NO327240B1 - Interleukin-18-bindende protein, DNA som koder for dette, vektor og celle inneholdende slikt DNA, fremgangsmate for fremstilling av proteinet, antistoffer som reagerer mot proteinet samt anvendelse av proteinet for fremstilling av medikamenter. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et interleukin-18 bindende protein, heretter kalt IL-18PB av den type som er nevnt i krav l's karakteriserende del og som er i stand til å binde IL-18. Mer spesielt vedrører foreliggende oppfinnelse en oppløselig IL-18PB som finnes i kroppsvæsker, en oppløselig IL-18PB som fremskaffes ved ekspresjon av egnede DNA-vektorer som angitt i krav 11 i vertsceller, vektorer som angitt i krav 19 som uttrykker de ulike IL-18BP, samt vektorer nyttige for ekspresjon av IL-18BP hos mennesker og andre pattedyr, til antistoffer som angitt i krav 27 mot IL-18-BP, en terapeutisk anvendelse av nevnte ekspresjonsvektorer til fremstilling av medikamenter i modulering og/eller blokkering av IL-18 aktivitet og ved anvendelse av antistoffene som angitt i krav 36-49 samt til genterapi som angitt i krav 50.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

I 1989 ble det beskrevet en endotoksintilført serumaktivitet som tilførte interferon-y (IFN-y) funnet i miltcellene hos en mus (27). Denne serumaktivitet fungerte ikke som en direkte tilfører av IFN-y, men derimot som et medstimulerende middel sammen med IL-2 eller mitogener. Et forsøk på å rense aktiviteten ved post-endotoksinserumet fra mus av-slørte et tilsynelatende homogent 50-55 kDa protein (26). Siden andre cytokiner kan opptre som medstimulanter ved fremstilling av IFN-y, ble det mislykte forsøk med å nøy-tralisere antistoffer til IL-1, IL-4, 11-5, IL-6 eller TNF for å nøytralisere serumaktiviteten foreslått til en distinkt faktor. I 1995 demonstrerte samme forskere at den en-dotoksintilførte medstimulant for IFN-y fremstilling var å finne i ekstrakter av lever fra mus forbehandlet med P.-ak-ner (31). I denne modell utvides populasjonen av lever-makrofag (Kupffer-celler) og i disse mus blir en lav dose bakteriell lipopolysakkarid, som i ikke-forbehandlede mus ikke er dødelig. Faktoren, kalt IFN-y -tilførende faktor (IGIF) og senere designert interleukin-18 (IL-18) ble renset til homogenitet fra 1.200 gram av P.aknebehandlet muselever. Degenererte oligonukleotider avledet fra aminosyresekvenser av renset IL-18 ble anvendt til kloning av et murint IL-18 cDNA (31). IL-18 er et 18-19 kDa protein av 157 aminosyrer, som ikke har noen innlysende likheter med noe annet peptid i databasene. Messenger-RNA for IL-18 og interleukin-12 (IL-12) oppdages enkelt i Kupffer-celler og i aktiverte makrofag. Rekombinant IL-18 induserer IFN-gamma kraftigere enn IL-12, antakelig gjennom en separat reaksjonsvei (31).

I likhet med den endotoksininduserte serumaktivitet induserer ikke IL-18 IFN-y av seg selv, men virker primært som en medstimulant med mitogener eller IL-2. IL-18 forbedrer T-celleformering, antakelig gjennom en IL-2-avhengig reaksjonsvei, og forbedrer Thl sytokinproduksjon in vitro og utøver synerisme når kombinert med IL-12 i forbindelse med forbedret fremstilling av IFN-y. Nøytraliserende antistoff til muse IL-18 viste seg å hindre dødelighet av lave doser LPS i P.akne forbehandlede mus. Andre hadde rapportert vik-tigheten av IFN-y som et bindeledd for LPS-dødelighet i forbehandlede mus. For eksempel beskyttet nøytralisering av anti-IFN-y antistoffer mus mot Shwartzman-liknende sjokk (16), og galaktosaminbehandlede mus mangelfulle i IFN-y reseptor ble motstandsdyktige mot LPS-indusert død (7). Videre var det ikke uventet at nøytralisering av antistoff til murint IL-18 beskyttet P.akne-forbehandlede mus mot dø-delig LPS (31). Antimurint IL-18-behandling beskyttet også overlevende mus mot alvorlig hepatisk cytoforgiftning. Etter at murinformen ble klonet, ble den menneskelige cDNA-sekvens for IL-18 rapportert i 1996 (38). Rekombinant men-neskelig IL-18 utøver naturlig IL-18 aktivitet (38). Men-neskelig rekombinant IL-18 er uten direkte IFN-y-induserende aktivitet i menneskelige T-celler, men opptrer som en medstimulant for fremstilling av IFN-y og andre T-hjelpecelle-1 (Thl) cytokiner (38). Til dags dato er IL-18 primært sett på som en medstimulant for Thl cytokinfremstil-ling (IFN-y, IL-2 og granulocytmakrofag kolonistimulerende faktor) (20) samt en medstimulant for FAS ligandmediert cytoforgiftning av murine naturlige drapscellekloninger (37). Ved kloning av IL-18 fra affekterte vev og ved studering av IL-18 genekspresjon, ble det funnet nær assosiasjon av disse cytokiner med en autoimmun sykdom. Den magre diabe-tiske (NOD) mus utvikler spontant autoimmun insulitt og diabetes, som kan akselereres og synkroniseres med en enkelt injeksjon av cyklofosfamid. IL-18 mRNA ble demonstrert ved revers transkriptase-PCR i NOD-musens bukspyttkjertel under en tidlig fase av insulitt. Nivå av IL-18 mRNA økte hurtig etter cyklofosfamidbehandling og fortsatte i en økning av IFN-y mRNA, og følgelig diabetes. Det er interessant at disse kinetikker etterligner den som i IL-12-p40 mRNA, resulterende i en nær korrelasjon med individuelle mRNA-nivåer. Kloning av IL-18 cDNA fra bukspyttkjertel-RNA fulgt av en sekvensering avslørte identitet med IL-18-sekvensen klonet fra Kuppfer-celler og in vivo foraktiverte makrofag. Også makrofag fra NOD-mus reagerte på cyklofosfamid med IL-18 genekspresjon, mens makrofag fra Balb/c-mus parallellt behandlet ikke reagerte. Derfor er IL-18-ekspresjon abnor-malt regulert i autoimmune NOD-mus og nært assosiert med utvikling av diabetes (32). IL-18 spiller en viktig rolle i immunoregulering eller i betennelse ved forsterkning av den funksjonelle aktivitet til Fas-ligand på Thl-celler (10). IL-18 er også uttrykt i binyremargen og kan derfor være en skjult nevroimmunmodulator, som spiller en viktig rolle i føringen av immunsystemet som følger en påkjennende opp-levelse (9) . In vivo er IL-18 dannet ved spalting av pro-IL-18, og dets endogene aktivitet ser ut til å telle som IFN-y-fremstilling i P.akner og LPS-mediert dødelighet. På grunn av dets aktivitet, er blokkering av biologisk aktivitet av IL-18 ved humane sykdommer en terapeutisk strategi ved mange sykdommer. Dette kan oppnås ved anvendelse av oppløselige reseptorer eller blokkering av antistoff til den cellebundne IL-18-reseptor. Cytokinbindende proteiner (oppløselige cytokinreseptorer) korresponderer med de eks-tracellulare domener av ligandbinding i deres respektive celleoverflatecytokinreseptorer. De stammer enten fra al-ternativ spleising av et pre-mRNA, vanlig med celleoverfla-tereseptor, eller fra proteolytisk spalting av celleover-flatereseptoren. Slike oppløselige reseptorer har blitt beskrevet før, inkluderende blant andre oppløselige reseptorer av IL-6 og IFN-y (30), TNF (11, 12), IL-1 og IL-4 (21), IFN-a/p(28, 29) og andre. Et cytokinbindende protein, kalt osteoprotegerin (OPG, også kjent som osteoklasthem-mende faktor-OCIF), et medlem av TNFR/Fas-familien, ser ut til å være det første eksempel på en oppløselig reseptor som eksisterer kun som et skjult protein (1, 34, 39).

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse frembringer IL-18-bindende proteiner som angitt i krav 1 og viralt kodede IL-18BP-homologer (heretter viralt IL-18BP) og sammensmeltede proteiner, muteiner, funksjonelle derivater, aktive fragmenter og sirkulært premuterte derivater derav, i stand til å binde seg til IL-18. De aktuelle proteiner kan fremstilles ved isolering av IL-18BP fra humane fluider, eller fra rekombinante midler. Oppfinnelsen fremskaffer også ekspresjonvektorer av IL-18BP, egnede for ekspresjon av IL-18BP hos mennesket og andre pattedyr. Spesifikke IL-18BP, viralt kodede IL-18BP-homologer, fusjonsproteiner, muteiner, funksjonelle derivater, aktive fragmenter og sirkulære derivater derav er nyttige for modulering og/eller blokkering av de biologiske aktiviteter av IL-18. Reproduserbare ekspresjonsvektorer inneholdende DNA egnede til ekspresjon av de ulike IL-18BP i vertsceller, vertsceller omdannet hermed og proteiner og polypeptider fremstilt ved ekspresjon av slike vertsceller er også fremskaffet. Oppfinnelsen tilveieskaffer videre farmasøytiske sammensetninger som angitt i krav 34 og 35 bestående av egnede midler og IL-18BP, eller virale IL-18BP, eller vektorer for uttrykking av samme hos mennesker og andre pattedyr for behandling av sykdommer eller til-stander som krever modulering eller blokkering av IL-18-aktivitet. Oppfinnelsen skaffer videre til veie antistoffer mot IL-18BP og de virale IL-18BP, egnede for affinitets-rensing og immunoprøving av samme.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser SDS-PAGE (natriumdodecylsulfatpolyakrylamid-gelelektroforese) av ligandaffinitetsrensede IL-18-bindende proteiner. Råurinproteiner (konsentrert ved ultrafiltrering av 500 1 normal human urin) ble lagret i en IL-18-agarosekolonne. Kolonnen ble vasket og bundne proteiner ble vasket ut ved 2,2 pH. Utvaskede fraksjoner ble nøytralisert og aliquoter ble analysert med SDS-PAGE (10% akrylamid) under ikke-reduserende forhold og sølvfarging. Feltene er: 1: råurinproteiner (1,5^g, lastet på gelen); 2-9: elu-sjoner 1-8, respektive, fra IL-18-agarosekolonnen; 10: molekylære vektmarkører, i kD, som indikert på høyre side. En pil indikerer båndet som korresponderer med IL-18BP. Figur 2 viser et audiogram av SDS-PAGE (7,5% akrylamid) av komplekser bestående av<125>I-IL-18 (angivelig molekylvekt 19kD), kryssbundet til følgende fremstillinger av oppløs-elig IL-18-bindende protein: felt 1: vask av IL-18-affi-nitetsspaltingen. Felt 2: Elusjon 2 av IL-18-affinitets-spaltingen. Felt 3: Elusjon 3 av IL-18-affinitetsspal-tingen. molekylære vektmarkører er indikert på høyre side (i kD). En pil indikerer det kryssbundne produkt (58kD). Figur 3 viser hindring av IL-18-indusert fremstilling av IFN-y ved IL-18BP. (A)-musmegali ble stimulert (24 t, 37°C) med de indikerte kombinasjoner av LPS (l^g/ml) og humant IL-18 (5 ng/ml) tilført enten direkte eller etter forblanding (1 t, 37°C) med urin-IL-18BP. Nivået av mus-IFN-y i kulturen ble anslått etter 24 t. (B)-musmegali ble inkubert (24 t) med LPS (l^g/ml) sammen med murint IL.18 (10ng/ml) forblandet (1 t, 37°C) med økende konsentrasjoner av humant IL-18BP. (C) mus-megali ble inkubert (24 t) med LPS (lO^g/ml) sammen med økende konsentrasjoner av humant IL-18BP. (D) musmegali ble inkubert (24 t) med TNF-a (20 ng/ml) og huIL-18 (25 ng/ml), tilført enten alene, eller etter forblanding (1 t, 37°C) med urin-IL-18BP. Figur 4 viser sekvensen av humant IL-18Bpa-cDNA og protein. Signalpeptid er understreket. Figur 5 viser sekvensen av humant IL-18Bpb-cDNA og protein. Signalpeptid er understreket. Figur 6 viser sekvensen av humant IL-18Bpc-cDNA og protein. Signalpeptid er understreket. Figur 7 viser sekvensen av humant IL-18Bpd-cDNA og protein. Signalpeptid er understreket. Figur 8 viser sekvensen av humant IL-18BP-gen. Sekvensen av en human genomisk kloning (7,1 kb) ble anslått og sammenliknet med den av ulike cDNA-kloninger isolert fra 3 cDNA-biblioteker. Den vanlige translasjon-startkodon er nukleotider 683-685. NuMal-genet er lokalisert ved den negative kjede, fra nukleotid 3578 til slutten. Figur 9 viser effekten av rekombinant IL-18BP på IL-18-aktivitet hos mennesker og mus. His6-merket IL-18BPa ble transient uttrykt i C0S7-celler og renset. (A) humant IL-18 (5 ng/ml) ble forblandet med enten His6_merket IL-18BPa eller RPMI og tilført til miltceller hos mus sammen med LPS ( 1 ng/ml). IFN-y -fremstillingen ble målt etter 24 t. (B) IL-18 fra mus ble forblandet med enten His6~merket IL-18BPa eller RPMI og tilført til miltceller hos mus sammen med LPS ( 1^g/ml). IFN-y-fremstillingen ble målt etter 24 t. (C) humant IL-18 (25 ng/ml) ble forblandet med enten C0S7-IL-18BPa eller RPMI og tilført til humant PBMC ved nærvær av IL-12 (10 ng/ml). (D) humant IL-18 (25 ng/ml) ble forblandet med enten COS7-IL-18BPa eller RPMI og tilført til humane KG-l-celler ved nærvær av TNF-a (20 ng/ml).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører ulike IL-18BP og virale IL-18BP som binder seg til IL-18. Slike IL-18BP kan være i stand til å modulere og/eller blokkere de biologiske akti-viteter hos IL-18. Begrepet "IL-18BP og virale IL-18BP" inkluderer det mature protein (uten signalsekvensen), proteinet omfattende signalsekvenser, muteiner av IL-18BP og virale IL-18BP, derivater av IL-18BP og virale IL-18BP og avkortede former av IL-18BP og virale IL-18BP og salter derav. Oppfinnelsen vedrører også reproduserbare ekspre-sjonsmidler, egnede for ekspresjon av ulike IL-18BP eller virale IL-18BP i vertceller og vertbakterier. Oppfinnelsen vedrører også ekspresjonsvektorer, egnede for ekspresjon av ulike IL-18BP eller virale IL-18BP hos mennesker og andre pattedyr. Oppfinnelsen vedrører også DNA som koder for ulike IL-18BP, virale IL-18BP, muteiner, fusjonsproteiner, funksjonelle derivater, aktive fraksjoner og blandinger derav. Nevnte DNA kan være et genomisk DNA, et cDNA, et syntetisk DNA, et PCR-produkt eller kombinasjoner derav. Disse DNAer kan settes inn i reproduserbare ekspresjons-midler for ekspresjon av ulike IL-18BP eller virale IL-18BP i vertceller. DNAer som er i stand til å overføres til ovennevnte DNAer under stringente betingelser og kodende proteiner eller polypeptider som også er i stand til å binde IL-18 kan også anvendes. Et slikt DNA koder et IL-18BP inkludert aminosyresekvensen av Sekvens-ID nr.10 og forsynt med en stoppkodon ved sin 3' ende. Ekspresjonsvek-torene, egnede for ekspresjon av ulike IL-18BP eller virale IL-18BP i mennesker og andre pattedyr, dvs. for genterapi, kan være virale vektorer eller andre typer vektorer hvor et IL-18BP-gen eller et IL-18BP-cDNA eller et DNA kodende et viralt IL-18BP ble innsatt på en måte som muliggjør effektiv ekspresjon av et IL-18BP eller virale IL-18BP i mennesker og andre pattedyr. DNA-molekyler som overføres til ovennevnte DNAer under stringente betingelser og kodende proteiner og polypeptider som er i stand til å binde IL-18 er også anvendbare. Isolasjon av IL-18BP kan utføres i samsvar med oppfinnelsen, f.eks. ved passering av et humant fluid, så som urin eller serum, gjennom en kromatografisk kolonne hvor IL-18 bindes, og deretter vasker ut det bundne IL-18BP. De ulike IL-18BP og virale 18BP kan også fremstil les ved rekombinante midler, dvs. ved å uttrykke IL-18BP i en egnet vert, etter operativt å knytte forsterkere, eks-presjonsforbedrere, regulatorsekvenser osv., egnede for den spesielt benyttede vert som f.eks. tillater ekspresjon i den korrekte orientering. De ulike IL-18BP og de virale IL-18BP og vektorer for uttrykking av IL-18BP hos mennesker og andre pattedyr kan anvendes ved behandling og lindring av lidelser assosiert med eksogent administrert eller endogent produsert IL-18. Slike forhold er f.eks. autoimmune sykdommer, type I diabetes, revmatoid artritt, implantasjonsut-støting, inflammatorisk tarmsykdom, sårbetennelse, multippel sklerose, iskemiske hjertesykdommer (inkludert hjerteinfarkt) , iskemisk hjerneskade, kronisk hepatitt, psoriasis, kronisk betennelse i bukspyttkjertel, akutt betennelse i bukspyttkjertel og liknende. I følge foreliggende oppfinnelse ble IL-18BP isolert fra normal human urin ved et kromatografisk trinn. En fremstilling av rå humane urinproteiner konsentrert fra 500 1 normal human urin ble lagret i en kolonne omfattende human IL-18 bundet til agarose. Kolonnen ble vasket og bundet protein ble eluert ved lav pH. Eluerte fraksjoner ble nøytralisert og aliquoter ble analysert ved SDS-PAGE (10% akrylamid) under ikke-reduserende forhold og sølvfarging. Et proteinbånd på~40kD ble spesifikt utvunnet fra de eluerte fraksjoner (figur 1). Proteinet på~40kD utvunnet i første trinn ble identifisert som et IL-18 bindende protein ved dets egenskap til å spesifikt kryssbinde med<125>I-IL-18 (figur 2). Proteinet på~40kD ble viderekarakterisert vedN-terminal proteinsekvensanalyse. Aliquoter fra det eluerte protein ble utsatt for SDS-PAGE, elektroover-ført til en PVDF membran og utsatt for proteinmikrosekvensanalyse. I begge tilfeller ble to polypeptidsekvenser funnet. En større sekvens og en mindre sekvens, den sistnevnte korresponderende med et fragment av human defensin (aksesjonsnummer pll398), begynnende på aminosyre 65. Subtrak-sjon av den kjente defensinsekvens fremskaffet følgende sekvens:

Hvor x representerer en ennå ubestemt aminosyre. For å ut-vinne en lenger og mer presis sekvens og for å identi-fi-sere potensielle cystinresiduer, ble en aliquot av den eluerte fraksjon redusert med DTT under denaturerende forhold, reagert med 4-vinylpyridin, avsaltet ved en anordning for mikro-ultrafiltrering ("Ultrafree, cutoff 10.000 Da, Millipore") og utsatt for protein mikrosekvensanalyse. Etter sekvensering av syklus 1 ble restproteinet reagert med o-ftalaldehyd for å blokkere alle N.terminalpolypeptider bortsett fra Pro og sekvenseringen var så gjenopptatt. På denne måten ble følgende enkle proteinsekvens utvunnet:

Den resulterende sekvens er signifikant annerledes fra en-hvert annet protein, som fastslått ved søk i protein databaser. Imidlertid, ved å søke i databasen til The Institute of Genomic Research (TIGR) ved "tblastn" søkerprogram ble det fremskaffet en cDNA-fil, betegnet THC 123801, hvis åpne leseramme (218 kodoner) når oversatt, og som inneholder en sekvens som er svært homolog til den fra N-terminal-sekvensen til IL-18BP. Homologien er som vist:

(den øvre sekvens (1-40) tilhører IL-18BP isolert i følge oppfinnelsen; den nedre sekvens (51-100) er utledet ved translasjon av cDNA fra TIGR-filen THC123801). Denne cDNA-

sekvens identifisert ved THC123801 er imidlertid kun en "EST" (expressed sequence tag), dvs. en tilfeldig utvalgt cDNA-kloning. Det har ikke blitt analysert hvorvidt denne EST inneholder en åpen leseramme, hvorvidt et protein er uttrykt fra genet korresponderende til EST eller fra EST i seg selv. Det har heller ikke blitt identifisert noen funksjon lik et protein kodet med THC123801. Ingen informasjon var tilgjengelig som tyder på at THC123801 inneholder en åpen leserammekoding for et IL-18BP. Det affinitetsrensede urin-IL-18BP gjenvant egenskapen til å binde dets merkede ligand (125I-IL-18) , og følgende kovalente kryssbinding, et kompleks med molekylær vekt på 58 kD ble dannet. Moleky-lærvekten til disse komplekser korresponderte til et 1:1 forhold av~40kD IL-18BP og 19kD IL-18 (figur 2). Det affinitetsrensede urin-IL-18BP blokkerte den biologiske aktivitet ved humant så vel som mus-IL-18. For når IL-18BP ble tilført til IL-18 hos enten menneske eller mus, blokkerte

det evnen til IL-18 å indusere produksjonen av interferon-y når det ble ført sammen med lipopolysakkarid (LPS) til kulturer i miltceller hos mus (figur 3). For hensikten ved foreliggende beskrivelse refererer uttrykket "biologisk aktivitet hos IL-18" inter alia til minst en av følgende biologiske egenskaper: (i) induksjon av IFN-y, primæt som en medstimulant med mitogener, IL-1, IL-12, TNF-a, LPS i ulike celletyper, så som mononukleære celler, murine splenocytter, humane periferale blodmononukleære celler, den humane KG-l-celletråd og T-celler,

(ii) forbedring av T-celle-formeringen,

(iii) forbedring av Th-1 cytokinproduksjon in vitro, primært som en medstimulant, (iv) synergisme med IL-12 med henblikk på forbedret IFN-y -produksjon, medstimulerende handling for produksjon av IFN-y og andre T-hjelpecelle-1 cytokiner, (v) medstimulerende handling for FAS ligand-mediert cytoforgiftning av murine naturlige dapcelle-kloninger, (vi) induksjon av aktiviseringen av NF-kB i humane KG-1-celler, angivelig ved å indusere formasjonen av 50 NF-KB-homodimer og p65/p50 NF-kB heterodimer,

(vii) induksjon av IL-8 .

Som anvendt her brukes uttrykket " å binde seg til IL-18" om evnen IL-18BP har til å binde IL-18, f.eks. som bevist ved dets binding til merkede IL-18 når affinitetsrenset som i eksempel 2. Som anvendt her brukes uttrykket "å modulere aktiviteten hos IL-18" om evnen IL-18BP har til å modulere enhver IL-18-aktivitet utenom blokkering, f.eks. delvis hindring, forbedring og liknende. Som anvendt her refererer uttrykket " å blokkere aktiviteten hos IL-18" til aktiviteten hos IL-18BP som blokkerer minst en av de ovennevnte biologiske aktiviteter hos IL-18. Den IL-18-blokkerende aktivitet eksemplifiseres ved evnen IL-18BP har til å blokkere IL-18-assosiert IFN-y-ekspresjon i murine splenocytter. Som vist mer detaljert nedenfor forårsakes moduleringen eller blokkeringsaktiviteten hos IL-18 delvis av det faktum av IL-18BP hindrer aktiveringen av NF-kB ved IL-18. Videre blokkerer IL-18BP minst en av de følgende akti-viteter hos IL-18, nemlig induksjon av IFN-y i celler hos menneske og mus, induksjon av IL-8 og aktivering av NF-kB. En DNA-prøve for å undersøke cDNA biblioteker ble fremstilt ved revers-transkripsjon PCR med spesifikke sense- og antisense primere og RNA fra de humane Jurkat T-celler med primere fra TIGR-sekvensen. Det resulterende PCR-produkt ble bekreftet av DNA sekvensanalyse. Dette PRC-produkt ble merket med 32 [P] og anvendt som en prøve for undersøkelse av fire humane cDNA biblioteker avledet fra perifere blodmonocytter, fra Jurkat T-cellelinjen, fra PBMC og fra human milt. De ulike uavhengige cDNA-kloninger korresponderte med fire IL-18BP spleisevarianter (Sekvens-ID nr. 1, 3, 5 og 7). Alle spleisevarianter kodet for forsøksvist oppløselige skjulte proteiner. Den mest fremtredende (IL-18BPa) hadde en åpen leseramme på 192 kodoner, koding for et signalpeptid som her av og til omtales som en "ledersekvens" på 28 aminosyrerester fulgt av et modent forsøksvist IL-18BPa, hvis 40 første residuer passet perfekt med N-terminal proteinsek-vensen fra urin-18PB (sekvens-ID nr.2). Posisjonering av cystinrester foreslo at dette polypeptid hører til immunoglobulin-(lg)-superfamilien. Hvert av de fire Gln-residuer innen modent IL-18BPa var et potensielt N-glykosyla-sjonssted. De tre andre varianter av IL-18BP var mindre fremtredende enn IL-18BPa. De inkluderte en kortere 1 kb IL-18BPb-cDNA, koding for et signalpeptid av 28 aminosyreresiduer fulgt av et modent protein av 85 aminosyreresiduer (sekvens-ID nr.4). En tredje variant, IL-18BPCble representert av et 2,3 kb cDNA, koding for et signalpeptid av 28 aminosyreresiduer fulgt av et modent IL-18BP av 169 aminosyrerester (sekvens-ID nr.6). Den fjerde variant, IL-18BPd, kodet for et signalpeptid av 28 aminosyreresiduer fulgt av et modent IL-18BP av 133 aminosyreresiduer (sekvens-ID nr.

8). For videre å studere den mulige eksistens av ytterligere IL-18BP spleisevarianter, ble et humant genomisk bibliotek silt med en prøve korresponderende til full lengde IL-18BP-cDNA. Fem genomiske kloner, ulike av lengde ble identifisert i dette bibliotek. Klonene ble utsatt for DNA-sekvensanalyse med eksterne og interne primere. Tilsammen ble en 7,8 kb sekvens sammenføyet fra disse klonene (sekvens-ID nr.9). Ingen eksonkoding for en transmembranresep-tor (TM) ble identifisert innen sekvensen på 7,8 kb. Alle varianter delte et felles startsted for translasjon, kodet for samme signalpeptid på 28 aminosyreresiduer og oppløse-lige modne proteiner av varierende størrelser og C-termi-nalsekvenser. IL-18BP-lokusen inneholder et ytterligere gen, som koder for det nukleære celledelende apparat protein 1 (NUMA1), plassert på minussiden. Dette funnet loka-

liserer IL-18BP-genet ved det humane kromosom llql3 (36). En homologisøk ble foretatt av den komplette proteinsekvens hos IL-18BPa og GenPect-database ved anvendelse av Smith Watermann-algoritme. Det ble funnet at homologer av IL-18BP er uttrykt i flere Poxvirus som skjulte protein med en tidligere ukjent funksjon. Det er tidligere rapportert at virus koder for ulike cytokinreseptorer og at slike viralt kodede molekyler fungerer som lokkereseptorer som hindrer immunresponser ved å nøytralisere deres korresponderende cytokin (omtalt av "Spriggs, MK, 1994, Curr. Opin. Immu-nol., 6j_ 526-529") . Derfor vedrører foreliggende oppfinnelse også viralt kodede homologer av IL-18BP som også kan fungere som blokkerere eller modulerere av den biologiske aktivitet hos IL-18. Eksempler på viruskodede homologer av IL-18BP er vist i tabell 1. I følge foreliggende oppfinnelse kan den viruskodede homolog av IL-18BP uttrykkes i en prokaryot eller eukaryot vert. Som anvendt her referer uttrykket "viruskodet homolog IL-18BP" til en likhet på minst 50% i en sekvens bestående av minst 70 aminosyreresiduer. Fortrinnsvis har den minst 50%, minst 60%, minst 70% , minst 80%, eller alle helst minst 90% likhet med en sekvens av 100 aminosyreresiduer. IL-18BPa ble uttrykt i C0S7-apeceller. Av denne hensikt ble cDNA hos IL18BPa satt inn i ekspresjonvektoren pEF-BOS hos pattedyr. En kassettkoding for en (His)6-sekvens ble lagt til 3'-enden av IL-18BP OFRs i ramme, for å kunne foreta opprensing av det rekombinante protein, ble C0S7-celler transient transfektert med ekspresjonsvektoren og det se-rumfrie medium fra cellene (150 ml) ble konsentrert og renset med metallchelatkromatografi. IL-18BPa ble kjørt som et enkeltbånd på SDS-PAGE med sølvfarging under reduserende og ikke-reduserende forhold og hadde den samme observerte molekylvekt som den av urin-IL-18BP. Proteinsekvensanalyse av denne fremstilling avslørte den samme N-terminalsekvens som den av urin-IL-18BP. Immunofargingsanalyse av IL-18BPa med antistoffer fremskaffet mot urin-IL-18BP avslørte det samme molekylvektbånd som det av urinprotein. Videre, ved anvendelse av immunopresipitasjon fulgt av SDS-PAGE og autoradiografi, var IL-18BPa i stand til å hindre urin-125I-IL-18BP i å binde seg til antistoffet. Derfor korresponderer IL-18BPa strukturelt med IL-18BP isolert fra urinen. Rå og rensede IL-18BPa ble testet for deres evne til å hindre biologisk aktivitet hos IL-18. IL-18BPa hindret aktivitet i IL-18 hos menneske og mus i murine splenocytter, PBMC og den humane KG-1 cellelinje (figur 9). Disse resultater bekrefter identiteten til IL.18BPa-cDNA som den som koder for biologisk aktivt IL-18BP. Begrepet "muteiner" som brukes her refererer til analoger ved et IL-18BP, eller analoger ved et viralt IL-18BP, hvori en eller flere av aminosyre-residuene fra et naturlig IL-18BP eller viralt IL-18BP er byttet ut med andre aminosyreresiduer, eller er slettet, eller en eller flere aminosyreresiduer er lagt til den naturlige sekvens for et IL-18BP, eller et viralt IL-18BP, uten større endring av hos det resulterte produkt i forhold til villtype IL-18BP eller viralt IL-18BP for binding til IL-18. Disse muteiner er fremstilt av kjent syntese og/eller ved seterettede mutageneseteknikker, eller annen egnet kjent teknikk. Ethvert slikt mutein har fortrinnsvis en sekvens med aminosyrer tilstrekkelig likt dem hos et IL-18BP, eller tilstrekkelig likt dem hos et viralt IL-18BP, et slikt som har vesentlig lik aktivitet som IL-18BP. En aktivitet hos IL-18BP er dets evne til å binde IL-18. Så lenge muteinet har vesentlig lik bindingsaktivitet med IL-18 kan det anvendes i rensingen av IL-18, ved bruk av midler som affinitetskromatografi, og kan betraktes å ha vesentlig lik aktivitet med IL-18BP. Det kan fastslås om et hvert gitt mutein har i hovedsak den samme aktivitet som IL-18BP ved anvendelse av rutineeksperiment omfattende å utsette et slikt mutein, f.eks. for en enkelt "sandwich"-konkurranseassay for å fastslå hvorvidt det binder seg eller ikke binder seg til en passende merket IL-18, så som radioimmunoassay eller ELISA-assay. I en foretrukket utfø-relsesform har ethvert slikt mutein minst 40% identitet eller homologi med sekvensen fra enten et IL-18BP eller en viralkodet IL-18BP-homolog. Mer foretrukket har den minst 50%, minst 60%, minst 70%, minst 80%, eller fortrinnsvis minst 90% identitet eller homologi dertil. Muteiner av IL-18BP-polypeptider eller muteiner av virale IL-18BP, som kan anvendes i følge foreliggende oppfinnelse, eller nuklein-syrer som koder for dette, inkluderer et begrenset sett av substansielt korresponderende sekvenser som substitusjons-peptider eller polynukleotider som rutinemessig kan ledes av en fagmann innen området, uten unødig eksperimentering, basert på kunnskap og retningslinjer som presentert ved foreliggende oppfinnelse. For en detaljert beskrivelse av proteinkjemi og -struktur ses "Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York 1978" og "Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman&Co., San Fransisco, 1983". For en presentasjon av nukleotid sekvenssubstitusjon, så som kodonpreferanser, se "Ausubel et al, supra, at §§ A.1.1-A.1.24" og "Sambrook et al, supra, at Appendices C and D". Foretrukne endringer for muteiner i følge foreliggende oppfinnelse er hva som er kjent som "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner hos IL-18BP-polypeptider eller proteiner eller virale IL-18BP, kan inkludere synonyme aminosyrer innen en gruppe som har tilstrekkelige like fysiokjemiske egenskaper til at sub-

stitusjoner mellom medlemmer av gruppen vil preservere mo-lekylets biologiske funksjon, "Grantham Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974)". Det er klart at innføringer og slet-tinger av aminosyrer også kan bli gjort i de allerede defi-nerte sekvenser uten å endre deres funksjoner, spesielt dersom innføringene eller slettingene kun involverer noen få aminosyrer, f.eks. under tretti, og fortrinnsvis under ti, og ikke fjerner eller endrer aminosyrer som er kritiske for en funksjonell konformasjon, f.eks. cystinresiduer, (Anfinsen "Principles That Govern The Folding of Protein Chains", Science, Vol. 181, pp.223-230 (1973)). Cystinresiduer som imidlertid ikke er ønsket for deres biologiske aktivitet kan byttes ut med andre residuer, f.eks. for å unngå formasjonen av uønskete intramolekylære eller inter-molekulære disulfidbroer som kan forårsake en reduksjon i aktiviteten hos IL-18BP. De foretrukne synonyme aminosyregrupper er definert i tabell 1. Mer foretrukne aminosyregrupper er definert i tabell 2; og de mest foretrukne aminosyregrupper er definert i tabell 3.

Eksempler på fremstilling av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan anvendes for oppnåelse av muteiner fra IL-18BP-polypeptid eller proteiner, eller muteiner fra virale IL-18BP, for anvendelse i foreliggende oppfinnelse inkluderer enhver kjent fremgangsmåte som presentert i US patenter nr. 33,653, 4,959,314, 4,588,585 og 4,737,462, i "Mark et al"; 5,116,943, i "Koths et al"; 4,965,195 i "Nåmen et al"; 4,879,111, i "Chong et al"; 5,017,691, i "Lee et al"; og lysinsubstituerte proteiner presentert i US patent nr. 4,904,584 ("Shaw et al"). I en annen foretrukket utførel-sesform ved foreliggende oppfinnelse har ethvert mutein av et IL-18BP eller et viralt IL-18BP en aminosyresekvens es-sensielt korresponderende til den hos IL-18BP, eller til et viralt IL-18BP. Begrepet "i hovedsak tilsvarende" er ment for å forstå proteiner med mindre endringer for sekvensen av det naturlige protein som ikke påvirker de grunnleggende karakteristikker ved de naturlige proteiner, spesielt deres evne til å binde IL-18. Typen endringer som generelt anses å falle inn under "i hovedsak tilsvarende"-begrepet er de som vil resultere fra konvensjonelle mutageneseteknikker av DNAet som koder disse proteiner, resulterende i noen få mindre modifiseringer, og utvelgelse for ønsket aktivitet ved måten omtalt ovenfor. I tillegg til å binde IL-18, kan også muteinene modulere og/eller blokkere IL-18-aktivitet.

Muteiner i følge foreliggende oppfinnelse inkluderer proteiner kodet av en nukleinsyre, så som DNA eller RNA, som koder et IL-18BP eller koder et viralt IL-18BP, i samsvar med foreliggende oppfinnelse, under stringente betingelser. Oppfinnelsen inkluderer også slik nukleinsyre, som er nyttig ved prøving av identifikasjon og rensing av ønsket nukleinsyre. Videre vil slik nukleinsyre være en førstekandi-dat for å fastslå om den koder et polypeptid, som gjenvin-ner den funksjonelle aktivitet hos et IL-18BP. Begrepet "stringente betingelser" refererer til binding og påføl-gende vaskebetingelser, som fagmenn konvensjonelt refererer til som "stringente". Se "Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supre, Interscience, N.Y., §§6,3 and 6,4 (1987, 1992)" og "Sambrook et al., supra". Uten be-grensning inkluderer eksempler på stringente vaskebetingelser 12-20°C under utregnet Tm av hybridet under studie i f.eks 2 x SSC og 0,5% SDS i 5 minutter, 2 x SSC og 0,1% SDS i 15 minutter; 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 37°C i 30 til 60 minutter, og deretter en 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 68 °C i 30 til 60 minutter. En fagmann forstår av stringentbeting-elsene også avhenger av lengden på DNA-sekvensene, oligo-nukleotide prøver (så som 10-40 baser) eller blandede oli-gonukleotide prøver. Dersom blandede prøver anvendes, er det foretrukket å anvende tetrametylammoniumklorid (TMAC) istedet for SSC. Se "Ausubel, supra". Oppfinnelsen inkluderer videre nukleinsyre som koder for IL-18BP I følge foreliggende oppfinnelse, men som er forskjellig i kodonsekvens på grunn av degenerasjon av den genetiske kode. Slikt DNA som mulig ikke binder under stringente betingelser ved DNA-sekvensen vist ved figur 4 til 7, men like fullt er i stand til å kode et IL-18BP i følge foreliggende oppfinnelse, er også inkludert i oppfinnelsen.

Begrepet "salter" anvendes her både om salter av kaboksyl-grupper og syretilførselsalter hos aminosyregrupper ved et IL-18BP, et viralt IL-18BP eller muteiner. Salter fra en karboksylgruppe kan dannes ved kjent teknikk og inkluderer uorganiske salter f.eks. natrium, kalsium, ammonium, jern-holdige salter eller sinkholdige salter og liknende, og salter med organiske baser som dannet her, f.eks. med aminer, så som trietanolamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain og liknende. Syreaddisjonssalter inkluderer f.eks. salter med mineral-syrer så som f.eks. eddiksyre eller ok-salsyre. Naturligvis må alle slike salter ha i hovedsak lik aktivitet med IL-18BP.

"Funksjonelle derivater" som anvendt her, dekker derivater av IL-18BP eller et viralt IL-18BP, og deres muteiner, som kan fremstilles f.eks. fra de funksjonelle gruppene som oppstår som sidegrener fra restene eller N- eller C-termi-nalgruppene, ved kjente midler, og er inkludert i oppfinnelsen så lenge de forblir farmasøytisk akseptable, dvs. at de ikke ødelegger aktiviteten til proteinet som er i hovedsak likt aktiviteten i IL-18- BP, eller i virale IL-18BP, og ikke tildeler giftige egenskaper i bestanddeler inneholdende dem. Disse derivater kan f.eks. inkludere polyetyl-englykolsidegrener, som kan skjule antigene steder og for-lenge oppholdstiden for et IL-18BP eller et viralt IL-18BP i kroppsvæsker. Andre derivater inkluderer alifatiske este-re fra karboksylgruppene, amider fra karboksylgruppene ved reaksjon med ammonium eller med primære eller sekundære aminer, N-akrylderivater fra frie aminogrupper av amino-

syreresiduer dannet med alkylbestanddeler (f.eks. alkanoyl eller karbosykliske aroylgrupper) eller O-alkylderivater fra frie hydroksylgrupper (f.eks. den fra seryl- eller treonylrester) dannet med alkylbestanddeler. Begrepet "sirkulært permuterte derivater" som anvendt her refererer til et linært molekyl hvori terminalene har blitt ført sammen, enten direkte eller gjennom en linker, for fremstilling av et sirkulært molekyl, og så blir det sirkulære molekyl åpnet ved en annen lokalisering for fremstilling av et nytt sirkulært molekyl med terminaler ulike fra terminalene i det originale molekylet. Sirkulære permutasjoner inkluderer de molekyler hvis struktur er lik et molekyl som har blitt sirkelformet og deretter åpnet. Et sirkulært permutert molekyl kan syntetiseres de novo som et lineært molekyl og aldri gå gjennom en sirkulerings- og åpningsfase. Fremstillingen av sirkulært permuterte derivater er beskrevet i W095/27732. Ulike rekombinante celler, så som prokaryote celler, f.eks E. coli, eller andre eukaryote celler, så som gjær- eller insektceller kan produsere IL-18BP eller virale IL-18BP. Fremgangsmåter for konstruksjon av egnede vektorer som bærer DNA som koder for et IL-18BP og egnet for transformering (f.eks. E. coli, pattedyrceller og gjærceller) eller infisering av insektceller for å kunne fremstille et rekombinant IL-18BP eller et vi ralt IL-18BP er kjent teknikk. Se f.eks. "Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology Current Protocols, 1993" og "Sambrook et al.,eds. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nded., Cold Spring Harbor Press, 1989". For hensikten med ekspresjon av IL-18BP-proteiner, eller virale IL-18BP blir DNA kodende et IL-18BP eller et viralt IL-18BP, deres fragmenter, muteiner eller sammensmeltede proteiner, og de opera-belt knyttede transkripsjonale og translasjonale regule-ringssignaler satt inn i vektorer som er i stand til å in-tegrere de ønskede gensekvenser inn i vertcellekromosomet. For å kunne velge ut cellene som har stabilt integrert det introduserte DNA inn i kromosomene, anvendes ekspresjonsvektoren. Markøren kan fremskaffe prototropi til en aukso-tropisk vert, biosid motstandsdyktighet, f.eks. antibiotika eller resistans mot tungmetaller så som kobber eller liknende. Det valgbare markørgenet kan enten være direkte knyttet til DNA-gensekvenser som skal uttrykkes, eller inn-ført i samme celle ved kotransfeksjon. Ytterligere elementer kan også være nødvendige ved optimal syntese av enkelt-kjedet bindingsprotein mRNA. Disse elementer kan inkludere spleisesignaler, så vel som transkripsjonfremmere, for-bedrere og termineringssignaler. Nevnte DNA-molekyl som skal innføres i de valgte celler, vil fortrinnsvis være in-korporert i et plasmid eller en viral vektor som er i stand til autonom replikasjon i den resipiente vert. Foretrukne prokaryote plasmider er derivater av pBr322. Foretrukne eukaryote vektorer inkluderer BPV, vaccinia, SV40, 2-mikron-sirkel, osv., eller deres derivater. Slike plasmider og vektorer er kjent fra teknikken (2-5, 22). Så snart vektoren eller DNA-sekvensen inneholdende konstruksjonen(e) har blitt fremstilt for ekspresjon, kan ekspresjonvektoren introduseres til en egnet vertscelle ved enhver variasjon av egnede midler, så som transformasjon, transfeksjon, lipo-feksjon, konjugasjon, protoplast fusjon, elektroporasjon, kalsiumfosfatpresipitasjon, direkte mikroinjeksjon, osv. Vertsceller som anvendes i denne oppfinnelse kan enten være prokaryote eller eukaryote. Foretrukne prokaryote verter

inkluderer bakterier så som E.coli, Bacillus, Streptomycer, Pseudomonar, salmonella, serratia, osv. Den mest foretrukne prokaryote vert er E.coli. Bakterielle verter av særlig in-teresse inkluderer E.coli K12 stamme 294 (ATCC 31446),

E.coli X1776 (ATCC 31537), E.coli W3110 (F-, lamda-, foto-tropisk (ATCC 27325)). Under slike betingelser vil proteinet ikke bli glykosylert. Den prokaryote vert må være kom-patibel med replikonene og kontrollsekvensene i ekspre-sjonsplasmidet. Men, siden naturlige IL-18BP er glykosy-lerte proteiner, er eukaryote verter mer foretrukne enn prokaryote verter. Foretrukne eukaryote verter er celler fra pattedyr f.eks menneske, ape, mus og eggstokkceller fra kinesisk hamster, fordi de fremskaffer posttranslasjonale modifiseringer hos proteinmolekyler inkluderende korrekt folding, korrekt disulfidbånddannelse, så vel som glyko- sylering på rette steder. Også gjærceller og insektceller kan utføre post-translasjonale peptidmodifiseringer inkluderende høymannoseglykosylering Et antall rekombinante DNA-strategier eksisterer som benytter sterke promoterings-sekvenser og høye kopinummer ved plasmider, som kan anvendes for fremstilling av de ønskede proteiner i gjær- og i insektceller. Gjær- og insektceller gjenkjenner ledersekvensen hos klonede pattedyrgenprodukter og skjulte ferdigutviklede IL-18BP. Etter innføring av vektoren, dyrkes vertcellen i et utvelgende medium, som fremmer vekst av vektorholdige celler. Ekspresjon av de klonede gensekvenser resulterer i fremstillingen av et IL-18BP, et viralt IL-18BP eller muteiner og fragmenter derav. Den ovennevnte kloning, klonisolering, identifikasjon, karakterisering og sekvensprosedyrer er heretter beskrevet mer utførlig i ek-semplene .

De uttrykte proteiner blir så isolert og renset ved konvensjonell prosedyre, involverende ekstraksjon, presipitasjon, kromatografi, elektroforese, eller liknende, eller ved affinitetskromatografi, ved anvendelse av anti-IL18BP-monoklonale antistoffer immobilisert i en gelmatrise holdt i en kolonne. Råprodukter inneholdende nevnte rekombinante IL-18BP sendes gjennom kolonnen hvor IL-18BP vil bli bundet til kolonnen med det spesifikke antistoff, mens urenhetene vil passere gjennom. Etter vasking blir proteinet eluert fra gelen under betingelser som vanligvis anvendes for denne hensikt, dvs. ved en høy eller lav pH, f.eks. pH 11 eller pH 2. Oppfinnelsen vedrører videre en vektor nyttig for ekspresjon av et IL-18BP eller et viralt IL-18BP eller deres derivater i pattedyr, og mer spesifikt hos mennesker. Vektorer for korttid- og langtidsekspresjon av gener i pattedyr er kjent fra litteraturen. Studier har vist av geno-verlevering til f.eks. skjelettmuskler, vaskulære myke muskler og lever resulterer i systemiske nivåer av terapeu-tiske proteiner. Skjelettmuskler er et nyttig mål grunnet deres store masse, vaskularitet og tilgjengelighet. Imidlertid har andre mål, og spesielt benmargprekursorer av im- munceller blitt vellykket anvendt. Nåværende tilgjengelige vektorer for ekspresjon av proteiner i f.eks. muskler inkluderer plasmid-DNA, liposomer, protein-DNA-konjugater og vektorer basert på adenovirus, adenoassosierte virus og herpesvirus. Av disse har vektorer basert på adenoassosierte virus (AW) vært mest vellykkede, med henblikk på varighet og nivå av genekspresjon og med henblikk på sik-kerhetsoverveielser ("Kessler, P.D. 1996, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93, 14082-14087"). Prosedyrer for konstruksjon av en AVV-basert vektor har blitt beskrevet i detalj. Kort-varig plasmid psub201 inneholdende villtype AVV-gemon er kuttet med restriksjonsenzym Xba I og ligert med et konst-rukt bestående av en effektiv eukaryot promoter, f.eks cy-tomegaloviruspromoteren, en Kozak konsensussekvens, en DNA-sekvens kodende for et IL-18BP eller et viralt IL-18BP eller fragmenter derav, en egnet 3' utranslatert region og et polyadenylasjonsignal, f.eks. polyadenylasjonsignalet i si-mianvirus 40. Det resulterte rekombinante plasmid blir kotransfektert med et hjelpe-AAV-plasmid, f.eks. pAAV/Ad til pattedyrceller, f.eks.humane T293-celler. Kulturene blir så infisert med adenovirus som et hjelpevirus og kultursupernatanter blir samlet etter 48 til 60 timer. Supernatantene blir fraksjonert ved ammoniumsulfatpresipitasjon, renset i en CsCl densitetsgradient, dialysert og varmet til 56°C for å ødelegge ethvert adenovirus, mens det rekombinante AVV, som er i stand til å uttrykke IL-18BP eller et viralt IL-18BP forblir stabile i denne fasen. Så langt har den fysiologiske rollen til de oppløselige cytokinreseptorer ikke blitt etablert. De oppløselige reseptorer binder deres spesifikke ligander og hindrer i de fleste tilfeller deres biologiske aktivitet, som ble vist f.eks i TNF-syste-met (11,12) . I svært få tilfeller, f.eks. IL-6, forbedrer de oppløselige reseptorer den biologiske aktivitet. Den rekombinante oppløselige TNF-reseptor, også kjent som TBP (TNF-bindende protein) viste seg å forhindre septiske sjokk i dyremodeller, mens oppløselige former av IL-l-reseptorer viste seg å ha sterkt hindrende virkning på utviklingen av in vivo alloreaktivitet i allograftresipienter hos mus. I likhet kan IL-18BP og de virale IL-18BP ved foreliggende oppfinnelse anvendes som modulerere av IL-18-aktivitet, f.eks. i anvendelse f.eks. i enhver sykdom hvor endogen produksjon eller eksogen administrasjon av IL-18 induserer sykdommen eller forverrer pasientens situasjon. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre farmasøytiske sammensetninger inneholdende en farmasøytisk akseptert bærer og f.eks. en viral vektor slik som enhver av de nevnte AAV-baserte virale vektorer eller andre vektorer som uttrykker et IL-18BP eller viralt IL-18BP og som er egnet for administrasjon til mennesker og andre pattedyr med hensikt å oppnå ekspresjon in vivo av IL-18BP, dvs. for anvendelse i genterapi. De farmasøytiske sammensetningene ved oppfinnelsen er fremstilt for administrasjon ved å blande et IL-18 eller et viralt IL-18 eller deres derivater eller vektorer for uttrykking av samme med fysiologisk aksepterte bærere og/eller stabilisatorer og/eller eksipienter, og fremstilt i doseringsform, f.eks. ved lyofilisering i doseringsvia-ler. Fremgangsmåten for administrasjon kan være via enhver av de aksepterte måter for administrering for lignende midler og vil avhenge av forholdet som skal behandles, f.eks. intravenøst, intramuskulært, subkutant, ved lokal injeksjon eller topisk påførsel, eller kontinuerlig ved infusjon, osv. Mengden av aktiv sammensetning som administreres, vil avhenge av administrasjonsruten, sykdommen som skal behandles og pasientens tilstand. Lokal injeksjon, vil f.eks. kreve en lavere dose protein med basis i kroppsvekt enn en intravenøs infusjon.

Følgelig vil IL-18BP, eller virale IL-18BP eller vektorer uttrykkende samme in vivo være indikert for behandling av autoimmune sykdommer, type I diabetes, sepsis, tranplantat-avstøtning, revmatoid artritt, inflammatorisk tarmsykdom, multippel sklerose, iskemiske hjertesykdommer inkludert akutte hjerteinfarkt, iskemisk hjerneskade, kronisk hepatitt, psoriasis, kronisk betennelse i bukspyttkjertel og akutt betennelse i bukspyttkjertel og liknende sykdommer hvor det er en aberrant ekpresjon av IL-18BP, førende til et overskudd av IL-18 eller i tilfeller av komplikasjoner grunnet eksogent administrert IL-18.

Oppfinnelsen inkluderer også antistoffer mot et IL-18BP eller et viralt IL-18BP, så vel som mot deres salter. Begrepet "antistoff" er anvendt for å inkludere polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer (Mabs), kimeriske antistoffer, antiidiotype, og humane (anti-Id) antistoffer til antistoffer som kan merkes i oppløselig eller bundet form, og humaniserte antistoffer så vel som fragmenter derav fremskaffet ved enhver kjent teknikk, så som, men ikke begrenset til, enzymatisk spalting, peptidsyntese eller rekombinante teknikker. Polyklonale antistoffer er heterogene populasjoner av antistoffmolekyler derivert fra sera fra dyr som er immunisert med et antigen. Et monoklonalt antistoff inneholder en i hovedsak homogen populasjon av antistoffer spesifikke mot antigener, hvis populasjon inneholder vesentlig like epitope bindingssteder. MAbs kan oppnås ved metoder som er kjent for fagmenn. Se f.eks. "Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975); US Patent No. 4,376,110; Ausubel et al, eds.,supre, Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Laboratory (1988); and Colligan et al.,eds., Current , Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)". Slike antistoffer kan være av enhver immunoglobulinklasse inkludert IgG, IgM, IgE, IgA, GILD og enhver underklasse derav. Et hybridom produserende et Mab i foreliggende oppfinnelse kan dyrkes in vitro, in situ eller in vivo. Produksjon av høytitervæske av Mabs in situ eller in vivo gjør denne til den foretrukne fremgangsmåte for fremstilling.

Kimeriske antistoffer er molekyler hvor ulike deler er avledet fra ulike dyrearter, så som de som har den variable region avledet fra et murint Mab og en human immunoglobu-linkonstant region. Kimeriske antistoffer er primært anvendt for å redusere immunogenisiteten ved tilføring og for å øke utbytte i produksjon, f.eks. der murint Mab har høy- ere utbytte, som der humane/murine kimeriske Mab er anvendt. Kimeriske antistoffer og fremgangsmåter for deres fremstilling er kjent i teknikken.

Et antiidiotypisk (anti-Id) antistoff er et antistoff som gjenkjenner unike determinanter generelt, assosiert med an-tigenbindingsstedet hos et antistoff. Et Id-antistoff kan bli fremstilt ved immunisering av et dyr av samme art og genetisk type (f.eks. museherkomst) som kilden til Mab med Mab hvortil et anti-Id er fremsilt. Det immuniserte dyr vil gjenkjenne og reagere på de idiotype determinanter hos det immuniserende antistoffet, ved fremstilling av et antistoff mot disse idiotype determinanter (anti-Id-anti-stoffet). Se f.eks. US patent nr. 4,699,880.

Anti-Id-antistoffet kan også anvendes som et "immunogen" for indusering av en immun respons i et annet dyr, ved å fremstille et såkalt anti-anti-Id-antistoff. Anti-anti-Id kan være epitopt identisk med det originale Mab, som induserer anti-Id. Ved å bruke antistoffer mot dd idiotype determinanter hos et Mab, er det mulig å identifisere andre kloner som uttrykker antistoffer av identisk art.

Følgelig kan Mab generert mot IL-18BP og relaterte proteiner ved foreliggende oppfinnelse anvendes for å indusere anti-Id antistoffer i egnede dyr, så som BALB/c-mus. Miltceller fra slike immuniserte mus ble anvendt for fremstilling av anti-Id-hybridomer som skjuler anti-Id-Mab. Videre kan anti-Id-Mab kobles til en bærer slik som "keyhole lim-pet"-hemocyanin (KLH) og anvendes for å immunisere ytterligere BALB/c-mus. Sera fra disse mus vil inneholde anti-anti-Id-antistof f er som har bindingsegenskapene lik det originale Mab spesifikt for et IL-18BP-epitop eller epitoper hos et viralt IL-18BP.

Anti-Id-MAb har deres egne idiotype epitoper, eller "idio-toper", strukturelt liknende epitopet som blir evaluert, så som et IL-18BP eller et viralt IL-18BP.

Begrepet "humanisert antistoff" er anvendt for å inkludere f.eks. antistoffer som ble oppnådd ved manipulasjon av mus-antistoffer gjennom genetiske utførelsesmetoder for å bli mer kompatible med den humane kropp. Slike humaniserte antistoffer har redusert immunogenisitet og forbedret farma-kokinetikk hos mennesker. De kan fremstilles ved kjent teknikk, så som beskrevet, f.eks. for humanisert anti-TNF antistoffer i "Molecular Immunology, Vol. 30, No. 16, pp. 1443-153, 1993".

Begrepet "antistoff" er også ment å inkludere både intakte

molekyler så vel som fragmenter derav, så som f.eks. Fab og F(ab')2, som er i stand til å binde antigen. Fab og F(ab')-2-fragmenter mangler Fc-fragmentet hos et intakt antistoff, fjernes raskere fra sirkuleringen, og kan ha færre uspesi-fiserte vevsbindinger enn et intakt antistoff ("Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Det vil forstås at Fab og F(ab')2, og andre fragmenter av antistoffene som er nyttige ved foreliggende oppfinnelse, kan anvendes for deteksjon og mengdebestemmelse av et IL-18BP eller et viralt IL-18BP, ifølge fremgangsmåtene beskrevet her, for intakte antistoffmolekyler. Slike fragmenter er typisk fremstilt ved proteolytisk spalting, ved anvendelse av enzymer som papain (for å fremstille Fab-fragmenter) eller pepsin (for å fremstille F(ab')2-fragmenter).

Et antistoff anses å være "i stand til å binde" et molekyl

dersom det er i stand til spesifikt å reagere med molekylet for å binde molekylet til antistoffet. Begrepet "epitop" er ment for å referere til den del av ethvert molekyl som er i stand til å bli bundet til et antistoff som også kan gjen-kjennes av det antistoffet. Epitoper, eller "antigene determinanter" består vanligvis av kjemisk aktive overflate-grupperinger av molekyler så som aminosyrer eller sukker-sidegrener og har spesifikt tredimensjonale strukturelle karakteristikker så vel som spesifikke ladekarakteristik-ker.

Et "antigen" er et molekyl eller en del av et molekyl som er i stand til å indusere et dyr til å fremstille antistoffer som er i stand til å binde seg til et epitop ved det antigenet. Et antigen kan ha et eller flere epitoper. Den spesifikke reaksjon referert til ovenfor er ment å in-dikere at antigenet vil reagere, på en høyst selektiv måte, med dets korresponderende antistoff, og ikke med mangfoldet av andre antistoffer som kan bli fremkalt av andre antigener.

Antistoffene, inkludert fragmenter av antistoffer, som er nyttige ved foreliggende oppfinnelse kan anvendes for kvan-titativ eller kvalitativ detektering av et IL-18BP eller et viralt IL-18BP, eller relaterte proteiner i en prøve eller å detektere nærværet av celler som uttrykker slike proteiner ved foreliggende oppfinnelse. Dette kan oppnås ved im-munofluorescenceteknikker, iverksettende et fluorescent merket antistoff (se nedenfor) kombinert med lysmikrosko-pisk, flytcytometrisk eller fluorometrisk deteksjon.

Antistoffene (eller fragmenter derav) som er nyttige ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes histologisk, som i immunofluorescence- eller immunoelektronmikroskopi, for in situ-deteksjon av et IL-18BP eller et viralt IL-18BP og relaterte proteiner ved foreliggende oppfinnelse. In situ-deteksjon kan oppnås ved å fjerne en histologisk prøve fra en pasient, og forsyne det a-merkede antistoff ved foreliggende oppfinnelse til en slik prøve. Antistoffet, (eller fragment) blir fortrinnsvis tilført ved å påføre eller å overlegge det merkede antistoff (eller fragment) til en biologisk prøve. Gjennom anvendelse av en slik prosedyre, er det mulig å fastslå ikke bare tilstedeværelsen av IL-18BP eller et viralt IL-18BP eller relaterte proteiner, men også dets distribusjon hos det undersøkte vev. Ved anvendelse av foreliggende oppfinnelse, vil en fagmann lett kunne forstå at enhver av det store utvalg av fremgangsmåter (så som flekkprosedyrer) kan modifiseres for å oppnå en slik in situ-deteksjon.

Slike prøver for et IL-18BP eller et viralt IL-18BP, eller relaterte proteiner ved foreliggende oppfinnelse omfatter vanligvis inkubasjon av en biologisk prøve, så som et biologisk fluid, en vevekstraksjon, nylig fjernede celler, så som lymfosytter eller leukocytter, eller celler som er blitt inkubert med vevskultur, ved tilstedeværelsen av et detekterbart merket antistoff som er i stand til å identifisere IL-18BP eller relaterte proteiner, og detektere antistoffet ved enhver av de mange kjente teknikker innen området .

Den biologiske prøve kan behandles med en fast fasestøtte eller bærer så som nitrocellulose eller annen fast støtte eller bærer som er i stand til å immobilisere celler, cel-lepartikler eller oppløselige proteiner. Støtten eller bæ-reren kan deretter vaskes med egnede buffere etterfulgt av behandling med det detekterbart merket antistoff i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Den faste fasestøtte eller bærer kan deretter vaskes med bufferen for andre gang for å fjerne ubundet antistoff. Mengden av bundet antistoff i nevnte faste støtte eller bærer kan detekteres ved konvensjonelle midler. Med " fast fasestøtte", "fast fasebærer", "fast støtte", "fast bærer", "støtte" eller "bærer" menes enhver støtte eller bærer som er i stand til å binde antigen eller antistoffer. Velkjente støtter eller bærere inkluderer glass, polystyren, polypropylen, polyetylen, dekstran, nylonamylaser, naturlige og modifiserte cellu-loser, polyakrylamider, gabbroer og magnetitt. Bærerens na-tur kan være enten oppløselig til en viss grad eller uopp-løselig for hensikten ved foreliggende oppfinnelse. Støtte-materialet kan nesten ha enhver mulig strukturell konfi-gurasjon så lenge det koblede molekylet er i stand til å binde seg til et antigen eller antistoff. Støtte- eller bæ-rekonfigurasjonen kan være sfærisk, som i en dråpe, eller sylindrisk, som i den indre overflate i et testrør, eller den ytre overflate ved en stang, alternativt kan overflaten være flat som et ark, teststrimmel, osv. Foretrukne støtter eller bærere inkluderer polystyrendråper. Fagmenn vil kjen- ne til mange andre egnede bærere for binding av antistoff eller antigen, eller vil være i stand til å utvikle tilsvarende ved rutineeksperimentering.

Bindingsaktiviteten ved en gitt mengde antistoff i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan fastslås i følge utprøvde fremgangsmåter. Fagmenn vil være i stand til å fastslå ope-rative og optimale assayforhold for hver fastslåelse ved å iverksette rutineeksperimentering.

Andre slike handlinger som vasking, røring, risting, fil-trering og liknende kan legges til assayene basert på hen-siktsmessighet eller nødvendighet for den spesielle situasjon .

En av måtene hvor antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan detekterbart merkes på er ved å binde det til et enzym og anvende i en enzymimmunassay (EIA). Dette enzymet vil reagere når senere eksponert mot et egnet substrat, for med substratet på den måte å fremstille em kjemisk bestanddel som kan detekteres, f.eks ved spektrofotometiske, flu-orometriske eller ved visuelle midler. Enzymer som kan anvendes i detektering av merket antistoff inkluderer, men er ikke begrenset til malat dehydrogenase, stafylokokkal, del-ta-5-steroid isomerase, gjæralkohol, dehydrogenase, alfag-lyserofosfatdehydrogenase, triosefosfatisomerase, pepper-rotperoksidase, alkalisk fosfatase, asparginase, glykose-oksidase, beta-galaktosidase, ribonuklease, urease, kata-lase, glykose-6-fosfatdehydrogenase, glukoamylase og ace-tylkolinesterase. Detekteringen kan oppnås ved kolorime-triske fremgangsmåter, som iverksetter et kromogent substrat for enzymet. Detektering kan også oppnås ved visuell sammenlikning av graden av enzymatisk reaksjon med et substrat i sammenlikning med liknende fremstilte standarer.

Deteksjon kan oppnås ved anvendelse av enhver blant utvalg-et av andre immunoprøver. For eksempel er det mulig, ved radioaktiv merking av antistoffer eller fragmenter av anti stoff, å detektere et IL-18BP eller et viralt IL-18BP ved anvendelse av radioimmunassay (RIA). En god beskrivelse av RIA finnes i "Laboratory Techniques and Bio-chemistry in Molecular Biology, av Work, T.S. et al., Nort Holland Publishing Company, NY (1978)" med spesiell referanse til ka-pitlet kalt "An Introduction to Radioimmuno Assay and Re-lated Techniques by Chard, T", som nevnt i foreliggende re-feranseliste. Det radioaktive isotop kan oppdages ved teknikker som anvendelse av gammateller eller en scintilla-sjonteller eller ved autoradiografi.

Det er også mulig å merke et antistoff i samsvar med foreliggende oppfinnelse, med en fluorescent bestanddel. Når det fluorescentmerkede antistoff blir eksponert mot lys av en egnet bølgelengde, kan dets tilstedeværelse detekteres grunnet fluorescensen. Blant de vanligste anvendte fluori-scentmerkende bestanddeler finner man fluorescein, isotio-cyanat, rodamin, fykoerytrin, fykocyanin, allofykocyanin, o-ftaldehyd og fluorescamin.

Antistoffet kan også detekterbart merkes ved anvendelse av flourescensemitterende metaller så som<152>Eu, eller andre innen de lantanide serier. Disse metaller kan kobles til antistoffet med anvendelse av metallchelaterende grupper som dietylentriaminpentaeddiksyre (ETPA).

Antistoffet kan også detekterbart merkes ved å binde det til biotin. Biotinylert antistoff kan så detekteres ved avidin eller streptavidin bundet til en fluorescent bestanddel eller til et enzym så som peroksidase eller til en radioaktiv isotop eller liknende.

Antistoffet kan også bli detekterbart merket ved å binde det til en kjemiluminescent bestanndel. Tilstedeværelsen av det kjemiluminescentmerkede antistoffet blir så fastslått ved deteksjon av tilstedeværelsen av luminescens som oppstår under en kjemisk reaksjon. Eksempler på spesielt nyttige kjemiluminescente merkingsbestanddeler er luminol, isoluminol, teromatisk akridiniumester, imidasol, akridi-niumsalt og oksalatester.

På liknende vis kan man anvende en bioluminescent bestanddel for merking av antistoffet ved foreliggende oppfinnelse. Bioluminescens er en type kjemiluminescens funnet i biologiske systemer hvor et katalytisk protein øker effek-tiviteten ved den kjemiluminescente reaksjon. Tilstedeværelsen av et bioluminescent protein anslås ved deteksjon av tilstedeværelsen av luminescens. Viktige bioluminescente bestanddeler med hensikten merking er luciferin, luciferase og akvuorin. Et antistoffmolekyl ved foreliggende oppfinnelse kan tilpasses for anvendelse i en immunometrisk assay, også kjent som et "two-site"- eller "sandwich"-assay.

I et typisk immunometrisk assay, blir en kvantitet umerket antistoff (eller fragment av antistoff) bundet til en fast støtte eller bærer og et kvantitet detekterbart merket opp-løselig antistoff blir lagt til for å tillate deteksjon og/eller mengdebestemmeIse av ternærkompleks dannet mellom fastfase antistoff, antigen og merket antistoff.

Typiske, og foretrukne immunometriske assayer inkluderer "fremmings"-assayer hvor antistoffet bundet til den faste fase først blir satt i kontakt med prøven som testes for å ektrahere antigenet fra prøven ved dannelse av et binært fastfaseantistoffkompleks. Etter en egnet inkubasjonstid, vaskes den faste støtte eller bærer for fjerning av residua fra den flytende prøve, inkludert ureagert antigen, dersom noe, og settes deretter i kontakt med oppløsningen inneholdende en ukjent mengde med merket antistoff (som fungerer som et "reporter"-molekyl). Etter en andre inkubasjonstid for å tillate det merkede antistoff å kompleksere med antigenet bundet til den faste støtte eller bærer gjennom det umerkede antistoff, vaskes den faste støtte eller bærer en andre gang for fjerning av det ureagerte merkede antistoff.

En annen type "sandwich"-assay, som også kan være nyttig med antigenene ved foreliggende oppfinnelse, er de såkalte "simultane" og "reverse" assayer. Et "simultan"-assay involverer et enkelt inkubasjonstrinn da antistoffet bundet til den faste støtte eller bærer og merkede antistoff begge blir satt til prøven som testes samtidig. Etter at inkuba-sjonen er fullført, blir den faste støtte eller bærer vasket for fjerning av residua fra fluidprøve og ukomplekse merkede antistoff. Tilstedeværelsen av det merkede antistoff med den faste støtte eller bærer blir fastslått som den ville ha blitt ved en konvensjonell "fremmersandwich"-assay.

I det "reverse" assay vil det tas i bruk gradvis tilføring først med en oppløsning av merket antistoff til fluidprøven etterfulgt av tilførsel av umerket antistoff bundet til en fast støtte eller bærer etter en egnet inkubasjonstid. Etter en andre inkubasjon blir den faste fase vasket på konvensjonelt vis for å frigjøre den fra residua fra prøven som testes og oppløsningen fra det ureagerte merkede antistoff. Fastslåelsen av merket antistoff assosiert med en fast støtte eller bærer er foretatt som i "simultane" og "fremmende" prøver.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også DNA-molekyler som koder ethvert av proteinene ved foreliggende oppfinnelse som definert ovenfor, reproduserbare ekspresjonsvektorer omfattende ethvert av slike DNA-molekyler, vertceller transformert med enhver slik ekspresjonsvektor inkludert prokaryote, eukaryote og vertsceller, fortrinnsvist CHO-celler. Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av ekspresjonsvektorer kodende for ethvert protein ved foreliggende oppfinnelse med henblikk på deres ekspresjon hos mennesker og andre pattedyr. Foreliggende oppfinnelse inkluderer også en fremgangsmåte for fremstilling av ethvert av de proteiner ved foreliggende oppfinnelse ved å dyrke en transformert celle ifølge foreliggende oppfinnelse samt gjenvinne proteinet kodet av DNA-molekylet og ekspresjonsvektoren i slike transformerte vertceller.

I tillegg til anvendelsen av IL-18BP eller et viralt IL-18BP for modulering av IL-18-aktiviteten kan de, naturligvis, iverksettes for rensing av selve IL-18 i seg selv. For dette bruk kobles IL-18 eller viralt IL-18 til en affini-tetskolonne og rått IL-18 passeres gjennom. IL-18 kan så gjenvinnes fra kolonnen ved f.eks. elusjon ved lav pH.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli illustrert ved følgende eksempler:

EKSEMPEL 1: Isolering av et IL- 18 bindingsprotein

E.coli IL-18 (2,5 mg, Peprotech, NJ) ble koblet med Affigel-10 (0,5 ml, BioRad), i følge forhandlerens instruksjon og lagt i en kolonne. Råurinproteiner (1000 ganger konsentrert, 500 ml) ble tilført kolonnen med en flythastighet på 0,25 ml/min. Kolonnen ble vasket med 250 ml 05,M NaCl i fosfatbufret salin (PBS). Bundne proteiner ble deretter eluert med 25mm sitronsyre, pH 2,2 og benzamidin (1 mm), øyeblikkelig nøytralisert med IM Na2C03) . Fraksjoner av 1 ml ble samlet opp. Fraksjonene ble analysert ved SDS-PAGE og sølvfarging. IL-18-bindingsproteinene eluerte i fraksjon 2-8 som et -40.000 Dalton-protein (figur 1). Båndet på -40 kD, tilsvarende med IL-18BP oppviste en distinkt gul farge ved søvfarging. De ulike fraksjoner ble analysert ved kyss-binding med<125>I-IL-18, SDS-PAGE og autoradiografi som beskrevet i eksempel 2. Et-IL-18 bindingsprotein ble funnet i fraksjon 2-8, eluert fra IL-18-agarosekolonnen (figur 2).

EKSEMPEL 2: KRYSS- BINDING AV AFFINITETSRENSET IL- 18BP MED

MERKET IL- 18.

Prøver (40^1) av IL-18BP fra affinitetsrensingstrinnet ble inkubert (70 min. ved 4°C) med<125>I-IL-18 (5.000.000 cpm). Disuccinimidylsuberat (DSS), oppløst i dimetylsulfoksid (Me2SO, 20mM), ble lagt til en endelig konsentrasjon på 2mM og blandingen ble stående i 20 min ved 4°C. Reaksjonen ble stoppet ved tilføringen av IM Tris-HCl pH 7,5, og IM NaCl til en endelig kosentrasjon på lOOmM. En prøvebuffer inneholdende Ditiotreitol (DTT, 25 rtiM endelig) ble lagt til og blandingene ble analysert med SDS-PAGE (7,5 % akrylamid) etterfulgt av autoradiografi (figur 2). Et spesifikt bånd med molekylvekt på 58kD, antakelig bestående av et~40 kD protein kryssbundet med~20kD12<5>I-IL-18, ble observert i fraksjoner eluert fra IL-18-affinitetskolonnen (bane 2 og 3) men ikke i kolonnevaskingen (bane 1), inneholdende alle andre råurinproteiner.

EKSEMPEL 3: PROTEINSEKVENS- ANALYSE

Eluerte fraksjoner fra affinitetskolonnen i eksempel 1 ble gjenoppløst med SDS-PAGE (10% akrylamid) under ikke-reduserende betingelser, elektroblottet i en PVDF-membran ("Pro-Blot, Applied Biosystems, USA"). Membranen ble farget med coomassieblå,~40 kD-båndet ble fjernet og utsatt for proteinsekvensanalyse med en Procise mikrosekvenserer ("Applied Biosystems, USA"). Følgende store sekvens ble oppnådd:

Hvor x representerer en ennå ubestemt aminosyre. I tillegg ble oppnådd følgende lille sekvens:

På grunn av denne doble sekvens var det ikke mulig å oppnå lengre sekvensdata. Den lille sekvensen ble identifisert som et fragment av human defensin (aksesjonsnummer pll398) begynnende ved aminosyre 65 ved defensin. Den store sekvens kunne ikke assosieres med noe annet kjent protein, som fastslått ved å søke i alle tilgjengelige databaser i NCBI og TIGR ved anvendelse av blastp- og tblastn-søkeprogram- mer. For å oppnå en lenger og mer presis sekvens og for å kunne identifisere potensielle cystinresidua, ble en annen aliquot fra fraksjonen eluert fra IL-18-agarosekolonnen redusert med DTT i 6 M guanidin HC1, reagert med 4-vinylpyridin, avsaltet ved en anordning for mikrofiltrering ("Ultrafree, cutoff 10.000 Daltons, Millipore") og utsatt for proteinmikrosekvensanalyse. Etter syklus nummer 1 i sekvenseringen ble filteret reagert med o-ftaladehyd for blokkering av alle N-terminalpolypeptider unntatt Pro. På denne måten ble kun den store sekvens oppnådd som følger:

I syklus 6, 7, 8 og 11 ble det oppnådd et lavt nivå av Thr-signal. På grunn av dette lave nivå så vi det klokt i ikke å angi et spesifikt aminosyreresiduum til nevnte syklus.

Den resulterende sekvens er signifikant annerledes enn ved noe annet kjent protein, som fastslått ved søk i protein-databasene. Men ved søking i TIGR-databasen ved anvendelse av søkeprogrammet tblastn ble det fremskaffet en cDNA-file, denotert THC123801, hvis åpne leserammer (218 kodoner), når translatert inneholder en sekvens svæt homolog med N-ter-minalsekvensen til IL-18BP. Homologien er herved vist:

(Den øvre sekvens (1-40) er den fra IL-18BP isolert i følge oppfinnelsen; den nedre sekvens (51-100) er dedusert ved

translasjon av cDNA fra TIGR-filen THC123801). Den forsøks-vise proteinsekvens, oppnådd ved translasjon av fil THC123801, var ubestemmelig ved residua 2 og 4 ved IL-18BP. Dette bekrefter identiteten til aminosyrerestene 6, 7 og 8 ved IL-18PB ettersom Thr også ser ut til å gjelde for residua 11.

EKSEMPEL 4: IL- 18BP ER ET GLYKOPROTEIN

Aliquot (0,3 ml) fra eluert fraksjon i eksempel 1 ble videre renset ved størrelsesekslusjonskromatografi i en Supe-rose 12-kolonne (1X30 cm, Pharmacia, Sverige). Kolonnen (ble preekvilibrert med fosfatbuffert salin og natriumazid (0,02%) ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min. og fraksjoner ble samlet over et minutt. IL-18BP eluerte i fraksjon 20-25 som en~40.000 Dalton-protein, som fastslått ved SDS-PAGE og sølvfarging. En prøve inneholdende~40.000 Dalton-proteinet (fraksjon 23, 50^1,~50 ng protein) ble reagert med N-glykosidase F ("PNGase F, Biolab") ifølge forhandlers instruksjoner. Aliquotene ble kort denaturert ved å kokes ved tilstedeværelse av 5% SDS i 10 min., 10Xg7 buffer (2,5 ni), 10% NP-40 (2,5 ni) og PNGase F(l^1), 1 time ved 37°C. Prøven ble analysert med SDS-PAGE (10% akrylamid) under ikke-reduserende forhold og sammenliknet med ufor-døyet IL-18BP fra samme Suprose 12-fraksjon. Det ble funnet at~40 kD-båndet av IL-18BP forsvant i den PNGase-behandlede fraksjon. Nye bånd, korresponderende med 30 kD (akku-rat over PNGase-båndet) og 2 0 kD ble oppnådd. Elimineringen av~40 kD-båndet indikerer at dette båndet er et N-glykosylert protein.

EKSEMPEL 5: BLOKKERING AV DEN BIOLOGISKE AKTIVITET AV IL- 18

HOS IL- 18BP.

Evnen til IL-18BP isolert fra urin til å blokkere IL-18-aktivitet ble anslått ved å måle den IL-18-induserte produksjon av IFN-y i mononukleære celler. IL-18 induserer IFN-y når ført sammen med enten lav konsentrasjon av LPS, IL- 12, IL-2 eller andre stimulanter. Il-18-aktiviteten ble testet i murine splenocytter, i humane periferale blodmononukleære celler (PBMC)og i den humane KG-l-cellelinjen. Miltceller ble fremstilt fra en frisk mus, vasket og suspendert i RPMI 164 0 middels supplementert med 10% fetalt bovinserum ved 5X10<6>celler/ml. 1,0 ml kulturer ble stimulert med LPS (enten 0,5 eller 1^g/ml) sammen med rekombinant humant eller murint IL-18 (enten 0,5 eller 5 ng/ml). Humant IL-18BP (0,5 eller 50 ng/ml) ble tilført til den rekombinante IL-18 før tilføring til miltceller. Etter dyr-king i 24 timer ble miltcellene utsatt for tre fryse- (-70°C) og tinings- (romtemperatur) sykluser, celleavfallet ble fjernet ved sentrifugering og supernatantene ble prøvet for IFN-y ved anvendelse av ELISA-utstyret for mus- IFN-y (endogen). Som vist i figur 3A, blokkerte IL-18BP aktiviteten til huIL-18 i murine splenocytter i en doseavhengig måte. I motsetning, som en kontroll, hadde oppløselige interferon-a/p-reseptor ingen effekt. Aktiviteten til det rekombinante murine IL-18 ble tilsvarende hindret av det humane IL-18BP, noe som antyder at humant IL-18BP gjenkjenner murint IL-18 (figur 3B). Endogent IL-18BP induseres i murine splenocytter ved høye konsentrasjoner av LPS, som fø-rer til produksjon av IFN-y . IFN-y-indusering med LPS (lO^g/ml) ble også hindret av urin-IL-18BP (figur 3C). Kon-kanavalin A (con A) aktiviserer T-celler til å produsere IFN-y i fravær av IL-18 (13) . Induksjon av IFN-y ved Con A ble ikke hindret av IL-18BP selv ved høye konsentrasjoner (figur 3D). Denne observasjonen demonstrerte at IL-18 var en spesifikk hemmer av Il-18-bioaktivitet mer enn en uspe-sifikk hemmer av IFN-y -fremstilling. IL-18BP hindret i tillegg aktiviteten hos det humane IL-18 i humane KG-l-celler indusert med en kombinasjon av IL-18 og TNF-a (figur 3E). Den ovennevte data demonstrerer at urin-IL-18BP hindrer human så vel som murin IL-18-aktivitet som målt ved sa-minduksjon av IFN-y i humane og murine mononukleære celler. Konsentrasjonen av IL-18BP som reduserte IL-aktiviteten med

>90% var sammenliknbar med selve IL-18, påvisende en høy affinitetsinteraksjon mellom disse to proteiner.

EKSEMPEL 6: ISOLASJON AV CDNA- KLONINGER KODENDE FOR IL- 18BP

Total RNA fra Jurkat T-celler ("CRL 8163, American Type Culture Collection") ble reverstranskribert med Super-Script RNase H-revers transkriptase (Gibco-BRL) og til-fel-dige primere ("Promega, Madison WI"). De resulterende cDNA-fragmenter ble så amplifisert ved PCR, ved anvendelse av Taq DNA-polymerase (Sigma) og primere korresponderende med TIGR-kloning THC123801 nukleotider 24-44 (sense) og 500-481 (revers). Ampiifikasjonen ble gjort i 30 sykluser av her-ding (55°C, 2 min.) og ekstensjon (70°C, 1 min.).De resulterende PCR-produkter ble gjenoppløst ved agarose- (1%) gel-elektroforese, eluert og klonet inn i pGEM-Teasy TA-kloningvektor (Promega). DNA fra individuelle kloninger ble sekvensert med T7 og SP6-primere. Det resulterte 477 bp-fragment ble merket<32>P ved vilkårlig priming. Denne prøve ble anvendt for å undersøke ulike humane cDNA og genomiske biblioteker. Duplikate nitrocellulosefiltre ble fremstilt og hybridisert med prøven ved 60°C i en buffer bestående av 6XSSC, 10 X Denharts oppløsning, 0,1% SDSog 100ng/ml laksemelke-DNA. Filtrene ble vasket og eksponert over natten ved -80°C mot Kodak XAR-film. Doble positive kloninger ble plakkrenset. Plasmider ble fjernet fra Åp>CEV9-kloninger og selvligert. CDNA-kloner fra andre biblioteker ble isolert ifølge forhandlers instruksjoner.

Automatisert DNA-sekvensanalyse av de isolerte kloner ble utført med "Models 373A" og "377"-sekvenser (Applied Biosystems) ved anvendelse av sense- og antisenseprimere. Standardprotokoller ble anvendt ved disse kloningsprose-dyrer (33). Følgende biblioteker ble undersøkt: et humant monocytt cDNA-bibliotek, konstruert i X,pCEV9-kloningsvektor (15), levert av T.Miki; et humant Jurkat leukemisk T-celle-DNA-bibliotek, et humant periferalt blodleukocytt-cDNA-bibliotek og et human milt-cDNA-bibliotek, alle fra ClonTech (Palo Alto, CA). Et humant morkakegenomisk bibliotek i lambda FIX II-vektor var fra Strata-gene (La Jolla, CA). Alle cDNA-kloner korresponderte med fire ulike IL-18BP spleisevarianter ble oppnådd ogkarakterisert. Alle spleisevarianter kodet for forsøksvis oppløselige skjulte proteiner. Den mest fremtredende (IL-18- BPa) hadde en åpen leseramme på 192 kodoner, kodende for et signalpeptid på 28 aminosyreresiduer etterfulgt av et modent forsøksvis IL-18BPa, hvis første 40 residuer (sekvens-ID nr. 10) passet perfekt med N-terminalproteinsekvensen fra urin-IL-18BP (sekvens-ID nr. 2). Plasseringen av cystinrestene anslo at dette polypeptid tilhører immunoglobulin-(lg)-superfamili-en. Hvert av de fire Gln-residuer innen modne IL-18BPa var et potensielt N-glykosyleringssted. De tre andre spleisevarianter av IL-18BP var signifikant mindre fremtredende. Et annet 1 kbb IL-18BP-CDNA kodet for et modent protein på 85 aminosyreresiduer (sekvens-ID nr. 4). En tredje variant, IL-18BPc var representert ved et 2,3 kb cDNA, kodende for et modent IL-18BP på 169 aminosyrerester (sekvens-ID nr. 6). Den fjerde variant, IL-18BPd kodet foret modent IL-18BP på 133 aminosyreresiduer (sekvens-ID nr. 8). In-exon-spleising oppstod på to steder langs pro-mRNA. Disse hendelser og et ytterligere 5' exon i IL-18BPd gav økning til 3 ulike 5'-UTR i de ulike cDNA-klonene. Det er derfor nokså mulig at ulike IL-18BP-varianter kan genereres i respons til dis-tinkte transkripsjonsreguleringsignaler. Ingen cDNA-koding for en reseptor med et transmembrandomene har ennå blitt funnet.

EKSEMPEL 7: KONSTRUKSJON AV EN PATTEDYR- UTTRYKKENDE VEKTOR. FREMSTILLING AV REKOMBINANT IL- 18BP, OG EVALUERING AV DE BIOLOGISKE AKTIVITETER VED REKOMBINANT IL- 18BP.

Kodingsregionen ved IL-18BPa-cDNA ble amplifisert med PCR med sense-primer 5' TATATCTAGAGCCACCATGACACAACTGGACACCA

og revers-primer:

PCR-produktet ble kuttet med Xba I og klonet inn i Xba I-plassen i pEF-BOS-ekspresjonsvektoren (25), til utbytte pEF-B0S-IL-18BPa. Konstruksjonene ble bekreftet med DNA-sekvensering. Satser av 6X10<7>C0S7-celler i 1,4 ml TD-buffer ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur, som beskrevet (35). Cellene ble så vasket med DMEM -10% FBS belagt i 4 timer i DMEM-10, vasket og inkubert i 3 til 5 døgn i serumfri DMEM. Kulturmiddelet ble oppsamlet, konsentrert 6 ganger ved ultrafiltrering ("10 kD cutoff) og IL-18BP-His6ble isolert i en Talon-kolonne ("Clontech") med imidasol som utslemmingsmiddel i følge produsentens instruksjoner. Immunologisk kryssreaktivitet til urinet og det COS7-ekspresjonerte IL-18BP ble vurdert som følger: urin-IL-18BP (5^g) ble merket med<125>I ved kloramin T-prosedyren. Supernatanter fra COS7-celler (250^1) ble blandet (1 time, romtemperatur, sluttvolum 500^1) med antistoffet med urin-IL-18BP, oppløst 1:1000 i fosfatbuffert salin (PBS), 0,05% Tween 20 og 0,5% bovinserumalbumin ("wash Buffer").<125>i-merket urin-IL-18BP (IO<6>cpm) ble så tilført og etter 1 time ble proteinet G-sefarose (20^1) tilført. Blandingen ble suspendert (1,5 timer, 4°C) , dråpene ble deretter isolert og vasket 3 ganger med "Wash Buffer" og en gang i PBS. Dråpene ble deretter eluert med en prøvebuffer, gjenoppløst med SDS-PAGE (10% akrylamid) under reduserende forhold etterfulgt av autoradiografi. IL-18BPa ble ført som et enkeltbånd i SDS-PAGE med sølvfarging under reduserende og ikke-reduserende forhold og hadde samme obserterte molekyl-masse som urin-IL-18BP (data ikke vist). Proteinsekvensanalyse av denne fremstillingen avslørte den samme N-terminalsekvens som den i urin-IL-18BP , indikerende at sistnevnte ikke ble degradert ved sin N-terminalen. Immunoblot-analyse av IL-18BPa med antistoffer som stod mot urin-IL-18BP avslørte det samme molekylære massebånd som i urin-proteinet. Videre, ved anvendelse av immunopresipitasjon, etterfulgt av SDS-PAGE og autoradiografi, var IL-18BPa i stand til å fjerne urin-125I-IL-18BP ved å binde seg til antistoffet. Derfor korresponderer IL-18BPa strukturelt til urin-IL-18BP. Rått og renset IL-18BPa ble testet for dets egenskap til å hindre den biologiske aktivitet av IL-18. IL-18BPa hindret, på en doseavhengig måte, den IFN-y-induserende aktivitet i humant og muse-IL-18 i murine splenocytter, PBMC og den humane KG-l-cellelinje (figur 9). Resultatene fra de ulike bioprøvene så vel som "mobility shift"-prøve (eksempel 8) demonstrerte at hindring av IL-18-aktivitet er en intrinsik egenskap ved det klonede IL-18BP og ikke ved noen av de andre følgende urenhetene i urin-IL-18BP, så som det sam-eluerende fragment av defensin .

EKSEMPEL 8: ELEKTROFORETISKE MOBILITETS- SKIFTEPRØVER

Effekten av urinen og den rekombinante IL-18-induserte aktivering av NF-kB i humane KG-l-celler ble også studert. Humane KG-l-celler (4X10<6>i 1 ml RPMI) ble stimulert med enten huIL-18 forbehandlet med et IL-18BP (20 min., romtemperatur) . Etter 20 minutter ved 37°C ble cellene vasket tre ganger med iskald PBS og umiddelbart frosset i flytende nitrogen. Cellepelleter ble resuspendert i tre ganger det pakkede cellevolum i buffer A (20 mM Tris pH 7,6, 0,4M NaCl, 0,2 mM EDTA, glyserol (20 volum-%), 1,5 mM MgCl2, 2 mM ditiotreitol (DDT), 0,4 mM PMSF, 1 mM Na3V04, 2ng/ml hver av leupeptin, pepstatin og aprotinin). Celleavfall ble fjernet ved sentrifugering (15.000xg, 15 min.), aliquoter fra supernatanten ble frosset i flytende nirogen og oppbe-vart ved -80°C. Proteinkonsentrasjon ble fastslått av en Bradford-prøve (Bio-Rad) ved å anvende bovinserumalbumin som standard. Et dobbeltkjedet oligonukleotid korresponderende med NF-KB-bindingselement (10 pmol, Promega) ble merket [<32>P]dCTP (300 Ci/mmol) og T4 polynukleotidkinase ("New England Biolabs"). Frie nukleotider ble fjernet med en spinnekolonne. Ekstrakter (10^g protein) av celler behandlet med IL-18 eller IL-18 pluss IL-18BP ble inkubert (15 min., romtemperatur) med den merkede prøve (3X10<4>cpm) sammen med poly-dl.dC (500 ng, Pharmacia) og denaturert laksemelke-DNA (100 ng, Sigma) i 20^1 buffer bestående av HEPES (pH 7,5, lOmM), 60 mM KC1, 1 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 1 mM DTT og glyserol (5 volum-%). Blandingene ble deretter lagt på 5% ikke-denaturerende polyakrylamidgeler. Elektroforese ble utøvet ved 185 V i 0,5XTBE (40 mM Tris HC1, 45 mM borsyre og 2,5 mM EDTA). Geler ble vakuumtørket og auto-radiografert over natten ved -80°C. IL-18 viste seg å indusere dannelsen av p50 NF-kB homodimer og p65/p50 NF-kB heterodimer. Urin så vel som rekombinant IL-18BP hindret aktiveringen av NF-kB hos IL-18, som fastslått ved en elek-troforetisk mobilitetsskifteprøve med KG-l-celleekstrakter bindende et radiomerket oligonukleotid tilsvarende NF-kB-konsensussekvensen.

EKSEMPEL 9: EKSPRESJON AV IL- 18BP I E. COLI-, GJÆR- OG INSEKTCELLER. IL-18BP kan også fremstilles ved andre rekombinante celler så som prokaryote celler, f.eks E. coli, eller andre eukaryote celler, så som gjær- eller insektceller. Velkjente metoder er tilgjengelige for konstruksjon av egnede vektorer, som bærer DNA som koder for enten IL-18BP og egn-ede for transformering av E. coli- og gjærceller, eller infisering av insektsceller for å kunne fremstille rekombinant IL-18BP. For ekspresjon i gjærceller , blir DNA som koder for IL-18BP (eksempel 6) kuttet ut og satt inn i ekspresjonsvektorer egnede for transfeksjon av gjærceller. For ekspresjon i insektsceller, blir DNA som koder for IL-18BP satt inn i bakulovirus og insektscellene blir infisert med nevnte rekombinante bakulovirus. For ekspresjon i E. coli, blir DNA som koder for IL-18BP utsatt for seterettet mutagenese med egnede oligonukleotider, slik at et innledende ATG-kodon settes inn rett før det første kodon ved et modent IL-18BP. Alternativt kan slikt DNA fresmtilles med PCR med egnede sens- og antisensprimere. De resulterende cDNA-konstruksjoner blir så innsatt i egnede konstruerte prokaryote ekspresjonsvektorer med kjente teknikker (23).

EKSEMPEL 10: KONSTRUKSJON AV ADENO- ASSOSIERT EKSPRESJONSVEKTOR FOR IN VTTO- EKSPRESJON AV IL- 18BPa.

Et funksjonelt gen kodende for IL-18BPa blir konstruert basert på plasmid pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). IL-18BP-cDNA med en Kozak konsensussekvens ved 5' ende er ligert inn i Xba I-stedet ved pcDNA3 på en måte som ødelegger restriksjonsstedet. Nye Xba I-seter er satt inn med sete-orientert mutagenese før neomysinkassetten (base 2151 til den originale pcDNA3-sekvens) og etter SV40-polyadenylasjonsignalet (base 3372 til den originale pcDNA3-sekvens). Denne konstruksjon blir så kuttet med Xba I og det resulterende 4,7 kb minigen blir satt inn i Xba I-setet i plasmid psub201 som beskrevet ("Snyder et al, 1996, Current Protocols in Human Genetics , Chapters 12.1.1-12.1.17, John Wiley&Sons"). Det resulterende rekombinante plasmid blir kotransfektert med hjelper AAV-plasmid-pAAV/Ad og cellene blir samlet opp etter 48-60 timer med inkubering. Cellene utsettes for 3 fryse- og tinings-sykluser, celleavfallet fjernes ved sentrifugering, og supernatanten blir øket til 33% metning med ammoniumsulfat. Blandingen blir deretter sentrifugert og rAAV blir presipitert fra supernatanten ved å bringe ammoniumsulfatet til 50% metning. Viruset blir videre renset med CsCl, dialysert og endelig varmet i 15 min ved 56°C for å ødelegge ethvert adenovirus.

EKSEMPEL 11: KONSTRUKSJON AV REKOMBINANTE FUSJONSPROTEINER

HOS IL- 18BP.

Fremstillingen av proteiner som omfatter IL-18BP sammensatt til den konstante region ved IgG2 tung kjede kan utføres som følger: DNA ved IL-18BP blir utsatt for seterettet mutagenese med egnede oligonukleotider slik at et unikt restriksjonssted introduseres umiddelbart før og etter kodings-sekvensene. Et plasmid som bærer den konstante region av IgG2 tung kjede, f.eks pRKC042Fcl(6) blir utsatt for liknende seterettet mutagenese for innføring av samme unike restriksjonssted så nært Asp 216 av IgGl tung kjede som mulig på en måte som tillater translasjon i fase av fusjonsproteinet. Et dsDNA-fragment, bestående av 5' ikke-transla-terte sekvenser og kodende for IL-18BP blir fremstilt ved spalting av de unike restriksjonsseter eller alternativt ved PCR med egnede dannede primere. Det muterte pRKCD42Fcl blir spaltet tilsvarende for å generere et stort fragment inneholdende plasmidet og IgGl-sekvensene. De to fragmen-tene blir ligert for å generere et nytt plasmid, kodende en polypeptidforløper bestående av IL-18BP og omkring 227 C-terminalaminosyrer av IgGl-tunge kjeder (hengselregion og CH2- og CH3-domener). DNA-kodende funksjonsproteiner kan isoleres fra plasmidet med spalting med egnede restrik-sjonsenzymer og deretter innføring i effektive prokaryote eller eukaryote ekspresjonsvektorer.

EKSEMPEL 12: FREMSTILLING AV KJEMISK MODIFISERTE IL- 18BP.

For å kunne øke halveringstiden til IL-18BP i plasma, kan IL-18BP som er kjemisk modifisert med polyetylenglykol (PEG), fremstilles. Modifiseringen kan utføres ved å kryssbinde PEG med et cystinresiduum av IL-18BP-molekylene. Mutante IL-18BP kan konstrueres som inneholder et ekstra cystinresiduum med aminoterminalen, glykosyleringssteder, og karboksylterminalen til hvert enkelt IL-18BP. Mutage-nesen kan utføres med PCR ved anvendelse av oligonulkeoider som inneholder den ønskede mutasjon. Disse mutante proteiner blir uttrykt på vanlig måte som kjent fra teknikken. Pegylering av disse proteiner vil bli utført, og aktiviteten vil bli vurdert.

EKSEMPEL 13: FREMSTILLING AV POLYKLONALE ANTISTOFFER TIL

IL- 18BP.

Kaniner ble injisert subkutant med 5^g med en rent fremstilt urin-IL-18BP, emulgert i fullstendig "Freunds"-adju-vant. Tre uker senere ble de igjen subkutant injisert med 5^g av IL-18BP-produktet i ufullstendig "Freunds"-adjuvant. To ytterligere injeksjoner med IL-18BP som opp-løsning i PBS ble utført med et intervall på 10 dager. Kaninene ble tappet 10 dager etter siste immunisering. Utviklingen av antistoffnivå ble utført med radioimmunassay.12<5>I-merket IL-18BP (166.000 cpm) ble blandet med ulike oppløsninger (1:50, 1:500, 1:5.000 og 1:50.000) av kaninserumet. En sus-pensjon av protein-G-agarosedråper (20^1, Pharmacia) ble tilført i et totalt volum på 200^1. Blandingen fikk stå en time i romtemperatur, dråpene ble deretter vasket tre ganger og bundet radioaktivitet ble målt. Kanin-antiserum til humant leptin ble anvednt som en negativ kontroll. Titrérvæsken til IL-18R-antiserum var mellom 1:500 og 1:5.000, mens den fra negativ kontroll var mindre enn 1:50.

EKSEMPEL 14: FREMSTILLING AV MONOKLONALE ANTISTOFFER TIL

IL- 18BP.

Balb/C-hunnmus (3 måneder gamle) blir først injisert med 2^g renset IL-18BP i en emulsjon av fullstendig "Freunds"-adjuvant, og tre uker senere subkutant i ufullstendig "Freunds"-adjuvant. Tre ytterligere injeksjoner blir gitt med 10 dagers intervaller, subkutant i PBS. Endelige inji-seringer blir gitt intraperitonealt til musa 4 og 3 dager før fusjon, noe som gav den høyeste bindingstitrérvæske som fastslått med IRIA (se nedenfor). Fusjon utføres ved anvendelse av NSO/l-myelomacellelinje og lymfocytter fremstilt fra både milten og lymfeknutene til dyret som fusjonspart-ner. De fuserte cellene distribueres inn i mikrokulturpla-ter og hybridomene velges ut i DMEM supplementert med HAT og 15% serum fra hest. Hybridomer som viser seg å produsere antistoffer mot IL-18BP blir subklonet ved den be-grensende fortynningsmetode og injisert i Balb/C-mus som har blitt primet med pristan for produksjon av bukvæske. Isotypene av antistoffene blir funnet ved anvendelse av en kommersielt tilgjengelig ELISA-anordning (Amersham, UK). Utvelgelsen av hybridomer som produserer anti-IL-18BP-monoklonale antistoffer blir utført som følger: hybridomsupernatanter blir testet for tilstedeværelse av anti-IL-18BP-antistoffer ved et invert fastfase radioimmunassay (IRIA). Elisa-plater ("Dynatech Laboratories, Alexandria, VA") blir belagt med Talon-renset IL-18BPa-His6(10^g /ml, 100^l/brønn). Etter følgende inkubasjon over natten ved 4°C, blir platene vas ket to ganger med PBS inneholdende BSA (0,5%) og Tween (0,05%) og blokkert i vaskeoppløsning i minst 2 timer ved 37°C. Hybride kultursupernatanter (100^l/brønn) blir lagt til og platene blir inkubert i 4 timer ved 37°C. Platene blir vasket i 3 timer, og et konjugat av geit-anti-mus-pep-perrotperoksidase (HRP, jackson Labs, 1:10.000, 100^1/brønn) blir lagt til i 2 timer ved romtemperatur. Platene blir vasket 4 ganger og fargen blir fremkalt av ABTS ("2,2 *-azino-biz" (3-etylbenztiasolin-6-sulfonsyre, Sigma)) med H2O2som et substrat. Platene blir lest av en automatisk ELISA-leser. Prøver som gir OD som er minst 5 ganger høyere enn den negative kontrollverdien blir regnet som positive. ;EKSEMPEL 15: AFFINITETSKROMATOGRAFI AV IL- 18BP MED MONOKLONALE ANTISTOFFER. ;Antistoffer mot IL-18BP blir anvendt for rensing av IL-18BP ved affinitetskromatografi. Bukvæske inneholdende det monoklonale antistoff dannet av hybridomet blir renset med ammoniumsulfatpresipitasjon ved 50% metning etterfulgt av ekstensiv dialyse mot PBS. Omkring 10 mg av immunoglobuliner blir bundet til 1 ml Affigel 10 ("BioRad, USA") som spesifisert fra produsenten. 250 ml av humane urinproteiner (tilsvarende 250 1 råurin) er lagt til 0,5 ml av anti-IL18BP-antistoffkolonnen ved 4°C med en flytgrad på 0,25 ml/min. Kolonnen blir vasket med PBS inntil intet protein blir detektert i vaskingene. IL-18BP eluereres med 25 mM sitronsyrebuffer, pH 2,2 (8x1 kolonnevolumfraksjoner) og umiddelbart nøytralisert med 1 M Na2C03. Videre rensing av denne fremstilling blir oppnådd ved størrelsesekskluderende kromatografi. ;EKSEMPEL 16: ELISA- TEST ;Mikrotirérplater ("Dynatech" eller "Maxisorb", av Nunc) blir belagt med anti-IL-18BP-monoklonalt antistoff (serum-frie hydride supernatanter eller bukvæske-immunoglobuliner) over natten ved 4°C. Platene blir vasket med PBS inneholdende BSA (0,5%) og Tween 20 (0,05%) og blokkert i samme oppløsning i minst 2 timer ved 37°C. De testede prøvene fortynnes i blokkeringsoppløsningen og tilsettes brønnene (100^l/brønn) i 4 timer ved 37°C. Platene vaskes deretter i 3 timer med PBS-holdig Tween 20 (0,05%) etterfulgt av tilsetting av kanin-anti-IL-18BP-serum (1:1.000, 100^l/brønn) for videre inkubering over natten ved 4°C. Platene blir vasket 3 ganger og et konjugat av geit-anti-mus-pepperrot-peroksidase (HRP, jackson Labs, 1:10.000, 100^1/brønn) blir lagt til i 2 timer ved romtemperatur. Platene blir vasket 4 ganger og fargen blir fremkalt med ABTS ("2,2 *-azino-biz" (3-etylbenztiasolin-6-sulfonsyre, Sigma)) med H2O2som et substrat. Platene blir lest av en automatisk ELISA-leser.

EKSEMPEL 17: IKKE- GLYKOSYLERT HUMANT IL- 18BP ER BIOLOGISK AKTIVT.

Renset rekombinant IL-18BPa ble testet for dets egen-skap til å hindre den biologiske aktivitet hos IL-18. IL-18BPa hindret, avhengig av dosen, IFN-y-induserende aktivitet hos humant- og mus-IL-18 i murine splenocytter, PBMC og de humane KG-l-cellelinjer (figur 9).

Renset IL-18BPa som har et His6-merke ved C-terminalen (1,5^g, 50^1) ble justert til pH 7,5 og blandet med N-glykosidase F (3 ul, 500.000 U/ml, PNGase, F, New England Biolabs). Blandingen ble inkubert i 24 timer ved 37°C under ikke-denaturerende forhold. Aliquoter fra prøven og fra uspaltet IL-18BP-his6ble analysert ved SDS-PAGE under ikke-reduserende forhold etterfulgt av immunoblotting med antistoffer mot IL-18BP. Det ble påvist at -40 kD-båndet til IL-18BP-His6forsvant i den PNGase-behandlede fraksjon og et nytt~20 kD-bånd ble oppnådd. Den molekylære masse til produktet og spesifisiteten av PNGase F indikerte at IL-18BP-His6ble helt og holdent deglykosylert. Den PNGase-behandlede fraksjon, uspaltet IL-18BP-Hiseog kontroll- prøve inneholdende PNGase i buffer ble absorbert separat i Talon-dråper, vasket med fosfatbuffer og eluert med imidasol (100 mM). De eluerte fraksjoner ble utsatt for bio-assay ved anvendelse av humant IL-18BP (20 ng/ml), LPS (2Hg/ml) og murine splenocytter. Resultatene er vist i føl-gende tabell:

Derfor er det konkludert at deglykosylert IL-18BP er biologisk aktivt som en modulator av IL-18-aktivitet.

Claims (50)

1. IL-18-bindende protein (IL-18BP),karakterisert vedat det er valgt fra gruppen bestående av: (a) polypeptider omfattende aminosyresekvensene SEQ ID NO: 2 eller 6; (b) polypeptider som definert i (a) uten en ledersekvens; (c) muteiner som har minst 80% homologi med IL-18BP som definert i (a) eller (b), kondenserte proteiner, kjemisk modifiserte derivater, sirkulært permuterte derivater og blandinger derav av polypeptidene definert i (a) eller (b); og som binder til IL-18 og blokkerer IL-18-indusert produksjon av IFN-y.

2. IL-18BP ifølge krav 1, karakterisert vedat det er et ikke-viralt protein.

3. IL-18BP ifølge krav 2, karakterisert vedat det er et humant protein.

4. IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 3,karakterisert vedat det har en molekylvekt på omkring 4 0 kD.

5. IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1-4,karakterisert vedat fusjonsproteinet omfatter et immunoglobulin eller et fragment derav.

6. IL-18BP ifølge krav 5, karakterisert vedat det er et fusjonspro-tein valgt fra IL-18BP kondensert til det konstante område av IgG2 tung kjede.

7. IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 6,karakterisert vedat de kjemisk modifiserte derivater innbefatter polyetylenglykol sidekjeder.

8. IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 7,karakterisert vedat de eksisterer i opp-løselig form.

9. IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 8.karakterisert vedat de er glykosylert.

10. IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 8,karakterisert vedat de er ikke-glykosylert.

11. DNA-molekyl, karakterisert vedat det koder for et IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10.

12. DNA-molekyl ifølge krav 11,karakterisert vedat det er utstyrt med et stopp-kodon ved sin 3' ende.

13. DNA-molekyl, karakterisert vedat det omfatter DNA-sekvensene i SEQ ID NO: 1 eller 5, hvor nevnte DNA koder for et IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10.

14. DNA-molekyl ifølge ethvert av kravene 11 til 13,karakterisert vedat det er operativt forbundet til andre DNA-sekvenser som letter ekspresjon, så som promotere eller forsterkere.

15. DNA-molekyl ifølge ethvert av kravene 11 til 14,karakterisert vedat det er et genomisk DNA.

16. DNA-molekyl ifølge ethvert av kravene 11 til 15,karakterisert vedat det er et cDNA.

17. cDNA-molekyl ifølge krav 16,karakterisert vedat det omfatter en cDNA-sekvens valgt fra gruppen av DNA-sekvenser av SEQ ID NO: 1 og 5.

18. cDNA-molekyl ifølge krav 16 til 17,karakterisert vedat det er tilpasset for ekspresjon i en bakteriell vertsorganisme.

19. Replikerbar vektor, karakterisert vedat den omfatter et DNA-molekyl ifølge ethvert av kravene 11 til 18.

20. Transformert vertscelle omfattende en vektor ifølge krav 19.

21. Transformert vertscelle ifølge krav 20,karakterisert vedat den er en eukaryot celle.

22. Transformert vertscelle ifølge krav 21,karakterisert vedat den er en pattedyr-celle .

23. Transformert vertscelle ifølge krav 22,karakterisert vedat den er valgt fra humane-, ape-, muse- og kinesisk hamster ovarie (CHO) -celler.

24. Transformert vertscelle ifølge krav 20,karakterisert vedat den er en prokaryot celle.

25. Fremgangsmåte ved fremstilling av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10, karakterisert vedat den omfatter å dyrke en vertscelle ifølge ethvert av kravene 20 til 24 under betingelser som er egnet for ekspresjon av nevnte IL-18BP.

26. Fremgangsmåte for fremstilling av IL-18BP ifølge krav 25, karakterisert vedat den ytterligere omfatter å isolere nevnte IL-18BP.

27. Antistoff, karakterisert vedat det spesifikt reage-rer med sekvensen vist i SEQ ID NO: 2 eller 6.

28. Antistoff ifølge krav 27, karakterisert vedat det er et polyklo-nalt antistoff.

29. Antistoff ifølge krav 28, karakterisert vedat det er et monoklonalt antistoff.

30. Antistoff ifølge krav 29, karakterisert vedat det er et chimerisk antistoff.

31. Antistoff ifølge krav 30 karakterisert vedat det er et humanisert antistoff.

32. Anti-idiotypisk antistoff,karakterisert vedat det er et antistoff til antistoffet ifølge krav 27.

33. Fremgangsmåte for isolering av IL-18BP ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat den omfatter: (a) å passere en human væske gjennom en kromatografiko-lonne til hvilken IL-18BP er koblet, (b) å eluere proteinet som binder til IL-18, og (c) å rense nevnte protein.

34. Sammensetning for farmasøytisk anvendelse,karakterisert vedat den omfatter IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller en viruskodet homolog av IL-18BP som binder til IL-18 og blokkerer IL-18-indusert produksjon av IFN-y.

35. Sammensetning for farmasøytisk anvendelse,karakterisert vedat den omfatter et DNA som koder for IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller et DNA som koder for en viruskodet homolog av IL-18BP som binder til IL-18 og blokkerer IL-18-indusert produksjon av IFN-y.

36. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34, ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av autoimmune sykdommer.

37. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av type-I diabetes .

38. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34 ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av sepsis.

39. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34 ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av transplantatavstøtninger.

40. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34 ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av reumatoid artritt.

41. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34 ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av inflammatorisk tarmsykdom.

42. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34, ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av multippel sklerose.

43. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34, ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av ischemisk hjertesykdom innbefattende akutt hjertesvikt.

44. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34, ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av ischemisk hjerneskade.

45. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34, ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av psoriasis.

46. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34, ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av akutt eller kronisk hepatitt.

47. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller av en viruskodet homolog derav som definert i krav 34, ved fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til behandling av akutt eller kronisk pankreatitt.

48. Anvendelse av IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 for opprensning av IL-18.

49. Anvendelse av antistoffene ifølge ethvert av kravene 27 til 31 i et assay for påvisning av IL-18BP.

50. Anvendelse av et DNA-molekyl som koder for IL-18BP ifølge ethvert av kravene 1 til 10 eller som koder for en viruskodet homolog derav som definert i krav 34 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning til genterapi.