ES2246905T3 - Inhibicion de la expresion genica con arndc. - Google Patents

Inhibicion de la expresion genica con arndc.

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ES2246905T3 ES00976188T ES00976188T ES2246905T3 ES 2246905 T3 ES2246905 T3 ES 2246905T3 ES 00976188 T ES00976188 T ES 00976188T ES 00976188 T ES00976188 T ES 00976188T ES 2246905 T3 ES2246905 T3 ES 2246905T3
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Abstract

ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana en una célula de mamífero o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6, 4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, o un vector de expresión que codifica para tal ARN, para su uso como un medicamento.

Description

Inhibición de la expresión génica con ARNdc.
La presente invención se refiere a la inhibición de la expresión génica. En particular, se refiere a la inhibición de la expresión génica en mamíferos utilizando ARN de doble cadena (ARNdc).
Los beneficios de poder inhibir la expresión de un gen o grupo de genes específico en los mamíferos son obvios. Muchas enfermedades (tales como el cáncer, trastornos endocrinos, trastornos inmunitarios, etcétera) surgen de la expresión anómala un gen o grupo de genes particular en un mamífero; por tanto, puede utilizarse la inhibición del gen o grupo para tratar estos estados. De manera similar, la enfermedad puede resultar a través de la expresión de una forma mutante de una proteína, en cuyo caso sería ventajoso eliminar la expresión del alelo mutante. Además, tal inhibición específica de genes puede utilizarse para tratar enfermedades virales que están producidas, por ejemplo, por retrovirus, tales como VIH, en las que los genes virales se integran en el genoma de su huésped y se expresan.
Además, puede utilizarse la eliminación o inhibición de la expresión de un gen específico para estudiar y manipular los acontecimientos de desarrollo tempranos en el embrión no humano. La información más valiosa se obtendría si la función del gen de interés pudiera alterarse en células específicas del embrión en momentos definidos. En tal situación, en el modelo de ratón, no pueden utilizarse las técnicas clásicas de "inactivación" ("knockout") génica, debido a que eliminan la función del gen de manera universal en todo el embrión. Además, si se utiliza un gen de manera repetida en el espacio y tiempo para dirigir procesos de desarrollo, la eliminación de su papel mediante la "inactivación" génica convencional puede negar la comprensión de todo excepto el primer acontecimiento. Incluso cuando el interés es estudiar el primer momento mismo en el desarrollo en el que funciona un gen, la contribución de los transcritos maternos y sus productos de traducción pueden enmascarar los efectos de la inactivación del gen. La tecnología de "inactivación" existente es extremadamente laboriosa. En primer lugar, necesita preparar un segmento de gen alterado que se marque adecuadamente para permitir la selección de acontecimientos de recombinación homólogos en células madre embrionarias en cultivo. Tales células deben entonces incorporarse a blastocistos y utilizarse los animales híbridos resultantes para establecer líneas reproductoras puras antes de que puedan obtenerse mutantes homocigóticos.
Se sabe que la expresión de genes puede inhibirse específicamente mediante ARN de doble cadena en ciertos organismos. La interferencia de ARN (ARNi) de doble cadena de la expresión génica que se mostró por primera vez en Caenorhabditis elegans (Fire et al. Nature 391, 806-811 (1998); documento WO99/32619), ha demostrado recientemente ser eficaz en eucariotas inferiores, incluyendo Drosophila melanogaster (Kennerdell. y Carthew, Cell 95, 1017-1026 (1998)), Trypanosoma brucei (Ngo, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 14687-14692 (1998)) planarias (Sanchez Alvarado y Newmark, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5049-5054 (1999)) y plantas (Waterhouse, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 13959-13964 (1998)). La aplicación de este enfoque también se ha demostrado en embriones de pez cebra, pero con éxito limitado (Wargelius, et al. Biochem Biophys Res Commun 263, 156-61 (1999)).
Hasta la fecha, no se ha notificado que puede utilizarse ARNi en mamíferos y además, existe la creencia en la técnica, de que ARNi no funcionará en mamíferos. A este respecto, se ha expresado la preocupación de que es poco probable que los protocolos utilizados para sistemas invertebrados y de plantas sean eficaces en mamíferos (revisado por Fire (Fire Trends Genet 15, 358-363 (1999)). Esto es debido a que la acumulación de ARNdc en las células de mamífero puede dar como resultado un bloqueo general de la síntesis de proteínas. La acumulación de cantidades muy pequeñas de ARN de doble cadena (ARNdc) en las células de mamífero tras una infección viral da como resultado la respuesta del interferón (Marcus, Interferon 5, 115-180 (1983)), que conduce a un bloqueo global de la traducción y el inicio de apoptosis (Lee y Esteban Virology 199, 491- 496 (1994)). Parte de la respuesta del interferón es la activación de una proteína cinasa que responde a ARNdc (PKR) (Clemens, Int J Biochem Cell 29, 945-949 (1997)). Esta enzima fosforila e inactiva el factor de traducción EIF2\alpha en respuesta al ARNdc. La consecuencia es una supresión global de la traducción, que a su vez desencadena la apoptosis. Wagner y Sun (Nature 391, 806-811 (1998)) sugieren que la ARNi no funcionará en mamíferos porque no tiene efecto cuando se utiliza como control en experimentos en ARN complementario.
Se ha probado el ARN complementario como medio de reducir la expresión génica en los embriones de varias especies. Aunque se ha tenido un éxito considerable en Drosophila, ha sido desalentador en embriones de pez cebra, Xenopus y ratón. En Xenopus, hubo algunas limitaciones en el uso de un enfoque complementario. Se cree que es debido a una destacada actividad de fundido del ARN (Bass y Weintraub, Cell 48, 607-613 (1987); Rebagliati y Melton, Cell 48, 599-605 (1987)), ejercida por la adenosina desaminasa específica para ARNdc (RADdc) y sugiere que no es probable que la ARNi sea satisfactoria.
En el embrión de ratón, el ARN complementario ha tenido un éxito desigual y limitado en la reducción de la expresión génica, particularmente entre las fases celulares dos a cuatro (Bevilacqua et al. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 831-835 (1988)). Estos autores estaban interesados en si la inhibición parcial de \beta-glucuronidasa en sus experimentos podría reflejar una actividad de fundido que actúa sobre los dúplex codificante/complementario, y así examinaron la estabilidad de ARNdc de \beta-glucuronidasa microinyectado en blastómeros de ratón. No notificaron efectos sobre la estabilidad del ARN, pero esto sólo se siguió durante un periodo de 5 horas. Por tanto, no hay sugerencias en este artículo de que el ARNdc pueda persistir en células de mamífero el tiempo suficiente para interferir en la expresión génica. Además, no notificaron efectos sobre la expresión de \beta-glucuronidasa tras la inyección de ARNdc. Por tanto, este artículo no sugiere que el ARNdc pueda inhibir la expresión génica en células de mamífero.
El documento WO99/32619 sugiere que puede utilizarse ARNdc para inhibir la expresión génica en mamíferos. Sin embargo, las únicas pruebas experimentales en este documento muestran que la ARNi funciona en C. elegans; no hay nada que muestre que podría funcionar en mamíferos. De hecho, las publicaciones posteriores de los inventores enumeradas para el documento WO99/32619 (Fire Trends Genet 15, 358-363 (1999); Montgomery y Fire, Trends Genet 14, 3255-258 (1998)) establecen que sólo podría hacerse funcionar la ARNi en mamífero si pudiera neutralizarse la respuesta de PKR o evitarse de alguna manera, aunque no se proporcionan sugerencias en el documento WO99/32619 sobre cómo podría conseguirse esto. Estas publicaciones posteriores indican que los inventores del documento WO99/32619 creen ellos mismos que la ARNi no se ha hecho funcionar todavía (y que no se puede) en mamíferos.
Por tanto, existe la percepción en la técnica de que la ARNi no puede hacerse funcionar en mamíferos. En contra de esta percepción, los inventores han demostrado ahora que es posible interferir en la expresión génica específica en el ovocito y cigoto de ratón tras la microinyección del ARNdc apropiado. Han demostrado experimentalmente que la ARNi puede crear una fenocopia de los efectos de perturbación de la expresión materna del gen c-mos en el ovocito, para vencer la detención de la meiosis en la metafase II, o la expresión cigótica de E-cadherina para evitar el desarrollo del blastocisto, tal como se observa en los correspondientes ratones deficientes. Los inventores han demostrado que la inyección de un ARNdc es específico para el gen correspondiente; no produce una detención traduccional general, ya que el embrión continúa desarrollándose y no pueden observarse signos de muerte celular. Por tanto, han demostrado que la ARNi puede ser eficaz en células de mamífero.
Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana en una célula de mamífero o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, o un vector de expresión que codifica para tal ARN, para su uso como un medicamento.
Según un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un método in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método:
introducir en la célula un ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno; y
verificar la inhibición de la expresión del gen diana;
en el que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
El ARNdc útil según la invención se deriva de un "molde endógeno". Tal molde puede ser toda o parte de una secuencia de nucleótidos endógena al mamífero; puede ser una secuencia génica de ADN o un ADNc producido a partir de un ARNm aislado del mamífero, por ejemplo, mediante transcriptasa inversa. Cuando el molde es toda o parte de una secuencia génica de ADN, se prefiere que proceda de uno o más o todos los exones del gen. Adicionalmente, todo o parte del gen viral puede formar un molde endógeno, si se expresa en el mamífero de tal manera que no se induzca la respuesta del interferón, por ejemplo, la expresión a partir de un provirus integrado en el cromosoma de la célula huésped. Por tanto, el ARNdc de la presente invención se distingue del ARNdc viral y polyrIC sintético, que se ha observado que inducen ambos PKR que conduce a apoptosis en las células de mamífero.
Aunque el ARNdc se deriva de un molde endógeno, no existe limitación sobre la manera en que se sintetiza. Por tanto, pueden sintetizarse in vitro o in vivo, utilizando procedimientos manuales y/o automatizados. La síntesis in vitro puede ser química o enzimática, por ejemplo, utilizando ARN polimerasa clonada (por ejemplo, T3, T7, SP6) para la transcripción del molde de ADN endógeno (o ADNc), o una mezcla de ambos.
In vivo, el ARNdc puede sintetizarse utilizando técnicas recombinantes bien conocidas en la técnica (véase por ejemplo, Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SEGUNDA EDICIÓN (1989); DNA CLONING, VOLÚMENES I Y II (D. N Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDISATION (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984), ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney ed. 1986); IMMOBILISED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); the series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller y M. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 y Vol. 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds., respectivamente), Mayer y Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, Londres), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, segunda edición (Springer-Verlag, N.Y.), y HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLÚMENES I-IV (D. M. Weir y C C. Blackwell eds 1986).
Por tanto, las células bacterianas pueden transformarse con un vector de expresión Que comprende el molde de ADN a partir del cual va a derivarse el ARNdc. Alternativamente, las células del mamífero en las que se requiere la inhibición de la expresión génica pueden transformarse con un vector de expresión o por otros medios. La transcripción bidireccional de una o más copias del molde puede estar por ARN polimerasa endógena de la célula transformada o por una ARN polimerasa clonada (por ejemplo, T3, T7, SP6) codificada por el vector de expresión o un vector de expresión diferente. El uso y la producción de un constructo de expresión se conocen en la técnica (véase el documento WO98/32016; las patentes de los EE.UU. números 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 y 5.804.693). La inhibición de la expresión génica puede dirigirse mediante la transcripción específica en un órgano, tejido o tipo celular; una condición ambiental (por ejemplo, infección, tensión, temperatura, compuesto químico); y/o transcripción mediante ingeniería genética en una fase o edad de desarrollo, especialmente cuando el ARNdc se sintetiza in vivo en el mamífero. El ARNdc también puede suministrarse a tejidos o tipos celulares específicos utilizando sistemas de suministro de genes conocidos. Los vectores eucariotas conocidos incluyen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Estos vectores se enumeran solamente a modo de ilustración de los muchos vectores disponibles comercialmente y bien conocidos de los que disponen los expertos en la técnica.
Si se sintetizan fuera de la célula de mamífero, el ARN puede purificarse antes de la introducción en la célula. La purificación puede ser mediante extracción con un disolvente (tal como fenol/cloroformo) o resina, precipitación (por ejemplo, en etanol), electroforesis, cromatografía, o una combinación de los mismos. Sin embargo, la purificación puede dar como resultado una pérdida de ARNdc y, por tanto, puede ser mínima o no llevarse a cabo en absoluto. El ARN puede secarse para su almacenamiento o disolverse en una disolución acuosa, que puede contener tampones o sales para promover la hibridación y/o la estabilización de las hebras de ARN.
El ARNdc útil en la presente invención incluye ARNdc que contiene una o más bases modificadas y ARNdc con un esqueleto modificado para su estabilidad o por otros motivos. Por ejemplo, pueden modificarse los enlaces fosfodiéster del ARN natural para incluir al menos uno de un heteroátomo de nitrógeno o azufre. Además, pueden utilizarse en la invención ARNdc que comprenden bases no usuales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, solamente por nombrar dos ejemplos. Se apreciará que puede realizarse una gran variedad de modificaciones al ARN para que sirva para muchos fines útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término ARNdc tal como se emplea en el presente documento engloba tales formas modificadas química, enzimática o metabólicamente de ARNdc, siempre que se derive de un molde endógeno.
La estructura de doble cadena puede formarse mediante una única cadena de ARN autocomplementario o dos cadenas de ARN complementario diferentes. La formación del dúplex de ARN puede iniciarse o bien dentro o bien fuera de la célula de mamífero.
El ARNdc comprende una estructura de doble cadena, cuya secuencia es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana. "Identidad", tal como se conoce en la técnica, es la relación entre dos o más secuencias polinucleotídicas (o polipéptidícas), determinado comparando las secuencias. En la técnica, identidad también significa el grado de relación entre las secuencias polinucleotídicas, determinado por la coincidencia de las cadenas de tales secuencias. La identidad puede calcularse fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Aunque existen varios métodos para medir la identidad entre dos secuencias polinucleotídicas, el término lo conocen bien los expertos en la técnica (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos empleados comúnmente para determinar la identidad entre secuencias incluyen, pero sin limitarse a los descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se codifican en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitarse a, el paquete informático GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)). Otro paquete informático bien conocido en la técnica para llevar a cabo este procedimiento es el programa CLUSTAL. Compara la secuencia de dos polinucleótidos y halla la alineación óptima insertando espacios en cualquier secuencia, según sea apropiado. La identidad para una alineación óptima puede calcularse utilizando un paquete de software tal como BLASTx. Este programa alinea la región más grande de secuencia similar y asigna un valor al ajuste. Para cualquier comparación patrón, pueden encontrarse varias regiones de similitud, que tienen, cada una, una puntuación diferente. Un experto en la técnica apreciará que dos polinucleótidos de longitudes diferentes pueden compararse a lo largo de la longitud completa del fragmento más largo. Alternativamente, pueden compararse regiones pequeñas. Normalmente, se comparan secuencias de la misma longitud para que se haga una comparación útil.
Se prefiere que haya un 100% de identidad de secuencia entre el ARN inhibidor y la parte del gen diana. Sin embargo, puede utilizarse ARNdc que tiene un 80% o más del 90% o el 95% de identidad de secuencia en la presente invención, y por tanto, pueden tolerarse las variaciones de la secuencia que podrían esperarse debido a la mutación genética, polimorfismo de las cepas o divergencia evolutiva.
La región de dúplex del ARN puede tener una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana (por ejemplo, hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM, pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas; seguido por lavado).
Aunque la longitud óptima del ARNdc puede variar según el gen diana y las condiciones experimentales, la región de dúplex del ARN puede ser de al menos 25, 50, 100, 200, 300, 400 o más bases de largo.
Tal como se utiliza en el presente documento, "gen diana" dignifica generalmente un polinucleótido que comprende una región que codifica para un polipéptido, o una región de polinucleótido que regula la replicación, transcripción o traducción u otros procesos importantes para la expresión del polipéptido, o un polinucleótido que comprende tanto una región que codifica para un polipéptido como una región operativamente unida a la misma que regula la expresión. Los genes diana pueden ser genes celulares presentes en el genoma o genes virales o provirales que no producen la respuesta del interferón, tales como genes retrovirales. El gen diana puede ser un gen que codifica para una proteína o un gen que codifica no para una proteína, tal como un gen que codifica para ARN ribosómicos, ARN del empalmosoma, ARNt, etc.
Se prefiere que el ARNdc sea sustancialmente idéntico a la totalidad del gen diana, es decir, a la parte codificante del gen. Sin embargo, el ARNdc puede ser al menos el 80% idéntico a una parte del gen diana. El tamaño de esta parte depende del gen diana particular y puede determinarse por los expertos en la técnica variando el tamaño del ARNdc y observando si la expresión del gen se ha inhibido.
En la presente invención, puede utilizarse ARNdc para inhibir un gen diana que produce o es probable que produzca una enfermedad, es decir, puede utilizarse para el tratamiento o la prevención de la enfermedad. En la prevención de la enfermedad, el gen diana puede ser uno que se requiera para el inicio o mantenimiento de la enfermedad, o que se ha identificado que está asociado con un riesgo superior de contraer la enfermedad.
En el tratamiento de la enfermedad, el ARNdc puede ponerse en contacto con las células o tejido que presentan la enfermedad. Por ejemplo, ARNdc sustancialmente idéntico a todo o parte de un gen mutado asociado con el cáncer, o uno que se exprese a altos niveles en células tumorales, por ejemplo cinasa aurora, puede ponerse en contacto con o introducirse en una célula cancerosa o gen tumoral. Ejemplos de cánceres con los que puede utilizarse la presente invención para prevenirlos o tratarlos incluyen tumores sólidos y leucemias, incluyendo: apudoma, coristoma, branquioma, síndrome carcinoide maligno, enfermedad cardiaca carcinoide, carcinoma (por ejemplo, de Walker, de células basales, basoescamoso, de Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, in situ, de Krebs 2, de células de Merkel, mucinoso, de pulmón no microcítico, de células en grano de avena, papilar, escirro, bronquiolar, broncogénico, epidermoide y de células de transición), trastornos histiocíticos, leucemia (por ejemplo, de células B, de células mixtas, de células nulas, de células T, crónica de células T, asociada a HTLV-II, linfocítica aguda, linfocítica crónica, de mastocitos y mieloide), histiocitosis maligna, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, inmunoproliferativo de células pequeñas, plasmacitoma, reticuloendoteliosis, melanoma, condroblastoma, condroma, condrosarcoma, fibroma, fibrosarcoma, tumores de células gigantes, histiocitoma, lipoma, liposarcoma, mesotelioma, mixoma, mixosarcoma, osteoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, sinovioma, adenofibroma, adenolinfoma, carcinosarcoma, cordoma, craneo-faringioma, disgerminoma, hamartoma, mesenquimoma, mesonefroma, miosarcoma, ameloblastoma, cementoma, odontoma, teratoma, timoma, tumor trofoblástico, adeno-carcinoma, adenoma, colangioma, colesteatoma, cilindroma, cistoadenocarcinoma, cistoadenoma, tumor de las células de la granulosa, ginandroblastoma, hepatoma, hidradenoma, tumor de las células del islote, tumor de las células de Leydig, papiloma, tumor de las células de Sertoli, tumor de las células de la teca, leiomioma, leiomiosarcoma, mioblastoma, mioma, miosarcoma, rabdomioma, rabdomiosarcoma, ependimoma, ganglioneuroma, glioma, meduloblastoma, meningioma, neurilemoma, neuroblastoma, neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma, quimiodectaoma, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, hemangioma esclerosante, angiomatosis, glomangioma, hemangioendotelioma, hemangioma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, linfangioma, linfangiomioma, linfangiosarcoma, pinealoma, carcinosarcoma, condrosarcoma, cistosarcoma, filoides, fibrosarcoma, hemangiosarcoma, leimiosarcoma, leucosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, miosarcoma, mixosarcoma, carcinoma ovárico, rabdomiosarcoma, sarcoma (por ejemplo, de Ewing, experimental, de Kaposi, y de mastocitos), neoplasias (por ejemplo, óseas, de mama, del sistema digestivo, colorrectales, hepáticas, pancreáticas, hipofisarias, testiculares, orbitales, de cabeza y cuello, del sistema nervioso central, de oído, pélvicas, del aparato respiratorio y genitourinario), neurofibromatosis y displasia del cuello uterino, y otros estados en los que las células se han inmortalizado o transformado. La invención podría utilizarse en combinación con otros tratamientos, tales como quimioterapia, crioterapia, hipertermia, radioterapia y similares.
La presente invención también puede utilizarse en el tratamiento y la profilaxis de otras enfermedades, especialmente aquellas asociadas con la expresión o sobreexpresión de un gen o genes particulares. Por ejemplo, podría inhibirse la expresión de genes asociados con la respuesta inmunitaria para tratar/prevenir enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide, enfermedad de injerto contra huésped, etc. En tal tratamiento, el ARNdc puede utilizarse junto con fármacos inmunosupresores. Los fármacos inmunosupresores utilizados más comúnmente incluyen actualmente costicosteroides e inhibidores más potentes como, por ejemplo, metotrexato, sulfasalazina, hidroxicloroquina, 6-MP/azatioprina y ciclosporina. Sin embargo, todos estos tratamientos tienen graves efectos secundarios relacionados con la toxicidad, y es urgente la necesidad de fármacos que permitieran su eliminación o la reducción de su uso. Otros fármacos inmunosupresores incluyen los tratamientos no esteroideos más suaves, pero no menos potentes tales como aspirina e ibuprofeno, y una nueva clase de reactivos que se basan en funciones moduladoras inmunitarias más específicas. Esta última clase incluye interleucinas, citocinas, moléculas de adhesión recombinantes y anticuerpos monoclonales. El uso de ARNdc para inhibir un gen asociado con la respuesta inmunitaria en un protocolo de tratamiento inmunosupresor podría aumentar la eficacia de la inmunosupresión, y particularmente, puede permitir que se disminuyan las cantidades administradas de otros fármacos, que tienen efectos adversos tóxicos u otros.
Las clases siguientes de posibles genes diana son ejemplos de los genes con los que puede utilizarse la presente invención para inhibirlos: genes de desarrollo (por ejemplo, moléculas de adhesión, inhibidores de la cinasa dependiente de ciclina, miembros de la familia Wnt, miembros de la familia Pax, miembros de la familia Winged helix, miembros de la familia Hox, citocinas/linfocinas y sus receptores, factores de crecimiento/diferenciación y sus receptores, neurotransmisores y sus receptores); oncogenes (por ejemplo, ABLI, BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETS1, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TCL3 y YES); genes supresores de tumores (por ejemplo, APC, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF1, NF2, RB1, TP53 y WT1); y enzimas (por ejemplo, ACP desaturasas e hidroxilasas, ADP-glucosa piroforilasas, ATPasas, alcohol deshidrogenasas, amilasas, amiloglucosidasas, catalasas, celulasas, ciclooxigenasas, descarboxilasas, dextrinasas, ADN y ARN polimerasas, galactosidasas, glucanasas, glucosa oxidasas, GTPasas, helicasas, hemicelulasas, integrasas, invertasas, isomerasas, cinasas, lactasas, lipasas, lipoxigenasas, lisozimas, pectinesterasas, peroxidasas, fosfatasas, fosfolipasas, fosforilasas, poligalacturonasas, proteinasas y peptidasas, pulanasas, recombinasas, trascriptasas inversas, topoisomerasas y
xilanasas).
En una realización preferida del primer aspecto, el ARNdc no se deriva de \beta-glucuronidasa. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método:
introducir en la célula un ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, en el que el ARNdc no se deriva de \beta-glucuronidasa, en el que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
La inhibición de la expresión de un gen diana puede verificarse observando o detectando la ausencia o una disminución visible en el nivel de proteína codificada por un gen diana (esto puede detectarse, por ejemplo, mediante un anticuerpo específico u otras técnicas conocidas para la persona experta) y/o el producto de ARNm de ese gen diana (esto puede detectarse, por ejemplo, mediante estudios de hibridación) y/o el fenotipo asociado con la expresión del gen. En el contexto de un tratamiento médico, la verificación de la inhibición de la expresión de un gen diana puede ser observando un cambio en el estado patológico de un sujeto, tal como una reducción de los síntomas, remisión, un cambio en el estado patológico, etcétera. Preferiblemente, la inhibición es específica, es decir, la expresión del gen diana se inhibe sin efectos evidentes sobre los demás genes de la célula.
La cantidad de ARNdc administrado a un mamífero para la inhibición génica eficaz variará entre límites amplios según una variedad de factores, incluyendo la vía de administración, la edad, tamaño y estado del mamífero, el gen que va a inhibirse, la enfermedad o trastorno que va a tratarse, etcétera. Los presentes inventores han encontrado que, cuando se inyectan 10 pl en un ovocito no humano o un embrión temprano no humano, son eficaces disoluciones que tienen ARNdc a una concentración en el intervalo de desde 0,01 a 40 mg/ml, preferiblemente de 0,1 a 4 mg/ml y lo más preferido de 0,1 a 2 mg/ml. Por tanto, el ARNdc puede administrarse para proporcionar de 0,1 a 400 pg, preferiblemente de 1 a 40 pg, y lo más preferido de 1 a 20 pg a cada célula.
La célula que tiene el gen diana puede ser somática, totipotente, Pluripotente, en división, que no está en división, del epitelio, inmortalizada o transformada, procedente de la línea germinal no humana o similar. La célula puede ser una célula madre o una célula diferenciada. Los tipos celulares que se diferencian incluyen adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, endotelio, neuronas, glía, células sanguíneas, megacariocitos, linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos y células de las glándulas endocrinas y exocrinas. La célula puede ser cualquier célula individual del embrión temprano no humano, y puede ser un blastocito no humano. Alternativamente, puede ser un ovocito no humano.
Se sabe que las células de mamífero pueden responder a ARNdc extracelular y, por tanto, pueden tener un mecanismo de transporte para el ARNdc (Asher, et al, Nature 223 715-717 (1969)). Por tanto, el ARNdc puede administrarse de manera extracelular en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un mamífero o introducirse por vía oral. Los métodos para la introducción oral incluyen el mezclado directo del ARN con los alimentos del mamífero, así como enfoques de ingeniería genética en los que una especie que se utiliza como alimento se modifica por ingeniería genética para expresar el ARN, luego se alimenta al mamífero que va a afectarse. Por ejemplo, pueden transformarse bacterias de los alimentos, tales como Lactococcus lactis, para producir el ARNdc (véanse los documentos WO93/17117, WO97/14806). La circulación vascular o extravascular, los sistemas sanguíneo o linfático y el líquido cefalorraquídeo son sitios en los que puede inyectarse el ARN.
El ARN puede introducirse en la célula de manera intracelular. Los métodos físicos de introducción de ácidos nucleicos también pueden utilizarse a este respecto. Los ARNdc también pueden administrarse utilizando las técnicas de microinyección descritas en Zernicka-Goetz,. et al. Development 124, 1133-1137 (1997) y Wianny, et al. Chromosoma 107, 430-439 (1998).
Otros métodos físicos de introducción de ácidos nucleicos de manera intracelular incluyen el bombardeo con partículas recubiertas por el ARN, por ejemplo, la tecnología de la pistola génica en la que se inmoviliza el ARNdc sobre partículas de oro y se lanzan directamente en el sitio de la herida. Por tanto, la invención proporciona el uso de un ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos, que es sustancialmente idéntica a al menos una parte de un gen diana en una célula de mamífero y que se deriva de un molde endógeno, en una pistola génica para inhibir la expresión del gen diana. Además, se proporciona una composición adecuada para el tratamiento con pistola génica que comprende: un ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos, que es sustancialmente idéntica a al menos una parte de un gen diana en una célula de mamífero y que se deriva de un molde endógeno; y partículas de oro. Un método físico alternativo incluye la electroporación de membranas celulares en presencia del ARN. El ARNdc puede introducirse en células embrionarias no humanas mediante electroporación utilizando condiciones similares a las aplicadas generalmente a células en cultivo. Las condiciones precisas para la electroporación dependen del dispositivo utilizado para producir el electrochoque y las dimensiones de la cámara utilizada para contener los embriones. Este método permite la ARNi a gran escala. Puede utilizarse cualquier terapia génica conocida para administrar el ARN. Un constructo viral empaquetado en una partícula viral conseguiría tanto la introducción eficaz de un constructo de expresión en la célula como la transcripción del ARN codificado por el constructo de expresión. Pueden utilizarse otros métodos conocidos en la técnica para la introducción de ácidos nucleicos en células, tales como el transporte de portadores mediado por lípidos, el transporte mediado por compuestos químicos, tales como el fosfato de calcio, y similares. Por tanto, el ARN puede introducirse junto con componentes que realizan una o más de las siguientes actividades: potenciar la captación de ARN por la célula, promover la hibridación de las hebras del dúplex, estabilizar las hebras hibridadas, o si no, aumentar la inhibición del gen diana. Puede producirse un mamífero transgénico no humano que expresa ARN a partir de un constructo recombinante introduciendo el constructo en un cigoto, una célula madre embrionaria, u otra célula multipotente derivada del mamífero adecuado.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un ARN, o un vector de expresión que codifica para tal ARN, según se define en el primer aspecto, en la fabricación de un medicamento para inhibir la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, en el que el gen diana produce o es probable que produzca una enfermedad, y en el que la célula de mamífero es una célula somática o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
El medicamento se suministrará normalmente como parte de una composición farmacéutica, estéril que incluirá normalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por tanto, la invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende un ARN según se define en el primer aspecto, o un vector de expresión que codifica para tal ARN, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del método deseado para administrársela al paciente). Puede proporcionarse en una forma farmacéutica unitaria, generalmente se facilitará en un envase sellado y puede proporcionarse como parte de un kit.
Tal kit normalmente incluiría (aunque no necesariamente) instrucciones para su uso. Puede incluir una pluralidad de dichas formas farmacéuticas unitarias.
La composición farmacéutica puede adaptarse para la administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo por la vía oral (incluyendo bucal y sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual y transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Tales composiciones pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica de la farmacia, por ejemplo, mezclando el principio activo con el (los) vehículo(s) o excipiente(s) en condiciones estériles.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración oral pueden presentarse como unidades diferenciadas tales como cápsulas o comprimidos; como polvos o gránulos; como disoluciones, jarabes o suspensiones (en líquidos acuosos o no acuosos; o como batidos o espumas comestibles; o como emulsiones). Los excipientes adecuados para los comprimidos o cápsulas de gelatina dura incluyen lactosa, almidón de maíz o derivados de los mismos, ácido esteárico o sales del mismo. Los excipientes adecuados para su uso con cápsulas de gelatina blanda incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, ceras, grasas, polioles semisólidos o líquidos, etc.
Para la preparación de disoluciones y jarabes, los excipientes que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, agua, polioles y azúcares, para la preparación de suspensiones aceitosas (por ejemplo, aceites vegetales) pueden utilizarse para proporcionar suspensiones de aceite en agua o de agua en aceite.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica pueden formularse como pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, disoluciones, pastas, geles, spray, aerosoles o aceites. Para infecciones oculares o de otros tejidos externos, por ejemplo la boca y la piel, las composiciones se aplican preferiblemente como una pomada o crema tópica. Cuando se formulan en una pomada, el principio activo puede emplearse con una base de pomada parafínica o miscible en agua. Alternativamente, el principio activo puede formularse en una crema con una base de crema de aceite en agua o una base de agua en aceite. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica ocular incluyen colirios, en los que el principio activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica bucal incluyen pastillas para chupar, pastillas y enjuagues bucales.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración rectal pueden presentarse como supositorios o enemas.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración nasal, en las que el vehículo es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 \mum, que se administran de la manera en que se toma rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través de las fosas nasales desde un recipiente con el polvo sostenido cerca de la nariz. Las composiciones adecuadas en las que el vehículo es un líquido, para la administración como un aerosol nasal o como gotas nasales, incluyen disoluciones acuosas o en aceite del principio activo.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración mediante inhalación incluyen polvos o nieblas de partículas finas que pueden generarse por medio de diversos tipos de aerosoles, nebulizadores o insufladores presurizados de dosis medidas.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración vaginal pueden presentarse como óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en spray.
Las composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración parenteral incluyen una disolución para inyección, estéril, acuosa o no acuosa, que puede contener antioxidantes, tampones, bacterióstatos y solutos que hacen que la formulación sea sustancialmente isotónica con la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles, acuosas y no acuosas, que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Los excipientes que pueden utilizarse para las disoluciones inyectables incluyen agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales, por ejemplo. Las composiciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado liofilizado (criodesecado) que solamente requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones para la inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes conservantes, agentes de solubilización, agentes de estabilización, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, odorizantes, sales (las propias sustancias de la presente invención pueden proporcionarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable), tampones, agentes de recubrimiento o antioxidantes. Pueden contener también agentes terapéuticamente aceptables además de la sustancia de la presente invención.
Las dosificaciones de la sustancia de la presente invención pueden variar entre límites amplios, dependiendo de la enfermedad o trastorno que va a tratarse, la edad y el estado del individuo que va a tratarse, etc. y un médico determinará en última instancia las dosificaciones apropiadas que van a utilizarse. Esta dosificación puede repetirse tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, pueden reducirse la cantidad y/o frecuencia de la dosificación, según la práctica clínica normal.
La presente invención puede utilizarse sola o como componente de un kit que tiene al menos uno de los reactivos necesarios para llevar a cabo la introducción in vitro o in vivo de ARN en sujetos. Los componentes preferidos son el ARNdc y un vehículo que promueva la introducción del ARNdc. Tal kit puede incluir también instrucciones para permitir al usuario del kit poner en práctica la invención.
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un kit para inhibir la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el kit:
ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana en una célula de mamífero o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, o un vector de expresión que codifica para tal ARN; y
un vehículo que promueve la introducción del ARN o vector en la célula de mamífero,
en el que el ARN no se deriva del gen que codifica para la \beta- glucuronidasa y en el que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
La presente invención puede utilizarse para manipular la expresión génica en el ovocito no humano para tratar la infertilidad. También puede utilizarse para regular los procesos de disyunción cromosómica en mamíferos no humanos. En los seres humanos, hay un aumento de la incidencia de la no disyunción cromosómica en madres mayores de 35 años de edad, que conduce a hijos con síndrome de Down y abortos espontáneos. Ahora se sabe que varias moléculas reguladoras del ciclo celular promueven varios aspectos de la progresión del ciclo que incluyen cinasas dependientes de ciclina, ciclinas, cinasa polo, cinasa aurora, cinasa min A, proteín fosfatasas, compuestos del complejo que promueve la anafase y sus moléculas reguladoras, compuestos del proteosoma, el complejo SCF, compuestos del centrosoma, componentes del cinetocoro, proteínas estructurales de los cromosomas, enzimas de replicación del ADN, proteínas de recombinación del ADN y proteínas de reparación del ADN. La invención puede utilizarse en seres no humanos para modular la expresión de una o más de las proteínas anteriores para garantizar la segregación correcta de los cromosomas.
La invención también puede utilizarse para manipular las fases del ciclo celular de cigotos enucleados receptores y células donantes que proporcionan los núcleos para la clonación de mamíferos no humanos (véase el documento WO97/07668). La experiencia con la clonación de ovejas y ratones muestra una necesidad de optimizar la fase del ciclo celular del cigoto receptor antes de su enucleación, y de quitar los núcleos de las células en una fase específica, frecuente pero no necesariamente, células en G_{O}. La aplicación de la presente invención para detener una o más moléculas del ciclo celular indicada anteriormente puede utilizarse para este fin.
La presente invención puede utilizarse también para dirigir patrones de expresión génica en células pluripotentes con el fin de producir tipos celulares diferenciados específicos, para su uso en el trasplante para sustituir tejido enfermo o de otro modo no funcional. Un ejemplo de células pluripotentes son las células madre embrionarias (ME) procedentes de embriones antes de la implantación no humanos. Se conoce bien en la técnica que las células ME de ratón pueden reintroducirse en el blastocisto, con lo que quedan incorporadas en el embrión en desarrollo, desarrollarse y diferenciarse en todos los tipos celulares y estructuras del organismo. Las células ME también pueden inducirse para que se diferencien in vitro en una amplia gama de tipos celulares tras la eliminación de factores de crecimiento específicos del medio de cultivo. Se espera que puedan establecerse líneas celulares ME a partir de todos los mamíferos y, de hecho, ya se han establecido métodos para establecer líneas celulares ME humanas. La diferenciación de tipos celulares pluripotentes en tipos celulares específicos requiere que ciertas rutas de la expresión génica se desconecten y otras se conecten. La presente invención puede aplicarse para eliminar proteínas clave en tales rutas reguladoras, con el fin de dirigir células ME y otras embrionarias a que se diferencien en tipos celulares específicos. Por tanto, la invención puede utilizarse para interferir en la expresión de genes del desarrollo (tales como los mencionados en el presente documento) para dirigir la diferenciación celular a lo largo de rutas preferidas. También se sabe que ciertos tipos celulares completan su diferenciación con la salida del ciclo de división celular. Por tanto, la invención puede utilizarse para inhibir moléculas reguladoras del ciclo celular, tal como las enumeradas anteriormente. Estos ARNdc pueden utilizarse directamente o expresarse a partir de promotores que se pueden regular para llevar a cabo las fases finales de la diferenciación celular.
La invención también proporciona una célula de mamífero aislada que contiene un constructo de expresión, codificando el constructo para un ARN que forma una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, en el que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
Cuando se utiliza en el presente documento, "tratamiento/terapia" incluyen cualquier régimen que pueda beneficiar a un ser humano o animal no humano, y "que comprende/que tiene" cubre todo aquello que consista solamente en un rasgo/característica específico, así como todo aquello con ese rasgo/característica, pero que también tiene uno o más rasgos/características adicionales.
Las características preferidas de cada aspecto de la invención son, como para cada uno de los demás aspectos, mutatis mutandi.
Ejemplos
Ahora se describirá la presente invención adicionalmente en los siguientes ejemplos. Se hace referencia a los dibujos adjuntos:
Figura 1: El ARNdc de MmGFP suprime la expresión de MmGPF en embriones transgénicos MmGFP
(a-c) Embriones representativos de 131 embriones obtenidos a partir de once apareamientos diferentes entre hembras F1 y machos transgénicos MmGFP. Embriones transgénicos MmGFP en la fase de 4 -6 células (a), mórula (b), blastocistos (c). Se obtuvo un patrón similar de expresión tras la inyección de ARN de MmGFP complementario. (d-f) Embriones representativos de 147 embriones transgénicos MmGFP a los que se había inyectado ARNdc de MmGFP en la fase de una célula. Embriones en la fase de 4-6 células (d), mórula (e), blastocisto (f). (g-i) Embriones representativos de 18 embriones transgénicos MmGFP a los que se había inyectado ARNdc de c-mos en la fase de una célula, Embriones en la fase de 6 células (g), mórula (h), blastocisto (i). Las barras de escala representan 20 \mum. El sombreado indica fluorescencia verde.
Figura 2: Interferencia en la expresión de ARNm de MmGFP sintético inyectado.
(a), mórulas de tipo natural a las que se inyecta ARNm de MmGFP solo; (b), junto con ARNdc de E-cadherina; y (c), junto con ARNdc de MmGFP, en la fase de una célula. Las barras de escala representan 20 \mum. El sombreado indica fluorescencia verde.
Figura 3: La inyección de ARNdc de E-cadherina al cigoto reduce la expresión de E-cadherina y altera el desarrollo de los embriones a los que se ha inyectado.
(a), Tinción inmunofluorescente de E-cadherina en embriones a los que se les inyectó en la fase de una célula ARNdc de MmGFP, y se cultivaron durante cuatro días in vitro hasta la fase de blastocisto. (b), Tinción inmunofluorescente de E-cadherina en embriones a los que se les inyectó en la fase de una célula ARNdc de E-cadherina, y se cultivaron durante cuatro días in vitro. Obsérvese el desarrollo alterado de estos embriones. Las barras de escala representan 20 \mum. (c), Análisis por inmunotransferencia (Western blot) de la expresión de E-cadherina en los cigotos, mórulas no inyectadas (recogidas en la fase de una célula y cultivadas in vitro tres días), mórulas a las que se les inyectó en la fase de una célula 2 mg ml^{-1} de ARNdc de GFP y se cultivaron in vitro durante tres días, mórulas a las que se les inyectó en la fase de una célula 2 mg ml^{-1} de ARNdc de E-cadherina y se cultivaron in vitro durante tres días. En cada caso, se extrajeron las proteínas de 15 embriones. Este experimento se ha repetido tres veces con el mismo resultado. La reducción de la señal tras la inyección de ARNdc de E-cadherina fue de aproximadamente 6,5 veces. Las barras de escala representan 20 \mum. El sombreado indica quimioluminiscencia.
Figura 4: La inyección de ARNdc de c-mos en ovocitos inmaduros inhibe la expresión de c-mos y produce activación partenogenética.
(a-d) Ejemplos de cigotos activados partenogenéticamente obtenidos tras la inyección de ARNdc de c-mos en ovocitos en la fase de vesícula germinal. (a), Ovocito control detenido en la metafase II; (b), embrión de una célula (la flecha blanca señala el pronúcleo); (c), embrión de dos células; (d), embrión de cuatro células. Las barras de escala representan 20 \mum. (e), Análisis por inmunotransferencia de la expresión de c-mos en ovocitos detenidos en la metafase II, ovocitos a los que se les inyectó en la fase de vesícula germinal 2 mg ml^{-1} de ARNdc de MmGFP y se cultivaron in vitro durante 12 horas, ovocitos a los que se les inyectó en la fase de vesícula germinal 2 mg ml^{-1} de ARNdc de c-mos y se cultivaron in vitro durante 12 horas. En cada caso, se extrajeron las proteínas de 35 ovocitos. Este experimento se ha repetido dos veces con el mismo resultado.
Figura 5: La inhibición de la expresión génica tras la inyección de ARN de doble cadena se limita al linaje clonal derivado de la célula inyectada.
La tinción inmunofluorescente de E-cadherina en embriones a los que se les inyectó en una célula, en la fase de dos células, ARNdc de E-cadherina y ARNm de MmGFP sintético. Los paneles de la izquierda muestran la fluorescencia (roja) de canal único que revela E-cadherina. Obsérvese que la tinción se reduce notablemente en la descendencia de la célula inyectada. Estas células de descendencia se identifican en los correspondientes canales segundos (verdes) como células que expresan MmGFP.
Métodos Recogida y cultivo de ovocitos y embriones
Se recogieron ovocitos inmaduros detenidos en la profase I de la meiosis de los ovarios de ratones F1 de 4-6 semanas (CBA x C57B1) en medio FHM (Speciality media, Inc. Lavalette, N.J.) complementado con albúmina de suero bovino (BSA) (4 mg ml^{-1}). Los ratones hembra F1 se sometieron a superovulación mediante inyecciones intraperitoneales de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG, 5 u.i.) y gonadotropina coriónica humana (GCh) separadas 48-52 horas. Se obtuvieron embriones de 1 célula fertilizados a partir de hembras apareadas 20-24 horas después de la GCh.
Síntesis de ARN y microinyecciones
Los moldes utilizados para la síntesis de ARN fueron plásmidos linealizados. Se clonó ADNc de MmGFP de longitud completa (714 pb) en el plásmido T7TS (Zernicka-Goetz,. et al. Development 124, 1133-1137 (1997)). Se clonó un fragmento KpnI/HindIII de ADNc de c-mos (550 pb) (Colledge et al, Nature 370, 665-68 (1994)) en Bluescript pSK. Se clonó un ADNc correspondiente al exón 4-exón 8 de E-cadherina (580 pb) (Larue et al, Proc Nat Acad Sci USA 92, 55-859 (1995)) en Bluescript pSK. Los ARN se sintetizaron utilizando las polimerasas T3 o T7, utilizando el kit Megascripts (Ambion). Se eliminaron los moldes de ADN con tratamiento con ADNasa. Los productos de ARN se extrajeron con fenol/cloroformo y se precipitaron con etanol.
Para la hibridación, se mezclaron cantidades equimolares de ARN codificante y complementario en el tampón de hibridación (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM) hasta una concentración final de 2 \muM cada uno, se calentaron durante 10 minutos a 68ºC y se incubaron a 37ºC durante 3-4 horas. Para evitar la presencia de ARN de cadena sencilla contaminante en las muestras de ARNdc, las preparaciones se trataron con 2 \mug/ml de ARNasa T1 (Calbiochem) y
1 \mug/ml de ARNasa A (Sigma) durante 30 minutos a 37ºC. los ARNdc se trataron entonces con 140 \mug/ml de proteinasa K (Sigma), se extrajeron con fenol/cloroformo y se precipitaron con etanol. Se confirmó la formación de ARNdc mediante su migración sobre un gel de agarosa: para cada ARNdc, se desplazó la movilidad en el gel comparado con los ARNcs. Para la comparación de ARN complementarios y de doble cadena, se infectaron masas iguales de ARN.
Los ARN se diluyeron en agua, hasta una concentración final de 2 a 4 mg ml^{-1}. El intervalo de concentraciones eficaces se ilustra mejor mediante el experimento con c-mos (tabla 2) debido a la sensibilidad de este fenotipo biológico. Se microinyectaron los ARNm en el citoplasma de los ovocitos o embriones, utilizando un sistema de flujo constante (Transjector, Eppendorf) tal como se ha descrito (Zernicka-Goetz en Cell lineage and fate determination (ed. Moody, S. A.) 521-527 (Academic Press, San Diego, CA, 1999)). Se inyectó a cada ovocito o embrión aproximadamente 10 pl de ARNdc. Se consiguió una penetrancia mejorada utilizando una capacitancia negativa. Tras la microinyección, los ovocitos y embriones se cultivaron en medio KSOM (Speciality media, Inc. Lavalette, N.J.) complementado con 4 mg ml^{-1} de BSA, a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Se observaron los embriones transgénicos MmGFP mediante microscopía confocal (cabezal de exploración Biorad 1024 en un microscopio Nikon Eclipse 800).
Análisis de inmunotransferencia e inmunotinción
Para el análisis de inmunotransferencia, las muestras se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa Hybond (Amersham). Las membranas se preincubaron en tampón TBTS (Tris-HCl 20 mM, pH 8,2, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween-20) que contenía un 5% (p/v) de leche desnatada en polvo durante la noche, para bloquear la unión no específica de anticuerpos. Luego se incubaron con el anticuerpo anti-E-cadherina (DECMA-1) o el anticuerpo anti-mos (SantaCruz Biotechnology), durante 1 hora, se lavaron con TBST, y se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (SantaCruz Biotechnology), durante 1 hora y se lavaron de nuevo con TBST. Los anticuerpos se diluyeron con TBST que contenía un 5% (p/v) de leche desnatada en polvo. El anticuerpo secundario se detectó mediante quimioluminiscencia intensificada (Amersham). Para la inmunofluorescencia de la preparación microscópica completa con el anticuerpo contra E-cadherina, se fijaron los embriones en paraformaldehído al 2% durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido por permeabilización con Triton X-100 al 0,1% durante 10 minutos. Tras la preincubación en BSA al 2% en PBS durante 30 minutos, se incubaron los embriones con el anticuerpo anti-E-cadherina durante 1 hora a 37ºC, y con un anticuerpo de cabra anti-rata conjugado con rojo Texas (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa., EE.UU.), durante 1 hora a 37ºC. Se observaron los embriones utilizando el microscopio confocal de exploración láser Biorad 1024.
Ejemplo 1 El ARNdc evita la expresión génica de gfp
Para determinar si podría utilizarse ARNdc para evitar la expresión génica en el embrión de ratón, se desarrolló un sistema de prueba experimental que utiliza una cepa transgénica de ratones que expresa MmGFP bajo el control del promotor del factor de elongación 1 \alpha (E1F\alpha) (Zernicka-Goetz, M. en Cell lineage and fate determination (ed. Moody, S. A.) 521-527 (Academic Press, san Diego, CA, 1999)). Esta línea ofreció la ventaja de que la expresión de GFP puede visualizarse fácilmente en embriones vivos y, dado que su función no es esencial, pudo monitorizarse con efectos perjudiciales no específicos del ARNdc sobre el desarrollo embrionario. Con el fin de evitar la complicación de la perduración de los productos génicos maternos, se utilizaron embriones heterocigóticos en los que el transgén se derivó por vía paternal. El comienzo de la expresión de GFP en estos embriones se observa mediante la aparición de células verdes tras el inicio de la transcripción cigótica en la fase de dos células.
Se pudo demostrar que la inyección de ARNdc de MmGFP en el cigoto de una sola célula evitó el comienzo de la aparición de fluorescencia verde en las fases de 2-4 células (figura 1). Tras la inyección, los embriones se cultivaron in vitro durante 3-4 días hasta la fase de blastocisto. Aunque los embriones no inyectados expresaron MmGFP de la manera esperada (figuras 1a-c), todos los embriones a los que se les inyectó Mn-ARNdc mostraron una disminución drástica de la fluorescencia verde en todo este periodo (figuras 1d-f), mostrando una proporción minoritaria (6,8%) fluorescencia verde. Los embriones mostraron un desarrollo normal antes y después de la implantación, demostrando que la inyección de ARNdc no es tóxica.
La interferencia en la expresión génica es específica porque, cuando se inyectó un ARNdc no relacionado correspondiente a un segmento del transcrito de c-mos en embriones transgénicos MnGFP, esto no dio como resultado una disminución de la fluorescencia verde (figura 1g-i). De manera similar, la inyección de ARNdc correspondiente a un segmento del transcrito de E-cadherina en cigotos transgénicos (59 embriones observados) no dio como resultado una disminución de la fluorescencia verde y no detuvo la síntesis de proteínas a través de la cinasa dependiente de ARNdc, aunque el genotipo de tales embriones fue anómalo (datos no mostrados, véase más adelante). También se encontró que los cigotos transgénicos a los que se les inyectó MnARN complementario mantuvieron la fluorescencia verde en todas las fases previas a la implantación (37 embriones observados - datos no mostrados).
También se intentó determinar si la expresión de MmGFP a partir de ARNm de MmGFP de longitud total con caperuza ("capped") podría eliminarse mediante la coinyección de ARNdc de MmGFP.
Se encontró que la fluorescencia verde disminuía enormemente o se suprimía en tales embriones inyectados (figura 2d). Esto fue a diferencia de los embriones a los que se les inyectó ARN de MmGFP codificante o se les coinyectó tanto ARN de MmGFP codificante como el ARNdc "irrelevante" para E-cadherina (figuras 2a-b). Por tanto, el ARNdc puede interferir tanto en la expresión de un gen localizado en los cromosomas como de ARNm sintético introducido mediante microinyección.
Ejemplo 2 Creación de fenocopias de la inactivación de E-cadherina
Se evaluaron las consecuencias específicas para el desarrollo de inyectar ARNdc de E-cadherina. La E-cadherina se expresa tanto por vía materna como cigótica durante el desarrollo antes de la implantación. La perturbación del gen E-cadherina, utilizando recombinación homóloga para eliminar regiones de la molécula esenciales para la función de adhesión, conduce a un grave defecto antes de la implantación. Estos embriones pueden experimentar inicialmente compactación, debido a la presencia de E-cadherina expresada por vía materna. Sin embargo, muestra un defecto en la cavitación y nunca forman blastocistos normales (Larue, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 8263- 8267 (1994); Riethmacher, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 92, 855-859 (1995)).
Se observó que tras la inyección de ARNdc de E-cadherina, el fenotipo era idéntico al de los embriones mutantes nulos. Por tanto, los embriones se desarrollaron inicialmente de manera normal hasta la fase de compactación de la mórula (datos no mostrados). Sin embargo, solamente el 30% pudieron experimentar cavitación y formaron los denominados "quistes", pero no formaron blastocistos normales (Larue, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 8263-8267 (1994)) (tabla 1). Por el contrario, la gran mayoría de los embriones no inyectados o los embriones control a los que se les inyectó ARNdc de MmGFP experimentaron cavitación y formaron blastocistos normales
(tabla 1).
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TABLA 1 Fenotipos obtenidos tras la inyección de ARNdc de E-cadherina en cigotos
1 
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El análisis de la expresión de E-cadherina mediante inmunotinción e inmunotransferencia muestra que la expresión de E-cadherina disminuye drásticamente tras la inyección de ARNdc de E-cadherina (figura 3b, c). Por el contrario, no se observó una disminución en la expresión de E-cadherina en los embriones a los que se les inyectó ARNdc de MmGFP, para los cuales el nivel de expresión de E-cadherina fue similar al de los embriones no inyectados control (figura 3c). El nivel de E-cadherina en la fase de mórula en los embriones a los que se les inyectó ARNdc de E-cadherina, es inferior que en embriones recién fertilizados antes de la inyección (figura 3c). Esta proteína E-cadherina residual puede reflejar en gran medida la persistencia de la proteína expresada por vía materna cuya síntesis cesa durante la fase de 2 células (Sefton, et al, Development 115, 313-318 (1992)). Esta proteína materna residual está presente hasta la fase de blastocisto tardía en embriones nulos homocigóticos (Larue, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 8263-8267 (1994)).
Se concluye que la inyección de ARNdc de E-cadherina conduce a una reducción sorprendente de la proteína y, en consecuencia, un fenotipo similar al de los embriones mutantes nulos.
Ejemplo 3 Interferencia de ARNdc en el ovocito
Para determinar si podría utilizarse ARNdc para interferir en los genes expresados por vía materna, se buscó un gen modelo que tuviera un fenotipo deficiente característico. C-mos es un componente esencial del factor citostático, responsable de la detención del ovocito en maduración en la metafase, en la segunda división meiótica. En ratones c-mos -/-, entre el 60 y el 75% de los ovocitos no mantiene esta detención en la metafase II e inicia un desarrollo partenogenético (Colledge, et al, Nature 370, 65-68 (1994); Hashimoto, et al, Nature 370, 68-71 (1994)). El ARNm de c-mos está presente en ovocitos inmaduros de crecimiento completo y su traducción se inicia a partir de moldes maternos cuando la meiosis se reanuda tras la ruptura de la vesícula germinal (Verlhac, et al. Development 122, 815-822 (1996)). Por tanto, la inyección de ARNdc de c-mos permitiría que se probase si el ARNdc podría interferir con la expresión de ARNm materno.
Cuando se inyecta ARNdc de c-mos en ovocitos, aproximadamente el 63% no mantiene la detención en la metafase II (tabla 2). De éstos, el 78% inició desarrollo partenogenético y avanzó hasta embriones en la fase de 2 a 4 células (figuras 4a, b, c). El resto experimentó fragmentación. Ambos de estos acontecimientos se producen con frecuencias similares en ovocitos mutantes nulos (Colledge, et al, Nature 370, 65-68 (1994)). Por el contrario, sólo el 1-2% de los ovocitos control, o bien no inyectados o bien a los que se les inyectó ARNdc de MmGFP, experimentó activación espontánea (tabla 2). Todavía se pudo observar que el 42% de los ovocitos inyectados fracasó en experimentar la detención de la metafase II, cuando se redujo la concentración de ARNdc de c-mos 20 veces a 0,1 mg/ml (tabla 2). Ésta es una concentración significativamente superior que la que se creía que era eficaz en C.elegans y plantas, en las que se reivindica que se puede conseguir un efecto con una cuantas moléculas de ARNdc por célula.
TABLA 2 Fenotipos observados tras las inyecciones de ARNdc de c-mos en el ovocito en la fase de vesícula germinal
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Se confirmó que el ARNdc de c-mos interfiere en la expresión de c-mos mediante un análisis de inmunotransferencia llevado a cabo 12 horas después de la inyección de los ovocitos en la fase de vesícula germinal, antes de que se hagan evidentes las consecuencias fenotípicas de su pérdida de la expresión (figura 4e). Por tanto, la inyección de ARNdc de c-mos en el ovocito interfiere específicamente en la actividad de c-mos para imitar la deleción dirigida de c-mos a través de recombinación homóloga. Estos experimentos muestran que el ARNdc puede bloquear la expresión de productos génicos proporcionados por vía maternal.
Ejemplo 4 Los efectos de la ARNi se heredan de manera clonal en el embrión de ratón
Para evaluar si sería posible eliminar la expresión de genes específicos en linajes definidos de células en el embrión temprano de ratón, se microinyectó ARNdc para E-cadherina en una célula de un embrión de ratón en la fase de dos células, junto con ARNm sintético para MmGFP, para marcar la célula inyectada. Los niveles de expresión de E-cadherina y MmGFP se siguieron según se desarrollaron estos embriones. La expresión de E-cadherina se redujo específicamente en las células derivadas del que se le inyectó ARNdc de E-cadherina, marcándose el clon mediante la expresión de MmGFP traducido a partir del ARNm inyectado en la misma célula. Por tanto, en el embrión temprano de ratón, el efecto del ARNdc no se transmite a las células vecinas. Por tanto, puede utilizarse ARNdc en el embrión para regular los patrones de expresión génica de manera diferencial entre linajes que tienen diferentes destinos.
Discusión
Se ha demostrado que el ARNdc puede utilizarse como un inhibidor específico de la actividad génica en el ovocito de ratón y el embrión antes de la implantación o temprano. Se muestra que la especificidad del procedimiento inhibiendo individualmente la expresión de 3 genes diferentes: c-mos en el ovocito y E-cadherina o un transgén de gfp en el embrión temprano. En los casos de los dos genes de ratón endógenos, esto da como resultado fenotipos comparables a los de los mutantes nulos. Los experimentos para evitar la expresión del transgén de gfp indican que la ARNi per se no afecta al transcurso normal del desarrollo.
Dos de los experimentos apoyan la hipótesis de que la ARNi actúa en el ratón induciendo la degradación de ARN seleccionado como objetivo, o inhibiendo su traducción. En primer lugar, se demuestra que la inyección de ARNdc de MmGFP inhibe la expresión de ARNdc de MmGFP codificante coinyectado. En segundo lugar, se inyectó ARNdc contra c-mos en ovocitos antes de que se rompiera la vesícula germinal, la fase en la que se ha acumulado ARNdc de c-mos pero no se ha traducido todavía. C-mos se traduce cuando se rompe la vesícula germinal, para detener los ovocitos en la metafase II de la segunda división meiótica. Se encontró que el ARNdc de c-mos evita su función; los ovocitos avanzaron a través de la metafase II y experimentaron activación partenogénetica. En cada caso, los efectos de la ARNi persistieron durante suficiente tiempo para crear una fenocopia de la pérdida de la función génica. Cuando se introduce ARNdc en blastocistos tempranos, sigue siendo eficaz hasta las fases tempranas después de la implantación. La herencia clonal del efecto de ARNi indica que puede dirigirse hacia un patrón de actividad génica en un linaje específico. Finalmente, como la ARNi funciona en el desarrollo de peri-implantación, puede esperarse que dé como resultado la eliminación de la expresión de los genes diana en células madre embrionarias establecidas a partir de embriones de ratón en esta fase del desarrollo, y esto puede facilitar su diferenciación dirigida en tipos celulares específicos.

Claims (35)

1. ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana en una célula de mamífero o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, o un vector de expresión que codifica para tal ARN, para su uso como un medicamento.
2. ARN, o vector de expresión que codifica para tal ARN, según la reivindicación 1, en el que el gen diana es un gen endógeno.
3. ARN, o vector de expresión que codifica para tal ARN, según la reivindicación 1, en el que el gen diana es un gen viral.
4. ARN, o vector de expresión que codifica para tal ARN, según cualquier reivindicación anterior, en el que el ARNdc no se deriva del gen que codifica para la \beta-glucuronidasa.
5. ARN, o vector de expresión que codifica para tal ARN, según cualquier reivindicación anterior, en el que el ARN comprende una única cadena de ARN autocomplementario.
6. ARN, o vector de expresión que codifica para tal ARN, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ARN comprende dos cadenas de ARN complementario diferentes.
7. ARN, o vector de expresión que codifica para tal ARN, según cualquier reivindicación anterior, en el que la secuencia de nucleótidos es idéntica en al menos un 80% a la totalidad del gen diana.
8. ARN, o vector de expresión que codifica para tal ARN, según cualquier reivindicación anterior, en el que la secuencia de nucleótidos tiene una identidad del 90%, 95% o 100% con al menos una parte del gen diana.
9. Uso de un ARN, o vector de expresión que codifica para tal ARN, según cualquier reivindicación anterior, en la fabricación de un medicamento para inhibir la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, en el que el gen diana produce o es probable que produzca una enfermedad y en el que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que el gen es BCL2.
11. Uso según la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que el embrión antes de la implantación es un blastocisto.
12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que la célula del embrión antes de la implantación es una célula madre embrionaria.
13. Formulación farmacéutica que comprende ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana en una célula de mamífero o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, o un vector de expresión que codifica para tal ARN, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el ARN no se deriva del gen que codifica para \beta-glucuronidasa y en la que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
14. Formulación farmacéutica según la reivindicación 13, modificada por las características de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12.
15. Kit para inhibir la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el kit:
ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana en una célula de mamífero o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, o un vector de expresión que codifica para tal ARN; y
un vehículo que promueve la introducción del ARN o vector en la célula de mamífero,
en el que el ARN no se deriva del gen que codifica para la \beta-glucuronidasa y en el que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
16. Kit según la reivindicación 15, modificado por las características de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12.
17. Célula de mamífero aislada que contiene un constructo de expresión, codificando el constructo para un ARN que forma una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana en una célula de mamífero o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, en el que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no
humano.
18. Mamífero transgénico no humano que contiene una célula según la reivindicación 17.
19. Método in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método:
introducir en la célula un ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno; y
verificar la inhibición de la expresión del gen diana,
en el que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
20. Método según la reivindicación 19, en el que el gen diana es un gen endógeno.
21. Método según la reivindicación 19, en el que el gen diana es un gen viral.
22. Método según la reivindicación 19, 20 ó 21, en el que el ARN se produce fuera de la célula.
23. Método según la reivindicación 22, en el que el ARN se inyecta en la célula.
24. Método según la reivindicación 19, 20 ó 21, en el que el ARN se produce dentro de la célula.
25. Método según la reivindicación 22, 23 o 24, en el que el ARN se produce de manera recombinante.
26. Método según la reivindicación 24 o 25, en el que el ARN se produce mediante un vector de expresión en la célula.
27. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, en el que el ARNdc no se deriva del gen que codifica para la \beta-glucuronidasa.
28. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, en el que el ARN comprende una única cadena de ARN autocomplementario.
29. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, en el que el ARN comprende dos cadenas de ARN complementario diferentes.
30. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 29, en el que la secuencia de nucleótidos es idéntica en al menos un 80% a la totalidad del gen diana.
31. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 30, en el que la secuencia de nucleótidos tiene una identidad del 90%, 95% o 100% con al menos una parte del gen diana.
32. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, en el que el gen diana produce o es probable que produzca una enfermedad.
33. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 32, en el que el embrión antes de la implantación es un blastocisto.
34. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 33, en el que la célula del embrión antes de la implantación es una célula madre embrionaria.
35. Método in vitro para inhibir la expresión de un gen diana en una célula de mamífero, comprendiendo el método:
introducir en la célula un ARN que comprende una estructura de doble cadena que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos un 80% a al menos una parte del gen diana o que puede hibridarse con una parte del transcrito del gen diana en las siguientes condiciones: hibridación en NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, a 50ºC o 70ºC durante 12-16 horas, seguido por lavado, y que se deriva de un molde endógeno, en el que el ARNdc no se deriva del gen que codifica para la \beta-glucuronidasa, en el que la célula de mamífero es una célula somática, un ovocito no humano o una célula de un embrión antes de la implantación no humano.
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