JP2012521763A - 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたシグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害 - Google Patents

低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いたシグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＳＴＡＴ１遺伝子の発現および／または活性のモジュレーションに応答する、および／またはＳＴＡＴ１遺伝子発現経路をモジュレートする形質、疾患および病状の試験、診断、および処置のための化合物、組成物、および方法に関する。詳しくは、本発明は、ＳＴＡＴ１遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得るか、または媒介する二本鎖核酸分子、例えば、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの小核酸分子に関する。

Description

本出願は、２００９年３月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／１６４，３０５号の利益を主張する。上記の出願は、引用によりその全体（図面を含む）が本明細書に組み込まれる。
配列表
３７ ＣＦＲ §１．５２（ｅ）（５）に従ってＥＦＳによって提出した配列表は、引用により本明細書に組み込まれる。ＥＦＳによって提出した配列表テキストファイルは、２０１０年３月１９日に作成した７７，１２６バイトのサイズのファイル「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ８２ＷＰＣＴ」を含む。
ＳＴＡＴは、サイトカイン細胞表面受容体で生じ、核に伝達される細胞内シグナル伝達を媒介する潜在的細胞質性転写因子の一ファミリーである。ＳＴＡＴ−１は、１型およびＩＩ型インターフェロンによって活性化される。ＩＦＮ−γがそのヘテロ二量体型受容体（ＩＦＮ−γＲ）に結合するとＩＦＮ−γシグナル伝達が始まり、ａ−鎖結合Ｊａｋ１およびｂ−鎖結合Ｊａｋ２チロシンキナーゼの活性化が誘発され、その結果、ａ−鎖がリン酸化される。この段階によって、シグナル伝達性転写因子１遺伝子（ＳＴＡＴ１）のそのＳＨ２ドメインによるａ−鎖の漸増、ならびにその後のＳｔａｔ１のリン酸化およびリン酸化されたＳｔａｔ１ホモ二量体の放出が可能になる。活性化されたＳｔａｔ１ホモ二量体は核に移行し、核内で、ＩＣＡＭ−１、ＴＡＰ−１、ＩＲＦ−１およびＳｔａｔ１などの遺伝子サブセットの転写を活性化させる。Ｓｔａｔ１レベルの増大は、次いでＳｔａｔ１依存性遺伝子の活性化の自己増幅に作用することがあり得るが、一方で、新たに生成されたＩＲＦ−１は、ＩＦＮ応答刺激（ＩＲＳ）部位に結合し、第二波の転写（ＨＬＡ−Ｂ、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、およびＩＦＮ−β遺伝子）を活性化させる（他の因子と協調して）ことがあり得る。ＩＦＮ−β誘発性の遺伝子発現は、ＩＦＮ−α／β受容体（ＩＦＮ−αＲ）の活性化、およびその後のＩＦＮ−αＲ１結合Ｔｙｋ２およびＩＦＮ−ａＲ２結合Ｊａｋ１の活性化によって起始され、その結果、ＩＦＮ−αＲ１がリン酸化され、Ｓｔａｔ２が漸増する。ＳＴＡＴ−１には２種類のアイソフォームが存在する。αアイソフォームは完全長ＳＴＡＴ−１であり、βアイソフォームは、αアイソフォームの切断型である。
喘息患者の亜集団を用いた研究により、喘息の重症度と、血清／末梢血中（Ｃｏｒｒｉｇａｎら，１９９０，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ，１４，９７０；Ｃｈｏら ２００５，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７１，２２４）および喀痰中（Ｔｒｕｙｅｎら，２００６；Ｔｈｏｒａｘ ６１，２０２）のＩＦＮγレベルとの間に、正の関係が示されている。また、Ｔｒｕｙｅｎら，２００８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，５０，９９−１０２には、アレルギー性喘息患者と比べて非アレルギー性喘息患者由来の喀痰中でＩＦＮが増大していることが示されており、Ｌａｉらにより、喘息の増悪を有する小児の血漿中では、ＩＦＮγ誘導性サイトカインＩＰ−１０およびＭＩＧが増大していることが示された。
このように、ＩＦＮγは、喘息表現型に役割を果たしていることが示されており、したがって、その活性を、ＳＴＡＴ１レベルを低下させることによって阻害する必要性が依然として存在している。また、Ｓａｍｐａｔｈら，１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３，１３５３には、正常対照被検体と比べて喘息患者において、上皮Ｓｔａｔ１が、不変的に過剰発現され、活性化されていたことが示されている。この活性化は、アトピーまたはグルココルチコイド処置とは無関係であり、同じ被検体由来の気管支肺胞マクロファージでは、Ｓｔａｔ１の活性化または過剰発現の証拠が示されなかったため、気道上皮細胞に特異的であった。したがって、ＳＴＡＴ１を阻害する分子は、喘息などの呼吸器系の疾患の処置における必要性を満たすものであろう。
ＲＮＡ干渉（本明細書において以下、「ＲＮＡｉ」）による遺伝子発現、具体的にはＳＴＡＴ１遺伝子発現の改変は、この必要性を満たす手法の１つである。ＲＮＡｉは、低分子二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子によって誘導される。この低分子ｄｓＲＮＡ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ阻害薬」と称され、ｓｉＲＮＡとの配列相同性を共有するメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の発現のサイレンシングを行なう。これは、一般的にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるｓｉＲＮＡ含有エンドヌクレアーゼ複合体によって媒介される該ｍＲＮＡの切断によって行なわれ得る。標的ＲＮＡの切断は、典型的には、ｓｉＲＮＡ二本鎖のガイド配列に相補的な領域中央部で起こる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５、１８８）。また、ＲＮＡ干渉は、小ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）媒介性遺伝子サイレンシングを伴うこともあり得、これは、おそらく、クロマチン構造を調節し、それにより標的遺伝子配列の転写が抑制される細胞機構によるものである（例えば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照のこと）。
Ｃｏｒｒｉｇａｎら，１９９０，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ，１４，９７０ Ｃｈｏら ２００５，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７１，２２４ Ｔｒｕｙｅｎら，２００６；Ｔｈｏｒａｘ ６１，２０２ Ｔｒｕｙｅｎら，２００８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，５０，９９−１０２ Ｓａｍｐａｔｈら，１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３，１３５３ Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５、１８８ Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９ Ｖｏｌｐｅら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７ Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８ Ｈａｌｌら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７
本発明は、シグナル伝達性転写因子１（ＳＴＡＴ１）遺伝子、具体的には、炎症性および／または呼吸器の疾患および病状の発生または維持と関連しているＳＴＡＴ１遺伝子の発現を、小核酸分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりモジュレートするのに有用な化合物、組成物、および方法を提供する。
特に、本発明は、小核酸分子、すなわち低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子、例えば限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および環状ＲＮＡ分子、ならびにＳＴＡＴ１遺伝子の発現をモジュレートするため、および／またはＳＴＡＴ１遺伝子の発現および／または活性の経路に関与している他の遺伝子の発現をモジュレートするために使用される方法を特色とする。
一態様において、本発明は、互いに相補性を有する第１鎖と第２鎖を含み、該鎖の少なくとも一方が、
５’− ＣＣＵＡＣＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＵ −３’ （配列番号：６）；
５’− ＡＧＵＵＣＵＵＵＣＵＵＣＧＵＧＵＡＧＧ −３’ （配列番号：１００）；
５’− ＧＣＵＵＧＡＣＡＡＵＡＡＧＡＧＡＡＡＧ −３’ （配列番号：２２）；
５’− ＣＵＵＵＣＵＣＵＵＡＵＵＧＵＣＡＡＧＣ −３’ （配列番号：１０１）；
５’− ＧＵＡＡＡＧＵＣＡＧＡＡＡＵＧＵＧＡＡ −３’ （配列番号：２３）；
５’− ＵＵＣＡＣＡＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＵＡＣ −３’ （配列番号：１０２）；
５’− ＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＧＵＡＡＵＣＵ −３’ （配列番号：２４）；
５’− ＡＧＡＵＵＡＣＧＣＵＵＧＣＵＵＵＵＣＣ −３’ （配列番号：１０３）；
５’− ＵＵＧＡＣＡＡＵＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡ −３’ （配列番号：２７）；または
５’− ＵＣＣＵＵＵＣＵＣＵＵＡＵＵＧＵＣＡＡ −３’ （配列番号：１０４）；
の少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドの１個以上が、任意選択で化学修飾されたものである二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
本発明の一部の実施形態では、該ヌクレオチドがすべて非修飾である。他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖の１つ以上のヌクレオチド位置が修飾されている（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の修飾ヌクレオチド）。修飾としては、核酸の糖鎖修飾、塩基修飾、主鎖（ヌクレオチド間結合）修飾、非ヌクレオチドの修飾、および／またはその任意の組合せが挙げられる。一部の特定の場合では、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドに異なる修飾がなされている。例えば、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドには、２’−糖鎖位置において異なる修飾がなされ得る（すなわち、同じ鎖または異なる鎖の２’−糖鎖位置において、少なくとも１個のプリンは少なくとも１個のピリミジンと異なる修飾を有する）。他の場合では、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、または２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである。
一部の特定の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、一方または両方の鎖に１、２、３または４個のヌクレオチドの３’突出部を有する。他の実施形態では、ｓｉＮＡには突出部がない（すなわち、平滑端を有する）。好ましくは、ｓｉＮＡ分子は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方に２個のヌクレオチドの３’突出部を有する。突出部は修飾されていても非修飾であってもよい。突出部内の修飾ヌクレオチドの例としては、限定されないが、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシヌクレオチドが挙げられる。アンチセンス鎖の突出部のヌクレオチドは、ＳＴＡＴ１標的配列内のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含むものであり得る。同様に、センス鎖（ｓｔａｎｄ）の突出部は、ＳＴＡＴ１標的配列内のヌクレオチドを含むものであり得る。一部の特定の場合では、本発明のｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖に２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである２つの３’突出ヌクレオチドと、センス鎖に２’−デオキシヌクレオチドである２つの３’突出ヌクレオチドを有する。
一部の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、キャップ（本明細書では「末端キャップ」とも称する）を有する。キャップは、５’末端に存在させても（５’−キャップ）３’末端に存在させてもよく（３’−キャップ）、両末端に存在させてもよい（ｓｉＮＡのセンス（ガイド）鎖の５’末端と３’末端など）。
一部の特定の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖を有し、式（Ａ）：
Figure 2012521763
 を含む分子であって、
式中、上側の鎖は、該二本鎖核酸分子のセンス鎖であり、下側の鎖はアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、または配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、該センス鎖は、該アンチセンス鎖と相補性を有する配列を含み；
各Ｎは、独立して、非修飾または化学修飾されたヌクレオチドであり；
各Ｂは、存在する、または存在しない末端キャップであり；
（Ｎ）は、各々、独立して、非修飾化学修飾された突出ヌクレオチドを表し；
［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチドを表し；
Ｘ１およびＸ２は、独立して、０〜４の整数であり；
Ｘ３は、１７〜３６の整数であり；
Ｘ４は、１１〜３５の整数であり；
Ｘ５は、１〜６の整数であるが、Ｘ４とＸ５の和は１７〜３６であるものとする、
二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せであり；
（ｂ）ＮＸ４位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せであり；
（ｃ）ＮＸ３位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せであり；
（ｄ）ＮＸ３位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり；
（ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり；
（ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドであり；
（ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドであり；
（ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、リボヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、リボヌクレオチドであり；
（ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、リボヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
また別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップ部分であり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（訳注：イタリック体 以下同じ）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ａは、アデノシンであり；
Ｇは、グアノシンであり；
Ｕは、ウリジンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップであり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ｕは、ウリジンであり；
Ｃは、シチジンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップ部分であり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ｃは、シチジンであり；
Ｕは、ウリジンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップ部分であり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ａは、アデノシンであり；
Ｇは、グアノシンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップ部分であり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ｕは、ウリジンであり；
Ｃは、シチジンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載の二本鎖核酸分子および任意選択で薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物の投与は、核酸が所望の標的細胞内にインビトロまたはインビボで導入される既知の方法によって行なわれ得る。
細胞、組織および生物体への本発明の核酸分子の導入に一般的に使用される技法としては、種々の担体系、試薬およびベクターの使用が挙げられる。本発明における使用に適したかかる担体系の非限定的な例としては、核酸−脂質粒子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、リポプレックス、ミセル、ビロソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、核酸複合体、およびその混合物が挙げられる。
医薬組成物は、エアロゾル剤、分散剤、液剤（例えば、注射用液剤）、クリーム剤、軟膏、錠剤、粉剤、懸濁剤などの形態であり得る。このような組成物は、任意の適切な様式で、例えば、経口、舌下、口腔内、非経口、経鼻または経表面的に投与され得る。一部の実施形態において、該組成物はエアロゾル化され、吸入によって送達される。
本発明の分子および医薬組成物は、広範囲の治療適用用途において有用性を有し、したがって、本発明の別の態様は、被検体の処置における本発明の化合物および医薬組成物の使用に関する。したがって、本発明は、被検体に有効量の本発明の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を投与することを含む、ＳＴＡＴ１の作用によって、または該作用の低下によって媒介される病状に苦しむ被検体（ヒトなど）の処置方法を提供する。一部の特定の実施形態では、該病状は、例えば、限定されないが、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、喘息、好酸球性の咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎などの呼吸器疾患である。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細説明および添付の図面を参照すると明らかとなろう。そのために、本発明の種々の態様を説明し、より詳しく示すために、本明細書の至るところで特許、特許出願、および他の文献を挙げている。本明細書において挙げたこれらの参考文献は各々、引用によりその全体（図面を含む）が本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の提案される非限定的な機構の図を示す。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって外来一本鎖ＲＮＡ（例えば、ウイルス、トランスポゾンまたは他の外因性のＲＮＡ）から生成された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がＤＩＣＥＲ酵素を活性化し、これが、さらにｓｉＮＡ二本鎖を生成させる。あるいはまた、合成または発現ｓｉＮＡを、細胞内に適切な手段によって直接導入してもよい。活性ｓｉＮＡ複合体が形成され、これは標的ＲＮＡを認識し、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体による標的ＲＮＡの分解をもたらすか、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によるさらなるＲＮＡの合成をもたらし、これによりＤＩＣＥＲが活性化され、さらなるｓｉＮＡ分子がもたらされ、それにより、ＲＮＡｉ応答が増幅され得る。 本発明の化学修飾されたｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示す。図中、Ｎは、任意のヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウリジン、または任意選択でチミジンを表し、例えば、チミジンは、括弧（ＮＮ）で表示する突出領域において置換されていてもよい。ｓｉＮＡ構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖に対する種々の修飾を示す。（ＮＮ）ヌクレオチド位置は、本明細書に記載のように化学修飾されていてもよく（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロなど）、対応する標的核酸配列に由来するもの、または由来しないもののいずれかであり得る（例えば、図４Ｃ参照）。さらに、図に示していないが、図２に示す配列は、任意選択で、センス鎖の５’端から９番目の位置、またはガイド鎖の５’端を基準にすると１１番目（ガイド鎖の５’末端から１１のヌクレオチド位置を数える）の位置にリボヌクレオチドを含むものであってもよい（図４Ｃ参照）。構築物Ａ〜Ｆのアンチセンス鎖は、本発明の任意の標的核酸配列に相補的な配列を含む。さらに、図２Ａ〜Ｆに示す任意の構築物について、グリセリル部分（Ｌ）がアンチセンス鎖の３’端に存在する場合、修飾ヌクレオチド間結合は任意選択である。 図２Ａ：センス鎖は２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは任意選択で塩基対合しており、存在するヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、リボヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、任意選択で３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは、任意選択で標的ＲＮＡ配列に相補的であり、存在するヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、リボヌクレオチドである。修飾ヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホノアセテート、チオホスホノアセテートなど）または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合を「ｓ」で示し、これは、任意選択で、アンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを連結するものである。 図２Ｂ：センス鎖は２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは任意選択で塩基対合しており、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、２’デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在し得るプリンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、任意選択で３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは、任意選択で標的ＲＮＡ配列に相補的であり、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在し得るプリンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。修飾ヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合を「ｓ」で示し、これは、任意選択で、センス鎖とアンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを連結するものである。 図２Ｃ：センス鎖は、５’−および３’末端キャップを有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは任意選択で塩基対合しており、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、任意選択で３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは、任意選択で標的ＲＮＡ配列に相補的であり、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである。修飾ヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合を「ｓ」で示し、これは、任意選択で、アンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを連結するものである。 図２Ｄ：センス鎖は、５’−および３’末端キャップを有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは任意選択で塩基対合しており、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在し得るプリンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、任意選択で３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは、任意選択で標的ＲＮＡ配列に相補的であり、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在し得るプリンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。修飾ヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合を「ｓ」で示し、これは、任意選択で、アンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを連結するものである。 図２Ｅ：センス鎖は、５’−および３’末端キャップを有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは任意選択で塩基対合しており、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、任意選択で３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは、任意選択で標的ＲＮＡ配列に相補的であり、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在し得るプリンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである。修飾ヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合を「ｓ」で示し、これは、任意選択で、アンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを連結するものである。 図２Ｆ：センス鎖は、５’−および３’末端キャップを有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは任意選択で塩基対合しており、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在し得るプリンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、任意選択で３’末端グリセリル部分を有する２１個のヌクレオチドを含み、２つの末端３’−ヌクレオチドは、任意選択で標的ＲＮＡ配列に相補的であり、また、１つの３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有し、存在し得るピリミジンヌクレオチドはすべて、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在し得るプリンヌクレオチドはすべて、（ＮＮ）ヌクレオチド（これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基または本明細書に記載の他の化学修飾を含むものであり得る）以外、２’−デオキシヌクレオチドである。修飾ヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）または本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合を「ｓ」で示し、これは、任意選択で、アンチセンス鎖内の（ＮＮ）ヌクレオチドを連結するものである。 図３Ａ〜Ｆは、本発明の具体的な化学修飾されたｓｉＮＡ配列の非限定的な例を示す。Ａ〜Ｆは、図２Ａ〜Ｆに示した化学修飾を、例示的なＳＴＡＴ１ ｓｉＮＡ配列に適用したものである。かかる化学修飾は、任意のＳＴＡＴ１配列に適用され得る。さらに、これは図３に図示していないが、図３に示す配列は、任意選択で、センス鎖の５’端から９番目の位置、またはガイド鎖の５’端を基準にすると１１番目（ガイド鎖の５’末端から１１のヌクレオチド位置を数える）の位置にリボヌクレオチドを含むものであってもよい（図４Ｃ参照）。また、図３に示す配列は、任意選択で、アンチセンス鎖の５’端の約６つまでの位置に末端リボヌクレオチド（例えば、アンチセンス鎖の５’端に約１、２、３、４、５、または６個の末端リボヌクレオチド）を含むものであってもよい。 本発明の種々のｓｉＮＡ構築物の非限定的な例を示す。 図４Ａに示す例（構築物１、２および３）は、１９個の代表的な塩基対を有するものである；しかしながら、本発明の種々の実施形態は、本明細書に記載の任意の数の塩基対を含むものである。括弧内の領域は、例えば、約１、２、３または４ヌクレオチド長（好ましくは、約２個のヌクレオチド）のヌクレオチド突出部を表す。構築物１および２は、独立して、ＲＮＡｉ活性に使用され得る。構築物２は、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー（任意選択で生分解性リンカーとして設計され得る）を含むものであってもよい。一実施形態において、構築物２に示したループ構造は、インビボおよび／またはインビトロで構築物１の形成をもたらす生分解性リンカーを含むものであってもよい。別の例では、同じ原理で構築物３を用いて構築物２が作製され得、この場合、リンカーの使用により、活性ｓｉＮＡ構築物２がインビボおよび／またはインビトロで生成され、該構築物２には、任意選択で、インビボおよび／またはインビトロで活性ｓｉＮＡ構築物１を生成させるための別の生分解性リンカーが使用されていてもよい。そのため、ｓｉＮＡ構築物の安定性および／または活性は、インビボまたはインビトロおよび／またはインビトロで使用するためのｓｉＮＡ構築物の設計に基づいてモジュレートされ得る。 図４Ｂに示す例は、一部相補性に起因する突出部、***部、ループ、および幹部−ループを含むものであり得る本発明の異なる型の二本鎖核酸分子（マイクロＲＮＡなど）を表す。***部、ループ、および幹部−ループを有するかかるモチーフは、一般的に、ｍｉＲＮＡの特徴である。***部、ループ、および幹部−ループは、任意の一部相補性度合いに起因するものであり得る（本発明の二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖内の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のヌクレオチドのミスマッチまたは***部など）。 図４Ｃに示す例は、二ヌクレオチド３’−突出部を有する２１個のヌクレオチドの２つの配列の１９塩基対の二本鎖を含む本発明のモデル二本鎖核酸分子を表す。上側の鎖（１）はセンス鎖（パッセンジャー鎖）を表し、真ん中の鎖（２）はアンチセンス（ガイド鎖）を表し、下側の鎖（３）は標的ポリヌクレオチド配列を表す。二ヌクレオチド突出部（ＮＮ）は、標的ポリヌクレオチドに由来する配列を含むものであり得る。例えば、ガイド鎖の３’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列に相補的であり得る。また、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列と同じ配列を含むものであり得る。他の実施形態では、突出部（ＮＮ）は、標的ポリヌクレオチド配列に由来するものでなく、例えば、ガイド鎖の３’−（ＮＮ）配列は標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列に相補的でなく、パッセンジャー鎖の５’−（ＮＮ）配列は、標的ポリヌクレオチドの５’−［ＮＮ］配列と異なる配列を含むものであり得る。さらなる実施形態において、任意の（ＮＮ）ヌクレオチドは化学修飾されたもの、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、および／または本明細書の他の修飾体である。さらに、パッセンジャー鎖は、パッセンジャー鎖のＮ位にリボヌクレオチドを含むものであってもよい。図示した代表的な１９塩基対合２１量体二本鎖は、Ｎ位がパッセンジャー鎖の３’端から９ヌクレオチドであり得る。しかしながら、異なる長さの二本鎖では、Ｎ位は、ガイド鎖の５’端を基準にしてガイド鎖の５’末端から１１のヌクレオチド位置を数え、パッセンジャー鎖内の対応する塩基対合ヌクレオチドを探す（ｐｉｃｋ）ことにより決定される。Ａｇｏ２による切断は、矢印で示した１０位と１１位との間で起こる。さらなる実施形態では、ガイド鎖の５’端を基準にして１０位と１１位（ガイド鎖の５’末端から１０および１１のヌクレオチド位置を数え、パッセンジャー鎖内の対応する塩基対合ヌクレオチドを探す）に、２つのリボヌクレオチドＮＮが存在する。 例えば、本発明のｓｉＮＡ配列の５’端および／または３’端を安定化させるため使用され得る種々の安定化化学構造（１〜１０）の非限定的な例、例えば、（１）［３−３’］−逆位デオキシリボース；（２）デオキシリボヌクレオチド；（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド；（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３’−グリセリル；（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド；および（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチドを示す。図に示した修飾型および非修飾型の主鎖化学構造に加え、このような化学構造は、本明細書に記載の種々の糖鎖および塩基ヌクレオチドの修飾と組み合わされ得る。 ヌクレアーゼ抵抗性であるが、ＲＮＡｉ活性を媒介する能力は保持している本発明の化学修飾されたｓｉＮＡ構築物を同定するために使用されるストラテジーの非限定的な一例を示す。化学修飾はｓｉＮＡ構築物内に、知識に基づいた設計パラメータに基づいて導入される（例えば、２’−修飾、塩基修飾、主鎖修飾、末端キャップ修飾などが導入される）。修飾型構築物は、適切な系（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性についてはヒト血清（表示）、またはＰＫ／送達パラメータについては動物モデル）において試験される。並行して、ｓｉＮＡ構築物はＲＮＡｉ活性について、例えば、細胞培養系において試験される（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）。次いで、特定の特徴を有するがＲＮＡｉ活性は保持しているリードｓｉＮＡ構築物が特定され、さらに修飾され、もう一度アッセイされ得る。この同じ手法を用いて、改善された薬物動態学的プロフィール、送達およびＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ−コンジュゲート分子が特定され得る。 線状および二本鎖構築物ならびにその非対称誘導体を含む、本発明のリン酸化ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。 本発明の化学修飾された末端リン酸基の非限定的な例を示す。 本発明のコレステロールコンジュゲート型ｓｉＮＡ分子を合成するために使用され得るコレステロール連結ホスホルアミダイトの非限定的な一例を示す。コレステロール部分がｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’端に連結された一例を示す。 ５’および３’逆位無塩基キャップが核酸鎖に連結された一実施形態を示す。
Ａ．用語および定義
本出願書類で用いる場合、以下の専門用語および定義を適用する。
用語「無塩基の」は、糖鎖部分の１’位において、核酸塩基が欠失した、または核酸塩基の代わりに水素原子（Ｈ）もしくは他の非核酸塩基化学基を有する糖鎖部分を指す。例えば、Ａｄａｍｉｃら，米国特許第５，９９８，２０３号を参照のこと。一実施形態において、本発明の無塩基部分は、リボース、デオキシリボーズ、またはジデオキシリボース糖類である。
用語「非環式ヌクレオチド」は、本明細書で用いる場合、非環式リボース糖鎖を有する任意のヌクレオチド、例えば、リボースの炭素／炭素結合または炭素／酸素結合のいずれかが、独立して、または組合せでヌクレオチドに存在しない場合を指す。
用語「アルキル」は、飽和または不飽和の炭化水素、例えば、直鎖、分枝鎖のアルケニル、アルキニル基および環式基を指すが、芳香族基は含まない。前述のことにかかわらず、アルキルはまた、非芳香族の複素環式基を指す。好ましくは、アルキル基は１〜１２個の炭素を有する。より好ましくは、炭素数が１〜７、より好ましくは炭素数が１〜４の低級アルキルである。アルキル基は、置換されていても、非置換であってもよい。置換されている場合、置換されている基（１つまたは複数）は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、＝０、＝Ｓ、ＮＯ２、ＳＨ、ＮＨ２、またはＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルである）である。
用語「アリール」は、共役π電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を指し、炭素環式アリール、複素環式アリールおよびビアリール基（これらはすべて、任意選択で置換されていてもよい）を包含する。アリール基の好ましい置換基（１つまたは複数）は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、ＮＨ２、ならびにＮＲ１Ｒ２基（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＨもしくはＣ１〜Ｃ４アルキルである）である。
用語「アルキルアリール」は、アリール基（上記のもの）に共有結合により連接されたアルキル基（上記のもの）を指す。炭素環式アリール基は、芳香族環上の環内原子がすべて炭素原子である基である。該炭素原子は、任意選択で置換されている。複素環式アリール基は、芳香族環内の環内原子として１〜３個のヘテロ原子を有し、残りの環内原子が炭素原子である基である。好適なヘテロ原子としては、酸素、イオウおよび窒素が挙げられ、かかるヘテロ原子を有する複素環式アリール基の例としては、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル（すべて、任意選択で置換されている）などが挙げられる。好ましくは、該アルキル基はＣ１〜Ｃ４アルキル基である。
用語「アミド」は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒを指し、式中、Ｒは、アルキル、アリール、アルキルアリールまたは水素のいずれかである。
語句「アンチセンス領域」は、標的核酸配列に相補性を有するｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。また、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、任意選択で、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に相補性を有する核酸配列を含むものであってもよい。一実施形態において、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域をアンチセンス鎖またはガイド鎖と称する。
語句「非対称ヘアピン」は、アンチセンス領域と、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドが含まれ得るループ部分と、センス領域とを含み、センス領域が、アンチセンス領域と塩基対合してループを有する二本鎖を形成するのに充分な相補ヌクレオチドを有する程度に、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む線形ｓｉＮＡ分子を指す。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、細胞またはインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに充分な長さを有するアンチセンス領域（例えば、約１５〜約３０、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド）と、約４〜約１２（例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）個のヌクレオチドを含むループ領域と、アンチセンス領域に相補的である約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）個のヌクレオチドを有するセンス領域とを含むものであり得る。また、非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、５’末端リン酸基（化学修飾されていてもよい）を含むものであってもよい。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分には、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、または本明細書に記載のコンジュゲート分子が含まれ得る。
用語「生分解性の」は、生物学的系における分解、例えば、酵素的分解または化学的分解を指す。
用語「生分解性リンカー」は、ある分子を別の分子に、例えば、生物学的に活性な分子を、本発明のｓｉＮＡ分子または本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖に連結させるために設計された、生分解性の核酸または非核酸リンカー分子を指す。生分解性リンカーは、その安定性が具体的な目的（特定の組織または細胞型への送達など）のためにモジュレートされ得るように設計される。核酸系生分解性リンカー分子の安定性は、種々の化学構造（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ならびに化学修飾されたヌクレオチド（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、および他の２’−修飾または塩基修飾ヌクレオチドなど）の組合せを使用することによりモジュレートされ得る。生分解性核酸リンカー分子は、二量体、三量体、四量体またはそれより長い核酸分子、（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド）であってもよく、リン系結合（例えば、ホスホロアミダートまたはホスホジエステル結合）を有する単一ヌクレオチドを含むものであってもよい。また、生分解性核酸リンカー分子は、核酸主鎖、核酸糖鎖、または核酸塩基に修飾を含むものであってもよい。
語句「生物学的に活性な分子」は、系内の生物学的応答を誘起もしくは変更し得る、 および／または他の生物学的に活性な分子の薬物動態特性および／または薬力学的特性をモジュレートし得る化合物または分子を指し、生物学的に活性な分子の非限定的な例としては、単独、または他の分子（例えば限定されないが、治療上活性な分子、例えば、抗体、コレステロール、ホルモン、抗ウイルス薬、ペプチド、タンパク質、化学療法薬、小分子、ビタミン類、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素性核酸、アンチセンス核酸、オリゴヌクレオチドを形成する三重鎖、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、他のポリエーテル、２−５Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイおよびその類似体など）との組合せのｓｉＮＡ分子が挙げられる。
語句「生物学的系」は、生物学的供給源、例えば、限定されないがヒトまたは動物由来の精製または未精製形態の物質を指し、該系は、ＲＮＡｉ活性に必要とされる成分を含む。したがって、この語句は、例えば、細胞、組織、被検体、もしくは生物体、またはその抽出物を包含する。また、該用語は、生物学的供給源由来の再構成された物質を包含する。
語句「平滑端」は、突出ヌクレオチドを有しない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を指す。二本鎖ｓｉＮＡ分子の２つの鎖は、末端でヌクレオチドが突出することなく、互いに一直線に並んでいる。
用語「キャップ」（本明細書において「末端キャップ」とも称する）は、センス鎖またはアンチセンス鎖いずれかのオリゴヌクレオチドの５’または３’いずれかの末端に組み込まれ得る化学修飾をいう（例えば、Ａｄａｍｉｃら，米国特許第５，９９８，２０３号参照、引用により本明細書に組み込まれる）。このような末端修飾により、核酸分子がエキソヌクレアーゼ分解から保護され、細胞内における送達および／または局在化が補助され得る。キャップは、５’末端に存在させてもよく（５’−キャップ）、３’末端に存在させてもよく（３’−キャップ）、両末端に存在させてもよい。非限定的な例において、５’−キャップとしては、限定されないが、グリセリル、逆位デオキシ無塩基残基（部分）；４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；ｔｈｒｅｏ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分；３’−３’−逆位無塩基部分；３’−２’−逆位ヌクレオチド部分；３’−２’−逆位無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホロアミダート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または橋状結合性もしくは非橋状結合性ホスホン酸メチル部分が挙げられる。３’−キャップの非限定的な例としては、限定されないが、グリセリル、逆位デオキシ無塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−リン酸アルキル；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート；３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；ｔｈｒｅｏ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分；５’−５’−逆位無塩基部分；５’−ホスホロアミダート；５’−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；橋状結合性および／または非橋状結合性５’−ホスホロアミダート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、橋状結合性または非橋状結合性ホスホン酸メチルならびに５’−メルカプト部分が挙げられる（さらなる詳細については、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９，１９２５を参照のこと；引用により本明細書に組み込まれる）。図５は、種々のキャップの非限定的な例の一部を示す。
用語「細胞」は、その通常の生物学的意味で用いており、多細胞生物体全体を指すのではない（例えば、具体的には、人間を指すのではない）。細胞は、生物体、例えば、鳥類、植物および哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ、およびネコに存在するものであり得る。細胞は、原核生物系（例えば、細菌細胞）であっても真核生物系（例えば、哺乳動物または植物の細胞）であってもよい。細胞は、体細胞起源または生殖細胞系起源、全能性または多能性、***性または非***性であり得る。また、細胞は、生殖体もしくは胚、幹細胞または完全に分化した細胞に由来するものであってもよく、これらを含むものであってもよい。
語句「化学修飾」は、天然のｓｉＲＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチドと異なるヌクレオチド化学構造の任意の修飾を指す。用語「化学修飾」は、本明細書に記載の、あるいは当該技術分野で知られているような、糖鎖、塩基またはヌクレオチド間結合における天然のｓｉＲＮＡまたはＲＮＡの付加、置換または修飾を包含する。本発明の核酸分子と適合性である化学修飾の非限定的な例については、例えば、ＵＳＳＮ １２／０６４，０１４を参照のこと。
用語「相補性」は、ある核酸配列と別の核酸配列との間での、従来のワトソン−クリック型または本明細書に記載の他の非従来型の結合のいずれかによる水素結合（１つまたは複数）の形成を指す。本発明の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）分子に関連して、核酸分子のその相補配列との結合自由エネルギーは、該核酸の関連機能（例えば、ＲＮＡｉ活性）が進行するのを可能にするのに充分なものである。核酸分子の結合自由エネルギーの測定は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒら，１９８７，ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒら，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照のこと）。完全に相補的とは、核酸配列の連続している残基のすべてが、第２の核酸配列内の同じ数の連続している残基と水素結合することを意味する。一部相補性は、核酸分子のセンス鎖もしくはセンス領域とアンチセンス鎖もしくはアンチセンス領域間、または核酸分子と対応する標的核酸分子のアンチセンス鎖間もしくはアンチセンス領域間に生成される***部、ループまたは突出部をもたらし得る、種々のミスマッチまたは非塩基対合ヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれ以上のミスマッチまたは非塩基対合ヌクレオチド）を核酸分子内に含むものであり得る。
用語「遺伝子」または語句「標的遺伝子」は、ポリペプチドの生成に必要なコード配列の一部の長さ部分または全長を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。また、遺伝子または標的遺伝子は、機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）または非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えば、小分子（ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびその前駆体ＲＮＡをコードするものであり得る。かかる非コードＲＮＡは、機能性または調節性細胞プロセスに関与しているｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性のモジュレーションにおいて、ｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡ干渉の標的核酸分子の機能を果たし得る。したがって、疾患をもたらす異常なｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性は、本発明のｓｉＮＡ分子によってモジュレートされ得る。また、ｆＲＮＡおよびｎｃＲＮＡを標的化するｓｉＮＡ分子は、遺伝子（ｇｅｎｅｔｉｃ）インプリンティング、転写、翻訳、または核酸プロセッシング（例えば、アミノ基転移、メチル化など）などの細胞プロセスに介在することにより、被検体、生物体または細胞の遺伝子型または表現型を操作または改変するために使用され得る。標的遺伝子は、細胞に由来する遺伝子、内因性遺伝子、導入遺伝子、または感染後の細胞内に存在する外因性遺伝子（病原体、例えば、ウイルスの遺伝子など）であり得る。標的遺伝子を含む細胞は、任意の生物体、例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌または真菌に由来するもの、またはこれらに含有されているものであり得る。植物の非限定的な例としては、単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物が挙げられる。動物の非限定的な例としては、脊椎動物または非脊椎動物が挙げられる。真菌の非限定的な例としては、カビまたは酵母が挙げられる。概説については、例えば、ＳｎｙｄｅｒおよびＧｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，２５８−２６０を参照のこと。
語句「相同配列」は、１種類以上のポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、遺伝子転写物および／または非コードポリヌクレオチドなどによって共有されたヌクレオチド配列を指す。例えば、相同配列は、関連するが異なるタンパク質（遺伝子ファミリーの異なる構成員、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォームなど）をコードする２種類以上の遺伝子によって共有された、あるいは、完全に相違する遺伝子（サイトカインとその対応する受容体など）によって共有されたヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、２種類以上の非コードポリヌクレオチド、例えば、非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、調節配列、イントロン、および転写制御または調節部位などによって共有されたヌクレオチド配列であってもよい。また、相同配列は、１つより多くのポリヌクレオチド配列によって共有された配列領域を含むものであり得る。相同性は、完全に同一（１００％）である必要はなく、一部相同配列も、本発明の範囲であることが想定され、本発明の範囲に含まれる（例えば、少なくとも９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％など）。相同性の割合は、２つの配列間でマッチしているヌクレオチドの数を比較対象の全長で除算し、１００を乗算したものである。
語句「改善されたＲＮＡｉ活性」は、インビトロおよび／またはインビボで測定されたＲＮＡｉ活性の増大を指し、該ＲＮＡｉ活性は、ｓｉＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力および本発明のｓｉＮＡの安定性の両方を反映している。本発明において、このような活性の生成は、全ＲＮＡ ｓｉＲＮＡまたは複数のリボヌクレオチドを含有するｓｉＮＡと比べて、インビトロおよび／またはインビボで高いものであり得る。一部の場合では、ｓｉＮＡ分子の活性または安定性は、低下している（すなわち、１０倍未満である）ことがあり得るが、ｓｉＮＡ分子の全体的な活性はインビトロおよび／またはインビボで向上している。
用語「阻害する」、「下方調節」、または「低減させる」は、遺伝子の発現、または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性を、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で観察されるものよりも低下させることを指す。また、下方調節は、転写後サイレンシング（ＲＮＡｉ媒介性切断など）と関連しているもの、またはＤＮＡのメチル化パターンもしくはＤＮＡのクロマチン構造の改変によるものであり得る。ｓｉＮＡ分子による阻害、下方調節または低減は、不活性な分子、弱毒化分子、スクランブル配列を有するｓｉＮＡ分子、またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子に関するものであってもよく、あるいはまた、核酸の非存在下での系に関するものであってもよい。
用語「哺乳動物の」または「哺乳動物」は、任意の温血脊椎動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜動物などを指す。
語句「定量吸入器」またはＭＤＩは、缶、該缶に蓋をするねじ込み式キャップおよび該キャップに配設された製剤を計量する弁を備えたユニットを指す。ＭＤＩ系としては、適切なチャネル付（ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ）デバイスが挙げられる。好適なチャネル付デバイスは、例えば、弁作動器と、医薬が、充填されたキャニスターから計量弁によって患者の鼻または口に送達され得る柱状路または円錐様路とを含むものである（マウスピース型作動器）。
用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、標的メッセンジャーＲＮＡの発現を、ｍＲＮＡの切断、翻訳の抑制／阻害または異質染色質サイレンシングのいずれかによって調節する小さい二本鎖ＲＮＡを指す（例えば、Ａｍｂｒｏｓ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ，４３１，３５０−３５５；Ｂａｒｔｅｌ，２００４，Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｃｕｌｌｅｎ，２００４，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１０２，３−９；Ｈｅら，２００４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５，５２２−５３１；Ｙｉｎｇら，２００４，Ｇｅｎｅ，３４２、２５−２８；およびＳｅｔｈｕｐａｔｈｙら，２００６、ＲＮＡ、１２：１９２−１９７を参照のこと）。
用語「モジュレートする」は、遺伝子の発現、または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性を、該発現、レベルまたは活性が、モジュレータの非存在下で観察されるものよりも大きくなるように、または小さくなるように上方調節または下方調節することを意味する。例えば、用語「モジュレートする」は「阻害する」ことを意味することがあり得るが、文言「モジュレートする」の使用は、この定義に限定されない。
語句「修飾ヌクレオチド」は、非修飾の（または天然）ヌクレオチドの塩基、糖鎖および／またはリン酸基の化学構造内に修飾を含むヌクレオチドを指す。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書およびＵＳＳＮ １２／０６４，０１４に記載されている。
語句「塩基対合されていない」は、二本鎖ｓｉＮＡ分子センス鎖またはセンス領域と、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域とが塩基対合されていないヌクレオチドを指し、例えば限定されないが、ミスマッチ、突出部、一本鎖ループなどが挙げられ得る。
用語「非ヌクレオチド」は、核酸鎖内の１つ以上のヌクレオチド単位の部分に組み込まれ得る任意の基または化合物（無塩基部分など）を指す。該基または化合物は、一般的に認識されているヌクレオチド塩基（アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなど）を含有しておらず、したがって、１’位に核酸塩基がないと指す点で「無塩基」である。
用語「ヌクレオチド」は、当該技術分野で認識されているとおりに用いる。ヌクレオチドは、一般的に、塩基、糖鎖、およびリン酸基部分を含む。塩基は、天然（標準）塩基であっても修飾塩基であってもよく、これらは、当該技術分野でよく知られている。かかる塩基は、一般的に、ヌクレオチドの糖鎖部分の１’位に存在している。また、ヌクレオチドは非修飾であってもよく、糖鎖、リン酸基および／または塩基部分が修飾されていてもよい（互換的にヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドなどとも称される；例えば、ＵＳＳＮ １２／０６４，０１４参照のこと）。
用語「突出部」は、二本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の２つの鎖が塩基対合されていない末端部分を指す（例えば、図４を参照のこと）。
用語「非経口」は、消化管以外の様式で投与されることを指し、皮膚上、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、または髄腔内注射または注入技法などが挙げられる。
語句「経路標的」は、遺伝子の発現または活性の経路に関与している任意の標的を指す。例えば、任意の所与の標的は、生物学的経路の上流、下流または変更遺伝子が含まれ得る関連経路標的を有することがあり得る。このような経路標的遺伝子により、本明細書における疾患、病状および形質の処置において相加的または相乗的効果がもたらされ得る。
「医薬組成物」または「医薬用製剤」は、細胞または被検体（例えば、ヒトなど）への投与（例えば、全身性または局所投与）に適した形態の組成物または製剤を指す。好適な形態は、一部において、用途または進入経路（例えば、経口、経皮、吸入もしくは注射）に依存する。かかる形態は、該組成物または製剤が標的細胞（すなわち、負電荷を有する核酸が送達に望ましい細胞）に達するのを妨げないものであるのがよい。例えば、血流中に注射される医薬組成物は、可溶性であるのがよい。他の要素は、当該技術分野で知られており、毒性および組成物または製剤の奏功を妨げる形態などの考慮が挙げられる。本明細書で用いる場合、医薬用製剤は、ヒト使用および獣医学的使用のための製剤を包含する。本発明の核酸分子を含む製剤に適した薬剤の非限定的な例としては、Ｐ−糖タンパク質阻害薬（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｐ８５など）；生分解性ポリマー（徐放送達のためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフィアなど（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦら，１９９９，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８））；および負荷ナノ粒子（ポリブチルシアノアクリレートで構成されたもの）が挙げられる。本発明の核酸分子の送達ストラテジーの他の非限定的な例としては、Ｂｏａｄｏら，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５；Ｔｙｌｅｒら，１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，１９９５，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７；Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａら，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；およびＴｙｌｅｒら，１９９９，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載された物質が挙げられる。「薬学的に許容され得る組成物」または「薬学的に許容され得る製剤」は、その所望の活性に最も適した身***置での本発明の核酸分子の有効な分布を可能にする組成物または製剤をいう。
用語「ホスホロチオエート」は、酸素原子の代わりに１個以上のイオウ原子を含むヌクレオチド間リン酸結合を指す。したがって、ホスホロチオエートと指す用語は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合と、ホスホロジチオエートヌクレオチド間結合の両方を指す。
用語「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。
用語「ＲＮＡ」は、少なくとも１つのリボフラノシド部分を含む分子を指す。該用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば、一部精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え作製されたＲＮＡ、ならびに天然に存在するＲＮＡと１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって異なる改変ＲＮＡを包含する。かかる改変としては、ｓｉＮＡの末端（１つまたは複数）または例えば、該ＲＮＡの１つ以上の内部ヌクレオチドなどへの非ヌクレオチド物質の付加が挙げられ得る。また、本発明のＲＮＡ分子内のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含むものであってもよい。このような改変ＲＮＡは、類似体または天然ＲＮＡの類似体と称されることがあり得る。
語句「ＲＮＡ干渉」または用語「ＲＮＡｉ」は、細胞内での遺伝子発現を阻害または下方調節する生物学的プロセスを指し、これは、当該技術分野で一般的に知られており、低分子干渉核酸分子によって媒介される。例えば、ＺａｍｏｒｅおよびＨａｌｅｙ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，１５１９−１５２４；ＶａｕｇｈｎおよびＭａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ，２００５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，−１５２６−１５２６；Ｚａｍｏｒｅら，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；ならびにＫｒｅｕｔｚｅｒら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第００／４４８９５号；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第０１／３６６４６号；Ｆｉｒｅ、ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第９９／３２６１９号；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第００／０１８４６号；Ｍｅｌｌｏ ａｎｄ Ｆｉｒｅ、ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第０１／２９０５８号；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ、ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第９９／０７４０９号；およびＬｉら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第００／４４９１４号；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；ならびにＨａｌｌら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；ＨｕｔｖａｇｎｅｒおよびＺａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓら，２００２、ＲＮＡ、８、８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔら，２００２、Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；ならびにＲｅｉｎｈａｒｔ ＆ Ｂａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１）を参照のこと。また、ＲＮＡｉという用語は、配列特異的ＲＮＡ干渉を指すために使用される他の用語、例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、または後成的などと等価であることを意図する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、転写後レベルまたは転写前レベルのいずれかで、後成的な遺伝子のサイレンシングを行なうために使用され得る。非限定的な一例において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的モジュレーションは、遺伝子発現を改変するためのクロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＮＡ媒介性修飾の結果、起こるものであり得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａら，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；およびＨａｌｌら，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照のこと）。別の非限定的な例では、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現のモジュレーションは、ＲＩＳＣまたは翻訳阻害によるＲＮＡ（コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡのいずれか）のｓｉＮＡ媒介性切断の結果、起こるものであり得るか（当該技術分野で知られている）、あるいは、モジュレーションは、転写阻害の結果、起こるものであり得る（例えば、Ｊａｎｏｗｓｋｉら，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，２１６−２２２を参照のこと）。
語句「ＲＮＡｉ阻害薬」は、細胞または生物体において、ＲＮＡ干渉性の機能または活性を下方調節、低減または阻害し得る任意の分子を指す。ＲＮＡｉ阻害薬は、ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介性切断、翻訳阻害、もしくは転写のサイレンシング）を、ＲＮＡｉ経路の任意の成分、例えば、ＲＩＳＣなどのタンパク質成分またはｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡなどの核酸成分の機能との相互作用によって、または該機能に干渉することによって下方調節、低減または阻害し得る。ＲＮＡｉ阻害薬は、ｓｉＮＡ分子、アンチセンス分子、アプタマー、またはＲＩＳＣの機能と相互作用する、もしくは該機能に干渉する小分子、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡまたは細胞もしくは生物体のＲＮＡｉ経路の任意の他の成分であり得る。ＲＮＡｉ（例えば、標的ポリヌクレオチドのＲＮＡｉ媒介性切断、翻訳阻害、または転写のサイレンシング）を阻害することにより、本発明のＲＮＡｉ阻害薬は、標的遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、上方調節または下方調節する）ために使用され得る。
語句「センス領域」は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に相補性を有する該ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。また、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を有する核酸配列を含むものであり得る。また、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、センス鎖またはパッセンジャー鎖と称されることもあり得る。
語句「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド 分子」、または「化学修飾された低分子干渉核酸分子」は、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを配列特異的様式で媒介することにより、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方調節し得る任意の核酸分子を指す。これらの用語は、個々の核酸分子、複数のかかる核酸分子、またはかかる核酸分子のプールのいずれも示すものであり得る。ｓｉＮＡは、自己相補性のセンス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子であって、アンチセンス鎖が、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖が、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸分子であり得る。ｓｉＮＡは、二本鎖、非対称二本鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有し、自己相補性のセンス領域とアンチセンス領域を有するポリヌクレオチドであって、アンチセンス領域が、別個の標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域が、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。ｓｉＮＡは、２つ以上のループ構造と、自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域を含む幹部とを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドであって、アンチセンス領域が、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域が、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含み、該環状ポリヌクレオチドがインビボまたはインビトロのいずれかでプロセッシングされると、ＲＮＡｉを媒介し得る活性なｓｉＮＡ分子が生成され得る環状の一本鎖ポリヌクレオチドであってもよい。また、ｓｉＮＡは、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含むものであってもよく（例えば、かかるｓｉＮＡ分子が、該ｓｉＮＡ分子内に標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない場合）、該一本鎖ポリヌクレオチドは、さらに、末端リン酸基、例えば、５’−リン酸基（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４およびＳｃｈｗａｒｚら，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，１０，５３７−５６８を参照のこと）、または５’，３’−二リン酸基などを含んでいてもよい。
用語「ＳＴＡＴ１」は、シグナル伝達性転写因子１の遺伝子、またはＳＴＡＴ１タンパク質、ＳＴＡＴ１ペプチド、ＳＴＡＴ１ポリペプチドをコードする遺伝子、ＳＴＡＴ１調節ポリヌクレオチド（例えば、ＳＴＡＴ１ ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）、変異型ＳＴＡＴ１遺伝子、およびＳＴＡＴ１遺伝子のスプライスバリアント、ならびに遺伝子の発現および／または活性のＳＴＡＴ１経路に関与している他の遺伝子をいう。したがって、用語「ＳＴＡＴ１」が言及された本明細書に記載の各実施形態は、本明細書において定義する用語である用語「ＳＴＡＴ１」に包含されるタンパク質、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド分子すべてに適用可能である。また、包括的に、かかる遺伝子標的を、本明細書では、一般的に「標的」配列（表１０を含む）とも称する。
用語「被検体」は、本発明の核酸分子が投与され得る生物体を指す。被検体は、哺乳動物または哺乳動物細胞（例えば、ヒトまたはヒト細胞）であり得る。また、該用語は生物体を指し、これは、採取された細胞のドナーもしくはレシピエントまたは細胞それ自体である。
語句「全身性投与」は、インビボでの全身性吸収、または血流中での薬物の蓄積後の全身への分布を指す。
用語「標的」は、ＳＴＡＴ１に言及している場合、任意のＳＴＡＴ１標的タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド（表１０に示したＧｅｎｂａｎｋ受託番号にコードされているものなど）をいう。また、該用語は、任意の標的タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド（表１０に示したＧｅｎｂａｎｋ受託番号を有する配列にコードされているタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドなど）をコードする核酸配列または標的ポリヌクレオチド配列も示す。対象の配列としては、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡなどの標的ポリヌクレオチド配列が挙げられ得る。また、用語「標的」は、種々のアイソフォーム、変異型標的遺伝子、標的ポリヌクレオチドのスプライスバリアント、標的多型、および非コード配列（例えば、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓＲＮＡ）または本明細書に記載の他の調節ポリヌクレオチド配列などの他の配列を包含することを意図する。
語句「標的部位」は、ｓｉＮＡ構築物によって媒介される切断のために「標的化される」標的ＲＮＡ内の配列であって、アンチセンス領域内の該標的配列に相補的な配列を含む配列を指す。
語句「治療有効量」は、細胞、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答が誘起される該化合物または医薬組成物の量であって、研究者、獣医、医師または他の臨床家が求める量を指す。
語句「ユニバーサル塩基」は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の各々と、互いの間にほとんど区別なく塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を指す。ユニバーサル塩基の非限定的な例としては、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびにニトロアゾール誘導体（３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールなど）が挙げられ、当該技術分野で知られている（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照のこと）。
語句「非修飾ヌクレオシド」は、β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に連接された塩基、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシルのうちの１つを指す。
用語「上方調節する」は、遺伝子の発現、または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１種類以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ）の非存在下で観察されるものよりも上に増大することを指す。一部の特定の場合では、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方調節または促進は、不活性分子または減弱分子の存在下で観察されるレベルより上である。他の場合では、ｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の上方調節または促進は、例えば、スクランブル配列またはミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観察されるレベルより上である。さらに他の場合では、本発明の核酸分子による遺伝子発現の上方調節または促進は、該核酸分子の存在下での方が、その非存在下よりも大きい。一部の場合では、遺伝子発現の上方調節または促進は、上方調節の対象遺伝子の発現を下方調節、阻害またはサイレンシングするコードまたは非コードＲＮＡ標的のＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ媒介性の切断またはサイレンシングなど）の阻害と関連している。遺伝子発現の下方調節は、例えば、コードＲＮＡまたはそのコードタンパク質によって、例えば、負のフィードバック効果またはアンタゴニスト効果などによって誘導され得る。遺伝子発現の下方調節は、例えば、対象遺伝子に対して調節的制御を有する非コードＲＮＡによって、例えば、翻訳阻害、クロマチン構造、メチル化、ＲＩＳＣ媒介性ＲＮＡ切断または翻訳阻害による該遺伝子の発現のサイレンシングによって誘導され得る。そのため、対象遺伝子を下方調節、抑制またはサイレンシングする標的の阻害または下方調節は、治療的使用のための対象遺伝子の発現を上方調節するために使用され得る。
用語「ベクター」は、所望の核酸を送達するために使用される任意の核酸系および／またはウイルス系の手法を指す。
Ｂ．本発明のｓｉＮＡ分子
本発明は、ＳＴＡＴ１と関連している疾患（例えば、呼吸器系疾患または炎症性疾患）を処置するために使用され得る、ＳＴＡＴ１に標的化されるｓｉＮＡを含む組成物および方法を提供する。本発明の具体的な態様および実施形態において、本発明の核酸分子は、表１ａ〜１ｂおよび／または図２〜３に示す配列を含む。該ｓｉＮＡは、いくつかの形態で提供され得る。例えば、該ｓｉＮＡは、１種類以上のｓｉＮＡ化合物として単離されたものであり得、あるいはＤＮＡプラスミド内の転写カセットの形態であってもよい。また、該ｓｉＮＡは、化学合成されたものであってもよく、修飾を含むものであり得る。該ｓｉＮＡは、単独で投与してもよく、他のｓｉＮＡ分子またはＳＴＡＴ１関連疾患もしくは病状を処置する慣用的な薬剤と共投与してもよい。
本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ転写物との相互作用によって、あるいは特定の遺伝子配列との相互作用によって（この場合、かかる相互作用により、転写レベルもしくは転写後レベルのいずれかで遺伝子サイレンシングがもたらされる（例えば、限定されないが、ＲＮＡｉなど）、または標的のクロマチン構造またはメチル化パターンをモジュレートし、標的のヌクレオチド配列を有する標的遺伝子の転写を抑制し、それにより、サイレンシングが媒介される細胞プロセスによって、遺伝子の、具体的にはＳＴＡＴ１のサイレンシングを媒介するために使用され得る。より具体的には、標的は、ＳＴＡＴ１ ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはその一部分のいずれかである。
一態様において、本発明は、互いに相補性を有する第１鎖と第２鎖を含み、該鎖の少なくとも一方が、
５’− ＣＣＵＡＣＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＵ −３’ （配列番号：６）；
５’− ＡＧＵＵＣＵＵＵＣＵＵＣＧＵＧＵＡＧＧ −３’ （配列番号：１００）；
５’− ＧＣＵＵＧＡＣＡＡＵＡＡＧＡＧＡＡＡＧ −３’ （配列番号：２２）；
５’− ＣＵＵＵＣＵＣＵＵＡＵＵＧＵＣＡＡＧＣ −３’ （配列番号：１０１）；
５’− ＧＵＡＡＡＧＵＣＡＧＡＡＡＵＧＵＧＡＡ −３’ （配列番号：２３）；
５’− ＵＵＣＡＣＡＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＵＡＣ −３’ （配列番号：１０２）；
５’− ＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＧＵＡＡＵＣＵ −３’ （配列番号：２４）；
５’− ＡＧＡＵＵＡＣＧＣＵＵＧＣＵＵＵＵＣＣ −３’ （配列番号：１０３）；
５’− ＵＵＧＡＣＡＡＵＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡ −３’ （配列番号：２７）；または
５’− ＵＣＣＵＵＵＣＵＣＵＵＡＵＵＧＵＣＡＡ −３’ （配列番号：１０４）；
の少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドの１個以上が、任意選択で化学修飾されたものである二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
一部の特定の実施形態では、該１５個のヌクレオチドは、ヌクレオチドの連続鎖を形成している。
他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、または配列番号：１０４に対して１個以上のヌクレオチドの欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加を含むものであり得るが、ｓｉＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡｉを媒介するその活性を維持しているものとする。非限定的な一例において、該欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加は、ループまたは***部（ｂｕｌｄｇｅ）、あるいはまた、ウォッブルまたは他の択一的な（非ワトソン−クリック）塩基対をもたらすものであり得る。
このようなｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡの短い二本鎖領域を含むものであり得る。本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、対称または非対称であり得る相補的な２つの相違する個別の鎖、すなわち、２本の一本鎖ＲＮＡ分子を含むものであってもよく、２つの相補部分（例えば、センス領域とアンチセンス領域）が塩基対合しており、かつ１つ以上の一本鎖「ヘアピン」領域（すなわち、ループ）が共有結合していて、例えば、一本鎖低分子ヘアピンポリヌクレオチドまたは環状の一本鎖ポリヌクレオチドになっている１つの一本鎖分子を含むものであってもよい。
リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、非ヌクレオチドリンカーであってもよい。一部の実施形態において、リンカーは非ヌクレオチドリンカーである。一部の実施形態において、本発明のヘアピン型または環状のｓｉＮＡ分子は１つ以上のループモチーフを含み、該ｓｉＮＡ分子のループ部分の少なくとも１つは生分解性である。例えば、本発明の一本鎖ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解によって、１、２、３または４個のヌクレオチドを含む３’末端突出部（３’末端ヌクレオチド突出部など）を有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成され得るように設計される。あるいはまた、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解によって、約２個のヌクレオチドを含む３’末端突出部（３’末端ヌクレオチド突出部など）を有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成され得るように設計される。
本発明の対称ｓｉＮＡ分子において、センス（パッセンジャー）鎖およびアンチセンス（ガイド）鎖の各鎖は、独立して、約１５〜約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０）ヌクレオチド長である。
非対称ｓｉＮＡ分子において、該分子のアンチセンス領域またはアンチセンス鎖は、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長であり、センス領域は、約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長である。
また他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖ヘアピンｓｉＮＡ分子を含むものであり、該ｓｉＮＡ分子は約２５〜約７０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０）ヌクレオチド長である。
さらに他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖の環状ｓｉＮＡ分子を含むものであり、該ｓｉＮＡ分子は約３８〜約７０（例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０）ヌクレオチド長である。
種々の対称性の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ二本鎖は、独立して、約１５〜約４０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０）個の塩基対を含む。
また他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子が非対称である場合、該ｓｉＮＡ分子は、約３〜２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）個の塩基対）を含む。
さらに他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子がヘアピン構造または環状構造である場合、該ｓｉＮＡ分子は、約３〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）個の塩基対を含む。
本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖またはセンス領域およびアンチセンス領域は相補的であり得る。また、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域は、ＳＴＡＴ１標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部分に相補的であり得る。ｓｉＮＡの（ｉｆ）センス鎖またはセンス領域は、ＳＴＡＴ１遺伝子またはその一部分のヌクレオチド配列を含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス領域またはセンス鎖は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域またはアンチセンス鎖の、ＳＴＡＴ１標的ポリヌクレオチド配列（例えば、限定されないが、表１０に示すＧＥＮＢＡＮＫ受託番号に代表される配列など）に相補的である部分に相補的である。
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間に完全な相補性を有する。他の実施形態または同じ実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、対応する標的核酸分子に完全に相補的である。
また他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域とアンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間、あるいはｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と対応する標的核酸分子との間に、一部相補性（すなわち、１００％未満の相補性）を有する。したがって、一部の実施形態では、本発明の二本鎖核酸分子は、一方の鎖に、他方の鎖のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを約１５〜約４０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個）有する。他の実施形態では、該分子は、二本鎖核酸分子のセンス領域に、アンチセンス領域のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを約１５〜約４０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個）有する。また他の実施形態では、本発明の二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖に、その対応する標的核酸分子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを約１５〜約４０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個）有する。
一部の実施形態において、本発明の二本鎖核酸分子は、一方の鎖または領域に、他方の鎖または領域とミスマッチであるか、または塩基対合していないヌクレオチドを１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）有する。他の実施形態では、本発明の二本鎖核酸分子は、各鎖または領域内に、他方の鎖または領域とミスマッチであるか、または塩基対合していないヌクレオチドを１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）有する。
また、本発明は、第１鎖と第６鎖が互いに相補的であり、少なくとも一方の鎖が、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、または配列番号：１０４のポリヌクレオチド配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能であり、該ヌクレオチドはいずれも非修飾であるか、または化学修飾されている、本明細書において上記のものとは別の（ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ）二本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む。
ハイブリダイゼーション技法は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと）。好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ｍｌの剪断処理した変性サケ***ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩のインキュベーション；続いて、０．１×ＳＳＣ中、約６５℃でのフィルターの洗浄が挙げられる。
具体的な一実施形態において、第１鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である約１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個のヌクレオチドを有し、少なくとも一方の鎖は、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、または配列番号：１０４のポリヌクレオチド配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能であり、該ヌクレオチドはいずれも非修飾であるか、または化学修飾されている。
一部の特定の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１〜約４（例えば、約１、２、３または４）個のヌクレオチドの突出部を含む。突出部内のヌクレオチドは、同じヌクレオチドであっても異なるヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態において、突出部は、該二本鎖核酸分子の一方または両方の鎖の３’端に存在する。例えば、本発明の二本鎖核酸分子は、該二本鎖核酸分子のガイド鎖もしくはアンチセンス鎖／領域の３’端、パッセンジャー鎖もしくはセンス鎖／領域の３’端、またはガイド鎖もしくはアンチセンス鎖／領域とパッセンジャー鎖もしくはセンス鎖／領域の両方にヌクレオチドまたは非ヌクレオチド突出部を含むものであり得る。
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の突出部部分を構成するヌクレオチドは、ＳＴＡＴ１標的ポリヌクレオチド配列に基づいた配列を含み、ここで、本発明のｓｉＮＡ分子のガイド鎖もしくはアンチセンス鎖／領域の突出部部分を構成するヌクレオチドは、ＳＴＡＴ１標的ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドに相補的であり得る、および／または本発明のｓｉＮＡ分子のパッセンジャー鎖もしくはセンス鎖／領域の突出部部分を構成するヌクレオチドは、ＳＴＡＴ１標的ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドを含むものであり得る。したがって、一部の実施形態では、突出部は、ＳＴＡＴ１標的ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的な２個のヌクレオチドの突出部を含む。しかしながら、他の実施形態では、突出部は、ＳＴＡＴ１標的ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的でない２個のヌクレオチドの突出部を含む。一部の特定の実施形態では、突出部は、ＳＴＡＴ１標的ポリヌクレオチド配列の一部分に相補的でない３’−ＵＵ突出部を含む。他の実施形態では、突出部は、アンチセンス鎖の３’端にＵＵ突出部、およびセンス鎖の３’端にＴＴ突出部を含む。
３’末端ヌクレオチド突出部を有する本明細書に記載のｓｉＮＡ分子の任意の実施形態において、突出部は、核酸糖鎖の位置、塩基の位置、または主鎖の位置の１つ以上が任意選択で化学修飾されている。本発明の二本鎖核酸（ｓｉＮＡ）分子の突出部部分の修飾ヌクレオチドの、代表的だが限定されない例としては、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノ（ＦＡＮＡ）、４’−チオ、２’−Ｏ−トリフルオロメチル、２’−０−エチル−トリフルオロメトキシ、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシ、ユニバーサル塩基、非環式、または５−Ｃ−メチルヌクレオチドが挙げられる。より好ましい実施形態では、突出部のヌクレオチドは、各々、独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ（ｄｅｘｏｙ）−２−フルオロヌクレオチド、または２’−デオキシリボヌクレオチドである。
また他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑端を有する（すなわち、ヌクレオチド突出部を全くもたない）二本鎖核酸分子を含み、この場合、両方の末端が平滑であるか、あるいはまた、一方の末端が平滑である。一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、アンチセンス鎖の５’端とセンス鎖の３’端は全く突出ヌクレオチドを含まない場合の１つの平滑端を含むものであり得る。別の例では、該ｓｉＮＡ分子は、例えば、アンチセンス鎖の３’端とセンス鎖の５’端は全く突出ヌクレオチドを含まない場合の１つの平滑端を含む。他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、アンチセンス鎖の３’端とセンス鎖の５’端ならびにアンチセンス鎖の５’端とセンス鎖の３’端は全く突出ヌクレオチドを含まない場合の２つの平滑端を含む。
本発明のｓｉＮＡ分子の任意の実施形態または態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、さらに、本明細書に記載のもの、または当該技術分野で知られたものなどのキャップを、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’端、５’端、または３’端と５’端の両方に有するものであり得る。あるいは、ヘアピンｓｉＮＡ分子の場合のように、キャップは、ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドの一方に存在していても両方に存在していてもよい。一部の実施形態において、キャップは、二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の一方または両方の末端に存在する。他の実施形態では、キャップは、アンチセンス（ガイド）鎖の５’端と３’端に存在する。好ましい実施形態では、キャップは、センス鎖の３’端とセンス鎖の５’端に存在する。
かかる末端キャップの代表的だが非限定的な例としては、逆位無塩基ヌクレオチド、逆位デオキシ無塩基ヌクレオチド、逆位ヌクレオチド部分、図５に示す基、グリセリル修飾、アルキルもしくはシクロアルキル基、複素環、またはＲＮＡｉ活性を妨げる任意の他の基が挙げられる。
任意の実施形態の本発明のｓｉＮＡ分子は、５’リン酸末端基を有するものであってもよい。一部の実施形態では、ｓｉＮＡ分子には末端リン酸基がない。
本発明の任意のｓｉＮＡ分子または構築物は、１つ以上の化学修飾を含むものであってもよい。修飾は、インビトロまたはインビボ特性、例えば、安定性、活性、毒性、免疫応答（例えば、インターフェロン応答、炎症性もしくは炎症促進性サイトカイン応答、あるいはＴｏｌｌ様受容体（ＴｌＦ）応答の刺激の抑制）および／またはバイオアベイラビリティなどを改善するために使用され得る。
本出願人は、本明細書において対応する非修飾型または修飾が最小限のｓｉＲＮＡ分子と比べて改善されたＲＮＡｉ活性を有する化学修飾されたｓｉＮＡ分子を説明する。本明細書において開示する化学修飾されたｓｉＮＡモチーフは、非修飾型または修飾が最小限の活性なｓｉＲＮＡと実質的に同様のＲＮＡｉ活性を維持する能力をもたらす（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７−６８８８を参照のこと）と同時に、ヌクレアーゼ抵抗性および治療適用用途における使用に適した薬物動態特性をもたらす。
種々の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は修飾を含み、この場合、センスおよび／またはアンチセンス鎖に存在する任意（例えば、１つ以上または全部）のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである（例えば、１個のヌクレオチドが修飾されているか、または全部のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである）か、あるいはまた、複数（すなわち、１個より多く）のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、化学修飾によって一部修飾されている（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０個のヌクレオチドが修飾されている）。他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、化学修飾によって完全に修飾されている（例えば、１００％修飾されている）、すなわち、該ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを全く含まない。他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドであるヌクレオチドを、少なくとも約８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８個含む。一部の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の１個以上のヌクレオチドが修飾されている。同じ実施形態または他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の１個以上のヌクレオチドが修飾されている。
単一のｓｉＮＡ分子内の化学修飾は同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態において、少なくとも一方の鎖が少なくとも１つの化学修飾を有する。他の実施形態では、各鎖が、同じであっても異なっていてもよい少なくとも１つの化学修飾（例えば、糖鎖、塩基、または主鎖（すなわち、ヌクレオチド間結合）の修飾）を有する。他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも２、３、４、５個またはそれ以上の異なる化学修飾を含む。
本発明における使用に適した化学修飾の非限定的な例は、ＵＳＳＮ １０／４４４，８５３、ＵＳＳＮ １０／９８１，９６６、ＵＳＳＮ １２／０６４，０１４およびこれらに挙げられた参考文献に開示されており、糖鎖、塩基およびリン酸基、非ヌクレオチドの修飾、および／またはその任意の組合せが挙げられる。
種々の実施形態において、二本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在するピリミジンヌクレオチドのほとんどが糖鎖修飾を含む。また他の実施形態では、二本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在するプリンヌクレオチドのほとんどが糖鎖修飾を含む。一部の特定の場合では、プリンとピリミジンは、２’−糖鎖位置において異なる修飾がなされている（すなわち、同じ鎖または異なる鎖の２’−糖鎖位置において、少なくとも１個のプリンは少なくとも１個のピリミジンと異なる修飾を有する）。
本発明のこの態様の一部の特定の具体的な実施形態において、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、または２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）ヌクレオチドである。
本発明のまた他の実施形態では、少なくとも１個のヌクレオチドは、リボ様のＮｏｒｔｈｅｒｎまたはＡ型ヘリックス立体配置を有する（例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ編，１９８４を参照のこと）。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ立体配置を有するヌクレオチドの非限定的な例としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、２’−Ｏ−トリフルオロメチルヌクレオチド、２’−Ｏ−エチル−トリフルオロメトキシヌクレオチド、２’−Ｏ−ジフルオロメトキシ−エトキシヌクレオチド、４’−チオヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。
本発明の一部の特定の実施形態では、センス鎖上の相補領域内のすべてのピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖の相補領域内のすべてのピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｎｄｉｎｅ）ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。一部の特定の実施形態では、センス鎖上の相補領域内のすべてのプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖上の相補領域内のすべてのプリンが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。一部の特定の実施形態では、センス鎖上の相補領域内のすべてのピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり；アンチセンス鎖の相補領域内のすべてのピリミジンヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり；センス鎖上の相補領域内のすべてのプリンヌクレオチドが、２’−デオキシプリンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖上の相補領域内のすべてのプリンが、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。
上記の任意の修飾、またはその組合せ（引用した参考文献のものを含む）が、本発明の任意のｓｉＮＡ分子に適用され得る。
本発明の修飾されたｓｉＮＡ分子は、該ｓｉＮＡ分子内の種々の位置に修飾を含むことができる。一部の実施形態において、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は修飾ヌクレオチドを、該ｓｉＮＡ二本鎖内の内部塩基対合位置に含む。他の実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は修飾ヌクレオチドを、該ｓｉＮＡ分子の非塩基対合領域または突出部領域に含む。また他の実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は修飾ヌクレオチドを、該ｓｉＮＡ分子の末端位置に含む。例えば、かかる末端領域としては、ｓｉＮＡ分子のセンスおよび／またはアンチセンス鎖または領域の３’位および／または５’位が挙げられる。また、本発明の修飾されたｓｉＮＡ分子はいずれも、修飾を、ｓｉＮＡ二本鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖に有し得る。さらに、本発明のｓｉＮＡ分子の化学修飾に関して、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、異なる化学修飾パターンを含むように、１つ以上の化学修飾を有し得る。
一部の特定の実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、種々の化学修飾パターン、例えば、本明細書の「Ｓｔａｂ ００」〜「Ｓｔａｂ ３６」もしくは「Ｓｔａｂ ３Ｆ」〜「Ｓｔａｂ ３６Ｆ」（表１１）のいずれかの修飾パターンまたはその任意の組合せを含む。さらに、種々の修飾パターンが生じ得る修飾スキームの非限定的な例を表１１に示す。表１１にＳｔａｂと示した安定化化学構造は、任意の組合せのセンス／アンチセンス化学構造において組み合わせることができる。（Ｓｔａｂ ７／８、Ｓｔａｂ ７／１１、Ｓｔａｂ ８／８、Ｓｔａｂ １８／８、Ｓｔａｂ １８／１１、Ｓｔａｂ １２／１３、Ｓｔａｂ ７／１３、Ｓｔａｂ １８／１３、Ｓｔａｂ ７／１９、Ｓｔａｂ ８／１９、Ｓｔａｂ １８／１９、Ｓｔａｂ ７／２０、Ｓｔａｂ ８／２０、Ｓｔａｂ １８／２０、Ｓｔａｂ ７／３２、Ｓｔａｂ ８／３２、またはＳｔａｂ １８／３２など）（例えば、Ｓｔａｂ ７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、または３２のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖またはその任意の組合せを有する任意のｓｉＮＡ）。本明細書において、数値付きＳｔａｂ化学構造は、表１１に示された化学構造の２’−フルオロ型と２’−ＯＣＦ３型の両方を含み得る。例えば、「Ｓｔａｂ ７／８」は、Ｓｔａｂ ７／８とＳｔａｂ ７Ｆ／８Ｆの両方を示す、などである。
他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子のガイド鎖またはガイド領域（アンチセンス鎖またはアンチセンス領域としても知られている）の５’端の１個以上（例えば、１、２、３、４または５個）のヌクレオチドがリボヌクレオチドである。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖のピリミジンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチドである。他の実施形態では、センス鎖のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス鎖に存在するプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシプリンヌクレオチドである。
種々の修飾パターンを有するかかるｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖のさらなる非限定的な例を、図２および３に示す。
本発明の一部の特定の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖を有し、下記式（Ａ）：
Figure 2012521763
 式中、上側の鎖は、該二本鎖核酸分子のセンス鎖であり、下側の鎖はアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、または配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、該センス鎖は、該アンチセンス鎖と相補性を有する配列を含み；各Ｎは、独立して、非修飾または化学修飾されたヌクレオチドであり；
各Ｂは、存在する、または存在しない末端キャップであり；
（Ｎ）は、各々、独立して、非修飾化学修飾された突出ヌクレオチドを表し；
［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチドを表し；
Ｘ１およびＸ２は、独立して、０〜４の整数であり；Ｘ３は、１７〜３６の整数であり；Ｘ４は、１１〜３５の整数であり；
Ｘ５は、１〜６の整数であるが、Ｘ４とＸ５の和は１７〜３６であるものとする、
を含む、二本鎖ｓｉＮＡ分子を提供する。
一部の特定の実施形態では、該少なくとも１５個のヌクレオチドはヌクレオチドの連続鎖を形成している。
他の実施形態では、ｓｉＮＡ分子は、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、または配列番号：１０４に対して１個以上のヌクレオチドの欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加を含むものであり得るが、ｓｉＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡｉを媒介するその活性を維持しているものとする。非限定的な一例において、該欠失、置換、ミスマッチおよび／または付加は、ループまたは***部、あるいはまた、ウォッブルまたは他の択一的な（非ワトソン−クリック）塩基対をもたらすものであり得る。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せであり；
（ｂ）ＮＸ４位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せであり；
（ｃ）ＮＸ３位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せであり；
（ｄ）ＮＸ３位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり；
（ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり；
（ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドであり；
（ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドであり；
（ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、リボヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
一実施形態において、本発明は、式中、
（ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、リボヌクレオチドであり；
（ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
（ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、リボヌクレオチドである、
式（Ａ）の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特色とする。
一部の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、核酸分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域の５’端の末端リン酸基を含む。
種々の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、Ｘ５＝１、２、または３；各Ｘ１およびＸ２＝１または２；Ｘ３＝１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０、およびＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０を含む。
具体的な一実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、Ｘ５＝１；各Ｘ１およびＸ２＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１８を含む。
別の具体的な実施形態では、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、Ｘ５＝２；各Ｘ１およびＸ２＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１７を含む。
また別の実施形態では、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、Ｘ５＝３；各Ｘ１およびＸ２＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１６を含む。
一部の特定の実施形態では、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、センス鎖またはセンス領域の３’端と５’端にキャップ（Ｂ）を含む。
一部の特定の実施形態では、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域の３’端にキャップ（Ｂ）を含む。
種々の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、センス鎖またはセンス領域の３’端と５’端にキャップ（Ｂ）を含み、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域の３’端にキャップ（Ｂ）を含む。
また他の実施形態では、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、二本鎖核酸分子のセンス（上側の）鎖の５’端のみにキャップ（Ｂ）を含む。
一部の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、さらに、第１末端（Ｎ）と、核酸分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’端上の隣接ヌクレオチドとの間に、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。例えば、二本鎖核酸分子は、Ｘ１および／またはＸ２＝２を含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する突出ヌクレオチド位置（例えば、（ＮｓＮ）（式中、「ｓ」はホスホロチオエートを示す）を有するものであり得る。
一部の実施形態において、式Ａを有するｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖（下側の鎖）内に、ＳＴＡＴ１標的ポリヌクレオチド配列（これも、アンチセンス（下側の）鎖Ｎおよび［Ｎ］ヌクレオチドに対して相補性を有する）内のヌクレオチドに相補的な（Ｎ）ヌクレオチドを含む。
また別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップ部分であり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ａは、アデノシンであり；
Ｇは、グアノシンであり；
Ｕは、ウリジンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップであり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ｕは、ウリジンであり；
Ｃは、シチジンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップ部分であり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ｃは、シチジンであり；
Ｕは、ウリジンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップ部分であり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ａは、アデノシンであり；
Ｇは、グアノシンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
また別の実施形態では、本発明は、ｓｉＮＡが、
Figure 2012521763
 （式中：
各Ｂは、図１０に示す逆位無塩基キャップ部分であり；
ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
Ｔは、チミジンであり；
Ｕは、ウリジンであり；
Ｃは、シチジンであり；
Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
である二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
Ｃ．ｓｉＮＡ分子の作製／合成
本発明のｓｉＮＡは、当業者に知られたいくつかの手法を用いて得ることができる。例えば、ｓｉＮＡは、化学合成され得るものであってもよく、プラスミドにコードされたものであってもよい（例えば、自発的にヘアピンループ二本鎖にフォールディングする配列として転写させる）。また、ｓｉＮＡは、長鎖ｄｓＲＮＡ（例えば、約２５ ヌクレオチド長より大きいｄｓＲＮＡ）を大腸菌ＲＮａｓｅ ＩＩまたはダイサーによって切断することによって作製することができる。これらの酵素はｄｓＲＮＡをプロセッシングして生物学的に活性なｓｉＲＮＡにする（例えば、Ｙａｎｇら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９９：９９４２−９９４７（２００２）；Ｃａｌｅｇａｒｉら ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９９：１４２３６（２００２）Ｂｙｒｏｎら Ａｍｂｉｏｎ Ｔｅｃｈ Ｎｏｔｅｓ；１０（１）：４−６（２００９）；Ｋａｗａｓｋｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：９８１−９８７（２００３），ＫｎｉｇｈｔおよびＢａｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２２６９−２２７１（２００１）ならびにＲｏｂｅｒｓｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２４３：８２（１９６９）を参照のこと。
１．化学合成
好ましくは、本発明のｓｉＮＡは化学合成されたものである。オリゴヌクレオチド（例えば、一部の特定の修飾オリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチドがないオリゴヌクレオチドの一部分）は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１１，３−１９、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第９９／５４４５９号、Ｗｉｎｃｏｔｔら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４、Ｗｉｎｃｏｔｔら，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９、Ｂｒｅｎｎａｎら，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５、およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号に記載された、当該技術分野で知られたプロトコルを用いて合成される。オリゴヌクレオチドの合成では、一般的な核酸の保護基およびカップリング基（５’端におけるジメトキシトリチル、および３’端におけるホスホルアミダイトなど）が利用される。
修飾なしのｓｉＮＡ分子は、Ｕｓｍａｎら，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１０９，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３に記載の手順を用いて合成される。このような手順は、一般的な核酸の保護基およびカップリング基（５’端におけるジメトキシトリチル、および３’端におけるホスホルアミダイトなど）を利用するものであり、本発明の一部の特定のｓｉＮＡ分子に使用され得る。
一部の特定の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国特許第６，９９５，２５９号、同第６，６８６，４６３号、同第６，６７３，９１８号、同第６，６４９，７５１号、同第６，９８９，４４２号、およびＵＳＳＮ １０／１９０，３５９に記載の方法に従って合成され、脱保護され、解析される。
非限定的な合成の一例において、小規模合成は、３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製の合成装置にて、０．２μｍｏｌ規模プロトコルを使用し、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドでは２．５分間カップリング工程を、２’−デオキシヌクレオチドまたは２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドでは４５秒カップリング工程を用いて行なわれる。表１２に、合成サイクルで使用した試薬の量および接触時間の概略を示す。
あるいはまた、本発明のｓｉＮＡ分子は、別々に合成し、合成後に、例えばライゲーションによって（Ｍｏｏｒｅら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第９３／２３５６９号；Ｓｈａｂａｒｏｖａら，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎら，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８，２０４）、あるいは合成および／または脱保護後にハイブリダイゼーションによって一緒に連接してもよい。
また、本発明の種々のｓｉＮＡ分子は、Ｓｃａｒｉｎｇｅら，米国特許第５，８８９，１３６号；同第６，００８，４００号；および同第６，１１１，０８６号の教示を用いて合成することもできる。
２．ベクター発現
あるいはまた、標的ＳＴＡＴ１分子をコードする遺伝子と相互作用し、下方調節する本発明のｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター内に挿入した転写単位（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅら，１９９６，ＴＩＧ．，１２、５１０を参照のこと）から発現させて送達することができる。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。ｓｉＮＡ発現ウイルスベクターは、限定されないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスを基にして構築され得る。
一部の実施形態では、本発明の核酸分子を発現させるために、ｐｏｌ ＩＩＩ系構築物が使用され、ｓｉＮＡ分子配列の転写は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）のプロモーターにより駆動され得る（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，米国特許第５，９０２，８８０号および同第６，１４６，８８６号を参照のこと）。（また、ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙおよびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃら，１９９２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅら，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒら，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｇｏｏｄら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５も参照のこと。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターによる転写物は、あらゆる細胞において高レベルで発現される；所与の細胞型における所与のｐｏｌ ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。また、原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターも使用されるが、原核生物のＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現させるものとする（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ １９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒら，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕら，１９９０，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。数名の研究者らにより、かかるプロモーターにより発現させた核酸分子は、哺乳動物の細胞において機能を果たし得ることが示されている（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔら，１９９２，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら，１９９２，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ ＆ Ｃｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より具体的には、Ｕ６核内低分子（ｓｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものなどの転写単位は、細胞内に高い濃度の所望のＲＮＡ分子（ｓｉＮＡなど）をもたらすのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，上掲；ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，上掲；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇら，米国特許第５，６２４，８０３号；Ｇｏｏｄら，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４，４５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第９６／１８７３６号。上記のｓｉＮＡ転写単位は、哺乳動物の細胞内への導入のために、多種多様なベクター内に、例えば限定されないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスベクターなど）、またはウイルスＲＮＡベクター（レトロウイルスもしくはアルファウイルスベクターなど）に組み込まれ得る（概説については、ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６（上掲）を参照のこと）。
本発明のｓｉＮＡ分子を発現させるために使用されるベクターは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方または両方の鎖をコードするものであってもよく、自己ハイブリダイズしてｓｉＮＡ二本鎖になる単一の自己相補的鎖をコードするものであってもよい。本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列は、ｓｉＮＡ分子の発現が可能な様式で作動可能に連結され得る（例えば、Ｐａｕｌら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；ＭｉｙａｇｉｓｈｉおよびＴａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；ならびにＮｏｖｉｎａら，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，事前にオンライン公開されたｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５を参照のこと）。
Ｄ．担体／送達系
本発明のｓｉＮＡ分子は、標的細胞または組織に、直接添加されるか、またはカチオン性脂質と複合体形成され得るか、またはリポソーム内にパッケージングされ得るか、またはｓｉＮＡ分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、または別の様式で送達される。核酸分子の送達方法は、Ａｋｈｔａｒら，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒら，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；ＨｏｆｌａｎｄおよびＨｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；ならびにＬｅｅら，２０００，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎら，米国特許第６，３９５，７１３号およびＳｕｌｌｉｖａｎら，ＰＣＴ 国際公開第９４／０２５９５号には、さらに、核酸分子の一般的な送達方法が記載されている。このようなプロトコルは、事実上、任意の核酸分子の送達に使用することができる。核酸分子は細胞に、当業者に知られた多種多様な方法、例えば限定されないが、リポソーム内への封入、イオン導入、または他の媒体（生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚら，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４；Ｗａｎｇら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第０３／４７５１８号および国際公開第０３／４６１８５号を参照のこと）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフィア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号および米国特許出願公開第２００２１３０４３０号を参照のこと）、生分解性ナノカプセル、ならびに生体接着性ミクロスフィアなど）への組込み、またはタンパク質様ベクター（Ｏ’ＨａｒｅおよびＮｏｒｍａｎｄ，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第００／５３７２２号）によって投与され得る。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のｓｉＮＡ分子を含む担体系を提供する。一部の実施形態において、担体系は、脂質系の担体系、カチオン性脂質、もしくはリポソーム核酸複合体、リポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質ナノ粒子またはその混合物である。他の実施形態では、担体系は、ポリマー系の担体系（カチオン性ポリマー−核酸複合体など）である。さらなる実施形態において、担体系は、シクロデキストリン系の担体系（シクロデキストリンポリマー−核酸複合体など）である。さらなる実施形態では、担体系は、タンパク質系の担体系（カチオン性ペプチド−核酸複合体など）である。好ましくは、担体系は、脂質ナノ粒子製剤である。表１３に記載した脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）製剤は、本明細書の任意のｓｉＮＡ分子またはｓｉＮＡ分子の組合せに適用され得る。
一部の特定の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＵＳＳＮ １１／３５３，６３０およびＵＳＳＮ １１／５８６，１０２に記載のもののような脂質ナノ粒子組成物として製剤化される。
一部の実施形態において、本発明は、製剤ＬＮＰ−０５１；ＬＮＰ−０５３；ＬＮＰ−０５４；ＬＮＰ−０６９；ＬＮＰ−０７３；ＬＮＰ−０７７；ＬＮＰ−０８０；ＬＮＰ−０８２；ＬＮＰ−０８３；ＬＮＰ−０６０；ＬＮＰ−０６１；ＬＮＰ−０８６；ＬＮＰ−０９７；ＬＮＰ−０９８；ＬＮＰ−０９９；ＬＮＰ−１００；ＬＮＰ−１０１；ＬＮＰ−１０２；ＬＮＰ−１０３；またはＬＮＰ−１０４（表１３参照）のいずれかとして製剤化されたｓｉＮＡ分子を含む組成物を特色とする。
他の実施形態では、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートおよび／または複合体を特色とする。かかるコンジュゲートおよび／または複合体は、生物学的系内（細胞など）へのｓｉＮＡ分子の送達を容易にするために使用され得る。本発明によって提供されるコンジュゲートおよび複合体は、細胞膜を越えて治療用化合物を運搬すること、薬物動態特性を改変すること、および／または本発明の核酸分子の局在化をモジュレートすることにより、治療活性を付与し得るものである。かかるコンジュゲートの非限定的な例は、ＵＳＳＮ １０／４２７，１６０およびＵＳＳＮ １０／２０１，３９４；ならびに米国特許第６，５２８，６３１号；同第６，３３５，４３４号；同第６，２３５，８８６号；同第６，１５３，７３７号；同第５，２１４，１３６号；同第５，１３８，０４５号に記載されている。
種々の実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、本発明のｓｉＮＡ化合物に共有結合され得る。結合されるＰＥＧは、任意の分子量、好ましくは約１００〜約５０，０００ダルトン（Ｄａ）であり得る。
また他の実施形態では、本発明は、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾された、もしくは長時間循環性のリポソームまたはステルスリポソーム）と、本発明のｓｉＮＡ分子とを含有する表面修飾されたリポソームを含む組成物または製剤を特色とする（例えば、ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄら，ＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第９６／１０３９２号に開示されているものなど）。
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はまた、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−ｔｒｉ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体などと製剤化または複合体形成され得る。一実施形態において、本発明の核酸分子は、米国特許出願公開第２００３００７７８２９号に記載のようにして製剤化される。
他の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、膜破壊剤（米国特許出願公開第２００１０００７６６６号に記載のものなど）と複合体形成される。また、さらに他の実施形態では、膜破壊剤（１種類または複数種）と該ｓｉＮＡ分子は、カチオン性脂質またはヘルパー脂質分子（米国特許第６，２３５，３１０号に記載の脂質など）と複合体形成される。
一部の特定の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国特許出願公開第２００３０７７８２９号；同第２００５０２８７５５１号；同第２００５０１６４２２０号；同第２００５０１９１６２７号；同第２００５０１１８５９４号；同第２００５０１５３９１９号；同第２００５００８５４８６号；および同第２００３０１５８１３３号；ならびにＰＣＴ国際出願公開公報番号国際公開第００／０３６８３号および国際公開第０２／０８７５４１号に記載のような送達系と複合体形成される。
一部の実施形態において、本発明のリポソーム製剤は、米国特許第６，８５８，２２４号；同第６，５３４，４８４号；同第６，２８７，５９１号；同第６，８３５，３９５号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８５８，２２５号；同第６，８１５，４３２号；同第６，５８６，００１号；同第６，１２０，７９８号；同第６，９７７，２２３号；同第６，９９８，１１５号；同第５，９８１，５０１号；同第５，９７６，５６７号；同第５，７０５，３８５号；ならびに米国特許出願公開第２００６／００１９９１２号；同第２００６／００１９２５８号；同第２００６／０００８９０９号；同第２００５／０２５５１５３号；同第２００５／００７９２１２号；同第２００５／０００８６８９号；同第２００３／００７７８２９号、同第２００５／００６４５９５号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００５／０１１８２５３号；同第２００４／００７１６５４号；同第２００５／０２４４５０４号；同第２００５／０２６５９６１号および同第２００３／００７７８２９号に記載された化合物および組成物と製剤化または複合体形成された本発明のｓｉＮＡ分子（例えば、ｓｉＮＡ）を含む。
あるいはまた、本発明のｓｉＲＮＡを発現する上記のような組換えプラスミドおよびウイルスベクターが、本発明の分子を送達するために使用され得る。ｓｉＮＡ分子発現ベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与、被検体から取り出された標的細胞に投与した後、該被検体に再導入、または所望の標的細胞への導入が可能であり得る任意の他の手段などによる全身性であり得る（概説については、Ｃｏｕｔｕｒｅら，１９９６，ＴＩＧ．，１２、５１０を参照のこと）。また、かかる組換えプラスミドは、直接投与してもよく、適切な送達試薬とともに、例えば、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリカチオン（例えば、ポリリジン）またはリポソーム脂質系の担体系、カチオン性脂質、もしくはリポソーム核酸複合体、ミセル、ビロソーム、脂質ナノ粒子などとともに投与してもよい。
Ｅ．キット
また、本発明は、核酸をキットの形態で提供する。キットには容器が含まれ得る。キットは、典型的には、本発明の核酸を、その投与のための使用説明書とともに含む。一部の特定の場合では、該核酸は、標的化部分が結合されたものであり得る。標的化部分（例えば、抗体、タンパク質）の結合方法は、当業者に知られている。一部の特定の場合では、該核酸は化学修飾されている。他の実施形態では、キットは、１種類より多くの本発明のｓｉＮＡ分子を含む。キットは、本発明のｓｉＮＡ分子を、薬学的に許容され得る担体または希釈剤とともに含むものであってもよい。キットは、さらに、賦形剤を含むものであってもよい。
Ｆ．治療的使用／医薬組成物
ＳＴＡＴ１研究における現在の一連の知識は、研究、診断および治療での使用のための、ＳＴＡＴ１活性をアッセイするための方法、およびＳＴＡＴ１発現を調節することができる化合物の必要性を示す。後述するように、本発明の核酸分子は、アッセイにおいて、ＳＴＡＴ１レベルが関連している疾患状態を診断するために使用され得る。また、該核酸分子および医薬組成物は、ＳＴＡＴ１レベルに関連している疾患状態を処置するために使用され得る。
１．ＳＴＡＴ１と関連している疾患状態
ＳＴＡＴ１発現のモジュレーションと関連し得る具体的な疾患状態としては、限定されないが、呼吸器系、炎症性および自己免疫性の疾患、形質、病状および表現型が挙げられる。かかる疾患状態または適応症の非限定的な例としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、好酸球性の咳、気管支炎、急性および慢性の肺同種移植片拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎ならびに副鼻腔炎が挙げられる。炎症性呼吸器疾患は各々、すべて、症状、炎症の持続、および慢性の場合は正常組織の崩壊または破壊を引き起こす酵素または酸素ラジカルを放出する種々の炎症細胞を漸増および活性化させるメディエータの存在を特徴とする。
本発明のｓｉＮＡ分子が標的ＳＴＡＴ１ ｍＲＮＡを分解（したがって、上記の疾患を抑止）し得るものであることは理解されよう。疾患の抑止は、被検体における疾患の進行を直接測定することにより評価することができる。また、これは、該疾患と関連している病状の変化または逆転を観察することにより推断することができる。また、本発明のｓｉＮＡ分子は、予防法として使用され得る。したがって、本発明の核酸分子および医薬組成物の使用は、ＳＴＡＴ１の調節と関連しているこれらおよび他の疾患を改善、処置、予防および／または治癒するために用いることができる。
２．医薬組成物
本発明のｓｉＮＡ分子は、多種多様な治療的、予防的、美容的、獣医学的、診断的、標的確認、ゲノム知得、遺伝子操作、および薬理ゲノム科学的適用用途に有用な試薬および方法を提供する。
ａ．製剤
したがって、本発明はまた、一態様において、記載のｓｉＮＡ分子の医薬組成物を提供する。このような医薬組成物としては、上記の化合物の塩、例えば、酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、酢酸およびベンゼンスルホン酸の塩が挙げられる。このような医薬用製剤または医薬組成物には、薬学的に許容され得る担体または希釈剤が含まれ得る。
一実施形態において、本発明は、配列番号：６の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：１００の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。また別の実施形態では、本発明は、配列番号：２２の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号：１０１の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：２３の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：１０２の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：２４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。また別の実施形態では、本発明は、配列番号：１０３の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：２７の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。また別の実施形態では、本発明は、配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。別の実施形態では、本発明は、配列番号：３９と配列番号：４０を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号：７１と配列番号：７２を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。また別の実施形態では、本発明は、配列番号：７３と配列番号：７４を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。また別の実施形態では、本発明は、配列番号：７５と配列番号：７６を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。また別の実施形態では、本発明は、配列番号：８１と配列番号：８２を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。さらに別の実施形態では、本発明は、式（Ａ）を含むｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特色とする。
本発明のｓｉＮＡ分子は、好ましくは、被検体に投与する前に、当該技術分野で知られた手法に従って、医薬組成物として製剤化される。本発明の医薬組成物は、少なくとも滅菌されており、パイロジェンフリーであることを特徴とする。本発明の医薬組成物の調製方法は、当該技術分野の技能の範囲内であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１７版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載されている。
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）は、さらに、慣用的な医薬用賦形剤および／または添加剤を含む。好適な医薬用賦形剤としては、保存料、フレーバー剤、安定剤、酸化防止剤、オスモル濃度調整剤、バッファー、およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性のバッファー（例えば、塩酸トリメチルアミン）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡもしくはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）またはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）の添加、または任意選択で、カルシウムもしくはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムもしくは乳酸カルシウム）の添加が挙げられる。また、酸化防止剤および懸濁化剤は使用され得る。
局所投与のための製剤の種々の型の非限定的な例としては、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、フォーム剤、経皮パッチによる送達のための調製物、粉末剤、スプレー剤、エアロゾル剤、カプセル剤または吸入器もしくは吹送器における使用のためのカートリッジ剤または滴剤（例えば、点眼薬または点鼻薬）、噴霧化用液剤／懸濁剤、坐薬、膣坐薬、貯留注腸剤およびチュアブルもしくはサッカブル錠もしくはペレット剤（例えば、アフタ性潰瘍の処置用）またはリポソームもしくはマイクロカプセル封入調製物が挙げられる。
軟膏、クリーム剤およびゲル剤は、例えば、水性または油性基剤を用い、適切な増粘剤および／またはゲル化剤および／または溶媒の添加を伴って製剤化され得る。したがって、かかる基剤の非限定的な例としては、例えば、水および／または液状パラフィンあるいは植物油（ラッカセイ油もしくはヒマシ油など）などの油類、またはポリエチレングリコールなどの溶媒が挙げられ得る。増粘剤およびゲル化剤は、基剤の性質に応じて使用され得る。かかる薬剤の非限定的な例としては、軟質パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、蜜蝋、カルボキシポリメチレンおよびセルロース誘導体、および／またはグリセリルモノステアレートおよび／または非イオン性乳化剤が挙げられる。
一実施形態において、ローション剤は、水性または油性基剤を用いて製剤化され得、また、一般に、１種類以上の乳化剤、安定化剤、分散化剤、懸濁化剤または増粘剤を含む。
一実施形態において、外用粉末剤は、任意の適切な粉末基剤、例えば、タルク、ラクトースまたはデンプンの補助を用いて形成され得る。滴剤は、水性または非水性基剤を用いて製剤化され得、また、１種類以上の分散化剤、可溶化剤、懸濁化剤または保存料を含む。
経口使用が意図される組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術分野で知られた任意の方法に従って調製され得、かかる組成物には、医薬品として洗練された口当たりのよい調製物を得るため、甘味剤、フレーバー剤、着色剤または保存剤などの１種類以上が含有され得る。錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容され得る賦形剤と混合された状態で含む。このような賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤；炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなど；造粒剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア；ならびに滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、既知の技法によってコーティングされていてもよい。一部の場合では、かかるコーティングは、胃腸管内での崩壊と吸収を遅延させ、それにより、長時間にわたって持続的作用をもたらすための既知の技法によって調製され得る。例えば、グリセリルモノステアレート（ｍｏｎｏｓｔｅｒａｔｅ）またはグリセリルジステアレートなどの時間遅延物質が使用され得る。
また、経口使用のための製剤は、活性成分が不活性な固形希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合された硬質ゼラチンカプセル剤として、あるいは活性成分が水または油性媒体（例えば、ピーナッツ油、液状パラフィンもしくはオリーブ油と混合された軟質ゼラチンカプセル剤）として提示され得る。
水性懸濁剤は、活性物質を、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤との混合物の状態で含む。かかる賦形剤は、懸濁化剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴムおよびアカシアゴムである；分散化剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えば、レシチン、あるいはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）；またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールから得られる部分エステルとの縮合生成物（ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなど）、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られる部分エステル（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートとの縮合生成物であり得る。また、水性懸濁剤には、１種類以上の保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｎ−プロピル）、１種類以上の着色剤、１種類以上のフレーバー剤、および１種類以上の甘味剤（スクロースまたはサッカリンなど）が含まれ得る。
油性懸濁剤は、活性成分を、植物油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油）、または鉱油（液状パラフィンなど）に懸濁させることにより製剤化され得る。油性懸濁剤には、増粘剤、例えば、蜜蝋、硬質パラフィンまたはセチルアルコールが含まれ得る。甘味剤およびフレーバー剤は、口当たりのよい経口調製物をもたらすために添加され得る。このような組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって保存することができる。
また、本発明の医薬組成物は、水中油型乳剤の形態であり得る。油相は、植物油または鉱油またはこれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然に存在するゴム（例えば、アカシアゴムまたはトラガントゴム）、天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン、および脂肪酸およびヘキシトール無水物から得られるのエステルまたは部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、ならびに前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。また、乳剤には、甘味剤およびフレーバー剤が含まれ得る。
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースを用いて製剤化され得る。また、かかる製剤には、粘滑剤、保存料およびフレーバー剤および着色剤が含まれ得る。医薬組成物は、滅菌された注射用の水性または油性懸濁剤の形態であってもよい。この懸濁剤は、既知の技術に従い、上記に記載した適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて製剤化され得る。また、滅菌された注射用調製物は、無毒性の非経口に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌された注射用の液剤または懸濁剤（例えば、１，３−ブタンジオール中の液剤）であり得る。中でも、使用可能な許容され得るビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌された固定油も、溶媒または懸濁媒体として慣用的に使用されている。この目的には、任意の無刺激性固定油（例えば、合成のモノ−またはジグリセリド）が使用され得る。また、オレイン酸などの脂肪酸は、注射用剤の調製に使用されることがわかっている。
また、本発明の核酸分子は、例えば、薬物の経直腸投与のための坐薬の形態で投与され得る。このような組成物は、薬物を適切な非刺激性賦形剤と混合することにより調製され得、該賦形剤は、通常の温度では固体であるが直腸温度では液状となり、したがって、直腸内で融解して薬物を放出するものである。かかる物質としては、ココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
本発明の核酸分子は、滅菌された媒体にて非経口投与してもよい。薬物は、使用されるビヒクルおよび濃度によるが、ビヒクル中に懸濁させるか、または溶解させるかのいずれかであり得る。好都合には、局所麻酔薬、保存料および緩衝剤などの佐剤をビヒクル中に溶解させるのがよい。
他の実施形態では、肺経由送達における使用のための、本明細書において提供するｓｉＮＡならびにＬＮＰ組成物および製剤は、さらに、１種類以上の界面活性剤を含む。本発明の組成物の取込みを向上させるための好適な界面活性剤または界面活性剤成分としては、とりわけ、合成および天然の、ならびに完全体および切断型の界面活性体プロテインＡ、界面活性体プロテインＢ、界面活性体プロテインＣ、界面活性体プロテインＤならびに界面活性体プロテインＥ、ジ−飽和ホスファチジルコリン（ジパルミトイル以外）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ユビキノン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、パルミトイル−リゾホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール、スルファチジン（ｓｕｌｆａｔｉｄｉｃ）酸、グリセロール−３−ホスフェート、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール、グリセロ−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミテート、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、コリンリン酸；ならびに界面活性剤成分の天然担体ビヒクルである天然および人工層状体、ω−３脂肪酸、ポリエン酸、ポリエノン酸、レシチン、パルミチン酸、エチレンまたはプロピレンオキシド、ポリオキシプロピレン、モノマー型およびポリマー型のポリオキシエチレン、モノマー型およびポリマー型のポリ（ビニルアミン）と、デキストランおよび／またはアルカノイル側鎖との非イオン性ブロックコポリマー、Ｂｒｉｊ ３５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ならびに合成界面活性剤ＡＬＥＣ、Ｅｘｏｓｕｒｆ、ＳｕｒｖａｎおよびＡｔｏｖａｑｕｏｎｅが挙げられる。このような界面活性剤は、製剤中で単独もしくは多成分界面活性剤の一部として、本明細書の医薬組成物中の核酸成分の５’端および／または３’端に共有結合された付加物としてのいずれかで使用され得る。
ｂ．組合せ
本発明による化合物および医薬用製剤は、被検体に単独で投与してもよく、例えば、抗炎症剤、抗コリン剤（特に、Ｍ１／Ｍ２／Ｍ３受容体アンタゴニスト）、β２−アドレナリン作動性受容体アゴニスト、抗感染剤、例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、または抗ヒスタミン薬から選択される１種類以上の他の治療用薬剤と組み合わせて使用してもよく、該治療用薬剤を含むものであってもよい。したがって、本発明は、さらなる実施形態において、例えば、限定されないが、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチド；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、もしくは配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２を含む、または式（Ａ）、またはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を含むｓｉＮＡ分子などの本発明のｓｉＮＡ分子を、例えば、抗炎症剤（コルチコステロイドもしくはＮＳＡＩＤなど）、抗コリン剤、β２−アドレナリン作動性受容体アゴニスト、抗感染剤（抗生物質もしくは抗ウイルス薬など）、または抗ヒスタミン薬から選択される１種類以上の他の治療活性薬剤と一緒に含む組合せを提供する。本発明の他の実施形態は、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、またはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、β２−アドレナリン作動性受容体アゴニスト、および／または抗コリン薬、および／またはＳＴＡＴ１インヒビター、および／または抗ヒスタミン薬と一緒に含む組合せを包含する。
一実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を、β２−アドレナリン作動性受容体アゴニストと一緒に含む組合せを包含する。β２−アドレナリン作動性受容体アゴニストの非限定的な例としては、サルメテロール（これは、ラセミ化合物であっても単独のエナンチオマー（Ｒ−エナンチオマーなど）であってもよい）、サルブタモール（これは、ラセミ化合物であっても単独のエナンチオマー（Ｒ−エナンチオマーなど）であってもよい）、ホルモテロール（これは、ラセミ化合物であっても単独のジアステレオマー（Ｒ，Ｒ−ジアステレオマーなど）であってもよい）、サルメファモール、フェノテロール、カルモテロール、エタンテロール、ナミンテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、フレルブテロール、レプロテロール、バムブテロール、インダカテロール、テルブタリンおよびその塩、例えば、サルメテロールのキシナホ酸（１−ヒドロキシ−２−ナフタレンカルボン酸）塩、サルブタモールの硫酸塩もしくは遊離塩基、またはホルモテロールのフマル酸塩が挙げられる。一実施形態において、β２−アドレナリン作動性受容体アゴニストは、長期作用性β２−アドレナリン作動性受容体アゴニスト、例えば、約１２時間以上、有効な気管支拡張をもたらす化合物である。
他のβ２−アドレナリン作動性受容体アゴニストとしては、国際公開第０２／０６６４２２号、同第０２／０７０４９０号、同第０２／０７６９３３号、同第０３／０２４４３９号、同第０３／０７２５３９号、同第０３／０９１２０４号、同第０４／０１６５７８号、同第２００４／０２２５４７号、同第２００４／０３７８０７号、同第２００４／０３７７７３号、同第２００４／０３７７６８号、同第２００４／０３９７６２号、同第２００４／０３９７６６号、同第０１／４２１９３号および同第０３／０４２１６０号に記載のものが挙げられる。
β２−アドレナリン作動性受容体アゴニストのさらなる例としては、３−（４−｛［６−（｛（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）フェニル］エチル｝アミノ）ヘキシル］オキシ｝ブチル）ベンゼンスルホンアミド；３−（３−｛［７−（｛（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−［４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチル）フェニル］エチル］−アミノ）ヘプチル］オキシ｝プロピル）ベンゼンスルホンアミド；４−｛（１Ｒ）−２−［（６−｛２−［（２、６−ジクロロベンジル）オキシ］エトキシ｝ヘキシル）アミノ］−１−ヒドロキシエチル｝−２−（ヒドロキシメチル）フェノール；４−｛（１Ｒ）−２−［（６−｛４−［３−（シクロペンチルスルホニル）フェニル］ブトキシ｝ヘキシル）アミノ］−１−ヒドロキシエチル｝−２−（ヒドロキシメチル）フェノール；Ｎ−［２−ヒドロキシル−５−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシ−２−［［２−４−［［（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−２フェニルエチル］アミノ］フェニル］エチル］アミノ］エチル］フェニル］ホルムアミド；Ｎ−２｛２−［４−（３−フェニル−４−メトキシフェニル）アミノフェニル］エチル｝−２−ヒドロキシ−２−（８−ヒドロキシ−２（１Ｈ）−キノリノン−５−イル）エチルアミン；および５−［（Ｒ）−２−（２−｛４−［４−（２−アミノ−２−メチル−プロポキシ）−フェニルアミノ］−フェニル｝−エチルアミノ）−１−ヒドロキシ−エチル］−−８−ヒドロキシ−１Ｈ−キノリン−２−オンが挙げられる。
一実施形態において、β２−アドレナリン作動性受容体アゴニストは、硫酸、塩酸、フマル酸、ヒドロキシナフトエ（例えば、１−または３−ヒドロキシ−２−ナフトエ）酸、桂皮酸、置換桂皮酸、トリフェニル酢酸、スルファミン酸、ナフタレンアクリル酸、安息香酸、４−メトキシ安息香酸、２−または４−ヒドロキシ安息香酸、４−クロロ安息香酸、および４−フェニル安息香酸から選択される薬学的に許容され得る酸と形成される塩の形態であり得る。
また、好適な抗炎症剤としてはコルチコステロイドが挙げられる。本発明の化合物と組み合わせて使用され得るコルチコステロイドの例は、抗炎症活性を有する経口および吸入型コルチコステロイドならびにそのプロドラッグである。非限定的な例としては、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−１，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル（フロ酸フルチカゾン）、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−プロピオニルオキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−（２−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３Ｓ−イル）エステル、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−（２，２，３，３テトラメチル（ｍｅｔｈｙ）シクロプロピル−カルボニル）オキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−シアノメチルエステルおよび６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−（１−メチルシクロプロピルカルボニル）オキシ−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、ベクロメタゾンエステル（例えば、１７−プロピオン酸エステルまたは１７，２１−ジプロピオン酸エステル）、ブデソニド、フルニソリド、モメタゾンエステル（例えば、フロ酸モメタゾン）、トリアムシノロンアセトニド、ロフレポニド、シクレソニド（１６α，１７−［［（Ｒ）−シクロヘキシルメチレン］ビス（オキシ）］−１１β，２１−ジヒドロキシ−プレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン）、プロピオン酸ブチキソコルト、ＲＰＲ−１０６５４１、ならびにＳＴ−１２６が挙げられる。一実施形態において、コルチコステロイドとしては、プロピオン酸フルチカゾン、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−［（４−メチル−１，３−チアゾール−５−カルボニル）オキシ］−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステル、６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−１７α−（２，２，３，３−テトラメチルシクロプロピルカルボニル）オキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−シアノメチルエステルおよび６α，９α−ジフルオロ−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−１７α−（１−メチルシクロ−プロピルカルボニル）オキシ−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルが挙げられる。一実施形態において、コルチコステロイドは、６α，９α−ジフルオロ−１７α−［（２−フラニルカルボニル）オキシ］−１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−３−オキソ−アンドロスタ−１，４−ジエン−１７β−カルボチオ酸Ｓ−フルオロメチルエステルである。コルチコステロイドの非限定的な例としては、以下の公開特許出願および特許：国際公開第０２／０８８１６７号、同第０２／１００８７９号、同第０２／１２２６５号、同第０２／１２２６６号、同第０５／００５４５１号、同第０５／００５４５２号、同第０６／０７２５９９号および同第０６／０７２６００号に記載のものが挙げられる。
一実施形態は、本発明のｓｉＮＡ分子と、グルココルチコイド活性化作用を有し、トランス活性化よりもトランス抑制に対して選択性を有するものであり得る非ステロイド系化合物（以下の公開特許出願および特許：国際公開第０３／０８２８２７号、同第９８／５４１５９号、同第０４／００５２２９号、同第０４／００９０１７号、同第０４／０１８４２９号、同第０３／１０４１９５号、同第０３／０８２７８７号、同第０３／０８２２８０号、同第０３／０５９８９９号、同第０３／１０１９３２号、同第０２／０２５６５号、同第０１／１６１２８号、同第００／６６５９０号、同第０３／０８６２９４号、同第０４／０２６２４８号、同第０３／０６１６５１号、同第０３／０８２７７号、同第０６／０００４０１号、同第０６／０００３９８号および同第０６／０１５８７０号に開示されている非ステロイド系化合物など）とを含む組合せである。
本発明のｓｉＮＡ分子と組み合わせて使用され得る他の抗炎症剤の非限定的な例としては、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。
ＮＳＡＩＤの非限定的な例としては、クロモグリク酸ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）阻害薬（例えば、テオフィリン、ＰＤＥ４阻害薬もしくは混合型ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害薬）、ロイコトリエンアンタゴニスト、ロイコトリエン合成の阻害薬（例えば、モンテルカスト）、ｉＮＯＳ阻害薬、トリプターゼおよびエラスターゼ阻害薬、β−２インテグリンアンタゴニストならびにアデノシン受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、アデノシン２ａアゴニスト）、サイトカインアンタゴニスト（例えば、ケモカインアンタゴニスト（ＣＣＲ３アンタゴニストなど））もしくはサイトカイン合成の阻害薬、または５−リポキシゲナーゼ阻害薬が挙げられる。一実施形態において、本発明は、経口投与のためのｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素シンターゼ）阻害薬を包含する。ｉＮＯＳ阻害薬の例としては、以下の公開国際特許および特許出願：国際公開第９３／１３０５５号、同第９８／３０５３７号、同第０２／５００２１号、同第９５／３４５３４号および同第９９／６２８７５号に開示されているものが挙げられる。ＣＣＲ３阻害薬の例としては、国際公開第０２／２６７２２号に開示されているものが挙げられる。
該化合物としては、シス−４−シアノ−４−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、２−カルボメトキシ−４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）シクロヘキサン−１−オンおよびシス−［４−シアノ−４−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）シクロヘキサン−１−オール］が挙げられる。また、シス−４−シアノ−４−［３−（シクロペンチルオキシ）−４−メトキシフェニル］シクロ−ヘキサン−１−カルボン酸（シロミラストとしても知られている）およびその塩、エステル、プロドラッグまたは米国特許５，５５２，４３８に記載の物理的形態。
他の化合物としては、ＥｌｂｉｏｎのＡＷＤ−１２−２８１（Ｈｏｆｇｅｎ，Ｎ．ら １５ｔｈ ＥＦＭＣ Ｉｎｔ Ｓｙｍｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（Ｓｅｐｔ ６−１０，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）１９９８，Ａｂｓｔ Ｐ．９８；ＣＡＳ参照番号２４７５８４０２０−９）；ＮＣＳ−６１３（ＩＮＳＥＲＭ）で指名される９−ベンジルアデニン誘導体；ＣｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＳｃｈｅｒｉｎｇ−ＰｌｏｕｇｈのＤ−４４１８；ＣＩ−１０１８（ＰＤ−１６８７８７）で特定され、ＰｆｉｚｅｒによるベンゾジアゼピンＰＤＥ４阻害薬；国際公開第９９／１６７６６号に協和発酵によって開示されたベンゾジオキソール誘導体；協和発酵のＫ−３４；ＮａｐｐのＶ−１１２９４Ａ（Ｌａｎｄｅｌｌｓ，Ｌ．Ｊ．ら Ｅｕｒ Ｒｅｓｐ Ｊ［Ａｎｎｕ Ｃｏｎｇ Ｅｕｒ Ｒｅｓｐ Ｓｏｃ（Ｓｅｐｔ １９−２３，Ｇｅｎｅｖａ）１９９８］１９９８，１２（別冊２８）：Ａｂｓｔ Ｐ２３９３）；ロフルミラスト（ＣＡＳ参照番号１６２４０１−３２−３）およびフタラジノン（ｐｔｈａｌａｚｉｎｏｎｅ）（国際公開第９９／４７５０５号，その開示は、引用により本明細書に組み込まれる）（Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ）；プマフェントリン，（−）−ｐ−［（４ａＲ＊，１０ｂＳ＊）−９−エトキシ−ｌ，２，３，４，４ａ，１０ｂ−ヘキサヒドロ−８−メトキシ−２−メチルベンゾ［ｃ］［１，６］ナフチリジン−６−イル］−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ベンズアミド（これは、混合型ＰＤＥ３／ＰＤＥ４阻害薬であり、Ｂｙｋ−Ｇｕｌｄｅｎ（現Ａｌｔａｎａ）によって調製および公開された）；Ａｌｍｉｒａｌｌ−Ｐｒｏｄｅｓｆａｒｍａによって開発中のアロフィリン（ａｒｏｆｙｌｌｉｎｅ）；ＶｅｒｎａｌｉｓのＶＭ５５４／ＵＭ５６５；またはＴ−４４０（田辺製薬；Ｆｕｊｉ，Ｋ．ら Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ，１９９８，２８４（１）：１６２）、ならびにＴ２５８５が挙げられる。さらなる化合物は、公開国際特許出願国際公開第０４／０２４７２８号（Ｇｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ）、同第０４／０５６８２３号（Ｇｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ）および同第０４／１０３９９８号（Ｇｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ）に開示されている。
本発明の化合物と組み合わせて使用され得る嚢胞性線維症用薬剤の例としては、限定されないが、Ｔｏｂｉ（登録商標）およびＰｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）などの化合物が挙げられる。
本発明の化合物と組み合わせて使用され得る抗コリン剤の例は、ムスカリン性受容体においてアンタゴニストとして作用する化合物、特に、Ｍ１もしくはＭ３受容体のアンタゴニスト、Ｍ１／Ｍ３もしくはＭ２／Ｍ３受容体のデュアルアンタゴニスト、またはＭ１／Ｍ２／Ｍ３受容体のパン−アンタゴニストである化合物である。吸入による投与のための例示的な化合物としては、イプラトロピウム（例えば、臭化物として、ＣＡＳ ２２２５４−２４−６、Ａｔｒｏｖｅｎｔの名称で販売）、オキシトロピウム（例えば、臭化物として、ＣＡＳ ３０２８６−７５−０）およびチオトロピウム（例えば、臭化物として、ＣＡＳ １３６３１０−９３−５、Ｓｐｉｒｉｖａの名称で販売）が挙げられる。また、レバトロパート（例えば、臭化水素酸塩として、ＣＡＳ ２６２５８６−７９−８）および国際公開第０１／０４１１８号に開示されているＬＡＳ−３４２７３も重要である。経口投与のための例示的な化合物としては、ピレンゼピン（ＣＡＳ ２８７９７−６１−７）、ダリフェナシン（ＣＡＳ １３３０９９−０４−４、または臭化水素酸塩はＣＡＳ １３３０９９−０７−７（Ｅｎａｂｌｅｘの名称で販売））、オキシブチニン（ＣＡＳ ５６３３−２０−５、Ｄｉｔｒｏｐａｎの名称で販売）、テロジリン（ＣＡＳ １５７９３−４０−５）、トルテロジン（ＣＡＳ １２４９３７−５１−５、または酒石酸塩はＣＡＳ １２４９３７−５２−６、Ｄｅｔｒｏｌの名称で販売）、オチロニウム（例えば、臭化物として、ＣＡＳ ２６０９５−−５９−０、Ｓｐａｓｍｏｍｅｎの名称で販売）、塩化トロスピウム（ＣＡＳ １０４０５−０２−４）およびソリフェナシン（ＣＡＳ ２４２４７８−３７−１、またはコハク酸塩はＣＡＳ ２４２４７８−３８−２（ＹＭ−９０５としても知られており、Ｖｅｓｉｃａｒｅの名称で販売））が挙げられる。
他の抗コリン剤としては式（ＸＸＩ）の化合物が挙げられ、これは、米国特許出願第６０／４８７９８１号に開示されており：
Figure 2012521763
 式中、トロパン環に結合されたアルキル鎖の好ましい向きはエンドであり；Ｒ３１およびＲ３２は、独立して、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分子鎖の低級アルキル基、５〜６個の炭素原子を有するシクロアルキル基、６〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキルアルキル、２−チエニル、２−ピリジル、フェニル、４個を超えない炭素原子を有するアルキル基で置換されたフェニル、および４個を超えない炭素原子を有するアルコキシ基で置換されたフェニルからなる群から選択され；Ｘ−は、Ｎ原子の正電荷と会合するアニオンを表す。Ｘ−は、限定されないが、クロリド、ブロミド、アイオダイド、スルフェート、ベンゼンスルホネート、およびトルエンスルホネートであり得る。式ＸＸＩの例としては、限定されないが、（３−エンド）−３−（２，２−ジ−２−チエニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；（３−エンド）−３−（２，２−ジフェニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；（３−エンド）−３−（２，２−ジフェニルエテニル）−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタン４−メチルベンゼン−スルホネート；（３−エンド）−８，８−ジメチル−３−［２−フェニル−２−（２−チエニル）エテニル］−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；および／または（３−エンド）−８，８−ジメチル−３−［２−フェニル−２−（２−ピリジニル）エテニル］−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミドが挙げられる。
さらなる抗コリン剤としては式（ＸＸＩＩ）または（ＸＸＩＩＩ）化合物が挙げられ、これらは、米国特許出願第６０／５１１００９号に開示されており：
Figure 2012521763
 式中、表示したＨ原子はエキソ位であり；Ｒ４１は、Ｎ原子の正電荷と会合するアニオンを表す。Ｒ４１は、限定されないが、クロリド、ブロミド、アイオダイド、スルフェート、ベンゼンスルホネートおよびトルエンスルホネートであり得；Ｒ４２およびＲ４３は、独立して、直鎖または分子鎖の低級アルキル基（好ましくは１〜６個の炭素原子を有する）、シクロアルキル基（５〜６個の炭素原子を有する）、シクロアルキルアルキル（６〜１０個の炭素原子を有する）、ヘテロシクロアルキル（５〜６個の炭素原子を有する）とヘテロ原子としてＮまたはＯ、ヘテロシクロアルキルアルキル（６〜１０個の炭素原子を有する）とヘテロ原子としてＮまたはＯ、アリール、任意選択で置換されたアリール、ヘテロアリール、および任意選択で置換されたヘテロアリールからなる群から選択され；Ｒ４４は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルヘテロアリール、−ＯＲ４５、−ＣＨ２ＯＲ４５、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＣＨ２Ｏ（ＣＯ）Ｒ４６、−ＣＯ２Ｒ４７、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４７）ＳＯ２Ｒ４５、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ４７）（Ｒ４８）、−ＣＯＮ（Ｒ４７ＸＲ４８）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＣＯ（Ｒ４６）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＳＯ２（Ｒ４６）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＣＯ２（Ｒ４５）、−ＣＨ２Ｎ（Ｒ４８）ＣＯＮＨ（Ｒ４７）からなる群から選択され；Ｒ４５は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルヘテロアリールからなる群から選択され；Ｒ４６は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアリール、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルヘテロアリールからなる群から選択され；Ｒ４７およびＲ４８は、独立して、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（Ｃ３〜Ｃ７）ヘテロシクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルアリール、および（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルヘテロアリールからなる群から選択され、代表的だが非限定的な例としては、（エンド）−３−（２−メトキシ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンアイオダイド；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオニトリル；（エンド）−８−メチル−３−（２，２，２−トリフェニル−エチル）−８−アザビシクロ［３．２．１．］オクタン；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニルプロピオンアミド；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオン酸；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジ−フェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンアイオダイド；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロパン−１−オール；Ｎ−ベンジル−３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピオンアミド；（エンド）−３−（２−カルバモイル−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンアイオダイド；１−ベンジル−３−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；１−エチル−３−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジ−フェニル−プロピル］−尿素；Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−アセトアミド；Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−ベンズアミド；３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−プロピオニトリル；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンアイオダイド；Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−ベンゼンスルホンアミド；［３−（（エンド）−８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−尿素；Ｎ−［３−（（エンド）−８−メチル８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，２−ジフェニル−プロピル］−メタンスルホンアミド；および／または（エンド）−３−｛２，２−ジフェニル−３−［（１−フェニル−メタノイル）−アミノ］−プロピル｝−８，８−ジメチル−８−アゾニアビシクロ［３．２．１］オクタンブロミドが挙げられる。
さらなる化合物としては、（エンド）−３−（２−メトキシ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジ−メチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンアイオダイド；（エンド）−３−（−２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジ−メチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンアイオダイド；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジ−メチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミド；（エンド）−３−（２−カルバモイル−２，２−ジフェニル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンアイオダイド；（エンド）−３−（２−シアノ−２，２−ジ−チオフェン−２−イル−エチル）−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンアイオダイド；および／または（エンド）−３−｛２，２−ジフェニル−３−［（１−フェニル−メタノイル）−アミノ］−プロピル｝−８，８−ジメチル−８−アゾニア−ビシクロ［３．２．１］オクタンブロミドが挙げられる。
一部の特定の実施形態では、本発明は、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、またはその薬学的に許容され得る塩を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、Ｈ１アンタゴニストと一緒に含む組合せを提供する。Ｈ１アンタゴニストの例としては、限定されないが、アンレキサノクス、アステミゾール、アザタジン、アゼラスチン、アクリバスチン、ブロムフェニラミン、セチリジン、レボセチリジン、エフレチリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シクリジン、カレバスチン、シプロヘプタジン、カルビノキサミン、デスカルボエトキシロラタジン、ドキシラミン、ジメチンデン、エバスチン、エピナスチン、エフレチリジン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、ケトチフェン、ロラタジン、レボカバスチン、ミゾラスチン、メキタジン、ミアンセリン、ノベラスチン、メクリジン、ノルアステミゾール、オロパタジン、ピクマスト、ピリラミン、プロメタジン、テルフェナジン、トリペレンナミン、テメラスチン、トリメプラジンおよびトリプロリジン、特に、セチリジン、レボセチリジン、エフレチリジンおよびフェキソフェナジンが挙げられる。
他の実施形態では、本発明は、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、またはその薬学的に許容され得る塩を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、Ｈ３アンタゴニスト（および／またはインバースアゴニスト）と一緒に含む組合せを提供する。Ｈ３アンタゴニストの例としては、例えば、国際公開第２００４／０３５５５６号および国際公開第２００６／０４５４１６号に開示されている化合物が挙げられる。本発明の化合物と組み合わせて使用され得る他のヒスタミン受容体アンタゴニストとしては、Ｈ４受容体のアンタゴニスト（および／またはインバースアゴニスト）、例えば、Ｊａｂｌｏｎｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６：３９５７−３９６０（２００３）に開示された化合物が挙げられる。
したがって、本発明は、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、および／またはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、ＳＴＡＴ１インヒビターと一緒に含む組合せを提供する。
また、本発明は、さらなる実施形態において、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、および／またはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、β２−アドレナリン作動性受容体アゴニストと一緒に含む組合せを提供する。
また、本発明は、さらなる実施形態において、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、および／またはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、コルチコステロイドと一緒に含む組合せを提供する。
また、本発明は、さらなる実施形態において、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、および／またはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、抗コリン薬と一緒に含む組合せを提供する。
本発明は、さらなる態様において、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、および／またはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、抗ヒスタミン薬と一緒に含む組合せを提供する。
本発明は、またさらなる態様において、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、および／またはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、ＳＴＡＴ１インヒビターおよびβ２−アドレナリン作動性受容体アゴニストと一緒に含む組合せを提供する。
したがって、本発明は、さらなる態様において、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）、および／またはその薬学的に許容され得る塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能性の誘導体を含む本発明のｓｉＮＡ分子を、抗コリン薬およびＳＴＡＴ１インヒビターと一緒に含む組合せを提供する。
上記に示した組合せは、医薬用製剤の形態における使用のために簡便に提示され得、したがって、上記に規定の組合せを薬学的に許容され得る希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物は、本発明のさらなる態様を表す。
かかる組合せの個々の化合物は、別々の医薬用製剤または併合した医薬用製剤で逐次または同時のいずれかで投与され得る。一実施形態において、個々の化合物は、併合した医薬用製剤にて同時に投与される。
さらなる実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、被検体または生物体の呼吸器の疾患、障害または病状を予防または処置するための他の既知の処置剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明のｓｉＮａ分子は、さらなる気道水分補給（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）療法剤、例えば、高張生理食塩水、デヌホソル（ｄｅｎｕｆｏｓｏｌ）、ブロンキトール；ＣＦＴＲ遺伝子療法剤；タンパク質補助／修復剤（ＣＦＴＲ中和剤（ｃｏｒｒｅｃｔｏｒ）、例えば、ＶＸ−８０９（Ｖｅｒｔｅｘ）、ＣＦＴＲ増強剤、例えば、ＶＸ−７７０（Ｖｅｒｔｅｘ）など）；粘液処理剤（パルモザイムなど）；抗炎症処置剤（経口Ｎ−アセチルシステイン、シルデナフィル、吸入型グルタチオン、ピオグリタゾン、ヒドロキシクロロキン、シムバスタチンなど）；抗感染治療薬（アジスロマイシン、アリカーセなど）；移植薬（吸入型シクロスポリンなど）；および栄養補給剤（ａｑｕＡＤＥＫ、パンクレリパーゼ製剤、Ｔｒｉｚｙｔｅｋなど）などとともに使用され得る。したがって、本記載の分子は、被検体または生物体の本明細書に記載の疾患、障害、病状および形質を予防または処置するための、当該技術分野で知られた１種類以上の既知の化合物、処置剤または処置（他のＳＴＡＴ１インヒビターなど）と組み合わせて使用され得る。
３．治療適用
ＳＴＡＴ１研究における現在の一連の知識は、治療的使用のためにＳＴＡＴ１発現を調節することができる方法の必要性を示す。
したがって、本発明の一態様は、被検体に有効量の本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子を投与することを含む、ＳＴＡＴ１の作用によって、または該作用の低下によって媒介される病状に苦しむ被検体（例えば限定されないが、ヒト）の処置方法を含む。この態様の一実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）を含むものである。この態様の別の実施形態では、該病状は、呼吸器疾患であるか、または呼吸器疾患によって引き起こされるものである。本発明のこの態様に従って処置可能な呼吸器疾患としては、ＣＯＰＤ、喘息、好酸球性の咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、副鼻腔炎が挙げられる。具体的な一実施形態において、該使用は、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、および喘息からなる群から選択される呼吸器疾患の処置のためのものである。一部の特定の実施形態では、ｓｉＮＡ分子の投与は、局所投与または全身性投与によるものである。他の実施形態では、本発明は、被検体または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と、該当する組織または細胞（肺の細胞および組織など）への局所投与によって（肺経由送達などによって）接触させることを特色とする。また他の実施形態では、本発明は、被検体または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と、該当する組織または細胞（被検体または生物体の炎症性の疾患、形質または病状の維持または発生に関与している組織または細胞など）への全身性投与によって（ｓｉＮＡの静脈内または皮下投与などによって）接触させることを特色とする。
また、本発明のｓｉＮＡ分子は、エキソビボ適用における試薬として使用される。例えば、ｓｉＮＡ試薬は、治療効果のために被検体に移植される組織または細胞内に導入される。該細胞および／または組織は、後に外植片を受ける生物体または被検体に由来するものであってもよく、移植前の別の生物体または被検体に由来するものであってもよい。ｓｉＮＡ分子は、細胞または組織内の１つ以上の遺伝子の発現を、該細胞または組織がインビボで移植されたとき所望の表現型取得するように、または機能を果たすようにモジュレートするために使用され得る。一実施形態では、一部ＳＴＡＴ１標的細胞を患者から採取する。この採取した細胞を、該細胞内の特定のヌクレオチド配列を標的化するＳＴＡＴ１ ｓｉＮＡと、該細胞によるｓｉＮＡの取込みに適した条件下で接触させる（例えば、カチオン性脂質、リポソームなどの送達試薬を使用するか、または細胞内へのｓｉＮＡの送達を助長するエレクトロポレーションなどの技法を使用する）。次いで、細胞を同じ患者または他の患者に再導入して戻す。
治療適用用途では、本発明のｓｉＮＡ分子または医薬組成物の医薬有効用量が被検体に投与される。医薬有効用量は、疾患状態を予防する、その発生を抑止する、または疾患状態を処置する（症状をある程度、好ましくはあらゆる症状を軽減する）ために必要とされる用量である。当業者は、被検体の体格および体重、疾患の進行または浸透の程度、被検体の年齢、健康状態および性別、投与経路ならびに投与が局所であるか全身性であるかなどの要素を考慮することにより、所与の被検体に投与される本発明のｓｉＮＡの治療有効用量を容易に決定することができよう。一般的に、負電荷を有するポリマーの効力に応じて、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の量の活性成分が投与される。本発明のｓｉＮＡ分子は、単回用量で投与してもよく、反復用量で投与してもよい。
Ｇ．投与
該組成物または製剤は、多種多様な様式で投与され得る。本発明の投与方法の非限定的な例としては、経口、口腔内、舌下、非経口（すなわち、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内）、局所経直腸投与または他の局所投与が挙げられる。一実施形態において、本発明の組成物は、吹送および吸入によって投与され得る。該投与は、単回用量で行なっても分割用量で行なってもよい。一部の実施形態において、医薬組成物は、ボーラス注射によって静脈内または腹腔内投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号を参照のこと）。脂質核酸粒子は、疾患部位への直接注射によって投与してもよく、疾患部位から遠位の部位への注射によって投与してもよい（例えば、Ｃｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０−７１（１９９４）を参照のこと）。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、本明細書に記載の、および当該技術分野で一般的に知られている細胞、被検体または生物体に投与される。
１．インビボ投与
本発明の任意の処置方法において、ｓｉＮＡは、被検体に、本明細書に記載のようにして、あるいは、当該技術分野で知られているようにして、単独療法剤として単独で、または本明細書に記載の、もしくは当該技術分野で知られているさらなる治療薬との組合せでのいずれかで、全身投与され得る。全身投与としては、例えば、肺経由（吸入、噴霧化など）、静脈内、皮下、筋肉内、カテーテル法、鼻咽頭経由、経皮、または当該技術分野で一般的に知られている経口／胃腸投与が挙げられ得る。
一実施形態では、本発明の任意の処置または予防方法において、ｓｉＮＡは被検体に対し、局所に、または局所組織に、本明細書に記載のようにして、あるいは、当該技術分野で知られているようにして、単独療法剤として単独で、または当該技術分野で知られているさらなる治療薬との組合せでのいずれかで、投与され得る。局所投与としては、例えば、吸入、噴霧化、カテーテル法、埋入、直接注射、経真皮／経皮適用、貼付剤、ステント挿入、点耳／点眼剤、または該当組織への門脈投与、または当該技術分野で一般的に知られている任意の他の局所投与手法、方法もしくは処置が挙げられ得る。
本発明の化合物は、全身性グルココルチコイド受容体アゴニスト療法が指示されている場合は、一般に、内服によって施与され得る。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、肝臓に、当該技術分野で一般的に知られているようにして投与される（例えば、Ｗｅｎら，２００４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１０，２４４−９；Ｍｕｒａｏら，２００２，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．，１９，１８０８−１４；Ｌｉｕら，２００３，ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１０，１８０−７；Ｈｏｎｇら，２００３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５４，５１−８；Ｈｅｒｒｍａｎｎら，２００４，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．，１４９，１６１１−７；およびＭａｔｓｕｎｏら，２００３，ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０，１５５９−６６を参照のこと）。
一実施形態において、本発明は、単球およびリンパ球などの造血細胞への本発明のｓｉＮＡ分子の送達方法の使用を特色とする。このような方法は、Ｈａｒｔｍａｎｎら，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８５（２），９２０−９２８；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ，９１（３），８５２−８６２；ＦｉｌｉｏｎおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１３２９（２），３４５−３５６；ＭａおよびＷｅｉ，１９９６，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２０（１１／１２），９２５−９３０；ならびにＢｏｎｇａｒｔｚら，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２），４６８１−８に詳細に記載されている。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、真皮または小胞に、直接または経表面的（例えば、局所的）に、当該技術分野で一般的に知られているようにして投与される（例えば、Ｂｒａｎｄ，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，３，２４４−８；Ｒｅｇｎｉｅｒら，１９９８，Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ，５，２７５−８９；Ｋａｎｉｋｋａｎｎａｎ，２００２，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，１６，３３９−４７；Ｗｒａｉｇｈｔら，２００１，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，９０，８９−１０４；ならびにＰｒｅａｔおよびＤｕｊａｒｄｉｎ，２００１，ＳＴＰ ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅｓ，１１，５７−６８を参照のこと）。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、直接または経表面的に、アルコール（例えば、エタノールまたはイソプロパノール）、水を含み、任意選択でミリスチン酸イソプロピルおよびカルボマー９８０などのさらなる薬剤を含む水性アルコールゲル製剤を用いて投与される。他の実施形態では、ｓｉＮＡは、鼻腔に経表面投与するために製剤化される。経表面用調製物は、罹患領域に１日１回以上の適用によって投与され得る；皮膚領域全体の閉鎖包帯が好都合に使用され得る。連続または長期送達は、接着性レザーバ系によって行なわれ得る。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、イオン導入的に、例えば、特定の器官または区画（例えば、目、眼底、心臓、肝臓、腎臓、膀胱、前立腺、腫瘍、ＣＮＳなど）に投与される。イオン導入的送達の非限定的な例は、例えば、国際公開第０３／０４３６８９号および同第０３／０３０９８９号（これは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、肺に、本明細書に記載のようにして、および当該技術分野で一般的に知られているようにして投与される。別の実施形態では、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤または組成物は、肺の組織および細胞に、米国特許出願公開第２００６／００６２７５８号；同第２００６／００１４２８９号；および同第２００４／００７７５４０号に記載のようにして投与される。
２．エアロゾル剤および送達デバイス
ａ．エアロゾル製剤
本発明の組成物は、単独、または他の適切な成分との組合せのいずれかで、エアロゾル製剤にされ（すなわち、「霧状にされ」得る）、吸入によって（例えば、鼻腔内または気管内）投与され得る（Ｂｒｉｇｈａｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）参照）。エアロゾル製剤は、許容され得る加圧噴射剤中（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）に収容され得る。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子およびその製剤は、肺経由送達によって、例えば、該当する肺系組織内への該核酸分子の速やかな局所取込みをもたらす吸入デバイスまたはネブライザによって投与されるエアロゾル製剤または噴霧乾燥製剤の吸入によって投与される。微粉化核酸組成物の呼吸用乾燥粒子を含む固形微粒状組成物は、乾燥または凍結乾燥させた核酸組成物を磨砕し、次いで、この微粉化組成物を、例えば、４００メッシュスクリーンに通し、大きな凝集塊を分解または解離させることにより調製され得る。本発明のｓｉＮＡ組成物を含む固形微粒状組成物には、任意選択で、エアロゾルの形成を助長する機能を果たす分散化剤ならびに他の治療用化合物を含めてもよい。適切な分散化剤はラクトースであり、これは核酸化合物と、任意の適切な比率（例えば、重量基準で１：１の比）でブレンドされ得る。
本発明のｓｉＮＡ分子または組成物スプレー剤組成物は、例えば、加圧パック（定量吸入器など）から、適切な液化噴射剤の使用を伴って送達される水性の液剤もしくは懸濁剤またはエアロゾル剤としてとして製剤化され得る。一実施形態において、吸入に適した本発明のエアロゾル剤組成物は懸濁剤または液剤のいずれかであり得、一般的に、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）を含むｓｉＮＡ分子と、適切な噴射剤（例えば、フルオロカーボンまたは水素含有クロロフルオロカーボンまたはその混合物、特に、ヒドロフルオロアルカン、特に、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン、またはその混合物）を含む。エアロゾル剤組成物には、任意選択で、界面活性剤などの、当該技術分野でよく知られたさらなる製剤用賦形剤を含めてもよい。非限定的な例としては、オレイン酸、レシチンまたはオリゴ乳酸もしくはその誘導体（国際公開第９４／２１２２９号および同第９８／３４５９６号に記載のものなど）ならびに共溶媒（例えば、エタノール）が挙げられる。一実施形態において、本発明の医薬用エアロゾル製剤は、本発明の化合物と、噴射剤としてフルオロカーボンまたは水素含有クロロフルオロカーボンまたはその混合物とを、任意選択で界面活性剤および／または共溶媒と組み合わせて含むものである。
本発明のエアロゾル製剤は、適切な緩衝剤の添加によって緩衝されたものであってもよい。
エアロゾル製剤には、製剤が滅菌状態に調製されていない場合、保存料などの任意選択の添加剤が含まれ得る。非限定的な例としては、安息香酸メチルヒドロキシ、酸化防止剤、フレーバー、揮発油、緩衝剤および乳化剤および他の製剤用界面活性剤が挙げられる。一実施形態では、分解を低減させるため、およびより安全な生体適合性非液状微粒状の本発明の懸濁剤組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を提供するために、フルオロカーボンまたはパーフルオロカーボン担体が使用される。別の実施形態では、ネブライザを含むデバイスによって、静菌性の含フッ素化学物質を含み、それにより、適合性デバイス内での微生物の増殖の可能性を減少させる本発明の組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を送達する。
吸入器または吹送器における使用のための、例えばゼラチン製の、本発明の組成物を含むカプセル剤およびカートリッジ剤が製剤化され得、これは、本発明の化合物と適切な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）の吸入用粉末ミックスを含む。一実施形態において、各カプセル剤またはカートリッジ剤は、配列番号：６、配列番号：１００、配列番号：２２、配列番号：１０１、配列番号：２３、配列番号：１０２、配列番号：２４、配列番号：１０３、配列番号：２７、もしくは配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含む；または配列番号：３９と配列番号：４０、もしくは配列番号：７１と配列番号：７２、もしくは配列番号：７３と配列番号：７４、または配列番号：７５と配列番号：７６、もしくは配列番号：８１と配列番号：８２、または式（Ａ）を含むｓｉＮＡ分子と、１種類以上の賦形剤とを含む。別の実施形態では、本発明の化合物は、ラクトースなどの賦形剤なしで提示され得る。
本発明のエアロゾル剤組成物は、呼吸器系内に、呼吸用サイズの粒子、例えば、吸入時に鼻、口および喉頭を通過し、さらに肺の気管支および肺胞に至るのに充分小さいサイズの粒子を含む製剤として投与され得る。一般に、呼吸用粒子は、サイズが約０．５〜１０ミクロンの範囲である。一実施形態において、該微粒状範囲は１〜５ミクロンであり得る。別の実施形態では、微粒状範囲は２〜３ミクロンであり得る。エアロゾル剤に含まれた呼吸用でないサイズの粒子は喉に堆積され、嚥下される傾向にあり、したがって、エアロゾル剤中の呼吸用でない粒子の量は最小限となる。経鼻投与では、鼻腔内での保持を確保するため、１０〜５００ｕｍの範囲の粒径が好ましい。
一部の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ組成物は、鼻に、例えば鼻炎の処置のために、加圧ポンプまたは噴霧化によって鼻に投与される加圧エアロゾル製剤、水性製剤によって経表面投与される。好適な製剤は、この目的のための希釈剤または担体として、水を含む。一部の特定の実施形態では、肺または鼻への本発明の組成物の投与のための水性製剤は、例えば、緩衝剤、張度加減剤などの慣用的な賦形剤を用いて提供され得る。
ｂ．デバイス
本発明のｓｉＮＡ分子は、上記のような粒子および／またはエアロゾル剤として製剤化および送達され得、当業者に知られた種々のエアロゾル化デバイスから投薬され得る。
本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を含む液状または非液状粒子のエアロゾル剤は、任意の適切な手段によって、例えば、ネブライザ（例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照のこと）（超音波式または空気ジェット式ネブライザなど）を含むデバイスを用いて作製され得る。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子を投与するためのネブライザは、本発明の組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を機械的に撹拌して医薬用エアロゾル雲霧を生成させる高エネルギー超音波を発生させるために、圧電性セラミックオシレータを駆動させる振動シグナルに依存するものである（例えば、米国特許第７，１２９，６１９ Ｂ２号および同第７，１３１，４３９ Ｂ２号を参照のこと）。別の実施形態では、ネブライザは、エアロゾル雲霧中で液滴を形成するために圧縮空気と本発明の組成物（例えば、ｓｉＮＡおよび／またはそのＬＮＰ製剤）を空気ジェット式で混合することに依存するものである。
本発明のｓｉＮＡ分子または製剤とともに使用されるネブライザデバイスでは、担体（典型的には、水）または本発明のｓｉＮＡ分子を含む希釈した水性もしくは非水性の液剤が使用され得る。本発明の一実施形態は、好ましくは、例えば、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を含む塩化ナトリウムまたは他の適切な塩の添加によって体液と等張性にしたアルコール性の液剤が使用される、ネブライザを含むデバイスである。別の実施形態では、ネブライザデバイスは、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を含む１種類以上の非水性含フッ素化学物質担体を含む。
本発明のｓｉＮＡ分子または製剤および界面活性剤を含む固形粒子エアロゾル剤は、任意の固形微粒状エアロゾル発生器を用いて作製され得る。一実施形態において、エアロゾル発生器は、固形微粒状薬剤を被検体に投与するために使用される。このような発生器では、以下に説明するような呼吸用粒子が所定の定量の組成物として生成される。本発明の一部の特定の実施形態は、少なくとも１種類の本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を有する微粒子と、呼吸器用ブレンドを得るための所定の容量の懸濁媒体または界面活性剤との組合せを含むエアロゾルを含むものである。本発明の他の実施形態は、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を含むエアロゾル発生器を含むものである。
本発明のｓｉＮＡ分子とともに使用される固形粒子エアロゾル発生器の型の一例は、吹送器である。吹送による投与に好適な製剤としては、吹送器によって送達され得る微細に粉砕された粉末剤が挙げられる。吹送器では、粉末剤（例えば、本明細書に記載の処置を行なうために有効なその定量）がカプセル剤またはカートリッジ剤に内包され、該カプセル剤またはカートリッジ剤は、典型的には、ゼラチンまたはプラスチック製であり、インサイチュで穿孔されるか、または開口されるかのいずれかであり、粉末剤は、吸入時にデバイスに吸引される空気によって、または手動操作式ポンプによって送達される。吹送器に使用される粉末剤は、活性成分のみからなるもの、または活性成分、適切な粉末希釈剤（ラクトースなど）、および任意選択の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなるもののいずれかである。例示的なエアロゾル発生器の第２の型は、定量吸入器（「ＭＤＩ」）を含むものである。
ＭＤＩは、加圧エアロゾルディスペンサーであり、典型的には、液化噴射剤中の活性成分の懸濁または溶液の製剤を含む。使用時、このようなデバイスにより、製剤は、定容量を送達して活性成分微粒子スプレーが生成されるように適合された弁から排出される。好適な噴射剤としては、一部の特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびその混合物が挙げられる。製剤には、さらに、１種類以上の共溶媒（例えば、エタノール）、乳化剤および他の製剤用界面活性剤（オレイン酸またはソルビタントリオレエートなど）、酸化防止剤ならびに適切なフレーバー剤が含まれ得る。他の肺経由送達方法は、例えば、米国特許出願公開第２００４００３７７８０号、および米国特許第６，５９２，９０４号；同第６，５８２，７２８号；同第６，５６５，８８５号に記載されている。
ＭＤＩのキャニスターは、典型的には、使用される噴射剤の蒸気圧に耐え得る容器を含み、該容器は、プラスチックボトルもしくはプラスチック−コーティングされたガラス製ボトル、または好ましくは金属缶（例えば、アルミニウムもしくはその合金製のもの、これは、任意選択で陽極酸化処理されたものであってもよい）、ラッカー−コーティングおよび／またはプラスチック−コーティングされたもの（例えば、引用により本明細書に組み込まれる国際公開第９６／３２０９９号の、内表面の一部または全部が１種類以上のフルオロカーボンポリマー（任意選択で、１種類以上の非フルオロカーボンポリマー、例えば、限定されないが、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）とポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）のポリマーブレンドなどとの組合せ）でコーティングされているもの）などであり、計量弁で閉鎖されている。計量弁は、１回の作動で定量の製剤が送達されるように、および弁からの噴射剤の漏出を抑制するガスケットが組み込まれるように設計されている。ガスケットは、任意の適切なエラストマー材料、例えば、低密度ポリエチレン、クロロブチル、ブロモブチル、ＥＰＤＭ、モノクロブタジエン−アクリロニトリルゴム、ブチルゴムおよびネオプレンなどで構成されたものであり得る。好適な弁は、エアロゾル業界でよく知られた製造業者から、例えば、Ｖａｌｏｉｓ，フランス（例えば、ＤＦ１０、ＤＦ３０、ＤＦ６０）、Ｂｅｓｐａｋ ｐｉｃ，ＵＫ（例えば、ＢＫ３００、ＢＫ３５７）および３Ｍ−Ｎｅｏｔｅｃｈｎｉｃ Ｌｔｄ，ＵＫ（例えば、Ｓｐｒａｙｍｉｓｅｒ（商標））から市販されている。
本明細書において教示するｓｉＮＡ分子または製剤を含むＭＤＩは、当該技術水準の方法によって調製され得る（例えば、Ｂｙｒｏｎ（上記）および国際公開第９６／３２０９９号参照）。
また、本発明のｓｉＮＡ分子とともに使用されるＭＤＩは、他の構造体とともに、例えば、限定されないが、ＭＤＩを保存および収容するためのオーバーラップパッケージ（例えば、米国特許第６，１１９，８５３号；同第６，１７９，１１８号；同第６，３１５，１１２号；同第６，３５２，１５２号；同第６，３９０，２９１号；および同第６，６７９，３７４号に記載のもの）、ならびに投与回数カウンターユニット（限定されないが、米国特許第６，３６０，７３９号および同第６，４３１，１６８号に記載のものなど）とともに使用してもよい。
また、ｓｉＮＡ分子を、流動体ディスペンサーからの送達のための流動体製剤として製剤化してもよく、流動体ディスペンサーは、例えば、ユーザーによる負荷力が流動体ディスペンサーのポンプ機構に負荷されると、施薬される定量の流動体製剤が通る施薬ノズルまたは施薬オリフィスを有するものである。本発明の一実施形態では、多数の定量流動体製剤のレザーバが使用され、該定量はポンプの逐次作動により施薬可能であり、かつ本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を含む流動体ディスペンサーを提供する。一部の特定の実施形態では、ディスペンサーの施薬ノズルまたはオリフィスは、鼻腔内へのｓｉＮＡ分子または製剤を含む流動体製剤の噴霧施薬のために、ユーザーの外鼻孔内に挿入されるように構成され得る。前記の型の流動体ディスペンサーは、国際公開第０５／０４４３５４号に説明および図解されている。該ディスペンサーは、流動体製剤を含めるための容器に載置された圧縮ポンプを有する流動体排出デバイスを収容するハウジングを有する。種々の実施形態において、ディスペンサーのハウジングは、指で操作可能な少なくとも１つのサイドレバーを有し、該サイドレバーはハウジングに対して内側に可動性であり、ハウジング内で該容器が上方にカム動作し、ポンプに圧がかかって定量の製剤がポンプ幹部からハウジングの経鼻ノズルを経由してポンプ輸送されるようになっている。別の実施形態では、流動体ディスペンサーは、国際公開第０５／０４４３５４号の図３０〜４０に図解された一般的な型のものである。
本発明の一部の特定の実施形態では、ネブライザデバイスが、意識があり、自発呼吸する被検体、および調節呼吸下のあらゆる年齢の被検体に対する適用において使用される。ネブライザデバイスは、肺への経表面および全身性の標的化薬物送達のために使用され得る。一実施形態において、ネブライザを含むデバイスは、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤は、肺または肺系組織に局所送達するために使用される。別の実施形態では、ネブライザを含むデバイスは、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を全身送達するために使用される。
他の実施形態では、ネブライザデバイスは、少なくとも１種類の活性薬剤のエマルジョン、マイクロエマルジョン、またはサブミクロンおよびナノ粒子状の懸濁液を含む呼吸器用分散剤を送達するために使用される（例えば、米国特許第７１２８，８９７号および同第７，０９０，８３０ Ｂ２号を参照のこと）。
ネブライザデバイスは、本発明のｓｉＮＡ分子または製剤を含むエアロゾル剤を、連続的または定期的に投与するために使用され得、手動で、自動で、または患者の呼吸と連動して調節され得る（米国特許第３，８１２，８５４号、国際公開第９２／１１０５０号参照）。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子の定期的投与は、マイクロチャンネル押出しチャンバによって単回ボーラスとして行なわれてもよく、サイクル式加圧によって行なわれてもよい。投与は、１日１回であってもよく、１日数回（例えば、２、３、４または８回）で、各回に、例えば、１、２または３回用量を投与してもよい。吸入器または吹送器でカプセル剤またはカートリッジ剤によって送達される全日用量および定量は、一般的に、エアロゾル製剤で送達される量の２倍である。
Ｈ．本発明のｓｉＮＡ分子の他の適用／使用
本発明のｓｉＮＡ分子は、診断適用、研究適用および／または医薬（ｍｅｄｉｃａｎｔ）の製造のためにも使用され得る。
一態様において、本発明は、被検体の疾患、形質または病状の診断方法であって、被検体に本発明の組成物を該被検体の該疾患、形質または病状の診断に適した条件下で投与することを含む、方法を特色とする。
一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ハプロタイプ多型によって生じ、被検体または生物体の形質、疾患または病状と関連しているＳＴＡＴ１タンパク質の発現を下方調節または阻害するために使用される。ＳＴＡＴ１遺伝子またはＳＴＡＴ１タンパク質もしくはＲＮＡレベルの解析は、かかる多型を有する被検体、または本明細書に記載の形質、病状もしくは疾患が発生するリスクのある被検体を特定するために使用され得る。このような被検体は、処置に対して、例えば、本発明のｓｉＮＡ分子および標的遺伝子発現に関連する疾患の処置に有用な任意の他の組成物での処置に対して寛容である。そのため、ＳＴＡＴ１タンパク質またはＲＮＡレベルの解析を用いて、被検体の処置における処置の型および治療過程が決定され得る。ＳＴＡＴ１タンパク質またはＲＮＡレベルのモニタリングを使用し、処置の結果が予測され、該形質、障害、病状または疾患と関連している特定のＳＴＡＴ１タンパク質のレベルおよび／または活性をモジュレートする化合物および組成物の有効性が判定され得る。
別の実施形態では、本発明は、医薬の製造における使用のための本発明による二本鎖核酸の使用を含む。一実施形態において、医薬は、ＳＴＡＴ１の作用によって、または該作用の低下によって媒介される病状の処置における使用のためのものである。一実施形態において、医薬は、呼吸器疾患の処置に使用するためのものである。一実施形態において、医薬は、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、喘息、好酸球性の咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎からなる群から選択される呼吸器疾患の処置に使用するためのものである。具体的な一実施形態において、該使用は、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、および喘息からなる群から選択される呼吸器疾患の処置のためのものである。
一部の特定の実施形態では、２５３５１−ＤＣ、２５３６７−ＤＣ、２５３６８−ＤＣ、２５３６９−ＤＣ、および２５３７２−ＤＣのｓｉＮＡ、ならびに少なくとも１つの鎖が配列番号：６、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２７、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、または配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含むｓｉＮＡ、ならびに式Ａを含むｓｉＮＡは、例えば、限定されないが、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、喘息、好酸球性の咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎などの呼吸器疾患の処置方法における使用のためのものである。
Ｉ．実施例
次に、本発明を、以下の非限定的な例とともに説明する。当業者には、本質的に同じ結果が得られる変更または修正され得る多種多様なノンクリティカルパラメータが容易に認識されよう。
実施例１：ＳＴＡＴ１に対するｓｉＮＡ活性体の設計、合成および同定
ＳＴＡＴ１ ｓｉＮＡの合成
一連の２８個のｓｉＮＡ分子を設計し、合成し、ＳＴＡＴ１に対する有効性について評価した。ヒトｓｉＮＡのためのＳＴＡＴ１の設計のための主な基準は、（ｉ）２つの種（ヒトとマウス）間の相同性、および（ｉｉ）プロプライエタリアルゴリズムで測定したときの高い有効性スコアであった。また、マウス配列も、動物モデルにおける使用のために調べた。また、ＳＴＡＴ１ ＲＮＡレベルに対するｓｉＮＡの効果、およびＳＴＡＴ１タンパク質レベルに対する一部のｓｉＮＡの効果も調べた。設計し、合成し、ＳＴＡＴ１に対する有効性について評価したｓｉＮＡの配列を表１ａ（標的配列）および表１ｂ（修飾配列）に示す。
表1ａ
Figure 2012521763
標的配列の各オリゴヌクレオチドについて、ｓｉＮＡの２つの個々の相補鎖は、固相合成を用いて別々に合成し、次いで、逆相固相抽出（ＳＰＥ）によって別々に精製した。相補鎖をアニーリングさせて二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ／ｄｕｐｌｅｘ）を形成し、所望の濃度で選択したバッファーにて送達した。
簡単には、一本鎖オリゴヌクレオチドを、自動固相合成装置でホスホルアミダイト化学反応を用いて合成した（これは、当該技術分野で一般的に知られている）（例えば、ＵＳＳＮ １２／０６４，０１４を参照のこと）。合成用カラムに、第１ヌクレオシド残基で誘導体化した固相支持体を充填した。合成は、酸不安定性５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基の脱トリチル化によって５’−ヒドロキシルを放出させることにより開始した。ホスホルアミダイトと適切な活性剤（アセトニトリル中）を、合成用カラムに同時に送達すると、５’−ヒドロキシルへのアミダイトのカップリングがもたらされた。次いで、カラムをアセトニトリルで洗浄した。ヨウ素溶液をカラム中にポンプ輸送し、亜リン酸トリエステル結合Ｐ（ＩＩＩ）をそのホスホトリエステルＰ（Ｖ）類似体に酸化させた。未反応の５’−ヒドロキシル基を、２，６−ルチジンおよびＮ−メチルイミダゾールの存在下、無水酢酸などの試薬を用いてキャップした。次のホスホルアミダイト組込みのため、脱トリチル化工程により伸長サイクルを再開させた。このプロセスを、所望の配列が合成されるまで繰り返した。合成は、最後の５’末端保護基（トリチルまたは５’−Ｏ−ジメトキシトリチル）により終結させた。
合成が終了したら、固相および結合オリゴヌクレオチドをアルゴン圧下または真空下で乾燥させた。水性塩基を添加し、混合物を加熱し、スクシニル結合の切断、リン酸シアノエチル保護基の除去、および環外アミン保護の脱保護を行なった。
以下のプロセスを、リボヌクレオチドを含まない単独鎖において行なう。固相支持体を水性塩基で処理後、混合物を濾過し、固相支持体を、脱保護された粗製合成物質から分離する。次いで、固相支持体を水ですすぎ洗浄し、これを濾液と合わせる。得られた塩基性溶液により、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基の保持が５’末端位置に残存すること（トリチル−オン）が可能になる。
リボヌクレオチドを含む単独鎖に対し、以下のプロセスを行なった。固相支持体を水性塩基で処理した後、混合物を濾過し、固相支持体を脱保護された粗製合成物質から分離した。次いで、固相支持体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ですすぎ洗浄し、これを濾液と合わせた。この混合物に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩などのフッ化物試薬を添加し、溶液を加熱した。反応液を適切なバッファーでクエンチし、最後の５’末端位置に５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基を有する粗製単独鎖の溶液を得た。
各粗製単独鎖のトリチル−オン溶液を、クロマトグラフィー精製（ＳＰＥ ＲＰＣ精製など）を用いて精製した。トリチル基の疎水性の性質により、非トリチル化切断型の不完全配列よりも強力な所望の完全長オリゴの保持が可能である。不完全配列は、少量割合のアセトニトリルなどの適切な溶媒で、レジンから選択的に洗い流した。次いで、保持されたオリゴヌクレオチドを、トリフルオロ酢酸を用いてカラム上で脱トリチル化し、酸不安定性トリチル基を除去した。残留している酸をカラムから洗い流し、塩交換を行ない、物質の最終の脱塩を開始させた。完全長オリゴ体を、水性有機溶媒を用いて精製形態で回収した。次いで、最終生成物を、純度（ＨＰＬＣ）、実体（Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ ＭＳ）および収率（ＵＶ Ａ２６０）について解析した。オリゴ体を真空乾燥または真空濃縮によって乾燥させた。
アニーリング：生成物の解析に基づき、乾燥させたオリゴ体を適切なバッファーに溶解させた後、等モル量（理論消衰係数を用いて計算）のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を混合した。次いで、この溶液を、二本鎖の純度（クロマトグラフィー法により）および所望の終濃度について解析した。解析によっていずれかの鎖が過剰であることが示された場合は、過剰でない鎖を添加し、二本鎖形成が完全になるまで滴定した。解析によって目的の生成物純度が得られたことが示された場合、該物質を搬送し、使用可能状態とした。
以下は、このプロトコルを用いて合成した種々のｓｉＮＡを示す表である。
表１ｂ
Figure 2012521763
Figure 2012521763
市販の調製物のさらなる合成工程
アニーリング工程後、解析によって所望の生成物純度が得られたことが示されたら、該物質を、濃縮および脱塩のためにタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムに移す（これをアニーリング工程の前に行なうのとは対照的）。
限外濾過：アニーリング生成物溶液は、適切な分子量カットオフ膜を含むＴＦＦシステムを用いて濃縮する。濃縮後、この生成物溶液を、濾液の電導度が水のものになるまで、ダイアフィルトレーションによってＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて脱塩する。
凍結乾燥：濃縮した溶液をボトルに移し、フラッシュ凍結させ、凍結乾燥機に取り付ける。次いで、生成物をフリーズドライして粉末にする。ボトルを凍結乾燥機から取り出すと、このとき、使用可能状態になっている。
初期スクリーニングプロトコル（９６ウェルプレートトランスフェクション）
細胞培養物の調製：
細胞はすべて、特に記載のない限り、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から取得した。細胞は、標準的な条件下（これは、以下に、各細胞株で詳述する）で培養し、トランスフェクトした。
Ａ５４９（ヒト；ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ−１８５）：細胞は、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で培養し、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含むように調整し、終濃度１０％のウシ胎仔血清、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを補給した２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ハムＦ１２Ｋ培地中で増殖させた。
ＮＩＨ ３Ｔ３（マウス；ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１６５８）：細胞は、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で培養し、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムおよび４．５ｇ／Ｌのグルコースを含むように調整し、終濃度１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを補給した４ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。
トランスフェクションおよびスクリーニング
細胞を、組織培養物用処理済９６ウェルプレートのすべてのウェル内で、１００μＬの適切な培養培地中、５０００細胞／ウェルの最終計数でプレーティングした。細胞は、プレーティング後、３７℃で５％ＣＯ２の存在下、２４時間培養した。
２４時間後、ｓｉＮＡとＲＮＡｉＭａｘを含む複合体を、以下のようにして作製した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３３倍に希釈したＲＮＡｉＭａｘの溶液を調製した。並行して、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中１２０ｎＭの終濃度までの試験用のｓｉＮＡの溶液を調製した。室温で５分間のＲＮＡｉＭａｘ／ＯＰＴＩ−ＭＥＭ溶液のインキュベーション後、各ｓｉＮＡで、等容量のｓｉＮＡ溶液とＲＮＡｉＭａｘ溶液を一緒に添加した。
混合すると、ｓｉＮＡの濃度が６０ｎＭであるｓｉＮＡ／ＲＮＡｉＭａｘ溶液が生成された。この溶液を室温で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、２０ｕＬの溶液を、該当する各ウェルに添加した。各ウェル内のｓｉＮＡの終濃度は１０ｎＭであり、各ウェル内のＲＮＡｉＭａｘの最終容量は０．３ｕｌであった。
ＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＮＡ複合体とのインキュベーション時間は２４時間とし、特に記載のない限り、トランスフェクションと収集とで培地は変えなかった。
ＲＮＡ単離用（９６ウェルプレート）
ＲＮＡを９６ウェルプレートから、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ（商標） Ｋｉｔ（カタログ番号４３９９００２）を使用し、修正プロトコルを用いて抽出した。簡単には、６０ｕＬ（１プレート）または１１０ｕＬ（２プレート）のＤＮａｓｅ Ｉ含有溶解溶液を、溶解バッファープレート（ｔｗｉｎ．ｔｅｃフルスカートプレート）の各ウェル内に分注した。溶解バッファーおよび停止プレートは、細胞を洗浄するまで４℃で保存した。
培養培地を吸引して培養プレートのウェルから廃棄した。５０ｕＬの低温ＤＰＢＳを各ウェルに添加し、次いで、吸引し、廃棄した。溶解は、ＢｉｏＭｅｋ ＦＸの機器および方法を用いて自動で行なった。Ｂｉｏｍｅｋ法を終了後、溶解プレートを室温で２分間インキュベートした。溶解プレートは、４℃で２時間、または−２０℃もしくは−８０℃で２ヶ月保存され得る。
逆転写プレートの各ウェルには、１０ｕＬの２×逆転写酵素バッファー、１ｕＬの２０×逆転写酵素および２ｕＬのヌクレアーゼ無含有水が必要であった。逆転写マスターミックスは、２×逆転写バッファー、２０×逆転写酵素ミックス、およびヌクレアーゼ無含有水を混合することにより調製した。１３ｕＬの逆転写マスターミックスを、逆転写プレートの各ウェル内に分注した（セミスカート付き）。各細胞プレートに対して別の逆転写プレートを準備した。プレートをＢｉｏｍｅｋ ＮＸまたはＢｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｄｕａｌ−９６に載せ、Ｂｉｏｍｅｋ法を実行した。このプログラムは、上記の細胞溶解手順による溶解物の７ｕＬが、逆転写プレートの各ウェルに自動的に添加されるようにプログラムされている。プレートを密封し、遠心機でスピンさせ（１０００ｒｐｍで３０秒間）、内容物を逆転写プレートの底に沈降させる。プレートをサーモサイクラー内に、３７℃で６０分間、９５℃で５分間、および４℃で、プレートをサーモサイクラーから取り出すまで入れる。取り出したら、すぐに使用しない場合は、プレートを−２０℃で凍結させた。
６ウェルプレートトランスフェクションプロトコル
Ａ５４９細胞を６ウェルプレート内に２ｍｌの完全増殖培地（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２，Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号１０−０８０−ＣＶ＋１０％ＦＢＳ）中、７０，０００細胞／ウェルの最終計数でプレーティングした。トランスフェクションは、２．５ｕＬのＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１３７７８−１５０）／ウェルｓｉＮＡの終濃度は、３０、３、０．３、０．０３、０．００３および０．０００３ｎＭとし、２連で実施した。ｓｉＮＡを２４〜７２時間インキュベートした。２連の試料をプールし、「ＰＡＲＩＳ」Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｂｉｏｎ製，カタログ番号１９２１）を用いてタンパク質溶解物およびＲＮＡを調製した。この溶解物中の全タンパク質を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カタログ番号５００−０２０５）を用いて測定した。タンパク質試料に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングを行ない、ＲＮＡ試料に対してＲＴ−ＰＣＲを行なった。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）
一連のプローブおよびプライマーを使用し、β−アクチン（ヒト細胞株のみ）、ならびにマウスおよびヒト細胞株においてＳＴＡＴ１およびＧＡＰＤＨの遺伝子の種々のｍＲＮＡ転写物を検出した。ここに記載の実験でのＴａｑｍａｎプローブおよびプライマーはすべて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．により事前に確認済の組として供給されたものである（表２参照）。
表２
Figure 2012521763
アッセイは、ＡＢＩ ７９００機器で、製造業者の使用説明書に従って行なった。
各実験において、増幅曲線の対数増殖期にベースラインを設定し、ベースラインと増幅曲線の交点に基づいて、機器にＣｔ値を割り当てた。
ＳＴＡＴ１ウエスタンブロット
ウエスタンブロット実験のためのタンパク質供給源は、上記の６ウェルプレート内でのＡ５４９細胞のトランスフェクション由来のものとした。
タンパク質試料を、５％β−メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉバッファー中で１：１に希釈し、９５℃で５分間インキュベートした。１０ｕｇのタンパク質を７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルの各レーン負荷した。レーンの１つをＭａｇｉｃＭａｒｋタンパク質標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＬＣ５６０２）に指定した。別のレーンをＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カタログ番号１６１−０３７４）に指定した。ゲルに１００Ｖをほぼ２時間印加した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に１００Ｖで６０分間移した。移し終わったら、膜を１％のカゼイン含有ＰＢＳ（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１６１−０７８３）中で１時間、プレート振盪機において室温でブロックした後、１％のカゼイン含有ＰＢＳ中で１：５００に希釈したＳＴＡＴ１一次抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カタログ番号６１０１８５）とともに、４℃一晩インキュベーションした。翌日、ブロットをＰＢＳＴ溶液中で４×５分間洗浄し、１％のカゼイン含有ＰＢＳ中で１：２０，０００に希釈したヤギ抗マウス二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号３ ３１４３０）とともに、室温で３０分間インキュベートした。次いで、ブロットをＰＢＳＴで４×５分間洗浄し、ＰＢＳですすぎ洗浄し、ＥＣＬウエスタンブロット用基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，カタログ番号３２１０６）とともに１分間インキュベートした。バンドを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＶｅｒｓａＤｏｃ Ｉｍａｇｅｒにおいて可視化した。
上記のウエスタンブロットアッセイを使用し、本発明のｓｉＮＡ分子によりＳＴＡＴ１タンパク質レベルが低減されることを確認した。
計算
対象遺伝子の発現レベルおよびノックダウン％を、比較Ｃｔ法を用いて計算した。
相対発現レベル
特に記載のない限り、非標的化用対照ｓｉＮＡを、最も関連性のある対照であるため、ノックダウン％を計算するための値として選択した。
また、標準化したデータ（これは、細胞の一般的な健全状態およびＲＮＡ抽出量を反映する）のみを調べた。これは、処理細胞において２種類の異なるｍＲＮＡ（第１のものは標的ｍＲＮＡであり、第２のものは標準体ｍＲＮＡである）のレベルを調べることにより行なった。これにより、対象遺伝子のノックダウンだけでなく、細胞に毒性である可能性があるｓｉＮＡの排除が可能であった。これは、各ウェル内のＧＡＰＤＨのＣｔを、プレート全体のＣｔと比較することにより行なった。
ＩＣ５０の計算はすべて、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １０．０ソフトウェアを用いて行なった。データは、単純なリガンド結合のＳ字状曲線の用量−応答（傾きが変動する）等式を用いて解析した。ノックダウン％の計算ではすべて、特に記載のない限り、計算は、非標的化用対照（Ｃｔｒｌ ｓｉＮＡ）で処理した試料中の対象遺伝子の標準化した発現レベルを基準にして行なった。
タンパク質レベルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＶｅｒｓａＤｏｃ Ｉｍａｇｅｒを装置の一部であるプロトコルに従って用いて定量した。各レーンにおいて、同一サイズの面積を用いてピクセル計数を行なった。次いで、各試料を適切な対照処理試料と比較し、対照と比較した残留タンパク質の割合に変換した。
結果：
ＳＴＡＴ１ ｓｉＮＡは、先に記載のようにして設計および合成した。ｓｉＮＡは、２種類の細胞株、ヒトＡ５４９細胞およびマウスＮＩＨ ３Ｔ３においてスクリーニングした。両方の種でのＳＴＡＴ１ ｓｉＮＡのスクリーニングのデータを表３に示す。ヒトＳＴＡＴ１ ｍＲＮＡのノックダウンレベルおよびマウスＳＴＡＴ１ ｍＲＮＡノックダウンレベルは、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して標準化している。各スクリーニングは、２４時間の時点で行なった。この時間点を使用する決定は、この時点で見られるｍＲＮＡのノックダウンの度合いを基にした。示した結果は２つの実験から計算した平均ＫＤ％である。
表３
Figure 2012521763
一部の特定のｓｉＮＡを、ヒトＡ５４９細胞およびマウス ＮＩＨ３Ｔ３細胞における有効性についてさらに解析した。結果を表４に示す。ＫＤ／減少の割合は、平均±Ｓ．Ｄ．で示している。ＩＣ５０を平均±Ｓ．Ｄ．で示す。データは少なくとも３つの別々の実験のまとめであり、各実験において、データ点はｎ＝２で計算したものである。使用したｓｉＮＡの終濃度は３０ｎＭであった。
表４
Figure 2012521763
表４のｓｉＮＡがＳＴＡＴ３に影響を及ぼさないことを確認するため、Ａ５４９細胞において１ｎＭの最終ｓｉＲＮＡ濃度での典型的なＳＴＡＴ１スクリーニング後、ヒトＳＴＡＴ３特異的Ｔａｑｍａｎ試薬を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を行なった。ＳＴＡＴ３の発現レベルをＧＡＰＤＨレベルに対して標準化した。いずれのリードＳＴＡＴ１ ｓｉＲＮＡでの処置でも、１ｎＭ（ｓｉＲＮＡのＩＣ５０の１０〜１００倍）において、ヒトまたはマウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現に対する有意な効果（ｐ＞０．０５）は見られなかった。データを表５に示す。
表５
Figure 2012521763
これらの同じｓｉＮＡについて、ウエスタンブロット解析（表６参照）により、ＳＴＡＴ１タンパク質の用量依存性の減少が示された。また、各時間点でｍＲＮＡレベルの評価も行ない、処理細胞由来のタンパク質試料を、ヒトＡ５４９細胞での、α−ＳＴＡＴ１抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カタログ番号６１０１８５）および抗チューブリンＡｂ（Ｓｉｇｍａ ＃ Ｔ６１９９）を用いたウエスタンブロットに使用した。細胞をトランスフェクトし、２４、４８または７２時間前に、全タンパク質を収集した。ｓｉＮＡの終濃度は３０ｎＭとした。レーンに１０ｕｇの全タンパク質を負荷した。定量は、ＳＴＡＴ１αおよびＳＴＡＴ１βの両方のタンパク質を一緒に行なった。試験したｓｉＮＡではすべて、試験した各時間点でＳＴＡＴ１タンパク質が減少し、最も高いタンパク質減少の度合いは、トランスフェクションの７２時間後に観察された。
表６
Figure 2012521763
実施例２：ヒト気管支上皮細胞におけるｓｉＮＡのインビトロ評価
ｓｉＮＡ ２５３６８−ＤＣおよび２５３７２−ＤＣを、最大Ｓｔａｔ１ ｍＲＮＡノックダウンおよびヒト気管支上皮細胞における効力について、以下のようにして試験した。
細胞培養物の調製：
Ｌｏｎｚａ（カタログ番号ＣＣ−２５４０）から入手したヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ細胞）を５％ＣＯ２の存在下、３７度で、Ｂｉｏｃｏａｔ Ｃｏｌｌａｇｅｎ １コートフラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）においてＢＥＢＭ基本培地（Ｌｏｎｚａ，カタログ番号ＣＣ−３１７１）中で培養した。
トランスフェクションおよびｍＲＮＡノックダウンならびにＮＨＢＥ測定におけるＥＣ５０：
細胞をコラーゲン１コートプレート内にプレーティングし、適切な培養培地中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７度でプレーティングした後、２４時間培養した。ｓｉＮＡは、ＯｐｔｉＭＥＭ １中で１ｕＭに、トランスフェクション薬剤は２５ｕｇ／ｍｌに希釈した。ｓｉＮＡの製剤化のため、等容量の希釈ｓｉＮＡと送達用脂質を合わせ、室温で２０分間インキュベートした。一方で、細胞をトリプシン処理し、抗生物質無含有ＢＥＢＭ培地中に１５０，０００細胞／ｍｌで再懸濁させた。２０ｕｌの製剤化ｓｉＮＡと８０ｕｌのＢＥＢＭ培地を、９６ウェルプレートの各ウェルに（６連／データ点／ｓｉＮＡ濃度）、ｓｉＮＡが９点用量範囲（１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０１ｎＭ）となるように添加した。トランスフェクション剤−ｓｉＮＡ複合体とのインキュベーション時間は４８時間とし、２４時間目に１回培地を交換した。
ＲＮＡ単離用９６ウェルプレート：
全ＲＮＡを細胞から、９６ウェルプレート形式で、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＳＶ９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の使用説明書に従って用いて単離した。Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用し、トランスフェクト細胞溶解物をシリカ膜に適用した。次いで、ＲＮａｓｅ無含有ＤＮａｓｅ Ｉを、このシリカ膜に直接適用し、夾雑ゲノムＤＮＡを消化させた。結合した全ＲＮＡを混入塩、タンパク質および細胞性不純物から、簡単な洗浄工程によってさらに精製した。最後に、全ＲＮＡを膜から、ヌクレアーゼ無含有水の添加によって溶出させた。
ＲＮＡ単離用９６ウェルプレート：
一連のプローブおよびプライマーを、ヒト細胞株におけるＳＴＡＴ１、ＯＡＳ１、およびＧＡＰＤＨ（対照／標準化物として）のｍＲＮＡ転写物の検出に使用した。アッセイは、ＡＢＩ ７９００ＨＴ機器で、製造業者の使用説明書に従って行なった。使用したプライマープローブセットを表７に示す。
表７
Figure 2012521763
計算：
ＴａｑＭａｎデータを用いて、臨界閾値（Ｃｔ）を、３８４ウェルプレートの各ウェルにおいて解析した具体的な遺伝子に対応するコピー数に変換した。所与の処理の各プレートにおいて、６つの同一のウェルを調製した。したがって、平均遺伝子コピー数および標準偏差を算出した。変動係数（ＣＶ）パーセンテージ（％Ｃ．Ｖ．＝［標準偏差／平均］＊１００）の決定により、値が外れ値であるウェルを除外することが可能であった（％Ｃ．Ｖ．＜２５となる）。遺伝子の相対アバンダンス（別称：相対発現）を、当該遺伝子の平均コピー数を具体的な当該試料中のＧＡＰＤＨ対応物で除算することにより求めた。
データの統計学的解析：
ＥＣ５０値は、データからシグマプロットを用いて計算した。ｓｉＮＡの有効性および効力の計算はすべて、非標的化用対照ｓｉＮＡを基準にして行なった。
結果：
ｓｉＮＡ ２５３６８−ＤＣおよび２５３７２−ＤＣ（それぞれ、標的部位７８２、９６８）で、ヒト正常気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）におけるＳｔａｔ１ ｍＲＮＡの最大ならびに用量依存性ノックダウン（ＫＤ）が示され、高い有効性および効力が明示された。表８は、トランスフェクションの４８時間後におけるＳＴＡＴ１標的化ｓｉＮＡのＮＨＢＥの３例の個々のドナーでの平均データを示す。
表８
Figure 2012521763
実施例３：ＴＬＲ３媒介性免疫賦活に関するｓｉＮＡの試験
ＮＨＢＥ細胞を実施例２で上記のようにして処理し、エンドソームＴＬＲ３媒介性免疫賦活の測定のために使用し、ポリＩ：Ｃを、ＯＡＳ１ ｍＲＮＡの上方調節の陽性対照として含めた。膜結合ＴＬＲ３媒介性免疫賦活の測定のため、ＮＨＢＥ細胞を１２００細胞／９６ウェルで培養し、ｓｉＮＡを、送達媒体の非存在下、ＰＢＳ中（１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０１ｎＭ）で投与した。
細胞表面ＴＬＲ３媒介性免疫賦活応答は、送達媒体の非存在下でＮＨＢＥ細胞をｓｉＮＡで処理した場合のＯＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの増大％（ＰＢＳ希釈物に対するＯＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの増大％）を記録することにより測定した。
免疫賦活性ＴＬＲ３媒介性のＯＡＳ１（免疫賦活バイオマーカー）ｍＲＮＡレベルの増大％を測定するため、０．０１〜１００ｎＭ濃度のｓｉＮＡ ２５３６８−ＤＣおよびｓｉＮＡ ２５３７２−ＤＣを用いて９点用量応答を測定した。
エンドソームＴＬＲ３媒介性免疫賦活は、ＮＨＢＥ細胞をｓｉＮＡでトランスフェクトした場合のＯＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの増大％（トランスフェクション薬剤対照に対するＯＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの増大％）を記録することにより測定した。ＴＬＲ３アゴニストポリＩ：Ｃは、ＯＡＳ１ ｍＲＮＡ減少の陽性対照として使用される。
試験したＳｔａｔ１ ｓｉＮＡの免疫賦活活性データを以下の表９にまとめる。
表９
Figure 2012521763
実施例４：気道に経表面投与されたｓｉＮＡの作用のインビボ評価
インビトロでの活性ｓｉＮＡ構築物の特定後、気道への経表面投与後のｓｉＮＡの活性が、多種多様な実験種（典型的な一例はラットである）において、以下にまとめる方法論を用いて評価され得る。ｓｉＮＡ、適切なスクランブル対照、またはビヒクルを、２００μｌ容量で気管内に、経口的に留置したカニューレ経由で注入し、この間、動物には、イソフルラン（酸素中４．５％）および亜酸化窒素（１：３の比で送達される麻酔薬）を用いて短時間、麻酔しておく。 物質の投与を容易にするため、動物を仰臥位にし、喉上に置いた冷光源によって気道を見やすくするため、投与台上にほぼ４５°の角度で置く。あるいはまた、麻酔した動物に、ピペットによって鼻腔内投与する（投与容量２５μｌ／外鼻孔）。他の試験において、意識のある齧歯類を円形のＰｅｒｓｐｅｘチャンバ内に入れ、霧状にされた試験物質のエアロゾルに少なくとも２０分間曝露する。各投与手順の終了時、動物を標準的な収容ケージに戻し、飼料と水を自由に摂取させる。次いで、動物の群（典型的には、ｎ＝４〜６）を、投薬後、設定された間隔でのペントバルビタールのｉ．ｐ．注射によって人道的に安楽死させる。気道の細胞および組織の試料を速やかに取り出し、後のｍＲＮＡ抽出および解析のためにＴｒｉｚｏｌまたはＲＮＡｌａｔｅｒ中に入れる。一部の試験では、後の組織学的解析のために、気道組織を４％パラホルムアルデヒド中で固定する。他の実験では、浸潤白血球集団および／またはサイトカイン／メディエイタの含有量の解析のために、気道を洗浄する。ＲＮＡ抽出は標準的な方法を用いて行ない、ＱＲＴ−ＰＣＲを用いて、活性および対照ｓｉＮＡで処理した動物間の対象の標的ｍＲＮＡの発現を定量し、標的のノックダウンが行なわれたかどうかを調べる。一部の場合では、ｍＲＮＡ発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ、または上皮特異的マーカーであるＥ−カドヘリンのいずれかに対して標準化する。
材料の調製
非製剤化ｓｉＮＡおよびスクランブル対照の溶液を、リン酸緩衝生理食塩水中で調製する。また、一連の製剤化材料も使用され得る。各場合において、ｓｉＮＡの効果を、同等容量のスクランブル対照のものと比較する。
実施例５：ナノ粒子封入ｓｉＮＡ／担体製剤の調製
一般的なＬＮＰの調製
ｓｉＮＡナノ粒子の溶液を、ｓｉＮＡおよび／または担体分子を２５ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ４．０）に、０．９ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させることにより調製する。脂質の溶液を、カチオン性脂質（例えば、ＣＬｉｎＤＭＡまたはＤＯＢＭＡ、表１３の製剤の構造および比率参照）、ＤＳＰＣ、コレステロール、ならびにＰＥＧ−ＤＭＧ（表１３に示した比率）の混合物を無水エタノールに、約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させることにより調製する。リン酸部に対する窒素の比率は、ほぼ３：１である。
等容量のｓｉＮＡ／担体溶液と脂質溶液を、２つのＦＰＬＣポンプを用いて同じ流速で混合Ｔ字型コネクタに送達する。所望の粒径に調整するために背圧弁を使用する。得られた乳状混合物を、滅菌ガラスボトル内に収集する。次いで、この混合物を等容量のクエン酸バッファーでゆっくり希釈し、イオン交換膜に通して濾過し、混合物中の遊離ｓｉＮＡ／担体（あれば）を除去する。クエン酸バッファー（ｐＨ４．０）に対する限外濾過を用いてエタノールを除去し（ＡＬＣＯスクリーンのテストスティック）、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対する限外濾過を用いてバッファー交換する。所望の容量に濃縮することにより最終ＬＮＰを得、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過する。得られたＬＮＰを、粒径、ゼータ電位、アルコール含有量、総脂質含有量、封入核酸、および総核酸濃度に関して特性評価する。
ＬＮＰ製造プロセス
非限定的な一例において、ＬΝＰ−０８６ ｓｉＮＡ／担体製剤を、バルクで以下のようにして調製する。このプロセスは、（１）脂質溶液の調製；（２）ｓｉＮＡ／担体溶液の調製；（３）混合／粒子形成；（４）インキュベーション；（５）希釈；（６）限外濾過および濃縮からなる。
１．脂質溶液の調製
２Ｌ容の３つ口丸底フラスコ、冷却器、メスシリンダー、および２つの１０Ｌ容円錐型ガラス槽を脱パイロジェン処理する。脂質を室温まで昇温させる。３つ口丸底フラスコ内に５０．４４ｇのＣＬｉｎＤＭＡをピペットで移し、４３．３２ｇのＤＳＰＣ、５．３２ｇのコレステロール、６．９６ｇのＰＥＧ−ＤＭＧ、および２．６４ｇのリノレイルアルコールを添加する。この混合物に１Ｌのエタノールを添加する。この丸底フラスコを、Ｊ−ＣＨＥＭプロセス制御装置に接続した加熱マントルに入れる。脂質懸濁液を、アルゴン下、撹拌バーおよび上部の冷却器により撹拌する。熱電対プローブを、丸底フラスコの開口の１つからこの懸濁中に入れ、アダプターで密封する。懸濁液を３０℃で、透明になるまで加熱する。溶液を室温まで放冷し、円錐型ガラス槽に移し、キャップで密封する。
２．ｓｉＮＡ／担体溶液の調製
Ｃｏｒｎｉｎｇ社製保存ボトルなどの滅菌容器内に、水の補正係数（ほぼ１．２）の３．６ｇ倍のｓｉＮＡ−１粉末を量り入れる。ｓｉＮＡを脱パイロジェン処理した５Ｌ容ガラス槽に移す。計量容器をクエン酸バッファー（２５ｍＭ，ｐＨ４．０，および１００ｍＭ ＮａＣｌ）で３回すすぎ洗浄し、すすぎ洗浄液を、この５Ｌ容の槽に入れ、クエン酸バッファーで４Ｌの適量（ＱＳ）にする。ｓｉＮＡ溶液の濃度を、ＵＶ分光計により以下の手順を用いて測定する。溶液から２０μＬを取り出し、５０倍に希釈して１０００μＬにし、クエン酸バッファーでブランク値測定後、ＵＶの読み値をＡ２６０ｎｍで記録する。これを繰り返す。２つの試料の読み値が一貫性している場合、平均し、ｓｉＮＡの消衰係数に基づいて濃度を計算する。終濃度が０．９０±０．０１ｍｇ／ｍＬの範囲外である場合、さらにｓｉＮＡ／担体粉末を添加すること、またはさらにクエン酸バッファーを添加することにより濃度を調整する。このプロセスを、第２のｓｉＮＡであるｓｉＮＡ−２で繰り返す。脱パイロジェン処理した１０Ｌ容ガラス槽内に、４Ｌの０．９ｍｇ／ｍＬの各ｓｉＮＡ溶液を移す。
あるいはまた、ｓｉＮＡ／担体溶液が、２種類以上のｓｉＮＡ二本鎖および／または担体のカクテルの代わりに単一のｓｉＮＡ二本鎖およびまたは担体を含む場合、ｓｉＮＡ／担体を２５ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ４．０，１００ｍＭのＮａＣｌ）に溶解させ、終濃度を０．９ｍｇ／ｍＬにする。
次いで、脂質／エタノール溶液を、Ｐａｌｌ Ａｃｒｏｐａｋ ２０ ０．８／０．２μｍ滅菌フィルターＰＮ １２２０３に通し、脱パイロジェン処理したガラス槽内に、Ｍａｓｔｅｒ Ｆｌｅｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｆｌｅｘ Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐモデル７５２０−４０を用いて滅菌／濾過し、封入プロセスのための滅菌出発材料を得る。濾過プロセスは８０ｍＬ規模で行ない、膜面積は２０ｃｍ２とする。流速は２８０ｍＬ／分とする。このプロセスは、チューブの直径および濾過面積を増大させることにより拡張可能である。
３．粒子の形成−混合工程
ＡＫＴＡ Ｐ９００ポンプのスイッチをオンにし、１０００ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨを１Ｌ容ガラス槽内に入れ、１０００ｍＬの７０％エタノールを１Ｌ容ガラス槽内に入れ、圧力蓋を有するポンプを各槽に取り付けることにより消毒（ｓａｎｉｔｉｚｅ）する。２０００ｍＬ容のガラス槽を、ポンプの排出口の下方に配置し、流速を４０ｍＬ／分に４０分間設定し、系に１０ｐｓｉでアルゴンを流す。消毒が終了したら、ガスを止め、ポンプを、使用の準備ができるまで該溶液中に保持する。使用前、２００ｍＬのエタノールおよび２００ｍＬの滅菌クエン酸バッファーを使用することにより、ポンプの流れを確認する。
ＡＫＴＡポンプに、滅菌脂質／エタノール溶液、滅菌ｓｉＮＡ／担体またはｓｉＮＡ／担体カクテル／クエン酸バッファー溶液、および蓋を有する脱パイロジェン処理した受容槽（２回バッチサイズ）を設置する。ガスを流し、混合時、圧力を５〜１０ｐｓｉに維持する。
４．インキュベーション
混合後、溶液を２２±２時間インキュベーションのために保持する。インキュベーションは室温で（２０〜２５℃）行ない、工程中の溶液は光から保護した。
５．希釈
脂質ｓｉＮＡ溶液を、等容量のクエン酸バッファーで、デュアルヘッド蠕動ポンプＭａｓｔｅｒ Ｆｌｅｘ Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ Ｐｕｍｐ，モデル７５２０−４０（これは、等しい長さのチューブとＴ字型コネクタ（Ｔｅｅ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）で構成されており、流速は３６０ｍＬ／分）を用いて希釈する。
６．限外濾過および濃縮
限外濾過プロセスは時限的プロセスであり、流速は注意深くモニタリングされなければならない。これは２工程プロセスであり、最初は、３２リットルの希釈物質を３６００ｍＬにして濃度をほぼ２ｍｇ／ｍＬにする濃縮工程である。
第１工程では、限外濾過膜ＧＥ ＰＮ ＵＦＰ−１００−Ｃ−３５Ａを備えたＦｌｅｘｓｔａｎｄを、クアトロフロー（ｑｕａｔｒｏｆｌｏｗ）ポンプに取り付ける。２００ｍＬのＷＦＩを貯蔵部に添加した後、３リットルの０．５Ｎ水酸化ナトリウムを添加し、次いで、これを保持液中に流し、廃棄する。このプロセスを３回繰り返す。次いで、３ＬのＷＦＩを系に２回流した後、３Ｌのクエン酸バッファーを流す。次いで、ポンプの排液を行なう。
希釈ＬＮＰ溶液を貯蔵部内に、４リットル線まで入れる。ポンプのスイッチを入れ、ポンプ速度を、透過液の流速が３００ｍＬ／分となり、かつ液体レベルが貯蔵部内で４Ｌで一定となるように調整する。希釈ＬＮＰ溶液がすべて貯蔵部に移送されたら、ポンプを停止する。希釈ＬＮＰ溶液を、必要に応じてポンプ速度を調整することにより、２４０分間で３６００ｍＬに濃縮する。
第２工程は、エタノールクエン酸バッファーをリン酸緩衝生理食塩水に交換するダイアフィルトレーション工程である。ダイアフィルトレーション工程は３時間を要し、この場合も、流速は注意深くモニタリングされなければならない。この工程中、エタノール濃度は、ヘッドスペースＧＣによってモニタリングされる。３時間後（２０ダイアフィルトレーション容量）、２回目の濃縮を行ない、溶液をほぼ６ｍｇ／ｍＬまたは１．２リットルの容量まで濃縮する。この物質を脱パイロジェン処理したガラス槽内に収集する。系を４００ｍＬのＰＢＳで高流速ですすぎ洗浄し、透過液ラインを閉じる。この物質を収集し、最初の収集物に添加する。この時点での予測される濃度は４．５ｍｇ／ｍＬである。濃度および容量を測定する。
蠕動ポンプの供給チューブを７２ＬのＰＢＳ（０．０５μｍ濾過済）を入れた容器内に入れ、流速を、最初は貯蔵部内で３６００ｍＬの定容量が維持されるように調整し、次いで、４００ｍＬ／分まで上げる。ＬＮＰ溶液を、ＰＢＳ（２０容量）で１８０分間ダイアフィルトレーションする。
ＬＮＰ溶液を１．２リットル線まで濃縮し、脱パイロジェン処理した２Ｌ容のメスシリンダー内に収集する。４００ｍＬのＰＢＳを貯蔵部に添加し、ポンプを２分間再循環させる。すすぎ洗浄液を収集し、メスシリンダー内に収集したＬＮＰ溶液に添加する。
得られたＬＮＰを、粒径、ゼータ電位、アルコール含有量、総脂質含有量、封入核酸、および総核酸濃度に関して特性評価する。
当業者には、本発明が、課題を遂行するため、ならびに記載の目的および利点ならびに本発明に固有の目的および利点を得るために充分適合したものであることが容易に認識されよう。現時点で代表的な好ましい実施形態である本明細書に記載の方法および組成物は、例示的であり、本発明の範囲に対する限定を意図しない。本発明の精神に包含され、特許請求の範囲に規定される本明細書における変更および他の使用は、当業者によって思い浮かべられよう。
表１０
Figure 2012521763
Figure 2012521763
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表１２
Figure 2012521763
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表１３
Figure 2012521763
Figure 2012521763
Figure 2012521763
Figure 2012521763
表１４
Figure 2012521763
Figure 2012521763
Figure 2012521763
Figure 2012521763

Claims (37)

  1. 互いに相補性を有する第１鎖と第２鎖を含み、該鎖の少なくとも一方が、
    ５’− ＣＣＵＡＣＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＵ −３’ （配列番号：６）；
    ５’− ＡＧＵＵＣＵＵＵＣＵＵＣＧＵＧＵＡＧＧ −３’ （配列番号：１００）；
    ５’− ＧＣＵＵＧＡＣＡＡＵＡＡＧＡＧＡＡＡＧ −３’ （配列番号：２２）；
    ５’− ＣＵＵＵＣＵＣＵＵＡＵＵＧＵＣＡＡＧＣ −３’ （配列番号：１０１）；
    ５’− ＧＵＡＡＡＧＵＣＡＧＡＡＡＵＧＵＧＡＡ −３’ （配列番号：２３）；
    ５’− ＵＵＣＡＣＡＵＵＵＣＵＧＡＣＵＵＵＡＣ −３’ （配列番号：１０２）；
    ５’− ＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＣＧＵＡＡＵＣＵ −３’ （配列番号：２４）；
    ５’− ＡＧＡＵＵＡＣＧＣＵＵＧＣＵＵＵＵＣＣ −３’ （配列番号：１０３）；
    ５’− ＵＵＧＡＣＡＡＵＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡ −３’ （配列番号：２７）；または
    ５’− ＵＣＣＵＵＵＣＵＣＵＵＡＵＵＧＵＣＡＡ −３’ （配列番号：１０４）；の少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、該ヌクレオチドの１個以上が、任意選択で化学修飾されたものである二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を提供する。
  2. 該ヌクレオチドがすべて非修飾である、請求項１に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  3. 該ヌクレオチドの少なくとも１つが、化学修飾されたヌクレオチドである、請求項１に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  4. 該化学修飾されたヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、請求項３に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  5. 該化学修飾されたヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチドである、請求項３に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  6. 該化学修飾されたヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドである、請求項３に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  7. センス鎖とアンチセンス鎖を有する式（Ａ）：
    Figure 2012521763
     式中、上側の鎖は、該二本鎖核酸分子のセンス鎖であり、下側の鎖はアンチセンス鎖であり；該アンチセンス鎖は、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、または配列番号：１０４の少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、該センス鎖は、該アンチセンス鎖と相補性を有する配列を含み；
    各Ｎは、独立して、非修飾または化学修飾されたヌクレオチドであり；
    各Ｂは、存在する、または存在しない末端キャップであり；
    （Ｎ）は、各々、独立して、非修飾化学修飾された突出ヌクレオチドを表し；
    ［Ｎ］は、リボヌクレオチドであるヌクレオチドを表し；
    Ｘ１およびＸ２は、独立して、０〜４の整数であり；
    Ｘ３は、１７〜３６の整数であり；
    Ｘ４は、１１〜３５の整数であり；
    Ｘ５は、１〜６の整数であるが、Ｘ４とＸ５の和は１７〜３６であるものとする、
    を含む、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  8. （ａ）ＮＸ４位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せであり；
    （ｂ）ＮＸ４位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せであり；
    （ｃ）ＮＸ３位の１個以上のピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せであり；
    （ｄ）ＮＸ３位の１個以上のプリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその任意の組合せである、
    請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  9. （ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり；
    （ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり；
    （ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドであり；
    （ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはリボヌクレオチドである、
    請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  10. （ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
    （ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドであり；
    （ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
    （ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシヌクレオチドである、
    請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  11. （ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
    （ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドであり；
    （ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
    （ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、リボヌクレオチドである、
    請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  12. （ａ）ＮＸ４位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
    （ｂ）ＮＸ４位の各プリンヌクレオチドが、独立して、リボヌクレオチドであり；
    （ｃ）ＮＸ３位の各ピリミジンヌクレオチドが、独立して、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであり；
    （ｄ）ＮＸ３位の各プリンヌクレオチドが、独立して、リボヌクレオチドである、
    請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  13. Ｘ５が３である、請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  14. Ｘ１が２であり、Ｘ２が２である、請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  15. Ｘ５が３であり、Ｘ１が２であり、Ｘ２が２である、請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  16. Ｘ５＝１、２、または３；各Ｘ１およびＸ２＝１または２；Ｘ３＝１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０、およびＸ４＝１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０である、請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  17. Ｘ５＝２；各Ｘ１およびＸ１＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１８である、請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  18. Ｘ５＝２；各Ｘ１およびＸ２＝２；Ｘ３＝１９、およびＸ４＝１７である、請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  19. Ｘ５が３であり、Ｘ１が２であり、Ｘ２が２であり、Ｘ３が１９であり、Ｘ４が１６である、請求項７に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  20. ｓｉＮＡが、
    Figure 2012521763
     （式中：
    各Ｂは、逆位無塩基キャップ部分であり；
    ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
    ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
    Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
    Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
    Ｔは、チミジンであり；
    Ａは、アデノシンであり；
    Ｇは、グアノシンであり；
    Ｕは、ウリジンであり；
    Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
    Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
    Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
    前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
    である、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  21. 前記ヌクレオチド間結合が非修飾である、請求項２０に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  22. ｓｉＮＡが、
    Figure 2012521763
     （式中：
    各Ｂは、逆位無塩基キャップであり；
    ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
    ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
    Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
    Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
    Ｔは、チミジンであり；
    Ｕは、ウリジンであり；
    Ｃは、シチジンであり；
    Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
    Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
    Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
    前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
    である、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  23. 前記ヌクレオチド間結合が非修飾である、請求項２２に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  24. ｓｉＮＡが、
    Figure 2012521763
     （式中：
    各Ｂは、逆位無塩基キャップ部分であり；
    ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
    ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
    Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
    Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
    Ｔは、チミジンであり；
    Ｃは、シチジンであり；
    Ｕは、ウリジンであり；
    Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
    Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
    Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
    前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
    である、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  25. 前記ヌクレオチド間結合が非修飾である、請求項２４に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  26. ｓｉＮＡが、
    Figure 2012521763
     （式中：
    各Ｂは、逆位無塩基キャップ部分であり；
    ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
    ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
    Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
    Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
    Ｔは、チミジンであり；
    Ａは、アデノシンであり；
    Ｇは、グアノシンであり；
    Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
    Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
    Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
    前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
    である、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  27. 前記ヌクレオチド間結合が非修飾である、請求項２６に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  28. ｓｉＮＡが、
    Figure 2012521763
     （式中：
    各Ｂは、逆位無塩基キャップ部分であり；
    ｃは、２’−デオキシ−２’フルオロシチジンであり；
    ｕは、２’−デオキシ−２’フルオロウリジンであり；
    Ａ（イタリック体）は、２’−デオキシアデノシンであり；
    Ｇ（イタリック体）は、２’−デオキシグアノシンであり；
    Ｔは、チミジンであり；
    Ｕは、ウリジンであり；
    Ｃは、シチジンであり；
    Ａは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり；
    Ｇは、２’−Ｏ−メチル−グアノシンであり；
    Ｕは、２’−Ｏ−メチル−ウリジンであり；
    前記ヌクレオチド間結合は化学修飾されているか、または非修飾である）
    である、二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  29. 前記ヌクレオチド間結合が非修飾である、請求項２８に記載の二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子。
  30. 薬学的に許容され得る担体または希釈剤中に、請求項１、７、２０、２２、２４、２６、または２８のいずれかの二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を含む医薬組成物。
  31. エアロゾル製剤中に請求項１、７、２０、２２、２４、２６、または２８の前記二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を含む医薬組成物。
  32. 被検体に、有効量の請求項７の前記二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を投与することを含む、ＳＴＡＴ１の作用によって、または該作用の低下によって媒介される病状に苦しむヒト被検体の処置方法。
  33. 被検体に、有効量の請求項２０、２２、２４、２６、または２８の前記二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を投与することを含む、ＳＴＡＴ１の作用によって、または該作用の低下によって媒介される病状に苦しむヒト被検体の処置方法。
  34. 該病状が呼吸器疾患である、請求項３２に記載の方法。
  35. 該病状が呼吸器疾患である、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記呼吸器疾患が、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、喘息、好酸球性の咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  37. 前記呼吸器疾患が、ＣＯＰＤ、嚢胞性線維症、喘息、好酸球性の咳、気管支炎、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎、および副鼻腔炎からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
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