ES2609014T3 - Producción in vivo de ARN de interferencia pequeños que median el silenciamiento génico - Google Patents

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Craig C. Mello
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Abstract

Un método para preparar un precursor de ARN manipulado que comprende las etapas de: (a) seleccionar una secuencia de ARN mensajero (ARNm) de un gen diana; y (b) manipular un ARN precuros que comprende i) una primera porción de tallo que comprende una secuencia de 18 a 40 nucleótidos que es complementaria a la secuencia de ARNm seleccionada; ii) una segunda porción de tallo que comprende una secuencia de 18 a 40 nucleótidos que es suficientemente complementaria a la secuencia de 18 a 40 nucleótidos de la primera porción de tallo para hibridar con la primera porción de tallo para formar un tallo dúplex; y iii) una porción de bucle de al menos 4 nucleótidos que conecta las dos porciones de tallo; en el que el precursor es capaz de ser procesado por Dicer.

Description

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objetivo indicará si la ingeniería del precursor creó un pre-ARNsi capaz de mediación de secuencias específicas ARNi.
Animales Transgénicos
Los precursores de ARN manipulados de la invención pueden expresarse en animales transgénicos. Estos animales representan un sistema modelo para el estudio de trastornos que son causados por, o exacerbados por, sobreexpresión o subexpresión (en comparación con tipo silvestre o normal) de ácidos nucleicos (y sus polipéptidos codificados) dirigidos a la destrucción por el precursor de ARN manipulado (ARNsi) y para el desarrollo de agentes terapéuticos que modulan la expresión o actividad de ácidos nucleicos o polipéptidos destinados a la destrucción.
Los animales transgénicos pueden ser animales de granja (cerdos, cabras, ovejas, vacas, caballos, conejos y similares), roedores (tales como ratas, cobayas y ratones), primates no humanos (por ejemplo, babuinos, monos y chimpancés), y animales domésticos (por ejemplo, perros y gatos). Pueden usarse invertebrados tales como Caenorhabditis elegans o Drosophila, así como vertebrados no mamíferos tales como peces (por ejemplo, pez cebra) o aves (por ejemplo, pollos). Los precursores de ARN manipulados con tallos de 18 a 30 nucleótidos de longitud se prefieren para uso en mamíferos, tales como ratones.
Se puede identificar un animal fundador transgénico basado en la presencia de un transgén que codifica los nuevos precursores de ARN en su genoma y/o expresión del transgén en tejidos o células de los animales, por ejemplo, usando PCR o análisis de Northern . La expresión se confirma mediante una disminución de la expresión (ARN o proteína) de la secuencia diana.
Se puede usar un animal fundador transgénico para engendrar animales adicionales que portan el transgén. Además, los animales transgénicos que llevan un transgén que codifica los precursores de ARN pueden ser cruzados además con otros animales transgénicos que portan otros transgenes. Además, las células obtenidas del animal fundador transgénico o de su progenie pueden cultivarse para establecer líneas celulares primarias, secundarias o inmortales que contienen el transgén.
Procedimientos para hacer animales transgénicos, no humanos
Se han utilizado varios métodos para obtener animales no humanos transgénicos, que son animales que han obtenido un gen adicional mediante la introducción de un transgén en sus células (por ejemplo, las células somáticas y las células germinales) o en una línea germinal antepasada. En algunos casos, los animales transgénicos pueden ser generados por instalaciones comerciales (por ejemplo, The Transgenic Drosophila Facility en Michigan State University, The Transgenic Zebrafish Core Facility en el Medical College of Georgia (Augusta, Georgia) y Xenogen Biosciences (St. Louis, MO). En general, la construcción que contiene el transgén se suministra a la instalación para generar un animal transgénico.
Los procedimientos para generar animales transgénicos incluyen la introducción del transgén en la línea germinal del animal. Un método consiste en la microinyección de un constructo genético en el pronúcleo de un embrión de etapa temprana (por ejemplo, antes de la etapa de cuatro células, Wagner et al., 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA
78: 5016, Brinster et al. 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 4438). AlteARNtivamente, el transgén puede introducirse en el pronúcleo por infección retroviral. Se ha descrito un procedimiento detallado para producir tales ratones transgénicos (véase, por ejemplo, Hogan et al., Manipulating the Embryo Mouse, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986), Patente U.S. nº 5.175.383 (1992)). Este procedimiento también se ha adaptado para otras especies animales (por ejemplo, Hammer et al., 1985, Nature 315: 680, Murray et al., 1989, Reprod. Fert. Dev 1: 147, Pursel et al., 1987, Vet Rexroad et al., 1990, J. Reprod. Fert. 41 (suppl): 119, Rexroad et al., 1989, Molec. Reprod. Dev.1: 164, Simons et al., 1988, BioTechnology 6: 179, Vize et al., 1988, J. Cell. Sci. 90: 295 y Wagner, 1989, J. Cell. Biochem., 13B (suppl): 164).
En resumen, el procedimiento implica la introducción del transgén en un animal mediante la microinyección de la construcción en los pronúcleos del huevo o mamíferos fecundados para hacer que una o más copias del transgén sean retenidas en las células del mamífero en desarrollo. Después de la introducción de la construcción transgénica en el huevo fertilizado, el óvulo puede incubarse in vitro durante cantidades variables de tiempo, o reimplantarse en un huésped sustituto, o ambos. Un método común es incubar los embriones in vitro durante aproximadamente 1-7 días, dependiendo de la especie, y luego reimplantarlos en el huésped sustituto. La presencia del transgén en la progenie de los embriones transgénicamente manipulados puede ser probada por análisis de transferencia Southern de un segmento de tejido.
Otro método para producir animales transgénicos de línea germinal es a través del uso de células de tallo embrionario (ES). La construcción génica puede introducirse en células madre embrionarias mediante recombinación homóloga (Thomas et al., 1987, Cell 51: 503, Capecchi, Science 1989, 244: 1288, Joyner et al., 1989, Nature 338: 153) en una región transcripcionalmente activa del genoma. Una construcción adecuada también se puede introducir en células madre embrionarias mediante transfección mediada por ADN, tal como por electroporación (Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987). Los procedimientos detallados para cultivar células madre embrionarias (por ejemplo, ES-D3, ATCC # CCL-1934, ES-E14TG2a, ATCC # CCL-1821, American Type Culture Collection, Rockville, MD) y métodos para producir animales
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naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel™, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o SterotesTM; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se suministran en forma de una pulverización de aerosol a partir de un recipiente o dispensador a presión que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosa o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se utilizan en la formulación agentes de penetración apropiados para la barrera que se va a permear. Tales agentes de penetración son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede lograrse mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilenacetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también pueden usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº
4.522.811.
Es ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación tal como se utiliza en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben altos índices terapéuticos. Aunque pueden utilizarse compuestos que exhiben efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado de diseñar un sistema de liberación que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a células no infectadas y, por tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar en la formulación de una gama de dosis para su uso en seres humanos. La dosificación de composiciones está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen un ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración en plasma circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto polipeptídico de una secuencia diana (por ejemplo, lograr una concentración disminuida del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) determinada en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con mayor precisión dosis útiles en humanos. Los niveles en el plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene una secuencia que codifica un precursor de ARN manipulado, o el propio precursor (es decir, una dosificación eficaz), es una cantidad que inhibe la expresión del polipéptido codificado por el gen diana en al menos 30 por ciento. Los porcentajes más altos de inhibición, por ejemplo , 45, 50, 75, 85, 90 por ciento o más pueden ser preferidos en ciertas realizaciones. Las dosis de ejemplo incluyen cantidades en miligramos o microgramos de la molécula por kilogramo de peso del sujeto o muestra (por ejemplo, aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 5 miligramos por kilogramo, o aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo. Las
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Ejemplos de trastornos que implican el corazón o "trastorno cardiovascular" incluyen, pero no se limitan a, una enfermedad, un trastorno o un estado que implican el sistema cardiovascular, por ejemplo, el corazón, los vasos sanguíneos, y/o la sangre. Un trastorno cardiovascular puede ser causado por un desequilibrio en la presión arterial, un mal funcionamiento del corazón, o una oclusión de un vaso sanguíneo, por ejemplo, por un trombo. Ejemplos de tales trastornos incluyen la hipertensión, la aterosclerosis, espasmo de la arteria coronaria, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial coronaria, enfermedad valvular, arritmias, y cardiomiopatías.
Trastornos que pueden tratarse por los métodos descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, trastornos asociados con una acumulación en el hígado de tejido fibroso, como la que resulta de un desequilibrio entre la producción y degradación de la matriz extracelular acompañado por el colapso y condensación de fibras preexistentes.
Además, las moléculas de la invención pueden usarse para tratar enfermedades virales, incluyendo pero sin limitarse a hepatitis B, hepatitis C, virus del herpes simple (HSV), VIH-SIDA, virus del polio y virus de la viruela. Las moléculas de la invención se diseñan como se describe en la presente memoria descriptiva para dirigir secuencias expresadas de un virus, mejorando así la actividad viral y la replicación. Las moléculas pueden usarse en el tratamiento y/o diagnóstico de tejido infectado por virus. También, tales moléculas pueden usarse en el tratamiento de carcinoma asociado a un virus, tal como cáncer hepatocelular.
Usos de precursores de ARN manipulados para inducir ARNi
Los precursores de ARN manipulados, introducidos en células u organismos enteros como se describen aquí, darán lugar a la producción de una molécula de ARNsi deseada. Tal molécula de ARNsi se asociará entonces con componentes de proteínas endógenas de la ruta ARNi para unirse a una secuencia de ARNm específica y segmentarla para la escisión y la destrucción. De esta manera, el ARNm a ser dirigido por el ARNsi generado a partir del precursor de ARN manipulado será empobrecido de la célula u organismo, dando lugar a una disminución en la concentración de la proteína codificada por ese ARNm en la célula u organismo.
Por ejemplo, se puede estar tratando de descubrir una molécula pequeña que reduzca la actividad de una quinasa cuya sobreexpresión conduce a una proliferación celular desenfrenada. Esta quinasa se sobreexpresa en una variedad de células cancerosas. Una pregunta clave a determinar es si la disminución de la actividad de esta quinasa en mamíferos adultos tendría efectos deletéreos inesperados. Mediante la expresión de un precursor de ARN manipulado que se dirige a la destrucción por la ruta ARNi, el ARNm que codifica la quinasa a través de los tejidos de un ratón adulto, se pueden determinar los efectos deletéreos de dicho fármaco potencial. Es decir, el método descrito aquí permitirá una evaluación rápida de la idoneidad de la quinasa como un objetivo de fármaco.
Las nuevas moléculas de ácido nucleico que codifican los precursores de ARN manipulados también pueden usarse para crear un gran número de células o vectores en microarreglos en los que cada célula o vector de la matriz incluye moléculas de ácido nucleico que codifican un precursor de ARN manipulado que es específico Para un gen diana diferente. Véase, por ejemplo, Ziauddin et al., Nature, 411: 107 -110 (2001).
Ejemplos
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplo 1 -Producción de un precursor de ARN manipulados
Para producir un precursor de ARN manipulado que se dirigirá a un gen para luciferasa de luciéARNga para escisión, se examinó la secuencia de la porción codificante del ARNm de luciferasa de luciéARNga para seleccionar una secuencia adecuada. En una posición de más de 100 nucleótidos, pero menos de 300 nucleótidos, 3’ al comienzo de la traducción, se encontró inmediatamente la secuencia CGUACGCGGAAUACUUCGAUU (SEQ ID NO: 16) después de la secuencia AA. Se eligió esta secuencia dado que cumple los criterios para la selección de un ARNsi,. Se diseñó entonces un ARN precursor modificado que incluye esta secuencia (subrayada) como se representa a continuación (y se muestra en la Figura 2B):
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Se prepararon secuencias sintéticas de desoxioligonucleótidos que sirven como una plantilla de transcripción in vitro para preparar este precursor de ARN manipulado usando la enzima ARN Polimerasa T7 de acuerdo con los protocolos publicados. A continuación se muestran los dos desoxioligonucleótidos. Los oligonucleótidos contienen la
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