JP2012085641A - Ｄｓｒｎａによる遺伝子発現の阻害 - Google Patents

Abstract

【課題】標的遺伝子を二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と接触させることによって、哺乳動物中での遺伝子発現を特異的に阻害する方法を提供する。
【解決手段】哺乳動物細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法。即ち、前記細胞中に、前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含み、内在性のテンプレートから由来するＲＮＡを細胞中に導入することと、前記標的遺伝子の発現の阻害を確認することとを備えた方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝子発現を阻害することに関する。特に、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）を用いて、哺乳動物における遺伝子発現を阻害することに関する。

哺乳動物において、ある特定の遺伝子又は遺伝子群の発現を阻害することができれば有益であることは明らかである。多くの疾病（癌、内分泌疾患、免疫疾患など）は、哺乳動物の中で、ある特定の遺伝子又は遺伝子群が異常発現することによって起こるので、遺伝子又は遺伝子群の阻害は、これらの症状を治療するために使用することができる。同様に、変異型タンパク質の発現に起因して疾病が発症することもあり、この場合には、変異した対立遺伝子の発現を抑えることが有益であろう。さらに、このような遺伝子特異的な阻害は、例えば、ＨＩＶなどのレトロウイルス（レトロウイルス中のウイルス遺伝子は、それらの宿主のゲノム中に組み込まれて、発現される）によって引き起こされるウイルス疾患を治療するために使用し得る。

さらに、特異的な遺伝子の発現を除去又は阻害することは、胚の中での初期の発生現象を研究し、操作するために使用することができる。関心を有する遺伝子の機能を、胚の特定の細胞中で、所定の時期に妨害することができれば、最も価値の高い情報が得られるであろう。マウスモデルの場合、遺伝子の「ノックアウト」という古典的な技術は、このような情況において、胚全体から一律に遺伝子機能を喪失せしめるので使用することができない。さらに、発生過程を誘導するために、遺伝子が空間的及び時間的に繰り返し使用される場合には、従来の遺伝子「ノックアウト」では、その遺伝子の役割が削除されてしまうので、最初の現象を除く全現象の理解が不能となるであろう。ある遺伝子が機能する発育のごく初期段階を研究の対象とする場合でさえ、母体の転写物及びそれらの翻訳産物が寄与するために、遺伝子ノックアウトの効果が覆い隠されることがあり得る。また、既存の「ノックアウト」技術は極めて手間がかかる。既存のノックアウト技術では、まず、培養胚性幹細胞中の相同的組換え現象を選別できるように適切にマークを付した崩壊した遺伝子セグメントを作製することが必要である。続いて、このような細胞を胚盤胞の中に取り込ませなければならず、ホモ接合体の変異体が得られる前に純粋な育種系を確立するために、得られたキメラ動物を使用する。

ある種の生物では、二本鎖ＲＮＡによって遺伝子の発現を特異的に阻害できることが知られている。二本鎖ＲＮＡによる遺伝子発現の妨害（ＲＮＡｉ、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓで初めて示され（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３９１， ８０６−８１１ （１９９８）； Ｗ０９９／３２６１９）、近年では、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ． ＆ Ｃａｒｔｈｅｗ， Ｃｅｌｌ ９５， １０１７−１０２６ （１９９８））、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｎｇｏ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５， １４６８７−１４６９２ （１９９８））、ｐｌａｎａｒｉａｎｓ（Ｓａｎｃｈｅｚ Ａｌｖａｒａｄｏ ＆ Ｎｅｗｍａｒｋ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６， ５０４９−５０５４ （１９９９））、及び植物（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５， １３９５９−１３９６４ （１９９８））を含む下等な真核細胞に対して有効であることが示されている。本アプローチの応用が、ゼブラフィッシュの胚でも実証されているが、完全な成功を収めたとはいい難い（Ｗａｒｇｅｌｉｕｓ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｉｎｕｎ ２６３， １５６−１６１ （１９９９））。

現在まで、ＲＮＡｉを哺乳動物に使用することができるという報告は存在しないのみならず、本分野では、ＲＮＡｉは哺乳動物では機能しないであろうと考えられている。この点に関して、無脊椎動物及び植物系に対して使用されるプロトコールは、哺乳動物には有効ではないと思われるという懸念が表明されていた（Ｆｉｒｅによる総説、（Ｆｉｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １５， ３５８−３６３ （１９９９））。ｄｓＲＮＡが哺乳動物の細胞中に蓄積することによって、タンパク質合成を全般的に遮断し得るからである。ウイルス感染した哺乳動物の細胞中に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がごく少量蓄積すると、インターフェロン反応が生じ（Ｍａｒｃｕｓ， Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ５， １１５−１８０ （１９８３））、翻訳及びアポトーシスの開始の全般的遮断が引き起こされる（Ｌｅｅ ＆ Ｅｓｔｅｂａｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９， ４９１−４９６ （１９９４））。インターフェロン反応の一部は、ｄｓＲＮＡ応答性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）の活性化である（Ｃｌｅｍｅｎｓ， Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２９， ９４５−９４９ （１９９７））。この酵素は、ｄｓＲＮＡに対して応答する翻訳因子ＥＩＦ２αをリン酸化し、不活性化させる。その結果、全般的な翻訳の抑制が起こり、次いで、アポトーシスを引き起こす。Ｗａｇｎｅｒ ＆ Ｓｕｎ．（Ｎａｔｕｒｅ ３９１， ８０６−８１１ （１９９８））は、アンチセンスＲＮＡの実験における対照として使用したときに全く効果がないので、ＲＮＡｉは哺乳動物では機能しないであろうと示唆している。

多数の種の胚における遺伝子発現を減少させる手段として、アンチセンスＲＮＡが試みられてきた。ショウジョウバエでは、アンチセンスＲＮＡはかなりの成功を収めているが、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、及びマウスの胚では、期待に反する結果に終わっている。アフリカツメガエルでは、アンチセンスアプローチを使用する上で幾つかの制約が存在した。これは、ｄｓＲＮＡ特異的なアデノシンデアミナーゼ（ｄｓＲＡＤ）によってもたらされる顕著なＲＮＡ融解活性によるものであると考えられており（Ｂａｓｓ， ＆ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｃｅｌｌ ４８， ６０７−６１３ （１９８７）； Ｒｅｂａｇｌｉａｔｉ ＆ Ｍｅｌｔｏｎ， Ｃｅｌｌ ４８，５９９−６０５（１９８７））、ＲＮＡｉが不成功に終わる公算が高いことを示唆している。

マウスの胚では、アンチセンスＲＮＡは、とりわけ２〜４細胞期の間で、遺伝子発現を不安定且つ不完全に減少させ得るにすぎない（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ， ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，８３１−８３５（１９８８））。これらの著者は、彼らの実験で、β−グルクロニダーゼが一部阻害されたことは、センス／アンチセンスニ重鎖に対して作用する融解活性をも反映しているかもしれないと懸念して、マウスの割球にマイクロインジェクトされたβ−グルクロニダーゼのｄｓＲＮＡの安定性を調べた。彼らはＲＮＡの安定性に対して影響はないと報告しているが、これは５時間にわたって追跡されたにすぎなかった。このように、この文献には、遺伝子発現を妨害するのに十分な期間にわたって、ｄｓＲＮＡが哺乳類細胞中に残存し得ることが全く示唆されていない。さらに、彼らは、ｄｓＲＮＡの注入後に、β−グルクロニダーゼの発現に対する影響はないと報告した。従って、本文献は、ｄｓＲＮＡが哺乳動物の細胞中で遺伝子発現を阻害し得ることを示唆していない。

Ｗ０９９／３２６１９は、哺乳動物中での遺伝子発現を阻害するためにｄｓＲＮＡを使用し得ることを示唆している。しかしながら、本文献中の唯一の実験的証拠は、ＲＮＡｉがＣ． ｅｌｅｇａｎｓの中で機能することを示しているにすぎず、哺乳動物中でＲＮＡｉが機能し得ることを示す証拠は全く存在しない。現に、Ｗ０９９／３２６１９に列記されている、この発明者らによる後の文献（Ｆｉｒｅ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １５９ ３５８−３６３ （１９９９）；（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＆ Ｆｉｒｅ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １４， ２５５−２５８ （１９９８））は、ＰＫＲ応答を中和し、あるいは何らかの方法で回避できなければ、ＲＮＡｉを哺乳動物中で機能させることができないと述べているが、ＷＯ９９／３２６１９は、これを達成する方法に関する示唆を与えていない。これらその後の文献は、ＷＯ９９／３２６１９の発明者自身、ＲＮＡｉを哺乳動物中で機能させることは未だ行われていない（且つ、行うことができない）と確信していることを示している。

このように、本分野では、ＲＮＡｉを哺乳動物で機能させることはできないという認識が存在する。かかる認識にもかかわらず、本発明者らは、適切なｄｓＲＮＡのマイクロインジェクションによって、マウスの卵母細胞及び接合体中で特定の遺伝子発現を妨害することが可能であることを示すに至った。本発明者らは、卵母細胞中のｃ−ｍｏｓ遺伝子の母発現を崩壊させると、減数***がＭＩＩ期の時点で停止するのが解消されるという効果、又は接合体によるＥ−カドヘリンの発現を崩壊させると、対応するノックアウトマウスで観察されるように、胚盤胞の発育が阻止されるという効果を、ＲＮＡｉが表現型模写することを実験的に示した。胚が発育を続け、細胞死の徴候は全く観察できないので、ｄｓＲＮＡの注入が対応する遺伝子に対して特異的であること、すなわち全般的な翻訳の停止を引き起こさないことを本発明者らは示した。このように、本発明者らは、ＲＮＡｉが哺乳動物細胞において有効であり得ることを示した。

本発明の第一の側面によれば、哺乳動物細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、
前記細胞中に、前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含み、内在性のテンプレートから由来するＲＮＡを細胞中に導入することと、
前記標的遺伝子の発現の阻害を確認することと
を備えた方法が提供される。

本発明において有用なｄｓＲＮＡは、「内在性テンプレート」に由来する。このようなテンプレートは、哺乳動物に内在するヌクレオチド配列の全部又は一部であり得る、すなわち、ＤＮＡ遺伝子配列、又は前記哺乳動物から単離されたｍＲＮＡから、例えば逆転写酵素によって作製されるｃＤＮＡであり得る。前記テンプレートがＤＮＡ遺伝子配列の全部又は一部であるときには、前記遺伝子の１以上のエキソン又は全てのエキソンから得られたものであれば好ましい。さらに、インターフェロン反応が誘導されないように、哺乳動物中で発現するのであれば、ウイルスの遺伝子の全部又は一部が内在性テンプレートを形成してもよい（例えば、宿主細胞染色体に組み込まれたプロウイルスからの発現）。このように、本発明のｄｓＲＮＡは、ウイルスのｄｓＲＮＡ及び合成ポリｒＩＣ（何れも、哺乳動物の細胞中でアポトーシスを引き起こすＰＫＲを誘導することが観察されている）とは区別される。

ｄｓＲＮＡは内在性テンプレートに由来するが、それが合成される態様には制限はない。従って、インビトロ又はインビボで、手動及び／又は自動化操作を用いて合成し得る。インビトロ合成は、化学的若しくは酵素的（例えば、内在性ＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）テンプレートを転写するために、クローニングされたＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）を用いる）合成であり得、又は両者を混合したものであり得る。

インビボでは、本分野で周知の組換え技術を用いて前記ｄｓＲＮＡを合成し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ； Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ＳＥＣＯＮＤ ＥＤＩＴＩＯＮ （１９８９）；ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ， ＶＯＬＵＭＥＳ Ｉ ＡＮＤ ＩＩ （Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ （Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ， １９８４）；ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＳＡＴＩＯＮ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｎｉｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４）； ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ ＡＮＤ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ （Ｂ．Ｄ． Ｈａｉｎｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４）， ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ （Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｄ． １９８６）； ＩＭＭＯＢＩＬＩＳＥＤ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥＳ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ （１９８４）； ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ， ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＶＥＣＴＯＲＳ ＦＯＲ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＣＥＬＬＳ （Ｊ．Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ． Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ． １９８７， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １５４ ａｎｄ Ｖｏｌ． １５５ （Ｗｕ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎ， ａｎｄ Ｗｕ， ｅｄｓ．， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）， Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ， ｅｄｓ． （１９８７）， ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ）， Ｓｃｏｐｅｓ， （１９８７）， ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ． ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．），ａｎｄ ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， ＶＯＬＵＭＥＳ Ｉ−ＩＶ （Ｄ．Ｍ． Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ｅｄｓ １９８６参照）。

このように、細菌細胞は、前記ｄｓＲＮＡを得るべきＤＮＡテンプレートを含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。あるいは、発現ベクターを用いて、又はその他の手段によって、遺伝子発現の阻害が必要とされる哺乳動物の細胞を形質転換してもよい。１コピー以上の前記テンプレート双方向性転写は、前記被形質転換細胞の内在性ＲＮＡポリメラーゼによって、又は前記発現ベクター若しくは異なる発現ベクターによってコードされるクローン化ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）によって行ってもよい。発現構築物の使用及び作製は、本分野において公知である（Ｗ０９８／３２０１６；米国特許第５，５９３，８７４号、５，６９８，４２５号、５，７１２，１３５号、５，７８９，２１４号、及び５，８０４，６９３号参照）。臓器、組織、若しくは細胞種における特異的な転写、環境状態（例えば、感染、ストレス、温度、化学物質）、及び／又は、ある発育段階若しくは年齢で（とりわけ、ｄｓＲＮＡが前記哺乳動物中においてインビボで合成されるときに）転写を加工することによって、遺伝子発現の阻害を標的とし得る。ｄｓＲＮＡは、公知の遺伝子輸送系を用いて、特異的な組織又は細胞種へ輸送してもよい。公知の真核細胞ベクターには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手し得るｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、及びｐＳＧ、並びにＰｈａｒｍａｃｉａから入手し得るｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬが含まれる。これらのベクターは、当業者が入手し得る、市販されている多くの周知のベクターを例示するために列記したものにすぎない。

哺乳動物細胞の外で合成された場合には、細胞中に導入する前に、前記ＲＮＡを精製してもよい。精製は、溶媒（フェノール／クロロホルムなど）若しくは樹脂による抽出、沈殿（例えば、エタノール中）、電気泳動、クロマトグラフィー、又はこれらの組合せによって行い得る。しかしながら、精製によって、ｄｓＲＮＡの喪失が生じる可能性があるので、最小限度で実施するか、あるいは全く実施しなくてもよい。前記ＲＮＡは、保存のために乾燥させてもよく、又は水溶液中（アニーリング、及び／又はＲＮＡ鎖の安定化を促進するために緩衝液又は塩を含有し得る）に溶解させてもよい。

本発明において有用なｄｓＲＮＡには、１以上の修飾塩基を含有するｄｓＲＮＡ、及び安定性又はその他の理由で修飾された骨格を有するｄｓＲＮＡが含まれる。例えば、少なくとも窒素又は硫黄ヘテロ原子のうちの１つを含むように、天然のＲＮＡのホスホジエステル結合を修飾してもよい。さらに、本発明では、イノシンなどの非典型塩基、又はトリチル化塩基などの修飾塩基を含むｄｓＲＮＡを使用することができる（二例のみを挙げる）。多数の有用な目的を果たす、当業者に公知の極めて様々な修飾がＲＮＡに加えられていることが理解されるであろう。本明細書で使用されるｄｓＲＮＡという用語は、化学的に、酵素的に、又は代謝的に修飾された形態のｄｓＲＮＡ（但し、内在性テンプレートに由来するｄｓＲＮＡである）を包含する。

前記二本鎖構造は、単一の自己相補性ＲＮＡ鎖又は２つの別個の相補性ＲＮＡ鎖によって形成され得る。ＲＮＡ二重鎖の形成は、前記哺乳動物の細胞内又は細胞外の何れかで開始され得る。

前記ｄｓＲＮＡは二本鎖構造を含み、その配列は、前記標的遺伝子の少なくとも一部と「実質的に同一」である。「同一性」とは、本分野において公知であるように、配列を比較することによって決定される、２以上のポリヌクレオチド（又はポリペプチド）配列間の関連性である。本分野では、同一性は、このような配列の鎖間の一致によって決定される、ポリヌクレオチド配列間の配列の関連度も意味する。同一性は、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定するための方法が数多く存在するが、前記用語は当業者に周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１； ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８： １０７３ （１９８８）。

配列間の同一性を決定するために一般的に使用される方法には、Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３ （１９８８）に開示されている方法が含まれるが、これに限定されるものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、被検配列間で最大の一致度を与えるようにデザインされている。同一性を決定するための方法は、コンピュータープログラム化されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）： ３８７ （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３ （１９９０））が含まれるが、これらに限定されない。本操作を実行するための本分野において周知である他のソフトウェアパッケージは、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムである。これは、２つのポリヌクレオチドの配列を比較し、何れかの配列中に適宜間隙を挿入することによって、最適なアラインメントを見出す。最適なアラインメントに対する同一性は、ＢＬＡＳＴｘのようなソフトウェアパッケージを用いて計算することもできる。

該プログラムは、最も大きな連続した類似配列を並列させて、適合度に対して値を割り当てる。１パターンの比較の何れに対しても、（それぞれ、異なるスコアを有する）同一性のある幾つかの領域を見出し得る。当業者であれば、さらに長い断片の全長にわたって、長さが異なる２つのポリヌクレオチドを比較し得ることが理解できるであろう。あるいは、小さな領域を比較してもよい。通常は、有用な比較を為すために、同じ長さの配列を比較する。

前記阻害性ＲＮＡと前記標的遺伝子の一部との間には、１００％の配列同一性が存在することが好ましい。しかしながら、本発明では、７０％、８０％、又は９０％若しくは９５％を超える配列同一性を有するｄｓＲＮＡを使用してもよく、従って、遺伝的変異、系の多型、又は進化的な発散のために予測され得る配列の変動も許容され得る。

前記ＲＮＡの二重鎖領域は、前記標的遺伝子の転写物の一部とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を有し得る（例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間ハイブリダイゼーションした後、洗浄）。

前記ｄｓＲＮＡの最適な長さは、前記標的遺伝子及び実験条件によって変動し得るが、ＲＮＡの前記二重鎖領域は、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００以上の塩基長であり得る。

本明細書で使用する「標的遺伝子」とは、一般的には、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、又は複製、転写、若しくは翻訳、若しくは前記ポリペプチドの発現に重要な他のプロセスを制御するポリヌクレオチド領域、又はポリペプチドをコードする領域と、該領域に対して作用可能に連結された発現を制御する領域とを共に含むポリヌクレオチドを意味する。標的遺伝子は、ゲノム中に存在する細胞の遺伝子、又はインターフェロン応答を引き起こさない、レトロウイルス遺伝子のようなウイルス及びプロウイルスの遺伝子であり得る。前記標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子、又はリボゾームＲＮＡ、スプライセオソームＲＮＡ、ｔＲＮＡなどをコードする遺伝子のようなタンパク質をコードしない遺伝子であり得る。

前記ｄｓＲＮＡが前記標的遺伝子全体（すなわち、前記遺伝子のコーディング部分）と実質的に同一であれば好ましい。しかしながら、前記ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の一部と実質的に同一であり得る。この部分のサイズは用いる標的遺伝子に依存し、ｄｓＲＮＡのサイズを変化させ、遺伝子の発現が阻害されたかどうかを観察することによって、当業者が決定し得る。

本発明では、疾病を引き起こし、又は疾病を引き起こす可能性がある標的遺伝子を阻害するためにｄｓＲＮＡを使用することができる。すなわち、疾病の治療又は予防のために、ｄｓＲＮＡを使用することができる。疾病を予防する場合、前記標的遺伝子は、前記疾病の開始若しくは維持に必要な遺伝子、又は前記疾病に罹患するリスクを高くすることに関与していることが同定された遺伝子であり得る。

疾病を治療する場合、前記ｄｓＲＮＡは、前記疾病を発症している細胞又は組織と接触させることができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、癌に関与する変異した遺伝子の全部又は同一と実質的に同一であり、又は腫瘍細胞中で、高いレベルで発現されている遺伝子（例えば、ａｕｒｏｒａキナーゼ）を、癌細胞又は腫瘍遺伝子と接触させ、又は癌細胞又は腫瘍遺伝子中に導入してもよい。その予防又は治療のために本発明を使用することができる癌の例には、アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、ブラウン・ピアース、腺管、エールリッヒ腫瘍、インサイチュ、クレブス２、メルケル細胞、粘液性、非小細胞肺、燕麦細胞、乳頭、硬性、細気管支、気管支、扁平上皮細胞、及び移行細胞）、組織球疾患、白血病（例えば、Ｂ細胞、混合型細胞、ヌル細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞慢性、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連、リンパ性急性、リンパ性慢性、肥満細胞、及び骨髄球性）、組織球増殖症悪性、ホジキン病、免疫増殖性小、非ホジキンリンパ腫、形質細胞腫、細網内皮症、黒色腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、繊維腫、繊維肉腫、巨細胞腫、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、腺繊維腫、腺リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント質腫、奇形腫、胸腺腫、絨毛性腫瘍、腺癌、腺腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、顆粒膜細胞腫、男女性胚細胞腫、肝臓癌、透明細胞汗腺腫、島細胞腫、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、筋腫（ｍｙｍｏｍａ）、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣細胞腫、神経節細胞腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、被角血管腫、好酸球増加症を伴う血管リンパ組織過形成、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管腫、血管内皮腫、血管腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｍａ）、血管外皮腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管平滑筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢胞肉腫、繊維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌腫、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング、実験性、カポジ、及び肥満細胞）、新生物（例えば、骨、***、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、睾丸、眼窩、頭頸部、中枢神経系、聴覚、骨盤気道、及び泌尿生殖器）、神経線維腫症、及び子宮頸部形成異常、及び細胞が不死化又は形質転換されたその他の症状を含む充実性腫瘍及び白血病が含まれる。本発明は、化学療法、凍結療法、温熱療法、放射線療法などの他の治療法と組み合わせて使用することもできるであろう。

本発明は、他の疾病、特に、ある１又は複数の遺伝子の発現又は過剰発現を伴う疾病の治療及び予防にも使用し得る。例えば、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病などのような自己免疫疾患を治療／予防するために、免疫反応に関連する遺伝子の発現を阻害することができる。このような治療では、免疫抑制薬と組み合わせて、ｄｓＲＮＡを使用してもよい。現時点で最も一般的に使用されている免疫抑制薬には、コルチコステロイド剤、並びに、例えばメトトレキサート、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、６−ＭＰ／アザチオプリン、及びサイクロスポリンのような、より強力な阻害剤が含まれる。しかしながら、これらの治療は全て、毒性に関連する重篤な副作用を有しているので、それらの使用を不要にする、又は減少させることができる薬物に対する要請は切迫している。他の免疫抑制剤には、アスピリンやイブプロフェンのような、より穏やかではあるが、効力が低い非ステロイド性治療、及びより特異的な免疫調節物質機能に基づいた新しいクラスの試薬が含まれる。この後者のクラスには、インターロイキン、サイトカイン、組換え接着分子、及びモノクローナル抗体が含まれる。免疫抑制治療プロトコールにおいて、免疫反応に関連する遺伝子を阻害するためにｄｓＲＮＡを使用することによって、免疫抑制の効率を増加させることができ、特に、毒性効果又はその他の有害な効果を与える他の薬物の投与量を減らすことが可能となるかもしれない。

以下のクラスに属する標的遺伝子の候補は、阻害のために本発明を使用し得る遺伝子の例である。発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼ阻害剤、Ｗｎｔファミリーの一員、Ｐａｘファミリーの一員、Ｗｉｎｇｅｄ ｈｅｌｉｘファミリーの一員、Ｈｏｘファミリーの一員、サイトカイン／リンホカイン及びそれらの受容体、成長／分化因子及びそれらの受容体、神経伝達物質及びそれらの受容体）、癌遺伝子（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ２、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＳ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、及びＹＥＳ）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＡＤＨ−４、ＭＣＣ、ＮＦＩ、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３、及びＷＴ１）、並びに酵素(例えば、ＡＣＰデサチュラーゼ及びヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ｐｙｒｏｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、ＡＴＰ分解酵素、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰ分解酵素、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスフォリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プルラナーゼ（ｐｕｌｌａｎａｓｅｓ）、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、及びキシラナーゼ。

前記第一の側面の好ましい実施態様では、前記ｄｓＲＮＡはβ−グルクロニナーゼに由来しない。第二の側面において、本発明は、哺乳動物細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記細胞中に、前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含み、且つ内在性のテンプレートに由来するＲＮＡを細胞中に導入することを備え、前記ｄｓＲＮＡがβ−グルクロニダーゼに由来しない方法を提供する。

標的遺伝子の発現の阻害は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質（これは、例えば、特異的な抗体、又は当業者に公知の他の技術によって検出し得る）、及び／又は標的遺伝子からのｍＲＮＡ産物（これは、例えば、ハイブリダイゼーション研究によって検出し得る）、及び／又は前記遺伝子の発現に関連する表現型が存在しないこと、又はそのレベルが観察可能な程度に減少したことを観察又は検出することによって確認することができる。医学的な治療においては、標的遺伝子の発現が阻害されたことは、患者の病状の変化（症候の減少、軽減、病状の変化など）を観察することによって確認し得る。好ましくは、前記阻害は特異的である、すなわち、前記細胞の他の遺伝子に対して影響が出現しないように、前記標的遺伝子の発現を阻害する。

効果的に遺伝子を阻害するために哺乳動物に投与すべきｄｓＲＮＡの量は、投与経路、年齢、哺乳動物の大きさ及び状態、阻害すべき遺伝子、治療すべき疾病又は疾患などを含む様々な要素によって、幅広く変動するものと思われる。本発明者らは、卵母細胞又は初期胚の細胞中に１０ｐｌ注入するときには、０．０１〜４０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｍｌの濃度範囲でｄｓＲＮＡを有する溶液が有効であることを見出した。このため、前記ｄｓＲＮＡは、各細胞中で０．１〜４００ｐｇ、好ましくは１〜４０ｐｇ、最も好ましくは１〜２０ｐｇになるように投与し得る。

前記標的遺伝子を有する前記細胞は、生殖細胞又は体細胞、全能性又は多能性、***又は非***、上皮、不死化又は形質転換された細胞などから得られたものであり得る。前記細胞は、幹細胞又は分化した細胞であり得る。分化した細胞種には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、神経細胞、膠細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、内分泌又は外分泌腺の細胞が含まれる。前記細胞は、初期胚の任意の各細胞であり得、未分化胚芽細胞であり得る。あるいは、前記細胞は卵母細胞であってもよい。

哺乳動物細胞は細胞外ｄｓＲＮＡに対して反応し得ることが知られているので、ｄｓＲＮＡに対する輸送機構を有しているのかもしれない（Ａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ２２３ ７１５−７１７ （１９６９））。このため、ｄｓＲＮＡは、腔、間質空隙中に、哺乳類の循環中など細胞外に投与してもよく、又は経口的に導入してもよい。経口導入法には、前記ＲＮＡを前記哺乳類の食物と直接混合することの他、前記ＲＮＡを発現するように、食物として使用される種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を操作し、処置を施すべき前記哺乳動物に食物として与える改変的アプローチが含まれる。例えば、前記ｄｓＲＮＡを生産するように、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのような食物細菌を形質転換させ得る（ＷＯ９３／１７１１７、ＷＯ９７／１４８０６参照）。血管又は血管外循環、血液又はリンパ系、及び脳脊髄液は、前記ＲＮＡを注入し得る部位である。

ＲＮＡは、細胞内に入るように、前記細胞中に導入し得る。この点では、物理的な核酸導入法も使用し得る。前記ｄｓＤＮＡは、Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ，． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４， １１３３−１１３７ （１９９７） ａｎｄ Ｗｉａｎｎｙ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ １０７， ４３０−４３９ （１９９８）に記載されているマイクロインジェクション技術を用いて投与し得る。

細胞内に核酸を導入する他の物理的方法には、ＲＮＡで被覆された粒子による衝撃、例えば、金の粒子上に前記ｄｓＲＮＡを固定化し、傷の付いた部位に直接発射する遺伝子銃技術が含まれる。従って、本発明は、哺乳動物細胞中に存在する標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡの使用であって、前記標的遺伝子の発現を阻害するための遺伝子銃における使用を提供する。さらに、遺伝子銃療法に適した組成物であって、哺乳動物細胞中に存在する標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡと、金粒子とを含む組成物が提供される。別の物理的方法には、前記ＲＮＡの存在下での細胞膜の電気穿孔が含まれる。ｄｓＲＮＡは、培養細胞に対して一般的に適用されている条件と同様の条件を用いて、電気穿孔によって胚細胞中に導入することができる。電気穿孔のための正確な条件は、電気ショックを与えるために用いられる装置、及び前記胚を固定するために用いられるチャンバーの大きさに依存する。該方法によれば、ＲＮＡｉを大規模に行うことが可能となる。前記ＲＮＡを投与するために、任意の公知の遺伝子療法技術を使用することができる。ウイルス粒子中に封入されたウイルス構築物を用いると、細胞中への発現構築物の効率的な導入及び該発現構築物によってコードされたＲＮＡの転写が、何れも効率的に達成されるであろう。脂質媒介性担体輸送、リン酸カルシウムのような化学物質媒介性輸送などの、細胞に核酸を導入するための本分野において公知である他の方法を使用してもよい。従って、以下の活性、すなわち、細胞によるＲＮＡの取り込みの増強、二重鎖のアニーリングの促進、アニールした鎖の安定化、あるいは前記標的遺伝子の阻害の増加のうちの１以上を与える成分とともに、前記ＲＮＡを導入し得る。適切な哺乳動物から得た接合体、胚性幹細胞、又は他の多分化能細胞中に前記構築物を導入することによって、組換え構築物からのＲＮＡを発現するトランスジェニック哺乳動物を作製し得る。

本発明は、医薬として使用するためのＲＮＡであって、哺乳動物細胞中に存在する標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡも提供する。

別の側面において、本発明は、哺乳動物細胞中の標的遺伝子の発現を阻害するための薬剤（ａｇｅｎｔ）、例えば医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）の製造におけるＲＮＡの使用であって、前記ＲＮＡが、前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む使用を提供する。

前記医薬は、薬学的に許容される担体を通常であろう無菌の薬学的組成物の一部として与えられるのが通常であろう。従って、本発明は、薬学的に許容される担体とともに、哺乳動物細胞中に存在する標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡを含む薬学的製剤も提供する。

該薬学的組成物は、（患者に投与する望ましい方法に応じた）任意の適切な形態であり得る。前記薬学的組成物は単位剤形で与えられ、一般的には、密封された容器中に入れられ、キットの一部として与え得る。このようなキットには、使用説明書を添付するのが通常であろう（但し、常にというわけではない）。前記薬学的組成物は、複数個の前記単位剤形を含み得る。

前記薬学的組成物は、任意の適切な経路、例えば経口（口腔内又は舌下を含む）、直腸、鼻、局所（口腔内、舌下、又は経皮を含む）、膣、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内）経路による投与に適合させ得る。このような組成物は、薬学の分野で公知である任意の方法によって、例えば、無菌条件下で、活性成分を（１又は複数の）担体又は（１又は複数の）賦形剤と混合することによって調製し得る。

経口投与に適合された薬学的組成物は、カプセル又は錠剤のような分割された単位として、粉末又は顆粒として、溶液、シロップ、又は懸濁液（水性又は非水性液体中に、又は食べられる発泡（ｆｏａｍ）又は泡（ｗｈｉｐ）として、又はエマルジョンとして）として与え得る。錠剤又は硬ゼラチンカプセル剤のための適切な賦形剤には、ラクトース、トウモロコシのデンプン又はその誘導体、ステアリン酸又はその塩が含まれる。軟ゼラチンカプセルとともに使用するのに適した賦形剤には、例えば、植物油、蝋、脂肪、半固体、又は液体ポリオールなどが含まれる。

溶液及びシロップを調製するために使用し得る賦形剤には、例えば、水、ポリオール、及び糖が含まれる。懸濁液の調製には、油(例えば、植物油)を使用して、水中油又は油中水懸濁液を作製してもよい。

局所適用に適合された薬学的組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、パウダー、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又はオイルとして調合し得る。眼又はその他の外部組織（口及び皮膚）の感染症に対しては、前記組成物は局所的軟膏又はクリームとして与えることが好ましい。軟膏の中に調合するときには、前記活性成分は、パラフィン系又は水混和性の軟膏基剤のうちの何れかを用いて取り扱うことができる。あるいは、水中油クリーム基剤又は油中水基剤を用いて、クリーム中に前記活性成分を調合してもよい。眼に局所投与するのに適合された薬学的組成物には、適切な担体、特に水性溶媒中に前記活性成分が溶解又は懸濁された点眼薬が含まれる。口腔内への局所投与に適合された薬学的組成物には、トローチ剤、香剤（ｐａｓｔｉｌｌｅ）、及び洗口剤が含まれる。

直腸投与に適合された薬学的組成物は、座薬又は浣腸として与え得る。

前記担体が固体である鼻腔投与に適合された薬学的組成物には、鼻から吸い込む態様で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻腔を通じて急速に吸い込むことによって投与される、例えば、２０〜５００μｍの範囲の粒子サイズを有する粗い粉末が含まれる。スプレー式点鼻薬として、又は点鼻剤として投与するための、前記担体が液体である適切な組成物には、前記活性成分の水溶液又は油溶液が含まれる。

吸入による投与に適合された薬学的組成物には、様々なタイプの定量式加圧エアロゾル、噴霧器、又は吸入器によって生成させ得る微粒子の粉塵又は霧が含まれる。

膣への投与に適合された薬学的組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、又はスプレー製剤として与え得る。

非経口投与に適合された薬学的組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を対象レシピエントの血液と実質的に等張にさせる溶質を含有し得る水性及び非水性無菌注射溶液、並びに懸濁剤及び濃縮剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液が含まれる。注射可能な溶液に使用し得る賦形剤には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、及び植物油が含まれる。前記組成物は、単位用量又は複数用量の容器、例えば、密閉されたアンプル及びバイアル中に入れて、使用直前に用意した無菌の液体（例えば、注射用の水）を添加するだけでよいように、凍結乾燥した状態で保存し得る。即席の注射溶液及び懸濁液は、無菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製し得る。

前記薬学的組成物は、防腐剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着香剤、塩（本発明の物質自体を薬学的に許容される塩の形態で与えてもよい）、緩衝液、コーティング剤、又は抗酸化剤を含有し得る。前記組成物は、本発明の前記物質に加えて、治療的に活性な薬剤も含有し得る。

本発明の前記物質の投薬量は、治療すべき疾病又は疾患、治療すべき個体の年齢及び状態などに応じて、広く変動し得るので、最終的には、使用すべき適切な投薬量を医師が決定することになるであろう。適切な限度で頻繁にこの投薬量を繰り返してもよい。副作用が出た場合には、通常の標準的治療法に従って、投薬の量及び／又は頻度を減らしてもよい。

本発明は、単独で、又はインビトロ若しくはインビボでＲＮＡを対象者に導入するために必要な試薬を少なくとも１つ有するキットの成分として使用し得る。好ましい成分は、前記ｄｓＲＮＡ、及び該ｄｓＲＮＡの導入を促進するビークルである。このようなキットには、本キットの使用者が本発明を実施できるように説明書を添付してもよい。

本発明のさらなる側面によれば、哺乳動物細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、
前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡを前記細胞中に導入することと、
必要に応じて、前記標的遺伝子の発現の阻害を確認することと
を備えた方法が提供される。該側面では、前記ＲＮＡは内在性テンプレートに由来することが好ましい。

さらなる側面では、本発明は、哺乳動物中の標的遺伝子によって引き起こされる症状又は疾病を治療又は予防する方法であって、
前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一である配列を有するｄｓＲＮＡに、前記標的遺伝子を接触させることを備えた方法を提供する。該側面では、前記ＲＮＡは内在性テンプレートに由来することが好ましい。

本発明は、特にヒトの不妊を治療するために、卵母細胞中での遺伝子発現を操作するために使用し得る。本発明は、染色体切断の過程を制御するためにも使用し得る。ヒトの場合、３５歳以上の母親では染色体の不分離の発生率が増加し、ダウン症候群の子供や自然流産をもたらす。現在では、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、ｐｏｌｏキナーゼ、ａｕｒｏｒａキナーゼ、ｍｉｎ Ａキナーゼ、プロテインホスファターゼ、***後期促進複合体の化合物及びその制御分子、プロテオソームの化合物、ＳＣＦ複合体、中心体の化合物、動原体の成分、染色体の構造タンパク質、ＤＮＡ複製酵素、ＤＮＡ組換えタンパク質、及びＤＮＡ修復タンパク質を含む、細胞周期の進行における幾つかの相を促進する数多くの細胞周期調節分子が知られている。本発明は、染色体の正しい分離を確保するために、１以上の上記タンパク質の発現を調節するために使用し得る。

本発明は、レシピエント除核接合体の細胞周期の段階、及び哺乳動物のクローニング用の核を与えるドナー細胞の細胞周期の段階を操作するためにも使用し得る（ＷＯ９７／０７６６８）。ヒツジ及びマウスのクローニングにおける経験から、除核前にレシピエント卵の細胞周期の段階を最適化して、特定の段階にある細胞（多くの場合（但し、常にというわけではない）Ｇ_０細胞）から核を取り出す必要があることが示されている。上述した１以上の細胞周期分子を停止させるための本発明の応用は、この目的で使用し得る。

本発明は、多能性細胞における遺伝子発現のパターンを誘導して、患部組織又はその他の機能していない組織を置換するための移植に用いる特定の分化した細胞種を作製するためにも使用し得る。多能性細胞の一例は、着床前の胚から得られる胚性幹（ＥＳ）細胞である。マウスのＥＳ細胞は胚盤胞に再導入することができ、ＥＳ細胞はここで発育中の胚に取り込まれて、全ての身体の細胞種及び細胞構造へ発育し、分化することが本分野において周知である。培地から特定の成長因子を除去すると、広範な細胞種へとインビトロで分化するようにＥＳ細胞を誘導することもできる。ＥＳ細胞株は、全ての哺乳動物から確立することが可能であると予想され、実際に、ヒトのＥＳ細胞株を確立するための方法が既に確立されている。多能性細胞種が特定の細胞種に分化するには、一定の遺伝子発現経路が停止され、他の経路が作動することが必要とされる。本発明は、このような制御経路中のキーとなるタンパク質を排除して、ＥＳ及び他の胚細胞を特定の細胞種に分化するように誘導するために適用することができる。本発明は、従って、細胞の分化が好ましい経路に沿うように誘導するために、（本明細書に明記したもののような）発育遺伝子の発現を妨害するために使用してもよい。ある細胞種が、細胞分割のサイクルから出た時点で、それらの分化が完了することも知られている。従って、本発明は、前に列記したもののような細胞周期調節分子を阻害するためにも使用し得る。これらのｄｓＲＮＡは、細胞分化の最終段階を実行させるために、直接使用してもよいし、あるいは調節可能なプロモーターから発現させてもよい。

本発明は、発現構築物を含有する哺乳動物細胞であって、前記構築物が、標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を形成するＲＮＡをコードする哺乳動物細胞、並びにこのような細胞を含有するトランスジェニック哺乳動物も提供する。

本明細書で使用する「治療／療法（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｔｈｅｒａｐｙ）」には、ヒト又はヒト以外の動物に有益であり得る任意の治療計画が含まれ、「備える／有する」には、ある特定の特性／特徴のみからなる全てのものが包含されるのみならず、この特性／特徴に加えて、１以上の特性／特徴をさらに有する全てのものが包含される。

本発明の各側面の好ましい特徴は、変更を加えて、それ以外の各側面の特徴にもなる。本明細書に記載された従来技術の文献は、法的に許容される最大限度まで援用される。

例
ここで、添付の図面を参照しながら、以下の例で、本発明をさらに説明する。

ＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡは、ＭｍＧＦＰトランスジェニック胚におけるＭｍＧＦＰ発現を特異的に消滅させる。

（ａ−ｃ） Ｆ１雌とＭｍＧＦＰトランスジェニック雄との間で為された１１の異なる交配から得られた１３１個の胚の中の代表的な胚。ＭｍＧＦＰトランスジェニック４−６細胞期の胚（ａ）、桑実胚（ｂ）、胚盤胞（ｃ）。アンチセンスＭｍＧＦＰ ＲＮＡの注入後に、同様のＧＦＰ発現パターンが得られた。（ｄ−ｆ）１細胞期の時点で、ＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡを注入した１４７個のＭｍＧＦＰトランスジェニック胚の中の代表的な胚。４−６細胞期の胚（ｄ）、桑実胚（ｅ）、胚盤胞（ｆ）。（ｇ−ｉ）１細胞期の時点で、ｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡを注入した１８個のＭｍＧＦＰトランスジェニック胚の中の代表的な胚。６細胞期の胚（ｇ）、桑実胚（ｈ）、胚盤胞（ｉ）。大きさを示すバーは、２０μｍを表している。影は緑の蛍光を示している。
注入した合成ＭｍＧＦＰ ｍＲＮＡの発現の妨害 （ａ）ＭｍＧＦＰ ｍＲＮＡのみを注入した野生型桑実胚、（ｂ）加えて、Ｅカドヘリン ｄｓＲＮＡを注入した、（ｃ）加えて、１細胞期の時点で、ＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡを加えた。大きさを示すバーは、２０μｍを表している。影は緑の蛍光を示している。 接合体にＥ−カドヘリンｄｓＲＮＡを注入すると、Ｅ−カドヘリンの発現が減少し、注入した胚の発育を擾乱する。

（ａ）１細胞期の時点でＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡを注入し、胚盤胞の段階までインビトロで４日間培養した胚におけるＥ−カドヘリンの免疫蛍光染色。（ｂ）１細胞期の時点でＥ−カドヘリン ｄｓＲＮＡを注入し、インビトロで４日間培養した胚におけるＥ−カドヘリンの免疫蛍光染色。これらの胚の発育が変化していることに注目せよ。大きさを示すバーは、２０μｍを表している。（ｃ）接合体、非注入桑実胚（１細胞期の時点で採集、インビトロで３日間培養）、１細胞期の時点で、２ｍｇ ｍｌ^−１のＧＦＰ ｄｓＲＮＡを注入し、インビトロで３日間培養した桑実胚、１細胞期の時点で、２ｍｇ ｍｌ^−１のＥ−カドヘリン ｄｓＲＮＡを注入し、インビトロで３日間培養した桑実胚におけるＥ−カドヘリン発現のウェスタンブロット分析。それぞれのケースで、１５個の胚からタンパク質を抽出した。この実験を３回繰り返して、同じ結果を得た。Ｅ−カドヘリン ｄｓＲＮＡ注入後のシグナルの減少は、約６．５倍であった。大きさを示すバーは、２０μｍを表している。影は化学発光を示している。
未成熟の卵母細胞中にｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡを注入するとｃ−ｍｏｓ発現が阻害され、単為生殖の活性化を引き起こす。

（ａ−ｄ）胚胞期の卵母細胞中にｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡを注入した後に得られた単為生殖的に活性化された卵の例。（ａ）中期ＩＩで停止した対照卵母細胞、（ｂ）１細胞期の胚（白い矢印は前核を指している）、（ｃ）２細胞期の胚、（ｄ）４細胞期の胚。大きさを示すバーは、２０μｍを表している。（ｅ）中期ＩＩで停止した卵母細胞、胚胞期の時点で、２ｍｇ ｍｌ^−１のＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡを注入し、１２時間インビトロで培養した卵母細胞、胚胞期の時点で、２ｍｇ ｍｌ^−１のｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡを注入し、１２時間インビトロで培養した卵母細胞でのｃ−ｍｏｓ発現のウェスタンブロット解析。それぞれのケースで、３５個の卵母細胞からタンパク質を抽出した。この実験を２回繰り返して、同じ結果を得た。
二本鎖ＲＮＡを注入した後の遺伝子発現の阻害は、注入した細胞に由来するクローン系列に限定されている。

２細胞期の時点で、１つの細胞に、Ｅ−カドヘリン ｄｓＲＮＡ及びＭｍＧＦＰの合成ｍＲＮＡを注入した胚でのＥ−カドヘリンの免疫蛍光染色。左側のパネルは、Ｅ−カドヘリンを現す単一チャンネル（赤）の蛍光を示している。注入した細胞の子孫では、染色が顕著に減少していることに注目せよ。これらの子孫細胞は、対応する第二（緑）チャンネルにおいて、ＭｍＧＦＰを発現している細胞として同定される。

方法
卵母細胞と胚の採集及び培養
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（４ｍｇ ｍｌ^−１）を補充したＦＨＭ培地（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．Ｌａｖａｌｅｔｔｅ，Ｎ．Ｊ．）中に、４〜６週齢のＦ１（ＣＢＡ×Ｃ５７Ｂｌ）マウスの卵巣から、減数***の前期Ｉで停止した未成熟の卵母細胞を採集した。妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ、５ｉ．ｕ．）、及び４８〜５２時間おいてヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を腹腔内注射することによって、Ｆ１雌マウスを過***させた。ｈＣＧから２０〜２４時間後に、交配した雌から、受精した１細胞の胚を得た。

ＲＮＡ合成及びマイクロインジェクション
ＲＮＡ合成に用いたテンプレートは直鎖化されたプラスミドであった。Ｔ７ＴＳ プラスミド（Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ，． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４， １１３３−１１３７ （１９９７））中に、完全長のＭｍＧＦＰ ｃＤＮＡ （７１４ｂｐ）をクローニングした。ｃ−ｍｏｓ ｃＤＮＡのＫｐｎＩ／ＨｉｎｄIII断片（５５０ｂｐ）（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０， ６６５−６８ （１９９４））をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐＳＫ中にクローニングした。Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ｐＫＳの中に、Ｅ−カドヘリンのエキソン４−エキソン８に対応するｃＤＮＡ（５８０ｂｐ）をクローニングした（Ｌａｒｕｅ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２， ８５５−８５９ （１９９５））。Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔｓキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用し、Ｔ３又はＴ７ポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成した。ＤＮＡｓｅ処理によって、ＤＮＡテンプレートを除去した。フェノール／クロロホルムでＲＮＡ産物を抽出し、エタノール沈殿した。

アニーリングさせるために、それぞれ２μＭの最終濃度になるように、アニーリング緩衝液（ｌＯｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４， ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ）中に、等モル量のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを混合し、６８℃で１０分間加熱し、３７℃で３〜４時間インキュベートした。ｄｓＲＮＡのサンプル中に一本鎖ＲＮＡが混在しないように、２μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ｔ１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と１μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、３７℃で３０分間、調製物を処理した。続いて、１４０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）で前記ｄｓＲＮＡを処理し、フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。アガロースゲル上での移動によって、ｄｓＲＮＡの形成を確認した。各ｄｓＲＮＡのゲル移動度は、ｓｓＲＮＡに比べてシフトしていた。アンチセンス及び二本鎖ＲＮＡを比較するために、同じ重量のＲＮＡを感染させた。

２〜４ｍｇ ｍｌ^−１の最終濃度になるように、ＲＮＡを水に希釈した。ｃ−ｍｏｓの生物的表現型の感度が高いので、有効濃度の範囲はｃ−ｍｏｓ実験（表２）で最も明らかである。定流システム（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、記載に従って（Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ ｉｎ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄ ｆａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（ｅｄ． Ｍｏｏｄｙ， Ｓ． Ａ．） ５２１−５２７ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９９））、卵母細胞又は胚の細胞質中にｍＲＮＡをマイクロインジェクトした。各卵母細胞又は胚に、約１０ｐｌのｄｓＲＮＡを注入した。負の電気容量を用いることによって、貫通を向上させた。マイクロインジェクション後に、５％ ＣＯ_２雰囲気中、３７℃で、４ｍｇ ｍｌ^−１のＢＳＡを補充したＫＳＯＭ（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ． Ｌａｖａｌｅｔｔｅ，Ｎ．Ｊ．）培地中で、卵母細胞及び胚を培養した。共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８００顕微鏡にＢｉｏｒａｄ １０２４ スキャニングヘッドが取り付けられている）によって、ＭｍＧＦＰトランスジェニック胚を観察した。

免疫ブロット及び免疫染色分析
免疫ブロット分析のために、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にサンプルをかけて、ハイボンド（ｈｙｂｏｎｄ）ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にタンパク質を転写した。抗体の非特異的結合をブロックするために、５％（ｗ／ｖ）の無脂肪ドライミルクを含有するＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中で、膜を一晩プレインキュベートした。続いて、抗Ｅ−カドヘリン抗体（ＤＥＣＭＡ−１）又は抗ｍｏｓ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに、膜を１時間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で膜を洗浄して、ベルオキシダーゼ抱合二次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともに１時間インキュベートし、ＴＢＳＴ中で再度洗浄した。５％（ｗ／ｖ）の無脂肪ドライミルクを含有するＴＢＳＴ中に前記抗体を希釈した。化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の増大によって、二次抗体を検出した。Ｅ−カドヘリン抗体を用いたホールマウント免疫蛍光のために、２％パラホルムアルデヒド中に、室温で２０分間、胚を固定した後、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を１０分間浸透させた。ＰＢＳ中の２％ＢＳＡ中で、３０分間プレインキュベートした後、抗Ｅカドヘリン抗体とともに３７℃で１時間、テキサスレッドを抱合したヤギ抗ラット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， Ｐａ．， ＵＳＡ）とともに３７℃で１時間、胚をインキュベートした。Ｂｉｏｒａｄ １０２４レーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いて、胚を観察した。

例１−ｄｓＲＮＡはｇｆｐ導入遺伝子の発現を抑える
マウス胚における遺伝子発現を抑えるために、ｄｓＲＮＡを使用し得るかどうかを決定するため、本発明者らは、伸長因子１α（Ｅ１Ｆα）プロモーター （Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ Ｍ． ｉｎ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ａｎｄｆａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ （ｅｄ． Ｍｏｏｄｙ， Ｓ．Ａ．） ５２１−５２７ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， １９９９））の制御下でＭｍＧＦＰを発現するマウスのトランスジェニック系統を用いた実験的検査系を開発した。この系統は、生きた胚の中でＧＦＰ発現を容易に可視化することができるという利点を与え、その機能は不可欠ではないので、本発明者らは、胚の発育に対する任意の非特異的な有害作用をモニターすることができた。母体の遺伝子産物が潜伏することによる複雑化を避けるために、本発明者らは、導入遺伝子が父方に由来するヘテロ接合の胚を用いた。これらの胚におけるＧＦＰ発現の開始は、２細胞期での接合体の転写が開始した後に、緑の細胞が出現することによって明らかとなる。

本発明者らは、単一細胞の接合体中にＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡを注入することによって、２〜４細胞期の時点で、緑色蛍光の出現の開始が抑えられることを実証することができた（図１）。注入後に、胚盤胞の段階になるまで、インビトロで胚を３〜４日間培養した。未注入の胚は、予想どおりの態様で、ＭｍＧＦＰを発現したのに対して（図１ａ−ｃ）、Ｍｎ ｄｓＲＮＡを注入した全ての胚では、緑色蛍光が残存しているのは、僅かな割合（６．８％）であり、この期間を通じて、緑色蛍光の劇的な減少を示した（図１ｄ−ｆ）。前記胚は、着床前及び着床後に正常な発育を示したので、ｄｓＲＮＡの注入が有害ではないことを実証している。

ＭｍＧＦＰトランスジェニック胚に、ｃ−ｍｏｓ転写物のセグメントに対応する無関係のｄｓＲＮＡを注入したときには、緑色蛍光の減少が生じなかったので（図１ｇ−ｉ）、遺伝子発現による妨害は特異的である。同様に、トランスジェニック接合体中にＥ−カドヘリン転写物のセグメントに対応するｄｓＲＮＡを注入すると（５９個の胚を観察）緑色蛍光の減少が生じず、ｄｓＲＮＡキナーゼを介したタンパク質合成が封鎖されなかったが、このような胚の遺伝子型は異常であった（データは示さず、下記参照）。本発明者らは、アンチセンスＭｎＲＮＡを注入したトランスジェニック接合体が、全ての前着床段階で、緑色蛍光を保持していることも見出した（３７個の胚を観察した、データは示さず）。

本発明者らは、ＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡを同時注入することによって、キャップを付加した完全長のＭｍＧＦＰ ｍＲＮＡからのＭｍＧＦＰの発現を消失させ得るかどうかも決定しようと試みた。

本発明者らは、このような注入胚では、緑色蛍光が大幅に減弱し、又は喪失されていることを観察した（図２ｄ）。これは、センスＭｍＧＦＰ ＲＮＡを注入した胚、又はセンスＭｍＧＦＰ ＲＮＡ及び「無関係な」Ｅ−カドヘリンのｄｓＲＮＡの両者を同時注入した胚（図２ａ−ｂ）とは対照的であった。このように、ｄｓＲＮＡは、染色体に存在する遺伝子の発現と、マイクロインジェクションによって導入された合成ｍＲＮＡをともに妨害することができる。

例２−Ｅ−カドヘリンノックアウトの表現型模写
本発明者らは、Ｅ−カドヘリンｄｓＲＮＡを注入したときに得られる特異的な発生の結果を評価した。Ｅ−カドヘリンは、前着床発育中に、母体と接合体の両者から発現される。該分子の接着機能に不可欠な領域を除去するために相同的組換えを用いて、Ｅ−カドヘリン遺伝子を破壊すると、著しい前着床欠損がもたらされる。これらの胚でも、母体から発現されたＥ−カドヘリンが存在するために、最初は胚細胞緊密化が起こり得る。しかしながら、これらの胚は、空洞化に欠陥があるので、正常な胚盤胞を形成し得ない（Ｌａｒｕｅ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１， ８２６３−８２６７ （１９９４）； Ｒｉｅｔｈｍａｃｈｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２，８５５−８５９ （１９９５））。

本発明者らは、Ｅ−カドヘリン ｄｓＲＮＡを注入すると、表現型が無発現変異の胚（ｎｕｌｌ ｍｕｔａｎｔ ｅｍｂｒｙｏ）の表現型と同一となることを観察した。このように、この胚は、桑実胚の胚細胞緊密化段階までは、最初、正常に発育した（データは示さず）。しかしながら、空洞化して、いわゆる「被覆体（ｃｙｓｔ）」を形成し得るのは約３０％にすぎず、正常な胚盤胞は形成しなかった（Ｌａｒｕｅ， ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１， ８２６３−８２６７ （１９９４））（表１）。これに対して、未注入の胚又はＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡを注入した対照胚の大部分は空洞化して、正常な胚盤胞を形成した（表１）。

免疫染色及び免疫ブロッティングによるＥ−カドヘリン発現の分析は、Ｅ−カドヘリン ｄｓＲＮＡ注入後に、Ｅ−カドヘリンの発現が劇的に減少することを示している（図３ｂ、ｃ）。これに対して、ＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡを注入した胚では、Ｅ−カドヘリン発現の減少は観察されず、Ｅ−カドヘリン発現のレベルは、対照の未注入胚のレベルと同様であった（図３ｃ）。Ｅ−カドヘリン ｄｓＲＮＡを注入した胚における、桑実胚段階の時点でのＥ−カドヘリンのレベルは、注入前に新たに受精した胚におけるレベルよりも低い（図３ｃ）。この残余のＥ−カドヘリンタンパク質の大部分は、母体から発現されたタンパク質（２細胞期の間にその合成は停止する）の残存を反映している可能性がある（Ｓｅｆｔｏｎ， ｅｔ ａｌ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１５， ３１３−３１８ （１９９２））。この残存する母体タンパク質は、ホモ接合無発現胚（ｎｕｌｌ ｅｍｂｒｙｏ）では、胚盤胞の後期段階まで存在する（Ｌａｒｕｅ， ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１ ８２６３−８２６７ （１９９４））。

本発明者らは、Ｅ−カドヘリン ｄｓＲＮＡの注入は、Ｅ−カドヘリンタンパク質を著しく減少させる結果、無発現変異胚の表現型と同様の表現型をもたらすと結論付ける。

例３−卵母細胞中でのｄｓＲＮＡ妨害
母体から発現された遺伝子を妨害するために、ｄｓＲＮＡを使用し得るかどうかを決定するために、本発明者らは、特徴的なノックアウト表現型を有するモデル遺伝子を探索した。Ｃ−ｍｏｓは、第二減数***において、成熟中の卵母細胞を中期に停止させるために必要とされる細胞***停止因子の不可欠な成分である。ｃ−ｍｏｓ −／−マウスでは、６０〜７５％の卵母細胞が、この中期IIでの停止を持続せず、単為生殖による発生を開始する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０， ６５−６８ （１９９４）； Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３７０， ６８−７１ （１９９４））。Ｃ−ｍｏｓ ｍＲＮＡは、十分に成長した未成熟の卵母細胞中に存在し、胚胞の崩壊を経て減数***が再開したときに、その翻訳が母テンプレートから開始される（Ｖｅｒｌｈａｃ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２， ８１５−８２２ （１９９６））。このように、ｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡの注入によって、ｄｓＲＮＡが母体のｍＲＮＡ発現を妨害し得るかどうかを調べることが可能になるであろう。

卵母細胞中にｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡを注入すると、約６３％が中期IIでの停止を持続できなかった（表２）。これらのうち、７８％が単為生殖による発生を開始し、２〜４細胞期の胚まで進行した（図４ａ、ｂ、ｃ）。残りは断片化を起こした。これらの現象は何れも、無発現変異卵母細胞の中で、同様の頻度で起こる（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ， ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０， ６５−６８ （１９９４））。これに対して、対照卵母細胞（未注入、又はＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡを注入の何れか）では、僅かに１〜２％で自発的な活性化が起こるにすぎなかった（表２）。本発明者らは、注入するｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡの濃度を０．１ｍｇ／ｍｌまで２０分の１に減らしても、注入した卵母細胞の４２％が中期IIでの停止を行い得ないことをなお観察することができた（表２）。これは、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ及び植物において有効であると考えられている濃度よりも、有意に高い濃度であり、細胞当り２〜３分子のｄｓＲＮＡで効果が得られることを主張している。

本発明者らは、胚胞段階の卵母細胞を注入してから１２時間後、その発現の喪失に起因する表現型が明瞭となる前に実施したイムノブロット分析によって、ｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡがｃ−ｍｏｓ発現を妨害することを確認した（図４ｅ）。このように、ｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡの卵母細胞への注入はｃ−ｍｏｓ活性を特異的に妨害し、相同的組換えを介した、ｃ−ｍｏｓを標的とする欠失を模倣した。これらの実験は、ｄｓＲＮＡが母体によって産生された遺伝子産物の発現を遮断できることを示している。

例４−ＲＮＡｉの効果はマウスの胚の中でクローンに遺伝する
初期のマウス胚の中に存在する細胞の所定の系列内の特異的な遺伝子の発現を除去することが可能であるかどうかを調べるために、ニ細胞期のマウス胚の一つの細胞中にＥ−カドヘリンに対するｄｓＲＮＡを、注入すべき細胞に印を付すためのＭｍＧＦＰの合成ｍＲＮＡとともにマイクロインジェクトした。これらの胚の発育とともに、Ｅ−カドヘリンとＭｍＧＦＰの発現レベルを追跡した。Ｅ−カドヘリンの発現は、ｄｓＥ−カドヘリン ＲＮＡを注入した細胞に由来する細胞（前記注入したｍＲＮＡから同細胞中に翻訳されたＭｍＧＦＰの発現によってマークされているクローン）で特異的に減少していた。このように、初期のマウス胚では、ｄｓＲＮＡ の効果は隣接する細胞には伝達されない。このため、ｄｓＲＮＡｉは、異なる運命を有する系列間での遺伝子発現パターンを区別して制御するために、胚に使用することができる。

考察
本発明者らは、マウスの卵母細胞及び着床前又は初期胚における遺伝子活性の特異的阻害剤として、ｄｓＲＮＡを使用し得ることを実証した。本発明者らは、３つの異なる遺伝子（卵母細胞中のｃ−ｍｏｓ、初期胚中のＥ−カドヘリン又はｇｆｐ導入遺伝子）の発現を各別に阻害することによって、該操作の特異性を示している。２つの内在性のマウスの遺伝子の場合には、これは、無発現変異体の表現型に類似した表現型をもたらす。ｇｆｐ導入遺伝子の発現を阻止する本発明者らの実験は、ＲＮＡｉ自体は、発生の正常な過程に影響を与えないことを示している。

本発明者らの実験のうち２つの実験は、標的となるＲＮＡの崩壊を誘導するか、又はその翻訳を阻害することによって、ＲＮＡｉがマウス内で作用するという仮説を裏付けている。第一に、本発明者らは、ＭｍＧＦＰ ｄｓＲＮＡの注入が同時注入したセンスＭｍＧＦＰ ｍＲＮＡの発現を阻害することを示している。第二に、本発明者らは、胚胞が崩壊する前に（ｃ−ｍｏｓ ｍＲＮＡが蓄積するが、まだ翻訳されていない段階）、ｃ−ｍｏｓに対するｄｓＲＮＡを卵母細胞中に注入した。胚胞が崩壊するときにＣ−ｍｏｓが翻訳され、第二減数***の中期IIで卵母細胞が停止する。本発明者らは、ｃ−ｍｏｓ ｄｓＲＮＡがその機能を抑えること、すなわち、卵母細胞は中期IIが完了するまで進行し、単為生殖の活性化を起こすことを見出した。それぞれの場合で、ＲＮＡｉの効果は、遺伝子機能の喪失を表現型模写するのに十分な時間にわたって持続する。初期の胚盤胞の中にｄｓＲＮＡを導入すると、初期の着床後段階までその効果が残存する。ＲＮＡｉ効果がクローンに遺伝することは、ＲＮＡｉ効果が特定の系列における遺伝子活性のパターンを標的とする可能性があることを示す。最後に、ＲＮＡｉは着床前後の発育時に機能するので、この発育段階にあるマウスの胚から確立された胚性幹細胞中に存在する標的遺伝子の発現の除去をもたらすと予測し得る。これによって、特異的な細胞種への誘導された分化が促進されるかもしれない。

Claims (25)

1. 哺乳動物細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、
   前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡを前記細胞中に導入することと、
   前記標的遺伝子の発現の阻害を確認することと
   を備えた方法。
2. 前記標的遺伝子が内在性遺伝子である請求項１に記載の方法。
3. 前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である請求項１に記載の方法。
4. 前記ＲＮＡが前記細胞外で産生される請求項１、２、又は３に記載の方法。
5. 前記ＲＮＡが前記細胞中に注入される請求項４に記載の方法。
6. 前記ＲＮＡが前記細胞内で産生される請求項１、２、又は３に記載の方法。
7. 前記ＲＮＡが組換えによって産生される請求項４、５、又は６に記載の方法。
8. 前記ＲＮＡが前記細胞中の発現ベクターによって産生される請求項６又は７に記載の方法。
9. 前記ｄｓＲＮＡがβ−グルクロニダーゼに由来しない、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
10. 前記ＲＮＡが単一の自己相補性ＲＮＡ鎖を含む請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
11. 前記ＲＮＡが２つの別個の相補性ＲＮＡ鎖を含む請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
12. 前記ヌクレオチド配列が前記標的遺伝子全体と実質的に同一である請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
13. 前記ヌクレオチド配列が、前記標的遺伝子の少なくとも一部と９０％、９５％、又は１００％の同一性を有する請求項１〜１２の何れか１項に記載の方法。
14. 前記標的遺伝子が疾病を引き起こし、又は疾病を引き起こす可能性がある請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
15. 前記細胞が多能性細胞、卵母細胞、初期胚の細胞、例えば、未分化胚芽細胞である請求項１〜１４の何れか１項に記載の方法。
16. 哺乳動物細胞中に存在する標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む、医薬として使用するためのＲＮＡ。
17. 哺乳動物細胞中の標的遺伝子の発現を阻害するための薬剤の製造におけるＲＮＡの使用であって、
    前記ＲＮＡが、前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含む使用。
18. 請求項２〜１５の何れか１項の特徴によって修飾された請求項１７に記載の使用。
19. 薬学的に許容される担体とともに、哺乳動物細胞中の標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡを含んだ薬学的製剤。
20. 請求項１〜１５の何れか１項の特徴によって修飾された請求項１９に記載の薬学的製剤。
21. 哺乳動物細胞中の標的遺伝子の発現を阻害するためのキットであって、
    前記哺乳動物細胞中の標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡと、
    前記哺乳動物細胞への前記ＲＮＡの導入を促進するビークルとを備えるキット。
22. 請求項２〜１５の何れか１項の特徴によって修飾された請求項２１に記載のキット。
23. 発現構築物を含有する哺乳動物細胞であって、
    前記構築物が、標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を形成するＲＮＡをコードする哺乳動物細胞。
24. 請求項２３に記載の細胞を含有するトランスジェニック哺乳動物。
25. 哺乳動物細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、
    前記標的遺伝子の少なくとも一部と実質的に同一であり、且つ内在性テンプレートに由来するヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を含むＲＮＡを前記細胞中に導入することを備え、
    前記ｄｓＲＮＡがβ−グルクロニダーゼに由来しない方法。

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