KR20100085951A - 신규 ｓｉｒｎａ 구조 - Google Patents

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KR20100085951A
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엘레나 페인스테인
휴제인 아이군
라미 스칼리터
하가르 칼린스키
이고르 메트
제임스 맥스위겐
레오니드 베이겔만
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Abstract

본 발명은 특이적 사람 유전자의 발현을 하향-조절하는 신규한 서열 및 구조 모티프를 지니는 siRNA 화합물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 화합물 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유전자와 관련된 다양한 질환 또는 상태 및/또는 이러한 질환 또는 상태와 관련된 증상의 발생 또는 위급도를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 이러한 질환 또는 상태 및/또는 증상의 치료를 필요로 하는 피험자에게 화합물 또는 제약 조성물을 피험자를 치료할 수 있는 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.

Description

신규 ＳＩＲＮＡ 구조{NOVEL SIRNA STRUCTURES}
본 출원 전체에서 여러 특허 및 과학 문헌들이 인용된다. 이들 문헌의 내용은 그 전문들이 본 발명이 속한 분야의 현재 상황을 더 충분히 설명하기 위하여 본 출원에 참고자료로서 포함된다.
기술분야
본 발명은 신규한 화합물, 그것을 포함하는 제약 조성물, 및 TP53BP2, LRDD, CYBA, CASP2, N0X3, HRK, RAC1, RHOA, 및 DUOX1을 포함하는 어떤 포유류 유전자의 억제를 위한 그것의 사용 방법에 관한 것이다. 이와 같은 화합물 및 조성물은 유전자 발현이 좋지 않은 결과를 가지는 질환 또는 상태, 및/또는 이러한 질환 또는 상태와 관련된 증상으로 고통받는 피험자의 치료에서 유용하다. 특정 구체예에서, 본 발명은 신규한 화합물을 포함하는 조성물 및 그것의 사용 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 화학적으로 변형된 siRNA 올리고뉴클레오티드의 제조에 유용한 신규한 구조 모티프, 그것을 포함하는 조성물 및 그것의 사용 방법을 제공한다.
siRNA 및 RNA 간섭
RNA 간섭(RNAi)은 이중 가닥(ds) RNA-의존성 유전자 특이적 전사 후 침묵화를 수반하는 현상이다. 이 현상을 연구하여 포유류 세포를 실험적으로 조작하려고 한 초기의 시도는 긴 dsRNA 분자에 반응하여 활성화되는 활성, 비특이적 항바이러스 방어기전에 의해 좌절되었다(Gil et al., Apoptosis, 2000, 5:107-114). 이후 21개 뉴클레오티드 RNA의 합성 듀플렉스가 일반적 항바이러스 방어기전의 자극 없이 포유류 세포에서 유전자 특이적 RNAi를 매개한다는 것이 발견되었다(Elbashir et al., Nature 2001, 411:494-498 및 Caplen et al., PNAS USA 2001, 98:9742-9747 참조). 결과적으로, 작은 간섭 RNA(siRNA)가 유전자 기능을 이해하려는 시도에서 강력한 도구가 되었다.
포유류에서 RNA 간섭(RNAi)은 작은 간섭 RNA들(siRNAs)(Fire et al., Nature 1998, 391:806) 또는 마이크로RNA들(miRNAs)(Ambros, Nature 2004, 431(7006):350-355; Bartel, Cell 2004, 116(2):281-97)에 의해 매개된다. 식물에서는 상응하는 과정을 통상 특이적 전사 후 유전자 침묵화(PTGS) 또는 RNA 침묵화라고 하고, 진균에서는 퀄링(quelling)이라고도 한다.
siRNA는 그것의 내인성(세포성) 카운터파트의 유전자/mRNA의 발현을 하향-조절하거나 침묵시키는(방지하는) 이중 가닥 RNA 또는 변형된 RNA 분자이다. RNA 간섭의 기전이 하기 상세히 설명된다.
몇몇 연구는 siRNA 치료제가 포유류와 사람 양쪽에서 생체내에서 효과적임을 밝혔다. Bitko 등은 호흡기세포융합 바이러스(RSV) 뉴클레오캡시드 N 유전자에 대해 작동되는 특이적 siRNA 분자가 비강내 투여되었을 때 마우스를 치료하는데 효과적임을 보였다(Nat. Med. 2005, 11(1):50-55). siRNA 치료제를 논의하는 최근 검토자료들을 이용할 수 있다(Barik et al., J. Mol. Med 2005, 83:764-773; Dallas and Vlassov, Med. Sci. Monitor 2006, 12(4):RA67-74; Chakraborty, Current Drug Targets 2007, 8(3):469-82; Dykxhoorn et al., Gene Therapy 2006. 13:541-552).
Mucke(IDrugs 2007 10(l):37-41)는 안질환, 예를 들어 노인성 황반변성(AMD) 및 녹내장의 치료에 있어서, 다양한 표적에 대한 siRNA를 포함하여, 현재 치료제에 대한 검토자료를 제시한다.
siRNA 구조
기지 유전자에 상응하는 siRNA의 선별 및 합성이 광범하게 보고되고 있다(예를 들어, Ui-Tei et al., J Biomed Biotech. 2006; 2006:650-52; Chalk et al., BBRC. 2004, 319(1):264-74; Sioud & Leirdal, Met. Mol. Biol. 2004, 252:457-69; Levenkova et al., Bioinform. 2004, 20(3):430-2; Ui-Tei et al., NAR. 2004, 32(3):936-48).
예를 들어, 변형된 siRNA의 생성과 사용에 관해서는, 예를 들어 Braasch et al., Biochem. 2003, 42(26):7967-75; Chiu et al., RNA, 2003, 9(9):1034-48; PCT 공개 WO 2004/015107(atugen AG) 및 WO 02/44321(Tuschl et al.)을 참조한다. US 특허 Nos. 5,898,031 및 6,107,094는 화학적으로 변형된 올리고머를 교시한다. US 특허공개 Nos. 2005/0080246 및 2005/0042647은 각기 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 간 연결을 가진 모티프와 dsRNA가 교대로 있는 올리고머 화합물에 관한 것이다.
다른 변형들도 개시되었다. 5'-포스페이트 부분의 포함은 초파리 배아에서 siRNA의 활성을 증진시키는 것으로 나타났으며(Boutla et al., Curr. Biol. 2001, 1.1:1776-1780), 사람 HeLa 세포에서 siRNA 기능에 필요하다(Schwarz et al., Mol. Cell, 2002, 10:537-48). Amarzguioui 등(NAR, 2003, 31(2):589-95)은 siRNA 활성이 2'-O-메틸 변형의 위치에 의존한다는 것을 보였다. Holen 등(NAR, 2003, 31 (9):2401-07)은 적은 수의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오시드를 가진 siRNA가 야생형에 비하여 우수한 활성을 제공했으며, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오시드의 수가 증가함에 따라 활성이 감소했다는 것을 보고한다. Chiu and Rana(RNA, 2003, 9:1034-48)은 센스 또는 안티센스 가닥(완전히 변형된 가닥)에 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오시드의 편입이 미변형된 siRNA에 비해 siRNA 활성을 심하게 감소시켰다는 것을 교시한다. 안티센스 가닥의 5' 말단에 2'-O-메틸기의 배치는 활성을 심하게 제한한다고 보고되었지만, 안티센스의 3' 말단과 센스 가닥의 양쪽 말단에 배치하는 것은 관용되었다(Czauderna et al., NAR, 2003, 31(11):2705-16; WO 2004/015107). 본 발명의 분자들은 이들이 비독성이고 다양한 질환의 치료를 위한 제약 조성물의 제조에서 유용하다는 점에서 이점을 제공한다.
전구- 세포자멸 유전자
전구-세포자멸 유전자(Pro-apoptotic gene)는 일반적으로 세포자멸성 세포사에서 역할을 하는 유전자로서 정의된다. 본 발명에서 유용한 전구-세포자멸 유전자의 비제한적인 리스트는 다음과 같다: 종양 단백질 p53 결합 단백질 2(TP53BP2); 로이신-부화 반복부 및 사멸 도메인 함유체(LRDD); 시토크롬 b-245, 알파 폴리펩티드(CYBA, p22phox); 활성화 전사인자 3(ATF3); 카스파아제 2, 세포자멸-관련 시스테인 펩티다아제(CASP2); NADPH 옥시다아제 3(NOX3); 하라키리, BCL2 상호작용 단백질(HRK, BED3); 보체 성분 1, q 아요소 결합 단백질(C1QBP); BCL2/아데노바이러스 E1B 19kDa 상호작용 단백질 3(BNIP3); 미토겐-활성화 단백질 키나아제 8(MAPK8, JNK1); 미토겐-활성화 단백질 키나아제 14(MAPK14, p38); ras-관련 C3 보툴리넘 독소 기질 1(rho 패밀리, 작은 GTP 결합 단백질 RAC1); 글리코겐 신타아제 키나아제 3 베타(GSK3B); 퓨린성 수용체 P2X, 리간드-게이트 이온 채널 7(P2RX7); 일시적 수용체 잠재 양이온 채널, 서브패밀리 M, 멤버 2(TRPM2); 폴리(ADP-리보오스)글리코히드롤라아제(PARG); CD38 분자(CD38); STEAP 패밀리 멤버 4(STEAP4); 뼈 형성 단백질 2(BMP2); 간극 연접 단백질, 알파 1, 43kDa(코넥신 43, GJA1); TYRO 단백질 티로신 키나아제 결합 단백질(TYROBP); 결합조직 성장인자(CTGF); 분비된 인단백질 1(오스테오폰틴, SPP1); ras 상동체 유전자 패밀리, 멤버 A(RHOA); 및 이중 옥시다아제 1(DUOX1).
본 발명의 양수인의 PCT 특허출원 No. PCT/IL2007/001278(PCT 공개 No. WO 2008/050329) 및 US Serial No. 11/978,089는 상기-언급된 유전자들의 억제제에 관한 것으로서, 전문이 참고자료로 포함된다.
청력 손실
화학물질-유도 내이독성
청각세포 및 나선신경절(spiral ganglion neuron)에 대한 여러 치료 약물의 내이독성 효과가 주로 이들의 치료적 유용성을 제한하는 요인이다. 흔히 사용되는 내이독성 약물은 광범하게 사용되는 화학치료제인 시스플라틴과 그 유사체들, 아미노글리코시드 항생제류, 예를 들어 젠타마이신, 퀴닌 및 그 유사체들, 살리실레이트와 그 유사체들, 및 루프-이뇨제류를 포함한다.
예를 들어, 젠타마이신, 스트렙토마이신, 카나마이신, 토브라마이신 등의 항균성 아미노글리코시드는 심각한 독성 부작용, 특히 내이독성 및 신장독성을 가진다고 알려져 있고, 이로 인해 치료제로서의 가치가 저하된다(Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 6th ed., A. Goodman Gilman et al., eds; Macmillan Publishing Co., Inc., 1980. New York, pp. 1169-71 참조). 따라서, 내이독성은 항생제 투여에서 용량-제한적 부작용으로 인식되고 있다. 연구들은 1주일이 넘는 기간 동안 하루 1g씩 복용한 환자들 중 4-15%에서 측정가능한 청력 손실이 발생하고, 만일 치료가 계속된다면 청력 손실이 점차 악화되어 결국에는 영구적 난청을 초래할 수 있다고 밝히고 있다. 또한, 내이독성은 고환암, 난소암, 방광암 및 두경부암을 비롯한 사람의 각종 암에 대해 효과가 증명된 백금 배위 복합체인 시스플라틴에 대한 중대한 용량-제한적 부작용이다. 시스플라틴(Platinol®)은 청각 및 전정 시스템을 손상시킨다고 알려져 있다. 아스피린과 같은 살리실레이트류는 가장 흔히 사용되는 치료 약물이며, 항염, 진통, 해열 및 항혈전 효과를 가진다. 불행하게도 이들 역시 내이독성 부작용을 가지며, 이명("귀울림") 및 일시적 청력 손실을 초래할 수 있다. 더욱이, 이 약물을 장기간 동안 고 용량으로 사용할 경우, 만성적이며 비가역적인 청력 손상이 생길 수 있다.
이론과 결부되지는 않지만, 시스플라틴 약물 및 다른 잠재적으로 내이독성인 약물은 내이 조직, 특히 내이 유모세포에서 세포자멸을 통해 내이독성 효과를 유도한다(Zhang et al, Neuroscience 2003, 120(1):191-205; Wang et al., 2003, J. Neuroscience, 23(24):8596-8607). 고 용량의 내이독성 약물의 장기적 사용은 영구적이며 비가역적인 청력 손상을 가져온다. 포유류에서 청각 유모세포는 배아 발생 동안에만 생성되고, 출생 후 살아가면서 상실되면 재생되지 않는다. 따라서, 유모세포의 상실은 심한 비가역적인 난청을 초래할 것이다.
불행하게도 와우를 치료하여 난청을 회복시키는 효과적인 치료법은 현재 존재하지 않는다. 따라서, 청각 유모세포의 세포사를 예방하기 위한 효과적인 치료법은 대단한 치료적 가치를 가질 것이다. 본 발명의 출원인에게 양도된 US Serial No. 11/655,610는 p53 폴리뉴클레오티드 억제제, 및 선택적으로 전구-세포자멸 유전자의 억제제를 유효량 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함하는 피험자에서 청력 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
노인성 난청
또 다른 타입의 청력 손실은 바로 노인성 난청인데, 이것은 사람이 나이 들면서 점차 발생하는 청력 손실이다. 65-75세 연령대의 성인 중 약 30-35%와 75세 이상의 사람 중 40-50%가 청력 손실을 경험한다. 따라서, 내이조직, 특히 내이 유모세포가 관련된 내이 장애 및 청력 손상의 병발 및/또는 심한 정도를 예방, 감소 또는 치료할 수 있는 수단이 필요하다.
외상성 난청
외상성 난청은 큰 소음에 장기간 노출됨으로써 야기되는 청력 손실의 일종이다. 이론과 결부시키고 싶지는 않지만, 큰 소음에 노출되면 와우 상의 유모세포의 민감성이 저하되게 된다. 더욱 심하게 노출되면 인접 지지세포의 손실로부터 손상이 진행될 수 있으며, 결국 코르티 기관이 파괴되게 된다. 감각세포의 죽음은 진행성 월러 변성(Wallerian degeneration)과 일차 청신경 섬유의 상실을 초래할 수 있다. 따라서, 내이 장애 및 청력 손상, 신장 손상(신장독성) 및 신경 손상(신경독성)을 비롯한 화학물질 독성으로 인한 질환 또는 장애의 병발 및/또는 심한 정도를 예방, 감소 또는 치료할 수 있는 수단이 필요하다.
급성 신부전증
급성 신부전증(ARF)은 수일 내에 발생하는 신장기능의 급속한 악화를 특징으로 하는 임상 증후군이다. ARF의 주된 특징은 사구체 여과율(GFR)의 급격한 감소이며, 그 결과 질소성 배설물(요, 크레아티닌)이 체류하게 된다. 세계적으로 연간 100만명 당 약 170-200명에서 중증 ARF가 발생한다. 현재 특별히 확립된 ARF 치료법은 없는 상황이다. 몇 가지 약물이 동물 모델에서 독성 및 허혈성의 실험적 ARF를 완화한다고 판명되었으며, 이것은 저하된 혈청 크레아니틴 수준, 감소된 조직학적 손상 및 신장기능의 빠른 회복에 의해 분명히 나타난다. 이들은 항산화제, 칼슘 채널 차단제, 이뇨제, 혈관작용 물질, 성장인자, 항염제 등을 포함한다. 그러나, 이들 약물을 임상시험에서 시험하였을 때는 이점을 나타내지 않았고, ARF 치료에서의 사용이 승인되지 않았다.
입원중인 ARF 환자의 대부분에서, ARF는 허혈 및/또는 신장독성 손상으로 인한 급성 신장기부관 괴사(ATN)에 의해 야기된다. 신장 저관류는 혈관수축 약물의 투여나 신혈관 손상에 의한 저혈량성, 심장성 및 패혈증성 쇼크에 의해 야기된다. 신장독소는 조영제 및 아미노글리코시드와 같은 내독소뿐 아니라 미오글로빈과 같은 내독소를 포함한다. 최근 연구들은 신장조직에서 세포자멸이 사람에서 대부분의 ARF 증례에서 두드러짐을 시사한다. 세포자멸성 세포사의 주요 부위는 원위 네프론이다. 허혈성 손상의 초기 단계 동안 액틴 세포골격의 완전성의 손실이 상피를 평탄화시키고, 이와 함께 솔 가장자리(brush border)와 초점세포 접촉부가 상실되며, 이어서 기저 하층으로부터 세포가 유리된다. 세포자멸성 관상세포사는 괴사성 세포사보다 기능적 변화의 더 많은 전조가 될 수 있다고 제시되었다(Komarov et al., 1999, Science. 285(5434):1733-7; Supavekin et al., 2003, Kidney Int. 63(5):1714-24). 결론적으로, 급성 신부전증의 예방 및/또는 치료에 대해 현재 만족스러운 치료법은 없는 상황이며, 이런 목적을 위한 신규 화합물의 개발이 분명히 필요하다.
신장이식
이식 신기능 지연
이식 신기능 지연(DGF)은 신장이식에서 수술 직후 발생하는 가장 흔한 합병증이며, 불량한 이식 결과를 초래한다(Moreso et al., Nephrol. Dial. Transplant. 1999, 14(4):930-35). DGF의 병발 및 정의는 이식센터마다 다르지만, 그 결과는 일정하며, 장기입원, 추가적인 침습적 과정, 및 환자와 보건시스템에 대한 추가 비용을 포함한다.
급성 이식거부반응
이식거부반응은 이식편 파괴의 개시에 따라서 세 가지 하위군으로 범주화된다. 초급성 거부반응은 일반적으로 최초 48시간 내에 발생하는 매우 빠른 이식편 파괴에 적용되는 용어이다. 급성 거부반응은 이식 후 수일에서 수 개월 또는 심지어 수년 뒤에 개시되며, 체액성 및/또는 세포성 기전을 수반할 수 있다. 만성 거부반응은 만성적인 동종반응성 면역반응과 관련된다.
녹내장
녹내장은 세계적으로 실명을 가져오는 주된 원인 중 하나이다. 전세계에서 약 6680만명의 사람이 녹내장에 걸린다. 적어도 12,000명의 미국인들이 매년 녹내장으로 인해 실명한다(Kahn and Milton, Am. J. Epidemiol. 1980, 111(6):769-76). 녹내장은 시신경 머리에 있는 축삭의 변형을 특징으로 하는데, 이것의 주된 원인은 상승된 안내압력(IOP)이다. 녹내장의 가장 흔한 형태 중 하나는 원발성 개방우각 녹내장(POAG)이라고 하는 것인데, 이것의 원인은 섬유주(TM: trabecular meshwork)에서 방수액 유출에 대한 저항이 증가하기 때문이며, IOP 상승과 최종적으로는 시신경 손상을 일으킨다. Mucke(IDrugs 2007, 10(1):37-41)는 안질환, 예를 들어 노인성 황반변성(AMD) 및 녹내장의 치료를 위한 다양한 표적에 대한 siRNA를 포함하여, 현행 치료제들을 검토하고 있다.
급성 호흡곤란 증후군
급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 호흡곤란 증후군(RDS) 또는 성인 호흡곤란 증후군(유아 호흡곤란 증후군, IRDS와 대조하여)이라고도 하며, 다양한 형태의 폐 손상에 따른 심각한 반응이다. 이것은 투과성 폐부종을 증가시키는 가장 중요한 장애이다.
ARDS는 여러 직간접적 손상에 의해 야기되는 중증 폐질환이다. 이것은 폐실질의 염증을 특징으로 하며, 이에 의해 가스 교환이 손상되는 것과 동시에 염증성 매개인자가 전신으로 방출되어 염증, 저산소혈증을 일으키고, 빈번히 다발성 장기부전을 초래한다. 이 상태는 생명을 위협하고 대체로 치사적이며, 일반적으로 기계호흡 및 집중치료실 입원이 필요하다. 덜 심각한 형태는 급성 폐손상(ALI)이라고 한다.
장기이식 후 허혈- 재관류 손상
허혈-재관류 손상(IRI)은 동종 장기이식 수여자의 주된 사망 원인 중 하나이다. 사망한 공여자로부터의 모든 장기이식에서 그리고 간 공여자로부터의 일부 경우에 중대한 IRI가 발생한다. 이것은 급성 거부반응의 증가와 장기적인 동종이식 기능의 손상에 기여한다. 말기 폐질환을 가진 많은 환자들에 대한 유일한 확정 치료법인 폐이식은 모든 고형 동종이식 수여자에서 불량한 생존율을 보인다.
급성 폐이식 거부반응
급성 동종이식 거부반응은 면역억제 약물치료의 진전에도 불구하고 폐이식에 중대한 문제를 남기고 있다. 거부반응 그리고 궁극적으로 조기 유병률 및 사망률은 허혈-재관류(I/R) 손상 및 저산소성 손상의 결과일 수 있다.
척수 손상
척수 손상은 감각 및/또는 운동성의 상실을 초래하는 척수의 장애이며, 척수병증이라고도 한다. 척수 손상의 가장 흔한 두 가지 타입은 외상 및 질환으로 인한 것이다. 외상성 손상은 대체로 차량 사고, 추락, 총상, 다이빙 사고 등이 원인이다. 척수에 영향을 미칠 수 있는 질환은 소아마비, 척추분리증, 종양 및 프리드라이히 운동실조가 원인이다.
압력상처
압력상처는 주로 욕창 또는 압력궤양이라고 하며, 피부 및 조직이 손상된 영역이다. 완화되지 않는 압력하에서 조직 허혈이 발생할 수 있고, 그 결과 사이질 조직에 대사 배설물이 축적되고, 이로써 무산소증과 세포사가 발생한다. 또한, 이런 압력-유도 허혈은 과도한 조직 저산소증을 가져오며, 더 나아가 박테리아 증식과 조직 파괴를 촉진한다.
노인성 황반변성
미국에서 65세 이상의 사람에서 최대 교정시력이 감소하는 가장 흔한 원인은 노인성 황반변성(AMD)이라고 알려진 망막 장애이다. 광수용체 세포로 주로 이루어진 망막의 중심에 있는 작은 영역인 반상이 AMD에 의해서 침범되는 눈의 영역이다. AMD가 진행함에 따라 이 질환은 선명한 중심시력의 상실이 특징으로 나타난다. 소위 말하는 "건성" AMD가 AMD 환자의 약 85%-90%를 차지하며, 이것은 눈 색소 분포의 변화, 광수용체의 상실 및 전반적인 세포 위축으로 인한 망막기능의 감소를 수반한다. "습성" AMD는 비정상 맥락막 혈관의 증식을 수반하며, 이것은 망막 밑 공간에 응혈이나 흉터를 만든다. 따라서, "습성" AMD의 개시는 신경망막 아래에 비정상 맥락막 신생혈관망의 형성(맥락막 혈관신생, CNV)으로 인해 일어난다. 새로 형성된 혈관은 과도하게 누출성이어서 망막 밑에 체액과 혈액이 축적되고, 이로써 시력이 상실된다. 결국, 맥락막과 망막을 포함하는 커다란 원반형 흉터가 형성됨에 따라 관련된 영역에서 기능 망막이 완전히 상실된다. 건성 AMD 환자는 저하된 시력이나마 보유할 수 있지만, 습성 AMD는 주로 실명을 초래한다(Hamdi & Kenney, Frontiers in Bioscience, e305-314, May 2003).
당뇨성 망막병증
당뇨성 망막병증(DR)은 과도한 모세혈관 투과성, 혈관폐쇄, 및 신생 혈관의 증식을 나타내는 망막혈관 장애로서 인식된다. DR은 비증식성과 증식성의 두 단계로 발생한다. 비증식성 단계에서 이 질환은 망막 모세혈관 혈관주위세포 상실, 기저막 비후화, 및 미세동맥류, 점-반점 출혈 및 경성 삼출물의 발생을 특징으로 한다. 비증식성 단계에서 이 질환은 광범한 혈관신생, 유리체로 혈관 침입, 출혈 및 섬유증과 그에 따른 망막 견인을 특징으로 하며, 이로써 심한 시력 손상이 초래된다. 본 발명의 양수인의 US 특허 No. 6,740,738 및 관련 특허와 출원들은 특히 망막병증을 치료하기 위해 RTP801 유전자 및 단백질을 억제하는 방법에 관한 것이다.
입안염
입안염은 구내염이라고도 하며, 화학요법과 방사선요법 섭생에서 흔히 나타나는 소모성 부작용으로서, 입안과 목의 홍반 및 통증이 있는 궤양성 병소로서 나타난다. 심한 입안염을 가진 환자는 먹고 마시고 삼키고 이야기하는 것과 같은 일상적인 활동이 어렵거나 불가능할 수 있다. 완화를 위한 치료법은 진통제 및 국소 헹굼제의 투여를 포함한다.
안구건조증
안구건조증은 일반적으로 눈에서 윤활 작용을 하는 눈물막의 생성에 생긴 질환으로 인해 일어나는 흔한 문제이다. 안구건조증 환자는 대부분 불편함을 경험하고 시력 손실은 없지만, 심한 경우에는 각막이 손상되거나 감염될 수도 있다. 눈을 적셔주는 안약(인공 눈물)이 치료에 사용될 수 있으며, 더 심한 경우에는 윤활 연고가 도움이 될 수 있다.
허혈성 안구이상
허혈성 시신경병증(ION)은 시신경에 허혈을 유발하는 다양한 장애를 포함한다. 정의에 따르면 ION은 원반형 부종이 급성으로 나타날 경우 전방 ION이라고 하며, 이는 안구에 가장 가까운 시신경의 일부가 경색된 것을 시사한다. 또한, ION은 안구 수 센티미터 뒤에서 발견되는 후방 ION일 수도 있다. 허혈성 시신경병증은 일반적으로 60세 이상의 사람에게만 발생한다. 대부분의 경우는 비동맥성이며, 시신경 관류에 대한 죽상경화증, 당뇨병 또는 고혈압의 영향으로 인한 탓이다. 일시적 동맥염이 약 5%의 증례에서 발생한다(동맥성 ION).
증상 및 징후는 시신경 머리의 팽윤과 대체로 출혈이 수반되는 갑작스런 부분적이거나 완전한 시력 상실이다. 시야 결여는 수평 경계와 함께 시야의 절반의 상실로서, 또는 중심 또는 중앙황반부(자연 맹점을 둘러싼) 암점으로서 나타날 수 있다. 감소된 시력은 곧 시신경 유두의 창백으로 이어진다.
상기 언급된 질환 및 장애들을 치료하기 위한 더욱 효과적인 치료법들은 매우 큰 치료적 가치를 가질 것이다.
본 발명은 신규한 TP53BP2, LRDD, CYBA, CASP2, NOX3, HRK, RAC1, RHOA 및 DUOX1 siRNA, 그리고 일반적인 유전자 발현의 억제, 특히 포유류 유전자 TP53BP2, LRDD, CYBA, ATF3, CASP2, N0X3, HRK, CIQBP, BNIP3, MAPK8, MAPK14, RAC1, GSK3B, P2RX7, TRPM2, PARG, CD38, STEAP4, BMP2, CX43, TYROBP, CTGF, SPP1, RHOA, 및 DUOX1의 억제를 위한 신규한 화학적으로 및/또는 구조적으로 변형된 siRNA 화합물을 제공한다(유전자들의 상세는 하기 표 A를 참조한다).
또한, 어떤 표적 서열에 대한 siRNA에 적용될 수 있는, 특히 본원에 개시된 siRNA 올리고뉴클레오티드에 적용될 수 있는 유리한 특성을 갖는 신규한 구조의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 본 발명에서 개시된 화학적으로 변형된 siRNA 모티프는 RNA 간섭(RNAi)에 유용한 안정한 활성 화합물의 제조에 있어서 유용하다.
또, 본 발명은 하나 이상의 이러한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 필요한 피험자에서 질환 또는 상태의 병발 또는 위급도를 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이며, 이때 관련된 질환 또는 상태 및/또는 증상은 표적 유전자의 발현과 관련된다. 어떤 구체예에서, 질환 또는 상태는 청력 손실, 급성 신부전증(ARF), 녹내장, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 다른 급성 폐 및 호흡기 손상, 폐이식 후 허혈-재관류 손상, 허혈성 안구이상, 폐, 간, 심장, 췌장 및 신장 이식을 포함하는 장기이식, 신장독성 및 신경독성, 척수 손상, 압력상처, 노인성 황반변성(AMD), 안구건조증, 입안염, 허혈성 시신경병증(ION) 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 이러한 방법은 적어도 하나의 이러한 유전자의 발현 또는 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 하나 이상의 이러한 화합물의 예방적 또는 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함한다.
따라서, 한 양태로서, 본 발명은 LRDD, CYBA, CASP2, N0X3, HRK, RAC1, RHOA 및 DUOX1로부터 선택된 유전자를 억제하는데 유용한 신규한 올리고뉴클레오티드 서열을 제공하며, 이것들의 mRNA 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 1-2, 3-5, 6, 10-11, 12, 13, 24-26, 46 및 47-48에 각각 제시된다. 표 D(D1-D34)는 본 발명의 19, 21 및 23-mer 센스 및 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 일반적인 유전자 발현 또는 TP53BP2, LRDD, CYBA, ATF3, CASP2, N0X3, HRK, CIQBP, BNIP3, MAPK8, MAPK14, RAC1, GSK3B, P2RX7, TRPM2, PARG, CD38, STEAP4, BMP2, CX43, TYROBP, CTGF, SPP1, RHOA, 또는 DUOX1로부터 선택된 유전자의 유전자 발현을 억제하는데 유용한 화학적으로 및/또는 구조적으로 변형된 핵산 화합물을 제공한다. 다양한 구체예에서, 변형된 화합물은 표 B(B1-B74) 및 C(C1-C3)에 나타낸, SEQ ID NOS: 97-68654(본원에 전문이 참고자료로 포함되는 US Ser. No. 11/978,089 및 PCT 특허출원 No. PCT/IL2007/001278에 개시됨)에 제시된 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, 화학적으로 및/또는 구조적으로 변형된 siRNA 화합물은 표 D(D1-D34; SEQ ID NOS: 68,655-87,088)에 나타낸 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 양태로서, 본 발명은 하기 제시된 구조 (A)를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure pct00001
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
(N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
x와 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
Z와 Z'는 각각 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 그것이 존재하고 있는 가닥의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 연속 뉴클레오티드이고;
(N)x의 서열은 표 D(D1-D34)에 나타낸 안티센스 서열 중 하나 이상을 포함한다.
어떤 구체예에서, (N)x와 (N')y는 완전히 상보적이다. 또 다른 구체예에서, (N)x와 (N')y는 실질적으로 상보적이다. 어떤 구체예에서, (N)x는 표적 서열과 완전히 상보적이다. 다른 구체예에서, (N)x는 표적 서열과 실질적으로 상보적이다. 어떤 바람직한 구체예에 따라서, 본 발명은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA 화합물을 제공하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 당 부분, 염기 부분 또는 뉴클레오티드 간 연결 부분에 변형을 지닌다.
한 양태로서, 본 발명은 하기 제시된 구조 (IX)를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure pct00002
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 또는 변형될 수 있는 리보뉴클레오티드, 또는 비정규 부분이고;
(N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
Z와 Z'는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 독립적으로 그것이 존재하고 있는 가닥의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 연속 뉴클레오티드이고;
z"는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 (N')y의 5' 말단에 공유 부착된 캡핑 부분이고;
x는 18 내지 27이고;
y는 18 내지 27이고;
(N)x는 변형된 및 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지며, (N)x의 3' 말단에 있는 N은 변형된 리보뉴클레오티드이고, (N)x는 3' 단부에서 시작하여 적어도 5개의 변형된 리보뉴클레오티드를 교대로 포함하며, 전체 적어도 9개의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 각 나머지 N은 미변형된 리보뉴클레오티드이고;
(N')y에는 적어도 하나의 비정규 부분이 존재하며, 비정규 부분은 비염기성 리보오스 부분, 비염기성 데옥시리보오스 부분, 변형된 또는 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드 및 2'-5' 뉴클레오티드 간 포스페이트 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드일 수 있고;
(N)x의 서열은 (N')y의 서열과 실질적으로 상보적이며, (N')y의 서열은 표적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA의 서열과 실질적으로 동일하다.
어떤 구체예에서, x=y=19이다. 다른 구체예에서, x=y=23이다. 어떤 구체예에서, 적어도 하나의 비정규 부분이 (N')y의 위치 15, 16, 17 또는 18에 존재한다. 어떤 구체예에서, 비정규 부분은 거울 뉴클레오티드, 비염기성 리보오스 부분 및 비염기성 데옥시리보오스 부분으로부터 선택된다. 어떤 바람직한 구체예에서, 비정규 부분은 거울 뉴클레오티드, 바람직하게는 L-DNA 부분이다. 어떤 구체예에서, L-DNA 부분은 위치 17, 위치 18, 또는 위치 17과 18에 존재한다.
다른 구체예에서, 비정규 부분은 비염기성 부분이다. 다양한 구체예들에서, (N')y는 적어도 5개의 비염기성 리보오스 부분 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분을 포함한다.
또 다른 구체예에서, (N')y는 적어도 5개의 비염기성 리보오스 부분 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분을 포함하며, N' 중 적어도 하나는 LNA이다.
구조 (IX)의 어떤 구체예에서, (N)x는 9개의 변형된 리보뉴클레오티드를 교대로 포함한다. 구조 (IX)의 또 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2에 2'O 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하는 9개의 변형된 리보뉴클레오티드를 교대로 포함한다. 어떤 구체예에서, (N)x는 홀수 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19에 2'O Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2와 18 중 하나 또는 둘 다에 2'O Me 변형된 리보뉴클레오티드를 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19에 2'O Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
다양한 구체예들에서, z"가 존재하며, 비염기성 리보오스 부분, 데옥시리보오스 부분; 반전된 비염기성 리보오스 부분, 데옥시리보오스 부분; C6-아미노-Pi; 거울 뉴클레오티드로부터 선택된다.
다른 양태로서, 본 발명은 하기 제시된 구조 (X)를 가진 화합물을 제공한다:
Figure pct00003
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 또는 변형될 수 있는 리보뉴클레오티드, 또는 비정규 부분이고;
(N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
Z와 Z'는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 독립적으로 그것이 존재하고 있는 가닥의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 연속 뉴클레오티드이고;
z"는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 (N')y의 5' 말단에 공유 부착된 캡핑 부분이고;
x는 18 내지 27이고;
y는 18 내지 27이고;
(N)x는 변형된 및 미변형된 리보뉴클레오티드, 및 선택적으로 적어도 하나의 비정규 부분을 포함하고;
(N')y에는 적어도 하나의 비정규 부분이 존재하며, 비정규 부분은 비염기성 리보오스 부분, 비염기성 데옥시리보오스 부분, 변형된 또는 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 비염기쌍 뉴클레오티드 유사체 또는 2'-5' 뉴클레오티드 간 포스페이트 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드일 수 있고;
(N)x의 서열은 (N')y의 서열과 실질적으로 상보적이며, (N')y의 서열은 표적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA의 서열과 실질적으로 동일하다.
어떤 구체예에서, x=y=19이다. 다른 구체예에서, x=y=23이다. 어떤 바람직한 구체예에서, (N)x는 변형된 및 미변형된 리보뉴클레오티드와 적어도 하나의 비정규 부분을 포함한다. 다양한 구체예들에서, (N)x는 mRNA에 상보하는 15개 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 구체예에서, (N)x에서 3' 말단에 있는 N은 변형된 리보뉴클레오티드이고, (N)x는 적어도 8개의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 적어도 8개의 변형된 리보뉴클레오티드 중 적어도 5개는 3' 단부에서 시작하여 교대로 위치한다. 어떤 구체예에서, (N)x는 위치 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 중 하나에 비염기성 부분을 포함한다.
어떤 구체예에서, (N')y에서 적어도 하나의 비정규 부분은 위치 15, 16, 17 또는 18에 존재한다. 어떤 구체예에서, 비정규 부분은 거울 뉴클레오티드, 비염기성 리보오스 부분 및 비염기성 데옥시리보오스 부분으로부터 선택된다. 어떤 바람직한 구체예에서, 비정규 부분은 거울 뉴클레오티드, 바람직하게는 L-DNA 부분이다. 어떤 구체예에서, L-DNA 부분은 위치 17, 위치 18, 또는 위치 17과 18에 존재한다. 다른 구체예에서, (N')y에서 적어도 하나의 비정규 부분은 비염기성 리보오스 부분 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분이다. 어떤 구체예에서, 15개 미만의 염기쌍이 (N)x와 (N')y 사이에 존재한다.
구조 (X)의 다양한 구체예들에서, z"가 존재하며, 비염기성 리보오스 부분, 데옥시리보오스 부분; 반전된 비염기성 리보오스 부분, 데옥시리보오스 부분; C6-아미노-Pi; 거울 뉴클레오티드로부터 선택된다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 제시된 구조 (XI)를 가진 화합물을 제공한다:
Figure pct00004
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 또는 변형될 수 있는 리보뉴클레오티드, 또는 비정규 부분이고;
(N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
Z와 Z'는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 독립적으로 그것이 존재하고 있는 가닥의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 연속 뉴클레오티드이고;
z"는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 (N')y의 5' 말단에 공유 부착된 캡핑 부분이고;
x는 18 내지 27이고;
y는 18 내지 27이고;
(N)x는 변형된 또는 미변형된 리보뉴클레오티드와 비정규 부분의 조합을 포함하며, 어떤 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지고;
(N')y는 변형된 또는 미변형된 리보뉴클레오티드, 및 선택적으로 비정규 부분을 포함하며, 어떤 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'O Me를 가지고;
(N)x의 서열은 (N')y의 서열과 실질적으로 상보적이며, (N')y의 서열은 표적 유전자에 의해 암호화되는 mRNA의 서열과 실질적으로 동일하고;
mRNA에 상보하는 15개 미만의 연속 뉴클레오티드가 존재한다.
어떤 구체예에서, x=y=19이다. 다른 구체예에서, x=y=23이다. 어떤 바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 바람직한 비정규 부분이 (N)x에 존재하며, 비염기성 리보오스 부분 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 비정규 부분이 (N)x에 존재하며, 비염기쌍 뉴클레오티드 유사체이다. 다양한 구체예들에서, (N)x는 mRNA에 상보하는 15개 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 구체예들에서, (N')y는 미변형 리보뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, (N)x는 적어도 5개의 비염기성 리보오스 부분 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분 또는 이들의 조합을 포함한다. 어떤 구체예에서, (N)x 및/또는 (N')y는 (N')y 및/또는 (N)x에 있는 상응하는 변형된 또는 미변형된 리보뉴클레오티드와 염기쌍이 아닌 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
구조 (IX), (X) 및 (XI) 부분은 포유류 또는 비포유류 유전자에 대한 어떤 올리고뉴클레오티드 쌍(센스 및 안티센스 가닥)과 함께 유용하다. 어떤 구체예에서, 포유류 유전자는 사람 유전자이다. 다양한 구체예들에서, 사람 유전자의 mRNA가 SEQ ID NOS: 1-41, 46-48 중 하나에 제시된다.
어떤 구체예에서, 구조 (IX), (X)및 (XI) 모티프는 표 B(B1-B74), C(C1-C34) 및 D(D1-D34)(SEQ ID NOS: 97-87, 178)에 제시된 올리고뉴클레오티드 쌍과 조합하여 사용된다.
다양한 구체예들에서, 본 발명은 구조 (IV)에 제시된 siRNA를 제공한다:
Figure pct00005
여기서, N 및 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴크레오티드이고;
(N)x 및 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
Z 및 Z'는 부재하고;
x=y=19이고;
(N')y에서 위치 15, 16, 17, 18 및 19 중 적어도 하나에 있는 뉴클레오티드는 비염기성 가-뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 및 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드를 포함하고;
(N)x는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드를 교대로 포함하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형되고, (N)x의 중앙 위치에 위치된 리보뉴클레오티드는 변형되거나 변형되지 않으며, 바람직하게는 변형되고;
(N)x의 서열은 (N')y의 서열과 실질적으로 상보적이며, (N')y의 서열은 표적 유전자의 mRNA와 실질적으로 동일하다.
구조 (IV)의 어떤 구체예에서, (N')y에서 위치 17과 18 중 하나 또는 둘 다에 있는 뉴클레오티드는 비염기성 가-뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드 및 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-DNA와 L-RNA로부터 선택된다. 다양한 구체예들에서, 거울 뉴클레오티드는 L-DNA이다.
다양한 구체예들에서, (N')y는 위치 15에 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, (N')y는 위치 2에 변형된 뉴클레오티드 또는 가-뉴클레오티드를 더 포함하며, 이때 가-뉴클레오티드는 비염기성 가-뉴클레오티드 유사체일 수 있고, 변형된 뉴클레오티드는 선택적으로 거울 뉴클레오티드이다.
다양한 구체예들에서, 안티센스 가닥 (N)x는 홀수 위치(5'에서 3' 방향으로; 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19)에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, (N)x는 위치 2와 18 중 하나 또는 둘 다에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 더 포함한다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
x=y=21, 또는 x=y=23인 구조 (IV), (IX) 및 (X)의 다른 구체예가 고안된다. 이들 구체예에서는, 상기 논의된 (N')y에 대한 변형이 위치 17 및 18에 있는 대신에 21-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 19 및 20에, 그리고 23-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 21 및 22에 있다. 유사하게, 위치 15, 16, 17, 18 또는 19에 있는 변형은 21-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 17, 18, 19, 20 또는 21에, 그리고 23-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 19, 20, 21, 22 또는 23에 있다. 안티센스 가닥 상의 2'O Me 변형은 유사하게 조정된다. 어떤 구체예에서, (N)x는 홀수 위치(5'에서 3' 방향으로: 21-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20[위치 11에 있는 뉴클레오티드는 미변형됨], 그리고 23-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23[위치 12에 있는 뉴클레오티드는 미변형됨])에 2'O Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, (N)x는 21-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20[위치 11에 있는 뉴클레오티드는 미변형됨]에, 그리고 23-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23[위치 12에 있는 뉴클레오티드는 미변형됨]에 2'O Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 구체예에서, (N')y는 5' 말단 캡 뉴클레오티드를 더 포함한다. 다양한 구체예들에서, 말단 캡 부분은 비염기성 가-뉴클레오티드 유사체, 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드 유사체, L-DNA 뉴클레오티드, 및 C6-이민 포스페이트로부터 선택된다.
구조 (IV) 모티프는 포유류 또는 비포유류 유전자에 대한 어떤 올리고뉴클레오티드 쌍(센스 및 안티센스 가닥)과 함께 유용하다. 어떤 구체예에서, 포유류 유전자는 사람 유전자이다. 다양한 구체예들에서, 사람 유전자의 mRNA가 SEQ ID NOS: 1-41, 46-48 중 하나에 제시된다.
어떤 구체예에서, 구조 (IV) 모티프는 표 B(B1-B74), C(C1-C3C4)및 표 D(D1-D34)(SEQ ID NOS: 97-87,178)에 나타낸 올리고뉴클레오티드 쌍과 조합하여 사용된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 제시된 구조 (V)를 가진 화합물을 제공한다:
Figure pct00006
여기서, N 및 N'는 각각 가-뉴클레오티드 및 뉴클레오티드로부터 선택되고; 각 뉴클레오티드는 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택되고;
(N)x 및 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
Z 및 Z'는 부재하고;
x는 18 내지 27이고;
y는 18 내지 27이고;
(N)x의 서열은 (N')y의 서열과 실질적으로 상보적이며, (N')y의 서열은 표적 서열의 mRNA와 실질적으로 동일하고;
N 중 적어도 하나는 비염기성 가-뉴클레오티드, 비염기쌍 뉴클레오티드 유사체 및 (N)x의 어떤 위치에 있는 표적 유전자의 mRNA에 대한 뉴클레오티드 미스매치로부터 선택되며, 이로써 (N)x가 표적 유전자의 mRNA에 상보하는 15개 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하게 된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 제시된 구조 (VI)를 갖는 이중 가닥 화합물을 제공한다:
Figure pct00007
여기서, N 및 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
(N)x 및 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
Z 및 Z'는 부재하고;
x 및 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
(N)x의 서열은 (N')y의 서열과 실질적으로 상보적이며, (N')y의 서열은 표적 유전자의 mRNA와 실질적으로 동일하고;
(N)x, (N')y 또는 (N)x와 (N')y는 (N)x와 (N')y가 이중 가닥 화합물 내에 15개 미만의 염기쌍을 형성하도록 하는 비염기쌍 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 제시된 구조 (VII)를 가진 화합물을 제공한다:
Figure pct00008
여기서, 각 N은 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
각 N'는 6-원 당 뉴클레오티드, 7-원 당 뉴클레오티드, 모르폴리노 부분, 펩티드 핵산 및 이들의 조합으로부터 선택된 뉴클레오티드 유사체이고;
(N)x 및 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
Z 및 Z'는 부재하고;
x 및 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
(N)x의 서열은 (N')y의 서열과 실질적으로 상보적이며, (N')y의 서열은 표적 유전자의 mRNA와 실질적으로 동일하다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 제시된 구조 (VIII)를 가진 화합물을 제공한다:
Figure pct00009
여기서, N 및 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
(N)x 및 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
Z 및 Z'는 부재하고;
x 및 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
(N)x 또는 (N')y의 내부에 위치한 N 또는 N' 중 하나 또는 (N)x 또는 (N')y의 말단에 위치한 N 또는 N' 중 하나 이상은 비염기성 부분 또는 2' 변형된 뉴클레오티드를 포함하고;
(N)x의 서열은 (N')y의 서열과 실질적으로 상보적이며, (N')y의 서열은 표적 유전자의 mRNA와 실질적으로 동일하다.
구조 (V) 내지 (VIII)의 어떤 구체예에서, (N)x는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드를 교대로 포함하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형된다. 어떤 구체예에서, (N)x의 중앙 위치에 위치된 N은 변형되지 않는다.
구조 (IV)의 어떤 구체예에서, (N')y에서 위치 17과 18 중 하나 또는 둘 다에 있는 뉴클레오티드는 비염기성 가-뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드 및 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-DNA와 L-RNA로부터 선택된다. 다양한 구체예들에서, 거울 뉴클레오티드는 L-DNA이다.
다양한 구체예들에서, (N')y는 위치 15에 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, (N')y는 위치 2에 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드 및 비염기성 가-뉴클레오티드 유사체로부터 선택된다.
다양한 구체예들에서, 안티센스 가닥 (N)x는 홀수 위치(5'에서 3' 방향으로; 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19)에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, (N)x는 위치 2와 18 중 하나 또는 둘 다에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 더 포함한다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
x=y=21, 또는 x=y=23인 구조 (IV)의 다른 구체예가 고안된다. 이들 구체예에서는, 상기 논의된 (N')y에 대한 변형이 위치 17 및 18에 있는 대신에 21-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 19 및 20에, 그리고 23-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 21 및 22에 있다. 유사하게, 위치 15, 16, 17, 18 또는 19에 있는 변형은 21-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 17, 18, 19, 20 또는 21에, 그리고 23-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 19, 20, 21, 22 또는 23에 있다. 안티센스 가닥 상의 2'O Me 변형은 유사하게 조정된다. 어떤 구체예에서, (N)x는 홀수 위치(5'에서 3' 방향으로; 21-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 1, 3, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 18, 20[위치 11에 있는 뉴클레오티드는 미변형됨], 그리고 23-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23[위치 12에 있는 뉴클레오티드는 미변형됨])에 2'O Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, (N)x는 21-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20[위치 11에 있는 뉴클레오티드는 미변형됨)에, 그리고 23-mer 올리고뉴클레오티드에서는 위치 2, 4, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19, 21, 23[위치 12에 있는 뉴클레오티드는 미변형됨]에 2'O Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 구체예에서, (N')y는 5' 말단 캡 뉴클레오티드를 더 포함한다. 다양한 구체예들에서, 말단 캡 부분은 비염기성 가-뉴클레오티드 유사체, 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드 유사체, L-DNA 뉴클레오티드, 및 C6-이민 포스페이트로부터 선택된다.
구조 (IV) 모티프는 포유류 또는 비포유류 유전자에 대한 어떤 올리고뉴클레오티드 쌍(센스 및 안티센스 가닥)과 함께 유용하다. 어떤 구체예에서, 포유류 유전자는 사람 유전자이다. 다양한 구체예들에서, 사람 유전자의 mRNA가 SEQ ID NOS: 1-41, 46-48 중 하나에 제시된다.
어떤 구체예에서, 구조 (IV) 모티프는 표 B(B1-B74), C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)에 나타낸 올리고뉴클레오티드 쌍과 조합하여 사용된다.
제 2 양태로서, 본 발명은 본원에 개시된 구조 (C)-(H) 및 관련된 구조 (I)-(XI)에 기초한 화학적으로 및/또는 구조적으로 변형된 siRNA 화합물을 제공한다. 다양한 구체예에서, siRNA 화합물은 표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및/또는 표 D(D1-D34)에 나타낸 센스 올리고뉴클레오티드 및 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 중 하나에 기초한다.
다른 양태로서, 본 발명은 사람 유전자 발현을 억제하는데 효과적인 양으로 본 발명의 변형된 또는 미변형된 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 이때 상기 화합물은 표 D(D1-D34)에 나타낸 안티센스 서열 (N)x; 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 사람 유전자 발현을 억제하는데 효과적인 양으로 본 발명의 하나 이상의 변형된 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 이때 상기 화합물은 표 B(B1-B74) 또는 표 C(C1-C4) 및/또는 표 D(D1-D34)에 나타낸 안티센스 서열 (N)x; 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 피험자가 치료될 수 있는 치료적 유효 용량으로 본 발명에 따른 siRNA의 양을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 유전자의 발현과 관련된 질환 또는 장애, 또는 질환 또는 장애와 관련된 증상의 치료가 필요한 환자의 치료를 위한 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 유전자의 mRNA 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 1-41, 46-48 중 어느 하나에 제시된다.
더 구체적으로, 본 발명은 급성 신부전증(ARF), 청력 손실, 녹내장, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 다른 급성 폐 및 호흡기 손상, 폐, 신장, 골수, 심장, 췌장, 각막 또는 간 이식 및 이식 신기능 지연(DFG)을 비롯한 장기이식에서의 손상(예를 들어, 허혈-재관류 손상), 신장독성, 척수 손상, 압력상처, 안구건조증, 입안염, 허혈성 시신경병증(ION) 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)으로 고통받는 피험자를 치료하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법은 유전자의 발현을 억제하는 하나 이상의 siRNA 화합물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 유전자의 mRNA 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 1-41, 46-48 중 어느 하나에 제시된다. 본원에 개시된 신규한 구조는 어떤 표적 유전자에 대한 안티센스 및 상응하는 센스 핵산 서열에 통합되었을 때 그 표적 유전자의 발현을 감소시키는데 유용한 siRNA 화합물을 제공한다. 표적 유전자는 포유류 또는 비포유류 유전자이다. 특정의 구체예에서, 표적 유전자는 SEQ ID NOS: 1-41, 또는 46-48 중 어느 하나로부터 선택된 mRNA를 갖는 포유류 유전자이다.
표 B 및 C에 제시된 센스 및 상응하는 안티센스 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 양수인의 PCT 공개 No. WO 2008/050329에 개시되며, 이것은 본원에 전문이 참고자료로 포함된다.
서열과 변형이 모두 공지되어 있는 siRNA는 본 발명에서 제외된다.
도 1a 및 1b는 19-mer siRNA 구조와 본 발명의 2'-O-메틸화된 화합물을 사용하여 얻어진 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 센스 가닥과 안티센스(AS) 가닥 모두에 교대하는 메틸화 패턴을 가진 23-mer siRNA 화합물의 예를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 2'-O-메틸화된 모노머를 포함하는 23-mer CASP2 siRNA 구조와 이들 화합물을 사용하여 얻어진 실험 결과를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 2'-O-메틸화된 모노머를 포함하는 23-mer CASP2 siRNA 구조와 이들 화합물을 사용하여 얻어진 실험 결과를 나타낸다.
도 5a 및 5b는 2'-O-메틸화된 모노머를 포함하는 23-mer CASP2 siRNA 구조와 이들 화합물을 사용하여 얻어진 실험 결과를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 2'5' 브릿지 뉴클레오티드를 포함하는 19-mer QM5(표적 p53) siRNA 구조와 이들 화합물을 사용하여 얻어진 실험 결과를 나타낸다.
도 7a 및 7b는 2'5' 브릿지 뉴클레오티드를 포함하는 19-mer CASP2 siRNA 구조와 이들 화합물을 사용하여 얻어진 실험 결과를 나타낸다.
도 8a 및 8b는 2'5' 브릿지 뉴클레오티드를 각각 포함하는 19-mer REDD2 및 QM5 siRNA 구조를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 2'5' 브릿지 뉴클레오티드(별표)와 2'-O-메톡시 리보뉴클레오티드(굵은 글씨, 밑줄)의 조합을 포함하는 19-mer QM5 siRNA 구조를 나타낸다.
도 9c-9e는 이들 화합물의 활성을 나타낸다.
도 10a 및 10b는 2'5' 브릿지 뉴클레오티드(별표)와 2'-O-메톡시 리보뉴클레오티드(굵은 글씨, 밑줄)의 조합을 포함하는 19-mer QM5 siRNA 구조와 이들 화합물을 사용한 실험 결과를 나타낸다.
도 10c 및 10d는 혈청 안정성 결과를 나타낸다.
도 11a 및 11b는 2'5' 브릿지 뉴클레오티드(별표)와 2'-O-메톡시 리보뉴클레오티드(굵은 글씨, 밑줄)의 조합을 포함하는 23-mer CASP2 siRNA 구조와 이들 화합물을 사용한 실험 결과를 나타낸다.
도 12a 및 12b는 2'5' 브릿지 뉴클레오티드(별표)를 포함하는 23-mer CASP2 siRNA 구조와 이들 화합물을 사용한 실험 결과를 나타낸다.
도 13a는 L-DNA 뉴클레오티드를 포함하는 QM5 siRNA 구조를 나타낸다.
도 13b는 이들 화합물을 사용한 실험 결과를 나타낸다.
도 13c는 혈청 안정성을 나타낸다.
도 13d는 교대하는 2' 메톡시 패턴을 포함하는 siRNA와 비교하여 L-DNA 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA의 IC50 값을 나타낸다.
도 14a는 LNA 뉴클레오티드를 포함하는 QM5 siRNA 구조를 나타낸다.
도 14b는 이들 화합물을 사용한 실험 결과를 나타낸다.
도 15는 직렬형 siRNA 화합물의 예와 이들의 혈청 안정성 결과를 나타낸다.
도 16은 별모양 siRNA 화합물의 예와 이들의 혈청 안정성 결과를 나타낸다.
도 17a-17c는 변형들의 조합을 포함하는 siRNA 화합물의 예를 나타낸다.
도 18은 RNA/DNA 키메라 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도 19a-19d는 L-DNA 모티프를 단독으로 또는 추가의 변형과 조합하여 포함하는 올리고뉴클레오티드의 예를 나타낸다.
도 20은 본 발명에 따른 듀플렉스 화합물의 제조에서 유용한 추가의 올리고뉴클레오티드 구조를 나타낸다.
도 21은 본원에 상세히 설명된 다양한 구조들에서 사용된 비염기쌍 뉴클레오티드 모노머의 예이다.
도 22는 본 발명에서 5' 캡 구조로서 유용한 C6-아미노-포스페이트(C6-아미노-Pi) 부분의 화학 구조의 이미지이다.
도 23은 본 발명에 따른 서열과 구조 모티프를 포함하는 RNAi에서 유용한 화합물의 표이다.
본 발명은 일반적으로 다양한 유전자의 발현을 하향-조절하는 화합물에 관한 것이며, 특히 신규한 작은 간섭 RNA(siRNA)와 다양한 의학적 상태로 고통받는 피험자의 치료에서 이들 신규한 siRNA의 사용에 관한 것이다. 따라서, 한 양태로서, 본 발명은 LRDD, CYBA, CASP2, NOX3, HRK, RAC1, RHOA 및 DUOX1로부터 선택된 유전자를 억제하는데 유용한 신규한 올리고뉴클레오티드 서열을 제공하며, 이들의 mRNA 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NOS: 1-2, 3-5, 6, 10-11, 12, 13, 24-26, 46 및 47-48에 각각 제시된다. 올리고뉴클레오티드 서열은 표 D(D1-D34)에 제시되며, 여기서 센스 가닥은 상보하는 안티센스 가닥과 쌍을 이룬다. 또한, 어떤 표적 유전자에 대한 siRNA의 제조에서 유용한 신규한 구조 모티프가 제공된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 바람직한 siRNA의 리스트가 표 B(B1-B74), C(C1-C4) 및 D(D1-D34)에 제공된다. 각 유전자에 대하여, 19-mer, 21-mer 및 23-mer 서열에 대한 별도의 표가 존재하며, 이들은 전용 알고리즘에서의 점수에 기초하여 사람 유전자 발현을 표적화하는데 있어서의 최상의 서열로서 우선순위가 매겨진다.
본 발명의 유전자를 억제하는 분자 및 조성물이 상세히 본원에 개시되며, 상기 분자 및/또는 조성물 중 어느 것이 상기 상태 중 어느 것으로부터 고통받는 피험자의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 siRNA 화합물은, 예를 들어 활성을 증가시키고, 안정성을 증가시키고, 및/또는 독성을 최소화할 수 있는 구조 및 변형을 지닌다. 본 발명의 siRNA의 신규한 변형은 표적 유전자 발현, 특히 본원에서 논의된 표적 유전자의 발현을 방지하거나 약화시키는데 유용한 이중 가닥 RNA에 유리하게 적용된다.
어떤 표적 유전자 및 바람직한 징후의 상세가 하기 표 A에 제시된다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
표 A는 SEQ ID NOS: 1-48에 제시된 mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열들에 대한 gi(GeneInfo 식별자)와 기탁번호를 제공한다. 상응하는 폴리펩티드가 SEQ ID NOS: 49-96에 제시된다. 상기 표 A에 나열된 유전자들이 다음과 같이 더 상세히 설명된다:
(1) 종양 단백질 p53 결합 단백질, 2 (TP53BP2):
유전자 별칭: BBP; 53BP2; ASPP2; p53BP2; PPP1R13A, AI746547, X98550
이 유전자는 ASPP(p53의 세포자멸-자극 단백질) 패밀리의 p53 상호작용 단백질의 구성원을 암호화한다. 상응하는 단백질은 4개의 앤키린 반복부와 단백질-단백질 상호작용에 관련된 SH3 도메인을 함유한다. 이것은 세포질의 핵주위 영역에 국소화되며, p53 패밀리의 구성원들을 포함하는 다른 조절성 분자와의 상호작용을 통해 세포자멸 및 세포성장을 조절한다. 상이한 동형들을 암호화하는 다수의 전사 변이체가 이 유전자에서 발견되었다. 사람 TP53BP2 mRNA 전사 변이체 1 및 2의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 1 및 2에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 49-50에 각각 제시된다.
(2) 로이신-부화 반복부 및 사멸 도메인 함유체(LRDD)
유전자 별칭: PIDD; MGC16925; DKFZp434D229, 120001lD09Rik, AU042446
이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 로이신-부화 반복부와 사멸 도메인(LRDD)을 함유한다. 이 단백질은 Fas(TNFRSF6)-회합 사멸 도메인(FADD) 및 MAP-키나제 활성화 사멸 도메인-함유 단백질(MADD)과 같은 다른 사멸 도메인 단백질과 상호작용하는 것으로 밝혀졌고, 이로써 세포사-관련 신호화 과정에서의 어댑터 단백질로서 기능할 수 있다. 이 유전자의 마우스 카운터파트의 발현이 종양 억제인자 p53에 의해 양성 조절되며, DNA 손상에 대한 반응에서 세포의 세포자멸을 유도한다는 것이 밝혀졌고, 이것은 p53-의존성 세포자멸의 이펙터로서 이 유전자의 역할을 시사한다. 상이한 동형들을 암호화하는 3개의 선택적 스플라이싱된 전사 변이체가 보고되었다. 사람 LRDD 전사 변이체 2, 1 및 3의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 3-5에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 51-53에 각각 제시된다.
국제 특허공개 No. WO 01/18037에 LRDD 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열이 개시된다. 국제 특허공개 No. WO 03/087368는 유전자를 억제하기 위한 조성물 및 방법을 교시한다.
(3) 시토크롬 b-245, 알파 폴리펩티드(CYBA)
유전자 별칭: 시토크롬 b 경쇄; 시토크롬 b(558) 알파-서브유닛; 시토크롬 b 알파 폴리펩티드; 플라보시토크롬 b-558 알파 폴리펩티드; p22-phox
시토크롬 b는 경쇄(알파)와 중쇄(베타)로 이루어진다. 이 유전자는 포식세포의 살균 옥시다아제 시스템의 주 성분이라고 제안된 경쇄, 알파 서브유닛을 암호화한다. 이 유전자의 돌연변이는 이들 세포의 살균 활성에 중요한 과산화물을 생성할 수 있는 활성화된 포식세포의 기능부전을 특징으로 하는 상염색체 열성 만성 육아종 질환(CGD)과 관련된다. 사람 CYBA mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 6에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 54에 제시된다.
국제 특허공개 No. WO 2005/103297는 p22-phox 활성의 조정을 교시한다.
(4) 활성화 전사인자 3(ATF3)
유전자 별칭: ATF3deltaZip2; ATF3deltaZip2c; ATF3deltaZip3, LRG-21, LRF-1
ATF3는 포유류 활성화 전사인자/cAMP 반응성 요소-결합(CREB) 단백질 패밀리의 전사인자의 구성원이다. 2가지 상이한 동형을 암호화하는 다수의 전사 변이체가 이 유전자에서 발견되었다. 더 긴 동형은 ATF 결합 요소를 가진 프로모터로부터 전사를 활성화하는 것이 아니라 억제한다. 더 짧은 동형(deltaZip2)은 로이신 지퍼 단백질-다이머화 모티프를 결여하고 있으며, DNA에 결합하지 않고, 억제성 보조-인자들을 프로모터로부터 멀리 격리함으로써 아마도 전사를 자극할 것이다. 선택적 스플라이싱은 표적 유전자의 조절에서 생리학적으로 중요할 수 있는 가능성이 있다. 사람 ATF3 전사 변이체 3, 1 및 2의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 7-9에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 55-57에 각각 제시된다.
US 특허공개 No. 2003/0125277는 ATF3에 대한 안티센스를 교시한다. 국제 특허공개 No. WO 2005/103297는 신경성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
(5) 카스파아제 2, 세포자멸-관련 시스테인 펩티다아제(신경 전구체 세포 발현된, 발생학적으로 하향-조절된 2(CASP2))
유전자 별칭: CASP-2, ICH-1L, ICH-1L/1S, ICH1, NEDD2; ICH-1 프로테아제; NEDD2 세포자멸 조절성 유전자; 카스파아제 2, 세포자멸-관련 시스테인 프로테아제
이 유전자는 시스테인-아스파르트산 프로테아제(카스파아제) 패밀리의 구성원인 단백질을 암호화한다. 카스파아제의 순차적 활성화는 세포 세포자멸의 실행 단계에서 중심적인 역할을 한다. 카스파아제는 비활성 전구효소로서 존재하며, 보존된 아스파르트산 잔기에서 단백질 가수분해 과정이 일어나 크고 작은 2개의 서브유닛이 생성되며, 이들이 다이머화하여 활성 효소가 형성된다. 이 단백질의 단백질 가수분해 절단은 다양한 세포자멸성 자극에 의해 유도된다. 이 유전자의 선택적 스플라이싱은 상이한 동형들을 암호화하는 복수의 전사 변이체를 생성한다. 사람 CASP2 전사 변이체 1 및 3의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 10-11에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 58-59에 각각 제시된다.
US 특허 No. 6,083,735는 Casp2의 선택적 스플라이싱 산물들에 관한 것이다. US 특허 Nos. 5,929,042와 7,223,856는 신경변성 장애의 치료를 위한 특이적 Casp2 안티센스 화합물을 개시한다. 국제 특허공개 No. WO 02/024720는 Casp2 안티센스를 교시한다. 국제 특허공개 No. WO 02/034201는 당뇨성 망막병증을 치료하는 방법을 개시한다. No. WO 03/05821는 세포자멸 관련 유전자의 억제에 관한 것이다. No. WO 2004/009797는 Casp2 안티센스를 교시한다. No. WO 2004/103389는 세포사를 방지하는 방법에 관한 것이다.
(6) NADPH 옥시다아제 3(NOX3)
유전자 별칭: GP91-3, MGC124289, het, nmf250; NADPH 옥시다아제 촉매 서브유닛-유사 3, NADPH 옥시다아제 1; head-tilt
NOX3과 같은 NADPH 옥시다아제는 많은 세포 타입에서 발견되는 원형질막-회합 효소이다. 이들은 NADPH를 전자 공여체로 사용하여 산소의 1-전자 환원에 의해 과산화물의 생성을 촉매한다. 사람 NOX3 mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 12에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 60에 제시된다.
국제 특허공개 No. WO 2005/119251은 청력 손실을 치료하는 방법에 관한 것이다.
(7) 하라키리, BCL2 상호작용 단백질(BH3 도메인만 함유)(HRK)
유전자 별칭: DP5, Bid3; BCL2-상호작용 단백질; 세포자멸 Hrk의 활성인자; BH3 상호작용(BCL2 패밀리와) 도메인, 세포자멸 아고니스트
세포자멸의 활성인자로서, Hrk는 사멸-억제인자 단백질 Bcl-2 및 Bcl-X(L)과의 상호작용을 통해 세포자멸을 조절한다. HRK 단백질은 BDC의 BLC2 상동성 도메인-3(BH3)과 유사한 8-아미노산 영역을 제외하고는 다른 BCL2 패밀리 구성원에 대해 유의한 상동성을 결여하고 있다. HRK는 BH3 도메인을 통해 BCL2 및 BCLXL과 상호작용하지만, 사멸-촉진 BCL2-관련 단백질 BAX, BAK 또는 BCLXS과는 상호작용하지 않는다. HRK는 BLC2와 BCLXL에 대해 이미 보고된 것과 유사한 방식으로 세포내 소기관들의 막에 국소화된다. 사람 HRK mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 13에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 61에 제시된다.
(8) 보체 성분 1, q 아요소 결합 단백질(C1QBP)
유전자 별칭: GC1QBP, HABP1, SF2p32, gC1Q-R, gC1qR, p32, RP23-83I13.1, AA407365, AA986492, D11Wsu182e, MGC91723; C1q 구상 도메인-결합 단백질; 히알루로난-결합 단백질 1; 스플라이싱 인자 SF2-회합 단백질
사람 보체 아요소 C1q는 C1r 및 C1s와 회합하여 혈청 보체 시스템의 제1 성분을 생성한다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 C1q 분자의 구상 머리에 결합하여 C1 활성화를 억제한다고 알려져 있다. 또한, 이 단백질은 프레-mRNA 스플라이싱 인자 SF2의 p32 서브유닛으로서, 그리고 히알루론산-결합 단백질로서 확인되었다. 사람 C1QBP mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ED NO: 14에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 62에 제시된다.
(9) BCL2/아데노바이러스 E1B 19kDa 상호작용 단백질 3(BNIP3)
유전자 별칭: NIP3, MGC93043; BCL2/아데노바이러스 E1B 19kD-상호작용 단백질 3, 미토콘드리아 산물을 위한 BCL2/아데노바이러스 E1B 19kDa-상호작용 단백질 3 핵 유전자
이 유전자는 BCL2/아데노바이러스 E1B 19kd-상호작용 단백질(BNIP) 패밀리의 구성원이다. 이것은 E1B 19kDa 단백질과 상호작용함으로써, 바이러스-유도 세포사에 대한 보호를 초래하고, 역시 세포자멸 보호인자인 BCL2의 E1B 19kDa-유사 서열을 초래한다. 이 유전자는 BH3 도메인과 막통과 도메인을 함유하는데, 이들은 전구-세포자멸 기능과 연합된다. 이 유전자에 의해 암호화된 다이머형 미토콘트리아 단백질은 심지어 BCL2의 존재하에서도 세포자멸을 유도한다고 알려져 있다. 사람 BNIP3 mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 15에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 63에 제시된다.
US 특허 No. 5,858,678는 BNIP3 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드 서열에 관한 것이다. 국제 특허공개 No. WO 2004/009780는 허혈-유도 세포 손상을 방지하는 방법을 개시한다.
(10) 미토겐-활성화 단백질 키나아제 8(MAPK8)
유전자 별칭: JNK; JNK1; PRKM8; SAPK1; JNK1A2; JNK21B1/2; JNK1 알파 단백질 키나아제; JNK1 베타 단백질 키나아제; c-Jun N-말단 키나아제 1; 미토겐-활성화 단백질 키나아제 8 전사 변이체 2; 단백질 키나아제 JNK1; 스트레스-활성화 단백질 키나아제 JNK1.
이 유전자에 의해서 암호화된 단백질은 MAP 키나아제 패밀리의 구성원이다. MAP 키나아제는 복수의 생화학적 신호들에 대한 통합점으로서 작용하며, 증식, 분화, 전사 조절 및 발생과 같은 광범한 세포 과정에 관련된다. 이 키나아제는 다양한 세포 자극에 의해서 활성화되며, 특이적 전사인자들을 표적으로 함으로써, 세포 자극에 반응하여 즉시-조기 유전자 발현을 매개한다. 종양-괴사인자 알파(TNF-α)에 의한 이 키나아제의 활성화가 TNF-α 유도 세포자멸에 필요한 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 키나아제는 자외선 유도 세포자멸에도 연관되며, 이것은 시토크롬 c-매개 세포사 경로와 관련된다고 생각된다. 이 유전자의 마우스 카운터파트에 대한 연구들은 T 세포 증식, 세포자멸 및 분화에서 그것의 역할을 시사했다. 상이한 동형들을 암호화하는 4개의 선택적 스플라이싱된 전사 변이체가 보고되었다. MAPK8 전사 변이체 2, 1, 3 및 4의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 16-19에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 64-67에 제시된다.
국제 특허공개 No. WO 99/09214와 US 특허 No. 5,877,309는 JNK 패밀리 구성원에 대한 안티센스를 개시한다.
(11) 미토겐-활성화 단백질 키나아제 14(MAPK14)
별칭: CSBP1; CSBP2; CSPB1; EXIP; Mxi2; PRKM14; PRKM15; RK; SAPK2A; p38; p38ALPHA; MGC102436; p38MAPK; CSBP; Exip; Hog; MGC105413; p38Hog; Csaids 결합 단백질; MAP 키나아제 Mxi2; MAX-상호작용 단백질 2; 사이토카인 억제 항염제 결합 단백질; p38 MAP 키나아제; p38 미토겐 활성화 단백질 키나아제; p38alpha Exip; 스트레스-활성화 단백질 키나아제 2A, tRNA 합성효소 보조-인자 p38
이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 MAP 키나제 패밀리의 구성원이며, 복수의 생화학적 신호들에 대한 통합점으로서 작용하고, 증식, 분화, 전사 조절 및 발생과 같은 광범한 세포 과정에 연관된다. 이 키나아제는 다양한 환경 스트레스와 전염증성 사이토카인에 의해 활성화된다. MAP 키나아제 키나아제들(MKKs)에 의한 인산화, 또는 MAP3K7IP1/TAB1 단백질과의 상호작용에 의해 촉발되는 자가인산화가 활성화에 필요하다. 이 키나아제의 기질은 전사 조절인자 ATF2, MEF2C 및 MAX, 세포주기 조절인자 CDC25B, 및 종양 억제인자 p53을 포함하며, 이것은 스트레스 관련 전사 및 세포주기 조절, 그리고 유전자독성 스트레스 반응에서 그것의 역할을 시사한다. 상이한 동형들을 암호화하는 이 유전자의 4개의 선택적 스플라이싱된 전사 변이체가 보고되었다. 사람 MAPK14 전사 변이체 2, 4, 1 및 3의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 20-23에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 68-71에 제시된다.
국제 특허공개 Nos. WO 2000/59919와 WO 2005/016947, 그리고 US 특허 Nos. 6,140,124와 6,448,079가 p38의 안티센스 억제를 교시한다.
(12) Ras-관련 C3 보툴리넘 독소 기질 1(rho 패밀리, 작은 GTP 결합 단백질 Rac1; RAC1)
유전자 별칭: MGC111543, MIG5, TC-25, p21-Rac1; 이동-유도 단백질 5; ras-관련 C3 보툴리넘 독소 기질 1; rho 패밀리, 작은 GTP 결합 단백질 Rac1, ras-관련 C3 보툴리넘 독소 기질 1(rho 패밀리, 작은 GTP 결합 단백질 Rac1)
이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 GTPase이며, 이것은 RAS 수퍼패밀리의 작은 GTP-결합 단백질에 속한다. 이 수퍼패밀리의 구성원들은 세포성장 조절, 세포골격 재조직, 및 단백질 키나아제 활성화를 포함하여, 다양한 어레이의 세포 사건들을 조절한다. 이 유전자에 대해 몇 가지 선택적 스플라이싱된 전사 변이체가 설명되었지만, 이들 변이체 중 일부의 전장 성질은 결정되지 않았다. 사람 RAC1 전사 변이체 1c, 1b 및 1의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 24-26에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 72-74에 제시된다.
US 특허 No. 6,180,597는 내피세포 산화질소 신타아제의 수준을 증가시키는 rho GTPase 억제제에 관한 것이다. 국제 특허공개 No. WO 01/15739는 Rho 패밀리 구성원의 안티센스 조정을 교시한다. 국제 특허공개 No. WO 2004/042052는 TNF-α 분비를 억제하는 방법을 교시한다.
(13) 글리코겐 신타아제 키나아제 3 베타(GSK3B)
별칭: 7330414F15Rik, 8430431H08Rik, C86142, GSK-3, GSK-3beta, GSK3
글리코겐 신타아제 키나아제-3(GSK3)은 프롤린-작동 세린-트레오닌 키나아제로서, 이것은 처음에 글리코겐 신타아제를 인산화하여 비활성화시키는 것으로서 확인되었다. 2개의 동형 알파(GSK3A; MIM 606784)와 베타는 높은 아미노산 상동성을 나타낸다(Stambolic and Woodgett, Biochem J. 1994, 303(Pt 3):701-4). GSK3B는 에너지 대사, 신경세포 발생 및 신체 패턴 형성에 연관된다(Plyte et al., Biocbim Biophys Acta. 1992, 1114(2-3):147-62). 사람 GSK3B mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 27에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 75에 제시된다.
US 특허 No. 6,323,029는 GSK3B의 안티센스 억제에 관한 것이다.
(14) 퓨린성 수용체 P2X, 리간드-게이트 이온 채널, 7(P2RX7)
별칭: MGC20089, P2X7, AI467586; ATP 수용체; P2X 퓨리노셉터 7; P2X7 수용체; P2Z 수용체; 퓨린성 수용체 P2X7.
이 유전자의 산물은 ATP의 퓨리노셉터 패밀리에 속한다. 이 수용체는 리간드-게이트 이온 채널로서 기능하며, 큰 분자의 투과가 가능한 막 기공의 형성을 통해 대식세포의 ATP-의존성 세포용해를 초래한다. 세포질에서 ATP에 의한 이 핵 수용체의 활성화는 세포 활성이 커플링되어 유전자 발현에 변화를 일으킬 수 있는 기전일 수 있다. 상이한 동형들을 암호화하는 복수의 선택적 스플라이싱된 변이체가 확인되었지만, 일부만 넌센스-매개 붕괴(NMD) 기준에 부합된다. 사람 P2RX7 mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 28에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 76에 제시된다.
(15) 일시적 수용체 잠재 양이온 채널, 서브패밀리 M, 멤버 2(TRPM2)
유전자 별칭: EREG1, KNP3, LTRPC2, MGC133383, NUDT9H, NUDT9L1, TRPC7, 9830168K16Rik, C79133, Trp7, Trrp7; 에스트로겐 반응성 요소 회합 유전자 1; 긴 일시적 수용체 잠재 채널 2; 일시적 수용체 잠재 채널 7, 일시적 수용체 잠재 양이온 채널, 서브패밀리 M, 멤버 2(Trpm2); 일시적 수용체 잠재 채널 7; 일시적 수용체 단백질 7
이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 자유 세포내 ADP-리보오스에 의해서 조절되는 칼슘-투과성 양이온 채널이다. 암호화된 단백질은 산화성 스트레스에 의해서 활성화되며, 세포사에 대한 감수성을 부여한다. 사람 TRPM2의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 29에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 77에 제시된다. (상이한 동형 S 및 L을 암호화하는 2개의 전사 변이체가 이 유전자에서 발견되었다. S 변이체(SEQ ID NO: 30)는 서열화 오차를 함유하므로 NCBI에 의해 제거되었으며, 존재하지 않는다).
(16) 폴리(ADP-리보오스)글리코디히드롤라아제(PARG)
유전자 별칭: PARG99; 폴리(ADP-리보오스)글리코히드롤라아제
PARG는 염색체 단백질의 가역적 공유-변형인자인 폴리(ADP-리보오스)의 이화작용을 초래하는 주된 효소이다. 이 단백질은 많은 조직에서 발견되며, 단백질 가수분해되어 더 작은 활성 산물들을 생성할 수 있다. 사람 PARG mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 31에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 79에 제시된다.
(17) CD38 분자(CD38)
유전자 별칭: T1O, Cd38-rsl; ADP-리보실 히드롤라아제; CD38 항원; CD38 항원(p45); 환상 ADP-리보오스 히드롤라아제
CD38은 세포 및 조직에서 광범하게 발현되는 신규의 다기능성 외부효소이며, 특히 백혈구에서 CD38은 세포 유착, 신호 변환 및 칼슘 신호화에서 기능한다. 사람 CD38 mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 32에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 80에 제시된다.
(18) STEAP 패밀리 멤버 4(STEAP4)
별칭: DKFZp666D049, FLJ23153, STAMP2, TIARP, TNFAIP9, 1110021O17Rik, AI481214, dudulin 4; 6 막통과 전립선 단백질2; 종양 괴사인자, 알파-유도 단백질 9; 종양 괴사-알파-유도 지방질-관련 단백질, TNFα-유도 지방질-관련 단백질; 종양 괴사인자, 알파-유도 단백질 9
지방질 조직에서 TNF-α와 IL-6에 의해 유도된 막 단백질. IL-6과 TNF-α는 모두 척수 손상 모델에서 조절되지 않는 것으로 나타났고(Ahn et al., BBRC 2006, 348(2):560-70), 세포자멸성 사건을 촉진한다고 생각된다. 사람 STEAP4 mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:33에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 81에 제시된다.
(19) 뼈 형성 단백질 2(BMP2)
유전자 별칭: BMP2A, AI467020, BC069214CR618407, M22489
이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 변형 성장인자-베타(TGFB) 수퍼패밀리에 속한다. 암호화된 단백질은 이황화-연결 호모다이머로서 작용하며, 뼈와 연골 형성을 유도한다. 사람 BMP2 mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 34에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 82에 제시된다.
본 출원의 양수인에게 공동 양도된 국제 특허공개 No. WO 2005/041857는 허혈 및 신경계 질환의 치료를 위한 BMP 억제에 관한 것이다.
(20) 간극 연접 단백질, 알파 1, 43kDa(코넥신 43, GJA1)
별칭: CX43, DFNB38, GJAL, ODD, ODDD, ODOD, SDTY3, MGC93610, AU042049, AW546267, Cnx43, Cx43alpha1, Gja-1, Npm1, 간극 연접 단백질, 알파-유사; 안이지형성이상(합지증 타입 III), 간극 연접 단백질 알파 1 43kD; 간극 연즙 단백질, 알파 1, 43kD, 알파 1 코넥신
간극 연접 단백질, 알파 1은 코넥신 유전자 패밀리의 단백질의 구성원이며, 심장의 간극 연접부의 성분이고, 심장의 동반 수축 및 배아 발생에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 코넥신 43은 심근의 세포-세포 커플링을 조절하는 몇몇 단백질 키나아제의 표적이다. 관련된 인트론이 적은 코넥신 43 가-유전자 GJA1P가 염색체 5에 대해서 지도화되었다. 사람 GJA1 mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 35에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 83에 제시된다.
US 특허 No. 7,098,190는 특히 상처 및 척수 손상을 치료하기 위한 안티센스 화합물을 교시한다.
(21) TYRO 단백질 티로신 키나아제 결합 단백질(TYROBP)
유전자 별칭: DAP12, KARAP, PLOSL, Ly83; DNAX-활성화 단백질 12; 킬러 활성화 수용체 회합 단백질
이 유전자는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 막통과 신호화 폴리펩티드를 암호화한다. 이 단백질은 킬러-세포 억제성 수용체(KIR) 패밀리의 막 당단백질과 회합할 수 있으며, 활성화 신호 변환 요소로서 작용할 수 있다. 이 단백질은 제타쇄(TCR) 회합 단백질 키나제 70kDa(ZAP-70) 및 비장 티로신 키나제(SYK)와 결합할 수 있고, 신호 변환, 뼈 모델링, 뇌 수초화 및 염증에서 역할을 할 수 있다. 유전자 내 돌연변이는 Nasu-Hakola 질환이라고도 알려진 경화성 백색질뇌증(PLOSL)을 동반한 다낭성 지질막성 이형성증과 관련되었다. 골수양 세포 2 상에서 발현된 촉발 수용체(TREM2)인 이것의 잠정 수용체 역시 PLOSL을 야기한다. 상이한 동형들을 암호화하는 2개의 선택적 전사 변이체가 이 유전자에서 확인되었다. 다른 선택적 스플라이스 변이체들도 설명되었지만, 이들의 전장 성질은 결정되지 않았다. 사람 TYROBP 전사 변이체 1 및 2의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 36-37에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 84-85에 제시된다.
(22) 결합조직 성장인자(CTGF)
별칭: CCN2, HCS24, IGFBP8, MGC102839, N0V2, CTGRP, Fisp12, Hcs24, fisp-12; 비대 연골세포-특이적 단백질 24; 인슐린-유사 성장인자-결합 단백질 8, FISP-12 단백질: 섬유아세포 유도성 분비 단백질; 섬유아세포 유도성 분비 단백질; 비대 연골세포-특이적 유전자 산물 24
혈관 내피세포에 의해 분비된 주요 결합조직 미토 유인제. 연골세포의 증식과 분화를 촉진한다. 사람 CTGF mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 38에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 86에 제시된다.
(23) 분비된 인단백질 1(SPP1)
유전자 별칭: AA960535, AI790405, Apl-1, BNSP, BSPI, Bsp, ETA-1, Eta, OP, Opn, Opnl, Ric, Spp-1, 미노폰틴, OSP; 44kDa 뼈 인단백질; 44kDa 뼈 인단백질; 뼈 타액단백질 I; 오스테오폰틴, 조기 T-림프구 활성화 1
SSP1은 인터페론-γ 및 인터류킨-12의 생성 증진 및 타입 I 면역을 유발하는 경로에서 필수적인 인터류킨-10의 생성 감소에 연관된 사이토카인으로서 작용하는 분비된 단백질이다. 사람 SPP1 전사 변이체 1, 2 및 3의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 39-41에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 87-89에 제시된다.
US 특허 No. 6,458,590 및 US 특허공개 Nos. 2004/0142865와 2006/0252684는 오스테오폰틴의 억제에 관한 것이다.
(24) 레티쿨론 4 수용체(RTN4R)
유전자 별칭: NGR, NOGOR, NgR1; Nogo-66 수용체; UNQ330/PRO526; nogo 수용체; 레티쿨론 4 수용체 전구체
이 유전자는 레티쿨론 4, 핍지교세포 미엘린 당단백질과 미엘린-회합 당단백질의 수용체를 암호화한다. 이 수용체는 축삭 성장 억제를 매개하며, 성인 중추신경계에서 축삭 재생 및 형성성을 조절하는데 역할을 할 수 있다. 사람 RTN4R mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 42에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 90에 제시된다.
(25) 아넥신 A2(ANXA2)
유전자 별칭: ANX2, ANX2L4, CAL1H, LIP2, LPC2, LPC2D, P36, PAP-IV; 아넥신 II, 칼팩틴 I 중 폴리펩티드; 크로모빈딘 8; 리포코르틴 II; 태반 항응고 단백질 IV
이 유전자는 아넥신 패밀리의 구성원을 암호화한다. 이 칼슘-의존성 인지질-결합 단백질 패밀리의 구성원은 세포성장의 조절과 신호 변환 경로에서 역할을 한다. 이 단백질은 파골세포 형성 및 뼈 재흡수를 증가시키는 자가분비 인자로서 기능한다. 이 유전자는 4번, 9번 및 10번 염색체에 각각 위치된 3개의 가-유전자를 가진다. 상이한 동형들을 암호화하는 복수의 선택적 스플라이싱된 전사 변이체가 이 유전자에서 발견되었다. 사람 ANXA2 전사 변이체 1, 3 및 2의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS:43-45에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 91-93에 제시된다.
(26) ras 상동체 유전자 패밀리, 멤버 A(RHOA)
유전자 별칭: ARH12, ARHA, RH012, RH0H12, 아프리시아 ras-관련 상동체 12; 암유전자 RHO H12; 작은 GTP 결합 단백질 RhoA
RHOA는 스트레스 섬유의 형성에서 액틴 세포골격을 조절한다고 알려진 작은 GTPase 단백질이다. 이것은 이펙터 단백질에 대해 작용하며, Rho 키나아제(ROCK)는 축삭 재생의 억제에서 최고조에 이른다. Rho-A 길항제 C3 트랜스페라아제를 사용한 시험관내 연구에서는 미엘린 기질 상에서 축삭 성장이 증진되지만, 생체내 연구에서는 효과적이지 않았다. 사람 RHOA mRNA의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 46에 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NO: 94에 제시된다.
(27) 이중 옥시다아제 1(DUOX1)
유전자 별칭: LNOX1, MGC138840, MGC138841, NOXEF1, THOX1, NADPH 갑상선 옥시다아제 1; 황색단백질 NADPH 옥시다아제; 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 옥시다아제
이 유전자에 의해 암호화된 단백질은 당단백질이며, NADPH 옥시다아제 패밀리의 구성원이다. 갑상선 소낭세포의 첨단부 구성원에 위치된 단백질 복합체에 의해 갑상선 호르몬의 합성이 촉매된다. 이 복합체는 요오드화물 전달체, 티로퍼옥시다아제, 및 이 암호화된 단백질 및 DUOX2를 포함하는 과산화물 발생 시스템을 함유한다. 이 단백질은 퍼옥시다아제 상동체 도메인과 gp91phox 도메인을 모두 가진다. 동일한 단백질을 암호화하는 2개의 선택적 스플라이싱된 전사 변이체가 이 유전자에서 설명되었다. 사람 DUOX1 전사 변이체 1 및 2의 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 47-48에 각각 제시되고, 상응하는 폴리펩티드 서열이 SEQ ID NOS: 95-96에 제시된다.
"전구-세포자멸 폴리펩티드"는 스플라이스 변이체, 동형, 오르토로그, 또는 파라로그 등을 포함해서, 상기 나열된 유전자 중 어느 것에 의해 암호화된 폴리펩티드를 말한다.
한 양태에 따라서, 본 발명은 미변형된 및 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 억제성 올리고뉴클레오티드 화합물을 제공한다. 상기 화합물은 당 변형, 염기 변형 및 뉴클레오티드 간 연결 변형으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, DNA, 및 ENA(에틸렌-브릿지 핵산); PNA(펩티드 핵산); 아라비노시드; PACE(포스포노아세테이트 및 그 유도체)를 포함하는 LNA(잠겨진 핵산), 거울 뉴클레오티드, 또는 6-원 당 유사체(예를 들어, 헥소오스 또는 모르폴리노)를 가진 뉴클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
한 구체예에서, 화합물은 적어도 하나의 리보뉴클레오티드의 당 부분에 2'- 변형을 포함한다("2' 당 변형"). 어떤 구체예에서, 화합물은 2'O-알킬 또는 2'-플루오로 또는 2'O-알릴 또는 어떤 다른 2' 당 변형을 선택적으로 다른 위치에 포함한다. 바람직한 2'-변형은 2'O-메틸(2' 메톡시, 2'OMe)이다.
또한, 다른 안정화된 변형도 가능하다(예를 들어, 올리고머의 3' 또는 5' 말단에 부가된 변형된 뉴클레오티드). 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 백본이 변형되며, 포스페이트-D-리보오스를 포함하지만, 또한 티오포스페이트-D-리보오스, 포스포디에스테르 L-리보오스, 트리에스테르, 티오에이트, 2'-5' 브릿지 백본 (5'-2'라고도 할 수 있다), PACE 변형된 뉴클레오티드 간 연결 또는 어떤 다른 타입의 변형을 함유할 수도 있다.
다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 말단에 부가된 것을 포함한다. 이러한 말단 변형은 지질, 펩티드, 당 또는 그외 다른 분자일 수 있다.
또한, 본 발명은 다양한 유전자의 발현을 하향-조절하는 화합물, 특히 신규한 작은 간섭 RNA(siRNA), 및 다양한 질환 및 의학적 상태의 치료에서 이들 신규한 siRNA의 사용에 관한 것이다. 치료되는 특정 질환 및 상태는 급성 신부전증(ARF), 청력 손실, 녹내장, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 다른 급성 폐 및 호흡기 손상, 폐, 신장, 골수, 심장, 췌장, 각막 또는 간 이식을 비롯한 장기이식에서의 손상(예를 들어, 허혈-재관류 손상), 허혈성 안구이상, 장기이식 신장독성, 척수 손상, 압력상처, 안구건조증, 입안염, ION 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)이다.
본 발명에서 사용되는 바람직한 siRNA의 리스트가 표B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)에 제공된다. 각 유전자에 대하여, 19-mer, 21-mer 및 23-mer 서열에 대한 별도의 리스트가 존재하며, 이들은 전용 알고리즘에서의 점수에 기초하여 사람 유전자 발현을 표적화하는데 있어서의 최상의 서열로서 우선순위가 매겨진다. 또한, 21-mer 또는 23-mer siRNA 서열은 본원에 개시된 19-mer 서열의 5' 및/또는 3' 확장에 의해 생성된다. 이러한 확장은 상응하는 mRNA 서열에 상보하는 것이 바람직하다. 어떤 23-mer 올리고머들이 이 방법에 의해 고안되었으며, 이때 우선순위의 순서는 상응하는 19-mer의 순서이다.
구조 모티프
본 발명에 따라서, siRNA 화합물은 구조 (A)-(H)에 제시된 하기 변형 중 하나에 따라서 또는 직렬형 siRNA 또는 RNAstar로서 화학적으로 및/또는 구조적으로 변형된다.
한 양태로서, 본 발명은 구조 (A)로서 제시된 화합물을 제공한다:
Figure pct00013
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
(N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
x와 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
Z와 Z'는 각각 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 그것이 존재하고 있는 가닥의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 연속 뉴클레오티드이고;
(N)x의 서열은 표 D(D1-D34)에 중 어느 하나에 제시되며; 단 (N)x 및 (N')y는 각각 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 50% 이하로 포함해야 한다.
현재의 바람직한 안티센스 서열은 TP53BP2, LRDD, CYBA, CASP2, NOX3, HRK, RAC1, RHOA 및 DUOX에 대해 작동되는 신규한 siRNA 화합물이며, 이들의 mRNA 폴리뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NOS: 1-2, 3-5, 6, 10-11, 12, 13, 24-26, 46 및 47-48에 각각 제시된다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 구조 (B)를 갖는 화합물을 제공한다(표 D에서 양쪽 가닥에 교대하는 2'-O-메틸 변형을 가진 구조):
Figure pct00014
여기서, (N)x과 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 미변형된 리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드인 올리고머이고;
x와 y는 각각 19, 21 또는 23이며, (N)x와 (N')y는 완전히 상보적이고;
각 (N)x 및 (N')y에서 교대하는 리보뉴클레오티드는 해당 리보뉴클레오티드의 당 잔기에 2'-O-메틸 변형이 생기도록 변형되고;
(N')y의 서열은 (N)x에 상보하는 서열이고;
(Nx)의 서열은 표 D의 어느 하나에 제시된다.
어떤 구체예에서, (Nx) 및 (N')y는 각각 독립적으로 3' 및 5' 말단에서 인산화되거나 인산화되지 않는다.
본 발명의 어떤 구체예에서, 교대하는 리보뉴클레오티드는 화합물의 안티센스와 센스 가닥 모두에서 변형된다.
x 및 y가 각각 19 또는 23인 어떤 구체예에서, (N)x의 5' 및 3' 말단에 있는 각 N은 변형되고, (N')y의 5' 및 3' 말단에 있는 각 N'는 변형되지 않는다.
x 및 y가 각각 21인 어떤 구체예에서, (N)x의 5' 및 3' 말단에 있는 각 N은 변형되지 않고, (N')y의 5' 및 3' 말단에 있는 각 N'는 변형된다.
특정 구체예에서, x 및 y가 19일 때, siRNA는 2'-O-메틸(2'-OMe) 기가 안티센스 가닥 (N)x의 제1, 제3, 제5, 제7, 제9, 제11, 제13, 제15, 제17 및 제19 뉴클레오티드에 존재하도록 변형되며, 이로써 바로 그 동일한 변형이 센스 가닥 (N')y의 제2, 제4, 제6, 제8, 제10, 제12, 제14, 제16 및 제18 뉴클레오티드에 존재하게 된다. 다양한 구체예에서, 이러한 특정 siRNA 화합물은 양쪽 말단에서 블런트형으로 종결된다.
siRNA 에 대한 새로운 구조 C-H
다음의 구조 모티프는 siRNA 화합물을 설계하는데 유용하다.
어떤 구체예에서, 본 발명은 구조 (C)를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure pct00015
여기서, N 및 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 및 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 독립적으로 선택된 뉴클레오티드이고;
(N)x 및 (N')y는 각각, 각 연속 뉴클레오티드가 공유 결합에 의해 다음번 뉴클레오티드에 이어진 올리고머이며, x 및 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
(N)x에 있는 뉴클레오티드는 변형되지 않거나, 또는 (N)x는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드를 교대로 포함하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형되며, (N)x의 중앙 위치에 위치된 리보뉴클레오티드는 변형되거나 변형되지 않으며, 바람직하게는 변형되지 않고;
(N')y는 말단 또는 끝에서 두 번째 위치에 하나의 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드, 2환 뉴클레오티드, 2'-당 변형된 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고;
(N')y에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형된 경우, 변형된 뉴클레오티드는 연속적일 수 있고;
Z와 Z'는 각각 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 그것이 부착되어 있는 어떤 올리고머의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 데옥시리보뉴클레오티드이고;
(N')y의 서열은 (N)x에 실질적으로 상보하는 서열을 포함하고;
(N)x의 서열은 유전자로부터 전사된 mRNA에 존재하는 약 18 내지 약 40개 연속 리보뉴클레오티드에 실질적으로 상보하는 안티센스 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, (N)x의 서열이 표 A-D 중 어느 하나에 제시된다.
특정 구체예에서, x=y=19이며, (N)x에서 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형되고, (N)x의 중앙에 위치된 리보뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 따라서, x=19인 화합물에서 (N)x는 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'-O-메틸 당 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비영기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 5에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 6에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 15에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 14에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 1, 2, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 5에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 6에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 15에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 14에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 5에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 5에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 14, 16, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 15에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 14, 16, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 15에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 7에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 8에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 9에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 10에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 11에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 12에 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, (N)x는 위치 2, 4, 6, 8, 11, 15, 17 및 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 적어도 하나의 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를, 예를 들어 위치 13에 더 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, (N)x는 표적 유전자와 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 어떤 바람직한 구체예에서, (N)x는 위치 5, 6 또는 14에 단일 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 구조 (C)의 한 구체예에서, (N')y의 5' 및 3' 말단의 한쪽 또는 양쪽에서 적어도 2개의 뉴클레오티드가 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다. 어떤 바람직한 구체예에서, x=y=19 또는 x=y=23이고; (N)x에서 뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드가 교대로 존재하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형되고, (N)x의 중앙에 위치된 리보뉴클레오티드는 변형되지 않으며; (N')y의 3' 말단에서 3개의 뉴클레오티드가 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다(본원에서 구조 I로 제시됨). 다른 바람직한 구체예에서, x=y=19 또는 x=y=23이고; (N)x에서 뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드가 교대로 존재하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형되고, (N)x의 중앙에 위치된 리보뉴클레오티드는 변형되지 않으며; (N')y의 5' 말단에서 4개의 연속 뉴클레오티드가 3개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다. 추가의 구체예에서, (N)y의 중앙 위치에 위치된 추가의 뉴클레오티드가 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형될 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, (N)x에서 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드가 교대로 존재하고, (N')y에서는 5' 말단에서 4개의 연속 뉴클레오티드가 3개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어지며, 5' 말단 뉴클레오티드 또는 5' 말단의 2개 또는 3개 연속 뉴클레오티드는 3'-O-메틸 변형을 포함한다.
구조 (C)의 어떤 바람직한 구체예에서, x=y=19이고, (N')y에서 적어도 하나의 위치는 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를 포함하며, 바람직하게는 5개 위치가 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 구체예에서, 다음의 위치가 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드를 포함한ㄷ: 위치 1 및 16-19, 위치 15-19, 위치 1-2 및 17-19, 위치 1-3 및 18-19, 위치 1-4 및 19, 및 위치 1-5. (N')y는 적어도 하나의 LNA 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
구조 (C)의 어떤 바람직한 구체예에서, x=y=19이고, (N')y에서 적어도 하나의 위치에서 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 및 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드를 포함한다.
구조 (C)의 어떤 바람직한 구체예에서, x=y=19이고, (N')y는 거울 뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-DNA 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, L-DNA는 L-데옥시리보시티딘이다. 어떤 구체예에서, (N')y는 위치 18에 L-DNA를 포함한다. 다른 구체예에서, (N')y는 위치 17과 18에 L-DNA를 포함한다. 어떤 구체예에서, (N')y는 위치 2 및 위치 17과 18 중 하나 또는 둘 다에 L-DNA 치환을 포함한다. 어떤 구체예에서, (N')y는 오버행으로서 5'-O-메틸 DNA 또는 비염기성 또는 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드와 같은 5' 말단 캡 뉴클레오티드를 더 포함한다.
또 다른 구체예에서, (N')y는 표적 유전자와 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 어떤 바람직한 구체예에서, (N')y는 위치 6, 14 또는 15에 단일 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다.
또 다른 구체예에서, (N')y는 위치 15에 DNA를, 그리고 위치 17과 18 중 하나 또는 둘 다에 L-DNA를 포함한다. 이 구조에서는 위치 2가 L-DNA 또는 비염기성 가-뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
x=y=21 또는 x=y=23인 구조 (C)의 다른 구체예가 고안된다. 이들 구체예에서, 상기 논의된 (N')y에 대한 변형은 위치 15, 16, 17, 18에 있는 대신에, 21-mer에서는 위치 17, 18, 19, 20에, 그리고 23-mer에서는 위치 19, 20, 21, 22에 있다. 유사하게, 위치 17과 18 중 하나 또는 둘 다에 존재하는 변형은 21-mer에서는 위치 19 또는 20 중 하나 또는 둘 다에, 그리고 23-mer에서는 위치 21과 22 중 하나 또는 둘 다에 존재한다. 19-mer에 있는 모든 변형은 21-mer와 23-mer에 대해서 유사하게 조정된다.
구조 (C)의 다양한 구체예에 따라서, (N')y에는 3' 말단에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드가 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된다. 한 바람직한 구체예에서, (N')y의 3' 말단에서 4개 연속 뉴클레오티드가 3개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어지며, 이때 2'-5' 포스포디에스테르 결합을 형성하는 2'-5' 뉴클레오티드 중 하나 이상은 3'-O-메틸 당 변형을 더 포함한다. 바람직하게, (N')y의 3' 말단 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 당 변형을 포함한다. 구조 (C)의 어떤 바람직한 구체예에서, x=y=19이고, (N')y에서 위치 15, 16, 17, 18 및 19에서 2개 이상의 연속 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 구체예에서, 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합을 형성하는 뉴클레오티드는 3' 데옥시리보오스 뉴클레오티드 또는 3' 메톡시 뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 구체예에서, (N')y에서 위치 17과 18에 있는 뉴클레오티드가 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 이어진다. 다른 구체예에서, (N')y에서 위치 16, 17, 18, 16-17, 17-18, 또는 16-18에 있는 뉴클레오티드가 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 이어진다.
어떤 구체예에서, (N')y는 위치 2에 L-DNA를, 그리고 위치 16, 17, 18, 16-17, 17-18, 또는 16-18에 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합을 포함한다. 어떤 구체예에서, (N')y는 위치 16, 17, 18, 16-17, 17-18, 또는 16-18에 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합 및 5' 말단 캡 뉴클레오티드를 포함한다.
구조 (C)의 다양한 구체예에 따라서, (N')y에서 어느 한 말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드 또는 각 5' 및 3' 말단의 2-8개 변형된 뉴클레오티드는 독립적으로 거울성 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-리보뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-데옥시리보뉴클레오티드이다. 거울 뉴클레오티드는 당 또는 염기 부분에서, 또는 뉴클레오티드 간 연결에서 더 변형될 수 있다.
구조 (C)의 한 바람직한 구체예에서, (N')y의 3' 말단에 있는 3' 말단 뉴클레오티드 또는 2개 또는 3개 연속 뉴클레오티드는 L-데옥시리보뉴클레오티드이다.
구조 (C)의 다른 구체예에서, (N')y에서 어느 한 말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드 또는 각 5' 및 3' 말단의 2-8개 변형된 뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 아미노, 플루오로, 알콕시 또는 알킬 부분의 존재를 포함한다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 메톡시 부분(2'-OMe)을 포함한다.
한 일련의 바람직한 구체예에서, (N')y의 5' 말단에서 3개, 4개 또는 5개 연속 뉴클레오티드는 2'-OMe 변형을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, (N')y의 3' 말단에서 3개 연속 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
구조 (C)의 어떤 구체예에서, (N')y에서 어느 한 말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드 또는 각 5' 및 3' 말단의 2-8개 변형된 뉴클레오티드는 독립적으로 2환 뉴클레오티드이다. 다양한 구체예에서, 2환 뉴클레오티드는 잠겨진 핵산(LNA)이다. 2'-O,4'-C-에틸렌-브릿지 핵산(ENA)이 LNA의 일종이다(하기 참조).
다양한 구체예에서, (N')y는 5' 말단에 또는 3'과 5' 말단 양쪽에 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
구조 (C)의 어떤 구체예에서, (N')y의 5' 및 3' 말단의 한쪽 또는 양쪽에서 적어도 2개의 뉴클레오티드가 P-에톡시 백본 변형에 의해 이어진다. 어떤 바람직한 구체예에서, x=y=19 또는 x=y=23이고; (N)x에서 뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드가 교대로 존재하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형되고, (N)x의 중앙 위치에 위치된 리보뉴클레오티드는 변형되지 않으며; (N')y의 3' 말단 또는 5' 말단에서 4개의 연속 뉴클레오티드가 3개의 P-에톡시 백본 변형에 의해 이어진다. 다른 바람직한 구체예에서, (N')y의 3' 말단 또는 5' 말단에서 3개의 연속 뉴클레오티드가 2개의 P-에톡시 백본 변형에 의해 이어진다.
구조 (C)의 어떤 구체예에서, (N')y에서 각 5' 및 3' 말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 거울 뉴클레오티드, 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드 또는 2환 뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, (N')y의 5' 및 3' 말단의 변형은 동일하다. 한 바람직한 구체예에서, (N')y의 5' 말단에서 4개의 연속 뉴클레오티드가 3개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어지고, (N')y의 3' 말단에서 3개의 연속 뉴클레오티드가 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다. 다른 구체예에서, (N')y의 5' 말단에 있는 변형은 (N')y의 3' 말단에 있는 변형과 상이하다. 한 특정 구체예에서, (N')y의 5' 말단에서 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, (N')y의 3' 말단에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다. 다른 특정 구체예에서, (N')y의 5' 말단에서 3개 연속 뉴클레오티드는 LNA 뉴클레오티드이고, (N')y의 3' 말단에서 3개 연속 뉴클레오티드는 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다. (N)x에서, 뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드가 교대로 존재하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형되고, (N)x의 중앙에 위치된 리보뉴클레오티드는 변형되지 않거나, 또는 (N)x에서 리보뉴클레오티드는 변형되지 않는다.
구조 (C)의 또 다른 구체예에서, 본 발명은, x=y=19 또는 x=y=23이고; (N)x에서 뉴클레오티드는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드가 교대로 존재하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지도록 변형되고, (N)x의 중앙에 위치된 리보뉴클레오티드는 변형되지 않으며; (N')y의 3' 말단에서 3개의 뉴클레오티드가 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 이어지고, (N')y의 5' 말단에서 3개의 뉴클레오티드는 ENA와 같은 LNA인, 화합물을 제공한다.
구조 (C)의 다른 구체예에서, (N')y의 5' 말단에서 5개 연속 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 당 변형을 포함하고, (N')y의 3' 말단에 있는 2개의 연속 뉴클레오티드는 L-DNA이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은, x=y=19 또는 x=y=23이고; (N)x가 미변형된 리보뉴클레오티드로 구성되며, (N')y의 3' 말단에서 3개의 연속 뉴클레오티드가 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어지고, (N')y의 5' 말단에서 3개의 연속 뉴클레오티드는 ENA와 같은 LNA인, 화합물을 제공한다.
구조 (C)의 또 다른 구체예에 따라서, (N')y에서, 5' 또는 3' 말단 뉴클레오티드, 또는 어느 한 말단의 2, 3, 4, 5 또는 6개 연속 뉴클레오티드 또는 각 5' 및 3' 말단의 1-4개 변형된 뉴클레오티드는 독립적으로 포스포노카르복실레이트 또는 포스피노카르복실레이트 뉴클레오티드(PACE 뉴클레오티드)이다. 어떤 구체예에서, PACE 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, (N')y에서, 각 5' 및 3' 말단의 1 또는 2개 연속 뉴클레오티드가 PACE 뉴클레오티드이다. PACE 뉴클레오티드 및 유사체의 예는 US 특허 Nos. 6,693,187 및 7,067,641에 개시되며, 이들은 본원에 참고자료로 포함된다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 구조 (D)를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure pct00016
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
(Nx)와 (N')y는 각각, 각 연속 뉴클레오티드가 공유 결합에 의해 다음번 뉴클레오티드에 이어진 올리고머이며, x와 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
(N)x는 3' 말단 또는 끝에서 두 번째 위치에 하나의 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고;
(N')y는 5' 말단 또는 끝에서 두 번째 위치에 하나의 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고;
각 (N)x 및 (N')y에서 변형된 뉴클레오티드와 미변형된 뉴클레오티드는 교대로 존재하고;
Z와 Z'는 각각 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 그것이 부착되어 있는 어떤 올리고머의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 데옥시리보뉴클레오티드이고;
(N')y의 서열은 (N)x에 실질적으로 상보하는 서열이고;
(N)x의 서열은 유전자로부터 전사된 mRNA에 존재하는 약 18개 내지 약 40개 연속 리보뉴클레오티드와 실질적으로 동일성을 갖는 안티센스 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, (N)x 및 상보하는 (N')y의 서열은 표 A-D 중 어느 하나에 제시된다.
구조 (D)의 한 구체예에서, x=y=19 또는 x=y=23이고; (N)x는 2개의 연속 뉴클레오티드가 3' 말단에서 하나의 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고; (N')y는 2개의 연속 뉴클레오티드가 5' 말단에서 하나의 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 연결된 미변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
어떤 구체예에서, x=y=19 또는 x=y=23이고; (N)x는 3개의 연속 뉴클레오티드가 3' 말단에서 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 함께 이어진 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고; (N')y는 4개의 연속 뉴클레오티드가 5' 말단에서 3개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 함께 이어진 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다(본원에서 구조 II로서 제시됨).
구조 (D)의 다양한 구체예에 따라서, (N)x의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드, 그리고 (N')y의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드가 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 연결된다.
구조 (D)의 한 바람직한 구체예에 따라서, (N')y의 5' 말단에서 4개 연속 뉴클레오티드가 3개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어지고, (N')x의 3' 말단에서 3개 연속 뉴클레오티드가 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다. 또한, (N')y의 5' 말단의 3개 뉴클레오티드와 (N')x의 3' 말단의 2개 뉴클레오티드는 3'-O-메틸 변형을 포함할 수 있다.
구조 (D)의 다양한 구체예에 따라서, (N)x의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드, 및 (N')y의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 거울 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-리보뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-데옥시리보뉴클레오티드이다.
구조 (D)의 다른 구체예에서, (N)x의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드, 및 (N')y의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드이다.
어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 아미노, 플루오로, 알콕시 또는 알킬 부분의 존재를 포함한다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 메톡시 부분(2'-OMe)을 포함한다.
구조 (D)의 한 바람직한 구체예에서, (N')y의 5' 말단의 5개 연속 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함하고, (N')x의 3' 말단의 5개 연속 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 구조 (D)의 다른 바람직한 구체예에서, (N')y의 5' 말단의 10개 연속 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함하고, (N')x의 3' 말단의 5개 연속 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 구조 (D)의 다른 바람직한 구체예에서, (N')y의 5' 말단의 13개 연속 뉴클레오티는 2'-O-메틸 변형을 포함하고, (N')x의 3' 말단의 5개 연속 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
구조 (D)의 어떤 구체예에서, (N')y에서, (N)x의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드, 및 (N')y의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2환 뉴클레오티드이다. 다양한 구체예에서, 2환 뉴클레오티드는 2'-O,4'-C-에틸렌-브릿지 핵산(ENA)과 같은 잠겨진 핵산(LNA)이다.
구조 (D)의 다양한 구체예에서, (N')y는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
구조 (D)의 다양한 구체예에서, (N)x는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
동일한 가닥의 3' 및 5' 말단이 각각 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 구체예에서, 5'와 3' 말단에서 변형은 동일하다. 다른 구체예에서, 5' 말단에 있는 변형은 동일한 가닥의 3' 말단에 있는 변형과 상이하다. 한 특정 구체예에서, 5' 말단에 있는 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, 동일한 가닥의 3' 말단에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다.
구조 (D)의 한 특정 구체예에서, (N')y의 5' 말단의 5개 연속 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 변형을 포함하고, (N')y의 3' 말단의 2개 연속 뉴클레오티드는 L-DNA이다. 이에 더하여, 화합물은 (N')x의 3' 말단에 5개 연속 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
구조 (D)의 다양한 구체예에서, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드와 상이하다. 예를 들어, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오티드이고, (N')y에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이다. 다른 예에서, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, (N')y에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이다. 다른 예에서, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드이고, (N')y에서 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 구조 (E)를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure pct00017
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
(N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 뉴클레오티드가 공유 결합에 의해 다음번 뉴클레오티드에 이어진 올리고머이며, x와 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
(N)x는 5' 말단 또는 끝에서 두 번째 위치에 하나의 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고;
(N')y는 3' 말단 또는 끝에서 두 번째 위치에 하나의 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고;
각 (N)x 및 (N')y에서 변형된 뉴클레오티드와 미변형된 뉴클레오티드가 교대로 존재하지 않고;
Z와 Z'는 각각 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 그것이 부착되어 있는 어떤 올리고머의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 데옥시리보뉴클레오티드이고;
(N')y의 서열은 (N)x에 실질적으로 상보하는 서열이고;
(N)x의 서열은 유전자로부터 전사된 mRNA에 존재하는 약 18개 내지 약 40개 연속 리보뉴클레오티드와 실질적으로 동일성을 갖는 안티센스 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, (N)x 및 상보하는 (N')y의 서열이 표 A-D 중 어느 하나에 제시된다.
어떤 바람직한 구체예에서, (N)x의 5' 말단의 맨 끝 뉴클레오티드는 변형되지 않는다.
구조 (E)의 다양한 구체예에 따라서, (N)x의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여, 바람직하게는 5'의 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드, 및 (N')y의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된다.
구조 (E)의 다양한 구체예에 따라서, (N)x의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여, 바람직하게는 5'의 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드, 및 (N')y의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드는 독립적으로 거울 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-리보뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-데옥시리보뉴클레오티드이다.
구조 (E)의 다른 구체예에서, (N)x의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여, 바람직하게는 5'의 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드, 및 (N')y의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 아미노, 플루오로, 알콕시 또는 알킬 부분의 존재를 포함한다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 메톡시 부분(2'-OMe)을 포함한다.
구조 (E)의 어떤 구체예에서, (N')y에서, (N)x의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여, 바람직하게는 5'의 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드, 및 (N')y의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2환 뉴클레오티드이다. 다양한 구체예에서, 2환 뉴클레오티드는 2'-O,4'-C-에틸렌-브릿지 핵산(ENA)과 같은 잠겨진 핵산(LNA)이다.
구조 (E)의 다양한 구체예에서, (N')y는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, P-알콕시 백본 변형에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드 또는 3' 말단 또는 각 3' 및 5' 말단에서 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
구조 (E)의 다양한 구체예에서, (N)x는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 5' 말단 또는 각 3' 및 5' 말단에서 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
동일한 가닥의 3'과 5' 말단 양쪽이 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 한 구체예에서, 5'와 3' 말단의 변형은 동일하다. 다른 구체예에서, 5' 말단에 있는 변형은 동일한 가닥의 3' 말단에 있는 변형과 상이하다. 한 특정 구체예에서, 5' 말단에 있는 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, 동일한 가닥의 3' 말단에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 이어진다.
구조 (E)의 다양한 구체예에서, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드와 상이하다. 예를 들어, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오티드이고, (N')y에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이다. 다른 예에서, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, (N')y에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이다. 또 다른 예에서, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드이고, (N')y에서 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 구조 (F)를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure pct00018
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
(N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 뉴클레오티드가 공유 결합에 의해 다음번 뉴클레오티드에 이어진 올리고머이며, x와 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
(N)x와 (N')y는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 (N)x와 (N')y는 각각 독립적으로 3' 말단 또는 끝에서 두 번째 위치에 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고, 이때 변형된 뉴클레오티드는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, P-알콕시 백본 변형에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고;
각 (N)x 및 (N')y에서 변형된 뉴클레오티드와 미변형된 뉴클레오티드는 교대로 존재하지 않고;
Z와 Z'는 각각 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 그것이 부착되어 있는 어떤 올리고머의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 데옥시리보뉴클레오티드이고;
(N')y의 서열은 (N)x에 실질적으로 상보하는 서열이고;
(N)x의 서열은 유전자로부터 전사된 mRNA에 존재하는 약 18개 내지 약 40개 연속 리보뉴클레오티드와 실질적으로 동일성을 갖는 안티센스 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, (N)x 및 상보하는 (N')y의 서열이 표 A-D 중 어느 하나에 제시된다.
구조 (F)의 어떤 구체예에서, x=y=19 또는 x=y=23이고; (N')y는 3' 말단의 2개 연속 뉴클레오티드가 2개 연속 거울 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고; (N)x는 3' 말단에서 하나의 뉴클레오티드가 거울 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다(구조 III로서 제시됨).
구조 (F)의 다양한 구체예에 따라서, (N)x 및 (N')y의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된다.
구조 (F)의 한 바람직한 구체예에서, (N')y의 3' 말단의 3개 연속 뉴클레오티드는 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어지고, (N')x의 3' 말단의 3개 연속 뉴클레오티드는 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다.
구조 (F)의 다양한 구체예에 따라서, (N)x 및 (N')y의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드는 독립적으로 거울 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-리보뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-데옥시리보뉴클레오티드이다.
구조 (F)의 다른 구체예에서, (N)x 및 (N')y의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 아미노, 플루오로, 알콕시 또는 알킬 부분의 존재를 포함한다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 메톡시 부분(2'-OMe)을 포함한다.
구조 (F)의 어떤 구체예에서, (N)x 및 (N')y의 3' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2환 뉴클레오티드이다. 다양한 구체예에서, 2환 뉴클레오티드는 2'-O,4'-C-에틸렌-브릿지 핵산(ENA)과 같은 잠겨진 핵산(LNA)이다.
구조 (F)의 다양한 구체예에서, (N')y는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 3' 말단 또는 3'과 5' 말단 양쪽에서 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
구조 (F)의 다양한 구체예에서, (N)x는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 3' 말단 또는 각 3' 및 5' 말단에서 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
동일한 가닥의 각 3' 및 5' 말단이 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 한 구체예에서, 5' 및 3' 말단의 변형은 동일하다. 다른 구체예에서, 5' 말단에 있는 변형은 동일한 가닥의 3' 말단에 있는 변형과 상이하다. 한 특정 구체예에서, 5' 말단에 있는 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, 동일한 가닥의 3' 말단에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다.
구조 (F)의 다양한 구체예에서, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드와 상이하다. 예를 들어, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오티드이고, (N')y에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이다. 다른 예에서, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, (N')y에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이다. 다른 예에서, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이고, (N')y에서 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 구조 (G)를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure pct00019
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
(N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 뉴클레오티드가 공유 결합에 의해 다음번 뉴클레오티드에 이어진 올리고머이며, x와 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
(N)x와 (N')y는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 (N)x와 (N')y는 각각 독립적으로 5' 말단 또는 끝에서 두 번째 위치에 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, P-알콕시 백본 변형에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고;
(N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 바람직하게 5' 말단의 끝에서 두 번째 위치에 있고;
각 (N)x 및 (N')y에서 변형된 뉴클레오티드와 미변형된 뉴클레오티드는 교대로 존재하지 않고;
Z와 Z'는 각각 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 그것이 부착되어 있는 어떤 올리고머의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 데옥시리보뉴클레오티드이고;
(N')y의 서열은 (N)x에 실질적으로 상보하는 서열이고;
(N)x의 서열은 유전자로부터 전사된 mRNA에 존재하는 약 18개 내지 약 40개 연속 리보뉴클레오티드와 실질적으로 동일성을 갖는 안티센스 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, (N)x 및 상보하는 (N')y의 서열이 표 A-D 중 어느 하나에 제시된다.
구조 (G)의 어떤 구체예에서, x=y=19 또는 x=y=23이다.
구조 (G)의 다양한 구체예에 따라서, (N)x 및 (N')y의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된다. 바람직하게, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 5' 말단의 끝에서 두 번째 위치에서 시작된다.
구조 (G)의 다양한 구체예에 따라서, (N)x 및 (N')y의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드는 독립적으로 거울 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-리보뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 거울 뉴클레오티드는 L-데옥시리보뉴클레오티드이다. 바람직하게, (N)x에서 변형된 뉴클레오티드는 5' 말단의 끝에서 두 번째 위치에서 시작된다.
구조 (G)의 다른 구체예에서, (N)x 및 (N')y의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 아미노, 플루오로, 알콕시 또는 알킬 부분의 존재를 포함한다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 메톡시 부분(2'-OMe)을 포함한다. 어떤 바람직한 구체예에서, 연속 변형된 뉴클레오티드는 바람직하게 (N)x의 5' 말단의 끝에서 두 번째 위치에서 시작된다.
구조 (G)의 한 바람직한 구체예에서, (N')y의 5' 말단의 5개 연속 리보뉴클레오티드가 2'-O-메틸 변형을 포함하고, (N')x의 5'의 끝에서 두 번째 위치에 있는 하나의 리보뉴클레오티드가 2'-O-메틸 변형을 포함한다. 구조 (G)의 다른 바람직한 구체예에서, (N')y의 5' 말단의 5개 연속 리보뉴클레오티드가 2'-O-메틸 변형을 포함하고, (N')x의 5' 말단 위치에서 2개 연속 리보뉴클레오티드가 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
구조 (G)의 어떤 구체예에서, (N)x 및 (N')y의 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 2환 뉴클레오티드이다. 다양한 구체예에서, 2환 뉴클레오티드는 2'-O,4'-C-에틸렌-브릿지 핵산(ENA) 같은 잠겨진 핵산(LNA)이다. 어떤 바람직한 구체예에서, 연속 변형된 뉴클레오티드는 바람직하게 (N)x의 5' 말단의 끝에서 두 번째 위치에서 시작된다.
구조 (G)의 다양한 구체예에서, (N')y는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 5' 말단 또는 각 3' 및 5' 말단에서 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
구조 (G)의 다양한 구체예에서, (N)x는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 5' 말단 또는 각 3' 및 5' 말단에서 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로부터 선택된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
동일한 가닥의 각 3' 및 5' 말단이 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 한 구체예에서, 5'와 3' 말단의 변형은 동일하다. 다른 구체예에서, 5' 말단에 있는 변형은 동일한 가닥의 3' 말단에 있는 변형과 상이하다. 한 특정 구체예에서, 5' 말단에서 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, 동일한 가닥의 3' 말단에서 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다. 구조 (G)의 다양한 구체예에서, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드와 상이하다. 예를 들어, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오티드이고, (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 이어진 뉴클레오티드이다. 또 다른 예에서, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이다. 또 다른 예에서, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이고, (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 구조 (H)를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure pct00020
여기서, N과 N'는 각각 미변형된 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드로부터 선택된 뉴클레오티드이고;
(N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 뉴클레오티드가 공유 결합에 의해 다음번 뉴클레오티드에 이어진 올리고머이며, x와 y는 각각 18 내지 40의 정수이고;
(N)x는 3' 말단 또는 끝에서 두 번째 위치 또는 5' 말단 또는 끝에서 두 번째 위치에 하나의 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고;
(N')y는 내부 위치에 하나의 변형된 뉴클레오티드를 더 포함하는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 뉴클레오티드는 2환 뉴클레오티드, 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드, 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합, P-알콕시 연결 또는 PACE 연결로부터 선택된 뉴클레오티드 간 연결에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택되고;
각 (N)x 및 (N')y에서 변형된 뉴클레오티드와 미변형된 뉴클레오티드는 교대로 존재하지 않고;
Z와 Z'는 각각 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재한다면 그것이 부착되어 있는 어떤 올리고머의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 데옥시리보뉴클레오티드이고;
(N')y의 서열은 (N)x에 실질적으로 상보하는 서열이고;
(N)x의 서열은 유전자로부터 전사된 mRNA에 존재하는 약 18개 내지 약 40개 연속 리보뉴클레오티드와 실질적으로 동일성을 갖는 안티센스 서열을 포함한다.
어떤 구체예에서, (N)x 및 상보하는 (N')y의 서열이 표 A-D 중 어느 하나에 제시된다.
구조 (H)의 한 구체예에서, (N)x의 3' 말단 또는 5' 말단 또는 양쪽 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 2환 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드이고, (N')y에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 내부 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 2환 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 아미노, 플루오로, 알콕시 또는 알킬 부분의 존재를 포함한다. 어떤 구체예에서, 2' 당 변형은 메톡시 부분(2'-OMe)을 포함한다.
구조 (H)의 다른 구체예에서, (N')y의 3' 말단 또는 5' 말단의 맨 끝 또는 끝에서 두 번째 위치에서 시작하여 독립적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 리보뉴클레오티드, 또는 (N')y의 각 5' 및 3' 말단의 2-8개 연속 뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 2환 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드이고, (N)x에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 내부 리보뉴클레오티드는 독립적으로 2' 당 변형된 뉴클레오티드, 2환형 뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 알트리톨 뉴클레오티드 또는 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드이다.
동일한 가닥의 각 3' 및 5' 말단이 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 한 구체예에서, 5'와 3' 말단의 변형은 동일하다. 다른 구체예에서, 5' 말단에 있는 변형은 동일한 가닥의 3' 말단에 있는 변형과 상이하다. 한 특정 구체예에서, 5' 말단에 있는 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, 동일한 가닥의 3' 말단에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 포스포디에스테르 결합으로 이어진다.
구조 (H)의 다양한 구체예에서, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드와 상이하다. 예를 들어, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2' 당 변형된 뉴클레오티드이고, (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이다. 다른 예에서, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이고, (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이다. 또 다른 예에서, (N)x에 있는 변형된 뉴클레오티드는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결에 의해 연결된 뉴클레오티드이고, (N')y에 있는 변형된 뉴클레오티드는 거울 뉴클레오티드이다.
구조 (H)의 한 바람직한 구체예에서, x=y=19이고; (N')y의 뉴클레오티드 위치 9-11에 있는 3개 연속 리보뉴클레오티드가 2'-O-메틸 변형을 포함하고, (N')x의 3' 말단 위치에서 5개 연속 리보뉴클레오티드가 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
상기 구조 (A)-(H) 모두에 있어서, 다양한 구체예에서, x=y이고, x와 y는 각각 19, 20, 21, 22 또는 23이다. 어떤 구체예에서, x=y=19이다. 또 다른 구체예에서, x=y=23이다. 추가의 구체예에서, 화합물은 교대로 위치하는 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 (N)x의 5' 및 3' 말단에서 각 N은 이들의 당 잔기에서 변형되고, 중앙 리보뉴클레오티드, 예를 들어 19-mer 가닥에서 위치 10에 있는 리보뉴클레오티드, 21-mer 가닥에서 위치 11에 있는 리보뉴클레오티드, 그리고 23-mer 가닥에서 위치 12에 있는 리보뉴클레오티드는 변형되지 않는다.
어떤 구체예에서, x=y=21 또는 x=y=23인 경우, 19-mer에서 변형 위치는 21-mer 및 23-mer에 맞춰 조정되며, 단 안티센스 가닥의 중앙 뉴클레오티드는 변형되지 않는 것이 바람직하다.
어떤 구체예에서, (N)x도 (N')y도 모두 3' 및 5' 말단에서 인산화되지 않는다. 다른 구체예에서, (N)x와 (N')y 중 하나 또는 둘 모두 3' 말단에서 인산화된다. 또 다른 구체예에서, (N)x와 (N')y 중 하나 또는 둘 모두 비-절단가능한 포스페이트기를 사용하여 3' 말단에서 인산화된다. 또 다른 구체예에서, (N)x와 (N')y 중 하나 또는 둘 모두 절단가능한 또는 비-절단가능한 포스페이트기를 사용하여 말단의 2' 말단 위치에서 인산화된다. 이들 특정한 siRNA 화합물은 또한 블런트형으로 종결되며, 말단에서 비-인산화된다. 그러나, 비교 실험에서 3'-말단의 한쪽 또는 양쪽에서 인산화된 siRNA 화합물은 비-인산화된 화합물과 비교하여 유사한 생체내 활성을 가진다고 나타났다.
어떤 구체예에서, 상기 언급된 모든 구조들에 있어서, 화합물은 블런트형으로 종결되며, 예를 들어 이때는 Z와 Z'가 모두 부재한다. 다른 구체예에서, 화합물은 적어도 하나의 3' 오버행을 포함하며, 이때는 Z 또는 Z' 중 적어도 하나가 존재한다. Z 및 Z'는 독립적으로 하나 이상의 공유 연결된 변형된 또는 미변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 반전된 dT 또는 dA; dT, LNA, 거울 뉴클레오티드 등을 포함한다. 어떤 구체예에서, Z와 Z'는 각각 독립적으로 dT 및 dTdT로부터 선택된다. Z 및/또는 Z'가 존재하는 siRNA는 Z와 Z'가 부재하는 siRNA와 유사한 활성 및 안정성을 가진다.
어떤 구체예에서, 상기 언급된 모든 구조들에 있어서, 화합물은 하나 이상의 포스포노카르복실레이트 및/또는 포스피노카르복실레이트 뉴클레오티드(PACE 뉴클레오티드)를 포함한다. 어떤 구체예에서, PACE 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이고, 포스피노카르복실레이트 뉴클레오티드는 포스피노아세테이트 뉴클레오티드이다. PACE 뉴클레오티드와 유사체의 예는 본원에 참고자료로 포함되는 US 특허 Nos. 6,693,187 및 7,067,641에 개시된다.
어떤 구체예에서, 상기 언급된 모든 구조들에 있어서, 화합물은 하나 이상의 잠겨진 핵산(LNA)을 포함하며, 잠겨진 핵산은 브릿지 핵산 또는 2환 뉴클레오티드라고도 정의된다. 바람직한 잠겨진 핵산은 2'-O,4'-C-에틸렌뉴클레오시드(ENA) 또는 2'-O,4'-C-메틸렌뉴클레오시드이다. LNA 및 ENA 뉴클레오티드의 다른 예는 본원에 참고자료로 모두 포함되는 WO 98/39352, WO 00/47599 및 WO 99/14226에 개시된다.
어떤 구체예에서, 상기 언급된 모든 구조들에 있어서, 화합물은 하나 이상의 알트리톨 모노머(뉴클레오티드)를 포함하며, 알트리톨 모노머는 1,5-안히드로-2-데옥시-D-알트리토-헥시톨이라고도 정의된다(예를 들어, 본원에 참고자료로 모두 포함되는 Allart et al., 1998. Nucleosides & Nucleotides 17:1523-1526; Herdewijn et al., 1999. Nucleosides & Nucleotides 18:1371-1376; Fisher et al., 2007, NAR 35(4):1064-1074를 참조한다).
본 발명은 각 N 및/또는 N'가 데옥시리보뉴클레오티드(D-A, D-C, D-G, D-T)인 화합물을 분명히 배제한다. 어떤 구체예에서, (N)x 및 (N')y는 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 각 N이 미변형된 리보뉴클레오티드이고, (N')y의 3' 말단 뉴클레오티드 또는 (N')y의 3' 말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드인 화합물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 각 N이 미변형된 리보뉴클레오티드이고, (N')y의 5 말단 뉴클레오티드 또는 (N')y의 5' 말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, (N)x의 5' 말단 뉴클레오티드 또는 (N)x의 5' 말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 연속 뉴클레오티드와 3' 말단의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 연속 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드이고, 각 N'가 미변형된 리보뉴클레오티드이다. 또 다른 구체예에서, (N)x는 미변형된 리보뉴클레오티드 및 각 5' 및 3' 말단에서 독립적으로 1개 또는 2, 3 또는 4개 연속 데옥시리보뉴클레오티드와 내부 위치에서 1개 또는 2, 3, 4, 5 또는 6개 연속 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하고, 각 N'는 미변형된 리보뉴클레오티드이다. 어떤 구체예에서, (N')y의 3' 말단 뉴클레오티드 또는 (N')y의 3' 말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드와 (N)x의 말단 5' 뉴클레오티드 또는 (N)x의 5' 말단의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 연속 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드이다. 본 발명은 각 N 및/또는 N'가 데옥시리보뉴클레오티드인 화합물을 배제한다. 어떤 구체예에서, N의 5' 말단 뉴클레오티드 또는 N의 2개 또는 3개 연속 뉴클레오티드와 N'의 1, 2 또는 3개가 데옥시리보뉴클레오티드이다. 활성 DNA/RNA siRNA 키메라의 어떤 예가 US 특허공개 No. 2005/0004064, 및 본원에 전문이 참고자료로 포함되는 Ui-Tei, 2008(NAR 36(7):2136-2151)에 개시된다.
다른 명시가 없다면, 본원에서 논의된 구조들의 바람직한 구체예에서, 각 연속 N 또는 N' 간의 공유 결합은 포스포디에스테르 결합이다.
본 발명에 의해 제공되는 추가의 신규한 분자는, 뉴클레오티드의 제 1 세그먼트가 제 1 억제성 RNA 분자를 암호화하고, 뉴클레오티드의 제 2 세그먼트가 제 2 억제성 RNA 분자를 암호화하고, 뉴클레오티드의 제 3 세그먼트가 제 3 억제성 RNA 분자를 암호화하는 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 제 1, 제 2 및 제 3 세그먼트는 각각 이중 가닥 RNA의 한 가닥을 포함할 수 있고, 제 1, 제 2 및 제 3 세그먼트는 링커에 의해 함께 이어질 수 있다. 또한, 이 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 링커에 의해 함께 이어진 3개의 이중 가닥 세그먼트를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의해 제공되는 한 분자는 3개의 억제성 RNA 분자를 암호화하는 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 상기 올리고뉴클레오티드는 3중 가닥 구조를 지닐 수 있고, 이로써 3개의 이중 가닥 팔이, 상기 제시된 링커들 중 임의의 것과 같은, 하나 이상의 링커에 의해 함께 연결된다. 이 분자는 "별"-모양 구조를 형성하며, 본원에서는 RNAstar라고 언급될 수도 있다. 상기 3중 가닥 올리고뉴클레오티드는 하기의 일반적 구조를 갖는 올리고리보뉴클레오티드일 수 있다:
Figure pct00021
여기서, 링커 A, 링커 B 또는 링커 C 중 하나 이상이 존재한다. 가닥의 극성 및 분자의 일반 구조가 유지되는 한, 둘 이상의 올리고뉴클레오티드와 링커 A-C 중 하나 이상의 어떤 조합도 가능하다. 또한, 링커 A-C 중 둘 이상이 존재하는 경우, 이들은 동일할 수도 상이할 수도 있다.
따라서, 각 팔이 센스 가닥 및 실질적으로 상보하는 안티센스 가닥을 포함하는 삼중-팔 구조가 형성된다(즉, Oligo1 안티센스 염기쌍 대 Oligo1 센스 등). 삼중-팔 구조는 삼중 가닥일 수 있으며, 이로써 각 팔은 염기쌍을 지니게 된다.
또한, 상기 삼중 가닥 구조는 가닥 중 하나 이상에서 링커 대신에 갭을 가질 수 있다. 하나의 갭을 가진 이러한 분자는 기술적으로 4중 가닥이며, 3중 가닥이 아니다. 추가의 갭 또는 닉의 삽입은 추가의 가닥을 갖는 분자를 가져올 것이다. 본 발명의 발명자들에 의해 얻어진 예비 결과는 상기 갭을 가진 분자가 갭이 없는 유사한 분자보다 어떤 표적 유전자를 억제하는데 더욱 활성임을 시사한다. 또한, 이것은 닉을 가진 분자의 경우에도 마찬가지일 수 있다.
공유 결합은 하나의 뉴클레오티드 모노머와 인접 뉴클레오티드 모노머를 연결하는 뉴클레오티드 간 연결을 말한다. 공유 결합은, 예를 들어 포스포디에스테르 결합, 포스포로티오에이트 결합, P-알콕시 결합, P-카르복시 결합 등을 포함한다. RNA 및 DNA의 정상적 뉴클레오시드 간 연결은 3'에서 5' 방향의 포스포디에스테르 연결이다. 어떤 바람직한 구체예에서, 공유 결합은 포스포디에스테르 결합이다. 공유 결합은 비-인-함유 뉴클레오시드 간 연결, 특히 WO 2004/041924에 개시된 것들을 포함한다. 다른 명시가 없다면, 본원에서 논의된 구조들의 바람직한 구체예에서, 각 연속 N 또는 N' 간의 공유 결합은 포스포디에스테르 결합이다.
상기 모든 구조들에 있어서, 어떤 구체예에서, (N)x의 올리고뉴클레오티드 서열은 (N')y의 올리고뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적이다. 다른 구체예에서, (N)x와 (N')y는 실질적으로 상보적이다. 어떤 구체예에서, (N)x는 표적 서열에 완전히 상보적이다. 다른 구체예에서, (N)x는 표적 서열에 실질적으로 상보적이다.
정의
편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 청구범위에서 사용된 어떤 용어들을 여기 설명한다.
본원에서 사용된 단수형 "한", 및 "그"는 문맥상 명백히 다른 뜻을 지시하지 않는다면 복수형을 포함하는 것으로 주지되어야 한다.
본 발명의 양태 또는 구체예가 마커쉬 그룹 또는 다른 대용물의 그룹에 의하여 설명된 경우, 본 발명이 또한 임의의 개별 구성원 또는 해당 그룹의 구성원들의 하위그룹에 의해서도 설명된다는 것을 당업자는 인정할 것이다.
"전구-세포자멸 폴리펩티드"는 스플라이스 변이체, 동형, 오르토로그, 또는 파라로드 등도 포함해서, 상기 나열된 유전자 중 어느 것에 의해 암호화된 폴리펩티드를 말한다.
"억제제"는 바람직한 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성할 만큼 충분한 정도로 유전자의 발현 또는 이러한 유전자의 산물의 활성을 감소시킬 수 있는 화합물이다. 본원에서 사용된 용어 "억제제"는 siRNA, shRNA, miRNA 및 리보자임을 포함해서, 올리고뉴클레오티드 억제제 중 하나 이상을 말한다. 또한, 억제는 하향-조절, 또는 RNAi에 대해서는 스플라이싱이라고 언급될 수도 있다.
본원에서 사용된 용어 "억제하다"는 바람직한 생물학적 또는 생리학적 효과를 달성할 만큼 충분한 정도로 유전자 또는 이러한 유전자의 산물의 활성을 감소시키는 것을 말한다. 억제는 완전 억제 또는 부분적 억제일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 호환하여 사용될 수 있으며, 데옥시리보핵산(DNA), 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 또한, 이 용어는 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체를 등가물로서 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서의 전체에서 mRNA 서열은 이들의 상응하는 유전자의 표적을 표시하는 것으로서 제시된다. 용어 "mRNA 폴리뉴클레오티드 서열" 및 mRNA는 호환하여 사용된다.
"올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고머"는 약 2 내지 약 50개 뉴클레오티드의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 서열을 말한다. 각 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드는 독립적으로 천연 또는 합성 뉴클레오티드일 수 있고, 및/또는 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 변형은 당 부분, 염기 부분 및 또는 올리고뉴클레오티드 내 뉴클레오티드 간 결합의 변화를 포함한다. 본 발명의 화합물은 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드 및 이들의 조합을 포함하는 분자들을 포괄한다.
본원에서 사용된 용어 "비염기쌍 뉴클레오티드 유사체"는 비-염기쌍 부분을 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 의미하며, 비염기쌍 부분은, 제한되는 것은 아니지만, 6 데스 아미노 아데노신(Nebularine), 4-Me-인돌, 3-니트로피롤, 5-니트로인돌, Ds, Pa, N3-Me 리보 U, N3-Me 리보 T, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-에틸-dC, N3-Me dC를 포함한다. 어떤 구체예에서, 비염기쌍 뉴클레오티드 유사체는 리보뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 이것은 데옥시리보뉴클레오티드이다.
본 발명은 생체내에서 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 SEQ ID NOS: 1-41, 46-48에 제시된 mRNA를 표적화하도록, 올리고리보뉴클레오티드, 특히 작은 간섭 RNA(즉, siRNA) 또는 세포에서 siRNA를 생성할 수 있는 핵산 물질을 RNA 간섭 기전에 의해 표적 유전자의 발현을 하향-조절하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 특히, 상기 방법은 해당 유전자의 발현과 관련된 질환으로 고통받는 피험자의 치료를 위해서 유전자의 발현을 억제하는데 유용하다. 본 발명에 따라서, 표적 유전자의 siRNA 분자 또는 억제제는 다양한 병리현상을 치료하기 위한 약물로서 사용된다.
"뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포괄하여 의미하며, 이들은 천연 또는 합성일 수 있고, 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 변형은 당 부분, 염기 부분 및/또는 뉴클레오티드 간 결합의 변화 및 치환을 포함한다.
뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드의 모든 유사체, 또는 변형이 본 발명과 함께 사용될 수 있으며, 단 상기 유사체 또는 변형은 뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드의 기능에 실질적으로 불리한 영향을 미치지 않아야 한다. 허용되는 변형은 당 부분의 변형, 염기 부분의 변형, 뉴클레오티드 간 결합의 변형, 및 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에서 이따금 "비염기성 뉴클레오티드" 또는 "비염기성 뉴클레오티드 유사체"로서 언급되는 것은 가-뉴클레오티드 또는 비정규 부분이라고 하는 것이 더 정확하다. 뉴클레오티드는 리보오스 또는 데옥시리보오스 당, 포스페이트, 및 염기(DNA에서 아데닌, 구아닌, 티민, 또는 시토신; RNA에서 아데닌, 구아닌, 우라실, 또는 시토신)로 구성된 핵산의 모노머 단위이다. 변형된 뉴클레오티드는 당, 포스페이트 및/또는 염기 중 하나 이상에 변형을 포함한다. 비염기성 가-뉴클레오티드는 염기를 결여하며, 따라서 엄밀히 뉴클레오티드는 아니다.
본원에서 사용된 용어 "캡핑 부분"은 비염기성 리보오스 부분, 비염기성 데옥시리보오스 부분, 2'-O 알킬 변형을 포함하는 비염기성 리보오스 및 비염기성 데옥시리보오스 부분의 변형; 반전된 비염기성 리보오스 및 비염기성 데옥시리보오스 부분 및 이들의 변형; C6-이미노-Pi; L-DNA 및 L-RNA를 포함하는 거울 뉴클레오티드; 5'-0Me 뉴클레오티드; 및 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 유사체; 1-(β-D-에리트로푸라노실)뉴클레오티드; 4'-티오뉴클레오티드, 탄소환 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필포스페이트, 3-아미노프로필포스페이트; 6-아미노헥실포스페이트; 12-아미노도데실포스페이트; 히드록시프로필포스페이트; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비환상 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-반전된 비염기성 부분; 1,4-부탄디올포스페이트; 5'-아미노; 및 브릿지 또는 비브릿지 메틸포스포네이트 및 5'-메르캅토 부분을 포함한다.
어떤 바람직한 캡핑 부분은 비염기성 리보오스 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분; 반전된 비염기성 리보오스 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분; C6-아미노-Pi; L-DNA 및 L-RNA를 포함하는 거울 뉴클레오티드이다. 도 22는 C6-아미노 포스페이트 5' 캡핑 부분의 화학 구조 및 그것의 5' 말단(N') 부착점을 나타낸다.
본원에서 사용된 "비정규 부분"은 비염기성 리보오스 부분, 비염기성 데옥시리보오스 부분, 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 비염기쌍 뉴클레오티드 유사체 및 2'-5' 뉴클레오티드 간 포스페이트 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드; LNA 및 에틸렌 브릿지 핵산을 포함하는 브릿지 핵산을 말한다.
비염기성 데옥시리보오스 부분은, 예를 들어 비염기성 데옥시리보오스-3'-포스페이트; 1,2-디데옥시-D-리보푸라노오스-3-포스페이트; 1,4-안히드로-2-데옥시-D-리비톨-3-포스페이트를 포함한다. 반전된 비염기성 데옥시리보오스 부분은 반전된 데옥시리보비염기성; 3',5' 반전된 데옥시비염기성 5'-포스페이트를 포함한다.
거울 뉴클레오티드는 예를 들어 L-DNA(L-데옥시리보아데노신-3'-포스페이트(거울 dA); L-데옥시리보시티딘-3'-포스페이트(거울 dC); L-데옥시리보구아노신-3'-포스페이트(거울 dG); L-데옥시리보티미딘-3'-포스페이트(거울상 dT)) 및 L-RNA (L-리보아데노신-3'-포스페이트(거울 rA); L-리보시티딘-3'-포스페이트(거울 rC); L-리보구아노신-3'-포스페이트(거울 rG); L-리보우라실-3'-포스페이트(거울 dU)를 포함한다.
변형된 데옥시리보뉴클레오티드는, 예를 들어 5' 말단 위치(위치 1번)에 있는 뉴클레오티드로서 유용할 수 있는 5'-0Me DNA(5-메틸-데옥시리보구아노신-3'-포스페이트); PACE(데옥시리보아데닌 3'-포스포노아세테이트, 데옥시리보시티딘 3'-포스포노아세테이트, 데옥시리보구아노신 3'-포스포노아세테이트, 데옥시리보티미딘 3'-포스포노아세테이트)를 포함한다.
브릿지 핵산은 LNA(2'-O,4'-C-메틸렌 브릿지 핵산 아데노신 3'-모노포스페이트, 2'-O,4'-C-메틸렌 브릿지 핵산 5-메틸-시티딘 3'-모노포스페이트, 2'-O,4'-C-메틸렌 브릿지 핵산 구아노신 3'-모노포스페이트, 5-메틸-우리딘(또는 티미딘) 3'-모노포스페이트); 및 ENA(2'-O,4'-C-에틸렌 브릿지 핵산 아데노신 3'-모노포스페이트, 2'-O,4'-C-에틸렌 브릿지 핵산 5-메틸-시티딘 3'-모노포스페이트, 2'-O,4'-C-에틸렌 브릿지 핵산 구아노신 3'-모노포스페이트, 5-메틸-우리딘(또는 티미딘) 3'-모노포스페이트)를 포함한다.
본 발명의 어떤 구체예에서, 바람직한 비정규 부분은 비염기성 리보오스 부분, 비염기성 데옥시리보오스 부분, 데옥시리보뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 및 2'-5' 뉴클레오티드 간 포스페이트 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드이다.
뉴클레오티드는 자연 발생 또는 합성 변형된 염기로부터 선택된다. 자연 발생 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실을 포함한다. 뉴클레오티드의 변형된 염기는 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 2-프로필 및 다른 알킬 아데닌, 5-할로 우라실, 5-할로 시토신, 6-아자 시토신 및 6-아자 티민, 가 우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌, 8-아미노아데닌, 8-티올 아데닌, 8-티오알킬 아데닌, 8-히드록시 아데닌 및 다른 8-치환 아데닌, 8-할로 구아닌, 8-아미노 구아닌, 8-티올 구아닌, 8-티오알킬 구아닌, 8-히드록실 구아닌 및 다른 치환 구아닌, 다른 아자 및 데아자 아데닌, 다른 아자 및 데아자 구아닌, 5-트리플루오로메틸 우라실 및 5-트리플루오로 시토신을 포함한다. 본 발명은 비염기성 가-뉴클레오티드뿐만 아니라 교대하는 RNA와 DNA 뉴클레오티드를 포함하는 분자들도 포괄한다. 비염기성 가-뉴클레오티드 모노머를 포함해서 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드 모노머가 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 대신하여 치환될 수 있다. 비염기성 가-뉴클레오티드 모노머는 말단 위치 중 하나 이상에 또는 5' 말단 캡으로서 포함될 수 있다. 5' 말단 캡은 또한 반전된 비염기성 가-뉴클레오티드 유사체, L-DNA 뉴클레오티드, 및 C6-이민포스페이트로부터 선택될 수 있다.
이에 더하여, 하나 이상의 뉴클레오티드의 구조가 근본적으로 변경되어 치료 또는 실험 시약으로서 더 적합하게 된 폴리뉴클레오티드의 유사체가 제조된다. 뉴클레오티드 유사체의 예는 DNA(또는 RNA)의 데옥시리보오스(또는 리보오스) 포스페이트 백본이 펩티드에서 발견되는 것과 유사한 폴리아미드 백본을 포함하는 펩티드 핵산(PNA)이다. PNA 유사체는 효소 분해에 내성을 가지고 생체내 및 시험관내에서 연장된 수명을 가지는 것으로 나타났다.
당 잔기에 대한 가능한 변형은 여러 가지이며, 2'0 알킬, 잠겨진 핵산(LNA), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 아라비노시드; 알트리톨(ANA) 및 모르폴리노 및 시클로헥시닐을 포함하는 다른 6-원 당을 포함한다.
LNA 화합물은 국제 특허공개 Nos. WO 00/47599, WO 99/14226 및 WO 98/39352에 개시된다. LNA 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA 화합물의 예는 Elmen et al. (NAR 2005. 33(1):439-447) 및 국제 특허공개 No. WO 2004/083430에 개시된다. 6-원 고리 뉴클레오티드 유사체는 Allart et al.(Nucleosides & Nucleotides, 1998, 17:1523-1526); 및 Perez-Perez et al.(1996, Bioorg. and Medicinal Chem Letters 6:1457-1460)에 개시된다. 헥시톨 및 알트리톨 뉴클레오티드 모노머를 비롯한 6-원 고리 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 국제 특허출원공개 No. WO 2006/047842에 개시된다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 반전된 뉴클레오티드, 예를 들어 반전된 티미딘 또는 반전된 아데닌을 사용하여 합성된다(예를 들어, Takei et al., 2002 JBC 277(26):23800-06를 참조한다).
본 발명의 맥락에서, "거울" 뉴클레오티드(거울상 앱타머(spiegelmer)라고도 한다)는 자연 발생 또는 통상 사용되는 뉴클레오티드에 비해 반전된 키랄성을 가진 뉴클레오티드 유사체, 즉 자연 발생 또는 통상 사용되는 뉴클레오티드의 거울상인 뉴클레오티드 유사체이다. 거울 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드(L-RNA) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(L-DNA)이며, 적어도 하나의 당 또는 염기 변형 및/또는 백본 변형, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 포스포네이트 부분을 더 포함할 수 있다. US 특허 No. 6,602,858는 적어도 하나의 L-뉴클레오티드 치환을 포함하는 핵산 촉매를 개시한다.
에틸(포스포-에틸 트리에스테르 생성); 프로필(포스포-프로필 트리에스테르 생성); 및 부틸(포스포-부틸 트리에스테르 생성)과 같은 백본 변형이 또한 가능하다. 다른 백본 변형은 중합체 백본, 환상 백본, 비환상 백본, 티오포스페이트-D-리보오스 백본, 아미데이트, 포스포노아세테이트 유도체를 포함한다. 어떤 구조는 하나 또는 복수의 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결(브릿지 또는 백본)을 갖는 siRNA 화합물을 포함한다.
어떤 구체예에서, (N)x도 (N')y도 모두 3' 및 5' 말단에서 인산화되지 않는다. 다른 구체예에서, (N)x와 (N')y 중 하나 또는 둘 모두가 3' 말단에서 인산화된다(3' Pi). 또 다른 구체예에서, (N)x와 (N')y 중 하나 또는 둘 모두가 비-절단가능한 포스페이트기로 3' 말단에서 인산화된다. 다른 구체예에서, (N)x와 (N')y 중 하나 또는 둘 모두가 절단가능한 또는 비-절단가능한 포스페이트기를 사용하여 말단의 2' 말단 위치에서 인산화된다.
더 나아가, 본 발명의 억제성 핵산 분자는 하나 이상의 갭 및/또는 하나 이상의 닉 및/또는 하나 이상의 미스매치를 포함할 수 있다. 이론과 결부시키고 싶지는 않지만, 갭, 닉 및 미스매치는 핵산/siRNA를 부분적으로 탈안정화하는 이점을 가지며, 이로써 DICER, DROSHA 또는 RISC와 같은 내인성 세포 기전에 의해 그것의 억제성 성분으로 더욱 용이하게 가공될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 핵산 내 갭은 1개 가닥에서 하나 이상의 내부 뉴클레오티드의 부재를 말하고, 핵산 내 닉은 1개 가닥에서 2개의 인접 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드 간 연결의 부재를 말한다. 본 발명의 분자 중 어느 것은 하나 이상의 갭 및/또는 하나 이상의 닉을 함유할 수 있다.
올리고뉴클레오티드
표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)는 siRNA 화합물의 제조에 유용한, 센스 및 상응하는 안티센스 올리고머의 핵산 서열들을 포함한다. 이 화합물들은 화학적으로 및/또는 구조적으로 변형된 화합물로서 사용된다.
기지의 유전자에 상응하는 siRNA의 선택과 합성이 광범하게 보고되었다. 예를 들어, Ui-Tei et al., J Biomed Biotechnol 2006; 650-52; Chalk et al., BBRC. 2004, 319(1):264-74; Sioud & Leirdal, Met Mol Biol 2004 252:457-69; Levenkova et al., Bioinform. 2004, 20(3):430-2; Ui-Tei et al., NAR. 2004, 32(3):936-48를 참조한다. 변형된 siRNA의 제조와 사용에 관해서, 예를 들어 Braasch et al., Biochem. 2003, 42(26):7967-75; Chiu et al., RNA. 2003, 9(9):1034-48; PCT 공개 Nos. WO 2004/015107 및 WO 02/44321, 및 US 특허 Nos. 5,898,031 및 6,107,094를 참조한다.
본 발명은 원하는 유전자의 발현을 하향-조절하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드(예를 들어, siRNA)를 제공한다. 본 발명의 siRNA는 센스 가닥이 원하는 유전자의 mRNA 서열로부터 유래되고, 안티센스 가닥이 센스 가닥에 적어도 실질적으로 상보하는 듀플렉스 올리고리보뉴클레오티드이다. 일반적으로, 표적 mRNA 서열로부터의 일부 편차는 siRNA 활성에 대한 손상 없이 관용된다(예를 들어, Czauderna et al., NAR. 2003, 31(11):2705-2716 참조). 본 발명의 siRNA는 mRNA를 파괴하거나 파괴하지 않으면서 전사 후 수준에서 유전자 발현을 억제한다. 이론과 결부되지는 않지만, siRNA는 특이적 절단 및 변성에 대해 mRNA를 표적화할 수 있으며, 및/또는 표적화된 메시지로부터 번역을 억제할 수 있다.
어떤 구체예에서, 표 D(D1-D34)로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 쌍은 본원에 개시된 변형 중 하나 이상을 가진 변형된 siRNA를 포함한다. 다양한 구체예에서, siRNA는 제 1 가닥과 제 2 가닥을 포함하는 RNA 듀플렉스를 포함하며, 제 1 가닥은 표적 유전자로부터 전사된 mRNA인 표적 핵산의 약 18개 내지 약 40개 연속 뉴클레오티드에 적어도 부분적으로 상보하는 리보뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제 2 가닥은 제 1 가닥에 적어도 부분적으로 상보하는 리보뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 상기 제 1 가닥 및/또는 상기 제 2 가닥은 변형된 리보뉴클레오티드들의 복수의 그룹을 포함하고, 이들은 선택적으로 당 부분의 2' 위치에 변형을 가지며, 각 가닥 내에서 변형된 리보뉴클레오티드의 각 그룹은 측면 뉴클레오티드의 그룹이 한 측면 또는 양 측면에 측면 위치되고, 측면 뉴클레오티드는 선택적으로 리보뉴클레오티드이며, 측면 리보뉴클레오티드의 그룹을 형성하는 각 리보뉴클레오티드는 미변형된 리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드의 그룹의 변형과는 상이한 변형을 가진 리보뉴클레오티드로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, 변형된 리보뉴클레오티드의 그룹 및/또는 측면 뉴클레오티드의 그룹은 1 내지 12의 정수로 구성되는 군으로부터 선택된 수의 리보뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 이와 같은 그룹은 1개 뉴클레오티드, 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드 또는 12개 뉴클레오티드를 포함한다.
변형된 뉴클레오티드와 측면 뉴클레오티드의 그룹은 한 가닥 또는 양쪽 가닥에 패턴으로 조직될 수 있다. 어떤 구체예에서, 안티센스 및 센스 가닥은 교대하는 미변형된 리보뉴클레오티드와 2' 당 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 바람직한 구체예에서, 안티센스 가닥에서 중앙 리보뉴클레오티드는 미변형된 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 19-올리고머 안티센스 가닥에서 위치 10의 리보뉴클레오티드는 변형되지 않고, 21-올리고머 안티센스 가닥에서 위치 11의 리보뉴클레오티드는 변형되지 않으며, 23-올리고머 안티센스 가닥에서 위치 12의 리보뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 변형이 존재한다면, siRNA의 변형 또는 변형의 패턴은 이를 허용하도록 계획되어야 한다. 짝수 올리고머에서, 예를 들어 22-mer에서 중앙 뉴클레오티드는 위치 11 또는 12에 있을 수 있다.
당 잔기의 2' 부분에 대한 가능한 변형은 아미노, 플루오로, 메톡시, 알콕시, 알킬, 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, CN, CF, 이미다졸, 카르복실레이트, 티오에이트, C1-C10 저급알킬, 치환 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬, OCF3, OCN, O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노 또는 치환 실릴을 포함하며, 특히 유럽특허 EP O 586 520 B1 또는 EP 0 618 925 B1에 설명된 것들을 포함한다. 또한, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드가 본 발명의 화합물에서 관용된다. 본원에 개시된 분자, RNAi 또는 RNAi의 어떤 구체예의 설계를 위한 어떤 전략의 설명에서, 본원에서 사용된 용어 "단부 변형"은 센스 및/또는 안티센스 가닥의 말단 5' 또는 3' 뉴클레오티드에 부가된 화학적 실체를 의미한다. 이러한 단부 변형의 예는, 제한되는 것은 아니지만, 3' 또는 5' 포스페이트, 반전된 비염기성, 비염기성, 아미노, 플루오로, 클로로, 브로모, CN, CF3, 메톡시, 이미다졸릴, 카르복실레이트, 포스포티오에이트, C1-C22 및 저급 알킬, 지질, 당 및 폴리아미노산(즉 펩티드), 치환 저급 알킬, 알카릴 또는 아랄킬, OCF3, OCN, 0-, S-, 또는 N-알킬; 0-, S-, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노 또는 치환 실릴을 포함하며, 특히 유럽특허 EP O 586 520 B1 또는 EP O 618 925 B1에 설명된 것들을 포함한다.
어떤 구체예에서, siRNA는 블런트 형으로 종결되는데, 즉 한 단부 또는 양쪽 단부에서 Z와 Z'가 부재한다. 더 구체적으로, siRNA는 제 1 가닥의 5' 말단 및 제 2 가닥의 3' 말단에 의해 한정된 단부, 및/또는 제 1 가닥의 3' 말단 및 제 2 가닥의 5' 말단에 의해 한정된 단부에서 블런트 형으로 종결될 수 있다.
다른 구체예에서, 2개 가닥 중 적어도 하나는 5' 말단에서 적어도 1개 뉴클레오티드의 오버행을 가질 수 있으며, 오버행은 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 또한, 가닥들 중 적어도 하나는 선택적으로 3' 말단에서 적어도 1개 뉴클레오티드의 오버행을 가질 수 있다. 오버행은 약 1개 내지 약 5개 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
RNA 듀플렉스의 길이는 약 18개 내지 약 40개 리보뉴클레오티드, 바람직하게 19, 21 또는 23개 리보뉴클레오티드이다. 또한, 각 가닥의 길이는 독립적으로 약 15개 내지 약 40개 염기, 바람직하게 18 내지 23개 염기, 더 바람직하게 19, 21 또는 23개 리보뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 길이를 가질 수 있다.
어떤 구체예에서, 상기 제 1 가닥과 표적 핵산 간의 상보성은 완벽할 수 있다. 어떤 구체예에서, 가닥들은 실질적으로 상보하는데, 즉 상기 제 1 가닥과 표적 mRNA 사이에, 또는 제 1 가닥과 제 2 가닥 사이에 1개, 2개 또는 최대 5개의 미스매치를 가진다. "실질적으로 상보하는"이란 다른 서열에 대한 약 70% 이상 100% 미만의 상보성을 말한다. 예를 들어, 19개 염기쌍으로 구성된 듀플렉스 영역에서, 1개의 미스매치는 94.7% 상보성, 2개의 미스매치는 약 89.5% 상보성, 3개의 미스매치는 약 84.2% 상보성, 4개의 미스매치는 약 79% 상보성, 그리고 5개의 미스매치는 약 74% 상보성을 가져오며, 듀플렉스 영역을 실질적으로 상보적이게 만든다. 따라서, "실질적으로 동일한"이란 다른 서열에 대한 약 70% 이상의 동일성을 말한다.
제 1 가닥과 제 2 가닥은 루프 구조에 의해 연결될 수 있으며, 루프 구조는, 특히 폴리에틸렌글리콜 같은 비-핵산 중합체로 이루어질 수 있다. 또는 달리, 루프 구조는 변형된 및 미변형된 리보뉴클레오티드 및 변형된 및 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드를 포함해서, 핵산으로 이루어질 수도 있다.
또한, siRNA의 제 1 가닥의 5' 말단이 제 2 가닥의 3' 말단에 연결될 수 있거나, 또는 제 1 가닥의 3' 말단이 제 2 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있는데, 상기 연결은 전형적으로 2-100개 뉴클레오염기, 바람직하게 약 2개 내지 약 30개 뉴클레오염기를 가진 핵산 링커를 통해 이루어진다.
화합물의 안티센스 및 센스 가닥 중 적어도 하나에서 변형된 리보뉴클레오티드가 교대로 존재하는 본 발명의 화합물의 바람직한 구체예에서, 19-mer 및 23-mer 올리고머에 있어서, 안티센스 가닥의 5' 및 3' 말단의 리보뉴클레오티드는 당 잔기에서 변형되고, 센스 가닥의 5' 및 3' 말단의 리보뉴클레오티드는 당 잔기에서 변형되지 않는다. 21-mer 올리고머에 있어서, 센스 가닥의 5' 및 3' 말단의 리보뉴클레오티드는 당 잔기에서 변형되고, 안티센스 가닥의 5' 및 3' 말단의 리보뉴클레오티드는 당 잔기에서 변형되지 않거나, 또는 3' 말단에 선택적 추가 변형을 가질 수 있다. 상기 언급된 대로, 안티센스 가닥의 중앙 뉴클레오티드는 변형되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 한 바람직한 구체예에 따라서, 올리고뉴클레오티드/siRNA의 안티센스 및 센스 가닥은 3' 말단에서만 인산화되고 5' 말단에서는 인산화되지 않는다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라서, 안티센스 및 센스 가닥은 비-인산화된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따라서, 센스 가닥의 가장 끝의 5' 리보뉴클레오티는 생체내 5'-인산화의 어떤 가능성을 제거하기 위해 변형된다.
본원에 설명된 어떤 siRNA 서열은 본원에 개시된 변형/구조 중 어느 것을 가지도록 제조된다. 서열과 구조의 조합은 신규하며, 본원에 개시된 상태의 치료에 유용하게 사용된다.
제약 조성물
본 발명의 화합물은 생 화학물질로서 투여하는 것도 가능할 수 있지만, 제약 조성물로서 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물 중 하나 이상과 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이 조성물은 둘 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드/siRNA의 혼합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 개시된 하나 이상의 유전자를 억제하는데 효과적인 양으로 본 발명의 하나 이상의 화합물에 공유 또는 비공유 결합된 본 발명의 적어도 하나의 화합물; 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 상기 화합물은 본 발명의 하나 이상의 올리고리보뉴클레오티드를 생성하도록 내인성 세포 복합체에 의해 세포내 가공될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체와 표적 유전자의 세포에서 발현을 하향-조절하는데 효과적인 양으로 본 발명의 화합물 중 하나 이상을 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 상기 화합물은 (N)x의 서열에 실질적으로 상보하는 서열을 포함한다. 어떤 구체예에서, 표적 유전자는 바이러스, 박테리아 또는 포유류 유전자이다. 다양한 구체예에서, 표적 유전자는 포유류 유전자, 바람직하게는 사람 유전자이다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 화합물 중 하나 이상과 표적 유전자의 mRNA 전사체를 접촉시키는 단계를 포함하는, 대조군과 비교하여 적어도 50%까지 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 활성 siRNA 화합물은 대조군과 비교하여 적어도 50%, 60% 또는 70%의 수준으로 유전자 발현을 억제한다. 어떤 바람직한 구체예에서, 억제는 대조군과 비교하여 적어도 75%, 80% 또는 90%의 수준이다. 어떤 구체예에서, 표적 유전자는 본원에 개시된 전구-세포자멸 유전자이다.
한 구체예에서, 올리고리보뉴클레오티드가 본 발명의 전구-세포자멸 유전자 중 하나 이상을 억제하며, 이때 억제는 유전자 기능의 억제, 폴리펩티드의 억제 및 mRNA 발현의 억제를 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 화합물은 표적에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현을 억제하며, 이때 억제는 기능의 억제(이것은 특히 효소 분석 또는 네이티브 유전자/폴리펩티드의 기지 지시제를 사용한 결합 분석에 의해 시험될 수 있다), 단백질의 억제(이것은 특히 웨스턴 블롯팅, ELISA 또는 면역침전에 의해 시험될 수 있다) 및 mRNA 발현의 억제(이것은 특히 노던 블롯팅, 정량 RT-PCR, 원위치 혼성화 또는 마이크로어레이 혼성화에 의해 시험될 수 있다)를 포함하는 군으로부터 선택된다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량으로 본 발명의 화합물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 본 발명의 전구-세포자멸 유전자의 상승된 수준에 의해 동반되는 질환으로 고통받는 피험자를 치료하는 방법을 제공하며, 이로써 피험자가 치료된다.
더 구체적으로, 본 발명은 1개 가닥이 5'에서 3' 방향으로 표 B에 제시된 서열 또는 그것의 상동체를 갖는 연속 뉴클레오티드를 포함하는 올리고리보뉴클레오티드를 제공하며, 이때 리보뉴클레오티드 중 최대 2개는 상보하는 가닥에 있는 리보뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는다.
추가로, 본 발명에 따른 추가의 핵산은 상기 설명된 제 1 가닥과 제 2 가닥으로 이루어진 이중 가닥 구조의 어느 단부에 표 B(표 B1-B74)에 제시된 폴리뉴클레오티드 올리고머 중 어느 하나의 적어도 14개 연속 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 14개 연속 뉴클레오티드 염기쌍을 포함한다.
송달
본 발명의 siRNA 분자는 담체나 희석제와 함께 제조된 네이키드 분자의 직접 적용에 의해 표적 조직에 송달될 수 있다.
용어 "네이키드 siRNA"는 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포솜 제제, 리포펙틴 또는 침전제 등을 포함하여 세포로의 진입을 보조하거나, 촉진하거나 또는 용이하게 되도록 작용하는 어떤 송달 부형제로부터 자유로운 siRNA 분자를 말한다. 예를 들어, PBS 중의 siRNA는 "네이키드 siRNA이다".
그러나, 어떤 구체예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 리포솜 또는 리포펙틴 제제 등 중에서 송달되며, 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 제조된다. 이러한 방법은, 예를 들어 US 특허 Nos. 5,593,972, 5,589,466 및 5,580,859에 설명되며, 이들은 본원에 참고자료로 포함된다.
포유류 세포로의 증진되고 개선된 siRNA 송달을 구체적으로 목표로 하는 송달 시스템이 개발되었다(예를 들어, Shen et al., FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010; Reich et al., Mol. Vision 2003, 9:210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003. 327:761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32:107-108 및 Simeoni et al., NAR 2003, 31,11:2717-2724 참조). siRNA는 최근 영장류에서 유전자 발현의 억제를 위해 성공적으로 사용되었다(예를 들어, Tolentino et al., Retina 24(4):660 참조).
제약학적으로 허용되는 담체, 용매, 희석제, 부형제, 애쥬번트 및 비히클과 이식물 담체는 일반적으로 본 발명의 활성 성분과 반응하지 않는 비활성, 비-독성 고상 또는 액상 충전재, 희석제 또는 캡슐화 재료라고 하며, 이들은 리포솜 및 마이크로스피어를 포함한다. 본 발명에서 유용한 송달 시스템의 예는 US 특허 Nos. 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196; 및 4,475,196을 포함한다. 많은 다른 이러한 이식물, 송달 시스템, 및 모듈은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 한 특정 구체예에서, 국소 및 경피 제제가 선택될 수 있다. 본 발명의 siRNA 또는 제약 조성물은 의료 종사자에게 알려진 각 환자의 임상 상태, 치료될 질환, 투여 부위 및 방법, 투여 일정, 환자 나이, 성별, 체중 및 다른 요인들을 고려하여, 적절한 의료 기준에 따라서 용량화되어 투여된다.
따라서, 본 발명의 목적을 위하여 "치료적 유효량"은 본 분야에 공지된 이러한 고려사항에 의해 결정된다. 이 용량은, 제한되는 것은 아니지만, 개선된 생존율이나 훨씬 빠른 회복, 또는 증상 및 당업자에 의해 적절히 측정되어 선택되는 다른 표지들의 개선 또는 제거를 포함해서 개선을 달성하는데 효과적이어야 한다.
일반적으로, 사람에 대한 화합물의 활성 용량은 1-4주 이상의 기간 동안 1일 당 1회 투약 또는 1일 당 2회 또는 3회 이상의 투약의 섭생에서, 1일 당 1ng/kg 내지 약 20-100mg/kg 체중, 바람직하게는 1일 당 약 0.01mg 내지 약 2-10mg/kg 체중의 범위이다.
본 발명의 화합물은 종래의 투여 경로 중 임의의 것에 의해 투여된다. 화합물은 화합물 그 자체로서, 또는 제약학적으로 허용되는 염으로서 투여되고, 단독으로 또는 제약학적으로 허용되는 담체, 용매, 희석제, 부형제, 애쥬번트 및 비히클과 조합된 활성 성분으로서 투여된다는 것이 주지되어야 한다. 화합물은 경구, 국소, 피하 또는 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내 및 비강내를 포함하는 비경구, 흡입, 경고막 투여뿐만 아니라 기관내 및 주입 기술에 의해 투여된다.
또한, 화합물의 이식이 유용하다. 주사용의 액체 형태가 제조될 수 있으며, 용어 "주사"는 피하, 경피, 정맥내, 근육내, 기관내, 및 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 액체 조성물은 유기 공-용매를 사용해도 되고 사용하지 않아도 되는 수성 용액, 수성 또는 유성 현탁액, 식용 오일을 사용한 에멀젼, 및 유사한 제약 비히클을 포함한다. 특정 구체예에서, 투여는 정맥내 투여를 포함한다. 다른 구체예에서, 투여는 국부 또는 국소 투여를 포함한다. 이에 더하여, 어떤 구체예에서, 본 발명의 신규 치료에 사용하기 위한 조성물은, 예를 들어 비강내 투여를 위한 에어로졸로서 형성될 수 있다.
어떤 구체예에서, 경구 조성물(정제, 현탁액, 용액과 같은)은 입안염의 치료를 위한 구강세척제에 적합한 경구 조성물과 같이 구강으로의 국소 송달에 효과적일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 치료될 피험자는 온혈 동물, 특히 사람을 비롯한 포유류이다.
추가의 구체예에서, 변형은 포스페이트 부분의 변형이며, 이때 변형된 포스페이트 부분은 포스포로티오에이트 또는 포스페이트 기의 결여를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 분자는 이러한 분자 또는 다른 억제성 뉴클레오티드 분자를 암호화하는 다른 핵산 서열 또는 분자에 더하여, siRNA, 합성 siRNA, 합성 shRNA를 포함할 수 있다.
또 다른 단부 변형은 바이오틴 기이다. 이러한 바이오틴 기는 바람직하게는 제 1 가닥 및/또는 제 2 가닥 또는 양쪽 단부의 5' 맨 끝 또는 3' 맨 끝 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 더 바람직한 구체예에서, 바이오틴 기는 폴리펩티드 또는 단백질과 커플링된다. 또한, 폴리펩티드 또는 단백질이 다른 전술된 단부 변형 중 어느 것을 통해 부착된 것도 본 발명의 범위 내이다.
본원에 개시된 다양한 단부 변형은 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산의 뉴클레오티드의 리보오스 부분에 위치된다. 더 구체적으로, 단부 변형은, 제한되는 것은 아니지만, 2' OH, 3' OH 및 5' OH 위치를 포함해서 리보오스 부분의 OH 기들 중 어느 것에 부착되거나 치환할 수 있으며, 단 이와 같이 변형된 뉴클레오티드는 말단 뉴클레오티드여야 한다. 반전된 비염기성 또는 비염기성은 뉴클레오염기 부분을 갖지 않는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드이다. 이 종류의 화합물은, 특히 Sternberger M. et al., (2002) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 12, 131-43에 설명된다. siRNA는 국제 특허출원 WO 03/070918에 설명된다.
본 발명의 맥락에서, 본원에 개시된 siRNA 분자 중 어느 것, 또는 본원에 설명된 siRNA를 형성하도록 내인성 세포 복합체(DICER 같은 - 상기 참조)에 의해 가공된 어떤 긴 이중 가닥 RNA 분자, 또는 본원에 개시된 siRNA 분자를 포함하는 분자가 본 발명의 분자에 통합되어 추가의 신규 분자를 형성할 수 있으며, 이들이 본원에 설명된 질환 또는 장애의 치료에 사용된다는 것이 이해되어야 한다.
특히, 하나 이상의 줄기 및 루프 구조를 포함하는 긴 올리고뉴클레오티드(전형적으로 약 80-500개 뉴클레오티드 길이)가 고안되며, 이때 줄기 영역은 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 담체, 바람직하게는 제약학적으로 허용되는 담체 중에서 송달될 수 있고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드인 하나 이상의 작은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드(siRNA)를 생성하도록 내인성 세포 복합체(예를 들어, 상기 설명된 DROSHA 및 DICER)에 의해 세포내 가공될 수 있다. 이런 올리고뉴클레오티드는 직렬형 shRNA 구성물로 명명된다. 이런 긴 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 줄기 및 루프 구조를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드인 것이 고안되며, 이때 각 줄기 영역은 센스 및 상응하는 안티센스 siRNA 서열을 포함한다. 본원에 개시된 (적절한 핵산 변형을 가진) 억제성 서열을 포함하는 어떤 분자, 예를 들어 안티센스 DNA 분자가 특히 바람직하며, 본원에 개시된 모든 용도 및 방법에 있어서 이들의 상응하는 RNAs/siRNAs와 동일한 능력으로 사용될 수 있다.
이에 더하여, 치료 또는 실험 시약으로서 더 적합하게 되도록 뉴클레오티드의 구조가 근본적으로 변경된 폴리뉴클레오티드의 유사체가 제조될 수 있다. 뉴클레오티드 유사체의 예는 DNA(또는 RNA)의 데옥시리보오스(또는 리보오스) 포스페이트 백본이 펩티드에서 발견되는 것과 유사한 폴리아미드 백본을 포함하는 펩티드 핵산(PNA)이다. PNA 유사체는 효소에 의한 변성에 내성이며, 생체내 또는 시험관내에서 연장된 수명을 가진다고 알려져 있다. 또한, PNA는 DNA 분자보다 상보하는 DNA 서열에 더 강하게 결합한다고 알려져 있다. 이런 관찰은 PNA 가닥과 DNA 가닥 간의 전하 반발의 결여 때문으로 생각된다. 올리고뉴클레오티드를 합성하는데 유용한 다른 변형된 모노머는 중합체 백본, 환상 백본, 또는 비환상 백본을 갖는 부분들을 포함한다.
치료 방법
또 다른 양태로서, 본 발명은 표적 유전자, 표 A의 전구-세포자멸 유전자의 비정상 발현과 관련된 질환 또는 장애의 치료가 필요한 피험자의 치료 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 이들 유전자의 발현을 감소 또는 억제하는 억제제의 양을 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 치료될 피험자는 온혈 동물, 특히 사람을 비롯한 포유류이다.
본 발명의 방법은 표 A의 전구-세포자멸 유전자의 발현을 하향-조절하는 하나 이상의 억제성 화합물, 특히 siRNA를 치험자가 치료될 수 있는 치료적 유효량으로 피험자에게 투여하는 것을 포함한다.
용어 "치료"는 치유적 치료 및 예방 또는 방지 대책을 모두 말하며, 이때 목적은 본원에 나열된 장애를 예방하거나 저지시키는(줄이는) 것이다. 치료가 필요한 피험자는 질환이나 상태를 이미 경험하고 있는 피험자, 질환이나 상태를 나타낼 경향이 있는 피험자 및 질환이나 상태가 방지되어야 할 피험자를 포함한다. 본 발명의 화합물은 질환이나 상태 또는 그와 관련된 증상의 개시 전에, 동안에 또는 이후에 투여된다. 치료가 예방 목적인 경우, 본 발명은 질환 또는 장애의 발생의 개시를 지연시키거나 이러한 발생을 피하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 전구-세포자멸 유전자의 억제가 유리한 하기의 질환 또는 상태의 치료에서 본 발명의 전구-세포자멸 유전자의 발현을 하향-조절하는 화합물, 특히 신규한 작은 간섭 RNAs(siRNAs)의 사용에 관한 것이다: 청력 손실, 급성 신부전증 (ARF), 녹내장, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 다른 급성 폐 및 호흡기 손상, 폐이식, DGF를 포함하는 폐, 간, 심장, 골수, 췌장, 각막 및 신장 이식을 비롯한 장기이식 후의 허혈-재관류 손상; 척수 손상, 압력상처, 노인성 황반변성(AMD), 안구건조증, ION 및 AION을 포함하는 허혈성 안구 이상; 입안염 및 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD). 다른 표지는 화학물질-유도된 신장독성 및 화학물질-유도된 신경독성, 예를 들어 시스플라틴 및 시스플라틴-유사 화합물, 아미노글리코시드, 루프 이뇨제, 및 히드로퀴논 및 그 유도체들에 의해 유도된 독성을 포함한다.
본 발명의 전구-세포자멸 유전자를 억제하는 방법, 분자 및 조성물은 본원에 충분히 논의되며, 상기 분자 및/또는 조성물 중 어느 것이 상기 상태 중 어느 것으로 고통받는 피험자의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 제약 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은
본 발명의 하나 이상의 화합물을 제공하는 단계; 및
상기 화합물을 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 화합물과 제약학적으로 허용되는 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 제약 조성물의 제조에 사용되는 화합물은 제약학적 유효량으로 담체와 혼합된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 스테로이드 또는 지질 또는 다른 적합한 분자, 예를 들어 콜레스테롤에 콘쥬게이트된다.
변형된 화합물의 합성
본 발명의 화합물은 본 분야에 잘 공지된 리보핵산(또는 데옥시리보핵산) 올리고뉴클레오티드의 합성을 위한 방법 중 어느 것에 의해 합성될 수 있다. 이러한 합성은, 특히 Beaucage and Iyer, Tetrahedron 1992; 48:2223-2311; Beaucage and Iyer, Tetrahedron 1993; 49:6123-6194 및 Caruthers et al., Methods Enzymol. 1987; 154:287-313에 설명된다. 티오에이트의 합성은, 특히 Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 1985; 54:367-402에 설명되고, RNA 분자의 합성은 Sproat, Humana Press 2005, Herdewijn P. 편저; Kap.2:17-31에 설명되며, 각 하류 과정은, 특히 Pingoud et al., IRL Press 1989, Oliver R.W.A. 편저; Kap.7:183-208에 설명된다.
다른 합성 과정들도 본 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 Usman et al., J. Am. Chem. Soc, 1987, 109:7845; Scaringe et al., NAR, 1990, 18:5433; Wincott et al., NAR 1995,. 23:2677-2684; 및 Wincott et al., Methods Mol. Bio., 1997, 74:59에 설명된 과정 등이 있으며, 이들 과정은 5' 단부의 디메톡시트리틸, 및 3' 단부의 포스포라미다이트와 같이, 공통 핵산 보호 및 커플링 기를 사용할 수 있다. 바람직한 경우, 변형된(예를 들어, 2-O-메틸화) 뉴클레오티드와 미변형된 뉴클레오티드가 통합된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 개별적으로 합성된 다음, 합성 후에, 예를 들어 라이게이션(Moore et al., Science 1992, 256:9923; 국제 특허공개 No. WO 93/23569; Shabarova et al., NAR 1991, 19:4247; Bellon et al., Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16:951; Bellon et al., Bioconjugate Chem 1997, 8:204), 또는 합성 및/또는 탈보호 후 혼성화에 의해 함께 이어질 수 있다.
상업적으로 입수가능한 기계(특히, Applied Biosystems에서 입수가능)가 사용될 수 있음이 주지된다. 본원에 개시된 서열에 따라서 올리고뉴클레오티드가 제조된다. 화학적으로 합성된 단편들의 오버랩 쌍들이 본 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 라이게이션될 수 있다(예를 들어, US 특허 No. 6,121,426 참조). 개별적으로 가닥들이 합성된 다음, 시험관에서 서로 아닐링된다. 다음에, HPLC에 의해서 이중 가닥 siRNA가 아닐링되지 않은(예를 들어, 이들 중 하나가 과량이어서) 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로부터 분리된다. 본 발명의 siRNA 또는 siRNA 단편과 관련하여, 둘 이상의 이러한 서열이 합성되고, 본 발명에서 사용하기 위해 함께 연결될 수 있다.
본 발명의 화합물은, 예를 들어 US 특허공개 No. 2004/0019001(McSwiggen)에 설명된 대로, 직렬 합성법을 통해 또한 합성될 수 있으며, 이때 절단가능한 링커에 의해 분리된 단일 연속 올리고뉴클레오티드 단편 또는 가닥으로서 양쪽 siRNA 가닥이 합성되고, 이것이 이어서 절단되어 분리된 siRNA 단편 또는 가닥들을 제공하고, 이것들이 siRNA 듀플렉스로 혼성화되고 정제된다. 링커는 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비뉴클레오티드 링커로부터 선택된다.
추가로, 본 발명은 본원에서 언급된 질환 및 상태 중 어느 것의 치료를 위한 둘 이상의 siRNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 제공하며, 이때 상기 2개의 분자는 동등한 또는 다른 유리한 활성을 생성하는 양으로 제약 조성물 중에서 물리적으로 함께 혼합될 수 있거나, 또는 공유 또는 비공유 결합될 수 있거나, 또는 2-100, 바람직하게는 2-50 또는 2-30개 뉴클레오티드 범위의 길이의 핵산 링커에 의해 함께 이어질 수 있다. 한 구체예에서, siRNA 분자는 본원에 설명된 이중 가닥 핵산 구조로 이루어지며, 이때 두 siRNA 서열은 표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)로부터 선택된다.
따라서, siRNA 분자들은 공유 또는 비공유 결합되거나 또는 링커에 의해 이어져 직렬형 siRNA 화합물을 형성할 수 있다. 두 siRNA 서열을 포함하는 이러한 직렬형 siRNA 화합물은 전형적으로 약 38-150개 뉴클레오티드 길이, 더 바람직하게 38개 또는 40-60개 뉴클레오티드 길이이며, 2개 이상의 siRNA 서열이 직렬형 분자에 포함되는 경우에는 그에 따라서 더 길다. 둘 이상의 shRNA를 암호화하는 직렬형 분자와 마찬가지로, 세포내 과정을 통해 생산된 siRNA, 예를 들어 dsRNA를 암호화하는 둘 이상의 긴 서열로 이루어진 더 긴 직렬형 화합물이 또한 고안된다. 또, 합성 변형된 직렬형 분자도 본 발명의 일부인 것으로 간주된다. 본 발명의 둘 이상의 siRNA 서열을 포함하는 직렬형 화합물이 고안된다.
본 발명의 전구-세포자멸 유전자를 표적으로 하는 siRNA 분자는 제약 조성물 중의 주요 활성 성분일 수 있거나, 또는 둘 이상의 siRNA(또는 둘 이상의 siRNA를 암호화하거나 내인성으로 생성하는 분자, 이것은 분자들의 혼합물 또는 둘 이상의 siRNA를 암호화하는 하나 이상의 직렬형 분자이다)를 함유하는 제약 조성물의 1개의 활성 성분일 수 있으며, 상기 제약 조성물은 또한 하나 이상의 추가 유전자를 표적으로 하는 하나 이상의 추가 siRNA 분자로 이루어진다. 상기 추가 유전자(들)의 동시 억제는 본원에 개시된 질환의 치료에 대해 추가적 또는 상승작용적 효과를 가질 것 같다.
추가로, 본원에 개시된 전구-세포자멸 siRNA 또는 이러한 siRNA를 포함하거나 암호화하는 어떤 핵산 분자가 표적 세포 상에 발현된 세포 표면 내재화 분자에 대한 항체(앱타머 분자를 포함하는)에 선택적으로 연결되거나 결합될(공유 또는 비공유) 수 있으며, 이로써 본원에 개시된 질환의 치료에 대한 증진된 표적화가 달성될 수 있다. 예를 들어, 항-Fas 항체(바람직하게는 중화 항체)가 어떤 전구-세포자멸 siRNA와 조합된다(공유 또는 비공유).
본 발명의 화합물은, 예를 들어 이중 가닥 화합물로서, 이중 가닥 헤어핀 화합물로서, 또는 직렬형 화합물로서 송달된다. 또, 하나 이상의 줄기 및 루프 구조를 포함하는 긴 올리고뉴클레오티드(전형적으로 25-500개 뉴클레오티드 길이)가 고안되며, 이때 줄기 영역은 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 담체, 바람직하게는 제약학적으로 허용되는 담체 중에 송달될 수 있으며, 본 발명의 올리고뉴클레오티드인 하나 이상의 작은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드(siRNA)를 생성하도록 내인성 세포 복합체에 의해(예를 들어, 상기 설명된 DROSHA 및 DICER)에 의해 세포내 가공된다. 이런 올리고뉴클레오티드는 직렬형 shRNA 구성물로 명명된다. 이 긴 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 줄기 및 루프 구조를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드인 것이 고안되며, 이때 각 줄기 영역은 본 발명의 전구-세포자멸 유전자의 센스 및 상응하는 안티센스 siRNA 서열을 포함한다. 특히, 이 올리고뉴클레오티드가 SEQ ID NOS: 97-87,178에 제시된 표 B-D(B1-B74; C1-C4; D1-D34)에 나타낸 센스 및 안티센스 siRNA 서열을 포함하는 것이 고안된다.
RNA 간섭
RNAi 현상에 관한 많은 PCT 출원이 최근 공개되었다. 이것들은 PCT 공개 WO 00/44895; PCT 공개 WO 00/49035; PCT 공개 WO 00/63364; PCT 공개 WO 01/36641; PCT 공개 WO 01/36646; PCT 공개 WO 99/32619; PCT 공개 WO 00/44914; PCT 공개 WO 01/29058; 및 PCT 공개 WO 01/75164를 포함한다.
RNA 간섭(RNAi)은 세포질 단백질 복합체로 진입하는 dsRNA 종들의 능력에 기초하며, 그리고 나서 그것이 상보하는 세포 RNA에 표적화되고, 구체적으로는 그것을 분해한다. RNA 간섭 반응은, 통상 RNA-유도 스플라이싱 복합체(RISC)라고 하는 siRNA를 함유하는 엔도뉴클레아제 복합체를 특징으로 하며, 이것이 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보하는 서열을 가진 단일 가닥 RNA의 절단을 매개한다. 표적 RNA의 절단은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보하는 영역의 중앙에서 발생할 수 있다((Elbashir et al., Genes Dev., 2001, 15(2):188-200). 더욱 상세히 말하면, 긴 dsRNA가 타입 III RNAses(DICER, DROSHA 등; Bernstein et al, Nature, 2001, 409(6818):363-6; Lee et al., Nature, 2003, 425(6956):415-9)에 의해 짧은(17-29bp) dsRNA 단편(짧은 억제성 RNA, "siRNA"라고도 한다)으로 효소분해된다. RISC 단백질 복합체가 이들 단편과 상응하는 mRNA를 인식한다. 전체 과정은 표적 mRNA의 엔도뉴클레아제 절단에 의해 종결된다(McManus & Sharp, Nature Rev Genet, 2002, 3(10):737-47; Paddison & Harmon, Curr Opin Mol Ther. 2003 5(3):217-24). (이들 용어 및 제안된 기전에 대한 추가 정보는, 예를 들어 Bernstein et al., RNA 2001 7(11):1509-21; Nishikura, Cell 2001 107(4):415-8 및 PCT 공개 WO 01/36646를 참조한다).
몇몇 그룹이 세포에서 siRNA를 생성할 수 있는 DNA-기반 벡터의 발생을 설명했다. 이 방법은 일반적으로 세포 내에서 siRNA를 형성하도록 효과적으로 가공되는 짧은 헤어핀 RNA의 전사를 포함한다(Paddison et al., PNAS USA 2002, 99:1443-1448; Paddison et al, Genes & Dev 2002, 16:948-958; Sui et al, PNAS USA 2002, 8:5515-5520; 및 Brummelkamp et al, Science 2002, 296:550-553). 이들 보고서는 수많은 내인성 및 외인성 발현된 유전자들을 특이적으로 표적화할 수 있는 siRNA를 생성하는 방법을 설명한다.
본 발명은 예시의 방식으로 설명되었지만, 사용된 용어는 제한보다는 설명하려는 의도로 사용되었음이 이해되어야 한다.
분명히 본 발명의 많은 변형 및 변화가 상기 교시에 비추어 가능하다. 따라서, 첨부된 청구항의 범위 내에서 본 발명의 구체적으로 설명된 것과는 다른 방식으로도 실시될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명은 실시예를 참조하여 하기 상세히 예시되지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
본원에 인용된 모든 문헌은 이러한 문헌이 선행기술에 속한다는 승인으로서 의도되거나, 또는 본 출원의 어떤 청구항의 특허성에 중요한 것으로서 고려되지 않는다. 모든 문헌의 내용 및 날짜에 관한 모든 진술은 제출시 출원인이 입수할 수 있었던 정보에 기초하며, 이러한 진술의 정확성에 관한 승인을 구성하지 않는다.
실시예
더 이상의 설명 없이도 당업자라면 앞선 설명을 이용하여 본 발명을 가장 완전한 정도로 이용할 수 있을 것이라고 믿는다. 따라서, 다음의 바람직한 특정 구체예들은 단순한 예시로서 구성되며, 어떤 식으로든 청구된 발명을 제한하지 않는다.
본원에 구체적으로 설명되지 않은 본 분야에 공지된 표준 분자생물학 프로토콜은 통상 본질적으로 Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York(1989, 1992), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1988), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988), Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)의 것들, 및 US 특허 Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 제시된 방법에 따르며, 이들은 본원에 참고자료로 포함된다. 중합효소 연쇄반응(PCR)은 통상 PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 따라 수행되었다. 원위치(세포내) PCR은 유세포분석과 조합하여 특이적 DNA 및 mRNA 서열을 함유하는 세포의 검출에 유용하다(Testoni et al., Blood 1996, 87:3822). RT-PCR을 수행하는 방법도 본 분야에 공지되어 있다.
세포 배양
HeLa 세포(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)는 Czauderna et al.(NAR, 2003, 31: 670-82)에 설명된 대로 배양하였다. 사람 각질세포는 10% FCS를 함유하는 듈베코스 변형 이글 배지(DMEM)에서 37℃에서 배양하였다. 마우스 셀라인 B16V(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)은 10% FCS를 함유하는 듈베코스 변형 이글 배지(DMEM)에서 37℃에서 배양하였다. 배양 조건은 Methods Find Exp Clin Pharmacol. 1997 May; 19 (4):231-9에 설명된 대로 따랐다.
각 경우, 세포에 대해 웰당 약 50,000 세포의 밀도에서 본원에 설명된 대로 실험을 수행하였고, 본 발명에 따른 이중 가닥 핵산은 20nM로 첨가하였으며, 이때 이중 가닥 핵산은 하기 설명된 대로 전용 지질 1μg/ml를 사용하여 복합체를 만들었다.
저산소증-유사 상태의 유도
세포를 다음과 같이 CoCl2를 사용해서 처리하여 저산소증-유사 상태를 유도하였다: siRNA 트랜스펙션을 Czauderna et al., 2003; Kretschmer et al., 2003에 의해 설명된 대로 10cm 플레이트(30-50% 컨플루언시)에서 수행하였다. 간단히 말해서, 완전 배지에 담긴 세포에 혈정 무함유 배지에 담긴 미리 형성된 10% 농축 GB 복합체와 지질을 첨가하여 siRNA를 트랜스펙션하였다. 총 트랜스펙션 부피는 10ml였다. 최종 지질 농도는 1.0μg/ml였다. 다른 말이 없으면 마지막 siRNA 농도는 20nM이었다. 세포용해 24시간 전에 조직 배양 배지에 CoCl2(100μM)를 직접 첨가하여 저산소증 반응을 유도하였다.
세포 추출물의 제조 및 면역 블롯팅
세포 추출물 제조와 면역 블롯 분석은 본질적으로 Klippel et al. Mol Cell Biol, 1998, 18:5699-711; Klippel A. et al., Mol Cell Biol 1996, 16:4117-27)에 설명된 대로 수행하였다.
실시예 1: siRNA 화합물의 시험관내 검사
약 1.5x105 시험대상 세포(사람 유전자를 표적화하는 siRNA용 HeLa 세포 및/또는 293T 세포 및 래트/마우스 유전자를 표적화하는 siRNA용 NRK52 세포 및/또는 NMUMG 세포)를 6-웰 플레이트의 각 웰에 파종하였다(70-80% 컨플루언트).
24시간 후, 세포를 Lipofectamine™ 2000 시약(Invitrogen)을 5nM 또는 20nM의 최종 농도로 사용하여 siRNA 화합물로 트랜스펙션하였다. 세포를 72시간 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다.
트랜스펙션에 대한 양성 대조군으로서 PTEN-Cy3 표지된 siRNA 화합물을 사용하였다. 사용된 추가의 양성 대조군은 블런트 단부 19-mer siRNA, 즉 x=y=19이고, Z와 Z'가 모두 부재하는 것이었다. 이 siRNA는 비인산화되었으며, 안티센스와 센스 가닥 모두에서 당 잔기의 2' 위치에 변형된 리보뉴클레오티드가 교대로 존재하고 있으며, 이때 2' 위치에 있는 부분은 메톡시(2'-O-메틸)이고, 안티센스 가닥의 5' 및 3' 말단의 리보뉴클레오티드는 당 잔기에서 변형되고, 센스 가닥의 5' 및 3' 말단의 리보뉴클레오티드는 당 단기에서 변형되지 않는다.
siRNA 활성에 대한 음성 대조군으로서 GFP siRNA 화합물을 사용하였다.
트랜스펙션 72시간 후 세포를 수거하고, 세포로부터 RNA를 추출하였다. 트랜스펙션 효능을 형광현미경으로 검사하였다.
특정의 바람직한 siRNA 구조를 사용한 유전자 발현의 억제 퍼센트는 내인성 유전자를 발현하는 세포에서 표적 유전자의 qPCR 분석에 의해 측정하였다.
일반적으로, 시험관내 시험에서 선택된 특정 서열을 가진 siRNA는 사람과 래트 또는 토끼 유전자와 같은 하등 종들에 대해 특이적이었다. 이러한 RNA 서열 및 본원에 설명된 대로 변형된 서열을 가진 siRNA를 사용하여 얻어진 결과는 유사하다. 다른 siRNA 올리고머에 의해서도 특정 유전자의 발현이 감소하는 유사한 결과가 얻어지며, 이 siRNA의 서열은 표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)에 나열된다. 표 B의 siRNA 올리고머는 SEQ ID NOS: 97-68,654에 제시된다(US Ser. No. 11/978,089 및 PCT 특허출원 No. PCT/IL2007/001278에 제시되며, 이들은 전문이 참고자료로 본원에 포함된다).
하기 표 C1, C2, C3 및 C4에 바람직한 siRNA 서열이 개시되며, 이들 siRNA는 모두 상기 분석에서 활성인 것으로 나타났다(표 C1, C3 및 C4 - 19mer siRNA 분자; 표 C2 - 23mer siRNA 분자). 일반적으로, 시험관내 시험에서 선택된 특정 서열을 가진 siRNA는 사람 및 래트/토끼 유전자에 모두 특이적이었다. 이들 RNA 서열 및 본원에 설명된 대로 변형된 서열을 가진 siRNA를 사용하여 얻어진 결과는 유사하다. 다른 siRNA에 의해서도 특이적 유전자의 발현이 감소하는 유사한 결과가 얻어지며, 이들의 서열은 표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(Dl-D34)에 제시된다.
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표 C1-C4에 따른 안티센서 서열 및 센스 서열을 포함하는 화합물 및 구조적 변형들의 활성 및/또는 안정성의 일부 예를 도 23에 나타낸다.
실시예 2: 급성 신부전증( ARF )의 모델 시스템
ARF는 수일 내에 발생하는 신장기능의 급격한 악화를 특징으로 하는 임상 증후군이다. 이론과 결부되지는 않지만, 급성 신장 손상은 주요 심장수술과 같은 큰 수술을 받은 환자에서의 신장 허혈-재관류 손상과 같은, 신장 허혈-재관류 손상의 결과일 수 있다. ARF의 주요 특징은 사구체여과율(GFR)의 급격한 감소이며, 그 결과 질소성 폐기물(요소, 크레아티닌)이 체류하게 된다. 최근 연구는 신장 조직에서 세포자멸이 대부분의 사람 ARF의 경우에서 지배적이라는 것을 뒷받침한다. 세포자멸성 세포사의 주요 부위는 원위 네프론이다. 허혈성 손상의 초기 단계 동안, 액틴 세포골격이 완전성을 잃음으로써 상피의 평탄화, 솔 가장자리의 상실, 초점세포 접촉부의 상실, 및 이어서 기저 하층으로부터 세포의 유리가 초래된다.
활성 siRNA 화합물의 시험을 허혈-재관류-유도 ARF의 동물 모델을 이용하여 수행하였다.
허혈- 재관류 -유도 ARF 에 대한 보호
양측 신장 동맥을 클램프로 집은 다음, 45분 후에 클램프를 열어 재관류시켜 래트에서 허혈-재관류 손상을 유도하였다. 재관류 7일 후에 래트를 죽였다. 클램프로 집은 후 4시간 뒤에 경정맥에 12mg/kg의 Casp2_4 siRNA 화합물(Casp2_4: 센스 서열: GCCAGAAUGUGGAACUCCU, SEQ ID NO:139; 안티센스 서열: AGGAGUUCCACAUUCUGGC, SEQ ID NO:140)을 주사했다. 수술 전(제0일)과 수술 후 제1일, 제3일, 제5일, 및 제7일에 혈청 크레아티닌 수준을 측정하여 ARF 진행을 모니터하였다. 실험 종료시에 유치 대퇴선을 통해 따뜻한 PBS와 4% 파라포름알데히드를 차례로 래트에 관류시켰다. 좌측 신장을 수술로 제거하고, 다음의 조직학적 분석을 위해 4% 파라포름알데히드에 보관하였다. 급성 신부전증은 주로 베이스라인으로부터 혈청 크레아티닌 수준의 급성 증가로서 정의된다. 혈청 크레아티닌의 적어도 0.5mg/dL 또는 44.2μmol /L의 증가가 급성 신부전증의 표지로서 간주된다. 혈청 크레아티닌은 수술 전 0시간과 ARF 수술 후 제1일, 제3일, 제5일 및 제7일에 측정하였다.
이 실험에 사용된 ARF의 치료 및 예방을 위한 특히 바람직한 화합물은 구조 (IV)의 구체예에 따른 CASP2_4 siRNA 화합물이며, 여기서 (N')y(센스 가닥)이 위치 18(하기 표제 "그룹 2"에 나타낸 결과)에 L-DNA를 포함하거나, 또는 (N')y(센스 가닥)이 위치 17과 18(하기 표제 "그룹 3"에 나타낸 결과)에 L-DNA를 포함하고, (N)x (안티센스 가닥)이 교대하는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 리보뉴클레오티드는 2' OMe 변형을 포함한다. 위약을 사용한 결과는 하기 표제 "그룹 1"에 나타낸다. siRNA 화합물은 (N')y의 위치 15에 DNA 뉴클레오티드 및/또는 위치 2에 L-DNA 뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 하기 결과로부터 드러났듯이, 클램프로 집은 후 4시간 뒤에 투여된 Casp2_4 siRNA 화합물은 허혈-재관류 손상 후 제1일과 제3일의 크레이티닌 수준 상승을 감소시켰다. 클램프로 집기 전에 siRNA 화합물의 투여도 역시 허혈-재관류에 대해 보호작용을 하는 것으로 판명된다.
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표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)로부터의 siRNA 화합물, 특히 표 A의 특정 전구-세포자멸 유전자, 특히 유전자 TP53BP2, LRDD, CYBA, ATF3, CASP2, HRK, CIQBP, BNIP3, MAPK8, MAPK14, RAC1, GSK3B, P2RX7, TRPM2, PARG, CD38, STEAP4, BMP2, CX43, TYROBP, CTGF 및 SPP1에 대해 작동되는 siRNA들이 상기 모델 시스템에서 시험되었고, 허혈성 재관류에 대해서 보호작용을 하는 것으로 판명되었다.
실시예 3: 압력상처 또는 압력궤양의 모델 시스템
당뇨병성 궤양을 비롯한 압력상처 또는 압력궤양은 지속적인 압력(일반적으로 침상이나 휠체어로부터)이 취약한 신체 부분, 특히 엉덩이, 둔부 및 뒤꿈치 피부로의 순환을 차단할 때 발생하는 손상된 피부 및 조직 영역이다. 충분한 혈류의 부족이 허혈성 괴사와 침범된 조직의 궤양을 초래한다. 압력상처는 감각이 손상되거나 감각이 없는 환자, 또는 쇠약해지거나, 수척해지거나, 마비되거나 오랜 침상생활을 하고 있는 환자들에서 주로 발생한다. 천골, 좌골, 대퇴골, 바깥쪽 복사뼈 및 뒤꿈치 위의 조직이 특히 민감하다. 환자의 상황에 따라 다른 부위들도 관련될 수 있다.
압력상처, 궤양 및 유사한 상처의 치료에 대한 본 발명의 활성 억제제(siRNA 화합물 같은)의 시험을 마우스 모델에서 Reid et al., J. Surg. Res. 116:172-180, 2004에 설명된 대로 수행한다.
추가 토끼 모델이 Mustoe et al, JCI 1991, 87(2):694-703; Ahn and Mustoe, Ann Pl Surg 1991, 24(1):17-23에 설명되며, 본 발명의 siRNA 화합물을 시험하는데 사용된다. 표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(Dl-D34)에 따른 siRNA, 특히 유전자 CIQBP, RAC1, GSK3B, P2RX7, TRPM2, PARG, CD38, STEAP4, BMP2, CX43, 또는 TYROBP에 대해 작동되는 화합물들이 동물 모델에서 시험되었고, 이들 siRNA 화합물은 압력상처 및 궤양을 치료 및 예방하는 것으로 나타났다.
실시예 4: 만성 폐쇄성 폐질환( COPD )의 모델 시스템
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 종말 세기관지 끝의 말초 공기 공간의 영구적인 파괴인 폐기종을 주된 특징으로 한다. 또한, 기종은 세기관지와 폐포 구조에 대식세포 및 호중구와 같은 염증성 세포의 축적을 특징으로 한다. 폐기종 및 만성 기관지염은 COPD의 일환으로서 발생하거나 독자적으로 발생할 수 있다.
COPD/폐기종/만성 기관지염의 치료에 대한 본 발명의 활성 억제제(siRNA 같은)의 시험을 동물 모델에서 다음 문헌에 개시된 것들과 같이 수행한다:
Starcher and Williams, 1989, Lab. Animals, 23:234-240; Peng et al., 2004; Am J Respir Crit Care Med, 169:1245-1251; Jeyaseelan et al., 2004. Infect. Immunol, 72:7247-56.
추가 모델이 본 출원인의 양수인에게 양도된 PCT 특허공개 WO 2006/023544에 설명되며, 이것은 본 출원에 참고자료로 포함된다.
표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)의 siRNA, 특히 유전자 CIQBP, BNIP3, GSK3B, P2RX7, TRPM2, PARG, CD38, STEAP4, BMP2, CX43, TYROBP5 CTGF, 및 DUOX1에 대한 siRNA가 이들 동물 모델에서 시험되었고, 이들 siRNA 화합물은 폐기종, 만성 기관지염 및 COPD를 치료 및/또는 예방할 수 있다고 나타났다.
실시예 5: 척수 손상의 모델 시스템
척수 손상 또는 척수병증은 감각 및/또는 운동성의 상실을 가져오는 척수의 장애이다. 두 가지 일반적인 유형의 척수 손상은 외상 및 질환으로 인한 것이다. 외상성 손상은 특히 차량 사고, 추락, 총상, 다이빙 사고로 인한 것일 수 있고, 척수에 영향을 미칠 수 있는 질환은 소아마비, 척추분리증, 종양 및 프리드라이히 운동실조를 포함한다.
손상된 척수에 주사 후 뉴런에서 siRNA 분자의 흡수:
상이한 타입의 세포에서 Cy3 표지된 siRNA(손상된 척수에 주사)의 흡수를 척수에 타박상을 가한 래트와 손상 없는 래트에서 시험한다. 시상부 냉동절편을 만들고, 4가지 상이한 그룹의 항체를 사용하여 면역염색하여 뉴런, 성상교세포, 핍지교세포 및/또는 대식세포/미세아교세포에서 흡수가 발생했는지의 여부를 결정한다. 뉴런에 대한 마커는 NeuN, 또는 GAP43을 포함하고, 성상교세포 및 잠재적 신경 줄기세포에 대한 마커는 GFAP, 네스틴 또는 비멘틴을 포함하고, 핍지교세포에 대한 마커는 NG2 또는 APC를 포함하고, 대식세포/미세아교세포에 대한 마커는 ED1 또는 Iba-1을 포함한다(Hasegawa et al., 2005. Exp Neurol 193:394-410).
래트에 2가지 상이한 용량의 Cy3 표지된 siRNA(1μg/μl, 10μg/μl)를 주사하고, 1일 및 3일 동안 방치한 후 죽인다. 조직학적 분석은 많은 긴 사상형 윤곽뿐만 아니라 다른 돌기 및 세포 소체들이 표지된 siRNA를 흡수한다는 것을 나타낸다. MAP2에 대한 항체를 사용한 면역염색은 운동뉴런을 포함한 뉴런의 수지상 돌기 및 세포 소체에서 표지의 흡수를 확인한다. 성상세포 또는 대식세포에 특이적인 다른 항체를 사용한 염색은 뉴런에 비하여 Cy3 표지된 siRNA의 적은 흡수를 나타낸다. 이들 결과는 손상된 척수에 주사된 siRNA 분자가 운동뉴런을 포함한 뉴런의 세포 소체 및 수지상 돌기까지 도달한다는 것을 시사한다.
표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)에 따른 siRNA 화합물, 특히 유전자 LRDD, CYBA, ATF3, CASP2, HRK, CIQBP, BNIP3, MAPK8, MAPK14, RAC1, GSK3B, P2RX7, TRPM2, PARG, CD38, STEAP4, BMP2, CX43, TYROBP, CTGF, 및 RHOA에 대해 작동되는 siRNA가 이 동물 모델에서 시험되었고, 이들 siRNA 화합물은 척수 손상 후 기능 회복을 촉진하는 것으로 나타났으며, 따라서 척수 손상을 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예 6: 녹내장의 모델 시스템
녹내장의 치료 또는 예방에 대한 본 발명의 활성 억제제(siRNA 같은)의 시험을 동물 모델에서, 예를 들어 Pease et al., J. Glaucoma, 2006, 15(6):512-9에 의해 설명된 대로 수행한다(실험 녹내장을 가진 래트와 정상 래트에서 마노미터 보정 및 TonoLab 및 TonoPen 토노미터의 비교).
표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)의 siRNA, 특히 유전자 TP53BP2, LRDD, CYBA, ATF3, CASP2, HRK, BNIP3, MAPK8, MAPK14, RAC1 및 RHOA에 대한 siRNA가 이 동물 모델에서 시험되었고, 이들 siRNA 화합물은 녹내장을 치료 및/또는 예방하는 것으로 나타났다.
실시예 6A: 허혈성 시신경병증(ION)의 모델 시스템
시신경 압박 손상의 프로토콜을 이용하여 성체 Wistar 래트에서 허혈성 시신경병증의 동물 모델을 확립하였다. 시신경 압박 7일 전에 망막 신경절 세포(RGC)를 상구에 역행 트레이서 FluoroGold(2%, Fluorochrome, Englewood, CO)를 적용하여 선택적으로 표지하였다. 트레이서를 RGC 축삭을 따라 역행 수송하였고, 그 결과 형광 트레이서의 주입 후 1주일 이내에 모든 RGC가 완전히 특이적으로 표지되었다. 역행 추적 7일 후에 동물에 시신경 압박 손상을 가했다. 안와 시신경을 안와위 접근을 통해 노출하고, 시신경에 있는 모든 축삭을 사상판에서 2mm 떨어진 곳을 10초 동안 겸자로 압박하여 가로로 쪼개었다. Casp2_4 siRNA 화합물의 PBS의 20μg/5μl의 단일 용량을 시신경 분쇄 시점에서 유리 마이크로피펫을 사용하여 신경 머리 2mm 앞 유리체에 미소주사하였다(Casp2_4: 센스 서열: GCCAGAAUGUGGAACUCCU, SEQ ID NO:139; 안티센스 서열: AGGAGUUCCACAUUCUGGC, SEQ ID NO:140; 센스 가닥은 위치 17과 18에 L-DNA를 포함하고, 안티센스 가닥은 교대하는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 변형된 리보뉴클레오티드는 2' OMe 변형을 포함한다). 시신경 분쇄 후 7일 뒤에 편평하게 장착한 망막 상의 FluoroGold-표지된 RGC를 계수하여 RGC의 생존을 측정하였다. 시신경 분쇄 1주일 후에 4% 파라포름알데히드를 심장을 경유하여 실험 동물에 관류시켰다. 양쪽 망막을 절개하여 30분간 더 고정시키고, 유리 슬라이드 위에 편평하게 장착하여 신경절 세포층을 정량하였다. 각 망막에서 16곳의 상이한 영역에서 형광 RGC의 수를 계수하였고, 시신경 분쇄 손상을 전혀 당하지 않은 래트에서 얻은 샘플 또는 시신경 분쇄 손상과 함께 PBS, 대조군 siRNA 또는 GFP siRNA를 주입한 래트에서 얻은 샘플과 비교하여 RGC의 생존 퍼센트를 측정하였다. 염색한 RGC의 포식작용 후 FluoroGold를 통합할 수 있었던 미세아교세포는 이들의 특징적인 형태에 의해 구별되었고, 정량 분석에서 제외되었다. 아래 표에 나타낸 결과는 무관한 siRNA 화합물과 비교하여 Casp2_4 화합물로 처치된 동물에서 RGC의 생존 퍼센트가 2배 이상 증가한 것으로 드러났다.
RGC 생존의 정량:
Figure pct00035
눈 근처 시신경의 가로 쪼개짐에 의해 RGC의 전 집단이 축삭절제된 또 다른 시신경 축삭절제 모델을 사용해서도 유사한 결과가 얻어진다(Cheng L, Sapieha P, Kittlerova P, Hauswirth WW, Di Polo A. TrkB Gene Transfer Protects Retinal Ganglion Cells from Axotomy-Induced Death In Vivo. J. Neurosci. May 15, 2002 2002;22:3977-3986).
실시예 7: 래트에서 폐이식 후 허혈/ 재관류 손상의 모델 시스템
폐이식 후 허혈/재관류 손상 또는 저산소성 손상을 치료 또는 예방하는데 대한 본 발명의 활성 억제제(siRNA 같은)의 시험을 하나 이상의 실험 동물 모델에서, 예를 들어 Mizobuchi et al., 2004, J. Heart Lung Transplant, 23:889-93; Huang et al., 1995, J. Heart Lung Transplant. 14:S49; Matsumura et al., 1995, Transplantation 59:1509-1517; Wilkes et al, 1999, Transplantation 67:890-896; Naka et al., 1996. Circulation Research, 79:773-783에 설명된 대로 수행한다.
표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)의 siRNA, 특히 TP53BP2, LRDD, CYBA, CASP2, BNIP3, RAC1, 및 DUOX1에 대한 siRNA가 이들 동물 모델에서 시험되었고, 이들 siRNA 화합물은 폐이식 후 허혈-재관류 손상을 치료 및/또는 예방하는 것으로 나타났으며, 따라서 이식수술에서 사용될 수 있다.
실시예 8: 급성 호흡곤란 증후군의 모델 시스템
급성 호흡곤란 증후군의 치료에 대한 본 발명의 활성 억제제(siRNA 같은)의 시험을 동물 모델에서 Chen et al., J Biomed Sci. 2003;10(6 Pt 1):588-92에 의해 설명된 대로 수행한다. 표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)의 siRNA, 특히 유전자 CYBA, HRK, BNIP3, MAPK8, MAPK14, RACl, GSK3B, P2RX7, TRPM2, PARG, SPP1, 및 DUOX1에 대한 siRNA가 이 동물 모델에서 시험되었고, 이들 siRNA는 급성 호흡곤란 증후군을 치료 및/또는 예방하는 것으로 나타났으며, 따라서 상기 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예 9: 청력 손실 상태의 모델 시스템
(i) 귀의 원창에 국소 적용된 후 와우에서 Cy3-PTEN siRNA의 분포
Cy3- PTEN siRNA(총 0.3-0.4μg) PBS의 1μg/100μl 용액을 친칠라의 원창에 적용한다. siRNA 원창 적용 후 24-48시간 뒤에 친칠라를 죽여서 치료된 와우 내의 Cy3-표지된 세포를 분석한다. 와우 내의 표지화 패턴은 24시간 후와 48시간 후가 유사하며, 와우의 기저 회전부, 와우의 중앙 회전부 및 와우의 첨단 회전부에 표지화를 포함한다. 고실계 위에 적용된 Cy3-PTEN siRNA는 와우의 기저 회전부와 와우의 중앙 회전부에서 주로 표지화된 것으로 드러난다. Cy3 신호는 Cy3-PTEN siRNA의 적용 후 최대 15일 지속된다. 본 발명의 siRNA 화합물이 이 동물 모델에서 시험되었고, 와우의 기저, 중앙 및 첨단 회전부에 이들 siRNA 화합물이 상당히 침투하는 것으로 나타났으며, 이들 화합물은 청력 손실의 치료에 사용될 수 있다.
(ii) 카르보플라틴-유도 또는 시스플라틴-유도 와우 유모세포의 세포사의 친칠라 모델
각 동물의 왼쪽 귀에 식염수 중의 특이적 siRNA를 직접 투여하여 친칠라를 사전 처치한다. 각 동물의 오른쪽 귀에 위약으로서 식염수를 제공한다. 본 발명의 특이적 siRNA 화합물을 투여한 후 2일 뒤에 동물을 카르보플라틴(75mg/kg ip) 또는 시스플라틴(30분에 걸쳐 13mg/kg을 복강내 주입)으로 처치한다. 친칠라를 죽인 후(카르보플라틴 처치 2주 후), 내이 유모세포(IHC)와 외이 유모세포(OHC)의 세포사 퍼센트를 왼쪽 귀(siRNA 처치)와 오른쪽 귀(식염수 처치)에서 계산한다. 계산에 따르면, 내이 유모세포(IHC)와 외이 유모세포(OHC)의 세포사 퍼센트는 오른쪽 귀(식염수 처치)에서보다 왼쪽 귀(siRNA 처치)에서 더 낮다.
(iii) 소음-유도 와우 유모세포 세포사의 친칠라 모델
소음성 외상 모델에서 특이적 siRNA의 활성을 친칠라에서 연구한다. 이 동물을 2.5시간 동안 105dB에서 4kHz에 집중된 소음 옥타브 대역에 노출한다. 소음에 노출된 친칠라의 왼쪽 귀를 식염수 약 10μl 중의 siRNA 30μg으로 사전 처치하고(소음성 외상 48시간 전), 오른쪽 귀는 비히클(식염수)로 사전 처치한다. 화합물 작용 전위(CAP)가 와우로부터 전달된 신경 활성을 측정하는 편리하며 신뢰할 만한 전기생리학적 방법이다. CAP는 와우의 기저 근처에 전극을 배치함으로써 기록되며, 이로써 클릭이나 톤 버스트와 같은 소리 자극이 갑자기 켜졌을 때 발생하는 국소장 전위를 검출할 수 있다. 각 귀의 기능 상태를 소음성 외상 후 2.5주 뒤에 평가한다. 구체적으로, 원창으로부터 기록된 화합물 작용 전위의 평균 역치를 소음성 외상 2.5주 후에 측정하고, 이로써 siRNA 처치된 귀의 역치가 처치되지 않은 귀(식염수)보다 더 낮은지(좋은지)를 결정한다. 이에 더하여, 내이와 외이 유모세포 손실 수준을 siRNA 처치된 귀와 대조군 귀에서 측정한다.
표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)의 siRNA, 특히 유전자 TP53BP2, LRDD, CYBA, ATF3, CASP2, N0X3, HRK, CIQBP, BNIP3, MAPK8, MAPK14, RAC1, GSK3B, P2RX7, TRPM2, PARG, CD38, STEAP4, BMP2, CX43, TYROBP, 및 CTGF에 대한 siRNA가 이 동물 모델에서 시험되었고, siRNA 처치된 귀에서의 역치가 처치되지 않은 귀(식염수)에서보다 더 낮은(좋은) 것으로 나타났다. 이에 더하여, 내이와 외이 유모세포 손실량도 대조군 귀에서보다 siRNA 처치된 귀에서 더 낮았다.
실시예 10: 골관절염( OA )의 동물 모델
콜라겐 유도 관절염(CIA): 마우스에서의 CIA는 Trentham et al., 1977, J. Exp. Med. 146:857-868에 설명된다. 애쥬번트 유도 관절염(AA): AA는 Kong et al, 1999, Nature 402:304-08에 설명된다. 반월상연골절제술 모델은 Han et al, 1999, Nagoya J. Med. Sci. 62(3-4):115-26에 설명된다.
연골세포 증식, 말단 분화 및 관절염 발생과 같은 OA에 관련된 상이한 변수들에 대한, SSP1에 대한 siRNA와 같은 상이한 siRNA 억제제들의 효과를 본 분야에 공지된 시험관내 모델에 더하여 상기 모델 중 하나 이상을 이용하여 평가한다. 표 A의 특이적 전구-세포자멸 유전자, 특히 SSP1에 대해 작동되는 siRNA 화합물이 동물 모델에서 시험되었고, 이들 siRNA는 OA를 치료 및/또는 예방하는 것으로 나타났으며, 따라서 상기 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예 11: 이식-관련 급성 신장 손상의 래트 모델 시스템
온허혈 - 시험 래트에서 좌측 신장절제술 수행 후 자가이식하면, 신장 이식물은 45분간 따뜻하게 보존된다. 자가이식 후, 동일한 동물에 우측 신장절제술을 수행한다. 표적에 대해 화학적으로 변형된 siRNA를 신장 이식물의 수거 전에(공여자 처치 모방)("pre"), 또는 신장 자기이식 후에(수용자 처치 모방), 또는 수거 전과 이식 후에(공여자와 수용자 처치 조합)("pre-post") 대퇴부 정맥을 통해 정맥내 투여한다.
냉허혈 - 공여자 동물에 좌측 신장절제술을 수행한 후, 수거된 신장을 5시간 동안 차갑게 보존한다(얼음에). 이 기간이 끝나면, 수용자 래트에 양측 신장절제술을 수행하고, 차게 보존된 신장 이식물을 이식한다. 총 온허혈 시간(수술 과정을 포함해서)은 약 30분이다. 화학적으로 변형된 siRNA를 신장 수거 전에 공여자 동물에("pre"), 또는 이식 후 15분("post 15min") 또는 4시간("post 4hrs")째에 수용자 동물에 대퇴부 정맥을 통해 정맥내 투여한다.
이식 후 신장기능의 개선에 있어서 siRNA의 효능을 평가하기 위해, 온허혈과 냉허혈 모델 모두에서 이식 후 제1일, 제2일 및 제7일째에 혈청 크레아티닌 수준을 측정한다.
실시예 12: 전구- 세포자멸 유전자에 대한 활성 siRNA 화합물의 서열의 발생 및 siRNA 의 생성
전용 알고리즘 및 임의의 유전자, 선택적으로는 본원에 개시된 전구-세포자멸 유전자의 공지된 서열을 이용하여, 많은 잠재적 siRNA의 서열을 만들었다. 알고리즘에 더하여, 23-mer 올리고머 서열의 일부는 19-mer 서열의 5' 및/또는 3' 확장에 의해 만들었다. 이 방법을 사용하여 만든 서열들은 상응하는 mRNA 서열에 완전히 상보적이다.
표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)는 다음의 전구-세포자멸 유전자의 siRNA를 나타낸다: 종양 단백질 p53 결합 단백질, 2(TP53BP2); 로이신-부화 반복부 및 사멸 도메인 함유체(LRDD); 시토크롬 b-245, 알파 폴리펩티드(CYBA); 활성화 전사인자 3(ATF3); 카스파아제 2, 세포자멸-관련 시스테인 펩티다아제(신경 전구체 세포 발현된, 발생학적으로 하향-조절된 2)(CASP2); NADPH 옥시다제 3(NOX3); 하라키리, BCL2 상호작용 단백질(BH3 도메인만 함유)(HRK); 보체 성분 1, q 아요소 결합 단백질(C1QBP); BCL2/아데노바이러스 E1B 19kDa 상호작용 단백질 3(BNIP3); 미토겐-활성화 단백질 키나제 8(MAPK8); 미토겐-활성화 단백질 키나제 14(MAPK14); ras-관련 C3 보툴리넘 독소 기질 1(rho 패밀리, 작은 GTP 결합 단백질 Rac1); 글리코겐 신타아제 키나아제 3 베타(GSK3B); 퓨린성 수용체 P2X, 리간드-게이트 이온 채널 7(P2RX7); 일시적 수용체 잠재 양이온 채널, 서브패밀리 M, 멤버 2(TRPM2); 폴리(ADP-리보오스)글리코히드롤라아제(PARG); CD38 분자(CD38); STEAP 패밀리 멤버 4(STEAP4); 뼈 형성 단백질 2 - BMP2; 간극 연접 단백질, 알파 1, 43kDa(코넥신 43)(GJA1); TYRO 단백질 티로신 키나아제 결합 단백질(TYROBP); 결합조직 성장인자(CTGF); 분비된 인단백질 1(오스테오폰틴, SPP1); ras 상동체 유전자 패밀리, 멤버 A(RHOA); 이중 옥시다아제 1(DUOX1). 각 유전자에 대한 19-mer, 21-mer 및 23-mer siRNA 서열의 별도 리스트가 있으며, 이들은 전용 알고리즘에서의 점수에 기초하여 사람 유전자 발현을 표적화하는데 있어서의 최상의 서열로서 우선순위가 매겨진다.
실시예 13: 변형된 siRNA
siRNA 화합물에 유용한 어떤 구조적 모티프들이 시험되었고, 활성이며 및/또는 안정한 것으로 나타났다. 구조 C-H는 표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)에 제시된 서열 중 어느 하나와 함께 있을 경우 활성이며 및/또는 안정한 것으로 나타난다.
다른 활성 구조들은 구조 (IX)-(XI)에 따른 구조 모티프를 가진 siRNA를 포함한다. 표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 및 표 D(D1-D34)에 제시된 서열과 구조 (I)-(XI)에 제시된 모티프를 포함하는 화합물들을 본원의 도 23에 나타낸다.
한 예에서, x=y=19인 CASP2 siRNA를 상이한 구조 모티프들과 함께 시험하였고, 활성과 안정성에 대해 비교하였다. 제 1 화합물(Casp2-i)에서 (N)x(안티센스)는 교대하는 2'-OMe 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드로 구성되고, (N')y(센스 가닥)의 3' 말단의 3개 연속 뉴클레오티드는 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 이어지며, (N')y의 5' 말단에서 3개 뉴클레오티드는 LNA이다. 제 2 화합물(Casp2-ii)에서 (N)x는 미변형된 리보뉴클레오티드로 구성되고, (N')y의 3' 말단의 3개 연속 뉴클레오티드는 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 이어지며, (N')y의 5' 말단에서 3개 연속 뉴클레오티드는 LNA이다. 제 3 화합물(Casp2-iii)에서 (N)x에서 5" 말단에 있는 2개 연속 뉴클레오티드(말단과 끝에서 두 번째 뉴클레오티드)는 2'-OMe 변형된 리보뉴클레오티드이고, (N')y의 3' 말단의 3개 연속 뉴클레오티드는 2개의 2'-5' 포스포디에스테르 결합에 의해 이어지며, (N')y의 5' 말단에서 3개 연속 뉴클레오티드는 LNA이다. 이들 분자를 하기 표 E에 나타내고, 사람 HeLa 세포에서의 억제 퍼센트와 IC50으로 표시된 이들의 활성을 표 F에 나타낸다. 화합물들은 HeLa 세포에서 활성(> 50% 억제)인 것으로 나타났다. 화합물들을 혈청 안정성에 대해 더 시험하였다. 구조 CASP2-i는 사람 혈청에서 24시간 동안 안정했다. Casp2-ii와 Casp2-iii은 24시간 이상 안정성을 나타냈으며, 낮은 수준의 분해 산물이 확인되었다. 이 올리고머들은 임의의 센스-안티센스 쌍, 또는 표 B(B1-B74), 표 C(C1-C4) 또는 표 D(D1-D34)에 나타낸 센스-안티센스 쌍으로 치환될 수 있는 CASP2-기반 서열들이다.
Figure pct00036
Figure pct00037
표 G는 구조 (E)에 기초한 19-mer 및 23-mer siRNA 화합물(rat p53)을 나타내며, 밑줄친 뉴클레오티드가 L-DNA 뉴클레오티드이다. 이들 화합물에서 각 (N)x 및 (N')y는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 이때 3' 끝에서 두 번째 뉴클레오티드 또는 3' 끝에서 두 번째 위치에서 2개 연속 뉴클레오티드는 L-DNA 뉴클레오티드이다. 이 올리고머들은 임의의 센스-안티센스 쌍, 또는 표 B(B1-B74), 표 C (C1-C4) 또는 표 D(D1-D34)에 나타낸 센스-안티센스 쌍으로 치환될 수 있는 p53-기반 서열들이다.
Figure pct00038
실시예 14: 본 발명의 2'-O-메틸화 구조에 대한 실험 결과
a) 나타낸 하기 구조를 갖는 p53 유전자에 대해 작동되는 siRNA(2OnM)를 유전자 발현을 억제하는 능력에 대해 내인성 p53을 발현하는 세포에서 시험하였다.
도 1a는 5 = 2'O-메틸화 리보우리딘; 6 = 2'O-메틸화 리보아데닌; 7 = 2'O-메틸화 리보시토신; 및 8 = 2'O-메틸화 리보구아닌인 구조를 나타낸다. 소문자는 미변형된 리보뉴클레오티드를 말한다.
결과
85-90% 억제가 구조 Nos: #2; #4, #5, #6, #8 및 #11의 트랜스펙션 후 관찰되었다.
75% 억제가 구조 No. #1의 트랜스펙션 후 관찰되었다.
60% 억제가 구조 Nos: #3; #7, #10 및 #12의 트랜스펙션 후 관찰되었다.
50% 억제가 구조 No. #9의 트랜스펙션 후 관찰되었다.
도 1b는 상기 구조들 중 일부인 #4, #5, #8 및 #11의 혈청 안정성을 나타낸다.
b) 본 발명의 siRNA 화합물의 23-mer 2'O-Me 구조를 사용한 추가의 실험 결과.
p53에 대해 작동되는, 도 2에 나타낸 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-O-메틸 변형을 가진 뉴클레오티드는 밑줄친 대문자로 표시된다.
90% 이상의 억제가 구조 #4, #5, #6, #8 및 #11을 사용하여 달성되었다; 75% 억제가 구조 #2를 사용하여 달성되었다.
c) 도 3a에 나타낸, CASP2에 대해 작동되는 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-O-메틸 변형을 가진 뉴클레오티드는 밑줄친 대문자로 표시된다. 활성 결과는 도 3b에 제시한다. 상기 분자들은 모두 약 75-95% 억제를 나타냈다.
d) CASP2에 대해 작동되는, 도 4a에 나타낸 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-O-메틸 변형을 가진 뉴클레오티드는 밑줄친 대문자로 표시된다. 결과를 도 4b에 나타낸다. 상기 분자들은 모두 약 75-95% 억제를 나타냈다.
e) 도 5a에 나타낸, CASP2에 대해 작동되는 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드는 밑줄친 대문자로 표시된다. 결과를 도 5b에 나타낸다. 상기 분자들은 모두 약 75-90% 억제를 나타냈다.
실시예 15: 2'-5' 브릿지 구조에 대한 추가 실험 결과
a) 도 6a에 나타낸 구조를 갖는 p53 유전자에 대해 작동되는 siRNA 화합물 (2OnM)을 유전자 발현을 억제하는 능력에 대해 내인성 p53을 발현하는 세포에서 시험하였다.
도 6a에서, 5 = 2'-5" 브릿지 리보우리딘; 6 = 2'-5" 브릿지 리보아데닌; 7 = 2'-5" 브릿지 리보시토신; 및 8 = 2'-5" 브릿지 리보구아닌. 밑줄은 2'-O-메틸화 뉴클레오시드를 표시한다.
결과
90-95% 억제가 구조 Nos. 1-3, 10 및 12로 트랜스펙션한 후 관찰되었다.
80-85% 억제가 구조 Nos. 4 및 15로 트랜스펙션한 후 관찰되었다.
다른 구조들은 덜 활성이었다. 도 6b는 상기 구조들 중 일부의 혈청 안정성을 나타낸다.
b) CASP2에 관한 2'-5' 구조의 결과.
도 7a에 나타낸, CASP2에 대해 작동되는 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-5' 브릿지에 의해 연결된 뉴클레오티드는 이들 사이의 별표(*)로 표시된다. 결과는 도 7b에 나타내며, CASP2에 대한 4개 siRNA는 모두 활성이었고, 75-92% 억제를 나타냈다.
c) DDIT4(REDD2)에 관한 2'-5' 구조의 결과
도 8a에 나타낸, DDIT4에 대해 작동되는 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-5' 브릿지에 의해 연결된 뉴클레오티드는 이들 사이에 별표로 표시된다. siRNA 화합물 1과 3은 상기 분석에서 활성이었고, 내인성 유전자의 60% 억제를 나타냈다.
d) QM5에 관한 2'-5' 구조의 결과
도 8b에 나타낸 마우스 p53에 대해 작동되는 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-5' 브릿지에 의해 연결된 뉴클레오티드는 이들 사이에 별표로 표시된다. 구조 1과 3은 90-95% 억제를 나타냈고, 구조 4는 70% 억제를 나타냈고, 구조 2는 약 50% 억제를 나타냈다.
e) 2'-5'와 2'-O-메틸 조합 변형을 가진 추가 구조
도 9a-9b에 나타낸 p53(QM5 siRNA)에 대해 작동되는 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-5' 브릿지에 의해 연결된 뉴클레오티드는 이들 사이에 별표로 표시된다. 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드는 밑줄로 표시된다. 결과는 도 9c, 9d 및 9e에 나타낸다. 대부분의 구조가 90%를 넘는 억제를 달성한다.
f) 2'-5'와 2'-O-메틸 조합 변형을 가진 추가 23-mer 구조
도 10a에 나타낸, p53에 대해 작동되는 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-5' 브릿지에 의해 연결된 뉴클레오티드는 이들 사이에 별표로 표시된다. 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드는 밑줄로 표시된다.
결과를 도 10b에 나타낸다. 구조 1-3이 80-95% 억제를 달성했다. 도 10c과 10d는 SS 상에 2'-5' 연결, 및 AS 상에 교대하는 메틸화 패턴을 갖는 구조에 대한 혈청 안정성 결과를 나타낸다.
g) 도 11a에 나타낸, CASP2에 대해 작동되는 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드는 밑줄로 표시되고, 2'-5' 브릿지에 의해 연결된 뉴클레오티드는 이들 사이에 별표로 표시된다.
결과를 도 11b에 나타내며, 이것은 구조 3-5가 약 70-95% 억제를 달성한다는 것을 나타낸다.
h) 도 12a에 나타낸, CASP2에 대해 작동되는 siRNA 화합물을 상기 분석에서 시험하였다. 2'-5' 브릿지에 의해 연결된 뉴클레오티드는 이들 사이에 별표로 표시된다.
결과를 도 12b에 나타내며, 이것은 구조 3-5가 약 80-95% 억제를 달성한다는 것을 나타낸다.
실시예 16: 거울 뉴클레오티드 함유 구조에 대한 추가 실험 결과
도 13a에 나타낸 구조를 갖는 p53 유전자에 대해 작동되는 siRNA 화합물(5nM 및 20nM)을 유전자 발현을 억제하는 능력에 대해 내인성 p53을 발현하는 세포에서 시험하였다. 밑줄친 뉴클레오티드가 거울 DNA 뉴클레오티드, 즉 L-데옥시리보뉴클레오티드이다.
결과
80-95% 억제가 구조 1-3, 10, 12 및 15의 트랜스펙션 후 관찰되었다. 양쪽 가닥에 교대하는 뉴클레오티드를 포함하는 구조 16을 양성 대조군으로 사용한다.
다른 구조들은 낮거나 중간 정도의 활성을 나타냈다. 결과를 도 13b에 나타낸다. 도 13c는 L-DNA 뉴클레오티드 모노머(인접 뉴클레오티드 모노머에 공유 연결된)를 포함하는 siRNA 화합물의 혈청 안정성을 나타낸다.
siRNA #1에 대한 활성 분석에서 추가의 일련의 결과는 0.09nM의 IC50을 나타냈다. 이 활성 수준은 IC50이 0.23nM인 양쪽 가닥에 교대하는 메틸화 구조를 가진 동일한 서열보다 2배 더 크다(도 13d 참조).
실시예 17: LNA 함유 구조에 대한 추가 실험 결과
도 14a에 나타낸 구조를 갖는 p53 유전자에 대해 작동되는 siRNA 화합물(5nM 및 20nM)을 유전자 발현을 억제하는 능력에 대해 내인성 p53을 발현하는 세포에서 시험하였다. 밑줄은 LNA 뉴클레오티드를 표시한다. 실시예 1에 제시된 것과 같은 분석이 사용되었다.
결과
80-95% 억제가 구조 10, 12 및 15로 트랜스펙션한 후 관찰되었다.
다른 구조들은 낮거나 중간 정도의 활성을 나타냈다. 결과를 도 14b에 나타낸다.
실시예 18: 직렬형 및 별모양 구조
도 15 및 16은 직렬형 siRNA 및 "별모양" siRNA 구조의 예들 및 혈청 안정성을 각각 나타낸다.
실시예 19: 복수 변형 타입을 갖는 siRNA 화합물
도 17a-17c는 여러 위치에 변형된 뉴클레오티드 모노머(인접 뉴클레오티드 모노머에 공유 연결된)를 포함하는 CASP2 siRNA 화합물, 및 20nM에서 측정된 표적 유전자 녹다운(KD) 퍼센트로 표시한 이들의 활성을 나타낸다. 도 17a에서 밑줄친 굵은 문자는 2' 메톡시 변형된 뉴클레오티드를 표시하고, 이탤릭체 대문자는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결과 3' 메톡시 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 표시한다. 도 17b에서 밑줄친 굵은 문자는 2' 메톡시 변형된 뉴클레오티드를 표시하고, 이탤릭체 대문자는 P-에톡시 뉴클레오티드 간 연결을 포함하는 뉴클레오티드를 표시한다. 도 17c에서 밑줄친 굵은 문자는 2' 메톡시 변형된 뉴클레오티드를 표시하고, 이탤릭체 대문자는 2'-5' 뉴클레오티드 간 연결을 포함하는 뉴클레오티드를 표시하고, 이탤릭체 소문자는 L-DNA 변형된 뉴클레오티드를 표시하고, 소문자는 LNA(2'O-4'C) 뉴클레오티드를 표시한다.
실시예 20: 데옥시리보뉴클레오티드 함유 구조
도 18은 CASP2_4 siRNA 안티센스 가닥(AS)과 센스 가닥(S)을 포함하는 예들을 나타내며, 이들은 여러 위치에 DNA 모노머를 포함한다(이탤릭체 굵은 문자, 인접 뉴클레오티드 모노머에 공유 연결됨). siRNA 화합물은 임의의 센스 가닥과 임의의 안티센스 가닥을 조합하여 합성한다. 도 18에서, 5 = 2'-O-메틸화 리보우리딘; 6 = 2'-O-메틸화 리보아데닌; 7 = 2'-O-메틸화 리보시토신; 및 8 = 2'-O-메틸화 리보구아닌. 도 19a-19d는 CASP2_4 및 RhoA_24 서열과 함께 예시된 L-DNA 모티프의 예들을 나타낸다.
도 19a는 RNAi에서 유용한 CASP2를 표적으로 하는 2개의 바람직한 이중 가닥 듀플렉스를 나타낸다.
도 19b는 L-DNA 뉴클레오티드를 포함하는 CASP2_4 듀플렉스를 나타낸다( n - L-DNA(L-데옥시리보뉴클레오티드); N (밑줄친 대문자) - 2'-0Me 리보뉴클레오티드; Lc - L-데옥시시티딘 5'-오버행; ab - 비염기성 가-데옥시리보뉴클레오티드 유사체).
도 19c는 미변형된 리보뉴클레오티드, DNA 뉴클레오티드 및 L-DNA 뉴클레오티드 유사체 및 교대하는 미변형된 리보뉴클레오티드와 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 CASP2_4 AS 올리고뉴클레오티드의 조합을 포함하는 CASP2_4 SEN 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 이것은 RNAi 활성을 나타내는 듀플렉스를 제조하는데 유용하다.
도 19d는 CASP2_4 변형된 듀플렉스의 활성 및 안정성을 나타낸다.
도 19e는 한쪽 또는 양쪽 3' 말단에 3' 포스페이트가 있기도 하고 없기도 한 RhoA_24 서열과 함께 예시된 어떤 듀플렉스 모티프를 나타낸다.
실시예 21: 비염기성 , 반전된- 비염기성 , 2'O- 메틸 , 미스매치 염기쌍 및 다른 변형들을 함유하는 구조
도 20은 본원에 개시된 상태 중 어느 것을 치료하는데 효과적인 구조들을 설명한다.
도 20a-20g에서, 뉴클레오티드 유사체 및 가-뉴클레오티드의 범례는 다음과 같다:
밑줄친 대문자 "N" - 2'OMe 리보뉴클레오티드; "ab" - 비염기성 가-뉴클레오티드; I - 역전된 비염기성 가-뉴클레오티드; 이탤릭체 "5N" - 5'OMe DNA; 흰색 대문자 "N" - LNA; 밑줄친 이탤릭체 소문자 n - L-DNA; 중간선
Figure pct00039
- 미스매치
도 20a: Set 1은 표적 서열에 대한 비염기성 매스매치를 포함하는 AS 가닥을 나타내며, 올리고뉴클레오티드는 3' 포스페이트를 결여한다;
도 20b: Set 2는 ds 구조에 15bp 미만을 갖는 듀플렉스 화합물을 제조하는데 유용한 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 올리고뉴클레오티드는 3' 포스페이트를 결여한다;
도 20c: Set 3은 표적 서열에 대한 적어도 하나의 미스매치가 삽입된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다;
도 20d-20e: Set 4 및 5는 Set 1에서와 같이 센스 가닥과 쌍을 이룬 비염기성 가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들("ab")을 포함하는 AS 가닥을 나타낸다;
도 20f: Set 6은 미변형된 센스 가닥과 쌍을 이룬 비염기썽 가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들("ab")을 포함하는 AS 가닥을 나타낸다.
도 20g: Set 7은 SET1 유래의 센스 가닥과 쌍을 이룬 미변형된 AS 가닥을 나타낸다.
도 21은 RNAi 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 유용한 비염기쌍 뉴클레오티드 유사체에서 염기 변형의 예들을 나타낸다(화학 구조를 도시한 칼럼에서 dR은 데옥시리보오스 부분에 대한 부착점을 나타내고, R은 리보오스 부분에 대한 부착점을 나타낸다).

Claims (37)

  1. 하기 제시된 구조 (IX)를 갖는 화합물:
    Figure pct00040

    여기서, N과 N'는 각각 변형될 수도 있고 변형되지 않을 수도 있는 리보뉴클레오티드, 또는 비정규 부분이고;
    (N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
    Z와 Z'는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재하는 경우에는 독립적으로 그것이 존재하고 있는 가닥의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 연속 뉴클레오티드이고;
    z"는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재하는 경우에는 (N')y의 5' 말단에 공유 부착된 캡핑 부분이고;
    x는 18 내지 27이고;
    y는 18 내지 27이고;
    (N)x는 변형된 리보뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 각 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지고, (N)x의 3' 말단에 있는 N은 변형된 리보뉴클레오티드이고, (N)x는 3' 단부에서 시작하여 적어도 5개의 교대하는 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 전체적으로 적어도 9개의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며, 각 나머지 N은 미변형된 리보뉴클레오티드이고;
    (N')y에는 적어도 하나의 비정규 부분이 존재하며, 비정규 부분은 비염기성 리보오스 부분, 비염기성 데옥시리보오스 부분, 변형된 또는 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 및 2'-5' 뉴클레오티드간 포스페이트 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드일 수 있고;
    (N)x의 서열은 (N')y의 서열에 실질적으로 상보적이고, (N')y의 서열은 표적 유전자에 의해서 암호화되는 mRNA의 서열과 실질적으로 동일하다.
  2. 제 1 항에 있어서, x=y=19인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, x=y=23인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 비정규 부분이 위치 15, 16, 17, 또는 18에 존재하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 4 항에 있어서, 적어도 하나의 비정규 부분이 거울 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 5 항에 있어서, 거울 뉴클레오티드가 위치 17, 위치 18, 또는 위치 17과 18에 존재하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서, (N')y가 적어도 5개의 비염기성 리보오스 부분 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서, N' 중 적어도 하나는 LNA인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 1 항에 있어서, (N)x는 9개의 교대하는 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제 1 항에 있어서, z"가 존재하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제 1 항에 있어서, (N)y가 위치 17, 위치 18, 또는 위치 17과 18 모두에 거울 뉴클레오티드를 포함하고, (N')y가 위치 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19에 2'O-Me 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고, 표적 유전자가 CASP2인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 하기 제시된 구조 (X)를 갖는 화합물:
    Figure pct00041

    여기서, N과 N'는 각각 변형될 수도 있고 변형되지 않을 수도 있는 리보뉴클레오티드, 또는 비정규 부분이고;
    (N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
    Z와 Z'는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재하는 경우에는 독립적으로 그것이 존재하고 있는 가닥의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 연속 뉴클레오티드이고;
    z"는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재하는 경우에는 (N')y의 5' 말단에 공유 부착된 캡핑 부분이고;
    x는 18 내지 27이고;
    y는 18 내지 27이고;
    (N)x는 변형된 또는 미변형된 리보뉴클레오티드, 및 선택적으로 적어도 하나의 비정규 부분을 포함하고;
    (N')y에는 적어도 하나의 비정규 부분이 존재하며, 비정규 부분은 비염기성 리보오스 부분, 비염기성 데옥시리보오스 부분, 변형된 또는 미변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 거울 뉴클레오티드, 비염기쌍 뉴클레오티드 유사체 또는 2'-5' 뉴클레오티드 간 포스페이트 결합에 의해 인접 뉴클레오티드에 이어진 뉴클레오티드일 수 있고;
    (N)x의 서열은 (N')y의 서열에 실질적으로 상보적이고, (N')y의 서열은 표적 유전자에 의해서 암호화되는 mRNA의 서열과 실질적으로 동일하다.
  13. 제 12 항에 있어서, x=y=19인 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제 12 항에 있어서, x=y=23인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제 12 항에 있어서, (N)x가 변형된 뉴클레오티드와 미변형된 리보뉴클레오티드, 그리고 적어도 하나의 비정규 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제 15 항에 있어서, (N)x가 mRNA에 상보하는 15개 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제 15 항에 있어서, (N)x에서 3' 말단에 있는 N은 변형된 리보뉴클레오티드이고, (N)x는 적어도 8개의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제 17 항에 있어서, 적어도 8개의 변형된 리보뉴클레오티드 중 적어도 5개는 3' 단부에서 시작하여 교대로 존재하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제 12 항 또는 제 15 항에 있어서, (N')y에서 적어도 하나의 비정규 부분은 거울 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제 19 항에 있어서, 거울 뉴클레오티드가 위치 17, 위치 18, 또는 위치 17과 18에 존재하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 제 12 항 또는 제 15 항에 있어서, (N')y에서 적어도 하나의 비정규 부분은 비염기성 리보오스 부분 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분인 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. 제 12 항에 있어서, z"가 존재하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  23. 하기 제시된 구조 (XI)를 갖는 화합물:
    Figure pct00042

    여기서, N과 N'는 각각 변형될 수도 있고 변형되지 않을 수도 있는 리보뉴클레오티드, 또는 비정규 부분이고;
    (N)x와 (N')y는 각각, 각 연속 N 또는 N'가 공유 결합에 의해 다음번 N 또는 N'에 이어진 올리고뉴클레오티드이고;
    Z와 Z'는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재하는 경우에는 독립적으로 그것이 존재하고 있는 가닥의 3' 말단에 공유 부착된 1-5개 연속 뉴클레오티드이고;
    z"는 존재할 수도 있고 부재할 수도 있으며, 존재하는 경우에는 (N')y의 5' 말단에 공유 부착된 캡핑 부분이고;
    x는 18 내지 27이고;
    y는 18 내지 27이고;
    (N)x는 변형된 또는 미변형된 리보뉴클레오티드와 비정규 부분의 조합을 포함하며, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'-O-메틸을 가지고;
    (N')y는 변형된 또는 미변형된 리보뉴클레오티드, 및 선택적으로 비정규 부분을 포함하며, 임의의 변형된 리보뉴클레오티드는 그것의 당에 2'OMe를 가지고;
    (N)x의 서열은 (N')y의 서열에 실질적으로 상보적이고, (N')y의 서열은 표적 유전자에 의해서 암호화되는 mRNA의 서열과 실질적으로 동일하며, mRNA에 상보하는 연속 뉴클레오티드는 15개 미만이다.
  24. 제 23 항에 있어서, x=y=19인 것을 특징으로 하는 화합물.
  25. 제 23 항에 있어서, x=y=23인 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 제 23 항에 있어서, 적어도 하나의 비정규 부분이 (N)x에 존재하고, 이것은 비염기성 리보오스 부분 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분인 것을 특징으로 하는 화합물.
  27. 제 23 항에 있어서, 적어도 하나의 비정규 부분이 (N)x에 존재하고, 이것은 비염기쌍 뉴클레오티드 유사체인 것을 특징으로 하는 화합물.
  28. 제 26 항에 있어서, (N')y는 미변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. 제 27 항에 있어서, (N')y는 미변형된 리보뉴클레오티드 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  30. 제 23 항 내지 제 29 항 중의 어느 한 항에 있어서, (N)x가 mRNA에 상보하는 15개 미만의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  31. 제 26 항에 있어서, (N)x가 적어도 5개의 비염기성 리보오스 부분 또는 비염기성 데옥시리보오스 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  32. 제 23 항에 있어서, (N)x 및/또는 (N')y가 (N')y 및/또는 (N)x에 있는 상응하는 변형된 또는 미변형된 리보뉴클레오티드와 염기쌍이 아닌 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중의 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자가 포유류 및 비포유류 유전자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  34. 제 33 항에 있어서, 포유류 유전자가 사람 유전자이고, 이 유전자에 의해 암호화되는 mRNA가 SEQ ED NOS: 1-41 또는 46-48 중 하나에 제시된 것을 특징으로 하는 화합물.
  35. 제 34 항에 있어서, (N)x 및 (N')y의 올리고뉴클레오티드 서열이 표 B(B1-74), C(C1-C4) 및 D(D1-D34)(SEQ ID NOS: 97-87,178)에 제시된 것을 특징으로 하는 화합물.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중의 어느 한 항에 따른 화합물; 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  37. 제 36 항에 따른 제약 조성물을 질환 또는 상태를 예방 또는 치료하는데 효과적인 양으로 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 피험자에서 질환 또는 상태의 발생 또는 위급도를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이때 질환 또는 상태 및/또는 이와 관련된 증상이 청력 손실, 급성 신부전증(ARF), 녹내장, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 및 다른 급성 폐 및 호흡기 손상, 폐이식 후 허혈-재관류 손상, 전방 허혈성 시신경병증을 포함하는 허혈성 안구 이상, 폐, 간, 심장, 췌장 및 신장 이식을 포함하는 장기이식 및 DGF, 신장독성 및 신경독성, 척수 손상, 압력상처, 노인성 황반변성(AMD), 안구건조증, ION, 입안염 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)으로부터 선택되는 방법.
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