。各群の代表的な画像が示されている。 （Ｂ）は（Ａ）と同様であるが、Ｓｃ−及びＳｈ−Ｒｏｂｏ４でトランスフェクションされた腫瘍細胞の脛骨内接種について。 （Ｃ）軟アガーコロニー形成アッセイ。ＲＯＢＯ４のサイレンシングは、コロニーの数及びサイズを減少させる。 ＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ４の状態による、２５４人の乳癌患者における無再発生存率についてのカプランマイヤーによる推定。ログランク検定によりＰ＝０．０５８。各亜群における転移イベントの総数（イベントの数）が、埋め込まれた表に示されている。 腫瘍血管新生と、腫瘍細胞におけるＲＯＢＯ１又はＲＯＢＯ４のサイレンシングとの間の関連。（Ａ）マウス内皮細胞を特異的に認識する抗ＣＤ３１抗体を使用した、腫瘍細胞接種後の５０日目におけるＳｃ−ＲＯＢＯ１及びＳｈ−ＲＯＢＯ１腫瘍異種移植片の免疫組織化学的分析。腫瘍内のＣＤ３１陽性血管の数を定量した。矢印は血管を示す。^＊＊Ｐ＜０．０１。（Ｂ）（Ａ）と同じであるが、Ｓｃ−ＲＯＢＯ４及びＳｈ−ＲＯＢＯ４腫瘍異種移植片について。^＊Ｐ＜０．０５。 Ｓｈ−又はＳｃ−Ｒｏｂｏ４によりトランスフェクションされた腫瘍細胞を脛骨内に接種された動物の転移性肢の脛骨の骨幹端を酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）により染色した後のインサイツにおける破骨細胞の検出。代表的な画像が左に示されている。破骨細胞が赤色に染色されている（矢印）。破骨細胞（ＯＣ）表面、対、骨表面の比を％で表現した。^＊＊、Ｓｃ−Ｒｏｂｏ４群と比較してＰ＜０．０１。 Ｒｏｂｏ４に対して指向されるポリクローナル抗体を用いてのヒトＢ０２乳癌細胞の処置は、動物における骨髄微小転移の形成を阻害する。

実施例１：
材料及び方法
患者
乳癌患者コホートの臨床的及び生物学的特徴が他の場所に（Berthier et al., 2010）記載されている。Hospices Civils de Lyon（ｎ＝２５４）及びRene Hughenin病院（ｎ＝４５６）の患者コホートの経過観察期間中央値はそれぞれ５４及び１２０．５か月であった。

リアルタイムＰＣＲ
ヒト乳腺腫瘍及びマウス骨髄からの全ＲＮＡを、トリゾール試薬（Sigma）を使用して抽出した。あらゆるゲノムＤＮＡの混入を除去するために、全ＲＮＡを、リボヌクレアーゼ非含有デオキシリボヌクレアーゼＩで処理し、ＲＮｅａｓｙマイクロカラム（Qiagen）を使用して精製した。ＲＮＡの品質を、Agilent Bioanalyser 2100（Agilent Technologies）を使用して確認した。ｃＤＮＡを、iScript cDNA合成キット（Biorad）を使用して合成した。ＰＣＲ反応を、SYBR（登録商標）Green qPCRキット（Life technologies）を使用して、９６ウェルプレートにおいてMastercycler EPシステム（Realplex2, Eppendorf, hamburg-Eppendorf, Germany）で製造業者の説明書に従って行なった。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、最初の工程を９５℃で２分間、続いて９５℃で１５秒間の４０サイクル、Ｔ_ｍで（ｍＬ３２：５８℃、ｍＳｌｉｔ２：６４℃、ＴＢＰ：６７℃、Ｒｏｂｏｌ：６３℃、Ｒｏｂｏ４：６７℃）１５秒間、および７２℃で２０秒間行われた。ＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ４発現は、ＴＢＰを用いて標準化された。マウスＳｌｉｔ２はｍＬ３２を用いて標準化された。

細胞株、細胞培養及びトランスフェクション
ヒトＢ０２乳癌細胞株は、動物において骨に転移する高い効率のために選択されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１癌株の亜個体群である（Peyruchaud et al., 2003）。以前に作成された（Buijs et al., 2007）、Ｆｌｐを発現するサブクローン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１/Ｂ０２−Ｆｒｔ１１）をここで細胞トランスフェクション実験に使用した。

ヒトＲＯＢＯ１ｍＲＮＡに対して指向される小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び対応するスクランブル配列（ＳｃＲＮＡ）を、Si Designer Tool（Promega）を使用して設計した。使用されたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：正方向ＳｈＲＮＡ、5'-ACCgCAgTACTAAgggAA-CAATAAgTTCTCTATTgTTCCCTTAgTACTgCTTTTTC-3'；逆方向ＳｈＲＮＡ、5'-TgCAgAAAAAgCAg-TACTAAgggAACAATAgAgAACTTATTgTTCCCTT-AgTACTg-3'。ｓｈＲＮＡ及び対応するスクランブル二本鎖を、psiSTRIKEピューロマイシンキット（Promega）を用いてＵ６プロモーター下で合成した。プラスミドを、Transfast試薬（Promega）を使用してＢ０２−Ｆｒｔ細胞中にトランスフェクションした。細胞をピューロマイシン（２μg/mL、ＰＡＡ）の存在下で２週間培養し、クローンをクローニングシリンダーを使用して単離した。

ＲＯＢＯ４ ｍＲＮＡに標的化するＳｈＲＮＡ及びその対応する対照ＳｃＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ設計ツール（Genscript）を用いて設計し、ｐＲＮＡ−Ｕ６．１/ゼオシンベクター（Genscript）にクローニングした。使用されたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった：正方向のＳｈＲＮＡ、5'-GAGCAGAGAAGAGTGACGA-3'；逆方向のＳｈＲＮＡ、5'-TCTTACACGGCCTTGTTCA-3'。トランスフェクション後、細胞を、ゼオシン（８００μg/mL、Life technologies）の存在下で３週間培養し、その後、クローンをクローニングシリンダーを使用して単離した。ＲＯＢＯ１又はＲＯＢＯ４についてサイレンシングさせたクローン及びそのそれぞれの対照を、その後、ウェスタンブロットによって選択した。

ウェスタンブロット
タンパク質細胞抽出物を、４〜１２％勾配のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Life technologies）上で電気泳動し、その後、ニトロセルロース膜（Millipore, Billerica, MA）に転写した。Ｒｏｂｏ１（抗体7279; AbCam；１：３００の希釈度）、Ｒｏｂｏ４（抗体10547, AbCam；１：５００の希釈度）、α−チューブリン（Sigma；１：２，０００の希釈度）、Ａｋｔ（9272番、Cell Signaling；１：２，０００の希釈度）、ホスホ−Ａｋｔ（9271S番、Cell signaling；１:２，０００の希釈度）、Ｓｒｃ（クローンGD11、Millipore；１：５００の希釈度）、ホスホ−Ｓｒｃ（クローン9A6、Millipore；１：５００の希釈度）、及びサイクリンＤ１（クローンEPR2241、Millipore；１：１０，０００の希釈度）を製造業者の説明書に従ってイムノブロットのために使用した。一次抗体と共にインキュベートした後、膜を、セイヨウワサビペルオキシド（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせたロバ抗ウサギ及び抗マウス二次抗体（Amersham；１：２，０００の希釈度）と共にインキュベートし、その後、免疫染色を、増強化学発光（ＥＣＬ）検出システム（Perkin Elmer）を用いて実施した。

細胞遊走及び浸潤アッセイ
実験を、以前に記載されているように（Zhang et al., 2007; Fradet et al., 2011）、直径８μmの孔サイズのインサートを有する２４ウェル細胞培養プレートで実施した。細胞浸潤アッセイのために、インサートを、１００μlの基底膜マトリゲル（０．３mg/ml）でコーティングした。親腫瘍細胞又はトランスフェクタント（１．６×１０^５個の細胞/ml）を、０．１％（w/v）のウシ血清アルブミンを含む培養培地に再懸濁し、３００μlのこの細胞懸濁液を、各インサート（上のチャンバー）にローディングした。抗Ｒｏｂｏ１（クローン１Ｆ８、Sigma）及び抗Ｒｏｂｏ４（抗体１０５４７、Abcam）を用いての実験のために、これらの各抗体を、３７℃で９０分間、腫瘍細胞と共にインキュベートして、その後、上のチャンバーに加えた。化学誘引物質［１０％（v/v）のウシ胎児血清］を、下のチャンバーに入れた（７５０μl/ウェル）。細胞遊走及び浸潤実験のために、プレートをそれぞれ６時間及び２４時間、３７℃で、５％ＣＯ_２インキュベーター中でインキュベートした。インキュベート後、インサートを回収し、非遊走細胞を除去し、インサート表面下上の遊走細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。その後、細胞を顕微鏡下で計数した。

動物
４週令の雌ＮＭＲＩ及びＢａｌｂ／ｃ免疫低下マウス及びＯＦ１雄マウスを、Charles River Laboratories (St. Germain sur l'Arbresle, France)から購入した。動物の小屋及び世話をはじめとする動物に関与する全ての手順、動物を選別する方法、並びに実験プロトコールは、リヨン大学の地方倫理委員会によって確立された実施規則に従って実施された。

動物の研究
同所性腫瘍異種移植片実験を、以前に記載されている通りに（Fradet et al., 2011）、ＮＭＲＩ免疫不全マウスにおいて実施した。４週令の雌ヌードマウスの、第４乳腺の脂肪パッドに、トランスフェクタントのプール（５０μlのＰＢＳ中、１０^６個の細胞）を注射した。プロトコール終了時に、マウスを屠殺し、腫瘍を回収し、秤量し、その後、免疫組織化学的検査のために準備した。

骨内腫瘍異種移植実験を、以前に記載されている通りに（Zhang et al., 2007）、雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて実施した。簡潔に言えば、３０ゲージの滅菌針を用いて、膝を曲げた脛骨プラトーを通して、小さな穴をあけた。５０mlの滅菌ハミルトンシリンジに装着させた新しい滅菌針を使用して、単一細胞懸濁液（３０μlのＰＢＳ中、１０^５個の細胞）を骨髄腔に注射した。溶骨性病変の進行を、キャビネットＸ線システムを使用した、麻酔した動物のＸ線検査によってモニタリングした。

骨転移実験を、以前に記載されているように（Fradet et al., 2011; Peyruchaud et al., 2003; Zhang et al., 2007）、雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおいて実施した。トランスフェクタント（１００μlのＰＢＳ中、５×１０^５個の細胞）を、麻酔したヌードマウスの尾動脈に注射した。Ｘ線写真を上記にように撮影した。溶骨性病変が、骨において放射線透過性病変としてＸ線写真上に同定された。溶骨性病変の領域を、コンピューター画像分析システムを使用して測定し、１つの肢あたりの骨破壊の程度を平方ミリメートルで表現した。

骨の組織学的検査、組織形態計測検査、及び免疫組織化学的検査
骨組織切片の骨組織学的及び組織形態計測的分析を、以前に記載の通りに（Fradet et al., 2011; Peyruchaud et al., 2003; Zhang et al., 2007）実施した。組織形態計測的測定［骨体積（ＢＶ）／骨組織体積（ＴＶ）比、及び腫瘍体積（ＴｕＶ）／軟組織体積（ＳＴＶ）比］を、皮質骨及び海綿骨を含む、成長板から０．５mmに位置する脛骨骨幹端の標準的な帯域で実施した。ＢＶ／ＴＶ比は、骨組織の比率を示す。ＴｕＶ／ＳＴＶ比は、腫瘍組織の比率を示す。破骨細胞のインサイツにおける検出は、市販のキット（Sigma）を使用して、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）により染色された縦方向のパラフィンに包埋された脛骨骨幹端の内側切片において実施された。破骨細胞の吸収表面は、腫瘍−骨の界面における、ＴＲＡＰ陽性海綿骨表面積と全海綿骨表面積の比として計算された。血管の免疫検出のために、腫瘍切片を、ウサギポリクローナル抗ＣＤ３１抗体（AnaSpec）と共にインキュベートし、その後、抗ウサギＨＲＰに連結された二次抗体と共にインキュベートした。腫瘍の微小血管の密度を、以前に記載されている通りに（Fradet et al., 2011; Peyruchaud et al., 2003）定量した。

破骨細胞形成アッセイ
実験を、以前に記載されている通りに（Fradet et al., 2011）実施した。簡潔に言えば、６週令のＯＦ１雄マウスの後肢からの骨髄細胞を、Ｍ−ＣＳＦ（２０ng/ml）及びＲＮＡＫ−Ｌ（２００ng/ml）の補充された１０％（v/v）ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地中、トランスフェクタント（２０μg/mL）からの馴化培地の存在下で培養した。７日後、成熟破骨細胞を、顕微鏡下で、核の数（３つを超える核）及びＴＲＡＰ活性に基づいて数えた。結果を、１つのウェルあたりの破骨細胞の数として表現した。

エクスビボにおける骨髄微小転移アッセイ
Ｓｈ／Ｓｃ−Ｒｏｂｏトランスフェクタント及び親Ｂ０２乳癌細胞を、動物の尾動脈に注射し、動物を腫瘍細胞接種から７日後に選別した。後肢を回収し、脛骨及び大腿骨の両端を切断し、骨髄を、２３ゲージの針を使用して培養培地を用いて洗い流した。その後、骨髄細胞を６ウェルプレートに接種し、完全培地中で培養した。１日間培養した後、骨髄細胞を抗生物質の選択下に２週間置き、抗生物質耐性腫瘍細胞の選択的な増殖を可能とした。腫瘍細胞のコロニーを固定し、クリスタルバイオレットで染色し、計数した。

サイトカインアレイ
７９個の増殖因子、サイトカイン及びケモカインを検出するように設計された市販の抗体をベースとしたタンパク質マイクロアレイ（RayBioヒトサイトカインアレイV, RayBiotech）を使用した。アレイ膜を、２時間、トランスフェクション培養細胞（１５０μg/mL）からの馴化培地と共にインキュベートした。洗浄後、膜を、７９個のビオチニル化抗体のカクテルと共にインキュベートし、残りの実験手順を製造業者の説明書に従って実施した。

統計分析
全てのデータは、StatViewソフトウェア（バージョン5.0; SAS Institute Inc, Cary, NC）を使用して分析された。結果は、図の説明文及び表に示されているように、平均値±ＳＤとして報告される。前臨床試験に関する対比較は、ノンパラメトリックマンホイットーニーＵ検定を実施することによって実施された。臨床データに関しては、通常の予後診断パラメーターに関連したＲｏｂｏ１及びＲｏｂｏ４発現の分布を、マンホイットニー又はクラスカル・ウォリス検定を使用して実施した。カプランマイヤー曲線間の比較を、ログランク検定を使用して実施した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意と判断した。

結果
ＲＯＢＯ１／ＲＯＢＯ４発現と、臨床上の乳癌の再発との関連
本発明者らは、骨にしか転移しないＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２と称される）の亜個体群を以前に選択した（Peyruchaud et al., 2003）。Ａ及びＢ Ｕ１３３アフィメトリクスGeneChipを使用して、本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２細胞の遺伝子発現プロファイルを比較し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２細胞が、ＲＯＢＯ／ＳＬＩＴファミリーの遺伝子を含む骨転移遺伝子サインを発現することを見出した（Bellahcene et al., Breast Cancer Res Treat., 101:135-148, 2007; Garcia et al., Clin Exp Metastasis, 25:33-42, 2008）。より正確に言えば、骨指向性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２細胞は、親細胞株と比較して、ＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ４を過剰発現した。ＲＯＢＯ２及びＲＯＢＯ３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２細胞によって発現されなかった。ＲｏｂｏリガンドのＳＬＩＴ２及びより少ない程度でＳＬＩＴ１（しかしＳＬＩＴ３ではない）もまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２細胞によって発現された。

ＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ４の発現と、乳癌の転帰との関連を調べるために、本発明者らは、診断時に遠隔転移のエビデンスが全くなく、以前に治療されたことも全くない、２５４人の患者コホートを調べた（Berthier et al., 2010）。本発明者らは、乳癌患者において、ＲＯＢＯ１状態と、臨床的及び生物学的特徴との間に全く相関を観察しなかった（表１）。著しく対照的には、ＲＯＢＯ４の発現とリンパ節の状態との間には統計学的に有意な相関があり（Ｐ＝０．００１）；原発性腫瘍における高いＲＯＢＯ４レベルが、３つを超えるリンパ節が陽性である患者においてより頻繁に観察された（表１）。乳癌患者におけるＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ４の発現の予後診断値を規定するために、生存曲線を、カプランマイヤー法を使用して推定した。無再発生存率は、高いまたは低いレベルのＲＯＢＯ１を発現している群の間で有意に異ならなかった。逆に、高いＲＯＢＯ４発現レベルを有する群における５４か月という経過観察期間の中央値における再発の数は、低いＲＯＢＯ４レベルを有する群の２倍であった（それぞれ３２回対１５回の再発；ログランク検定によりＰ＝０．００９）。

さらに、ＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ４の状態による患者コホートの亜群分析は、ＲＯＢＯ１の発現レベルが高い又は低いに関係なく、高いＲＯＢＯ４レベルを有する原発性腫瘍を有する患者において再発がより頻繁に起こったことを示した（Ｐ＝０．０５８）。リンパ節の状態は、本発明者らが分析したコホートにおいて高い転移リスクと以前に相関し（Berthier et al., 2010）、ＲＯＢＯ４の発現とリンパ節の状態との間の有意な相関がここで観察されたため（表１）、本発明者らは、リンパ節の状態が交絡因子であり得るかどうかを検証した。リンパ節陰性（ｐＮ０）患者において、ＲＯＢＯ４の発現は、転移のリスクと関連していなかった（示されていない）。逆に、分析がリンパ節陽性（ｐＮ＋）患者に限定された場合、高いＲＯＢＯ４レベルは、遠隔再発（ログランク検定によりＰ＝０．０７）及び骨再発（ログランク検定によりＰ＝０．０１８）と相関していた。従って、高いＲＯＢＯ４の発現は、悪い予後に相関していた。

ＲＯＢＯ１のサイレンシングは、実験的な原発性腫瘍増殖を増強するが、ＲＯＢＯ４のサイレンシングは減少させる
ＲＯＢＯ１／ＲＯＢＯ４発現とマウス乳腺内の腫瘍増殖との間に関連があるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＲＮＡ干渉戦略を使用して、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２乳癌細胞におけるＲＯＢＯ１又はＲＯＢＯ４の内因性レベルを安定に減少させた。ｓｈＲＮＡにより媒介されるサイレンシングは、スクランブルでトランスフェクションされたＳｃＲｏｂｏ１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２親細胞において観察されたものと比較して、Ｒｏｂｏ１タンパク質レベルを９０％超で減少させた。Ｒｏｂｏ４レベルは、ＳｈＲｏｂｏ１及びＳｃＲｏｂｏ１乳癌細胞において依然として不変であった。その後、ＲＯＢＯ１についてサイレンシングさせたＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２トランスフェクタントのプール（クローンＳｈ１．３２及びＳｈ１．３３）及び偽トランスフェクタントのプール（クローンＳｃ２．１及びＳｃ２．４）を、免疫不全マウスのマウス乳腺内の同所に埋め込んだ。原発性腫瘍サイズの中央値の分析により、ＳｈＲｏｂｏ１腫瘍が、ＳｃＲｏｂｏ１腫瘍よりも大きいことが実証された。マウス内皮細胞を特異的に認識する抗ＣＤ３１抗体を用いた腫瘍異種移植片の免疫組織化学的分析は、ＲＯＢＯ１のサイレンシングが、ＳｃＲｏｂｏ１腫瘍と比較して、ＳｈＲｏｂｏ１腫瘍微小血管の密度の実質的な増加をもたらしたことを示した。ＳｈＲｏｂｏ１乳癌細胞によって産生されたＶＥＧＦレベルもまた、ＳｃＲｏｂｏ１及び親Ｂ０２細胞と比較して統計学的に有意に増加していた（データは示していない）。著しく対照的には、ＲＯＢＯ４についてサイレンシングされたＢ０２乳癌細胞のマウス乳腺内の同所への埋め込みは、ＳｃＲｏｂｏ４腫瘍と比較して原発性ＳｈＲｏｂｏ４腫瘍サイズの中央値の３倍の減少をもたらした。より小さなサイズのＳｈＲｏｂｏ４腫瘍は、ＣＤ３１免疫染色によって判断されたところ、減少した腫瘍血管新生を伴った。しかしながら、ＳｈＲｏｂｏ４及びＳｃＲｏｂｏ４乳癌細胞によって産生されたＶＥＧＦレベルは類似していた。総合すると、これらのデータは、腫瘍細胞上に発現されたＲｏｂｏ１及びＲｏｂｏ４は拮抗機能を有し；Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ４はそれぞれ、原発性腫瘍増殖の正及び負の調節因子であることを示唆した。

Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ４は、乳癌の骨での増殖及び溶骨性病変の形成を差次的に調節する
骨転移におけるＲｏｂｏ１及びＲｏｂｏ４の役割を試験するために、ＲＯＢＯ１についてサイレンシングされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｂ０２トランスフェクタントのプール（クローンＳｈ１．３２及びＳｈ１．３３）、又はＲＯＢＯ４についてサイレンシングされたトランスフェクタントのプール（クローンＳｈ２．６及びＳｈ４．５）、又はＲＯＢＯ１（クローンＳｃ２．１及びＳｃ２．４）及びＲＯＢＯ４（クローンＳｃ１．２及びＳｃ２．２）についてのそれぞれの偽トランスフェクタントのプールを、免疫不全マウスの尾動脈に注射した。この動物モデルを使用した、腫瘍細胞の注射から２８日後のＸ線検査による分析により、ＳｈＲｏｂｏ１腫瘍を有する動物の後肢における骨溶性病変の程度は増加し、偽トランスフェクションされたＳｃＲｏｂｏ１腫瘍を有する動物よりも４０％大きいことが判明した。この差は、組織形態計測検査によって決定されたところ、偽トランスフェクションされたＳｃＲｏｂｏ１腫瘍を有するマウスと比較して、ＢＶ／ＴＶ比の著しい低下（より高度な骨の破壊を示す）及びＴＢ／ＳＴＶ比の３倍増加（骨への腫瘍量の指標）を伴った。ＲＯＢＯ４のサイレンシングは、偽トランスフェクションされたＳｃＲｏｂｏ４腫瘍を有するマウスと比較して、ＳｈＲｏｂｏ４腫瘍を有する動物における骨溶性病変の程度のわずかな増加をもたらした。しかしながら、転移を有する後肢の組織形態計測分析は、ＢＶ／ＴＶ比及びＴＢ／ＳＴＶ比は２つの動物群間で統計学的に有意に異ならなかったことを示した。興味深いことに、ＳｈＲｏｂｏ４腫瘍を有するマウスの転移性肢の骨組織切片の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）による染色は、腫瘍−骨の界面における活発な破骨細胞吸収表面は、ＳｃＲｏｂｏ４腫瘍と比較して実質的に増加していたことを示した。対照的に、ＳｈＲｏｂｏ１又はＳｃＲｏｂｏ１腫瘍を有するマウスの転移性肢における活発な破骨細胞吸収表面は類似していた。これらの観察は、破骨細胞により媒介される骨破壊を調節する際の腫瘍由来Ｒｏｂｏ４の特異的な役割を指摘し、一方、腫瘍細胞上で発現されるＲｏｂｏ１は、骨における転移性増殖に関連していた。

腫瘍細胞におけるＲＯＢＯ４（又はＲＯＢＯ１）のサイレンシングが、破骨細胞形成に影響を及ぼし得るかどうかを直接試験するために、本発明者らは、種々のトランスフェクタントの馴化培地と一緒に、ＲＡＮＫＬ及びマクロファージコロニー刺激因子（これらは破骨細胞形成を誘導するために両方共に必要とされかつ十分である２つの造血因子である）を用いて、一次マウス骨髄細胞培養液を処理した。インビボのデータと一致して、Ｓｈ−Ｒｏｂｏ１及びＳｃ−Ｒｏｂｏ１ Ｂ０２乳癌細胞の馴化培地は、ＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞の形成を同程度刺激した。逆に、Ｓｈ−Ｒｏｂｏ４ Ｂ０２細胞の馴化培地は、Ｓｃ−Ｒｏｂｏ４細胞と比較して、破骨細胞形成の２倍の増加を誘導した。その後、本発明者らは、ヒトサイトカイン抗体アレイを使用して、トランスフェクタントからの馴化培地中のサイトカインを測定した。破骨細胞の活性を刺激することが知られているいくつかのサイトカイン及びインターロイキン（ＭＣＰ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８）が、これらのトランスフェクタントによって産生されていた。サイトカインプロファイルは、Ｓｃ−及びＳｈ−Ｒｏｂｏ１細胞について類似していた。対照的に、サイトカインアレイ及びＥＬＩＳＡによって決定したところ、Ｓｃ−Ｒｏｂｏ４細胞よりも、Ｓｈ−Ｒｏｂｏ４細胞によってＰｌＧＦ、ＭＣＰ−１及びＩＬ−８のより多くの産生がもたらされた。これらのサイトカインはまた、インビボにおいても検出された。さらに、ＰｌＧＦ及びＩＬ−８（しかしＭＣＰ−１ではない）の濃度は、対照群よりもＳｈ−Ｒｏｂｏ４腫瘍を有する動物の血清中でより高かった。それ故、ＳｈＲｏｂｏ４腫瘍を有する動物の転移性肢における増強された活発な破骨細胞吸収表面は、インビボにおける腫瘍細胞によるより多くの骨破壊誘発性サイトカインの産生の結果のようであった。逆に、Ｒｏｂｏ１欠損腫瘍を有する動物におけるより大きな骨溶性病変は、ＲＯＢＯ１のサイレンシングに直接関連していなかったが、骨髄に存在し、それにより、破骨細胞により媒介される骨破壊を刺激したより多数のＳｈＲｏｂｏ１腫瘍細胞の間接的な結果であった。

乳癌細胞の細胞遊走及び浸潤に対する、抗体によるＲＯＢＯ１及びＲＯＢＯ４のサイレンシング又は標的化の効果
これらの結果を鑑みて、本発明者らは、ＲＯＢＯ１のサイレンシングは、ＳｈＲｏｂｏ１腫瘍細胞によるより迅速な骨への定着をもたらし得ると推測した。実際に、文献にはＳｌｉｔ−Ｒｏｂｏ１が癌細胞の遊走を調節するといういくつかのエビデンスが存在する（Mehlen et al., 2011）。それ故、本発明者らは、Ｒｏｂｏ１及び／又はＲｏｂｏ４が、改変されたボイデンチャンバーアッセイを使用して、乳癌細胞の遊走／浸潤を調節し得るかどうかを調べた。本発明者らはまず、血清への乳癌細胞の走化性応答に対するＲＯＢＯ１又はＲＯＢＯ４のサイレンシングの効果を試験した。スクランブルでトランスフェクションされたＳｃＲｏｂｏ１細胞（クローンＳｃ２．１及びＳｃ２．４のプール）と比較して、Ｓｈ−Ｒｏｂｏ１でトランスフェクションされた細胞（クローンＳｈ１．３２及びＳｈ１．３３のプール）の遊走は１．５倍から２倍増加した。同様に、ＳｃＲｏｂｏ１細胞と比較してＳｈＲｏｂｏ１細胞の浸潤は実質的に増加した。対照的に、ＲＯＢＯ４のサイレンシングは、対照細胞（クローンＳｃ１．２及びＳｃ２．２のプール）と比較して、ＳｈＲｏｂｏ４細胞（クローンＳｈ２．６及びＳｈ４．５のプール）の遊走の統計学的に有意な減少をもたらした。さらに、ＳｃＲｏｂｏ４細胞と比較して、ＳｈＲｏｂｏ４細胞の浸潤は４倍減少した。次に、本発明者らは、親Ｂ０２乳癌細胞の浸潤に対する、抗体を用いてのＲｏｂｏ１又はＲｏｂｏ４の標的化の利点を評価した。アイソタイプの一致した対照抗体と比較して、モノクローナル抗Ｒｏｂｏ１抗体を用いてのＢ０２乳癌細胞の処置は浸潤性を促進し、一方、Ｂ０２細胞の浸潤は、漸増濃度のポリクローナル抗Ｒｏｂｏ４抗体の存在下で用量依存的に阻害された。総合すると、本発明者らは、腫瘍細胞におけるＲｏｂｏ１及びＲｏｂｏ４は、それぞれ、抗浸潤特性及び浸潤誘発特性を有すると結論付けた。

それ故、これらの結果は、Ｒｏｂｏ１のサイレンシングは、静脈内に注射されると、乳癌細胞がより迅速に骨に定着するように導き得、これにより、Ｒｏｂｏ１欠損腫瘍を有する動物の肢におけるより多い骨への腫瘍量が説明されることを示唆した。この仮定は、実際に、Ｓｃ−Ｒｏｂｏ１及びＳｈ−Ｒｏｂｏ１でトランスフェクションされた細胞が、脛骨骨髄腔に直接接種されると、対照又はＲｏｂｏ１の欠失した腫瘍を有するマウスが、Ｘ線検査及び組織形態計測検査によって決定されたところ、同程度の骨破壊及び骨への腫瘍量を有していたという観察によって支持された。従って、ＲＯＢＯ１のサイレンシングは、腫瘍細胞にインビボにおけるより高い浸潤性を賦与した。骨転移におけるＲｏｂｏ４の機能に関して、Ｓｈ−Ｒｏｂｏ４腫瘍細胞によって形成される骨溶性病変は、Ｓｃ−Ｒｏｂｏ４腫瘍を有する動物の転移性肢に観察されたものと同等であった。これは、ＲＯＢＯ４のサイレンシングが、ＳｃＲｏｂｏ４腫瘍と比較して、転移性動物においての骨への腫瘍量を減少させたことを考えると意外であった。しかしながら、また、ＳｃＲｏｂｏ４腫瘍と比較してＳｈＲｏｂｏ４腫瘍を有する動物の腫瘍−骨の界面においてＴＲＡＰ陽性破骨細胞が著しく増加し、及び、ＳｃＲｏｂｏ４腫瘍と比較してＳｈＲｏｂｏ４腫瘍を有する動物の血清中に高レベルの骨破壊促進性サイトカインＩＬ−８が存在していた。従って、ＳｈＲｏｂｏ４腫瘍細胞の高い内因性破骨細胞刺激活性は、なぜＳｈＲｏｂｏ４腫瘍を有する動物が、骨への腫瘍量の減少にも関わらず、骨溶性病変を示したのかを説明するようであった。

ＲＯＢＯ４のサイレンシングは、骨髄における乳癌細胞の生存及び増殖を減少させる
腫瘍細胞の浸潤は、骨転移形成中の非常に早期の段階で起こり、これにより腫瘍細胞が骨髄において播種及び栄えることを可能とする（Weilbaecher et al., 2011）。Ｒｏｂｏ１及びＲｏｂｏ４はインビトロにおいて乳癌細胞の浸潤を、及びインビボにおいて骨への転移の形成を調節していたので、本発明者らは、これらの受容体が、骨髄微小環境における腫瘍細胞の生着を促進し得ると仮定した。この問題に対処するために、Ｓｈ−Ｒｏｂｏトランスフェクタント及び親Ｂ０２乳癌細胞を、動物の尾動脈に注射し、その後、これらの動物を、腫瘍細胞の接種後の７日目に選別し、この時にはＸ線検査、生物発光イメージング及び組織学的検査によって判断したところ転移のエビデンスは全くない（Garcia et al., 2008）。その後、これらの動物の後肢から骨髄を洗い流し、抗生物質の選択下の培養液に入れ、抗生物質耐性腫瘍細胞の選択的増殖を可能とした。親Ｂ０２細胞又はＳｈＲｏｂｏ１細胞の接種されたマウスと比較して、ＳｈＲｏｂｏ４細胞の接種されたマウスの骨髄における腫瘍細胞コロニー数は、７５から８０％減少した。さらに、脛骨の骨髄腔に直接接種し、腫瘍増殖について追跡した場合に、骨髄におけるＳｈＲｏｂｏ４コロニーの数は、ＳｃＲｏｂｏ４細胞について観察されたのと比較して７８％減少した。腫瘍細胞を足場とは独立して軟アガー中で増殖させた場合に同じような効果が観察された。ＳｃＲｏｂｏ４及び親Ｂ０２細胞と比較して、ＳｈＲｏｂｏ４細胞によって形成されたコロニーの数及びサイズは統計学的に有意に減少した。従って、Ｒｏｂｏ４は、骨髄における乳癌細胞の生存にとって必要とされた。

実施例２：
抗Ｒｏｂｏ４抗体で前処理されたＢ０２細胞を、免疫不全マウスの尾動脈に注射した。腫瘍細胞の接種から１週間後、これらの動物の後肢から骨髄を洗い流し、抗生物質の選択下の培養液中に入れ、抗生物質に耐性な腫瘍細胞の選択的な増殖を可能とした。２週間培養した後、腫瘍細胞のコロニーを固定し、染色し、計数した。各シリーズの３つのウェルは、１匹の動物の骨髄からの腫瘍細胞コロニーの増殖を示す。１群あたり４匹のマウスが含まれていた。図９は、Ｒｏｂｏ４に対して指向されるポリクローナル抗体を用いてのヒトＢ０２乳癌細胞の処置が、動物における骨髄微小転移の形成を阻害することを示す。ＰＣＲ分析は、大半の乳癌細胞株がＲｏｂｏ１を発現したが、骨指向性を有するものだけが（Ｂ０２及びＭＣ−Ｍ１）Ｒｏｂｏ４を発現したことを示す。さらに、Ｈｓ５７８Ｔ及びＴ４７Ｄ細胞がＲｏｂｏ２を強力に発現したことが判明した。

本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (11)

1. 抗ＲＯＢＯ４抗体、抗ＲＯＢＯ４アプタマー、ＲＯＢＯ４の細胞外ドメインの全部又は一部を含むＲＯＢＯ４デコイポリペプチド、及びｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるＲＯＢＯ４発現阻害剤からなる群より選択される物質を含む、それを必要とする被験体における骨転移を予防又は治療するための医薬組成物。
2. 該被験体が、前立腺癌、乳癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、及び脳癌からなる群より選択される癌を患う、請求項１の医薬組成物。
3. 該抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全ヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される、請求項１の医薬組成物。
4. ＲＯＢＯ４デコイポリペプチドが、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合させたＲＯＢＯ４の細胞外ドメインの全部又は一部を含む、請求項１又は２の医薬組成物。
5. ビスホスホネートと組み合わせて被験体に投与するための、請求項１〜４のいずれか１項記載の医薬組成物。
6. 抗ＲＡＮＫＬ抗体と組み合わせて被験体に投与するための、請求項１〜４のいずれか１項記載の医薬組成物。
7. 抗ＲＡＮＫＬ抗体がデノスマブである、請求項６の医薬組成物。
8. ｉ）患者から得られた試料中のＲＯＢＯ４発現レベルを決定する工程、ｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルを既定の参照レベルと比較する工程、及びｉｉｉ）工程ｉ）で決定されたレベルが規定の参照レベルよりも高い場合に、患者が骨転移を有する高いリスクを有すると結論付ける工程を含む、癌患者が骨転移を有するリスクがあるかどうかを試験する方法。
9. 該試料が、患者の原発性腫瘍から単離されるか、又は被験体から得られた血液試料から単離された循環中の腫瘍細胞の収集物からなる、請求項８の方法。
10. 被験体が、前立腺癌、乳癌、肺癌、黒色腫、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌及び脳癌からなる群より選択される癌を患う、請求項８の方法。
11. 試料中のＲＯＢＯ４発現レベルが、ＲＯＢＯ４を発現している癌細胞の数又は癌細胞表面におけるＲＯＢＯ４のレベルを決定することによって評価される、請求項８の方法。