PL206070B1 - Izolowane białko wiążące IL-18, sposób jego wytwarzania i izolowania, izolowana cząsteczka DNA, zdolny do replikacji wektor, transformowana komórka gospodarza, przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest izolowane białko wiążące IL-18, sposób jego wytwarzania i izolowania, izolowana cząsteczka DNA, zdolny do replikacji wektor, transformowana komórka gospodarza, przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie. Białka wiążące interleukinę 18 (IL-18), zwane dalej IL-18BP, są zdolne do wiązania IL-18. Rozpuszczalne IL-18BP jest otrzymywane z płynów ustrojowych oraz przez ekspresję odpowiednich wektorów DNA w komórkach gospodarza. Kodowane przez wirusy homologi IL-18BP można otrzymywać przez ekspresję odpowiednich wektorów DNA w komórkach gospodarza. Wynalazek dotyczy zatem wektorów wyrażających różne IL-18BP oraz wektorów przydatnych do ekspresji IL-18BP u ludzi i innych ssaków. Wynalazek dostarcza także przeciwciał przeciwko IL-18BP. Możliwe są liczne terapeutyczne zastosowania IL-18BP przez modulowanie i/lub blokowanie aktywności IL-18, jak również zastosowania terapeutyczne wektorów ekspresyjnych do modulowania i/lub blokowania aktywności IL-18. Przedmiotem wynalazku są ponadto zastosowania przeciwciał.

W 1989 roku opisano wywołaną endotoksyną zachodzącą w surowicy aktywność, która indukowała interferon-γ (IFN-γ) z mysich splenocytów (27). Zachodząca w surowicy aktywność działała niejako bezpośredni induktor IFN-γ, ale raczej jako ko-stymulator wraz z IL-2 albo mitogenami. Próby oczyszczenia z poddanej działaniu endotoksyny surowicy mysiej doprowadziły do otrzymania homogennego białka 50-55 kDa (26). Ponieważ inne cytokiny mogą działać jako ko-stymulatory wytwarzania IFN-γ, nieskuteczność przeciwciał neutralizujących przeciwko IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 albo TNF w neutralizacji zachodzącej w surowicy aktywności sugeruje, że aktywność ta była wywoływana przez inny czynnik. W 1995, ci sami naukowcy wykazali, że wywołany endotoksyną ko-stymulator wytwarzania IFN-γ występował w ekstraktach z wątroby od myszy wstępnie traktowanych P. acnes (31). W modelu tym populacja makrofagów wątrobowych (komórki Kupffera) ulega namnażaniu, zaś niska dawka lipopolisacharydu (LPS) bakteryjnego, która nie jest letalna u myszy nietraktowanych wstępnie, staje się letalna. Czynnik nazwany czynnikiem indukującym IFN-γ (IGIF), zaś później nazwany interleukiną (IL-18) oczyszczono do homogenności z 1200 gramów wątrób myszy traktowanych P. acnes. Zdegenerowane oligonukleotydy otrzymane na podstawie sekwencji aminokwasowych oczyszczonej IL-18, zastosowano do klonowania cDNA mysiej IL-18 (31). IL-18 jest białkiem 18-19 kDa o długości 157 aminokwasów, które nie wykazuje podobieństwa z żadnym peptydem w bazach danych. Informacyjne RNA dla IL-18 i interleukiny 12 (IL-12) są łatwo wykrywalne w komórkach Kupffera i aktywowanych makrofagach. Rekombinowana IL-18 indukuje IFN-γ silniej niż IL-12, zapewne przez osobny szlak (31). Podobnie jak w przypadku zachodzącej w surowicy, indukowanej endotoksyną aktywności, IL-18 nie indukuje IFN-γ sama, ale działa głównie jako ko-stymulator z mitogenami albo IL-2. IL-18 zwiększa proliferację limfocytów T, prawdopodobnie przez szlak zależny od IL-2, zwiększa wytwarzanie cytokin Th1 in vitro i wykazuje synergizm w połączeniu z IL-12 zwiększając wytwarzanie IFN-γ (24).

Wykazano, że przeciwciała neutralizujące wobec mysiej IL-18 zapobiegają śmiertelności spowodowanej niską dawką LPS u myszy wstępnie traktowanych P. acnes. Opisuje się również znaczenie IFN-γ jako mediatora śmiercionośnej aktywności LPS u myszy wstępnie traktowanych. Przykładowo, neutralizujące przeciwciała przeciwko IFN-γ chroniły myszy przed wstrząsem typu Schwartzmana (16), zaś myszy pozbawione receptora IFN-γ traktowane galaktozaminą były odporne na śmierć indukowaną przez LPS (7). Stąd fakt, że neutralizujące przeciwciała przeciwko mysiej IL-18 będą chroniły myszy wstępnie traktowane P. acnes przed śmiercią spowodowaną LPS nie był nieoczekiwany (31). Leczenie przeciwciałami przeciwko mysiej IL-18 chroniło myszy również przed ciężką cytoksycznością wątrobową.

Ludzką sekwencję cDNA dla IL-18 opisano w 1996 po sklonowaniu mysiej postaci (38). Rekombinowana ludzka IL-18 wykazuje naturalną aktywność IL-18 (38). Ludzka rekombinowana IL-18 nie działa bezpośrednio na indukującą IFN-γ aktywność ludzkich limfocytów T, ale działa jako ko-stymulator wytwarzania IFN-γ i innych cytokin limfocytów T pomocniczych typu 1 (Th1) (38). Do tej pory, IL-18 uważano głównie za ko-stymulator wytwarzania cytokin Th1 (IFN-γ, IL-2 oraz czynnika pobudzającego kolonie granulocytów-makrofagów) (20), oraz za ko-stymulator cytotoksyczności zachodzącej za pośrednictwem liganda FAS klonów mysich komórek naturalnych zabójców (komórek NK, ang. natural killer) (37).

Przez klonowanie IL-18 z chorych tkanek i badanie ekspresji genu IL-18, ujawniono ścisłą zależność chorób autoagresyjnych od tej cytokiny. Nieotyłe myszy z cukrzycą (NOD, ang. non-obese diabetic) spontanicznie rozwijają zapalenie wysepek trzustkowych i cukrzycę, które mogą być przyspiePL 206 070 B1 szone i zsynchronizowane przez pojedyncze wstrzyknięcie cyklofosfamidu. W trzustkach myszy NOD podczas wczesnych etapów zapalenia wysepek wykazano obecność mRNA dla IL-18 przez PCR z odwrotną transkryptazą. Poziomy mRNA dla IL-18 wzrastały gwałtownie po traktowaniu cyklofosfamidem i poprzedzały wzrost mRNA IFN-γ, a następnie cukrzycy. Co ciekawe, kinetyka ta naśladowała kinetykę mRNA IL-12-p40, czego wynikiem była bliska korelacja indywidualnych poziomów mRNA. Klonowanie cDNA IL-18 z RNA trzustki, a następnie sekwencjonowanie, wykazało identyczność z klonowaną sekwencją IL-18 z komórek Kupffera i makrofagów aktywowanych in vivo. Również makrofagi myszy NOD reagowały na cyklofosfamid ekspresją genu IL-18, podczas gdy makrofagi myszy Balb/c traktowanych identycznie nie reagowały. Zatem, ekspresja IL-18 ulega nieprawidłowej regulacji u myszy NOD z autoagresją i jest ściśle związana z rozwojem cukrzycy (32).

IL-18 odgrywa potencjalnie rolę w immunoregulacji albo w stanie zapalnym przez wzmacnianie funkcjonalnej aktywności ligandu Fas na komórkach Th1 (10). IL-18 ulega również ekspresji w korze nadnerczy, a stąd może być wydzielana jako neuroimmunomodulator odgrywając istotną rolę w kierowaniu układem odpornościowym po stresujących doświadczeniach (9).

In vivo, IL-18 jest wytwarzana przez cięcie pro-IL-18, zaś jej endogenna aktywność przyczynia się do wytwarzania IFN-γ przy zachodzącej przy udziale P. acnes oraz LPS śmiertelności. Z powodu swej aktywności, blokowanie aktywności biologicznej IL-18 u ludzi stanowi strategię leczenia wielu chorób. Osiąga się to przez zastosowanie rozpuszczalnych receptorów albo przeciwciał blokujących receptor komórkowy IL-18.

Białka wiążące cytokiny (rozpuszczalne receptory cytokin) odpowiadają zewnątrzkomórkowym domenom wiążącym ligand odpowiednich receptorów cytokin na powierzchni komórek. Pochodzą one z alternatywnego składania pre-mRNA, wspólnego dla receptora powierzchniowego komórki albo przez cięcie proteolityczne receptora powierzchniowego komórki. Takie receptory rozpuszczalne opisano w przeszłości, w tym m.in., rozpuszczalne receptory IL-6 i IFN-γ (30), TNF (11,12), IL-1 i IL-4 (21), IFN-α/β (28, 29) i inne. Jedno z białek wiążących cytokiny, zwane osteoprotegeryną (OPG, znane również jako czynnik hamujący osteoklasty - OCIF), członek rodziny TNFR/Fas, jest pierwszym przykładem rozpuszczalnego receptora, który występuje wyłącznie jako białko wydzielnicze (1, 34, 39).

Przedmiotem wynalazku jest izolowane białko wiążące IL-18 (IL-18BP) wybrane z grupy składającej się z:

(a) polipeptydów zawierających sekwencję aminokwasową AA1-AA192 SEK. NR ID.: 2, AA29-AA192 SEK. NR ID.: 2, AA1-AA197 SEK. NR ID.: 6 lub AA29-AA197 SEK. NR ID.: 6, (b) mutein wykazujących co najmniej 90% identyczność z IL-18BP jak określono w (a), białek fuzyjnych, chemicznie modyfikowanych pochodnych, kołowo permutowanych pochodnych oraz ich mieszanin polipeptydów określonych w (a), które wiążą się z IL-18 oraz blokują indukowane przez IL-18 wytwarzanie IFN-γ.

Korzystnie izolowane IL-18BP według wynalazku jest białkiem niewirusowym, a korzystniej ludzkim. Również korzystnie jego ciężar cząsteczkowy wynosi około 40 kD.

Izolowane IL-18BP według wynalazku jest korzystnie białkiem fuzyjnym obejmującym immunoglobulinę lub jej fragment, a korzystniej białkiem fuzyjnym IL-18BP z regionem stałym łańcucha ciężkiego IgG2. Również korzystnie chemicznie modyfikowana pochodna IL-18BP obejmuje łańcuchy boczne poliglikolu etylenowego.

Izolowane IL-18BP według wynalazku jest korzystnie w postaci rozpuszczalnej. Korzystniej IL-18BP jest glikozylowane lub nieglikozylowane.

Przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka DNA kodująca IL-18BP według wynalazku. Korzystnie izolowana cząsteczka DNA według wynalazku jest zaopatrzona w kodon stop na końcu 3'.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto izolowana cząsteczka DNA zawierająca sekwencję DNA przedstawioną w SEK. NR ID.: 1 lub 5 kodująca IL-18BP według wynalazku.

Izolowana cząsteczka DNA według wynalazku jest korzystnie funkcjonalnie połączona z innymi sekwencjami DNA umożliwiającymi ekspresję, takimi jak promotory lub wzmacniacze. Izolowana cząsteczka DNA według wynalazku jest korzystnie genomowym DNA, korzystniej cDNA, a najkorzystniej obejmuje sekwencję cDNA wybraną z grupy sekwencji SEK. NR ID.:1 i 5. Również korzystnie jest ona przystosowana do ekspresji w gospodarzu bakteryjnym.

Przedmiotem wynalazku jest także zdolny do replikacji wektor zawierający cząsteczkę DNA według wynalazku oraz zawierająca go transformowana komórka gospodarza. Komórka gospodarza według wynalazku jest korzystnie komórką eukariotyczną korzystniej komórką ssaka, a najkorzystniej

PL 206 070 B1 komórką wybraną z spośród komórek ludzkich, małpy, myszy oraz komórek jajnika chomika chińskiego (CHO). W innej postaci wykonania transformowana komórka gospodarza według wynalazku jest komórką prokariotyczną.

Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało specyficznie reagujące z polipeptydem o sekwencji przedstawionej w SEK. NR ID.:2 lub 6. Przeciwciało według wynalazku może być przeciwciałem poliklonalnym lub monoklonalnym. Korzystnie przeciwciało to jest przeciwciałem chimerowym, a korzystniej przeciwciał em humanizowanym. Wynalazek dostarcza również przeciwciał a antyidiotypowego wobec wyżej określonego przeciwciała według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz czynnik aktywny wybrany spośród IL-18BP według wynalazku oraz DNA kodującego IL-18BP według wynalazku.

Wynalazek dostarcza ponadto sposobu wytwarzania IL-18BP według wynalazku obejmującego hodowanie komórki gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do ekspresji IL-18BP. Sposób według wynalazku korzystnie obejmuje także etap izolowania IL-18BP.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób izolowania IL-18BP obejmujący:

a) przepuszczanie płynu ustrojowego przez kolumnę chromatograficzną której złoże jest sprzęgnięte z IL-18;

b) wymywanie związanego IL-18BP; oraz

c) oczyszczanie białka.

W kolejnej postaci wykonania wynalazek dotyczy zastosowania IL-18BP do wytwarzania leku do leczenia chorób autoimmunizacyjnych, cukrzycy typu I, posocznicy, odrzucania przeszczepów, reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalnej choroby jelit, stwardnienia rozsianego, choroby niedokrwiennej serca, włącznie z zawałem serca, niedokrwiennego urazu mózgu, łuszczycy, ostrego lub przewlekłego zapalenia wątroby, oraz ostrego lub przewlekłego zapalenia trzustki.

Przedmiotem jest ponadto zastosowanie IL-18BP według wynalazku do oczyszczania IL-18, jak również zastosowanie przeciwciał według wynalazku w teście wykrywającym IL-18BP. Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest również zastosowanie cząsteczki DNA kodującej IL-18BP według wynalazku do wytwarzania leku do terapii genowej.

Opis figur

Figura 1 przedstawia SDS-PAGE (elektroforezę na żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu) białka wiążącego IL-18 oczyszczonego przez powinowactwo z ligandem. Nieoczyszczone białka moczu (zatężone przez ultrafiltrację 500 l prawidłowego moczu ludzkiego) wprowadzono do kolumny IL-18-agaroza. Kolumnę płukano, a związane białka eluowano przy pH 2,2. Eluowane frakcje neutralizowano i analizowano porcjami przez SDS-PAGE (10% poliakrylamid) w warunkach nieredukujących i barwiąc srebrem. Ścieżki: 1: nieoczyszczone białka moczu (1,5 μg na żelu); 2-9: frakcje wymywane, odpowiednio 1-8, z kolumny IL-18-agaroza; 10: znaczniki ciężaru cząsteczkowego, w kDa, jak zaznaczono po prawej stronie. Strzałki wskazują prążek odpowiadający IL-18BP.

Figura 2 przedstawia autoradiogram SDS-PAGE (7,5% poliakrylamid) kompleksów złożonych z ¹²⁵I-IL-18 (pozorny ciężar cząsteczkowy 19 kDa) sieciowanych z następującymi preparatami rozpuszczalnego białka wiążącego IL-18: ścieżka 1: płukanka z kolumny powinowactwa IL-18; ścieżka 2: wymywana frakcja 2 z kolumny powinowactwa z IL-18; ścieżka 3: wymywana frakcja 3 z kolumny powinowactwa z IL-18. Znaczniki ciężaru cząsteczkowego zaznaczono po prawej stronie (w kDa). Strzałka oznacza produkt sieciowany (58 kDa).

Figura 3 przedstawia hamowanie przez IL-18BP indukowanego przez IL-18 wytwarzania IFN-γ.

(A) mysie splenocyty pobudzano (24 godz., 37°C) zaznaczonymi kombinacjami LPS (1 μg/ml) i ludzką IL-18 (5 ng/ml), dodanymi bezpośrednio albo po uprzednim zmieszaniu (1 godz., 37°C) z IL-18BP z moczu. Poziom muIFN-γ w hodowli oznaczono po 24 godz.

(B) mysie splenocyty inkubowano (24 godz.) z LPS (1 μg/ml) wraz z mysią IL-18 (10 ng/ml) zmieszaną uprzednio (1 godz., 37°C) z rosnącymi stężeniami ludzkiej IL-18BP.

(C) mysie splenocyty inkubowano (24 godz.) z LPS (10 μg/ml) wraz z rosnącymi stężeniami ludzkiej IL-18BP.

(D) mysie splenocyty inkubowano (24 godz.) z ConA (1 μg/ml) z rosnącymi stężeniami ludzkiej IL-18BP.

(E) ludzkie komórki KG-1 pobudzano TNF-α (20 ng/ml) i huIL-18 (25 ng/ml) oddzielnie, albo po ich uprzednim zmieszaniu (1 godz., 37°C) z IL-18BP z moczu.

Figura 4 przedstawia sekwencję cDNA ludzkiej IL-18BPa i białka. Podkreślono peptyd sygnałowy.

PL 206 070 B1

Figura 5 przedstawia sekwencję cDNA ludzkiej IL-18BPb i białka. Podkreślono peptyd sygnałowy.

Figura 6 przedstawia sekwencję cDNA ludzkiej IL-18BPc i białka. Podkreślono peptyd sygnałowy.

Figura 7 przedstawia sekwencję cDNA ludzkiej IL-18BPd i białka. Podkreślono peptyd sygnałowy.

Figura 8 przedstawia sekwencję ludzkiego genu IL-18BP. Sekwencję ludzkiego klonu genomowego (7,1 bp) oznaczono i porównano z sekwencją różnych klonów cDNA izolowanych z 3 bibliotek cDNA; wspólne miejsce kodonu startu leży w pozycjach nukleotydów 683-685. Gen NuMA1 położony jest na nici antysensownej, od nukleotydu 3578 do końca.

Figura 9 przedstawia wpływ rekombinowanego IL-18BP na aktywność ludzkiej i mysiej IL-18.

IL-18BPa znakowany His6 poddano przemijającej ekspresji w komórkach COS7 i oczyszczono.

(A) ludzką IL-18 (5 ng/ml) zmieszano z IL-18BPa znakowanym His6 albo RPMI i dodano do mysich splenocytów wraz z LPS (1 μg/ml). Wytwarzanie IFN-γ mierzono po 24 godzinach.

(B) mysią IL-18 (10 ng/ml) zmieszano z IL-18BPa znakowanym His6 albo RPMI i dodano do mysich splenocytów wraz z LPS (1 μg/ml). Wytwarzanie IFN-γ mierzono po 24 godzinach.

(C) ludzką IL-18 (25 ng/ml) zmieszano z COS7-IL-18BPa albo RPMI i dodano do ludzkich PBMC w obecności IL-12 (10 ng/ml).

(D) ludzką IL-18 (25 ng/ml) zmieszano z COS7-IL-18BPa albo RPMI i dodano do ludzkich komórek KG-1 w obecności TNF-α (20 ng/ml).

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dotyczy IL-18BP, które wiążą się z IL-18. Takie IL-18BP są zdolne do modulowania i/lub blokowania aktywności biologicznych IL-18. Określenie „IL-18BP” obejmuje dojrzałe białko (bez sekwencji sygnałowej), białko obejmujące sekwencje sygnałowe, muteiny IL-18BP oraz pochodne IL-18BP. W znaczeniu tu stosowanym określenie IL-18BP odnosi się także do wirusowych IL-18BP, postaci skróconych IL-18BP i wirusowych IL-18BP oraz ich soli.

Wynalazek dalej dotyczy zdolnych do replikacji nośników ekspresyjnych, przydatnych do ekspresji różnych IL-18BP w komórkach gospodarza albo bakteriach. Wynalazek dalej dotyczy wektorów ekspresyjnych, przydatnych do ekspresji różnych IL-18BP u ludzi i innych ssaków.

Wynalazek dalej dotyczy DNA kodujących różne IL-18BP. DNA mogą być genomowymi DNA, cDNA, syntetycznymi DNA, produktami PCR albo ich kombinacjami. DNA można, według wynalazku, wprowadzać do zdolnych do replikacji nośników w celu ekspresji różnych IL-18BP w komórce gospodarza. DNA zdolne do hybrydyzacji z powyższymi DNA w ostrych warunkach i kodujące białka albo polipeptydy, które są również zdolne do wiązania IL-18 są również niniejszym ujawnione.

Jeden z takich DNA koduje IL-18BP obejmujące sekwencję aminokwasową SEK. NR ID.: 10 i jest zaopatrzony w kodon stop na końcu 3'.

Wektory ekspresyjne, odpowiednie do ekspresji różnych IL-18BP u ludzi i innych ssaków, np. w terapii genowej, mogą być wirusowymi wektorami albo wektorami innego rodzaju, w których gen IL-18BP albo cDNA IL-18BP wprowadzono w sposób umożliwiający skuteczną ekspresję IL-18BP u ludzi i innych ssaków. Cząsteczki DNA hybrydyzujące z powyższymi DNA w ostrych warunkach i kodujące białka albo polipeptydy, które są zdolne do wiązania IL-18 są również niniejszym opisane.

Izolowanie IL-18BP można przeprowadzić według wynalazku, np. przez przepuszczanie płynu ustrojowego, np. moczu albo surowicy, przez kolumnę chromatograficzną z którą związana jest IL-18, a następnie eluowanie związanego IL-18BP.

Różne IL-18BP można również wytworzyć metodami rekombinacyjnymi, np. przez wyrażanie IL-18BP w odpowiednim gospodarzu, po funkcjonalnym połączeniu promotorów, wzmacniaczy ekspresji, sekwencji regulatorowych, itp. odpowiednich dla konkretnego zastosowanego gospodarza, które, np. umożliwiają ekspresję w prawidłowej orientacji.

Różne IL-18BP oraz wektory do ekspresji IL-18BP u ludzi i innych ssaków można zastosować w leczeniu i łagodzeniu stanów, z którymi związana jest IL-18 albo spowodowanych nadmiarem egzogennie podanej albo endogennie wytworzonej IL-18. Stanami takimi są np. choroby autoagresyjne, cukrzyca typu I, reumatoidalne zapalenie stawów, odrzucanie przeszczepu, choroba zapalna jelita grubego, posocznica, stwardnienie rozsiane, choroba niedokrwienna serca (w tym zawał serca), niedokrwienne uszkodzenie mózgu, przewlekłe zapalenie wątroby, łuszczyca, przewlekłe zapalenie trzustki, ostre zapalenie trzustki, itp.

Według wynalazku, IL-18BP wyizolowano z prawidłowego moczu ludzkiego przez chromatografię. Preparat nieoczyszczonych białek moczu, zatężonych z 500 l prawidłowego moczu ludzkiego, wprowadzono do kolumny zawierającej IL-18 sprzęgniętą z agarozą. Kolumnę płukano i eluowano związane białka przy niskim pH. Eluowane frakcje neutralizowano i analizowano porcjami przez SDS6

PL 206 070 B1

-PAGE (10% poliakrylamid) w warunkach nieredukujących i barwiąc srebrem. W eluowanych frakcjach uzyskano prążek białka wielkości około 40 kDa (fig. 1).

Białko około 40 kDa otrzymane w pierwszym etapie zidentyfikowano jako białko wiążące IL-18 przez jego zdolność do swoistego sieciowania ¹²⁵I-IL-18 (fig. 2). Białko około 40 kDa dalej charakteryzowano przez analizę sekwencji białkowej końca N. Porcje eluowanego białka poddano SDS-PAGE, elektrotransferowi na membranę PVDF i mikroanalizie sekwencji białkowej. Podobnie porcje eluowanego białka poddano bezpośredniej mikroanalizie sekwencji białka. W obu przypadkach, otrzymano dwie sekwencje polipeptydowe, sekwencję główną i sekwencję poboczną przy czym ta druga odpowiadała fragmentowi ludzkiej defensyny (numer dostępu p11398), rozpoczynającego się od aminokwasu 65. Odjęcie znanej sekwencji defensyny dostarczyło następującej sekwencji:

T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A 1 . . . 5 . . . .10 . .

w której x oznacza nieokreślony aminokwas.

W celu otrzymania dłuższej i bardziej dokładnej sekwencji, oraz w celu zidentyfikowania potencjalnych reszt cysteinowych, porcję eluowanej frakcji zredukowano DTT w warunkach denaturujących, poddano reakcji z 4-winylopirydyną wysolono przy użyciu urządzenia do mikroultrafiltracji (Ultrafree, ciężar odcięcia 10000 Da, Millipore) i poddano mikroanalizie sekwencji białka. Po 1 cyklu sekwencjonowania pozostałe białko poddano reakcji z o-ftalaldehydem w celu zablokowania wszystkich polipeptydów N-końcowych innych niż Pro i wznowiono sekwencjonowanie. W ten sposób otrzymano następującą pojedynczą sekwencję białka:

TPVSQXXXAA XASVRSTKDP CP3QPPVFPA AKQC?ALEVT 1 10 20 30 4C (T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser; Q=Gln; X=nieznany; A=Ala; R=Arg; K=Lys; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu).

Uzyskana sekwencja różni się zasadniczo od jakiegokolwiek znanego białka, co stwierdzono przez przeszukiwanie baz danych białek. Jednakże, w wyniku przeszukiwania bazy danych The Institute of Genomic Research (TIGR) (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov) przez program poszukujący tblastn otrzymano plik cDNA oznaczony THC123801, którego ramka odczytu (218 kodonów), po translacji zawierała sekwencję o znacznej homologii z sekwencją końca N sekwencji IL-18BP. Homologię przedstawiono poniżej:

.......T?VSQXXXAAXASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVT... 40 ϊ j i ΗΝπιπίϋΗίππιπίϋΐΗΠΐ

VTX.IVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQP P VFPAAKQCPALEVTWPfi 100 (górna sekwencja (1-40) jest sekwencją IL-18BP wyizolowanego według wynalazku; sekwencja dolna (51-100) jest wydedukowaną sekwencją po translacji cDNA pliku THC123801 TIGR).

Sekwencja cDNA zidentyfikowana jako THC123801 jest jednakże wyłącznie EST (znacznik sekwencji wyrażanej, ang. expressed sequence tag), tj. losowo wybranym klonem cDNA. Nigdy nie analizowano, czy ten EST zawiera otwartą ramkę odczytu, czy białko ulega ekspresji z genu odpowiadającego EST albo z samego EST, ani nie zidentyfikowano funkcji białka kodowanego przez THC123801. Nie jest dostępna żadna informacja, że THC123801 zawiera otwartą ramkę odczytu kodująca IL-18BP.

Oczyszczone przez powinowactwo IL-18BP z moczu zachowuje zdolność do wiązania swego znakowanego liganda (¹²⁵I-IL-18), zaś po sieciowaniu kowalencyjnym, tworzy się kompleks o ciężarze cząsteczkowym 58 kDa. Ciężar cząsteczkowy tego kompleksu odpowiada stosunkowi 1:1 IL-18BP o ciężarze około 40 kDa i IL-18 o ciężarze 19 kDa (fig. 2).

Oczyszczone przez powinowactwo IL-18BP blokuje aktywność biologiczną ludzkiej oraz mysiej IL-18. Tak więc, kiedy IL-18BP było dodane do ludzkiej albo mysiej IL-18 blokowało ono zdolność IL-18 do wywołania wytwarzania interferonu-γ przy dodaniu do hodowli mysich splenocytów razem z lipopolisacharydem (LPS) (fig. 3).

Dla celów niniejszego wynalazku, określenie „aktywność biologiczna IL-18” odnosi się między innymi do następujących właściwości biologicznych:

PL 206 070 B1 (i) indukowania IFN-γ, głównie jako ko-stymulator z mitogenami, IL-1, IL-2, TNF-α, LPS w różnych rodzajach komórek, takich jak komórki jednojądrzaste, mysie splenocyty, ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej, ludzkie komórki linii KG-1 i limfocyty T;

(ii) zwiększania proliferacji limfocytów T;

(iii) wzmacniania wytwarzania cytokin Th1 in vitro, głównie jako ko-stymulator;

(iv) synergizmu z IL-12 w odniesieniu do zwiększonego wytwarzania IFN-γ, działania ko-stymulującego wytwarzanie IFN-γ i innych cytokin limfocytów T pomocniczych typu 1;

(v) działania ko-stymulującego cytotoksyczność zależną od liganda FAS w klonach mysich komórek naturalnych zabójców;

(vi) indukowania aktywacji NK-kB w ludzkich komórkach KG-1, prawdopodobnie przez indukowanie tworzenia homodimeru p50 NF-kB, oraz heterodimeru p65/p50 NF-kB;

(vii) indukowania IL-8.

W znaczeniu tu stosowanym określenie „wiązanie IL-18” oznacza zdolność IL-18BP do wiązania IL-18, np. jak wskazano w przykładzie 2 przez wiązanie wyznakowanego IL-18 przez oczyszczony przez powinowactwo IL-18BP.

W znaczeniu tu stosowanym, określenie „modulowanie aktywności IL-18 oznacza zdolność IL-18BP do modulowania aktywności IL-18 w sposób inny niż blokowanie, np. przez częściowe zahamowanie, wzmocnienie, itp.

W znaczeniu tu stosowanym, określenie „blokowanie aktywności IL-18” dotyczy aktywności IL-18BP blokującej przynajmniej jedną z wyżej opisanych aktywności biologicznych IL-18. Aktywność blokująca IL-18 jest zilustrowana przykładowo przez zdolność IL-18BP do blokowania związanej z IL-18 ekspresji IFN-γ w mysich splenocytach. Jak to będzie pokazane niżej w sposób szczegółowy, modulowanie albo blokowanie aktywności IL-18BP jest częściowo spowodowane faktem, że IL-18BP hamuje aktywację NF-kB przez IL-18. Ponadto, IL-18BP blokuje przynajmniej jedną z następujących aktywności IL-18: indukowanie IFN-γ w komórkach ludzkich i mysich, indukowanie IL-8 i aktywacja NF-kB.

Sondę DNA do badania przesiewowego bibliotek cDNA wyizolowano przez PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) ze swoistymi starterami sensownymi i antysensownymi oraz RNA z ludzkich limfocytów T Jurkat, ze starterami z sekwencji TIGR. Powstały produkt PCR potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Produkt PCR znakowano ³²P i zastosowano jako sondę do badania przesiewowego ludzkich bibliotek cDNA, pochodzących z monocytów krwi obwodowej, linii limfocytów T Jurkat, z PBMC oraz ze śledziony ludzkiej. Różne niezależne klony cDNA odpowiadały czterem wariantom składania transkryptu IL-18BP (SEK. NR ID.:1, 3, 5 i 7). Wszystkie warianty składania kodowały domniemane rozpuszczalne białko wydzielnicze. Najpowszechniejsze (IL-18BPa) miało otwartą ramkę odczytu długości 192 kodonów, kodując peptyd sygnałowy, określany czasem jako „sekwencja liderowa” długości 28 reszt aminokwasowych, po którym następowało dojrzale domniemane IL-18BPa, którego pierwszych 40 aminokwasów odpowiadało dokładnie sekwencji białka końca N IL-18BP z moczu (SEK. NR ID.:2). Pozycja reszt cysteinowych wskazywała, że polipeptyd ten należy do nadrodziny immunoglobulinowej (Ig). Co ciekawe, każda z czterech reszt Gln z dojrzałego IL-18BPa była potencjalnym miejscem glikozylacji N. Trzy inne warianty IL-18BP były mniej rozpowszechnione niż IL-18BPa. Obejmowały one krótszy 1 kb cDNA IL-18BPb, kodujący peptyd sygnałowy długości 28 reszt aminokwasowych, po których następowało dojrzałe białko długości 85 reszt aminokwasowych (SEK. NR ID.:4). Trzeci wariant, IL-18BPc występował jako cDNA 2,3 kb, kodując 28 aminokwasów peptydu sygnałowego oraz dojrzałą sekwencję IL-18BP o długości 169 reszt aminokwasowych (SEK. NR ID.:6). Czwarty wariant, IL-18BPd kodował peptyd sygnałowy długości 28 reszt aminokwasowych, a następnie dojrzałe IL-18BP długości 133 reszt aminokwasowych (SEK NR ID.:8).

Aby dalej zbadać możliwość występowania dodatkowych wariantów składania II-18BP, przeprowadzono badanie przesiewowe ludzkiej biblioteki genomowej sondą odpowiadającą cDNA IL-18BP pełnej długości. W bibliotece tej zidentyfikowano pięć klonów genomowych różniących się długością. Klony te poddano analizie sekwencji DNA przy użyciu starterów zewnętrznych i wewnętrznych. Podsumowując, z klonów tych złożono sekwencję 7,8 kb (SEK. NR ID.: 9). W sekwencji tej nie stwierdzono egzonu kodującego receptor przezbłonowy (TM). Wszystkie warianty miały wspólne miejsce startu translacji, kodowały ten sam peptyd długości 28 reszt aminokwasowych i rozpuszczalne dojrzałe białka o różnych wielkościach i różnych sekwencjach końca C. Locus IL-18BP zawierał dodatkowy gen, kodujący jądrowe białko 1 aparatu mitotycznego (NUMA1, ang. nuclear mitotic apparatus protein 1), położony na nici antysensownej. Ujawnienie to zlokalizowało gen IL-18BP na ludzkim chromosomie 11q13 (36).

PL 206 070 B1

Przeprowadzono poszukiwanie homologii, przy użyciu kompletnej sekwencji białkowej IL-18BP i bazy danych GenPept (http//:www.ncbi.nlm.nih.gov), stosując algorytm Smitha-Watermanna. Stwierdzono, że homologi IL-18BP ulegają ekspresji w kilku wirusach ospy, jako białka wydzielnicze o uprzednio nieznanej funkcji. Uprzednio opisano, że wirusy kodują różne receptory cytokin oraz, że takie cząsteczki kodowane przez wirusy służą jako receptory wabikowe, które hamują reakcję odpornościową przez neutralizację odpowiednich cytokin (opisane przez Spriggs, 1994, Curr. Opin. Immunol. 6:526-529). Stąd, niniejszym opisano homologi IL-18BP kodowane przez wirusy, które mogą służyć jako blokery albo modulatory aktywności biologicznej IL-18. Przykłady homologów IL-18BP kodowanych przez wirusy dostarczono w tabeli 1.

Homologi IL-18BP kodowane przez wirusy mogą ulegać ekspresji w komórkach prokariotycznych albo eukariotycznych gospodarzy. W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „homolog IL-18BP kodowany przez wirusy” dotyczy podobieństwa wynoszącego przynajmniej 50% na długości przynajmniej 70 reszt aminokwasowych. Korzystnie, podobieństwo wynosi przynajmniej 50%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80% albo, korzystnie przynajmniej 90% na długości 100 reszt aminokwasowych.

T a b e l a 1

Białka kodowane przez wirusy, wykazujące wysoką homologię z ludzkim IL-18BP

Sekwencja GenPept	Rodzaj wirusa
MCU60315_54	wirus mięczaka zakaźnego podtyp 1 U61315
MCU60316_53	wirus mięczaka zakaźnego podtyp 1 U61315
SWPHLSB_12	wirus ospy świńskiej L22013
CV41KBPL_14	wirus ospy krowiej
VVCGAA_5	wirus ospy
U01161_3174	wirus ektromelii (mysi wirus ospy)
VVU18340_6	wirus ospy
VVU18338_7	wirus ospy
VVU18337_7	wirus ospy
VARCG_7173	wirus ospy
MCU60315_51	wirus mięczaka zakaźnego
HNABV_1	nowy wirus towarzyszący zapaleniu wątroby nie A nie B

IL-18BPa wyrażono w małpich komórkach COS7. W tym celu, cDNA IL-18BPa wprowadzono do ssaczego wektora ekspresji pEF-BOS. Na końcu 3' ORF IL-18BPa dodano w tej samej ramce kasetę z sekwencją kodującą (His)6, w celu ułatwienia oczyszczania rekombinowanego białka. Komórki COS7 transfekowano przejściowo wektorem ekspresji i bezsurowiczą pożywkę tych komórek (150 ml) zatężano i oczyszczano przez chromatografię chelatacyjną. IL-18BPa stanowiło pojedynczy prążek w SDS-PAGE z barwieniem srebrem w warunkach redukują cych i nieredukujących, oraz miało ten sam ciężar cząsteczkowy co IL-18BP z moczu. Analiza sekwencji tego preparatu wykazała tę samą sekwencję końca N co IL-18BP z moczu. Analiza immunologiczna IL-18BPa z przeciwciałami wywołanymi przeciwko IL-18BP z moczu wykazała prążek o ciężarze cząsteczkowym, takim jak białko z moczu. Ponadto, stosując immunoprecypitację, a następnie SDS-PAGE oraz autoradiografię IL-18BPa

125 było w stanie wyprzeć ¹²⁵I-IL-18BP z moczu z wiązania z przeciwciałem. Stąd, IL-18BPa odpowiada strukturalnie IL-18BP izolowanej z moczu.

Surowe i oczyszczone IL-18BPa badano pod kątem ich zdolności do hamowania aktywności biologicznej IL-18. IL-18BPa hamowało aktywność ludzkiej i mysiej IL-18 w splenocytach mysich, PBMC i ludzkiej linii komórek KG-1 (fig. 9). Wyniki te potwierdzają toż samość klonów cDNA IL-18BPa jako kodujących aktywne IL-18BP.

PL 206 070 B1

Dalej opisano muteiny IL-18BP oraz białka fuzyjne obejmujące IL-18BP typu dzikiego albo ich muteiny i ich fragmenty, poddane fuzji z innymi polipeptydami albo białkami i zdolne do wiązania IL-18 oraz blokowania indukowanego przez IL-18 wytwarzania IFN-γ.

W znaczeniu tu stosowanym, określenie „luteina” dotyczy analogów IL-18BP, w których jedną albo więcej reszt aminokwasowych naturalnej IL-18BP zastąpiono różnymi resztami aminokwasowymi, albo usunięto, albo dodano jedną albo wiele reszt aminokwasowych do naturalnej sekwencji IL-18BP, albo wirusowej IL-18BP, bez istotnej zmiany zdolności powstałych produktów w porównaniu z IL-18BP typu dzikiego albo wirusowym IL-18BP do wiązania IL-18. Muteiny te wytwarza się znanymi technikami syntezy i/lub techniką kierowanej mutagenezy, albo dowolną inną odpowiednią techniką.

Każda taka muteina korzystnie ma sekwencję aminokwasową odpowiednio odpowiadającą IL-18BP, albo wirusowej IL-18BP, i wykazuje zasadniczo podobną aktywność do IL-18BP. Jedną z aktywności IL-18BP jest zdolność do wiązania IL-18. Tak długo jak muteina ma zasadniczą zdolność wiązania IL-18, może być stosowana do oczyszczania IL-18, jak np. przy pomocy chromatografii powinowactwa, i może być uważana za posiadającą zasadniczo podobną aktywność do IL-18BP. Tak więc, można określić czy dana muteina ma zasadniczo tę samą aktywność co IL-18BP przy użyciu rutynowych doświadczeń obejmujących poddawanie takiej muteiny, np. prostemu, kompetycyjnemu testowi kanapkowemu w celu określenia, czy wiąże się, czy nie z odpowiednio znakowaną IL-18, jak np. w teście radioimmunologicznym albo ELISA.

Taka muteina ma przynajmniej 90% identyczność albo homologię.

Muteiny polipeptydów IL-18BP, które można zastosować w rozwiązaniach według wynalazku, albo kodujący je kwas nukleinowy, obejmują skończony zestaw zasadniczo odpowiadających sekwencji, jako peptydy albo polinukleotydy substytucyjne, które specjalista w dziedzinie może rutynowo otrzymać, bez zbędnego eksperymentowania, w oparciu o zawarte tu ujawnienie i wskazówki. Szczegółowy opis chemii i budowy białek przedstawiono w Schulz i in., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, Freeman & Co., San Francisco, 1983. Zastąpienia sekwencji nukleotydowej, na przykład preferencje kodonów opisano w Ausubel i in., § A.1.1-A.1.24 oraz Sambrook i in., wyżej, Dodatek C i D.

Korzystne zmiany dla mutein znane są pod nazwą zastąpień „konserwatywnych”. Konserwatywne zastąpienia aminokwasowe w polipeptydach albo białkach IL-18BP mogą obejmować synonimiczne aminokwasy, w grupie o zasadniczo podobnych właściwościach fizyko-chemicznych, tak, że zastąpienie pomiędzy członkami grupy zachowuje działanie biologiczne cząsteczki, Grantham, Science, 185:862-864 (1974). Wiadomo, że wprowadzanie i usuwanie aminokwasów można również przeprowadzić w wyżej określonych sekwencjach bez zmiany ich funkcji, szczególnie gdy insercje albo delecje obejmują jedynie kilka aminokwasów, np. poniżej 30, zaś korzystnie poniżej 10, i nie usuwają albo zastępują aminokwasów kluczowych dla konformacji czynnościowej, np. reszt cysteinowych, Anfinsen, Principles That Govern The Folding of Protein Chains, Science, 181:223-230 (1973).

Jednakże, reszty cysteinowe, które nie są konieczne do aktywności biologicznej można zastąpić innymi resztami, np. w celu uniknięcia tworzenia się niepożądanych wewnątrz- albo międzycząsteczkowych mostków disiarczkowych, które mogą spowodować redukcję aktywności IL-18BP.

Korzystnie grupy aminokwasów synonimicznych podane są w tabeli I. Korzystniejsze grupy aminokwasów synonimicznych podane są w tabeli II, zaś najkorzystniejsze grupy aminokwasów synonimicznych podane są w tabeli III.

T a b e l a I

Korzystne grupy aminokwasów synonimicznych

Aminokwas	Grupa synonimiczna
1	2
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

PL 206 070 B1 cd. tabeli I

1	2
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn	Gln, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met	Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp	Trp

T a b e l a II

Bardziej korzystne grupy aminokwasów synonimicznych

Aminokwas	Grupa synonimiczna
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gln, Arg
Gln	Glu, Gln, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gln
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp

T a b e l a III

Najkorzystniejsze grupy aminokwasów synonimicznych

Aminokwas	Grupa synonimiczna
1	2
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met

PL 206 070 B1 cd. tabeli III

1	2
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Cys	Cys, Ser
His	His
Gln	Gln
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Met

Przykładowe metody wprowadzania zastąpień aminokwasowych w białkach, które można zastosować w celu otrzymania mutein polipeptydów albo białek IL-18BP, obejmują dowolną metodę, taką jak przedstawiona w patentach USA nr RE 33653, 4959314, 4588585 i 4737462, Mark i in.; 5116943, Koths i in.; 4965195, Namen i in.; 4879111, Chong i in.; oraz 5017691, Lee i in.; oraz białka podstawione lizyną, przedstawione w patencie USA nr 4904584 (Shaw i in.).

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku, dowolna muteina IL-18BP ma sekwencję aminokwasową zasadniczo odpowiadającą sekwencji IL-18BP. W znaczeniu tu zastosowanym, określenie „zasadniczo odpowiadająca” oznacza białka z niewielkimi zmianami sekwencji naturalnego białka, które nie wpływają na zasadniczą charakterystykę naturalnych białek, szczególnie w odniesieniu do ich zdolności wiązania IL-18. Rodzaj zmian, które są generalnie uważane za wchodzące w zakres określenia „zasadniczo odpowiadających” obejmuje takie, które wynikają z konwencjonalnych technik mutagenezy DNA kodującego te białka, powodujące niewielkie zmiany, oraz badanie przesiewowe w kierunku pożądanej aktywności w sposób omówiony powyżej. Oprócz wiązania IL-18, muteiny mogą również modulować i/lub blokować aktywność IL-18.

Muteiny obejmują białka kodowane przez kwas nukleinowy, taki jak DNA albo RNA, który hybrydyzuje z DNA albo RNA kodującymi IL-18BP w ostrych warunkach. Opisany niniejszym kwas nukleinowy jest również przydatny jako sonda do identyfikacji i oczyszczania pożądanego kwasu nukleinowego. Ponadto, taki kwas nukleinowy może być głównym kandydatem do określenia, czy koduje on polipeptyd, który zachowuje aktywność funkcjonalną IL-18BP według wynalazku. Określenie „ostre warunki” dotyczy warunków hybrydyzacji i następującego po niej płukania, które specjaliści w dziedzinie określają jako „ostre”. Patrz Ausubel i in., wyżej, § 6.3 i 6.4 (1987, 1992) oraz Sambrook i in., wyżej. Przykłady ostrych warunków obejmują nieograniczająco warunki płukania 12-20°C poniżej obliczonej wartości Tm badanej hybrydy, np. 2xSSC i 0,5% SDS przez 5 minut, 2xSSC i 0,1% SDS przez 15 minut, 0,1xSSC i 0,5% SDS w 37°C przez 30 - 60 minut, a następnie 0,1xSSC i 0,5% SDS w 68°C przez 30 - 60 minut. Specjaliści zrozumieją że warunki ostrości również zależą od długości sekwencji DNA, sond oligonukleotydowych (np. obejmujących 10-40 zasad) albo mieszanych sond oligonukleotydowych. Jeżeli stosuje się mieszane sondy, korzystne jest zastosowanie chlorku tetrametyloamonowego (TMAC) zamiast SSC, patrz, Ausubel, wyżej.

Wynalazek dalej obejmuje kwasy nukleinowe, które kodują IL-18BP według wynalazku, ale które różnią się sekwencją kodonów z powodu degeneracji kodu genetycznego. Takie DNA, które prawdopodobnie nie hybrydyzują w ostrych warunkach z sekwencjami DNA przedstawionymi na fig. 4 - 7, ale są zdolne do kodowania IL-18BP według wynalazku stanowią również rozwiązanie według wynalazku.

PL 206 070 B1

Określenie „białko fuzyjne” dotyczy polipeptydu obejmującego IL-18BP albo jego muteinę, poddanego fuzji z innym białkiem, które np. ma wydłużony okres przebywania w płynach ustrojowych. IL-18BP można więc poddać fuzji z innym białkiem, polipeptydem, itp., np. immunoglobuliną albo jej fragmentem. Może być również poddane fuzji z poliglikolem etylenowym (PEG) w celu wydłużenia okresu trwania.

Określenie „sole” dotyczy zarówno soli grup karboksylowych, jak i soli addycyjnych kwasów z grupami aminowymi IL-18BP, mutein, albo ich białek fuzyjnych. Sole grup karboksylowych można wytwarzać znanymi sposobami i obejmują one sole nieorganiczne, przykładowo, sole sodowe, wapniowe, amonowe, żelazowe albo cynkowe, itp., oraz sole zasad organicznych, przykładowo z aminami, takimi jak trietanoloamina, arginina albo lizyna, piperydyna, prokaina, itp. Sole addycyjne kwasów obejmują przykładowo, sole kwasów mineralnych, takich jak, przykładowo kwas chlorowodorowy lub siarkowy, oraz sole kwasów organicznych, takich jak kwas octowy albo kwas szczawiowy. Oczywiście każda taka sól musi mieć zasadniczo taką samą aktywność co IL-18BP.

„Chemicznie modyfikowane pochodne” w znaczeniu tu stosowanym, oznaczają pochodne IL-18BP oraz ich muteiny i białka fuzyjne, które można wytworzyć np. z grup funkcyjnych, które występują w łańcuchach bocznych reszty albo grup końca N albo C, znanymi sposobami, i objęte są wynalazkiem, tak długo, jak pozostają dopuszczalne farmaceutycznie, tj. nie niszczą aktywności białka, która jest zasadniczo podobna do aktywności IL-18BP i nie nadają właściwości toksycznych zawierającej je kompozycji. Pochodne te mogą przykładowo, obejmować łańcuchy boczne poliglikolu etylenowego, które mogą maskować miejsca antygenowe i wydłużać okres przebywania IL-18BP w płynach ustrojowych. Inne pochodne obejmują alifatyczne estry grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych, przez reakcję z amoniakiem albo aminami pierwszo- albo drugorzędowymi, pochodne N-acylowe wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych utworzone z grupami acylowymi (np. grupami alkanoilowymi albo karbocyklicznymi aroilowymi) albo pochodne O-acylowe wolnych grup hydroksylowych (przykładowo reszt serylowych albo treonylowych) utworzone z grupami acylowymi.

Określenie „pochodne kołowo permutowane” w znaczeniu tu stosowanym oznacza liniową cząsteczkę, której końce połączono ze sobą bezpośrednio albo przez łącznik, tworząc cząsteczkę kołową po czym cząsteczkę otworzono w innym położeniu tworząc nową cząsteczkę liniową o końcach innych niż końce w oryginalnej cząsteczce. Kołowe permutacje obejmują takie cząsteczki, których struktura jest równoważna z cząsteczką którą przekształcano w cząsteczkę kolistą a następnie otworzono. Tak więc, cząsteczkę permutowaną kołowo można syntetyzować de novo jako cząsteczkę liniową bez przeprowadzania etapu przekształcania w cząsteczkę kolistą i otwierania. Wytwarzanie pochodnych permutowanych kołowo opisano w WO 95/27732.

Różne komórki rekombinowane, takie jak komórki prokariotyczne, np. E. coli albo inne komórki eukariotyczne, takie jak drożdże albo komórki owadzie mogą wytwarzać IL-18BP. Sposoby konstruowania odpowiednich wektorów, niosących DNA, który koduje IL-18BP i odpowiednie transformowanie (np. komórek E. coli, ssaczych albo drożdżowych) albo zakażanie komórek owadzich w celu wytwarzania rekombinowanego IL-18BP są dobrze znane. Patrz, przykładowo Ausubel i in., red., „Current Protocols in Molecular Biology”, Current Protocols, 1993; Sambrook i in., red., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Press, 1989.

Aby wyrażać białka IL-18BP, DNA kodujący IL-18BP, ich fragmenty, muteiny albo białka fuzyjne, oraz połączone funkcjonalnie sygnały regulacji transkrypcji i translacji wprowadza się do wektorów, które są zdolne do integrowania pożądanych sekwencji genów z chromosomem komórki gospodarza. W celu umożliwienia selekcji komórek, które stabilnie zintegrowały wprowadzony DNA do ich chromosomów, stosuje się jeden albo więcej znaczników, które umożliwiają selekcjonowanie komórek gospodarza zawierającego wektor ekspresyjny. Znacznik może zapewniać prototrofię gospodarzowi auksotroficznemu, oporność na substancję bójczą np. antybiotyki, albo odporność na metale ciężkie, jak miedź itp. Gen znacznika umożliwiającego selekcję można połączyć bezpośrednio z sekwencjami DNA genu, który ma być wyrażony, albo wprowadzić do tej samej komórki przez równoczesną transfekcję. Do optymalnej syntezy mRNA jednołańcuchowego białka wiążącego mogą być konieczne dodatkowe elementy. Elementy te obejmują sygnały składania, jak również promotory, wzmacniacze i sygnały terminacji transkrypcji.

Cząsteczka DNA do wprowadzania do wybranych komórek korzystnie będzie włączona do wektora plazmidowego albo wirusowego zdolnego do autonomicznej replikacji w organizmie gospodarza. Korzystnymi plazmidami prokariotycznymi są pochodne pBR322. Korzystne wektory eukariotyczne obejmują BPV, krowiankę, SV40, kołowy 2-μ itd., albo ich pochodne. Plazmidy takie i wektory są dobrze znane (2-5, 22). Po wytworzeniu wektora albo sekwencji DNA zawierającej konstrukt do ekspresji, wektor ekspresyjny można wprowadzić do odpowiedniej komórki gospodarza dowolnym spośród znaPL 206 070 B1 nych sposobów, takich jak transformacja, transfekcja, lipofekcja, koniugacja, fuzja protoplastu, elektroporacja, precypitacja fosforanem wapnia, bezpośrednie mikrowstrzyknięcie, itp.

Komórki gospodarza do zastosowania według wynalazku mogą obejmować komórki prokariotyczne albo eukariotyczne. Korzystnymi komórkami prokariotycznymi są E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia itp., Najkorzystniejszym gospodarzem prokariotycznym jest E. coli. Szczególnie interesujące szczepy gospodarzy bakteryjnych obejmują np. szczep 249 K12 E. coli (ATCC 31446); X1776 E. coli (ATCC 31537), W3110 E. coli (F-, lambda-, fototropowy (ATCC 27325)). W takich warunkach, białko nie będzie glikozylowane. Gospodarze eukariotyczni muszą być zgodni z sekwencjami replikona i sekwencjami kontrolującymi w plazmidzie ekspresyjnym.

Jednakże, ponieważ naturalne IL-18BP są białkami glikozylowanymi, gospodarze eukariotyczni są korzystniejsi niż prokariotyczni. Korzystnymi gospodarzami eukariotycznymi są komórki ssacze, np. komórki ludzkie, małpie, mysie i jajnika chomika chińskiego (CHO), ponieważ zapewniają modyfikację potranslacyjną cząsteczek białka, w tym prawidłowe fałdowanie, prawidłowe tworzenie mostków disiarczkowych, jak również glikozylację w prawidłowych miejscach. Również komórki drożdży i owadów mogą przeprowadzać modyfikację potranslacyjną peptydu, w tym glikozylację mannozą.

Istnieje wiele strategii rekombinacji DNA, które wykorzystują sekwencje silnych promotorów, oraz plazmidy o licznych kopiach, które można wykorzystać do wytwarzania białka w drożdżach i komórkach owadów. Komórki drożdży i owadów potrafią rozpoznawać sekwencje liderowe na klonowanych produktach genów ssaczych i wydzielają dojrzałe białko IL-18BP. Po wprowadzeniu wektora, komórki gospodarza hoduje się na wybiórczym podłożu, które selekcjonuje wzrost komórek zawierających wektor. Ekspresja klonowanej sekwencji genu powoduje wytwarzanie IL-18BP, ich białek fuzyjnych albo mutein albo fragmentów. Wyżej wspomniane klonowanie, izolowanie genu, identyfikacja, charakteryzowanie i sekwencjonowanie przeprowadza się jak to opisano bardziej szczegółowo w przykładach.

Wyrażane białka izoluje się i oczyszcza konwencjonalnymi procedurami obejmującymi ekstrakcję, precypitację, chromatografię, elektroforezę itp., albo przez chromatografię powinowactwa, stosując przeciwciała przeciwko IL-18BP unieruchomione na matrycy żelowej w kolumnie. Surowe preparaty zawierające rekombinowane IL-18BP przepuszcza się przez kolumnę, w której IL-18BP wiąże się ze swoistym przeciwciałem, podczas gdy zanieczyszczenia przepływają. Po przepłukaniu, białko eluuje się z żelu w warunkach zwykle stosowanych w tym celu, tj. wysokim albo niskim pH np. pH 11 albo pH 2.

Wynalazek dalej dotyczy wektorów przydatnych do ekspresji IL-18BP albo ich pochodnych u ssaków, zaś szczególnie u ludzi. Wektory do krótko- albo długotrwałej ekspresji genów u ssaków są znane z literatury. Badania wykazały, że dostarczanie genów do, np., mięśni szkieletowych, mięśniówki gładkiej naczyń i wątroby umożliwia układowe utrzymanie poziomu białka terapeutycznego w organizmie. Mięśnie szkieletowe są przydatnym celem z powodu swojej znacznej masy, unaczynienia i dostępności. Jednakże, zastosowano również z powodzeniem inne cele, zaś w szczególności komórki prekursorowe układu odpornościowego w szpiku. Obecnie dostępne wektory do ekspresji białek, np. do mięśni obejmują plazmidowy DNA, liposomy, koniugaty białka z DNA i wektory oparte na adenowirusie, wirusie towarzyszącym adenowirusom oraz wirusach opryszczki. Wśród nich, wektory oparte na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV) są najskuteczniejsze ze względu na długotrwałość i poziom ekspresji genów, oraz bezpieczeństwo (Kessler, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14082-14087).

Procedury konstruowania wektorów opartych na AAV opisano szczegółowo (Snyder i in., 1996, Current Protocols in Human Genetics, rozdz. 12.1.1-12.1.17, John Willey & Sons). Pokrótce, plazmid psub201, zawierający genom AAV typu dzikiego tnie się enzymem restrykcyjnym Xbal i poddaje ligacji z konstruktem obejmującym wydajny promotor eukariotyczny, np. promotor wirusa cytomegalii, sekwencję zgodności Kozaka, sekwencję DNA kodującą IL-18BP albo wirusowe IL-18BP albo ich muteiny albo białka fuzyjne albo fragmenty, odpowiedni region 3' nie ulegający translacji oraz sygnał poliadenylacji, np. sygnał poliadenylacji małpiego wirusa 40. Powstały rekombinowany plazmid współtransfekuje się z plazmidem pomocniczym AAV, np. pAAVAd do komórek ssaczych, np. ludzkich komórek T293. Następnie, hodowle zakaża się adenowirusem jako wirusem pomocniczym i zbiera się nadsącz po 48 - 60 godzinach. Nadsącz frakcjonuje się przez precypitację siarczanem magnezu, oczyszcza na gradiencie ScCl, dializuje i podgrzewa do 56°C w celu zniszczenia adenowirusa, podczas gdy powstały rekombinowany AAV, zdolny do ekspresji IL-18BP albo ich mutein albo białek fuzyjnych pozostaje stabilny w tym etapie.

Jak dotąd, nie ustalono fizjologicznej roli rozpuszczalnych receptorów cytokin. Rozpuszczalne receptory wiążą się z ich swoistymi ligandami i w większości przypadków hamują ich aktywność biologiczną, co wykazano, np. w układzie TNF (11, 12). W niewielu przypadkach, np. IL-6, rozpuszczalny receptor zwiększa aktywność biologiczną. Rekombinowany rozpuszczalny receptor TNF, znany również

PL 206 070 B1 jako TBP (białko wiążące TNF) zapobiega wstrząsowi septycznemu na modelu zwierzęcym, podczas gdy rozpuszczalne postaci receptora IL-1 wywierają silny wpływ na rozwój alloreaktywności in vivo u mysich biorców przeszczepów allogenicznych.

Podobnie, IL-18BP według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie jako modulatory aktywności IL-18, np. w cukrzycy typu 1, w posocznicy, chorobach autoagresyjnych, odrzucaniu przeszczepu, reumatoidalnym zapaleniu stawów, chorobie zapalnej jelita grubego, posocznicy, stwardnieniu rozsianym, chorobie niedokrwiennej serca, w tym w ostrym zawale serca, chorobie niedokrwiennej mózgu, przewlekłym lub ostrym zapaleniu wątroby, łuszczycy, przewlekłym i ostrym zapaleniu trzustki. Można je zastosować np. w dowolnej chorobie, w której endogenna produkcja albo egzogenne podanie IL-18 wywołuje chorobę albo zaostrza sytuację pacjenta.

Wynalazek dalej dotyczy kompozycji farmaceutycznej obejmującej dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i IL-18BP albo ich aktywne muteiny, białka fuzyjne i ich sole albo chemicznie modyfikowane pochodne według wynalazku.

Wynalazek dalej dotyczy kompozycji farmaceutycznych obejmujących dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i DNA kodujący IL-18BP, np. wektor wirusowy, taki jak jeden z wektorów wirusowych opartych na AAV albo innych wektorów wyrażających IL-18BP albo ich aktywne muteiny, białka fuzyjne i ich sole, chemicznie modyfikowane pochodne przydatne do podawania ludziom i innym ssakom w celu wyrażania IL-18BP albo ich aktywnych mutein, białek fuzyjnych i ich soli, chemicznie modyfikowane pochodne, tj. do zastosowania w terapii genowej.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku wytwarza się do podawania przez zmieszanie IL-18BP, albo ich pochodnych albo wektorów do ich wyrażania z dopuszczalnymi farmaceutycznie nośnikami i/lub stabilizatorami i/lub zaróbkami z wytworzeniem postaci dawkowania, np. przez liofilizację we fiolkach. Podawanie można przeprowadzić dowolnym dopuszczalnym sposobem dla podobnych czynników, np. dożylnie, domięśniowo, podskórnie, miejscowo albo w ciągłym wlewie, itp. i sposób podawania zależeć będzie od leczonego stanu. Ilość składnika czynnego do podawania zależeć będzie od drogi podawania, leczonej choroby oraz stanu pacjenta. Wstrzyknięcie miejscowe, przykładowo, wymagać będzie niższej dawki białka w przeliczeniu na ciężar ciała niż wlew dożylny.

Tak więc, IL-18BP albo wektory wyrażające je in vivo są przeznaczone do leczenia chorób autoagresyjnych, cukrzycy typu 1, posocznicy, odrzucania przeszczepu, reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby zapalnej jelita grubego, stwardnienia rozsianego, choroby niedokrwiennej serca, w tym ostrego zawału serca, choroby niedokrwiennej mózgu, przewlekłego zapalenia wątroby, łuszczycy, przewlekłego i ostrego zapalenia wątroby, przewlekłego i ostrego zapalenia trzustki, oraz podobnych chorób, w których występuje zaburzona ekspresja IL-18, prowadząca do nadmiaru IL-18 albo w przypadkach komplikacji spowodowanych egzogennie podaną IL-18.

Wynalazek obejmuje również przeciwciała przeciwko IL-18BP. Określenie „przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklonalne (mAb), przeciwciała chimeryczne, przeciwciała antyidiotypowe (anty-Id) przeciwko przeciwciałom, które można znakować w postaci rozpuszczalnej i związanej oraz przeciwciała humanizowane, jak również ich fragmenty uzyskane dowolnym sposobem, jak np. przez cięcie enzymatyczne, syntezę peptydową albo techniką rekombinacji.

Przeciwciała poliklonalne są heterogenną populacją cząsteczek przeciwciał pochodzących z surowic zwierząt immunizowanych antygenem. Przeciwciało monoklonalne zawiera zasadniczo homogenną populację przeciwciał przeciwko antygenowi, która zawiera zasadniczo podobne miejsca wiązania epitopu. mAb można otrzymać sposobami znanymi specjalistom, patrz, przykładowo, Kohler i Milstein, Nature 256:495-497 (1975); patent USA nr 4,376,110; Ausubel i in., wyd. wyżej, Halow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); i Colligan i in., wyd. Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. i Wiley Interscience, NY (1992, 1993). Przeciwciała takie mogą należeć do dowolnej klasy immunoglobulinami, w tym IgG, IgM, IgE, IgA, GILD oraz do ich dowolnej podklasy. Hybrydoma wytwarzającą mAb według wynalazku można hodować in vitro, in situ albo in vivo. Wytwarzanie wysokich mian mAb in vivo albo in situ czyni je korzystnymi sposobami wytwarzania.

Przeciwciała chimeryczne są cząsteczkami, których różne części pochodzą od różnych gatunków zwierząt, np. region zmienny pochodzi z mAb myszy, zaś region stały z immunoglobuliny ludzkiej. Przeciwciała chimeryczne są stosowane głównie w celu zmniejszenia immunogenności podczas stosowania oraz w celu zwiększenia wydajności wytwarzania. Przykładowo, gdy mysie mAb są wytwarzane z większą wydajnością przez hybrydoma, ale są znacznie bardziej immunogenne u ludzi, stosuje się chimeryczne mAb ludzko/mysie. Przeciwciała chimeryczne i sposoby ich wytwarzania są znane (Cabilly i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA

PL 206 070 B1

81:6851-6855 (1984); Boulianne i in., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly i in., EPA 125023 (opublikowane 14 listopada, 1984); Neuberger i in., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi i in., EPA 171496 (opublikowane 19 lutego, 1985); Morrison i in., EPA 173494 (opublikowane marzec, 1985); Neuberger i in., PCT WO 86/01533 (opublikowane 13 marca, 1986); Kudo i in., EPA 184187 (opublikowane 11 czerwca, 1986); Morrison i in., EPA 173494 (opublikowane 5 marca, 1986); Sahagan i in., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson i in., WO 97/02671 (opublikowane 7 maja, 1987); Liu i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better i in., Science 240:1041-1043 (1988); i Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, wyż ej.

Przeciwciało antyidiotypowe (anty-Id) jest przeciwciałem, które rozpoznaje unikatowe determinanty, zasadniczo związane z miejscem wiązania antygenu przeciwciała. Przeciwciało antyidiotypowe można wytworzyć przez immunizowanie zwierzęcia tego samego gatunku i rodzaju genetycznego (np. szczepu myszy) co źródło mAb, przy użyciu mAb. Immunizowane zwierzę rozpoznaje i reaguje na determinantę przeciwciała stosowanego do immunizacji wytwarzając przeciwciała wobec tych idiotypowych determinant (przeciwciało anty-Id). Patrz, przykładowo, patent USA nr 4699880.

Przeciwciała anty-Id można również zastosować jako „immunogen” w celu immunizowania jeszcze innego zwierzęcia, wytwarzając tzw. przeciwciała anty-anty-Id. Przeciwciało anty-anty-Id jest epitopowo identyczne z oryginalnym mAb, które indukowało anty-Id. Tak więc, przez zastosowanie przeciwciał przeciwko determinantom idiotypowym mAb możliwe jest zidentyfikowanie innych klonów wyrażających przeciwciała o identycznej swoistości.

Tak więc, mAb wytwarzane przeciwko IL-18BP według wynalazku można zastosować do indukowania przeciwciał anty-Id u odpowiednich zwierząt, takich jak myszy Balb/c. Śledziony immunizowanych zwierząt stosuje się do wytwarzania hybrydoma anty-Id, które wytwarzają mAb anty-Id. Dalej, mAb anty-Id można sprzęgać z nośnikiem, takim jak hemocyjanina skałoczepu (KLH, ang. keyhole limpet hemocyanin) i stosować do immunizowania dodatkowych myszy Balb/c. Surowice od tych myszy zawierać będą przeciwciała anty-anty-Id, które wykazują właściwości wiązania oryginalnych mAb swoistych wobec epitopów IL-18BP.

MAb anty-Id mają zatem swoje własne idiotypowe epitopy, lub „idiotopy” strukturalnie podobne do epitopów będących przedmiotem badania, takich jak IL-18BP.

Określenie „przeciwciało humanizowane” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza np. przeciwciała bardziej zgodne z organizmem człowieka, które można otrzymać przez manipulację przeciwciał mysich metodami inżynierii genetycznej. Takie przeciwciała humanizowane wykazują zmniejszoną immunogenność i polepszoną farmakokinetykę u ludzi. Można je wytworzyć znanymi technikami, takimi jak opisane, przykładowo dla humanizowanych przeciwciał przeciwko TNF w Molecular Immunology 30, 16:1443-1453 (1993).

Określenie „przeciwciało” w znaczeniu tu zastosowanym może oznaczać zarówno całą cząsteczkę, jak i przykładowo, Fab i F(ab')2, które są zdolne do wiązania antygenu. Fab i F(ab')2 są pozbawione fragmentu Fc kompletnego przeciwciała, są szybciej usuwane z układu krążenia i wykazują mniej swoiste wiązanie się z tkankami niż kompletne przeciwciała (Wahl i in., J. Nucl. Med., 24:316-325 (1983)). należy uwzględnić, że Fab, F(ab')2 i inne fragmenty przeciwciał można zastosować do wykrywania i oznaczania ilościowego IL-18BP, jak zostało to opisane niniejszym dla kompletnych cząsteczek przeciwciał. Fragmenty takie zwykle wytwarza się przez cięcie proteolityczne, stosując takie enzymy jak papaina (do wytwarzania fragmentu Fab) albo pepsyna (do wytwarzania fragmentu F(ab')2).

Przeciwciało „ma zdolność wiązania” cząsteczki, jeżeli jest zdolne do swoistej reakcji z cząsteczką w wyniku której następuje wiązanie cząsteczki z przeciwciałem. Określenie „epitop” w znaczeniu tu stosowanym oznacza tę część dowolnej cząsteczki zdolnej do bycia związaną przez przeciwciało, która jest rozpoznawana przez to przeciwciało. Epitopy albo „determinanty antygenowe” zwykle obejmują chemicznie czynne ugrupowania powierzchniowe cząsteczek, takie jak aminokwasy albo boczne łańcuchy cukrowe, i mają swoistą budowę trójwymiarową jak również swoistą charakterystykę ładunku elektrycznego.

„Antygen” jest cząsteczką albo częścią cząsteczki, która jest zdolna do bycia związaną przez przeciwciało i która jest dodatkowo zdolna do wywołania wytwarzania u zwierzęcia przeciwciał, zdolnych do wiązania epitopu na tym antygenie. Antygen może zawierać jeden albo więcej niż jeden epitop. Swoista reakcja, jak wskazano wyżej, oznacza że antygen reaguje w sposób swoisty z odpowiadającym przeciwciałem, nie zaś z wieloma innymi przeciwciałami, które można wywołać przy użyciu innych antygenów.

Przeciwciała, w tym fragmenty przeciwciał, według wynalazku można zastosować do wykrywania ilościowego albo jakościowego IL-18BP albo pokrewnych białek w próbce, albo do wykrywania komórek, które wyrażają takie białka. Można to osiągnąć technikami immunofluorescencji wykorzystu16

PL 206 070 B1 jącymi wyznakowane fluorescencyjnie przeciwciała (patrz niżej) w połączeniu z mikroskopią świetlną, cytometrią przepływową albo wykrywaniem fluorometrycznym.

Przeciwciała (albo ich fragmenty) według wynalazku można wykorzystać histologicznie, np. w mikroskopii immunofluorescencyjnej albo immunoelektronowej, do wykrywania in situ IL-18BP i pokrewnych białek. Wykrywanie in situ można osiągnąć przez pobranie próbki histologicznej od pacjenta i dostarczenie wyznakowanego przeciwciała według wynalazku do takiej próbki. Przeciwciało (albo fragment) korzystnie jest dostarczone przez nałożenie albo pokrycie próbki biologicznej wyznakowanym przeciwciałem (albo fragmentem). Przez zastosowanie takiej procedury, możliwe jest określenie nie tylko obecności IL-18BP, ale również ich rozmieszczenie w badanej tkance. Stosując wynalazek, specjalista w dziedzinie łatwo określi, że dowolną spośród licznych metod histologicznych (jak procedury barwienia) można zmodyfikować do przeprowadzenia wykrywania in situ.

Testy na obecność IL-18BP zwykle obejmują inkubowanie próbki biologicznej, takiej jak płyn ustrojowy, ekstrakt tkankowy, świeżo zebrane komórki, np. limfocyty albo leukocyty, albo komórki, które inkubowano w hodowli tkankowej, w obecności przeciwciała wyznakowanego w sposób umożliwiający wykrywanie, które jest zdolne do wykrycia IL-18BP i wykrywanie przeciwciała dowolną spośród znanych technik.

Próbkę biologiczną można nanosić na podłoże stałe lub nośnik, taki jak nitroceluloza albo inne podłoże czy nośnik, który jest zdolny do unieruchamiania komórek, części komórek albo rozpuszczalnych białek. Podłoże albo nośnik można płukać odpowiednimi buforami, a następnie traktować przeciwciałem wyznakowanym w sposób umożliwiający wykrywanie. Podłoże albo nośnik można następnie płukać buforem w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Ilość związanego znacznika na podłożu stałym można wykrywać dowolnym konwencjonalnym sposobem.

Przez określenie „podłoże stałe”, „nośnik stały”, „podłoże” albo „nośnik” w znaczeniu tu stosowanym rozumie się dowolne podłoże albo nośnik zdolny do wiązania antygenu albo przeciwciał. Dobrze znane podłoża albo nośniki obejmują szkło, polistyren, polipropylen, polietylen, dekstran, nylon, amylazy, naturalne albo modyfikowane celulozy, poliakrylamidy, gabro i magnetyt. Nośnik może być do pewnego stopnia rozpuszczalny albo nierozpuszczalny. Materiał podłoża może mieć dowolną strukturę, o ile sprzęgnięte cząsteczki są zdolne do wiązania z antygenem albo przeciwciałem. Tak więc, konfiguracja podłoża albo nośnika może być sferyczna, jak w przypadku perełki, albo cylindryczna, jak w przypadku powierzchni wewnętrznej probówki, albo powierzchni zewnętrznej pręta. Alternatywnie, powierzchnia może być płaska jak w przypadku arkusza, paska testowego, itp. Korzystne podłoża albo nośniki obejmują perełki polistyrenowe. Specjaliści w dziedzinie znają wiele odpowiednich nośników do wiązania przeciwciała albo antygenu, albo mogą je określić stosując rutynowe eksperymenty.

Aktywność wiążącą danej partii przeciwciała według wynalazku można określić stosując dobrze znane sposoby. Specjaliści w dziedzinie są w stanie określić optymalne warunki testowe dla każdego oznaczenia stosując jedynie rutynowe doświadczenia.

Inne etapy obejmują płukanie, mieszanie, wytrząsanie, filtrowanie, itp., które można dodać do testu jako standardowe albo konieczne dla konkretnej sytuacji.

Jedną z metod, którą przeciwciało według wynalazku można znakować w sposób umożliwiający wykrywanie, jest połączenie go z enzymem i zastosowanie enzymatycznego testu immunologicznego (EIA). Enzym ten z kolei, po ekspozycji na odpowiedni substrat, będzie reagował z substratem, w taki sposób, że powstaje cząsteczka chemiczna, którą można wykrywać, przykładowo, spektrofotometrycznie, fluorymetrycznie albo wizualnie. Enzymy, które można zastosować do znakowania przeciwciał obejmują, choć nie są ograniczone do dehydrogenazy jabłczanowej, gronkowcowej nukleazy, izomerazy delta-5-steroidowej, drożdżowej dehydrogenazy alkoholowej, dehydrogenazy alfaglicerolofosforanowej, izomerazy triozofosforanowej, peroksydazy chrzanowej, fosfatazy alkalicznej, asparaginazy, oksydazy glukozowej, β-galaktozydazy, rybonukleazy, ureazy, katalazy, dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, glukoamylazy i acetylocholinesterazy. Wykrywanie można osiągnąć metodami kolorymetrycznymi, które wykorzystują chromogenny substrat dla enzymu. Wykrywanie można również osiągnąć przez porównanie wizualne wielkości reakcji enzymatycznej substratu z podobnie wytworzonymi wzorcami.

Wykrywanie można osiągnąć stosując różne testy immunologiczne. Przykładowo, przez radioaktywne wyznakowanie przeciwciał możliwe jest wykrywanie IL-18BP w teście radioimmunologicznym (RIA). Dobry opis RIA można znaleźć w Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work i in., North Holland Publishing Company, NY (1978), w szczególności w rozdziale zatytułowanym „An Introduction to Radioimmuno Assay and Related Techniques”, T. Chard. Izotop radioPL 206 070 B1 aktywny można wykrywać takimi sposobami, jak licznik gamma albo licznik scyntylacyjny albo przez autoradiografię.

Możliwe jest również wyznakowanie przeciwciała według wynalazku związkiem fluorescencyjnym. Gdy związek fluorescencyjny eksponuje się na światło o odpowiedniej długości fali, jego obecność można wykryć dzięki fluorescencji. Do najpowszechniej stosowanych związków do znakowania fluorescencyjnego należą izotiocyjanian fluoresceiny, rodamina, fikoerytryna, fikocyjanina, allofikocyjanina, o-ftalaldehyd i fluoreskamina.

Przeciwciało można również znakować stosując zdolne do fluorescencji metale, takie jak ¹⁵²Eu albo inne z szeregu lantanowców. Metale te można przyłączyć do przeciwciała stosując grupy chelatujące, np. kwas dietylenotriaminopentaoctowy (ETPA).

Przeciwciało można znakować w sposób umożliwiający wykrywanie przez sprzęganie z biotyną. Biotynylowane przeciwciało można wykrywać awidyną albo streptawidyną sprzęgniętą ze związkiem fluorescencyjnym albo enzymem, takim jak peroksydaza, albo izotopem radioaktywnym, itp.

Przeciwciało można również znakować w sposób wykrywalny sprzęgając je ze związkiem chemiluminescencyjnym. Obecność przeciwciała wyznakowanego chemiluminescencyjnie określa się przez wykrywanie obecności luminescencji, która pojawia się w trakcie reakcji chemicznej. Przykłady szczególnie przydatnych związków do znakowania chemiluminescencyjnego obejmują luminol, izoluminol, teromatyczny ester akrydyny, imidazol, sole akrydynowe i estry szczawiowe.

Podobnie, do znakowania przeciwciał według wynalazku można zastosować związki bioluminescencyjne. Bioluminescencja jest rodzajem chemiluminescencji spotykanym w układach biologicznych, w których białko katalityczne zwiększa skuteczność reakcji chemiluminescencyjnej. Obecność białka bioluminescencyjnego określa się przez wykrywanie obecności luminescencji. Istotne związki bioluminescencyjne dla celów znakowania obejmują lucyferynę, lucyferazę i ekworynę.

Cząsteczkę przeciwciała można zaadaptować do wykorzystania w teście immunometrycznym, znanym również jako test „dwumiejscowy” albo „kanapkowy. W typowym teście immunometrycznym, pewna ilość nieznakowanego przeciwciała (albo fragmentu przeciwciała) wiązana jest z podłożem stałym albo nośnikiem, zaś pewną ilość znakowanego w sposób wykrywalny przeciwciała dodaje się w celu umożliwienia wykrywania i/lub oznaczania ilościowego kompleksu wytworzonego pomiędzy przeciwciałem związanym z podłożem stałym, antygenem i znakowanym przeciwciałem.

Zwykle, i korzystnie, testy immunometryczne obejmują testy typu „forward” w których przeciwciało związane z podłożem stałym doprowadza się do kontaktu z badaną próbką w celu ekstrahowania antygenu z próbki przez wytworzenie kompleksu binarnego przeciwciał z antygenem. Po odpowiednim okresie inkubacji, podłoże stałe albo nośnik płucze się w celu usunięcia resztek płynu ustrojowego, w tym antygenu, który nie wszedł w reakcję, a następnie doprowadza się do kontaktu roztworem zawierającym nieznaną ilość znakowanego przeciwciała (które działa jako „cząsteczka reporterowa”). Po drugiej inkubacji, której celem jest umożliwienia wyznakowanemu przeciwciału wejście w reakcję z antygenem związanym z podłożem stałym albo nośnikiem przez nieznakowane przeciwciało, podłoże stałe albo nośnik płucze się drugi raz w celu usunięcia wyznakowanego przeciwciała, które nie weszło w reakcję.

W innym rodzaju testu „kanapkowego”, który również może być przydatny dla antygenów według wynalazku, stosuje się tzw. test „równoczesny” albo „odwrotny” (ang. reverse). Test „równoczesny” obejmuje pojedynczy etap inkubacji, ponieważ przeciwciało związane z podłożem stałym albo nośnikiem i znakowane przeciwciało dodaje się do badanej próbki w tym samym czasie. Po zakończeniu inkubacji, podłoże stałe albo nośnik płucze się w celu usunięcia resztek płynu ustrojowego i niezwiązanego wyznakowanego przeciwciała. Obecność wyznakowanego przeciwciała związanego z podłożem stałym albo nośnikiem określa się jak w konwencjonalnym teście kanapkowym (teście „forward”).

W teście „odwrotnym”, stosuje się kolejno dodanie pierwszego roztworu wyznakowanego przeciwciała do próbki płynu ustrojowego, a następnie po odpowiednim okresie inkubacji dodanie nieznakowanego przeciwciała związanego z podłożem stałym albo nośnikiem. Po drugiej inkubacji, fazę stałą płucze się w sposób konwencjonalny w celu uwolnienia jej z resztek próbki badanej i roztworu wyznakowanego przeciwciała, które nie weszło w reakcję. Określenie wyznakowanego przeciwciała związanego z podłożem stałym albo nośnikiem dokonuje się jak w teście „równoczesnym” albo „forward”.

Wynalazek dostarcza również cząsteczek DNA kodujących białka IL-18BP według wynalazku, jak to określono wyżej, zdolnych do replikacji nośników obejmujących takie cząsteczki DNA, komórki gospodarza transformowane takim nośnikiem ekspresji, w tym prokariotyczne i eukariotyczne komórki

PL 206 070 B1 gospodarza, korzystnie komórki CHO. Niniejszym opisano również sposób wytwarzania wektorów ekspresyjnych kodujących IL-18BP według wynalazku, w celu ekspresji IL-18BP u ludzi i innych ssaków.

Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania białek IL-18BP według wynalazku przez hodowanie transformowanej komórki według wynalazku i pozyskiwanie białka kodowanego przez cząsteczkę DNA i wektor ekspresyjny w takiej transformowanej komórce gospodarza.

Oprócz zastosowania IL-18BP w modulowaniu aktywności IL-18, można je oczywiście, zastosować również do oczyszczania samej IL-18. W tym celu, IL-18BP sprzęga się z kolumną powinowactwa i przepuszcza się przez nią surową IL-18. Następnie, IL-18 można odzyskiwać z kolumny przez, np. wymywanie przy niskim pH.

Wynalazek zostanie zilustrowany poniższymi nieograniczającymi przykładami.

P r z y k ł a d 1

Izolowanie białka wiążącego IL-18

IL-18 z E. coli (2,5 mg, Peprotech, NJ) sprzęgnięto z Affigel-10 (0,5 ml, Bio-Rad), według instrukcji producenta i upakowano w kolumnie. Surowe białka moczu (zatężone 1000 krotnie, 500 ml) wprowadzono do kolumny z prędkością przepływu 0,25 ml/min. Kolumnę płukano 250 ml 0,5 M NaCl w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS). Związane białka wymywano następnie 25 mM kwasem cytrynowym, pH 2,2 i benzamidyną (1 mM), po czym natychmiast neutralizowano 1 M Na2CO3. Zbierano frakcje po 1 ml. Frakcje analizowano przez SDS-PAGE i barwienie srebrem. Białko wiążące IL-18 eluowano we frakcjach 2-8 jako białko około 40000 Da (fig. 1). Prążek około 40 kDa odpowiedający IL-18BP wykazywał wyraźny żółty kolor po barwieniu srebrem. Różne frakcje analizowano przez sieciowanie ¹²⁵I-IL-18, SDS-PAGE i autoradiografię, jak to opisano w przykładzie 2. Białko wiążące IL-18 wykrywane we frakcjach 2-8 eluowano z kolumny IL-18-agaroza (fig. 2).

P r z y k ł a d 2

Sieciowanie oczyszczonego przez powinowactwo IL-18BP przy użyciu znakowanej IL-18

Próbki (40 μθ IL-18BP z etapu oczyszczania przez powinowactwo inkubowano (70 min, 4°C) z ¹²⁵I-IL-18 (5000000 cpm). Następnie dodano suberanu disukcynoimidylowego (DSS) rozpuszczonego w dimetylosulfotlenku (Me2SO, 20 mM) w stężeniu końcowym 2 mM i pozostawiono mieszaninę w 4°C przez 20 minut. Reakcję zatrzymano przez dodanie 1 M Tris-HCl, pH 7,5, i 1 M NaCl do stężenia końcowego 100 mM. Dodano bufor do próbek zawierający ditiotreitol (DTT, 25 mM) i analizowano mieszaninę przez SDS-PAGE (7,5% akrylamid), a następnie poddano autoradiografii (fig. 2).

Swoisty prążek o ciężarze cząsteczkowym 58 kDa prawdopodobnie obejmujący białko około 40 kDa i około 20 kDa ¹²⁵I-IL-18 obserwowano we frakcjach eluowanych z kolumn powinowactwa IL-18 (ścieżki 2 i 3), ale nie we frakcjach uzyskanych z płukania kolumny (ścieżka 1), które zawierały pozostałe białka moczu.

P r z y k ł a d 3

Analiza sekwencji białka

Eluowane frakcje z kolumny powinowactwa według przykładu 1 rozdzielono przez SDS-PAGE (10% akrylamid) w warunkach nieredukujących, poddano elektrotransferowi na membranę PVDF (Pro-Blot, Applied Biosystems, USA). Membranę barwiono błękitem Coomassie, wycięto prążek około 40 kDa i białko poddano sekwencjonowaniu na urządzeniu Procise Microsequencer (Applied Biosystems, USA). Otrzymano następującą sekwencję:

T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A 1 ... 5 ... .10 . .

w której x oznacza nieokreślony aminokwas.

Oprócz tego otrzymano inną sekwencję:

A-x-Y-x-R-I-P-A-x-A-I-A 1 ... S ... .10 . .

Z powodu tej podwójnej sekwencji nie można było otrzymać danych o dłuższej sekwencji. Mniejszą sekwencję rozpoznano jako fragment ludzkiej defensyny (nr dostępu p11398) począwszy od aminokwasu 65. Głównej sekwencji nie można było powiązać z żadnym znanym białkiem, co stwierdzono przeszukując wszystkie dostępne bazy danych w NCBI i TIGR, programami blastp i tblastn.

PL 206 070 B1

W celu otrzymania dłuższej i bardziej dokładnej sekwencji, oraz w celu zidentyfikowania potencjalnych reszt cysteinowych, inną porcję frakcji eluowanej z kolumny IL-18-agaroza zredukowano DTT w 6 M chlorowodorku guanidyny, poddano reakcji z 4-winylopirydyną, odsolono w urządzeniu do mikrofiltracji (Ultrafree, ciężar odcięcia 10000 Da, Millipore) i poddano analizie sekwencji. Po pierwszym cyklu sekwencjonowania, filtr poddano reakcji z o-ftalaldehydem w celu zablokowania wszystkich aminokwasów N-końcowych innych niż Pro. W ten sposób otrzymano wyłącznie główną sekwencję:

TPVSQXXXAA XASVRSTKD? CPSQFPVFPA AKQCPALEVT

10 20 30 40 (T=Thr; P=Pro; V=Val; S=Ser; Q=Gln; X=nieznany; A=Ala; R=Arg; K=Lys; D=Asp; C=Cys; F=Phe; L=Leu; E=Glu).

W cyklach 6, 7, 8 i 11 stwierdzono niski sygnał Thr. Ze względu na ten niski sygnał uważano, że nie należy przypisywać aminokwasów w tych cyklach.

Uzyskana sekwencja różni się zasadniczo od jakiegokolwiek sekwencji znanego białka, co stwierdzono przez przeszukiwanie baz danych białek. Jednakże, przeszukiwanie bazy danych TIGR przez program poszukujący tblastn dostarczyło pliku cDNA, oznaczonego THC123801, którego ramka odczytu (218 kodonów), po translacji zawierała sekwencję o znacznej homologii z sekwencją końca N sekwencji IL-18BP. Homologię przedstawiono poniżej:

.......TPVSQXXXAAXASVRSTKDPCFSQPPVFPAAKQCPALEVT... 40

I i t i I Η ί I I i (I 1 I [ Η Η I f I t ί Η ί Η Π f 1

VTLLVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPE 100 (górna sekwencja (1-40) jest sekwencją IL-18BP wyizolowanego według wynalazku; sekwencja dolna (51-100) jest wywnioskowaną sekwencją po translacji cDNA pliku THC123801 TIGR).

Domniemana sekwencja białkowa, otrzymana przez translację pliku THC123801 była niejednoznaczna w resztach 2 i 4 IL-18BP. Potwierdza to tożsamość reszt aminokwasowych 6, 7 i 8 IL-18BP jako Thr, jak również wydaje się potwierdzać w przypadku reszty 11.

P r z y k ł a d 4

IL-18BP jest glikoproteiną

Porcję (0,3 ml) eluowanych frakcji z przykładu 1 dalej oczyszczano przez chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie Superose 12 (1 x 30 cm, Pharmacia, Szwecja). Kolumnę równoważono i eluowano roztworem soli buforowanym fosforanem z azydkiem sodu (0,02%) z prędkością przepływu 0,5 ml/min i zbierano frakcje co 1 min. Białko wiążące IL-18 było wymywane we frakcjach 20-25, jako białko około 40000 Da, co określono przez SDS-PAGE i barwienie srebrem. Próbkę zawierającą białko około 40 kDa (frakcja 23, 50 gl, około 50 ng białka) poddano reakcji z N-glikozydazą F (PNGaza F, Biolab) według instrukcji producenta. Pokrótce, porcję denaturowano przez gotowanie w obecności 5% SDS przez 10 minut, buforu 10XG7 (2,5 gl), 10% NP-40 (2,5 gl) i PNGazy F (1 gl), przez godzinę w 37°C. Próbkę analizowano przez SDS-PAGE (10% akrylamid) w warunkach nieredukujących i porównywano z nietrawionym IL-18BP z tej samej frakcji Superose 12. Stwierdzono, że około 40 kDa prążek IL-18BP zanikł we frakcji traktowanej PNGazą. Otrzymano nowe prążki odpowiadające 30 kDa (tuż powyżej prążka PNGazy) i 20 kDa. Eliminacja prążka około 40 kDa wskazuje, że prążek ten stanowił białko glikozylowane.

P r z y k ł a d 5

Blokowanie aktywności biologicznej IL-18 przez IL-18BP

Zdolność IL-18BP izolowanego z moczu do blokowania aktywności IL-18 oznaczano przez pomiar indukowanego przez IL-18 wytwarzania IFN-γ w komórkach jednojądrzastych. IL-18 indukuje IFN-γ, kiedy jest podawana wraz z niskim stężeniem LPS, IL-12, IL-2 albo innymi czynnikami stymulującymi. Aktywność IL-18 badano na mysich splenocytach, ludzkich jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej (PBMC) oraz ludzkiej linii KG-1. Splenocyty wyizolowano ze zdrowych myszy, płukano i zawieszano w podłożu RPMI 1640 z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej w ilości 5 x 10⁶ komórek/ml. 1 ml hodowle pobudzano LPS (0,5 albo 1 gg/ml) wraz z rekombinowaną ludzką albo mysią IL-18 (0,5 albo 5 ng/ml). Ludzkie białko wiążące IL-18 (0,5 albo 50 ng/ml) dodano do rekombinowanej IL-18 przed dodaniem do splenocytów. Po hodowaniu przez 24 godziny, splenocyty poddano trzem cyklom zamrażania (-70°C) i odmrażania (w temperaturze pokojowej), resztki komórkowe usunięto przez wiro20

PL 206 070 B1 wanie, zaś nadsącz badano pod kątem IFN-γ stosując zestaw ELISA dla mysiego IFN-γ (Endogen). Jak przedstawiono na fig. 3A, IL-18BP blokowało aktywność huIL-18 w mysich splenocytach w sposób zależny od dawki. W przeciwieństwie, stosowane jako kontrola rozpuszczalne receptory interferonu-α/β nie wywierały efektu. Aktywność rekombinowanej mysiej IL-18 była podobnie hamowana przez ludzkie IL-18BP, wskazując, że ludzka IL-18BP rozpoznaje mysią IL-18 (fig. 3B). Endogenna IL-18 była indukowana ze splenocytów mysich przez wysokie stężenia LPS, prowadząc do wytwarzania IFN-γ. W rzeczywistości, indukcja IFN-γ przez LPS (10 μg/ml) była również hamowana przez IL-18BP z moczu (fig. 3C). Konkanawalina A (conA) aktywuje limfocyty T do wytwarzania IFN-γ pod nieobecność IL-18 (13). W rzeczywistości, indukcja IFN-γ przez ConA nie była hamowana przez IL-18BP, nawet w wysokich stężeniach (fig. 3D). Obserwacja ta wykazała, że IL-18BP było swoistym inhibitorem aktywności biologicznej IL-18, a nie nieswoistym inhibitorem wytwarzania IFN-γ. IL-18BP hamowało również aktywność ludzkiej IL-18 w ludzkich komórkach KG-1 indukowanych kombinacją IL-18 i TNF-α (fig. 3E).

Powyższe dane sugerują że IL-18BP z moczu hamuje aktywność ludzkiej, jak również mysiej IL-18, mierzonej przez współindukowanie IFN-γ w ludzkich i mysich komórkach jednojądrzastych.

Stężenie IL-18BP, które redukowało aktywność IL-18 w 90% było porównywalne do stężenia samej IL-18, co wskazuje na oddziaływanie o wysokim powinowactwie pomiędzy tymi dwoma białkami.

P r z y k ł a d 6

Izolowanie klonów cDNA kodujących IL-18BP

Całkowity RNA z limfocytów T Jurkat (CRL 8163, American Type Culture Collection) poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu odwrotnej transkryptazy Superscript Rnaze H- (Gibco-BRL) i starterów losowych (Promega, Madison WI). Powstałe fragmenty cDNA amplifikowano przez PCR, stosując polimerazę DNA Taq (Sigma) i startery odpowiadające klonowi THC123801 TIGR, nukleotydom 24-44 (nici sensownej) i 500-481 (nici antysensownej). Amplifikację przeprowadzono w 30 cyklach przyłączania (55°C, 2 min) i wydłużania (70°C, 1 min). Powstały produkt PCR rozdzielono przez elektroforezę na agarozie (1%), eluowano i klonowano do wektora do klonowania pGEM-Teasy TA (Promega). DNA z poszczególnych klonów sekwencjonowano starterami T7 i SP6.

Powstały fragment 477 bp znakowano ³²P stosując losowe startery. Sondę tę zastosowano do badania przesiewowego różnych ludzkich bibliotek cDNA i genomowych. Wykonano odbitki filtrów nitrocelulozowych i hybrydyzowano z sondą w 60°C w buforze zawierającym 6xSSC, 10X roztwór Denhardta, 0,1% SDS i 100 μg/ml DNA spermy łosia. Filtry płukano i eksponowano przez noc w -80°C na kliszę Kodak XAR. Podwójnie pozytywne klony oczyszczono z łysinek. Plazmidy wycięto z klonów λpCEV9 i poddano ligacji między sobą. Klony cDNA z innych bibliotek wyizolowano według instrukcji producenta. Automatyczną analizę sekwencji DNA wyizolowanych klonów przeprowadzono na sekwenatorze Model 373A i 377 (Applied Biosystems) stosując startery sensowne i antysensowne. Do klonowania zastosowano standardowe procedury (33).

Badano następujące biblioteki: bibliotekę cDNA ludzkich monocytów, skonstruowaną w wektorze do klonowania λpCEV9 (15), uprzejmie udostępnioną przez T. Miki; bibliotekę cDNA ludzkiej linii limfocytów T Jurkat; bibliotekę cDNA ludzkich leukocytów krwi obwodowej i bibliotekę cDNA ludzkiej śledziony, wszystkie pochodzące z Clontech (Palo Alto, CA). Biblioteka genomowa ludzkiego łożyska w wektorze lambda FIX II pochodziła ze Stratagene (La Jolla, CA).

Otrzymano i scharakteryzowano wszystkie klony cDNA odpowiadające czterem różnym wariantom składania IL-18BP. Wszystkie warianty składania kodowały domniemane rozpuszczalne białka wydzielnicze. Najbardziej rozpowszechniony (IL-18BPa) miał otwartą ramkę odczytu wielkości 192 kodonów, kodując peptyd sygnałowy 28 aminokwasów, po którym następowała dojrzała sekwencja IL-18BPa, której pierwsze 40 aminokwasów (SEK. NR ID.:10) pasowało do sekwencji końca N białka IL18BP z moczu (SEK. NR ID.:2). Położenie reszt cysteinowych wskazywało, ze polipeptyd ten należy do nadrodziny immunoglobulinowej (Ig). Każda z czterech reszt Gln w dojrzałym IL-18BP mogła być miejscem glikozylacji. Trzy inne warianty IL-18BP były mniej rozpowszechnione niż IL-18BPa.

Inny 1 kb cDNA IL-18BPb kodował dojrzałe białko długości 85 reszt aminokwasowych (SEK. NR ID.:4). Trzeci wariant, IL-18BPc występował jako cDNA 2,3 kb, kodując dojrzałą sekwencję IL-18BP o długości 169 reszt aminokwasowych (SEK. NR ID.:6). Czwarty wariant, IL-18BPd kodował dojrzałe IL-18BP długości 133 reszt aminokwasowych (SEK. NR ID.:8). Miejsce składania w egzonie występowało w dwóch miejscach wzdłuż pro-mRNA. Miejsca te oraz dodatkowy egzon 5' w IL-18BPd powodowały 3 różne 5'UTR w różnych klonach cDNA. Stąd, jest dość prawdopodobne, że różne warianty IL-18BP można wytworzyć w reakcji na różne sygnały regulujące transkrypcję.

Jak dotąd nie ujawniono cDNA kodującego receptor przezbłonowy.

PL 206 070 B1

P r z y k ł a d 7

Konstruowanie ssaczego wektora ekspresyjnego, wytwarzanie rekombinowanego IL-18BP i badanie aktywności biologicznej rekombinowanego IL-18BP

Region kodujący cDNA IL-18BPa amplifikowano przez PCR stosując starter sensowny:

5'TATATCTAGAGCCACCATGAGACACAACTGGACACCA i starter antysensowny:

5'ATATCTAGATTAATGATGATGATGATGATGACCCTGCTGCTGTGGACTGC.

Produkty PCR cięto Xbal i klonowano w miejsce Xbal wektora ekspresyjnego pEF-BOS (25) otrzymując pEF-BOS-IL-18BPa. Konstrukt sprawdzono przez sekwencjonowanie DNA.

Porcje po 6 x 10⁷ komórek COS7 w 1,4 ml buforu TD, zawierającego plazmidowy DNA pEF-BOS-IL-18BPa (10 μg) oraz dekstran-DEAE (120 μg) inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej jak to opisano (35). Następnie komórki płukano DMEM- 10% FBS, wysiewano przez 4 godziny w DMEM-10, płukano i inkubowano przez 3 - 5 dni w bezsurowiczej DMEM. Pożywkę hodowlaną zbierano, zatężano 6 krotnie przez ultrafiltrację (ciężar odcięcia 10 kDa) i izolowano IL-18BP-His6 na kolumnie Talon (Clontech) z imidazolem jako eluentem zgodnie instrukcją producenta.

Krzyżową reaktywność immunologiczną IL-18BP z moczu i rekombinowanego IL-18BP oceniano w następujący sposób: IL-18BP z moczu (5 μg) znakowano ¹²⁵I procedurą z chloraminą T. Nadsącz komórek COS7 (250 ml) mieszano (1 godz., w temperaturze pokojowej, objętość końcowa 500 μθ z przeciwciałem przeciwko IL-18BP z moczu, rozcieńczonym 1:1000 w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS), 0,05% Tween 20 i 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (bufor do płukania). Dodano IL-18BP z moczu znakowane ¹²⁵I (10⁶ cpm), a następnie po godzinie dodano sepharose-białko G (20 μβ. Mieszaninę zawieszono (1,5 godz., 4°C), perełki wyizolowano i płukano buforem do płukania 3 x i raz w PBS. Perełki eluowano buforem do próbek, rozdzielano przez SDS-PAGE (10% akrylamid w warunkach redukujących, a następnie poddano autoradiografii).

IL-18BPa występowało jako pojedynczy prążek w SDS-PAGE przy barwieniu srebrem w warunkach redukujących i nieredukujących i miało tę samą masę cząsteczkową co IL-18BP z moczu (dane nie przedstawione). Analiza sekwencji białkowej tego preparatu wykazała tę samą sekwencję końca N co IL-18BP z moczu, co wskazuje, że to ostatnie nie ulegało degradacji na końcu N.

Analiza immunologiczna IL-18BPa przy użyciu przeciwciał wywołanych przeciwko IL-18BP wykazała prążek o tej samej masie cząsteczkowej, co białko z moczu. Ponadto, stosując immunoprecypitację, a następnie SDS-PAGE i autoradiografię, IL-18BPa wypierało ¹²⁵I-IL-18BP z wiązania z przeciwciałem. Stąd, IL-18BPa odpowiada strukturalnie IL-18BP z moczu.

Surowe i oczyszczone IL-18BPa badano pod kątem zdolności do hamowania aktywności biologicznej IL-18. IL-18BPa hamowało w sposób zależny od dawki aktywność indukującą IFN-γ ludzkiej i mysiej IL-18 w splenocytach mysich, PBMC i ludzkiej linii komórkowej KG-1 (fig. 9).

Wyniki różnych testów biologicznych, jak również test przesunięcia ruchliwości (przykład 8) wykazuje, że hamowanie aktywności IL-18 jest wewnętrzną właściwością klonowanego IL-18BP, a nie jakichkolwiek towarzyszących zanieczyszczeń w IL-18BP z moczu, takich jak fragmenty defensyny.

P r z y k ł a d 8

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej

Badano również wpływ IL-18BP z moczu i rekombinowanego IL-18BP na indukowaną przez IL-18 aktywację NF-kB w ludzkich komórkach KG-1. Ludzkie komórki KG-1 (4 x 10⁶ w 1 ml RPMI), pobudzano huIL-18 (10 ng/ml) albo huIL-18 zmieszanej wcześniej z IL-18BP (20 min, w temperaturze pokojowej). Po 20 minutach w 37°C, komórki płukano trzykrotnie lodowatym PBS i natychmiast zamrażano w ciekłym azocie. Osady komórkowe zawieszano w trzykrotnej objętości buforu A (20 mM Tris, pH 7,6, 0,4 M NaCl, 0,2 mM EDTA, glicerol (20% objętości), 1,5 mM MgCl2, 2 mM ditiotreitol (DTT) 0,4 mM PMSF, 1 mM Na₃VO₄, 2 μg/ml leupeptyny, pepstatyny i aprotyniny). Osad komórkowy usunięto przez odwirowanie (15000 xg, 15 minut), porcje nadsączu zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C. Stężenie białka oznaczano testem Bradforda (Bio-Rad) stosując albuminę surowicy bydlęcej jako znacznik. Dwuniciowe oligonukleotydy odpowiadające elementowi wiążącemu NF-kB (10 pmol, Promega) znakowano [³²P]dCTP (300 Ci/mmol) i kinazą polinukleotydową T4 (New England Biolabs). Wolne nukleotydy usunięto stosując kolumnę do wirowania (ang. spin column). Ekstrakty (10 μg białka) z komórek traktowanych IL-18 albo IL-18 z IL-18BP inkubowano (15 min, w temperaturze pokojowej) ze znakowanymi sondami (3 x 10⁴ cpm) wraz z polidl.dC (500 ng, Pharmacia) i denaturowanym DNA spermy łosia (100 ng, Sigma) w 20 μl buforu zawierającego HEPES (pH 7,5, 10 mM), 60 mM KCI, 1 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 1 mM DTT i glicerynę (5% objętości). Mieszaniny wprowadzono na

PL 206 070 B1

5% żel poliakrylamidowy niedenaturujący. Elektroforezę przeprowadzono przy 185 V w 0,5xTBE (40 mM Tris HCl, 45 mM kwas borowy i 2,5 mM EDTA). Żele suszono pod próżnią i poddawano autoradiografii przez noc w -80°C. Stwierdzono, że IL-18 indukuje tworzenie homodimeru NF-kB p50 oraz heterodimeru NF-kB p50/p65. IL-18BP z moczu, jak i rekombinowane IL-18BP hamowało aktywację NF-kB przez IL-18, co określono przez przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej z ekstraktami komórek KG-1 wiążącymi oligonukleotyd odpowiadający sekwencji zgodności NF-kB.

P r z y k ł a d 9

Ekspresja IL-18BP w E. coli, drożdżach i komórkach owadów

IL-18BP można również wytwarzać w innych komórkach rekombinowanych, takich jak komórki prokariotyczne, np. komórki E. coli albo inne komórki eukariotyczne, takie jak drożdże i komórki owadów. Dostępne są dobrze znane sposoby konstruowania odpowiednich wektorów niosących DNA, który koduje IL-18BP, które są przydatne do transformowania E. coli i komórek drożdżowych albo zakażania komórek owadów w celu wytwarzania rekombinowanego IL-18BP. W celu ekspresji w komórkach drożdży, DNA kodujący IL-18BP (przykład 6) wycina się i wprowadza do wektorów ekspresyjnych przydatnych do transfekowania komórek drożdży. W celu transfekowania komórek owadów, DNA kodujący IL-18BP wprowadza się do bakulowirusa, zaś komórki owadów zakaża się rekombinowanym bakulowirusem. W celu ekspresji w E. coli, DNA kodujący IL-18BP poddaje się kierowanej mutagenezie odpowiednimi oligonukleotydami, w taki sposób, że kodon początkowy ATG jest wprowadzony tuż przed pierwszym kodonem dojrzałego IL-18BP. Alternatywnie, taki DNA można wytworzyć przez PCR przy użyciu odpowiednich starterów sensownych i antysensownych. Powstałe konstrukty cDNA wprowadza się do odpowiednio skonstruowanych prokariotycznych wektorów ekspresyjnych dobrze znanymi technikami (23).

P r z y k ł a d 10

Konstruowanie wektora ekspresyjnego wirusa towarzyszącego adenowirusom w celu ekspresji IL-18BPa in vivo

Funkcjonalny gen, kodujący IL-18BPa konstruowany jest w oparciu o plazmid pcDNA3 (Invitrogen, San Diego CA). cDNA IL-18BPa z sekwencją zgodności Kozaka na końcu 5' poddaje się ligacji w miejsce Xbal pcDNA3 w sposób niszczący miejsce restrykcyjne. Nowe miejsca Xbal wprowadza się przez kierowaną mutagenezę przed kasetą oporności na neomycynę (zasada 2151 oryginalnej sekwencji pcDNA3) i po sygnale poliadenylacji SV40 (zasada 3372 początkowej sekwencji pcDNA3). Konstrukt ten tnie się Xbal, zaś powstały minigen wielkości 4,7 kb wprowadza się w miejsce Xbal plazmidu psub201 jak to opisano (Snyder i in., 1996, Current Protocols in Human Genetics, rozdz. 12.1.1-12.1.17, John Wiley & Sons). Powstały plazmid rekombinowany poddaje się równoczesnej transfekcji do ludzkich komórek T293 z pomocniczym plazmidem AAVpAAV/Ad. Następnie hodowle zakaża się adenowirusem jako wirusem pomocniczym, zaś komórki zbiera się po 48-60 godzinach inkubacji. Komórki poddaje się trzykrotnemu zamrażaniu i odmrażaniu, osad komórkowy usuwa się przez odwirowanie, zaś nadsącz doprowadza się do 33% nasycenia siarczanem amonu. Mieszaninę poddaje się wirowaniu i z nadsączu wytrąca się rAAV przez doprowadzenie do 50% nasycenia siarczanem amonu. Wirus dalej oczyszcza się przez CsCl, dializuje i na koniec podgrzewa przez 15 minut w 56°C w celu zniszczenia adenowirusów.

P r z y k ł a d 11

Konstruowanie rekombinowanych białek fuzyjnych IL-18BP

Wytwarzanie białek obejmujących IL-18BP poddanych fuzji z regionem stałym łańcucha ciężkiego IgG2 można przeprowadzić w następujący sposób: DNA IL-18BP poddaje się ukierunkowanej mutagenezie z odpowiednimi oligonukleotydami w taki sposób, że unikalne miejsce restrykcyjne wprowadza się bezpośrednio przed i po sekwencji kodującej. Plazmid niosący region stały łańcucha ciężkiego IgG2, np. pRKCO42Fc1(6) poddaje się podobnej ukierunkowanej mutagenezie, w celu wprowadzenia tego samego unikalnego miejsca restrykcyjnego tak blisko, jak tylko to możliwe Asp216 łańcucha ciężkiego IgG1 w sposób umożliwiający translację białka fuzyjnego w jednej fazie. Fragment dsDNA obejmujący sekwencje nieulegające translacji 5' oraz kodujące IL-18BP przygotowuje się przez trawienie unikalnych miejsc restrykcyjnych albo alternatywnie przez PCR z odpowiednio dobranymi starterami. Zmutowany pRKCD42Fc1 trawi się podobnie w celu wytworzenia dużego fragmentu obejmującego plazmid i sekwencje IgG1. Dwa fragmenty poddaje się następnie ligacji w celu wytworzenia nowego plazmidu, kodującego prekursor polipeptydowy obejmujący IL-18BP i około 227 aminokwasów końca C łańcucha ciężkiego IgG1 (region zawiasowy i domeny CH2 i CH3). DNA kodujący białka fuzyjPL 206 070 B1 ne można izolować z plazmidu przez trawienie odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi, a następnie wprowadzanie do wydajnych wektorów ekspresyjnych prokariotycznych albo eukariotycznych.

P r z y k ł a d 12

Wytwarzanie chemicznie modyfikowanego IL-18BP

W celu wydłużenia okresu półtrwania IL-18BP w osoczu, można wytworzyć IL-18BP, które są chemicznie modyfikowane poliglikolem etylenowym (PEG). Modyfikację można przeprowadzić przez sieciowanie PEG z resztami cysteinowymi cząsteczek IL-18BP. Zmutowane IL-18BP można skonstruować w taki sposób, że zawierają dodatkowe cysteiny na końcach aminowych, miejscach glikozylacji, oraz końcu karboksylowym każdego z IL-18BP. Mutagenezę można przeprowadzić przez PCR z użyciem oligonukleotydów zawierających pożądaną mutację. Mutanty te wyrażane są w zwykły sposób dobrze znany w dziedzinie. Białka te poddaje się modyfikacji PEG, po czym ocenia się ich aktywność.

P r z y k ł a d 13

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych przeciwko IL-18BP

Królikom wstrzykiwano podskórnie po 5 μο czystego preparatu IL-18BP z moczu, emulgowanego w kompletnym adiuwancie Freunda. Trzy tygodnie później wstrzykiwano im ponownie 5 μο IL-18BP podskórnie w niekompletnym adiuwancie Freunda. Dwa dodatkowe wstrzyknięcia IL-18BP w postaci roztworu w PBS podawano w odstępach 10 dniowych. Króliki skrwawiano 10 dni po ostatniej immunizacji. Poziom przeciwciał monitorowano testem radioimmunologicznym. IL-18BP znakowane ¹²⁵I (166000 cpm) zmieszano z różnymi rozcieńczeniami (1:50, 1:500, 1:5000 i 1:50000) surowicy króliczej. Zawiesinę perełek agarozy-białka G (20 μ|, Pharmacia) dodano do objętości całkowitej 200 μ|. Mieszaninę pozostawiono na godzinę w temperaturze pokojowej, perełki płukano 3 krotnie i zliczano związaną radioaktywność. Króliczą surowicę odpornościową przeciwko ludzkiej leptynie zastosowano jako kontrolę negatywną. Miano surowicy odpornościowej przeciwko IL-18R wynosiło od 1:500 do 1:5000, podczas gdy miano kontroli negatywnej mniej niż 1:50.

P r z y k ł a d 14

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko IL-18BP

Samicom myszy Balb/c (3 miesięcznym) wstrzykiwano 2 μΙ oczyszczonej IL-18BP w emulsji kompletnego adiuwantu Freunda, i trzy tygodnie później podskórnie w niekompletnym adiuwancie Freunda. Trzy dodatkowe wstrzyknięcia podawano w odstępach 10 dniowych podskórnie w PBS. Końcową dawkę przypominającą podano dootrzewnowo myszy wykazującej najwyższe miano określone w teście IRIA (patrz niżej) 4 albo 3 dni przed fuzją. Fuzję przeprowadzono z komórkami szpiczaka linii NSO/1 i limfocytami wyizolowanymi ze śledziony i węzłów chłonnych zwierzęcia. Komórki poddane fuzji rozdzielono do mikropłytek hodowlanych i selekcjonowano hybrydoma w DMEM z dodatkiem HAT i 15% surowicy końskiej. Wyselekcjonowano hybrydoma wytwarzające przeciwciała przeciwko IL18BP i klonowano je metodą rozcieńczeń granicznych i wstrzykiwano myszom Balb/c traktowanym wstępnie pristanem w celu wytworzenia puchliny brzusznej. Izotypy przeciwciał określono stosując dostępny na rynku zestaw ELISA (Amersham, UK).

Badanie przesiewowe hybrydoma wytwarzających przeciwciała monoklonalne przeciwko IL-18BP przeprowadzono w następujący sposób. Nadsącze hybrydoma badano na obecność przeciwciał przeciwko IL-18BP w teście radioimmunologicznym z odwróconą fazą stałą (IRIA, ang. inverted solid phase radioimmunoassay). Płytki ELISA (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) pokryto IL-18BP-His6 oczyszczonym na kolumnie Talon (10 μg/ml, 100 μl/studzienkę). Po całonocnej inkubacji w 4°C płytki płukano 2 krotnie PBS zawierającym BSA (0,5%) i Tween 20 (0,05%) i blokowano roztworem do płukania przez co najmniej 2 godziny w 37°C. Dodano nadsącze hodowli hybrydoma (100 μl/studzienkę) i inkubowano przez 4 godz. w 37°C. Płytki płukano 3 krotnie i dodawano koniugat peroksydazy chrzanowej z anty-mysim kozim przeciwciałem (HRP, Jackson Labs, 1:10000, 100 μl/studzienkę). Płytki płukano 4 krotnie i wywoływano reakcję barwną stosując jako substrat ABTS (kwas 2,2'-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy), Sigma) z H2O2. Płytki odczytywano w czytniku ELISA. Próbki dające OD wyższe niż 5 krotność kontroli negatywnej uznawano za pozytywne.

P r z y k ł a d 15

Chromatografia powinowactwa IL-18BP z przeciwciałami monoklonalnymi

Przeciwciała przeciwko IL-18BP stosuje się do oczyszczania IL-18BP przez chromatografię powinowactwa. Płyn puchlinowy zawierający przeciwciała monoklonalne oczyszczono przez precypitację siarczanem amonu przy 50% nasyceniu, a następnie przez intensywną dializę wobec PBS. Około 10 mg immunoglobulin związano z 1 ml Affigel 10 (BioRad, USA) według instrukcji producenta.

PL 206 070 B1

250 ml białek moczu ludzkiego (co odpowiada 250 l surowego moczu) wprowadzono na 0,5 ml kolumny zawierającą przeciwciała IL-18BP w 4°C przy prędkości przepływu 0,25 ml/min. Kolumnę płukano PBS dopóki przestano wykrywać wymywane z kolumny białko, IL-18BP eluowano 25 mM buforem cytrynianowym, pH 2,2 (8 frakcji o objętości kolumny) i natychmiast neutralizowano 1 M Na2CO3. Dalsze oczyszczanie przeprowadzono przez chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek.

P r z y k ł a d 16

Test ELISA

Płytki do mikromiareczkowania (Dynatech lub Maxisorb, Nunc) opłaszczono przeciwciałem monoklonalnym anty-IL-18BP (immunoglobuliny wolnego od surowicy nadsącza hybrydoma lub płynu puchlinowego) przez noc w 4°C. Płytki przemywano PBS zawierającym BSA (0,5%) i Tween 20 (0,05%) i blokowano tym samym roztworem przez co najmniej 2 godziny w 37°C. Próbki testowe rozcieńczono roztworem blokującym i dodano do studzienek (100 μl/studzienkę) i inkubowano przez 4 godz. w 37°C. Płytki płukano 3 krotnie PBS zawierającym Tween 20 (0,05%), po czym dodawano surowicę króliczą anty -IL-18BP (1:1000, 100 μl/studzienkę) i inkubowano dalej przez noc w 4°C. Płytki przemywano 3 krotnie i dodawano koniugat peroksydazy chrzanowej z anty-mysim kozim przeciwciałem (HRP, Jackson Labs, 1:10000, 100 μl/studzienkę) na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Płytki płukano 4 krotnie i wywoływano reakcję barwną stosując ABTS (kwas 2,2'-azyno-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy), Sigma) z H2O2 jako substrat. Płytki odczytywano w czytniku ELISA.

P r z y k ł a d 17

Nieglikozylowane biało IL-18BP jest aktywne biologicznie

Oczyszczone rekombinowane IL-18BPa badano pod kątem zdolności do hamowania aktywności biologicznej IL-18. IL-18BPa hamowało w sposób zależny od dawki aktywność ludzkiej i mysiej IL-18 indukującą IFN-γ w mysich splenocytach, PBMC i linii komórkowej ludzkich komórek KG-1 (fig. 9).

Oczyszczone IL-18BPa ze znacznikiem His₆ na końcu C (1,5 μg, 50 μθ doprowadzono do pH 7,5 i zmieszano z N-glikozydazą F (3 μ!, 500000 U/ml, PNGaze F, New England Biolab). Mieszaninę inkubowano przez 24 godziny w 37°C w warunkach niedenaturujących. Porcje próbki i nietrawionego IL-18BP-His6 analizowano przez SDS-PAGE w warunkach nieredukujących, a następnie poddano immunoblottingowi z przeciwciałami przeciwko IL-18BP. Stwierdzono, że około 40 kDa prążek IL-18BP-His6 znikł we frakcji traktowanej PNGazą, a pojawił się nowy około 20 kDa. Masa cząsteczkowa produktu oraz swoistość PNGazy F wskazują, że białko IL-18BP-His6 stanowiło białko w pełni glikozylowane.

Frakcję IL-18BP traktowaną PNGazą, nietrawioną IL-18BP-His6 i próbkę kontrolną zawierającą PNGazę w buforze zaadsorbowano oddzielnie na perełkach Talon, przemywano buforem fosforanowym i eluowano imidazolem (100 mM). Eluowane frakcje poddano testowi biologicznemu z ludzką IL-18 (20 ng/ml), LPS (2 μg/ml) i mysimi splenocytami. Wyniki przedstawiono w tabeli:

Próbka	IFN-γ (ng/ml)
Kontrola	7,5
Nietrawione IL-18BP-His6	0
IL-18BP-His6 traktowane PNGazą	0

Stąd wywnioskowano, że deglikozylowne IL-18BP jest biologicznie czynne.

Powyższy opis konkretnych wykonań ujawnia ogólną naturę wynalazku, w taki sposób, że inni wykorzystując obecną wiedzę, mogą łatwo modyfikować i/lub adaptować różne zastosowania konkretnych wykonań bez oddalania się od ducha wynalazku. Należy rozumieć, że frazeologia i terminologia zastosowana tu została w celu opisu, nie zaś ograniczania.

PL 206 070 B1

Literatura

1. Anderson, D.M., et al, A homologue of the TNF receptor and its Ugand enhance T-cell growth and dendritic-cell function. Nature, 1997. 390(6656): p. 175-179.

2. Bollon, D. P., et al. (1980) J. Clin. Hematol Oncol. 10:39-48.

3. Botstein, D., et al. (1982) Miami Wint. Symp. 19:265-274.

4. Broach, J. R., in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 445-470 (1981).

5. Broach, J. R., (1982) Cell 28:203-204.

6. Byrn R. A. et al, 1990, Nature (London) 344:667-670.

7. Car, B. D., V. M. Eng, B. Schnyder, L. Ozmen, S. Huang, P. Gallay, D. Heumann, M. Aguet, and B. Ryffel. 1994. Interferon gamma receptor deficient mice are resistant to endotoxic shock.

J. Exp. Med. 179:1437-44 issn: 0022-1007.

8. Chater, K. F. et al, in „Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology”, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54).

9. Conti, B., J. W. Jahng, C. Tinti, J. H. Son, and T. H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272:2035-2037.

10. Dao, T., K. Ohashi, T. Kayano, M. Kurimoto, and H. Okamura. 1996. Interferon-gamma-inducing factor, a novel cytokine, enhances Fas ligand-mediated cytotoxicity of murine T helper 1 cells. Cell-Immunol. 173:230-5 issn: 0008-8749.

11. Engelmann, H., D. Aderka, M. Rubinstein, D. Rotman, and D. Wallach. 1989. A tumor necrosis factor-binding protein purified to homogeneity from human urine protects cells from tumor necrosis factor toxicity. J. Biol Chem. 264:11974-11980.

12. Engelmann, H., D. Novick, and D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265:1531-1536.

13. Fantuzzi, G., et al, IL-18 regulation of IFN-g production and cell proliferation as revealed in interleukin-1b converting enzyme-deficient mice. Blood, 1998. 91: p. 2118-2125.

14. Gryczan, T., „The Molecular Biology of the Bacilli”, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329).

15. Gutkind, J.S., et al, A novel c-fgr exon utilized in Epstein-Barr vims-infected B lymphcytes but not in mormal monocytes. Molec. Cell. Biol., 1991. 11: p. 1500-1507.

16. Heremans, H., J. Van Damme, C. Dillen, R. Dijkmans, and A. Billiau. 1990. Interferon gamma, a mediator of lethal lipopolysaccharide-induced Shwartzman-like shock reactions in mice.

J. Exp. Med. 171:1853-69 issn: 0022-1007.

17. Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742).

18. John, J. F., et al. (1986) Rev. Infect. Dis. 8:693-704).

19. Kendall, K. J. et al. (1987) J. Bacteriol 169:4177-4183).

20. Kohno, K., J. Kataoka, T. Ohtsuki, Y. Suemoto, I. Okamoto, M. Usui, M. Ikeda, and M. Kurimoto. 1997. IFN-gamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th1 but not Th2 cells and exerts its effect independently of IL-12. J. Immunol 158:1541-1550.

21. Maliszewski, C. R., T. A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dower, J. Slack, M. P. Beckmann, and K. H. Grabstein. 1990. Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4-induced B cell activities in vitro. J. Immunol 144:3028-3033.

22. Maniatis, T., in „Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3: Gene Expression”, Academic Press, NY, pp. 563-608 (1980).

23. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982.

24. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto,

K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur-J-Immunol 26:1647-51 issn: 0014-2980.

25. Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector. Nucleic Acid Res. 18:5322-5328.

26. Nakamura, K., H. Okamura, K. Nagata, T. Komatsu, and T. Tamura. 1993. Purification of a factor which provides a costimulatory signal for gamma interferon production. Infect-Immun 61:64-70 issn: 0019-9567.

PL 206 070 B1

27. Nakamura, K., H. Okamura, M. Wada, K. Nagata, and T. Tamura. 1989. Endotoxin-induced serum factor that stimulates gamma interferon production. Infect-Immun 57:590-5 issn: 0019-9567.

28. Novick, D., B. Cohen, and M. Rubinstein. 1994. The Human Interferon alpha/beta Receptor - Characterization and Molecular Cloning. Cell 77:391-400.

29. Novick, D., B. Cohen, and M. Rubinstein. 1992. Soluble Interferon-alpha Receptor Molecules Are Present in Body Fluids. FEBS Lett 314:445-448.

30. Novick, D., H. Engelmann, D. Wallach, and M. Rubinstein. 1989. Soluble cytokine receptors are present in normal human urine. J. Exp. Med. 170:1409-1414.

31. Okamura, H., H. Tsutsui, T. Komatsu, M. Yutsudo, A. Hakura, T. Tanimoto, K. Torigoe,

T. Okura, Y. Nukada, K. Hattori, K. Akita, M. Namba, F. Tanabe, K. Konishi, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1995. Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells. Nature 378:88-91.

32. Rothe, H., N. A. Jenkins, N. G. Copeland, and H. Kolb. 1997. Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novel cytokine, IGIF, which is located near Idd2. J-Clin-Inves.t 99:469-74 issn: 0021-9738.

33. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and M. T., Molecular Cloning: A laboratory manual. 2nd ed. ed.

1989, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

34. Simonet, W.S., et al, Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation ofbone density. Cell, 1997. 89 (2): p. 309-319.

35. Sompayrac, L.H. and K.L. Danna, Efficient infection of monkey cells with DNA of simian virus 40. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1981. 78: p. 7575-7578.

36. Sparks, C.A., et al., Assignment of the nuclear mitotic apparatus protein NuMA gene to human chromosome 11q13. Genomics, 1993. 17: p. 222-224.

37. Tsutsui, H., K. Nakanishi, K. Matsui, K. Higashino, H. Okamura, Y. Miyazawa, and

K. Kaneda. 1996. IFN-gamma-inducing factor up-regulates Fas ligand-mediated cytotoxic activity of rnurine natural killer cell clones. J. Immunol. 157:3967-73 issn: 0022-1767.

38. Ushio, S., M. Namba, T. Okura, K. Hattori, Y. Nukada, K. Akita, F. Tanabe, K. Konishi,

M. Micallef, M. Fujii, K. Torigoe, T. Tanimoto, S. Fukuda, M. Ikeda, H. Okamura, and M. Kurimoto. 1996. Cloning of the cDNA for human IFN-gamma-inducing factor, expression in Escherichia coli, and studies on the biologic activities of the protein. J. Immunol. 156:4274-4279.34. Okayama, H. and Berg, P. (1983) A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 3:280-289.

39. Yasuda, H., et al., Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (OCIF) and osteoprotegerin (OPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro. Endocrinology, 1998. 139: p. 1329-1337.

PL 206 070 B1 jISTA sekwencji <110> Novick, Daniela

Dinarello, Charles Rubinstein, Menacnem Kim, Soo Hyun

Yeda Research and Development Co. Ltd.

Białka wiążące interleukine-18, ich wytwarzanie i sowanie zasto-

<130>	IL-18 Rubinstein
<140>
< 14 1 >
<150>	125463
<151>	1998-07-22
<150>	122134
<151>	1997-11-06
<150>	121869
<151>	1997-09-29
<150>	121639
<151>	1997-08-27
<150>	121554
<151>	1997-08-14
<160>	10'
<170>	Patentln Ver. 2.0
<210>	1
<211>	1348
<212>	D\’A
<213>	Homo sapiens
<400>	1
gagaagagga cgttgtcaca gataaagagc	caggctcacc	agctcctgac	gcatgcatca	60
tgaccatgag acacaactgg acaccagacc	tcagcccttt	gtgggtcctg	ctcctgtgtg	120
cccacg	ccgt cactctcctg gtcagagcca	cacctgtctc	gcag acca cc	acagctgcca	180
ctgcctcagt tagaagcaca aaggacccct	gcccctccca	gcccccagtg	t tcccagcag	240
ctaagcagtg tccagcattg gaagtgacct	ggccagaggt	ggaagtgcca	ctgaatggaa	300
cgctqa	gett atcctgtgtg gcctgcagcc	gcttccccaa	cttcagcarc	ctctactggc	360
tgggca	atgg ttccttcatt gagcacctcc	caggccgact	gtgggagggg	agcaccagcc	420

PL 206 070 B1 gggaacgtgg ctgccccgca grcacgtcgt aagccctgcc agcagcagca c c t g a c a g c c cct tctctca aatgcctcct tcctcacact ccagggccct ttcccagaca cagcagggga cagctctggc ttCSCtCIBS tgtatctgtg

aaaaaaaaaa
<210>	2
<211 >	192
<2I2>	PRT
<213>	Homo
<220>
<221>	SIGM
<222>	' i ; ·
<400>	2
Met A.	ro Hi

; 28;

gagcacagat eagcaccaac cctggcccag ctccagccac caaccttgac tgtaggctgc ccaaattcaa cctcctgcca gctctactgc acctgcattt gctcccactc acgctcaagc cgcactctgc tggactgttc

Ccatccccac aaaaaaaaaa acgcagctg,. ttctcccgtg ctctgggctg agcagtccac gg gatgcgc actceatccc ttctctctcc ccagaaacca cccacatgac ccatgtctct ctggttgaaa agactcccca cagggaaggg atgggtcctc aaaaaaaa cagag gcgga gcaaggcct t tgctcgtgga ggctgagggc agcagcaggg gtcctacctg aacacacccc cacctaccta acctatccat ccaagactgt tttctggaag gctcatttag tgctgcctct ccttcgtgct atgggggcac ataaaggatt

cagctgaccc gttgtccagc cccacccaag gcacagggcc gtgaacagtc gctttgggtc gcctccttac aacgtcctac gccttgcact attcttgctt ctcaccgccc catcctcttt tttttccccc ggatccacac aaaaaaaaaa

80 540 600 660 7 2 0 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 134 8

Leu Cys Ala His 20

Thr Pro Aso Leu Ser Pro Leu trp Val Leu Leu 10 15

Val Val Thr Leu Leu Val Arg Ala Thr Pro Val Ser

Gin Thr Thr Thr Aia Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser Thr Lys Asp Pro

Cys Pro Ser Gin Pro Pro 50

Val Phe Pro Ala Ala Lys Gin Cys Pro Ala

Leu Glu Val Thr Tro Pro Glu Val Glu Val Pro Leu Asn Gly Thr Leu

Ser Leu Ser Cys Val Ala Cys Ser Arg Phe Pro Asn Phe Ser Ile Leu

Tyr Trp Leu Gly Asn Gly Ser 100

Phe Ile Glu His Leu Pro Gly Arg Lei

105 no

PL 206 070 B1

Trp Glu Gly Ser Thr Ser Arg Glu Arg Gly Ser Thr Gly Thr Gin Leu

115

120

125

Cys Lys Ala Leu Tal Leu Glu Gin Leu Thr Pro Ala Leu His Ser Thr

130

135

0

Asn Phe Ser Cys Tai Leu Val Asp Pro Glu Gin Val Tal Gin Arg His

5

150

155

160

Val Val Leu Ala Gin Leu Trp Ala Gly Leu Arg Ala mr Leu Pro Pro 165 170 175

Thr Gin Glu Ala Leu Pro Ser Ser His Ser Ser Pro Gin Gin Gin Gly

180

190 <210> 3 <211> 1038 <212> DNA <213> Homo saoiens <400> 3 gagaagagga tgaccatgag cccacgscat ctgcctcagt ctaagcagtg ctgagggcaa cagcagggtt cacaccccct cctacctaga ctatccatta aagactgttg tctggaagcc tcatttagtc cgt* acac cacr :aca :tgg :ctg ttcgtgctgt gggggcacca aaaggattat tagaagca ca tccagcattg ccttgccccc aagactcagc tacctggagt ccttctctgc aaatcacagc gccttcctaa atgccttagc tcccaactat ccgtcttcct agtgaagtca atgttttttt gctgcttcgg tcaatgga gataaagagc acaccaaacc gtcagagcca aaggacccct gaagtgacct cacccaagaa acagggccag gaacagtccc tttgggtccc ctccttataa cgtcctactc cttacactcc rcttgctttt caccgcccca tcctctttca tttccccctt atccacactg caggctcacc tcagcccttt cacctgtctc gcccctccca ggccagaggt gccctgccct cagcagcaca tgactgcctg ttctctcacc tgcctcctcc ctcacactgc agggccctac cccagacagc gcaggggaac gctctggccg cactctaatg tatctgtgtc agctcc’ gtgggtc gcagac:

gac :ctg :acc gcccccagtg ggaagtgcca ccagccacag accttgacca taggctgcgt aaattcaaac tcctgccatt tctactgctc ctgcatttcc tcccactccc gct caagcct cattctgcag gactgttcca atccccacat gcatgcatca ctcctgtgtg acagctgcca ttcccagcaa ctgagctggg cagtccacag gagcttgggt ggatgcgcaa tccattccca ctctctccac agaaaccacc cacatgactt atgtctctgc ggttgaaatg acttcctatc gggaagggat gggtcctcat

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1038 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sac

PL 206 070 B1 <220>

<221> SIGNAL <222> (1)..(28) <400> 4

Met 1

Ara

His

Asn

Trp 5

Thr

Pro

Asp

Leu

Ser 10

Pro

Leu

Val

Leu 15

Leu

Leu

Cys

Ala

His

V 3 -L

Val

Thr

Leu

Leu

Val

Arg

Ala

Thr

Pro

Val

Ser

20

25

30

Git.

Tr.r

Thr

Thr

Ala

Ala

Thr

A. 1a

Ser

Val

Arg

Ser

T r. r

Lys

Asp

P r o

35

i r\ 8 U

4 3

Cys

p r* .3

Ser

Gln

Pro

Pro

Val

Phe

Pro

Ala

Ala

Lys

Gir.

Cys

Pro

Ala

ru

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Tro

Pro

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Leu

Ser

Trp

Ala

Glu

65

70

75

80

Gly

/-i s r.

Leu

Ala

Prc

His

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala

Leu

Gir.

Pro

Gln

Gln

85

90

95

Ser

Thr

Ala

Ala

Gly

Leu

Arg

Leu

Ser

Thr

Gly

Pro

Ala

Ala

Ala

Gir.

100

105

110

Pro

<210 5 <211> 7063 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 5
gaattcgcgg	ccgcgtcgac	gccagagagg	ctaggatgag	agacagaggg	tgtgatgatg	60
ggtgctggga	aatgtacccg	accttggggc	tggtggctgg	gggagtgggt	agcctgggaa	120
aggccaggat	gtggacggac	tggtatggca	ttgagcctga	agtggtccaa	cttggggttc	180
cccagrgcct	aggaaagttg	tccccttgaa	tgtcagtgtg	aaggtgaagg	aggaagcaga	240
tgcctgt tca	tatggaaaca	aagacctggc	tgtgaagagg	ggaggcggac	accaaagtcc	300
tgacact tgg	gcagqacaga	attgatctgt	gagagactca	tetagtteat	accctaggtg	360
accctggggg	tggcatgggg	gtagattaga	gatcccagcc	tggtatcctc	tggagagtag	420
gaatccoagg	agctgaaggt	ttctggccac	tgaactttgg	ctaaaacaga	ggtgtcacag	480
ctgctcaaga	ttccctggtt	aaaaagtgaa	agtgaaatag	agggtcgggg	cagtgctttc	540
ccagaaggat	tgeteggeat	cctgcccttc	ccagaagcag	ctctggtgct	gaagagagca	600
ctgc :t net	gcgtgaccgg	gtgagt seat	a 11 c t c t c 11	tgggtctcaa	ttttgccttc	660

PL 206 070 B1

cctaatgaca	gggtaagatt	ggactaggt a	agcatct tac	aacca1t cgt	ggtcatgaga	720
gctggggtgg	ggaaggattg	tcacttgacc	cccccagctc	tgt t cctaag	tgctgaaaga	7 80
gctccaggct	atgctacggg	aggagaagcc	a q c t a c t g a g	gaaaagccag	ctactgagaa	340
aaagcgggag	tggtttacca	t tctcctccc	ccacctttca	cca g a g a a g a	ggacgttgtc	900
acacataaag	agccaggctc	accagctcct	gacgcatgea	tcatgaccat	gagacacaac	960
tggacaccag	acctcagccc	tctgtgggtc	ctgctcctgt	gtgcccacgt	cgtcactctc	1020
ctggtcagag	ccacacctgt	ctcgcagacc	accacagctg	ccactgcctc	agttagaagc	1080
acaaaggacc	cctgcccctc	ccaąccccca	gcgttcccag	cagctaagca	gcgtccagca	114 0
ttggaagtga	cctggccaga	ggtggaagtg	ccactgaatg	gaacgctgag	cttatcctgt	1200
gtggcctgca	gccgcttccc	caact ccagc	atcctctact	ggctgggcaa	tggttccttc	12 60
eit t <53 CJ C 3 CC	tcccaggccg	actgtgggag	gggagcacca	gccgggascg	tgggagcaca	1320
ggtacgcagc	tgtgcaaggc	ctcggtgctg	gagcagctga	cccctgccct	gcacagcacc	1380
aacttctcct	gtgtgctcgt	ggaccctgaa	caggttgtcc	agcgtcscgt	cgtcctggcc	1440
cagctctggg	tgaggagccc	aaggagaggc	ctccaggaac	aggaggagct	ctgcttccat	1500
atgtggggag	gaaagggtgg	gctccgccag	agcagcctgt	gaactaacgc	ccagca t tcc	1560
tcaaggtcag	ccagacaaaa	aggaacttag	gtcttgggca	gaggagg agt	agcctggggc	1620
aaagtgatga	gatgtccctc	ctttccttgg	cctgatcctt	gtctgccccc	act tccctag	168 0
gctgggctga	gggcaacctt	gccccccacc	caagaagccc	tgccctccag	ccacagcagt	1740
ccacagcagc	agggttaaga	ctcagcacag	ggccagcagc	agcacaacct	tgaccagagc	1800
ttgggcccta	cctgtctacc	tggagtgaac	agtccctgac	tgcctgtagg	ctgcgtggat	1860
gcacaacaca	ccccctcctt	ctctgctttg	ggtcccttct	ctcaccaaat	ccaaactcca	1920
ttcccaccta	cctagaaaat	cacagcctcc	ttataatgcc	tcctcctcct	gccattctct	198 0
ctccacctat	ccattagcct	tcctaacgtc	ctactcctca	cactgctcca	ctgctcsgaa	2040
accaccaaga	ctgctgatgc	ettagccttg	cactccaggg	ccctacctgc	att tcccaca	2100
t g a c 11t c t g	gaagcctccc	aactattctt	gcttttccca	gacagctccc	actcccatgt	2160
ctccgcaca*	ttagccccgt	cttccteacc	gccccagcag	gggaacgccc	aagcccggct	2220
gaaatgctgc	ctcttcagtg	aagtcatcct	ctttcagctc	tggccgcatt	CtęC3CJ3Cu t	2280
cctatccccg	tgctgtatgt	tttttttttc	cccct tcact	ctaatggact	gttccaggga	234 0
agggatgggg	gcagcagctg	cttcggatcc	acactgtatc	tgtgtcaccc	ccacatgggt	2400
cctcat aaag	gattattcaa	tggaggcatc	ctgacatctg	ttcatttagg	cttcagttcc	2 4 60
actcccagga	actttgcctg	tcccacgagg	gagtatggga	gagatggact	gccacacaga	2520
agctgaagac	aacacctgct	tcaggggaac	acaggcgctt	gaaaaagaaa	aaagagaaca	2580
gcccataatg	ctccccggga	gcagaggcca	ccaatggaga	gtgggaagag	cctggaaaga	2 64 0
tgtggcctca	ggaaaaggga	tgagagaaag	gaggtggtat	ggaagactca	gcaggaacaa	2700
ggtaggcttc	aaagagccta	tattcctctt	t ctcccacac	cgatcaagtc	aactcagtac	2760
tcacgggaga	aaaatagact	ttatttacaa	gtaataacat	ttagaaaaga	tccatccccg	2820
gcccttaaaa	accttcccat	cactccaaat	cccaccccag	tgcaagtctg	gggaaggtag	2880
ggtgtgagct	gctgctgaag	gctgtccccc	aaccccactc	ctgagacaca	gggcccatcc	2940
gtcctgggaa	agagcatcct	ctggcaggtg	ctcccaccag	gtcagaccca	gtcctggact	3000
tcaagagtga	gggcccccgc	tgggcccagc	caccaggaca	gcaggaacca	gggcctactc	3060
ctct tatggt	cccttctaga	tccagaggct	aagaggaaga	ctggccaggc	ccaaggaccc	3120
agccatcaaa	accagcctca	aatctggttg	tgatggagaa	gtgactttgc	tttaagaaaa	3180
aaggaggcaa	ggtagggaga	gcgcccacac	tgtccatgct	ccaggccccc	tgggccagct	3240
ccgagaaggc	gccagtgaag	gaccaggga c	caggccaggg	t g c g g g c a g g	catcactgtc	3300
tctaggggtt	tggctactgt	tggcctggga	gctgagagaa	ggcactgaga	gggacagtag	3360
gcggaggacc	aggtgacggc	agcatcgggg	acacaggtgg	ggccactcac	cggtaetggc	34 20
cctttagtgc	tttgcctgaa	agagacacag	tcacatgqcc	agatgagaac	ttgcgatact	3480
3 ę c c t ej c 3 c c	cactggctgg	g a a q a t c t c t	t cctgetccc	acgcccctgt	ctggatcccc	3540

PL 206 070 B1

tcccttgtga	gccccagggt	tatcagttgc
ccatgagaat	ggggccatct	gtcttccetc
ctcttacccc	acaccctcca	gcagcctggc
gcggtctggg	gggtgccca t	gctckcaccg
taccttgccc	ttggctcgag	gagtcg^acc
ggtggtggca	atgcgcggag	aacgg_^g~
cagggcct tc	tttaaggctc	cccgccgcag
gaggatgctg	aaggccatca	actggcgccg
ggagacccaa	tgctgccttc	ccaggccagc
cgccagggcg	tcgcttcatc	ccccttcagc
gctgctttct	tctgggcctc	agtagcgctc
gtcatggggc	gtgggaaaca	gctggtggcc
gcagacagta	gcaagaggag	tzcacat.CL.ga
tggaccttgt	aagtcaacgt	gcaacccgct
cttcccaaca	gttcccatcc	atgggtcagg
tgagggaagg	agagagaagg	ctccctttag
agtgctggag	taacacccag	gagccaccgc
gggctctagg	gagacccgtt	tgcgctgctg
ctggattggc	tgcatgctgg	ctcggcgcag
ctcatctgtg	atggtgccca	ggctcaggga
gaccatagct	gtatggagat	ggaggaggac
cgacacttat	ggtcgggacc	cttcctgcct
tgttctgctt	tctacctaag	ccctgggcaa
tcctctctga	gctcctgcct	acccccaggg
gt tccacctg	gaacatgaga	aggtcacccc
accctagtgc	tcaggctaga	tcagcaggtg
cctgcacagt	gaccccaggc	ctcaccctgg
ggggcacact	cgat tgcgct	gctgcagctc
aggctcatcc	tggcaagtgc	ccatgtagaa
gggaacaaat	gagcctggag	tcggcaggtc
tgctgccacc	taccccataa	acttgaagcc
tacaggagta	cggcacacag	actatttcta
ggagagggca	gaagaggtca	cacgcagaga
cttggtggcc	aacacccaga	ggaacaaatt
ctggtgccca	aaggacaaga	gcttccaaga
cccatcaccg	cctgagaagg	gcatggagga
gggaatcccg	ggcccttaac	tctggctaag
ggcaggtaag	gaaggccctg	aggctgcagg
aaggaggcca	gccttggatt	tttaaaaagc
ttccagtcta	attttggggt	atagtaagtc
ctggacaccc	cggcctggga	acgacgagca
aagctgagca	gggctgagtt	gccataatcg
gaggaggtgg	ctcgcaggct	agcctgggaa
gag t tggcgc	tgtctggccc	ttccacatct
agtgtacagt	ccctggcact	gtacagaagc
cacggcacat	ccatgtattc	ccaactgct t
g a a a t g g g c c	ttgtcgacag	aagccct tac
t a c g c a 1111	11 tcatggag	t c ta tttata

tggctgtgcc	tgagcagct c	tgggtgctct	3600
cttggagagg	agctaccagg	acagggacac	3660
gtggccccat	cttggatgct	acttggtggg	3720
ggtttccctc	ccccatcctg	ccagtgcctc	3780
aatggcggca	gcagtggcgg	cgctggctgt	3840
tccactgcga	gtgttggggg	aagccttgga	3900
aaggctgttc	cctagcttct	tgggtgtgtt	3960
gtcagcctgc	aaggaagggc	tgtcagaccg	4020
gtgctgtgcc	acgctgtacc	agcaaggtcc	4080
cccagcctca	cctgtttagt	agaagctgga	4140
tgtttgcgcc	cttcatgtcg	gtctcgggga	4200
ttcttagact	atggagaaga	gga cagtt a g	4 2 60
agccaggtgt	cttgtcctct	cagagctgag	4320
cccct tccca	actctgggcc	agaccctccc	4380
cccttggaga	gagggaaaga	gagggggaag	4 4 4 0
tccttggtga	gctgggccta	acccgagcac	4500
gcctacctca	ggagttccag	ggccctggtg	4560
ccgggtggtg	atgccagtgc	cctcggctat	4620
ggtctcttgg	gggtctccag	tttacatctc	4680
aggctgcatg	ggtggaagag	gtggtcagtg	474 0
ctggggctgt	tccagaactc	tacactcgcc	4800
acgaggtaga	aagacacaag	cctcctttcc	4860
atggcacaag	cagtgcagtc	ctgaccagat	4 920
acttcacccc	tgagtgccct	ccagctgtct	4 980
uLCCCCtCut	cggccagtca	gtgatccagg	5040
ggattccaag	gaagggcagg	gatgggaggc	5100
actccaggga	tagcaggtct	tcagatgtgg	5160
tgcaatgcgg	ttccagtcat	ccagctgctc	5220
gctgt tcct t	cctgtggaag	gcagggaagt	5280
acctcctggc	cctggcatct	tgccagcctt	5340
cggcacacca	gtctgattca	gtgccgcagg	5400
tcctaggggc	ttgctcacca	ccttctccct	54 60
ctgctactac	atcttattca	cctaccaagg	5520
aaggaccggg	aattaattcc	caggggctcc	5580
agagtctggc	cagcctggcc	tttccagcag	5640
ctccccacag	ctaagtgtca	caattgtgct	5700
agtgccccca	acacagccag	cccctagatg	5760
aaggaggggc	aggtggagct	ggatggtagc	5820
tttcctcttt	tccctgtgcc	acgatccacc	5880
cctgtagtcc	cctcacctgg	aggggcccca	5940
gaactgcgag	tggtggggcg	gtagccaggc	6000
ggagaaccca	ggcgagctag	agactgagta	6060
gcaggagcag	accgcgtgct	gtagaacgat	6120
aacttctgga	agacagagtg	aatctgt tgc	6180
ttcccattcc	cttccgaagc	cctcagatcc	6240
tgcaaaggtc	cttaaagtgt	gtgtctgcaa	6300
aaggtggtgc	tgatgc tgtc	aagactcttc	6360
a t g c 11.1 g a g	gtagggaatg	caga gtgt t1	6420

PL 206 070 B1 atcggcccat tttggagatg aagtgcaaag aaataaagtg actagcccca aatcacactg 6430 ctaggaagta tcagagctgg ggctaggccc catgtctcct gactagtcag gctcatccca 6540 cagcctctgc tgtccctcag tccaaacttc cagggccctt accargttcc agaacttccc 6600 ccaacttctt ggtagcaggg ggcaccctaa acacacaggt cccccctgct gtaccagggg 6660 ccccctctcc cctcctccca aacctcccct tcaagatgtg gaaacaaagg caagggcctg 6720 cagcctgtca ggcagtccac tgggcagcaa caatgcctct cagctgcatg gggcatgctg 6730 ggaggcacag gatgggctgc agcttcgcca cgttctctcc cctaacccrg cacaggctca 6840 gtgctacgca tggagagaat gctagcctta gtcaggaggc agggatctaa tcctagccct 6900 gcctttttct tcagaagtgc ccttaaccaa gtcactgccc tttttaagac ctctcagctt 6960 tcccactgta acatggactg gctgctcatc cctccctgct cctgactgag tgcccagtgc 7020 aaagatgccc ttgagaggaa gtgggaattg ctgacctgtc gac 7063 <210> 6 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNAL <222> ( 1) . . (28)

<400> 6

Leu

Ser 10

Pro

Leu

T ro

Tal

Leu 15

Leu

Met 1

Arg

His

Asn

Trp 5

Thr

Pro

Asp

Leu

Cys

Ala

His

V a 1

Val

Thr

Leu

Leu

Tal

Arg

Ala

ThlT

Pro

Tal

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Thr

Ala

Ser

Tal

Arg

Ser

T Y

Lys

Asp

Pro

35

40

4 5

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Pro

Val

Phe

Pro

Ala

Ala

Lys

Gir

Cys

Pro

Ala

50

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Leu

Asn

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Cys

Ser

Arg

Phe

Pro

Asn

Phe

Ser

Ile

Leu

δ 5

90

95

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Gly

Ser

Phe

Ile

Glu

His

Leu

Pro

Gly

Arg

Leu

100

105

110

Trp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ser

Arg

Glu

Arg

Gly

Ser

Thr

Gly

Thr

Gin

Leu

115

120

12 5

Cys

Lys

Ala

Leu

V a 1

Leu

Glu

Gin

Leu

Thr

Pro

Ala

Leu

H i s

Ser

Thr

130

13 5

140

PL 206 070 B1

Asn 14 5

Phe

Ser

Cys

Val

Leu 150

Tai

Asp Pro

Glu

Gln 155

V'al

Val

Gln

Arg

His 1 c 0

Vai

Va 1

Leu

Ala

Gin

Leu

Trp

Val Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

ciy

Leu

Gln

165

170

175

G i u

Gln

Glu

Glu

Leu

Cys

Phe

His Met

Trp

Gly

ciy

Lys

Gly

Gly

Leu

180

18 5

190

Cys

Gin

Ser

Ser

Leu

195 <210> 7 <211> 1360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcggccgcgt aagcttctgg acagataaag tggacaocag ctggtcagag acaaaggacc ttggaagtga gtggcctgca attgagcacc ggctgggctg tccacagcag ct tgggt cct tgcgcaacac attcccacct tctccaccta aaccaccaag atgactttct tctctgctca tgaaatgctg tcctatcttc aagggatggg tcctcataaa cact cccagg cgaccacgca aaaggaaggc agccaggctc acctcagccc ccacacctgt cctgcccctc cctggccaga gccgcttccc tcccaggccg agggcaacct cagggttaag acctgtctac accccctcct acctagaaaa tccattagcc actgttgatg ggaagcctcc tttagtcccg cctcttcagt gtgctgtatg ggcagcagct ggattattca aact ttgcct gctaaacaca tcttcaggac accagctcct Lttgtgggtc ctcgcagacc ccagccccca ggtggaagtg caact tcagc actgtgggag tgccccccac acicacjcace ctggagtgaa tctctgcttt tcacagcctc ttcctaacgt ccttagcctt caactattct tcttcctcac gaagtcatcc gcttcggatc atggaggcat gtcccacgag gctaacttga ctcttaggag gacgcatgca ctgctcctgt accacagctg gtgttcccag ccactgaatg atcctctact gggagcacca ccaagaagcc gggccagcag cagtccctga gggtcccttc cttataatgc cctactcctc gcactccagg tgcttttccc cgccccagca tctttcagct cccccttcac cacactgtat cctgacatct ggagtatggg gtcttggagc ccaaagaaga tcatgaccat gtgcccacgt ccactgcctc cagctaagca gaacgctgag ggctgggcaa gccaggaacg ctgccctcca cagcacaacc ctgcctgtag tctcaccaaa ctcctcctcc acactgctct gccctacctg agacagctcc ggggaacgct ctggccgcat tctaatggac ctgtgtcatc gtccatttag tcctaaaggg ggacgttgtc gagacacaac cgtcactctc agttagaagc gtgtccagca cttatcctgt tggttccttc tgggagcaca gccacagcag ttgaccagag gctgcgtgga ttcaaactcc tgccattctc actgctcaga catttcccac cactcccatg caagcctggt tctgcagact tgttccaggg cccacatggg gcttcagttc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1360 <210> 6 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 206 070 B1 <220>

<221> SIGNAŁ <222> (1)..(23)

<400> 8

Leu

T1 vx-«.

V 3 i.

Leu i a

Leu

Met

Arg

His

Asn

Trp 5

Thr

Pro

Asp

Leu

Ser 10

Pro

Leu

Cys

Ala

His

Val

Va 1

Thr

Leu

Leu

Tal

Arg

Aia

Thr

Pro

V a 1

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Thr

Thr

Ala

Aia

Thr

Ala

Ser

Val

Arg

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

35

40

4 5

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Pro

Vai

Phe

Pro

Ala

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

50

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu

Vr<3 i

Glu

Vai

Pro

Leu

Asn

Thr

Leu

6 5

70

75

80

Ser

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Cys

Ser

Arg

Phe

Pro

Asn

Phe

Ser

Ile

Te u

85

90

95

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Gly

Ser

?he

Ile

Glu

His

Leu

Pro

Giy

Arg

Lea

100

105

i 10

Trp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ser

A r o

- lL tu

Arg

Gly

Ser

Thr

G - y

Trp

Al a

G1 a

115

12 0

12 5

Gly

Asn

Leu

Ala

Pro

His

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Gin

Gin

130

135

140

Ser

Thr

Ala

Ala

Gly

Leu

Arg

Leu

Ser

Thr

ciy

Pro

Ala

Ala

Ala

Gin

145

150

155

160

Pro <210> 9 <211> 7812 <212> DNA <213> Homo Jdp.ens <400> 9 gtcgaoggta cccccgggaa agatccaata ogactcacta ctgtgagaga ctcatctago toatacccoa ggtgaccctg tagggcggga ggggrgocat cagaac tgat gggggt aga t

120

PL 206 070 B1

tagagstccc	agtctggtat	cctctggaga	gtaggagtcc	caggagctga	aggtt tctgg	180
ccactgaact	ttggctaaag	cagaggtgtc	acagctgctc	aagattccct	ggttaaaaag	240
tgaaagtgaa	atagagggtc	gggg^Tig.g.	tt tcccagaa	ggattgeteg	g” ic c - g c c	300
cttcccagaa	gcagctccgg	cgccgaagag	a g c a c t g c c t	ccctgtgt ga	ctgggtgagt	360
ccatattccc	tet ttgggtc	ccaattttgc	ct tccctaat	gaaggggtaa	gactggacta	420
ggtaagcacc	ttacaaccac	ctgcggccat	gagagctggg	gtggggaagg	attgtcactt	480
gaccccccca	gctctgtttc	tL33ijtgiCIlCJ3	aagagctcca	ggetatgeta	cgggaggaga	540
agccagctac	tgaggaaaag	ccagctactg	agaaaaagcg	ggagtggtcr	accattctcc	600
tcccccacct	ttcaccagag	aagaggacgt	tgceaeacat	aaagagccag	gctcaccagc	660
tcctgacgca	tgcatcatga	cca tgagaea	caactggaca	ccaggtaggc	cttggggcta	720
cgcatgggca	ggcggggtag	ggtgaggtct	atgaacagaa	tggagcaatg	ggctaacccg	780
gagcct tcac	tccaaggcaa	eiC C&CCC3ęC	gcacctggcg	ctgttgcttt	aagaacctgg	8 4 0
gcagataccg	cagctctggc	tccagtctaa	agettetetg	tactctgttc	aataaagggc	900
taaggggtgg	gtgctgaggg	g-ccctctrc	ccgctetgat	t C c C . g g c . a	gaacccagac	960
atctctgggc	tggagt taca	OcctLacccg	ggcagcccsc	tctgteccca	gagccgctga	1020
cctgtaactg	tcctttcctc	agacctcagc	cctttgtagg	tcctgctcct	gtgtgcecac	1080
gtcgtcactc	tcetggtcag	agccaeacet	gtetegeaga	ccaccacagc	tgccaetgec	1140
tcagttagaa	gcacaaagga	cccctgcccc	tcccagcccc	cagtgttccc	agcagctaag	1200
cagtgtccag	cattggaagt	gacctggcca	gaggtggaag	tgccactgag	t aagaagcac	1260
agtggtggag	ggtgggctat	gggcacagag	gttcccaggg	tcgggttgac	tcctgagcgc	1320
cagtcccctt	etgccca tgt	accaccagct	gagccagctg	ggctgagcac	gcaccattct	1380
ccctccccaa	cccagtgtca	tgggtgcagg	cttggcgcag	ctcccaagat	gctccctate	1440
aaataggaca	gagaactcaa	gacataagta	atggtcacag	gacctcecag	agccttggtt	1500
gcagtggacc	ccaaggccag	cccctecacc	cagagcctgc	tggcctctgg	ccatctcaga	1560
ggagcagcag	ccatccagca	ctgcctctgt	cacctgggcc	CCC33GtC3C	cgaggctggg	1620
cactagaaaa	ggteatcctg	sggsgaCsgg	ttcagaagag	O3ttC3tC3C	gtgaaccaag	1680
gaecatccct	cacattccce	gtgr.ttaggg	ctagggcctc	tcggagacaa	ctgcacttct	1740
gtaacggacg	tteccaccta	ggcggcgtgc	agagcagtcc	tctaggttcc	agatgeatgg	1800
ggactggggg	gagetggcag	agagggcaca	gcagagcagg	gtaggggaag	ggcctgctct	1860
tctgaagagc	taactgctge	ccgtgtccct	agatggaacg	ctgagcttat	cctgtgtggc	1920
ctgcagccgc	ttccccaact	tcagcaccct	ctactggccg	ggeaacggtt	ccttcattga	1980
gcacctccca	ggccgaccgt	gggaggggag	caccaggtga	gggtegcagc	agccaggtgg	2040
gtgggaagga	agccttctge	ggcct tetea	tgaectttcc	ttcccttccg	ctccagccgg	2100
gaacgtggga	gcacaggtac	gcagctgtgc	aaggccttgg	tgctggagca	gctgacccct	2160
gccctgcaca	gcaccaactt	ctcccgtgtg	ctcgtggacc	ctgaacaggt	tgtccagcgt	2220
cacgtegtcc	tggcccagct	ctgggtgagg	agcccaagga	gaggcetcca	ggaacaggag	2280
gagctctgct	tccatatgtg	gggaggaaag	ggtgggctct	gccagagcag	cctgtgaact	2340
aacgcccagc	attcctcaag	gtcagccaga	caaaaaggaa	cttaggtctc	gggcagagga	2400
ggcgtagcct	ggggcaaagt	gatgagatgt	ccctcctttc	cttggcetga	tccttgtctg	2460
ccttcacttc	cctaggctgg	gctgagggca	accttgcccc	ccacccaaga	agccctgccc	2520
tccagccaca	gcagtccaca	gcagcagggt	taagactcag	cacagggcca	gcagcageac	2580
aaccttgacc	agaget tggg	tcctacctgt	ctacctggag	tgaacagtcc	ctgactgcct	2540
gtaggctgcg	tggatgegea	acacaccccc	tccttetctg	ctttgggtcc	cttctctcac	2700
caaattcaaa	ctccattccc	acctacctag	aaaatcacag	cctcct tat a	atgcctcctc	2 7 60
ctcct gccat	tctcteteca	cctatccatt	agcct tccta	acgtcctact	cctcacactg	2820
ctctactgcc	cagaaaccac	caagactgtt	gatgeettag	ccttgcactc	cagggcceta	2880
cctgcsc tcc	ccacatgact	r. r ctggaagc	ctcccaacta	ttettgett t	tcccagacag	2940
ctcccacccc	catgtccct c	ar. cat tt agt	cccgccttce	teaccgccee	agcaggggaa	3000

PL 206 070 B1

cgctcaagcc	tggttgaaat	Ig c-Y* C*	cagtgaagtc	atcctccttc	agctctggcc	3060
gcattctgca	gacttcctat	cttcgtgctg	tatgtttttt	ttCtCCCGCt	tcactctaat	3120
ggactgttcc	agggaaggga	tgggggcagc	agctgcttcg	ga tceseacc	gtatctgtgt	318 0
catccccaca	tgggtcctca	taaaggatta	ttcaatggag	gc atcctgac	atctgtccat	3240
ttaggcttca	gttccactcc	caggaac c 11	gcctgtccca	cgagggagta	tgggagagat	3300
ggactgccac	acagaagctg	aagacaacac	ctgcttcagg	ggaacacagg	cgcttgaaaa	3360
agaaaagaga	gaacagccca	taatgctccc	cgggagcaga	ggccacraat	ggagagtggg	3420
aagagcctgg	aaagatgtgg	cctcaggaaa	agggatgaga	gaaaggaggt	ggtatggaag	34 8 0
actcagcagg	aacaaggtag	gcttcaaaga	gcccatattc	ctctttttcc	cacaccgatc	354 0
aagtcaacLc	agtactcacg		agactttatt	tacaagtaat	aacatttaga	3600
aaaga tccat	ccccggccct	L3ćlcl3ęŁCCTIt	cccatcactc	caaatcccac	cccagtgcaa	3660
gtctggggaa	ggtagggtgt	gagctgecęc	tgaaggctgt	CCCCC33CCC	cactcctgag	3720
acacagggcc	catccgtcct	gggaaagagc	atcctctggc	aggtgctccc	accaggtcag	3780
acccagtcct	ggacttcaag	agtgagggcc	cctgctgggc	c c a g c c a c c a	ggacagcagg	384 0
aaccagggcc	tactcetctc	atggtccctt	ctagatccag	aggctaagag	gaagactggc	3900
caggcccaag	gacccagcca	tcaaaaccag	cctcaaatct	ggttgrgatg	gagaagtgac	3960
tttgctttaa	gaaaaaagga	ggcaaggtag	ggagagcgcc	cacactgtcc	atgctccagg	4020
ccccctgggc	cagctccgag	aaggcgccag	tgaaggacca	gggaccaggc	cagggtgcgg	4080
gcaggcatca	ctgtctccag	gggtttggec	actgttggcc	tgggagctga	gagaaggcac	4140
tgagagggac	agtaggcgga	ggaccaggtg	acggcagcat	cggggacaca	ggtggggcca	4200
ctcactggta	ctggccccct	agtgctttgc	ctgaaagaga	cacaatcaca	tggccagatg	4260
agaact tgcg	atactagcct	gcacccactg	gctgggaaga	tctcttcctg	ctcccacgec	4 320
cctgtctgga	tcccctccct	cgtgagcccc	agggttatca	g t c α c '— c	gtgcctgagc	4 38 0
agctctgggt	gctctccatg	agaatggggc	catctgtctt	ctctccttgg	agaggagcta	4440
ccaggacagg	gacacctctr	accccacacc	ctccagcagc	ctggcgtggc	cccatcttgg	4500
atgctacttg	gtggggcggt	ctggggggtg	cccatgctct	catcgggctt	ccct ccccca	4 560
tcctaccagt	gcctctacct	o c e1— 11 g Gj ι·—	tcgaggggtg	gcaccaatgg	cggcagcagt	4 620
ggcggcgctg	gctgtggtgg	tggcaatgcg	cggagaacgg	cgggttccac	tgcgagtgtt	4680
gggggaagcc	ttggacaggg	ccttctttga	ggctccccgc	cgcagaaggc	tgttccctag	4740
cttcttgggt	gtgttgagga	tgctgtiaggc	catcgactgg	cgccggtcag	cctgcaagga	4 800
agggctgtca	gaccgggaga	cccaatgctg	ccttcccagg	ccagcgtgct	gtgccacgct	4860
gtaccagcaa	ggtcccgcca	gggcgtcgct	tcatccccct	tcagccccag	cctcacccgt	4920
ttagtagaag	ctggagctgc	rttcttctgg	gcctcagtag	tgctctgttt	gcgcccttca	4980
tgtcggtctc	ggggagtcat	ggggcgtggg	aaacagctgg	tggccttctt	agactatgga	5040
gaagaggaca	gttaggcaga	cagtagcaag	aggagtcaca	tctgaagcca	ggtgtcttgt	5100
cctctcagag	ctgagtggac	cttgtaagtc	aacgtgcaac	ctgctcccct	tcccaactct	5160
gggccagatc	cttcccttcc	caacagttcc	catccatggg	tcaggccctt	ggagagaggg	5220
aaagagaggg	ggaagtgagg	gaaggagaga	gaaggctccc	tt tagtcctt	ggtgagctgg	5280
gcctgacctg	agcacagtgc	cggagtaaca	cccaggagcc	accgcgccta	cctcaggagt	534 0
tccagggccc	tggtggggct	ctagggagac	ccgtttgcgc	tgctgccggg	tggtgatgcc	5400
agtgccctcg	gctatctgga	ttggctgcat	gctggctcgg	cgcagggtct	cttgggggtc	54 60
tccagttttc	a tctcctcat	ctgtgatggt	gcccaggctc	agggaaggct	gcatgggtgg	5520
aagaggtggt	cagtggacca	tagctgtata	gagatggagg	aggacctggg	gctgttccag	5580
aactctacac	tcgcccgaca	cttatggtcg	ggc ccc ttcc	tgectacgag	gtagaac gac	5 64 0
acaagcctcc	tttcctgttc	tgctttctac	ct aagccctą	ggcaaatggc	acaagcag tg	5700
cagtcctgac	cagattcctc	tctgagctcc	tgcctacccc	cagggacttc	acccctgagt	5760
gccctccagc	tgtctgt tcc	acctggaaca	cgagaaggtc	accccr tccc	ctcttcggcc	5820
agt cagtgat	ccagggccct	agtgctcagg	ctagatcagc	aggtgggar. t	ccaaggaagg	5880

PL 206 070 B1

gcagggatgg	gaggccctgc	acagtgaccc	caggcctcac	c c l g g a c c c c	agggatagca	5940
ggtcttcaga	tgtggggggc	acactcgatt	gcgctgctgc	agctctgcaa	tgcggttcca	6000
gtcatccagc	tgctcaggct	catcctggca	agtgcccatg	tagaagctgt	tccttcctgt	6060
ggaaggcagg	gaagtgggaa	caaatgagcc	tggagtcggc	aggtcacctc	ctggccctgg	6120
catct tgcca	gcccttgctg	ccacctaccc	cataaacttg	aagcccggca	caccagtctg	6180
atccagtgcc	gcaggtgcag	gagtacggca	cacagactat	ttcrarccta	ggggcttgct	6240
caccaccttc	tccctggaga	gggcagaaga	ggtcacacgc	agagactgct	actacatct t	6300
attcacctgc	caaggcttgg	tggccaacac	ccagaggaac	aaattaagga	ccgggaatta	63 60
attcccaggg	gctccctggt	gcccaaagga	caagagcttc	caagaagagt	ctggccagcc	6420
tggcccttcc	agcagcccat	caccgcctga	gaagggcatg	gaggactccc	cacagctaag	6480
tgtcacaatt	gtgctgggaa	tcccgggccc	ttaactctgg	ctaagagtgc	ccccaacaca	6540
gccagcccct	agacgggcag	gtaaggaagg	ccctgaggct	gcaggaagga	ggggcaggtg	6600
gagctggatg	gtagcaagga	g g c c a g c o ct	ggatttttaa	aaagctttcc	tcttttccct	6660
gtgccacgat	ccaccctcca	gtctaatttt	ggggtatagt	aagtccctgt	agtcccctea	6720
cctggagggg	ccccactgga	caccccggcc	tgggaacgac	gagcagaact	gcgagtggtg	6780
gggcggtagc	caggcaagct	gagcagggct	gagttgccat	aatcgggaga	acccaggcga	6840
gctagagact	gagtagagga	ggtggctcgc	aggctagcct	gggaagcagg	agcagaccgc	6900
gtgctgtaga	acgatgagtt	ggcgctgtct	ggctcttcca	catctagctt	ctggaagaca	6960
gagtgaatcr	gttgcagtgt	acagtccctg	gcactgtaca	gaagcttccc	attcccttcc	7020
gaagccccca	gatcccacgg	cacatccatg	tattcccaac	tgctttgcaa	aggtccttaa	7080
agtgtgtgtc	tgcaagaaat	gggccttgtc	gacagaagcc	ctcacaaggt	ggtgctgatg	7140
ttgtcaagac	tct tccacgc	atctttttca	tggagtctat	tcataatgct	ttgaggtagg	7200
gaatgcagag	tgcctatcgg	cccattttgg	agatgaagtg	caaagaaata	aagtgactag	7260
ccccaaatca	cactgctagg	aagtatcaga	gctggggcta	ggccccatgt	ctcctgacta	7320
gtcaggctca	tcccacagcc	tctgcrgtcc	ctcagtccaa	acttccaggg	cccttaccat	7380
gctccagaac	ttcccccaac	ttcttggtag	cagggggcac	cctaaacaca	caggtccccc	7440
ctgctgtacc	aggggccccc	tctcccctcc	tcccaaacct	ccccttcaag	atgtggaaac	7500
aaaggcaagg	gcctgcagcc	tgtcaggcag	tccactgggc	agcaacaatg	ccrctcagct	7560
gcatggggca	tgctgggagg	cacaggatgg	gctgcagctt	cgccacgttc	tctcccttca	7620
ccccgcacag	gctcagtgct	acgcatggag	agaatgctag	ccttagtcag	gaggcaggga	7680
rctsatccta	gcccrgcctt	trtcttcaga	agtgccctta	accaagtcac	tgcccttttt	7740
aagacctctc	agctttccca	ctgtaacatg	gactggctgc	tcatccctcc	ctgctcctga	7800
ctgagtgccc	ag					7812
<210> 10
<211> 40
<212> PRT
<213> Homo	sapiens
<400> 10
Thr Pro Val	. Ser Gin Thr Thr Thr Ala Ala Thr	Ala Ser Val	Arg Ser
1	5		10		15
Thr Lys Asp	; Pro Cys Pro Ser Gin ί	’ro Pro Val	Phe Pro Ala	Ala Lys
	20		25	30
Gin Gys Prc	? Ala Leo G1	o Val Thr

5 4 O

Claims (44)

1. Izolowane białko wiążące IL-18 (IL-18BP) wybrane z grupy składającej się z: (a) polipeptydów zawierających sekwencję aminokwasową AA1-AA192 SEK. NR ID.: 2, AA29-AA192 SEK. NR ID.: 2, AA1-AA197 SEK. NR ID.: 6 lub AA29-AA197 SEK. NR ID.: 6, (b) mutein wykazujących co najmniej 90% identyczność z IL-18BP jak określono w (a), białek fuzyjnych, chemicznie modyfikowanych pochodnych, kołowo permutowanych pochodnych oraz ich mieszanin polipeptydów określonych w (a), które wiążą się z IL-18 oraz blokują indukowane przez IL-18 wytwarzanie IFN-γ.

2. Izolowane białko wiążące IL-18 według zastrz. 1, znamienne tym, że jest białkiem niewirusowym.

3. Izolowane białko wiążące IL-18 według zastrz. 2, znamienne tym, że jest białkiem ludzkim.

4. Izolowane białko wiążące IL-18 według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienne tym, że jest białkiem o ciężarze cząsteczkowym około 40 kD.

5. Izolowane białko wiążące IL-18 według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że jest białkiem fuzyjnym obejmującym immunoglobulinę lub jej fragment.

6. Izolowane białko wiążące IL-18 według zastrz. 5, znamienne tym, że jest białkiem fuzyjnym IL-18BP z regionem stałym łańcucha ciężkiego IgG2.

7. Izolowane białko wiążące IL-18 według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienne tym, że chemicznie modyfikowana pochodna obejmuje łańcuchy boczne poliglikolu etylenowego.

8. Izolowane białko wiążące IL-18 według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienne tym, że jest w postaci rozpuszczalnej.

9. Izolowane białko wiążące IL-18 według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienne tym, że jest glikozylowane.

10. Izolowane białko wiążące IL-18 według jednego z zastrz. 1 do 8, znamienne tym, że jest nieglikozylowane.

11. Izolowana cząsteczka DNA kodująca IL-18BP określone w jednym z zastrz. 1-10.

12. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 11, znamienna tym, że jest zaopatrzona w kodon stop na końcu 3'.

13. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 11 albo 12, znamienna tym, że jest funkcjonalnie połączona z innymi sekwencjami DNA umożliwiającymi ekspresję, takimi jak promotory lub wzmacniacze.

14. Izolowana cząsteczka DNA według jednego z zastrz. 11 do 13, znamienna tym, że jest genomowym DNA.

15. Izolowana cząsteczka DNA według jednego z zastrz. 11 do 14, znamienna tym, że jest cDNA.

16. Cząsteczka cDNA według zastrz. 15, znamienna tym, że obejmuje sekwencję cDNA wybraną z grupy sekwencji SEK. NR ID.: 1 i 5.

17. Cząsteczka cDNA według zastrz. 15 albo 16, znamienna tym, że jest przystosowana do ekspresji w gospodarzu bakteryjnym.

18. Izolowana cząsteczka DNA zawierająca sekwencję DNA przedstawioną w SEK. NR ID.: 1 lub 5, przy czym DNA koduje IL-18BP określoną w jednym z zastrz. 1-10.

19. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 18, znamienna tym, że jest funkcjonalnie połączona z innymi sekwencjami DNA umożliwiającymi ekspresję, takimi jak promotory lub wzmacniacze.

20. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 18 albo 19, znamienna tym, że jest genomowym DNA.

21. Izolowana cząsteczka DNA według jednego z zastrz. 18 do 20, znamienna tym, że jest cDNA.

22. Cząsteczka cDNA według zastrz. 21, znamienna tym, że obejmuje sekwencję cDNA wybraną z grupy sekwencji SEK. NR ID.: 1 i 5.

23. Cząsteczka cDNA według zastrz. 21 albo 22, znamienna tym, że jest przystosowana do ekspresji w gospodarzu bakteryjnym.

24. Zdolny do replikacji wektor zawierający cząsteczkę DNA określoną w jednym z zastrz. 11 do 23.

25. Transformowana komórka gospodarza zawierająca wektor określony w zastrz. 24.

26. Transformowana komórka gospodarza według zastrz. 25, znamienna tym, że jest komórką eukariotyczną.

27. Transformowana komórka gospodarza według zastrz. 26, znamienna tym, że jest komórką ssaka.

PL 206 070 B1

28. Transformowana komórka gospodarza według zastrz. 27, znamienna tym, że jest wybrana z spośród komórek ludzkich, małpy, myszy oraz komórek jajnika chomika chińskiego (CHO).

29. Transformowana komórka gospodarza według zastrz. 25, znamienna tym, że jest komórką prokariotyczną.

30. Przeciwciało specyficznie reagujące z polipeptydem o sekwencji przedstawionej w SEK. NR ID.: 2 lub 6.

31. Przeciwciało według zastrz. 30, znamienne tym, że jest przeciwciałem poliklonalnym.

32. Przeciwciało według zastrz. 30, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.

33. Przeciwciało według zastrz. 30, znamienne tym, że jest przeciwciałem chimerowym.

34. Przeciwciało według zastrz. 33, znamienne tym, że jest przeciwciałem humanizowanym.

35. Przeciwciało antyidiotypowe wobec przeciwciała określonego w zastrz. 30.

36. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera IL-18BP określone w jednym z zastrz. 1-10.

37. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera DNA kodujący IL-18BP określone w jednym z zastrz. 1-10.

38. Sposób wytwarzania IL-18BP określonego w jednym z zastrz. 1 do 10, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w jednym z zastrz. 25 do 29 w warunkach odpowiednich do ekspresji IL-18BP.

39. Sposób wytwarzania IL-18BP według zastrz. 38, znamienny tym, że ponadto obejmuje izolowanie IL-18BP.

40. Sposób izolowania IL-18BP określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje:

a) przepuszczanie płynu ustrojowego przez kolumnę chromatograficzną, której złoże jest sprzęgnięte z IL-18;

b) wymywanie związanego IL-18BP; oraz

c) oczyszczanie białka.

41. Zastosowanie IL-18BP określonego w jednym z zastrz. 1 do 10 do wytwarzania leku do leczenia chorób autoimmunizacyjnych, cukrzycy typu I, posocznicy, odrzucania przeszczepów, reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalnej choroby jelit, stwardnienia rozsianego, choroby niedokrwiennej serca, włącznie z zawałem serca, niedokrwiennego urazu mózgu, łuszczycy, ostrego lub przewlekłego zapalenia wątroby, oraz ostrego lub przewlekłego zapalenia trzustki.

42. Zastosowanie IL-18BP określonego w jednym z zastrz. 1 do 10 do oczyszczania IL-18.

43. Zastosowanie przeciwciał określonych w zastrz. 30 do 35 w teście wykrywającym IL-18BP.

44. Zastosowanie cząsteczki DNA kodującej IL-18BP określonego w zastrz. 1 do 10 do wytwarzania leku do terapii genowej.