JP2003524600A - 免疫関連疾患治療のための組成物及び方法 - Google Patents

免疫関連疾患治療のための組成物及び方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なタンパク質を含有する組成物及び免疫関連疾患の治療及び診断方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、免疫関連疾患の診断及び治療のための組成物及び方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 免疫関連及び炎症性疾患は、正常な生理では傷害又は損傷に対する反応、傷害
又は損傷からの修復の開始、及び外来生物体に対する生得的又は獲得的防御に不
可欠である全く複雑で多くは複数の相互に関連する生物学的経路の顕現又は結果
である。疾患又は病理は、これらの正常な生理学的経路が、反応の強さに直接関
連して、異常な調節又は過剰な刺激の結果として、自己に対する反応として、又
はこれらの組み合わせとして、さらなる傷害又は損傷を起こす場合に生ずる。 これらの疾患の起源は、しばしば多段階の経路及びしばしば複数の異なる生物
学的系／経路を含み、これらの一又は複数の経路の臨界点における介入は寛解的
又は治療的効果を持つことができる。治療的介入は、有害な過程／経路の拮抗作
用又は有益な過程／経路の刺激のいずれかによって起こりうる。 多くの免疫関連疾患が知られ、広範に研究されている。そのような疾患は、免
疫媒介炎症性疾患、非免疫媒介炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全疾患、腫瘍形
成などを含む。 Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は哺乳動物の免疫反応の重要な成分である。Ｔ細胞は、
腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣ）内の遺伝子にコードされる自己分子に関連する
抗原を認識する。抗原は、抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片な
どの表面上でＭＨＣ分子とともに提示される。Ｔ細胞系は、宿主哺乳動物の健康
を脅かすこれらの変化した細胞を除去する。Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞及び細胞傷
害性Ｔ細胞を含む。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞上の抗原-ＭＨＣ複合体の
認識に続いて多数増殖する。ヘルパーＴ細胞はまた、種々のサイトカイン、例え
ばＢ細胞の活性化で中心的役割を担うリンホカイン、細胞障害性Ｔ細胞及び免疫
反応に酸化する他の種々の細胞を分泌する。
【０００３】 体液性及び細胞媒介免疫反応の両方における中心的事象は、ヘルパーＴ細胞の
活性化及びクローン性増殖である。ヘルパーＴ細胞活性化は、Ｔ細胞レセプター
（ＴＣＲ）-ＣＤ３複合体と抗原提示細胞表面上の抗原-ＭＨＣとの相互作用によ
って開始される。この相互作用は生物学的事象のカスケードを媒介し、これが休
止中のＴ細胞の細胞周期（Ｇ0〜Ｇ1過渡期）への進入を誘発し、ＩＬ-２及び場
合によってはＩＬ-４に対する高親和性レセプターの発現をもたらす。活性化Ｔ
細胞は、サイクル増殖及び免疫記憶細胞又は効果細胞への分化を通して進行する
。 ＴＣＲを通して媒介されるシグナルに加えて、Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細
胞によって放出されたサイトカインにより、又は抗原提示細胞上の膜結合分子及
びＴ細胞の相互作用を通して誘発される付加的な同時刺激を含む。ＩＬ-１及び
ＩＬ-６は同時刺激シグナルを提供することが示された。また、抗原提示細胞の
表面に発現されるＢ７分子とＴ細胞表面に表現されるＣＤ２８及びＣＴＬＡ-４
分子との間の相互作用もＴ細胞活性化に影響する。活性化されたＴ細胞は、増大
した数の細胞接着分子、例えばＩＣＡＭ-１、インテグリン、ＶＬＡ-４、ＬＦＡ
-１、ＣＤ５６などを発現する。 混合リンパ球培養又は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞増殖は、化
合物が免疫系を刺激する能力の確立された表示である。多くの免疫反応において
、炎症性細胞は傷害又は感染部位に浸潤する。泳動細胞は好中球、好酸球、単球
又はリンパ球であってよい。感染組織の組織学的試験は反応の免疫刺激又は阻害
の証拠を提供する。Current Protocols in Immunology, 編集 E. Coligan, 1994
, John Wiley and Sons, Inc. 免疫関連疾患は免疫反応の抑制によって治療できる。免疫刺激活性を持つ分子
を阻害する中和抗体の使用は、免疫媒介及び炎症性疾患の治療において有益であ
ろう。免疫反応を阻害する分子は、免疫反応を阻害し、よって免疫関連疾患を寛
解するために利用できる（タンパク質で直接又は抗体アゴニストの使用を介する
）。
【０００４】 （発明の概要） 本発明は、ヒトを含む哺乳動物における免疫関連疾患の診断及び治療のための
組成物に関する。本発明は、哺乳動物における免疫反応を刺激又は阻害するタン
パク質（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）の同定に基づいている。免
疫関連疾患は、免疫反応を抑制又は促進することにより治療できる。免疫反応を
促進する分子は抗原に対する免疫反応を刺激又は増強することができる。免疫反
応を刺激する分子は、免疫反応の促進が有益である場合に治療的に使用できる。
そのような刺激性分子はまた、免疫反応の抑制が価値のある場合に阻害されうる
。中和抗体は、免疫刺激活性を有する分子を阻害する分子 の例であり、免疫関連及び炎症性疾患の治療において有益であろう。また、免疫
反応を阻害する分子も、免疫反応を阻害し、よって免疫関連疾患を寛解するのに
利用できる（タンパク質で直接、又は抗体アゴニストの使用を介する）。 従って、本発明の遺伝子にコードされる本発明のタンパク質は、免疫関連疾患
の診断及び／又は治療（予防を含む）に有用である。刺激性タンパク質に結合す
る抗体は、免疫系及び免疫反応の抑制に有用である。阻害性タンパク質に結合す
る抗体は、免疫系及び免疫反応を刺激するのに有用である。また本発明のタンパ
ク質及び抗体は、免疫関連疾患及び炎症性疾患の治療のための薬剤及び医薬の調
製に有用である。 一実施態様では、本発明は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、Ｐ
ＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドに結合
する単離された抗体に関する。一態様では、抗体は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１
７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２
６ポリペプチドにの活性に類似する（アゴニスト抗体）、又は逆に抗体はＰＲＯ
２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３
３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドの活性を阻害又は中和する（アンタゴニスト
抗体）。他の態様では、抗体はモノクローナル抗体であり、それは好ましくは非
ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基を
有する。抗体は標識されていてもよく、固体支持体に固定化されていてもよい。
さらなる態様では、抗体は抗体断片、一本鎖抗体、又は抗-イディオタイプ抗体
である。
【０００５】 他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、
ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド、又
は当該ポリペプチドに結合するアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を、担体又は
賦形剤と混合して含有する組成物に関する。一態様では、組成物は治療的有効量
のペプチド又は抗体を含有する。他の態様では、組成物が免疫刺激性分子を含有
する場合、当該組成物は、抗原に応答して（ａ）それを必要とする哺乳動物の組
織への炎症性細胞の浸潤を増大させ、（ｂ）それを必要とする哺乳動物における
免疫反応を刺激又は促進し、又は（ｃ）それを必要とする哺乳動物におけるＴリ
ンパ球の増殖を増大させるのに有用である。さらなる態様では、組成物が免疫阻
害性分子を含有する場合、当該組成物は、抗原に応答して（ａ）それを必要とす
る哺乳動物の組織への炎症性細胞の浸潤を減少させ、（ｂ）それを必要とする哺
乳動物における免疫反応を阻害又は低下させ、又は（ｃ）それを必要とする哺乳
動物におけるＴリンパ球の増殖を減少させるのに有用である。他の態様では、組
成物は更なる活性成分を含有し、それは、例えば更なる抗体又は細胞障害性又は
化学治療薬であってよい。好ましくは、組成物は無菌である。 一実施態様では、本発明は本発明のポリペプチド及び抗体の、上記の用途を有
する組成物又は医薬の調製のための使用に関する。 さらなる実施態様では、本発明は抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３
０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体をコー
ドする核酸、及びそのような核酸を含むベクター及び宿主細胞に関する。またさ
らなる態様では、本発明は、抗体をコードする核酸で形質転換した宿主細胞を、
抗体が発現される条件下で培養し、細胞培地から抗体を回収することによるそれ
らの抗体の製造方法に関する。
【０００６】 さらに本発明は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６
、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドの一又は複数の機
能又は活性を阻害する、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２
６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドのアンタゴニ
スト及びアゴニストに関する。 さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０
１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド
をコードする核酸分子の補体にハイブリッド形成する単離された核酸分子に関す
る。核酸は好ましくはＤＮＡであり、ハイブリッド形成は好ましくは緊縮性条件
下で起こる。このような核酸分子は、ここに同定される増幅されたアンチセンス
分子として作用し、それは翻って、対応する増幅された遺伝子のモジュレーショ
ンにおいて、又は増幅反応におけるアンチセンスプライマーとしての用途が見出
される。さらに、これらの配列は、リボザイム(ribozyme)及び／又は三重螺旋配
列の一部として使用でき、それは翻って増幅された遺伝子の調節で使用してもよ
い。 他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、
ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドを含
有すると推測される細胞を、抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、
ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体に暴露し、抗
体の細胞への結合を測定することを含んでなる、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポ
リペプチドの存在を測定する方法に関する。 さらに他の実施態様では、本発明は哺乳動物における免疫関連疾患を診断する
方法に関し、それは（ａ）当該哺乳動物から得た組織細胞の試験試料中、及び（
ｂ）同じ細胞型の知られた正常細胞の対照試料中におけるＰＲＯ２４５、ＰＲＯ
２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ
３２６ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含んでな
り、試験試料中での高い発現レベルが、当該試験組織細胞を得た哺乳動物におけ
る免疫関連疾患の存在を示す。 他の実施態様では、本発明は哺乳動物における免疫関連疾患を診断する方法に
関し、それは（ａ）抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２
６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体を当該哺乳動物から得
た組織細胞の試料と接触させ、そして（ｂ）試験試料中での抗体とポリペプチド
との間の複合体形成を検出することを含んでなる。検出は、定性的でも定量的で
も良く、同じ細胞型の知られた正常組織細胞の対照試料における複合体形成の監
視との比較において実施される。試験試料中で形成された複合体量が多いことは
、試験組織細胞を得た哺乳動物における腫瘍の存在を示す。抗体は、好ましくは
検出可能な標識を担持している。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサ
イトメトリー、蛍光定量法、又はこの分野で知られた他の技術によって監視され
る。試験試料は、通常は免疫系の不全又は異常を有すると推定される個体から得
る。
【０００７】 他の実施態様では、本発明は、抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０
１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体及び担体
（例えば、バッファー）を適当な包装中に具備してなる診断キットに関する。こ
のキットは、好ましくは抗体をＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、Ｐ
ＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドの検出
に使用するための説明書を備える。 さらなる実施態様では、本発明は、 容器； 当該容器上のラベル；及び 当該容器内に収容された活性剤を含有する組成物とを具備し、当該組成物が哺
乳動物における免疫反応を刺激又は促進するのに有効であり、容器上のラベルが
当該組成物は免疫関連疾患の治療に使用できることを表示し、組成物中の活性剤
がＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、
ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドの発現及び／又は活性を刺激又は阻
害する薬剤である製造品に関する。好ましい態様では、活性剤はＰＲＯ２４５、
ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又は
ＰＲＯ３２６ポリペプチド又は抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１
、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体である。 さらなる実施態様では、候補化合物をＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３
０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチ
ドと、これら２成分を相互作用させる条件下及び十分な時間で接触させることを
含んでなるＰＲＯ２４５ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害することので
きる化合物の同定方法に関する。特別な態様では、候補化合物あるいはＰＲＯ２
４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３
１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドのいずれかが固体支持体上に固定化される。他
の態様では、非固定化成分が検出可能な標識を担持する。
【０００８】 （好適な実施態様の詳細な説明） Ｉ．定義 「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が哺乳動物の罹患を
生じさせる、媒介する又は他に寄与する疾患を意味する。また、免疫反応の刺激
又は介入が疾患の進行に寛解的効果を有する疾患も包含する。この用語には、免
疫媒介炎症性疾患、非免疫媒介炎症性疾患、感染性疾患、免疫不全疾患、腫瘍形
成などが含まれる。 「Ｔ細胞媒介」疾患という用語は、Ｔ細胞が哺乳動物の罹患を直接的又は間接
的に媒介する又は他に寄与する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は、細胞媒介効
果ｍリンホカイン媒介効果など、及び、例えばＢ細胞がＴ細胞により分泌された
リンホカインによって刺激される場合はＢ細胞に関連する効果にも関連する。 免疫関連及び炎症性疾患であって、それらの幾つかはＴ細胞媒介性であり、本
発明に従って治療される疾患の例は、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマ
チ、若年性慢性関節炎、脊髄関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性ミ
オパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、サル
コイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素
尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板
減少症）、甲状腺炎（グレーヴズ病、橋本甲状腺炎若年性リンパ球甲状腺炎、萎
縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎
）、多発性硬化症、特発性脱髄性多発性ニューロパシー又はギヤン‐バレー症候
群及び慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー等の中枢及び末梢神経系の脱髄性
疾患、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及び他の非肝向性ウイルス）、自己免疫
性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎等の肝
臓胆管疾患、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン感受性腸炎
、及びホウィップル病等の炎症性及び線維症性肺疾患、水疱性皮膚疾患、多形性
紅斑及び接触皮膚炎を含む自己免疫性又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレ
ルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びじんま疹等のアレルギー性疾
患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎等の肺の免疫性疾患、移植拒
絶及び対宿主性移植片病を含む移植関連疾患を含む。感染性疾患はＡＩＤＳ（Ｈ
ＩＶ感染）、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及
び寄生虫感染を含む。
【０００９】 「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変更の本発明で実施される介入であ
る。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治
療が必要なものは、既に疾患に罹っているもの並びに疾患が防止されるべきもの
を含む。免疫関連疾患の治療では、治療薬は直接的に免疫反応の成分の反応の大
きさを増加又は減少させてもよいし、又は疾患を他の治療薬、例えば抗生物質、
抗真菌剤、抗炎症剤、化学治療等に対してより敏感にしてもよい。 免疫関連疾患の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含
む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長（好中球
、好酸球、単球、リンパ球細胞）、抗体生産、自己免疫生産、補体生産、隣接細
胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、
炎症又は免疫反応の抑制又は悪化、炎症細胞（好中球、好酸球、単球、リンパ球
細胞）の細胞空間への浸潤などを含む。 治療の目的とされる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し
、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイ
ヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。 一又は複数のさらなる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び
任意の順序での連続投与を含む。 「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するよう
にするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「
間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的
になされる処理である。
【００１０】 ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤
を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに暴露される細胞又は哺乳動
物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である
ことが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他
の有機酸バッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基
未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免
疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミ
ン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノー
ス又はデキストラン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレー
ト化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形
成対イオン；及び／又はTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
及びPLURONICS(商品名)等の非イオン性界面活性剤を含む。 ここで用いられる「細胞毒性薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する
及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例え
ば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真
菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとさ
れる。 「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化合物である。化学治療薬の例は、アド
リアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラシル、シトシ
ンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルフ
ァン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（Taxol(商品名), Bri
stol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Taxotere(
商品名), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）、トキソテール、メトトレキ
セート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エト
ポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリ
スチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミ
ノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマ
イシン（米国特許第4,675,187号）、メルファラン、及び他の関連するナイトロ
ジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及び
オナプリストンなどの腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用する
ホルモン様薬剤である。
【００１１】 ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の
遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合
物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ相でそのような遺伝子を過剰
発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周
期を（Ｓ相以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ相停止を誘発す
る薬剤を含む。古典的なＭ相ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビン
ブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ、例えばドキソルビシン、エピルビシ
ン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させる
これらの薬剤は、Ｓ相停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、
タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン
、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。更なる情報
は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1,
表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murak
ami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。 「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞
間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイト
カインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモン
である。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン
、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン
；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン
；糖タンパク質、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（Ｔ
ＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラ
クチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウ
ス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因
子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子
；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子
（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ
）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；
コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；
顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳ
Ｆ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-
３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、Ｉ
Ｌ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキッ
トリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、
用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を
含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
【００１２】 ここで使用される際の「ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ
２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド」は、自然
から誘導されたＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、Ｐ
ＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６と同じアミノ酸配列を有する天然配
列ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、
ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６を意味する。このような天然配列ＰＲＯ２４５、
ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又は
ＰＲＯ３２６は、自然から単離でき、又は組換え及び／又は合成手段によって製
造できる。この用語には、特に、ＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分
泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択
的にスプライシングされた形態)及びＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０
１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の自然に生じ
る対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様では、天然配列ＰＲＯ２４
５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１
又はＰＲＯ３２６は、Ｆｉｇ４、６、８、１０、１２、１４及び１６に示したア
ミノ酸配列を含む成熟又は全長の天然配列ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ
３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６である。 「本発明のポリペプチド」という用語は、個々のＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７
、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６
ポリペプチド各々を意味する。「本発明のポリペプチド」又は「ＰＲＯ２４５、
ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又は
ＰＲＯ３２６ポリペプチド」に言及する本明細書の全ての開示は、個々のポリペ
プチド各々並びに全体を指す。例えば、その調製、その精製、その誘導体化、そ
れに対する抗体の形成、その投与、それを含む組成物、それでの疾患治療などの
記載は、個々の本発明のポリペプチド各々に関係する。「本発明の化合物」とい
う用語は、本発明のポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドのアゴニスト抗
体及びアンタゴニスト抗体、ポリペプチドから発展したアゴニスト又はアンタゴ
ニスト活性を持つペプチド又は小分子などを含む。
【００１３】 また「本発明のポリペプチド」という用語は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、
ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポ
リペプチドの変異体も包含する。「変異体」ポリペプチドは、下記に定義するよ
うにＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５
、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約８
０％のアミノ酸配列同一性を持つ活性ポリペプチドである。これらの変異体は、
例えば、Ｎ-及び／又はＣ-末端並びに一又は複数の内部ドメインにおいて一又は
複数のアミノ酸残基が付加又は削除されたポリペプチドを含む。通常、変異体ポ
リペプチドは、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、Ｐ
ＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドのアミノ酸配列と、少
なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そ
して、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。変異
体ポリペプチドは天然のポリペプチド配列は含まない。 通常は、変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、より多くは少
なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多く
は少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より
多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、
より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸
長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０
アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも
約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００１４】 ここに定義されるポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(
％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を
得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と
考えないとした、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、
ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドの配列のアミノ酸残
基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パー
セントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の
技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMega
lign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエア
を使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長
に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含
む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる
。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、以下に記載す
るように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードがＦｉｇ２Ａ-Ｐに与えら
れている配列比較プログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピ
ュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、Ｆｉｇ２Ａ-Ｐに示した
ソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とと
もに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2は
ジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能で
あり、またＦｉｇ２Ａ-Ｐに与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALI
GN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデ
ジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメー
タは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。 ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸
配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたア
ミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は
含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメン
トによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全
アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる
場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列
同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列
同一性の計算の例として、Ｆｉｇ１Ａ-Ｂは、「比較タンパク質」と称されるア
ミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性
の計算方法を示す。
【００１５】 特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のように
ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％
アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic
Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配
列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NC
BI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては
初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最
小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５
、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリ
クス＝BLOSUM62を含む。 アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸
配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同
一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％
アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともでき
る）は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアライン
メントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ
の全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異
なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸
配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００１６】 また「本発明のポリペプチド」という用語には、上記のように実施された配列
比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有しているア
ミノ酸残基を含むポリペプチドも包含される。これらのポリペプチドは「ポジテ
ィブ（陽性）」と名付けられる。対象とするアミノ酸残基に対してポジティブ値
のスコアとされるアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又
は対象とするアミノ酸残基の（下記の表１で特定するように）好ましい置換とさ
れるものである。ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えら
れたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％ポジティブ値（あるいは、与えら
れたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含
む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメン
トによってポジティブであるとのスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全
アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる
場合、ＡのＢに対する％ポジティブは、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なる
ことは理解されるであろう。
【００１７】 「本発明の変異体ポリヌクレオチド」又は「本発明の変異体核酸配列」は、こ
こに定義するように活性な本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を意味し
、ＤＮＡ３５６３８、ＤＮＡ３３０９４、ＤＮＡ４０６２８、ＤＮＡ３７１５０
、ＤＮＡ４１３８８、ＤＮＡ４０９８１、又はＤＮＡ３７１４０又はその特異的
誘導断片と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を持つ。通常、本発明の変異体
ポリヌクレオチドは、 ＤＮＡ３５６３８、ＤＮＡ３３０９４、ＤＮＡ４０６２８、ＤＮＡ３７１５０、
ＤＮＡ４１３８８、ＤＮＡ４０９８１、又はＤＮＡ３７１４０又はその特異的誘
導断片と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１
％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも
約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一
性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少な
くとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の
核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９
４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、
より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同
一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有してい
る。変異体は、天然のヌクレオチド配列を含まない。この点において、遺伝子暗
号の変性のために、ヌクレオチドＤＮＡ３５６３８、ＤＮＡ３３０９４、ＤＮＡ
４０６２８、ＤＮＡ３７１５０、ＤＮＡ４１３８８、ＤＮＡ４０９８１、又はＤ
ＮＡ３７１４０と約８０％の核酸配列同一性を持つ多くの本発明の変異体ポリヌ
クレオチドが、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、Ｐ
ＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６のアミノ酸配列又は下記のようにＡ
ＴＣＣに寄託されたクローンにコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列
を持つポリペプチドをコードすることを当業者は即座に理解するであろう。 通常は、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド
長、より多くは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９０
ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より多くは少
なくとも約１５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１８０ヌクレオチド
長、より多くは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２
４０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、より多く
は少なくとも約３００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約４５０ヌクレオ
チド長、より多くは少なくとも約６００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも
約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００１８】 ここに定義されるＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列に対して同定されてい
る「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配
列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一
性の一部と考えないとした、ＰＲＯポリペプチドコード化配列のヌクレオチドと
同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセン
ト核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範
囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNA
STAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用す
ることにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して
最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラ
インメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし
、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、AL
IGN-2プログラム用の完全なソースコードがＦｉｇ２Ａ-Ｐに与えられている配列
比較プログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログ
ラムはジェネンテク社によって作成され、Ｆｉｇ２Ａ-Ｐに示したソースコード
は米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され
、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク
社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、またＦ
ｉｇ２Ａ-Ｐに与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラ
ムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用
のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラム
によって設定され変動しない。 ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄと
の、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、
又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ
酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｗ／Ｚの１００倍 ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメン
トによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全
ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、Ｃ
のＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なる
ことは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例とし
て、Ｆｉｇ１Ｃ-Ｄは、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」
と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【００１９】 特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIG
N-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸
配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids R
es. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プ
ログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST
2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に
設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合
長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギ
ャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BL
OSUM62を含む。 配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与
えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与え
られた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は
含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｗ／Ｚの１００倍 ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアライン
メントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤ
の全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合
、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異
なることは理解されるであろう。
【００２０】 他の実施態様では、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、活性な本発明のポリ
ペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び
洗浄条件下で、全長の本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハ
イブリッド形成できる。本発明の変異体ポリペプチドは、本発明の変異体ポリヌ
クレオチドにコードされるものであってもよい。 本発明のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、同定され、ポ
リペプチドのコード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核
酸分子から分離された核酸分子である。単離されたポリペプチドコード化核酸分
子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離され
た核酸分子は、天然の細胞中に存在するポリペプチドコード化核酸分子とは区別
される。しかし、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、例
えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色***置にある、通常は本発明
のポリペプチドを発現する細胞に含まれるポリペプチドコード化核酸分子を含む
。 「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード化配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核
生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配
列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリア
デニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。 核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」てい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡ
に作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影
響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合
部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用
可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤ
ＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズに
あることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない
。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位
が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター
あるいはリンカーが使用される。
【００２１】 ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般
的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に
、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブ
が短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその
融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニール
する能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相
同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い
相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。
さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる
詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley
Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。 ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄の
ために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム
／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの
；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において
50%（v/v）ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン／0.1%フィコール／0.1%のポ
リビニルピロリドン／50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの
塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）42℃における50
%％ホルムアミド、5xＳＳＣ（0.75MのＮａＣｌ、0.075Mのクエン酸ナトリウム）
、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハ
ード液、超音波処理サケ***ＤＮＡ（50μg/ml）、0.1%ＳＤＳ、及び10%のデキ
ストラン硫酸と、42℃における0.2xＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウ
ム）中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるＥＤＴＡを含
む0.1xＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。 「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されて
いるように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件
（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件
は、20%ホルムアミド、5xＳＳＣ（150mMのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナトリウ
ム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸
、及び20mg/mLの変性剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中の37℃での終夜インキュ
ベーション、次いで1xＳＳＣ中37-50℃でのフィルターの洗浄といった条件であ
る。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのよ
うにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００２２】 「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチ
ド」に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。
タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試
薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、
その長さは対象とするＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。
また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差
反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少
なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約
１０〜約２０の残基)を有する。 本発明のポリペプチドの変異体の文脈における「活性な」及び「活性」とは、
天然又は天然発生の本発明のポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を
保持する本発明のタンパク質の形態を意味する。 ここに開示されるスクリーニングアッセイによって同定できる抗体又は他のア
ンタゴニスト分子（例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等）の文脈における
「生物学的活性」は、それらの分子が炎症性細胞の組織への浸潤を誘発又は阻害
する能力、又はＴ細胞増殖を刺激又は阻害する能力及び細胞によるリンホカイン
放出を刺激又は阻害する能力を指すのに用いられる。他の好ましい活性は、血管
透過性の向上又はその阻害である。 「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然
の本発明のポリペプチドの生物学的活性を全体的又は部分的に阻止、阻害、又は
中和する任意の分子を含む。同様に、「アゴニスト」という用語は最も広い意味
で用いられ、ここに開示する天然の本発明のポリペプチドの生物学的活性に類似
する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴ
ニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然の本発明のポリペプチドの断
片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子などを含む。 「小分子」は、ここで約６００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
【００２３】 「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を持
つ糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する特異性を示すが、免疫グロブ
リンは抗体及び抗原特異性を持たない他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類
のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、ミエローマによって
向上したレベルで生産される。「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、
限定されることなく、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なく
とも２つの無傷の抗体から形成される多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）
、及びそれらが所望の生物学的活性を有している限り抗体断片を包含する。抗-
ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、Ｐ
ＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０
１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド
に免疫学的に結合する抗体である。抗体は、抗体に接触しうる本発明のポリペプ
チドの任意のドメインに結合してよい。例えば、抗体はポリペプチド任意の細胞
外ドメインに結合してもよく、ポリペプチド全体が分泌される場合には、抗体が
結合に利用できるポリペプチド上の任意のドメインに結合してもよい。 「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及
び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０,０００ダルトンの異種四量体糖タ
ンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合してお
り、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中
で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有
している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有
する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽
鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重
鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ド
メイン間の界面を形成すると考えられている。
【００２４】 「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲
に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使
用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイ
ンにわたって一様には分布していない。それは、共に軽鎖及び重鎖の可変ドメイ
ンにある相補性決定領域(ＣＤＲｓ)又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメ
ントに集中している。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワー
ク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大きくベータ
-シート構造とり、ベータ-シート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成す
るループ結合を形成する、ＣＤＲｓにより連結された４つのＦＲ領域をそれぞれ
含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣ
ＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, NIH Publ. No
.91-3242, Vol.I, 647-669頁(1991)参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結
合に直接関連しているものではないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与とい
った種々のエフェクター機能を示す。 ここで使用される場合の「高頻度可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ
）なる用語は、抗原結合部位を形成し、抗原特異性の主要な決定基性であるサブ
領域を決定する。或る定義に従うと、それらは、例えば、軽鎖可変領域の残基（
Kabat命名法）２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)及び重
鎖可変領域の３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)であ
りうる。Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, P
ublic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)
。あるいは、又はKabatによって定義された領域に加えて、高頻度可変領域は「
高頻度可変ループ」、例えば、軽鎖可変領域の残基（Chothia命名法）２６−３
２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び残基（Chothia命名法）
２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｌ２)及び９６−１０１(Ｌ３)であり得る;Choth
ia及びLesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)。「フレームワーク」又は「Ｆ
Ｒ」残基は、ＣＤＲ領域間にある比較的低い配列可変性の可変ドメイン残基であ
る。
【００２５】 「抗体断片」は、未変性の抗体の一部、好ましくは未変性の抗体の抗原結合又
は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦ
ｖ断片；ダイアボディ(diabody)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10):
1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異
的抗体を含む。 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を
持つ２つの同一な抗原結合断片、及び残りの「Ｆｃ」断片、そのＰＲＯ２４５、
ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又は
ＰＲＯ３２６は容易に結晶化する能力を反映している、を生成する。ペプシン処
理により、２つの抗原結合部位を有するが、交差結合抗原であり得るＦ(ａｂ')
２断片が生成される。 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領
域は、緊密に非共有的に結合した１つの重鎖と１つの軽鎖の二量体からなる。こ
の配置では、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を決定するために各
可変領域の３つのＣＤＲが相互作用する。正確には、６つのＣＤＲが抗体に抗原
結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原特異的な３つのＣ
ＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識し結合する能力を持つが、結
合部位全体よりは親和性が低い。 また、Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ
１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを
含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によりＦ
ａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここにおいて、定常ドメインのシステイ
ン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'の記号である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は
、元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ'断片の対として生成され
た。抗体断片の他の化学的結合も知られている。 任意の種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメイン
のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる１つ又は
２つの明らかに異なる型に分類できる。
【００２６】 それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異
なるクラスに分けられる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｄ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（
アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及び
ＩｇＡ２に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメ
インは、各々α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリ
ンのサブユニット構造及び三次元配置は良く知られている。 ここで用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の
集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が少量で存在する自然に起こりうる突然
変異以外は同一である集団から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は
高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられている。さらに、典型的に異な
る決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む従来の（ポリクロ
ーナル）抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対し
て向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンに汚染されない点において有
利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得
られ、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするとは解釈されない抗体の
特徴を示す。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler
等, Nature, 256: 495 [1975]によって最初に記載されたハイブリドーマ法によ
り作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）
により作成してもよい。また「モノクローナル抗体」はファージ抗体ライブラリ
から、例えば、Clackson等, Nature, 352: 624-628 [1991]及び Marks等, J. Mo
l. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いて単離してもよい。ま
た、ファージミド及びファージベクターを用いた抗体の調製を記載した米国特許
第5,750,373号、第5,571,698号、第5,403,484号及び第5,223,409号も参照。 ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含
み、それは、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラ
ス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残
りの部分は他の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する
抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望のお生物学
的活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片である（米国特許第4,816,567号
；Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]）。
【００２７】 非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘
導された最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又
はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の
他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリ
ン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ
）が、マウス、ラット、ヤギなどのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来
する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。幾つかの場合
では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が対応する
非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入
されるＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。これ
らの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最大化するために施される。一般にヒ
ト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに
対応し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のもので
ある少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有する
であろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型
的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有するであろう。さらな
る詳細については、Jones等, Nature 321: 522 -525 (1986)；Reichmann等, Nat
ure 332: 323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. struct. Biol. 2: 593 -596
(1992)を参照のこと。「ヒト化抗体」という用語は、抗体の抗原結合領域が、
対象とする抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体から由来す
る「霊長類化」抗体を含む。オールド・ワールド・モンキー(Ols World monkey)
からの残基を含む抗体も本発明の範囲内である。米国特許第5,658,570号、第5,6
93,780号、第5,681,722号、第5,750,105号及び第5,756,096号。
【００２８】 この発明における抗体及びその断片は「親和性成熟」抗体も含み、そこでは抗
体が一又は複数のＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域のアミノ酸配列を変
えるように変更され、抗体又はその断片が結合する抗原に対する親和性が変えら
れている。親和性成熟は、成熟抗体の抗原に対する親和性が出発抗体に比較して
向上又は低下している。典型的には、出発抗体はヒト化、ヒト、キメラ又はマウ
ス抗体であり、親和性成熟抗体は出発抗体より高い親和性を有する。成熟過程の
間に、ＣＤＲ又はフレームワーク領域の一又は複数のアミノ酸残基が任意の標準
的方法を用いて異なる残基に変えられる。好適な方法は、公知のカセット突然変
異誘発法（Wells等, 1985, Gene, 34: 315）又はオリゴヌクレオチド媒介突然変
異誘発法(Zoller等, 1987, Nucl. Acids Res., 10: 6487-6504）を用いた点突然
変異を含む。また親和性成熟は、多数の変異体を作成し、抗原又はリガンドに対
する向上した親和性に基づく変異体のプール又はライブラリから所望の親和性を
有する変異体を選択する公知の選択法を用いて実施してもよい。公知のファージ
表示技術はこの方法に便利に使用できる。例えば、米国特許第5,750,373号；米
国特許第5,223,409号参照。 ヒト抗体も本発明の抗体の範囲内である。ヒト抗体は、ファージ表示ライブラ
リ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol
. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて産生
することができる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル
抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Canc
er Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：
86-95(1991)；U.S. 5,750,373 ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位
をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完
全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の
際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点において
ヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。この方
法は、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同
第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks
等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (19
94); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnolo
gy 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lo
nberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００２９】 「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含
む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ま
しくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを
更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。
ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.
113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)
のPluckthunを参照のこと。 「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指
し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つの
ドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ド
メインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディー
は、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollingerら, Pro
c.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。 「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され又は回収
されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への
使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他の非タンパク質様溶質が含
まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって
決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）
スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ
末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)
クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下での
ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細
胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つ
の成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少な
くとも１つの精製工程により調製される。
【００３０】 「標識」という語は、ここで用いられる場合、抗体に直接的又は間接的に結合
して「標識化」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は
それ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）
、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変
換を触媒してもよい。 「固相」とは、本発明の化合物が接着できる非水性マトリクスを意味する。こ
こに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、孔の制御され
たガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリ
スチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る
実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他
では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）を含むこと
ができる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような別々
の粒子の不連続な固体相も含む。 「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（ここに開示される抗-ＥｒｂＢ２抗体
など、場合によっては化学治療薬）の送達に有用な、脂質、リン脂質及び／又は
界面活性剤を含む種々の型の小さな小胞である。リポソームの成分は、通常は生
物学的メンバーの脂質配列に類似した２層構造に配列される。 ここで用いる「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメイ
ンのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を
付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及
び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫
グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへ
シン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近
接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は
、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（Ｉｇ
Ａ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロ
ブリンから得ることができる。
【００３１】 ＩＩ. 本発明の組成物と方法 １．本発明のポリペプチドの調製 本発明は、本出願においてＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲ
Ｏ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６（各々ＵＮＱ２１９、
ＵＮＱ１９１、ＵＮＱ２６４、ＵＮＱ２３３、ＵＮＱ２８７Ｖ、ＵＮＱ２９２又
はＵＮＱ２８７）と称されるポリペプチドをコードする新規に同定され単離され
たヌクレオチド配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するよう
に、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５
、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単
離した。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質は異なるＰＲＯ番号が与え
られるが、ＵＮＱ番号は任意の与えられたＤＮＡ及びコードされたタンパク質に
独特であり変化しない。しかしながら、単純化のために、本明細書では、ＤＮＡ
３５６３８、ＤＮＡ３３０９４、ＤＮＡ４０６２８、ＤＮＡ３７１５０、ＤＮＡ
４１３８８、ＤＮＡ４０９８１、又はＤＮＡ３７１４０によりコードされるタン
パク質並びに前述のＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６
、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の定義に含まれる更なる天然相
同体及び変異体は、それらの起源又は調製方法に関わらず、ＰＲＯ２４５、ＰＲ
Ｏ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲ
Ｏ３２６あるいは単に「本発明のポリペプチド」と呼ぶものとする。 以下の説明は、主として、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベク
ターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより本発明のポリペプ
チドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野において良く知られている他
の方法を用いて本発明のポリペプチドを調製することができると考えられる。例
えば、ポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成
によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis
, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. S
oc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク
質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・
ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施しても
よい。本発明のポリペプチドの種々の部分を、別々に化学的に合成し、化学的又
は酵素的方法を用いて結合させて全長ポリペプチドを製造してもよい。
【００３２】 ここに記載した全長天然配列ポリペプチドに加えて変異体も調製できると考え
られる。変異体は、ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及
び／又は所望のポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、適切
なアミノ酸変化が本発明のポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうること、例え
ばグリコシル化部位の数の変化又は膜固着特性の改変を理解するであろう。 ここに記載した本発明のポリペプチドの天然全長配列又は種々のドメインにお
ける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保
存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結
果として天然配列ポリペプチドと比較してポリペプチドのアミノ酸配列が変化す
るようなポリペプチドをコードするコドンの一又は複数の置換、欠失又は挿入で
あってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸の本発明のポリ
ペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いず
れのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失さ
れるかの指針は、本発明のポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分
子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にす
ることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造又は
化学特性を持つ他のアミノ酸で置換した結果、例えばロイシンのセリンでの置換
、即ち保存的アミノ酸置換とすることができる。挿入及び欠失は、場合によって
は１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列に
おいてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長
又は成熟天然配列によって発揮される活性について試験することにより決定され
る。
【００３３】 本発明のポリペプチドのポリペプチド断片も本発明の範囲内である。このよう
な断片は例えば全長天然タンパク質と比較した場合、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断
されていてもよいし、あるいは内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は本
発明のポリペプチドの所望の生物活性に対して必須ではないアミノ酸残基を欠い
ている。 ポリペプチド断片は多くの従来の方法の任意のものによって調製することがで
きる。所望のペプチド断片を化学的に合成してもよい。他のアプローチ法は、酵
素消化により、例えば特定のアミノ酸残基により定まる部位でタンパク質を切断
することが知られている酵素でタンパク質を処理するか、適当な制限酵素でＤＮ
Ａを消化させることにより断片を産生し、所望の断片を単離することを含む。さ
らに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ)により、所望のポリペ
プチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の
所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける５'及び３'プライマー
として使用する。好ましくは、ポリペプチド断片は、天然の本発明のポリペプチ
ドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。 特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換という見出しで
表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に例示
的置換と名前を付け、又は以下にアミノ酸分類を参照して更に記載するような、
より大幅な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００３４】 本発明のポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置
換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位
の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において
有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通
の側鎖特性に基づいてグループに分けられる： （１）疎水性：ノルノイシン, met, ala, val, leu, ile; （２）中性の親水性：cys, ser, thr; （３）酸性：asp, glu; （４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg; （５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び （６）芳香族：trp, tyr, phe
【００３５】 非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを
必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、よ
り好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。 変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキ
ャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で周知の技術を用いてなすこ
とができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331
(1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異
誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等,
Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他のこの分野で
知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、変異体ＤＮＡを作成するこ
ともできる。 また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニング
アミノ酸分析を用いることができる。中でも好ましいスキャンニングアミノ酸は
、比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グ
リシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖
を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好まし
いスキャンニングアミノ酸である［Cunninghem及びWells, Science, 244: 1081-
1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的に
は好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが
多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co., N.Y.); Chothia, J.
Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場
合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００３６】 本発明のポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結
合的修飾の一型は、本発明のポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ポリペ
プチドの選択された側鎖又はＮ-又はＣ-末端残基と反応できる有機誘導体化試薬
と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えば本発明のポリペ
プチドを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ポリペプチド抗体の精製方法又
はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋
剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタル
アルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル
酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシン
イミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１
，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-
ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。 他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル
及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリ
ル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及び
ヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structur
e and Molecular Properties, W.H. Freeman and Co., San Francisco, pp.79-8
6 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のア
ミド化を含む。 本発明の範囲内に含まれる本発明のポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は
、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリ
コシル化パターンの変更」とは、ここでの目的のためには、天然配列ポリペプチ
ドに見出される１つ又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位
の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除による）、及
び／又は天然配列に存在しない１つ又は複数のグリコシル化部位の付加を意味す
る。さらに、この語句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び比率の変化を
含む、天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化を含む。 ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更によって達
成されうる。この変更は、例えば、天然配列ポリペプチドへの一又は複数のセリ
ン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合
グリコシル化部位の場合)。場合によっては、アミノ酸配列はＤＮＡレベルでの
変化によって、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが産生されるように予め
選んだ塩基でポリペプチドをコードしているＤＮＡを突然変異させることによっ
て変更される。
【００３７】 本発明のポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、ポリペ
プチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は1987年9
月11日公開の国際特許出願第WO 87/05330号及びAplin及びWriston, CRC Crit. R
ev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。 本発明のポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的
あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異
的置換によりなされる。例えば、化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知ら
れており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (1987)及
びEdge等, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチ
ド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura等, Meth. Enzymol., 138:350 (
1987)に記載されているように種々のエンド-及びエキソ-グリコシダーゼを使用
して達成することができる。 共有結合的修飾の他の型は、本発明のポリぺプチドの、種々の非タンパク質様
ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポ
リオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,
301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法
での結合を含む。 また、本発明のポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融
合した本発明のポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい
。 一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できる
エピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のポリペプチドとの融合体を含
む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ-又はカルボ
キシル-末端に位置する。このような本発明のポリペプチドのエピトープタグ形
態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。ま
た、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型
の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって本発明のポリペプチドを
容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体は
この分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又は
ポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及
びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c
-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０
抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び
単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Pr
otein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、
フラッグ(Flag)-ペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；Ｋ
Ｔ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チュ
ーブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (
1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。 これに換わる実施態様では、キメラ分子は本発明のポリペプチドの免疫グロブ
リン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二
価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体は
ＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少な
くとも１つの可変領域に換えて本発明のポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン
欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融
合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ
２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月2
7日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【００３８】 ｉ．本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの単離 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ポリペプチドｍＲＮＡを保有し
、それを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡ
ライブラリから得ることができる。従って、ヒトＤＮＡは、実施例に記載される
ように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることがで
きる。また本発明のポリペプチドのコード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又
はオリゴヌクレオチド合成により得てもよい。 ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタン
パク質を同定するために設計された(本発明のポリペプチドに対する抗体又は少
なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリ
ーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのス
クリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標
準的な手順を使用して実施することができる。本発明のポリペプチドをコードす
る遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上
掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor La
boratory Press, 1995)］。 下記の実施例は、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。
プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が
最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スク
リーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であ
るように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く
知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるい
は酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリ
ッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。 このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genban
k等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能
とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の所
定領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同
一性は、この分野で知られここに記載する方法を用いて決定できる。 タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ
酸配列を使用し、また必要ならばｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成
中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来の
プライマー伸展法を使用することにより選択したｃＤＮＡ又はゲノムライブラリ
のスクリーニングにより得られる。
【００３９】 ｉｉ．宿主細胞の選択及び形質転換 宿主細胞を、ここに記載した本発明のポリペプチド生成のための発現又はクロ
ーニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換
体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に改変さ
れた常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過
度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性
を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Bio
technology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambro
ok等, 上掲に見出すことができる。 形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に
知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な
方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウ
ムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的
な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公
開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用い
られる。このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der
Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳
動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載され
ている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 13
0:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方
法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例
えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又
はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラ
スト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の
技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び M
ansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００４０】 ここに記載のベクターにおいてＤＮＡをクローン化あるいは発現するために適
切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核
生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性
生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株、例えば、大
腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大
腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）が公衆に利用可
能である。 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、本発明のポリペ
プチドのコード化ベクターのための適切なクローン化又は発現宿主である。サッ
カロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。 グリコシル化された本発明のポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞
生物から誘導される。無脊椎生物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及び
スポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿
主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む
。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7,
ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクロー
ン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズ
ハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO), （Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Re
prod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (
Hep G2, HB 8065)；及びマウス***腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む
。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００４１】 ｉｉｉ．複製可能なベクターの選択及び使用 本発明のポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)
は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入
される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラス
ミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切
な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこ
の分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。
ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複
数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエ
レメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数
を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技
術を用いる。 本発明のポリペプチドは直接組換え的に生産されるだけではなく、シグナル配
列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を
有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生
産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入さ
れる本発明のポリペプチドのコード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例
えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテ
ロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。
酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、
アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyv
eromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されてい
る)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリー
ダー(1990年4月4日発行のEP 362,179)、又は1990年11月15日に公開された国際特
許出願第WO 90/13646号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の
発現においては、同一あるいは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配
列、ウイルス分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列をタンパク質の
直接分泌に使用してもよい。
【００４２】 発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞におい
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、
酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来
する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点
は酵母菌に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノ
ウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに
有用である。 発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される
選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、
メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素
に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子
コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素
を供給するタンパク質をコードする。 哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジン
キナーゼのように、本発明のポリペプチドのコード化核酸を取り込むことのでき
る細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の
好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (
1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあ
るＣＨＯ細胞系である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母菌プラスミ
ドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(
1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］
。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１の
ようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択
マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。 発現及びクローニングベクターは、通常、本発明のポリペプチドのコード化核
酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を指示するプロモーターを含む。種々
の潜在的な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核
生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロ
モーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544
(1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Go
eddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッド
プロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci
. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯを
コードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有す
る。
【００４３】 酵母菌宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグ
リセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他
の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Bioch
emistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン
酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレー
トムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。 他の酵母菌プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的
効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
チトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオ
ネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及び
ガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現
に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。 哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ転写は、例えば、ポリオー
マウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノ
ウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、
サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４
０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物
から得られるプロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプ
ロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、この
ようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。 より高等の真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は
、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハ
ンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写
を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハン
サー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェト
プロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由
来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ
４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモー
ターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィ
ルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード化配列の５'又は
３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから
５'位に位置している。 また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多
細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮ
Ａの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤ
ＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これら
の領域は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデ
ニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。 組換え細胞培養での本発明のポリペプチドの合成に適応化するのに適切なさら
に他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981
); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載
されている。
【００４４】 ｉｉｉ．遺伝子発現の検出 遺伝子の増幅又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識された
プローブを用い、例えば、従来からのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量
化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-520
5 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成
法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖
、ＲＮＡ二重鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク二重
鎖を含む、特異的二重鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次
いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二重鎖は表面に結
合しており、その結果二重鎖の表面での形成の時点でその二重鎖に結合した抗体
の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色又はアッ
セイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳
動物で調製することができる。簡便には、抗体は、本発明のポリペプチドの天然
配列に対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに
対して、又は本発明のポリペプチドに融合し特異的抗体エピトープをコードする
外因性配列に対して調製され得る。
【００４５】 ｉｖ．ポリペプチドの精製 本発明のポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶解液から回収すること
ができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵
素的切断を用いて膜から引き離すことができる。本発明のポリペプチドの発現に
用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解
剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。 本発明のポリペプチドを組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製するこ
とが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち
、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチ
オン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシ
ング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５
を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラ
ム；及び本発明のポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート
化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymolo
gy, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, S
pringer-Verlag, New York (1982)に記載され種々のタンパク質精製方法を用い
ることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる産生方法及び特に産
生される本発明のポリペプチドの性質に依存する。
【００４６】 ２．組織分布 本発明のポリペプチドを発現する組織の位置は、種々のヒト組織におけるｍＲ
ＮＡ発現の検出により同定できる。そのような遺伝子の位置は、本発明のポリペ
プチドの活性の刺激及び阻害によって最も影響を受けると思われる組織について
の情報を提供する。また特定組織での遺伝子の位置は、下記の活性阻害アッセイ
のための試料組織を提供する。 上記したように、種々の組織における遺伝子増幅又は遺伝子発現は、ｍＲＮＡ
の転写の定量化のための従来のサザンブロット、ノーザンブロット（Thomas, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]）、ドットブロット（ＤＮＡ
分析）、又はインサイツハイブリッド形成により、ここに提供する配列にもとづ
いて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ
二重鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク質二重鎖を
含む特定の二重鎖を認識する抗体を用いてもよい。 あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するた
めの、組織断片及び細胞培地又は体液の免疫組織学的染色などの免疫的方法によ
っても測定できる。免疫組織学的染色又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モ
ノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。便利に
は、抗体は本発明のポリペプチドの天然配列に対して、又はここに提供するＤＮ
Ａ配列に基づく合成ペプチドに対して、又は本発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列に融合し特異的抗体エピトープをコードする細胞外配列に対して調製
される。抗体を生成する一般的技術、及びノーザンブロット及びインサイツハイ
ブリッド形成のプロトコールは以下に提供する。
【００４７】 ３．抗体結合実験 本発明のポリペプチドの活性は、抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３
０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体が組織
細胞においてＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲ
Ｏ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドの効果を阻害する能力が
試験される抗体結合実験によって更に確認できる。例示的な抗体は、ポリクロー
ナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ抱合体抗体を含み、そ
の調製は以下に記載する。 抗体結合実験は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ
、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Zola, Monocl
onal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 19
87)。 競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試
験分析物と競合する能力による。試験試料中の標的タンパク質の量は、抗体に結
合し始める標準物の量に逆比例する。結合し始める標準物の量の測定を促進する
ために、抗体は好ましくは競合の前又は後に固定化し、抗体に結合した標準品及
び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにす
る。 サンドウィッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々が検出すべきタンパ
ク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセ
イにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第１の抗体に結合し、
その後第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３成分複合体が形成される
。例えば米国特許第4,376,110号参照。第２の抗体は検出可能部分で標識され（
直接サンドウィッチアッセイ）、あるいは検出可能部分で標識された抗-免疫グ
ロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドウィッチアッセイ）。例えば
、サンドウィッチアッセイの一形態はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検
出可能部分は酵素である。 免疫組織学のために、組織試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィン
に包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
【００４８】 ４．細胞ベースのアッセイ ここに同定する遺伝子及びポリペプチドと免疫関連疾患の進行及び病原との関
係をさらに理解するために、細胞ベースアッセイ及び免疫関連疾患の動物モデル
を用いることができる。 異なるアプローチにおいては、特定の免疫関連疾患に含まれることが知られた
細胞型の細胞をここに記載するｃＤＮＡで形質移入し、これらのｃＤＮＡが免疫
機能を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞が所望の遺伝子で形質移入
でき、免疫機能活性について監視される。このような形質移入細胞系は、次いで
、ポリペプチド-又はモノクローナル抗体又は抗体組成物が免疫機能を阻害又は
刺激する、例えばＴ細胞増殖又は炎症性細胞浸潤を変調する能力を試験するのに
使用できる。ここに同定される遺伝子のコード化配列で形質移入された細胞は、
さらに免疫関連疾患の治療のための候補薬剤を同定するために使用できる。 さらに、（下記のような）トランスジェニック動物から誘導された一次培地は
、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な細胞系が好ましい。トラ
ンスジェニック動物から連続細胞系を誘導する技術はこの分野で良く知られてい
る（Small等, Mol. Cell. Biol. 5, 642-648 [1985]参照）。 一つの好適な細胞ベースアッセイは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である。Curr
ent Protocols in Immunology, unit 3.12; .E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H
. Marglies, E.M. Shevach, W. Strober編集, National Institutes of Health,
John Wiley and Sons, Inc.発行。このアッセイにおいて、試験化合物が活性化
Ｔ細胞の増殖を刺激する能力が検定される。レスポンダーＴ細胞の懸濁物を同種
の刺激性細胞とともに培養し、Ｔ細胞の増殖をトリチウム化チミジンの取り込み
により測定する。このアッセイはＴ細胞反応性の一般的な手段である。Ｔ細胞の
大部分は活性化に際して反応してＩＬ-２を産生するので、このアッセイにおけ
る反応性の相違は、部分的には反応性細胞によるＩＬ-２産生の相違を反映して
いる。ＭＬＲの結果は、標準的なリンホカイン（ＩＬ-２）検出アッセイによっ
て確認することができる。上掲の、Current Protocols in Immunology, 3.15, 6
.3。
【００４９】 ＭＬＲアッセイにおける増殖性Ｔ細胞反応は、検定された分子の直接の***促
進特性又は外部抗原誘発活性化による。本発明のポリペプチドのＴ細胞刺激活性
の更なる検証は、同時刺激アッセイによって得ることができる。Ｔ細胞活性化は
、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を通して媒介される抗原特異的シグナル及び第２
のリガンド結合性相互作用、例えば(ＣＤ８０、ＣＤ８６)／ＣＤ２８結合性相互
作用を通して媒介される同時刺激シグナルを必要とする。ＣＤ２８交差結合は活
性化Ｔ細胞によるリンホカイン分泌を増大させる。Ｔ細胞活性化は、ネガティブ
又はポジティブ効果を持つリガンドの結合を通してネガティブ及びポジティブ制
御の両方を有する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ-４は、Ｂ７に結合するＩｇスーパー
ファミリーの糖タンパク質に関連する。ＣＤ２８のＢ７への結合は、Ｔ細胞活性
化に対してポジティブな同時刺激効果を有し、逆にＣＴＬＡ-４のＢ７への結合
はネガティブなＴ細胞不活性化効果を持つ。Chambers, C.A.及びAllison, J.P.,
Curr. Opin. Immunol. (1997) 9: 396; Schwartz, R.H., Cell (1992) 71: 106
5; Linsey, P.S.及びLedbetter, J.A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11: 191;
June, C.H.等, Immunol. Today (1994) 15: 321; Jenkins, M.K., Immunity (19
94) 1: 405。同時刺激アッセイにおいて、本発明のポリペプチドはＴ細胞同時刺
激又は阻害活性について検定される。 本発明のポリペプチド、並びに本発明の他の化合物は、Ｔ細胞増殖の刺激装置
（同時刺激装置）及び例えばＭＬＲ及び同時刺激アッセイで決定されたそれに対
するアゴニスト、例えばアゴニスト抗体であり、乏しい、最適以下又は不十分な
免疫機能を特徴とする免疫関連疾患の治療において有用である。これらの疾患は
、Ｔ細胞（及びＴ細胞媒介免疫性）の増殖及び活性化を刺激し、本発明の刺激性
ポリペプチド等の刺激性化合物の投与を通して哺乳動物における免疫反応を促進
することにより治療される。刺激性ポリペプチドは、例えば、ＰＲＯ２４５、Ｐ
ＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰ
ＲＯ３２６ポリペプチド又はそれに対するアゴニスト抗体であってよい。 本発明におけるような刺激性化合物の直接的な使用は、プライムされたＴ細胞
上で発現されるリガンド（４-１ＢＢＬ）に結合してＴ細胞活性化及び成長のシ
グナル伝達をする、腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーである４-１
ＢＢ糖タンパク質での実験において確証される。
【００５０】 アゴニスト刺激性化合物の使用も実験的に確証された。アゴニスト抗-４-１Ｂ
Ｂ抗体での処理による４-１ＢＢの活性化は、腫瘍の根絶を促進する。Hellstrom
, I.及びHellstrom, K.E., Crit. Rev. Immunol. (1998) 18:1。以下でさらに詳
細に説明する腫瘍治療のためのイムノアジュバント(immunoadjuvant)療法は、本
発明の刺激性化合物の使用の他の例である。 また免疫刺激又は促進効果は、ＭＬＲアッセイで阻害することが見出されたタ
ンパク質の活性を拮抗（アンタゴナイズ）又は阻止することによっても達成でき
る。化合物の阻害活性をうち消すことにより、全体としての刺激効果が生ずる。
好適なアンタゴニスト／阻止化合物は、阻害性タンパク質を認識してそれに結合
し、それによりタンパク質とそのレセプターとの有効な相互作用を阻止してレセ
プターを通したシグナル伝達を阻害する抗体又はその断片である。この効果は、
Ｔ細胞増殖を、おそらくＣＴＬＡ-４結合によって生ずる阻害シグナルを除去す
ることにより促進する抗-ＣＴＬＡ-４抗体を用いた実験で確証された。Walunas,
T.L.等, Immunity (1994) 1: 405。 一方、Ｔ細胞増殖／活性化及び／又はリンホカイン分泌の直接的な阻害剤であ
る本発明のポリペプチド、並びに本発明の他の化合物は、免疫反応を抑制するた
めに直接使用できる。これらの化合物は、免疫反応の程度を低下させるため、及
び過剰反応性、最適以上、又は自己免疫反応を特徴とする免疫関連疾患を治療す
るために有用である。本発明の化合物のこの用途は、ＣＴＬＡ-４のＢ７への結
合がＴ細胞を不活性化する上記の実験により確証された。本発明の直接的阻害化
合物は類似の方式で機能する。 あるいは、本発明の刺激性ポリペプチドに結合し、これらの分子の刺激効果を
阻止する化合物、例えば抗体は、全体として阻害効果を生じ、Ｔ細胞増殖／活性
化及び／又はリンホカイン分泌を阻害することによりＴ細胞媒介免疫反応を抑制
するのに使用できる。ポリペプチドの刺激効果の阻止は、哺乳動物の免疫反応を
抑制する。この用途は、抗-ＩＬ-２抗体を用いた実験で確証された。これらの実
験において、抗体はＩＬ２に結合し、ＩＬ２のそのレセプターへの結合を阻止し
て、それによりＴ細胞阻害効果を達成する。
【００５１】 ５１．動物モデル 細胞ベースのインビトロアッセイの結果は、インビボ動物モデル及びＴ細胞機
能についてのアッセイを用いてさらに確かめることができる。免疫関連疾患の進
行及び病原におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そし
て抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む
候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用で
きる。これらのモデルのインビボ性質によりヒト患者における反応を予測できる
。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動
物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデル
を含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射
、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入する
ことにより作成される。 移植片対宿主疾患は、免疫担当細胞が免疫抑制又は寛容患者に移植されたとき
に起こる。ドナー細胞が宿主抗原を認識して反応する。反応は生命を脅かす重篤
な炎症から下痢又は体重減少の軽い場合まで変わり得る。移植片対宿主疾患モデ
ルはＭＨＣ抗原及び少数の移植抗原に対するＴ細胞の反応性を評価する手段を提
供する。好適な手法は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 4.3に
詳細に記載されている。 皮膚移植片拒絶の動物モデルは、Ｔ細胞がインビボ組織破壊を媒介する能力を
試験する手段であり、移植片拒絶におけるそれらの役割の基準である。最も普通
で許容されるモデルは、マウスの尾の皮膚移植である。繰り返し実験により、皮
膚同種移植片拒絶はＴ細胞、ヘルパーＴ細胞尾キラー効果Ｔ細胞に媒介され、抗
体ではないことが示された。Auchincloss, H. Jr.及びSachs, D.H., Fundamenta
l Immunology, 2版, W.E. Paul編, Raven Press, NY, 1989, 889-992。好適な手
法は、上記のCurrent Protocols in Immunology, unit 4.4に詳細に記載されて
いる。本発明の化合物の試験に使用できる他の移植片拒絶モデルは、Tanabe, M.
等, Transplantation (1994) 58: 23及びTinubu, S.A.等, J. Immunol. (1994)
4330-4338に記載されている同種心臓移植モデルである。 遅延型過敏症の動物モデルは、同様に細胞媒介免疫機能のアッセイ法を提供す
る。詳細な型の過敏症反応は、抗原負荷後時間が経過するまでピークに達しない
炎症を特徴とするＴ細胞媒介免疫反応である。これらの反応はまた、組織特異的
自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）及び実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｅ
ＡＥ、ＭＳのモデル）を起こす。好適な手法は、上記のCurrent Protocols in I
mmunology, unit 4.5に詳細に記載されている。
【００５２】 ＥＡＥは、Ｔ細胞及び単核細胞炎症及び続く中枢神経系における軸索の脱髄を
特徴とするＴ細胞媒介自己免疫疾患である。ＥＡＥは一般に、ヒトにおけるＭＳ
の関連動物モデルであると考えられている。Bolton, C., Multiple Sclerosis (
1995) 1: 143。急性及び再発寛解モデルの両方が開発されている。本発明の化合
物は、上記のCurrent Protocols in Immunology, units 15.1及び15.2に記載さ
れているプロトコールを用いて、免疫媒介脱髄疾患に対するＴ細胞刺激又は阻害
活性について試験できる。また、Duncan, I.等, Molec. Med. Today (1997) 554
-561に記載されているようなオリゴデンドログリア又はシュワン細胞が中枢神経
系に移植されるミエリン疾患についてのモデルも参照のこと。 接触過敏症は細胞媒介免疫機能のインビボアッセイで簡単に現れる型の過敏症
である。この手法では、外因性ハプテンに皮膚が暴露され、それが遅延型の過敏
反応を生じ、それが測定され定量化される。接触過敏症は、最初の感作相及びそ
れに続く誘発相を含む。誘発相は、Ｔリンパ球が、それが以前に接触した抗原に
出会ったときに生じる。腫脹及び炎症が起こり、これがヒトのアレルギー性接触
皮膚炎の優れたモデルとなる。好適な手法は、Current Protocols in Immunolog
y, E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Marglies, E.M. Shevach, W. Strober編
, John Wiley and Sons, Inc., 1994, unit 4.2に詳細に記載されている。また
、Grabbe, S.及びSchwarz, T., Immun.Today 19(1): 37-44 (1998)も参照のこと
。 関節炎の動物モデルはコラーゲン誘発関節炎である。このモデルは、ヒトの自
己免疫性慢性関節リウマチと臨床的、組織学的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト
の自己免疫性関節炎の許容されるモデルである。マウス及びラットモデルは、滑
膜炎、軟骨及び肋軟骨下骨の浸食を特徴とする。本発明の化合物は、上記のCurr
ent Protocols in Immunology, unit 15.5に記載されているプロトコールを用い
て、自己免疫性関節炎に対する活性について試験できる。また、Issekutz, A.C.
等, Immunology (1996) 88: 569に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ-４インテ
グリンに対するモノクローナル抗体を用いたモデルも参照のこと。
【００５３】 喘息のモデルは記載され、そこでは抗原誘発気道過剰反応性、肺性好酸球増加
症及び炎症が、動物をオボアルブミンで感作し、次いで動物にエアロゾルで運ば
れる同じタンパク質を負荷することにより誘発される。幾つかの動物モデル（モ
ルモット、ラット、非ヒト霊長類）は、エアロゾル抗原で負荷した際にヒトのア
トピー性喘息に似た徴候を示す。マウスモデルは、ヒト喘息の多くの特徴を持つ
。本発明の化合物の喘息治療における活性及び有効性を試験するための好適な方
法は、Wolyniec, W.W.等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18: 777
及びその引用文献に記載されている。 さらに、本発明の化合物は、乾癬様疾患の動物モデルでも試験できる。証拠は
、乾癬についてのＴ細胞病原を示唆している。本発明の化合物は、Schon, M.P.
等, Nat. Med. (1997) 3: 183によって記載された、マウスが乾癬に類似する組
織病原学的皮膚疾患を示すscid/scidマウスモデルでも試験できる。他の好適な
モデルは、Nickoloff, B.J.等, Am . J. Path. (1995) 146: 580に記載されたよ
うに調製されるヒト皮膚／ｓｃｉｄマウスキメラである。 組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコー
ド部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象とす
る動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標
的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモ
ット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及
びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技
術は、全核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191
号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Putten等,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性肝細胞での遺伝子標
的化（Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション
（Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；***媒介遺伝子転移（Lavitra
no等, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説のためには、例えば、米国特許第
4,736,866号を参照のこと。
【００５４】 本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝
子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子
として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組
み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。 トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監
視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣ
Ｒ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッ
ド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて
分析できる。 動物は、例えば、炎症細胞の特定組織への浸潤を決定する組織学的試験により
、免疫疾患病理の徴候について更に試験してもよい。また、トランスジェニック
マウスが本発明のの化合物で処理され、化合物のＴ細胞増殖刺激又は阻害の程度
が測定される阻止実験を行うこともできる。これらの実験では、本発明のポリペ
プチドに結合する阻止抗体が上記のように調製され、動物に投与され、免疫機能
に対する効果が決定される。 あるいは、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノム
ＤＮＡと、同じポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えに
よって、ここに同定するポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する
「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドを
コードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、そのポリペプチドをコードする
ゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲ
ノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能な
マーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的に
は、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベー
ス含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas and Capecchi, Cell,
51: 503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポ
レーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換
えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell,69:915 (1992)参照］。選択され
た細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラ
を形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:
A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-
152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノック
アウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する
子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に
組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は
、そのポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及び病理的状態
の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【００５５】 ６．イムノアジュバント療法 一実施態様では、本発明の免疫刺激性化合物が、腫瘍（癌）の治療のためのイ
ムノアジュバント(immunoadjuvant)療法で使用できる。Ｔ細胞がヒト腫瘍特異的
な抗原を認識することは現在良く確認されている。腫瘍抗原の一群は、ＭＡＧＥ
、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーの遺伝子にコードされ、全ての成人正常組織
では無症状だが、黒色腫、肺腫瘍、頭部及び頸部腫瘍、及び膀胱癌などの腫瘍で
はかなりの量が発現される。DeSmet, C. 等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 93: 7149。Ｔ細胞の同時刺激が腫瘍の退行及びインビトロ及びインビボでの
抗腫瘍反応を誘発することが示された。Melero, I.等, Nature Medicine (1997)
3: 682; Kwon, E.D.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 8099; Lynch
, D.H.等, Nature Medicine (1997) 3: 625; Finn, O.J.及びLotze, M.T., J. I
mmunol. (1998) 21: 114。本発明の刺激性化合物は、Ｔ細胞増殖／活性化及び腫
瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激するために、アジュバントとして、単独又は成
長調節剤、細胞毒性又は化学治療薬とともに投与できる。成長調節、細胞毒性、
又は化学治療薬は、公知の投与計画を用いて従来の量で投与してよい。本発明の
化合物による免疫刺激活性は、成長調節、細胞毒性、又は化学治療薬の量を低減
させ、よって患者への毒性を低下させる可能性がある。
【００５６】 ７．候補薬についてのスクリーニングアッセイ 候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされる
ポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物又はその生物学的に活性な断片、
あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する
化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特
に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループット
スクリーニングに従うアッセイを含む。小分子とは、合成有機又は無機化合物を
含むと考え、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチ
ド-免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ-及びモノクローナル抗
体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は
断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでい
る。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパ
ク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッ
セイ及び細胞ベースのアッセイを含む。 全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定される核酸にコードされるポ
リペプチドと、それら２成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触さ
せることで共通している。
【００５７】 結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離され
るか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された
遺伝子にコードされるポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固
相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固
体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるい
は、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を
、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは
、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されて
いてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき
、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する
。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された
標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持
たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する
標識抗体によって検出できる。 候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のポリペプチドと相
互作用するが結合しない場合、その相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作
用を検出するために良く知られた方法によって検定することができる。そのよう
なアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通
す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作
用は、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246
(1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載
された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans［Proc
.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように監視す
ることができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に
別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、
他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現
系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して
、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４の
ＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化
ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性
化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介した
ＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは
、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド
技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同
定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入
手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメ
インのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも
拡張することができる。 ここで同定される遺伝子と他の細胞内又は外成分との相互作用を阻害する化合
物は、次のように試験することができる：通常は、増幅された遺伝子の生成物及
び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、２つの生成物が相互作用及び結合する
条件下及び時間で調製する。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために
、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。さらに、第３の反応混合物にプラ
シーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物
と細胞内又は外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視する。対照反応
において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物ではしないことは試験
化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【００５８】 ８．免疫関連疾患治療のための組成物及び方法 免疫関連疾患の治療で有用な組成物は、限定されないが、抗体、小有機及び無
機分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺
旋分子などを含み、免疫機能、例えばＴ細胞増殖／活性化、リンホカイン放出、
又は免疫細胞浸潤を阻害又は刺激するものである。 例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド
形成してタンパク質翻訳を防止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止する。
アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレ
オチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌク
レオチドが好ましい。 リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リ
ボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレ
オチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切
断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current B
iology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551（1997年9月18日発
行）を参照。 転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌク
レオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩
基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の
一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さら
なる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。 これらの分子は上記のスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組み合
わせにより、又は当業者に知られた他のスクリーニング技術により同定できる。
【００５９】 ９．抗体 本発明で最も有望な候補薬剤の幾つかは、Ｔ細胞増殖、好酸球浸潤などを阻害
（アンタゴニスト）又は刺激（アゴニスト）できる抗体及び抗体断片である。 ｉ．ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポ
リクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを
、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤
又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免
疫化剤は、本発明のポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤
を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させ
るのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが
、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン
及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例に
は、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリ
ル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコ
ールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００６０】 ｉｉ．モノクローナル抗体 あるいは、本発明のポリペプチドを認識して結合する、又はそのアゴニストと
して作用する抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は
、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブ
リドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マ
ウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化す
ることで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリ
ンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。 免疫化剤は、典型的には本発明のポリペプチド又は融合タンパク質を含む。一
般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され
るか、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節
細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いて
リンパ球を不死化細胞系と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) p
p. 59-103］。不死化細胞系は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯
動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄
腫細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細
胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養され
る。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的
には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、こ
の物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。 好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安
定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性の
ものである。より好ましい不死化細胞系はマウス骨髄腫系であり、これは例えば
カリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerや
メリーランド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
より入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及び
マウス-ヒト異種骨髄腫細胞系も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:30
01 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Appl
ications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。 次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、本発明のポリペプチドに
対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドー
マ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジ
オイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結
合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において
公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, A
nal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定す
ることができる。
【００６１】 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサ
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及び
ＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物
においてインビボで腹水として成長させることもできる。 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ
−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳
動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン
精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。 また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567
号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体
をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び
軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使
用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細
胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡ
は発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク
質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクロ
ーナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列
に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US
. Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列
に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合するこ
とにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、
本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原
結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することが
できる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメ
インに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに
置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。 抗体は好ましくは一価抗体である。一価抗体の調製方法は当該分野においてよ
く知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発
現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイ
ントで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置
換するか欠失させて架橋を防止する。 一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その
断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使
用して達成できる。
【００６２】 ｉｉｉ．ヒト及びヒト化抗体 本発明の抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウ
ス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそ
の断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結
合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むもので
ある。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、
ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ド
ナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント
抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基
は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピ
エント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されな
い残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全て
のＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全
てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも
１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最
適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常
領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); R
iechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Bio
l., 2:593-596 (1992)］。 非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒト
アミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移
入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト
抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［
Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1
988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類
ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施され
る。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的
に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4
,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及
び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によ
って置換されたヒト抗体である。 また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol
. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含む
この分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及
びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる
（Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1
985；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；米国特許第5,750,373号
）。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例
えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導
入することにより産生することができる。負荷の際に、遺伝子再配列、組立、及
び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類
似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第
5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,63
3,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10,
779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 3
68, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); N
euberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern
. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００６３】 ｉｖ．二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する
モノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合
において、結合特異性の一方は本発明のポリペプチドに対してであり、他方は任
意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサ
ブユニットに対してである。 二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein及びCuello, Nature,
305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため
、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合
物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精
製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の
手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-
3656 (1991)に開示されている。 所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部
、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードす
るＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿
入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更
なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)
を参照されたい。
【００６４】 ｖ．ヘテロ抱合体抗体 ヘテロ抱合抗体は２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例え
ば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,
676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 0
3089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク
化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考え
られる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形
成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な
試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及
び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。 ｖｉ．エフェクター機能の設計 本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えばガンの治療における
抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導
入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産
生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は
増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しうる。
Caron等, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148
:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体
は、Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘ
テロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を
有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計すること
ができる。Stevensonら, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
【００６５】 ｖｉｉ．免疫複合体 本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の
酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち
、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。 このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることので
きる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活
性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ
鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリ
テス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパ
ク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ
、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica char
antia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オ
フィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミト
ゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(pheno
mycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々
な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２ １２ Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。 抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、
例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチ
ルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等
）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジ
ドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジ
アゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２
，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-
２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は
、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することがで
きる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン
トリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合の
ためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。 他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター
」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患
者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細
胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（例えば
アビジン）を投与する。
【００６６】 ｖｉｉｉ．免疫リポソーム また、ここに開示するタンパク質、抗体などは免疫リポソームとして調製して
もよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 8
2: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及
び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知
られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,
013,556号に開示されている。 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆
相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して
押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ
’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているよ
うに、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（
ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等,
J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【００６７】 １０．製薬組成物 本発明の活性分子、ポリペプチド及び抗体、並びに上記に開示したスクリーニ
ングアッセイで同定された他の分子は、免疫関連疾患の治療のために、製薬組成
物の形態で投与することができる。 活性分子、好ましくは本発明のポリペプチド又は抗体の治療用製剤は、所望さ
れる程度の純度を持つ活性分子を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製
薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存さ
れる（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [198
0]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受
容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；ア
スコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチル
ベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコ
ニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベン
ジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコー
ル；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾー
ルなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチ
ン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリ
マー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリ
シン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、
二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート化剤、スクロース、マンニトー
ル、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン
；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）
、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）等の非イオン性界面活性剤を含む。 本発明のスクリーニングアッセイで同定された化合物は、同様の方式で、この
分野で知られた標準技術を用いて製剤される。 リポフェクション又はリポソームは、ポリペプチド、抗体、又は抗体断片を細
胞に輸送するのにも使用できる。抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の
結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の
可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は標的タンパク質配列に結合する能力を
保持するように設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成及び／又は組
換えＤＮＡ技術により生成できる（Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90
. 7889-7893 [1993]参照）。 ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、
好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。ある
いは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤
を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合
わせで存在する。
【００６８】 また、活性分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により
調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼ
ラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中
、コロイド状薬物送達系<BR（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロ
エマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に
包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science
16th edition, Osol, A. Ed. [1980]に開示されている。 インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過
膜を通した濾過により容易に達成される。 徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体
疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、
例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は
、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレー
ト)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）
、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビ
ニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロ
リドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)
-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸な
どのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒド
ロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身
体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝
集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす
。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができ
る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成
であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの
凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリ
クス組成物の開発によって達成されうる。
【００６９】 １１．治療方法 本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物は、種々の免疫関連疾患及び状態
、例えば、 組織への炎症精細胞の浸潤、Ｔ細胞増殖の刺激、Ｔ細胞増殖の阻害、欠陥透過性
の向上又は低下あるいはそれらの阻害を特徴とするものを含むＴ細胞媒介疾患の
治療に使用できると考えられる。 本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物で治療される状態又は疾患の例は
、これらに限られないが、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、若年性
慢性関節炎、変形性関節症、脊髄関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症
性ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、
サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血
色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血
小板減少症）、甲状腺炎（グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球甲状腺
炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質
性腎炎）、多発性硬化症、特発性脱髄性多発性ニューロパシー又はギヤン‐バレ
ー症候群及び慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシー等の中枢及び末梢神経系の
脱髄性疾患、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及び他の非肝向性ウイルス）、自
己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎
等の肝臓胆管疾患、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン感受
性腸炎、及びホウィップル病等の炎症性及び線維症性肺疾患、水疱性皮膚疾患、
多形性紅斑及び接触皮膚炎を含む自己免疫性又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息
、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びじんま疹等のアレルギ
ー性疾患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎等の肺の免疫性疾患、
移植拒絶及び対宿主性移植片病を含む移植関連疾患を含む。
【００７０】 全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心となるメディエータは自己タンパク
質／組織に対する自己反応性抗体の生成及びそれに続く免疫媒介性炎症の発生で
ある。抗体は、直接的又は間接的に組織傷害を仲介する。Ｔリンパ球は組織損傷
に直接含まれることは示されなかったが、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発生に
必要である。よって疾患の発生はＴ細胞依存性である。多数の器官及び系が臨床
的に影響を受け、腎臓、肺、骨格筋系、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系
、胃腸管、骨髄及び血液である。 慢性関節リウマチ（ＲＡ）は慢性の全身性自己免疫性炎症疾患であり、主に多
くの関節の滑膜を含み、最終的に関節軟骨の損傷を伴う。病因はＴ細胞依存性で
あり、リウマチ因子という自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成に関連し、結果的
に免疫複合体の形成をもたらし、それが滑液及び血液中で高レベルに達する。関
節におけるこれらの複合体は、リンパ球及び単球の滑膜への顕著な浸潤及びそれ
に続く滑膜の顕著な変化を誘発し、多くの好中球の添加で類似の細胞によって浸
潤された場合の関節空間／液。影響を受ける組織は主に関節であり、多くは対称
的なパターンをとる。しかしながら、関節外疾患も２つの主要な形態で起こる。
一方の形は進行性関節疾患の進行による関節外損傷の進行であり、典型低な損傷
は肺性線維症、脈管炎、及び皮膚潰瘍である。関節外疾患第二の形は、所謂フェ
ルティ症候群であり、それはＲＡ疾患の後期に起こるが関節疾患の鎮静開始後の
場合もあり、好中球減少、血小板減少及び巨脾症を含む。これは、複数の器官で
の梗塞を伴う脈管炎、皮膚潰瘍及び壊疽を付随する可能性がある。また患者は、
しばしば罹患関節を被う皮下組織で慢性関節リウマチ小結節が進行し；小結節の
後期段階は混合炎症性細胞浸潤に囲まれた壊死性中心部を持つ。ＲＡで起こりう
る他の徴候は：心膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺性線維症を持つ間質肺炎、乾性角
結膜炎、及び慢性関節リウマチ小結節を含む。 若年性慢性関節炎は、多くは１６歳未満の年齢で始まる慢性の特発性検証性疾
患である。その表現型はＲＡに幾分の類似性を持ち：リウマチ因子ポジティブの
患者の中には若年性慢性関節炎に分類される者もある。この疾患は３つの主要な
カテゴリー：少数関節(pauciarticular)、多数関節(polyarticular)、及び全身
に更に分類される。関節炎は重篤な、典型的には破壊的であり得、関節強直及び
成長遅延を導く。他の徴候は、慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイドーシス
を含みうる。
【００７１】 脊髄関節症は、幾つかの共通する臨床的特徴及び共通してＨＬＡ-Ｂ２７遺伝
子産物の発現に関連する群の疾患である。この疾患は：強直性脊椎炎、ライター
症候群（反応性関節炎）、炎症性膀胱疾患に関連する関節炎、乾癬を伴う脊髄炎
、脊髄関節症の若年発病及び未分化脊髄関節症を含む。区別できる特徴は、脊髄
炎有又は無の仙腸骨炎；炎症性非対称性関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７（クラスＩのＭ
ＨＣのＨＬＡ-Ｂ位置の血清学的に決定された対立遺伝子）関連；眼の炎症；及
び他のリウマチ性疾患に関連する自己抗原の欠如を含む。疾患の誘発に最も鍵と
なると考えられる細胞は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、クラスＩのＭＨＣ分子に提示さ
れる抗原を標的とする細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞はクラスＩのＭＨＣ対立遺伝
子ＨＬＡ-Ｂ２７に対して、ＭＨＣクラスＩ分子によって発現された外来ペプチ
ドであるように反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープは、細菌性又は他の微生
物性の抗原性エピトープに類似し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘発する。 全身性硬化症（強皮症）は病因が知られている。疾患の特徴は皮膚の硬結であ
り；これは活性な炎症性プロセスによって誘発されるようである。強皮症は局所
性又は全身性であり、血管損傷が多く発生し、毛細血管の上皮細胞損傷が全身性
強皮症進行の初期の重要な事象であり；血管損傷は免疫媒介されうる。免疫学的
な基礎は、皮膚損傷いおける単核細胞浸潤の存在、及び多くの患者における抗-
核抗体の存在によって示される。ＩＣＡＭ-１は皮膚損傷における繊維芽細胞の
細胞表面でしばしばアップレギュレートされ、これらの細胞とＴ細胞の相互作用
がこの疾患の病理で役割を担うことを示唆している。他の器官は：胃腸管：異常
な蠕動／運動性をもたらす平滑筋萎縮及び線維症；腎臓：小弓状及び小葉間動脈
に影響して結果的に腎臓皮質血流を減少させ、タンパク尿症、高窒素血症及び高
血圧をもたらす求心的皮下内膜増殖；骨格筋：萎縮、腸線維症、炎症；肺：間質
性肺炎及び間質性線維症；及び心臓：収縮帯壊死、瘢痕化／線維症を含む。
【００７２】 皮膚筋炎、多発性筋炎及び他を含む特発性炎症性ミオパシーは、未知の病因の
慢性筋肉炎症であり、筋肉の弱体化をもたらす。筋肉損傷／炎症は対称的で進行
性であることが多い。自己抗体は最大の形を伴う。これらの筋炎特異的自己抗体
は、タンパク質合成に含まれる成分、タンパク質及びＲＮＡの機能に対して検出
され、それらを阻害する。 シェーグレン症候群は、免疫媒介性炎症及びそれに続く涙腺及び唾液腺の機能
的破壊による。この疾患は、炎症性関節組織疾患に関連し、それを付随すること
がる。この疾患は、共に小さなＲＮＡ-タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗
原に対する自己抗体生産に関連する。損傷は、乾燥性角結膜炎、口内乾燥をもた
らし、タンパク質及び徴候又は関連はバイラル(bilary)肝硬変、末梢又は感覚神
経障害、及び明白な紫斑病を含む。 全身性脈管炎は、主要な傷害が炎症及びそれに続く血管への損傷であり、罹患
した血管によって供給される組織への虚血／壊死／変性及び或る場合には最終的
な末端組織の機能障害をもたらす。また脈肝炎は、第二の傷害又は続発症として
、他の免疫-炎症媒介疾患、例えば、慢性関節リウマチ、全身性硬化症などを起
こし、特に疾患において免疫複合体の形成を伴う。原発全身性脈管炎の群は：全
身性壊死性脈管炎：多発性動脈炎結節、アレルギー性血管炎及び肉芽腫症、多発
性血管炎；ヴェーゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症；及び巨細胞性動脈炎を
含む。その他の脈管炎は：粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳ又は川崎病）、孤
立性ＣＮＳ脈管炎、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎（バーガー病）及び皮
膚壊死性脈管炎を含む。列挙した脈管炎の殆どの型の病原機構は、主に血管壁で
の免疫グロブリン複合体の沈積及びそれに続くＡＤＣＣ、複合体形成のいずれか
、又はその両方を介する炎症反応の誘発による。 サルコイドーシスは、未知の病因の状態であり、身体の任意の組織近傍におけ
る類上皮肉芽腫の存在を特徴とし；肺が含まれるのが最も通常である。病原は活
性化マクロファージ及び疾患部位のリンパ細胞の持続を含み、これらの細胞型に
よって放出される局所性又は全身性の生成物の放出からもたらされる慢性的な後
遺症を持つ。 自己免疫性溶血性貧血、免疫性汎血球減少症、及び発作性夜間血色素尿症を含
む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞（或る場合には血小板などを含む他の血
液細胞）の表面に表現される抗原と反応する抗体の産生の結果であり、補体媒介
溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ-レセプター-媒介機構を介するこれらの抗体で被
覆された細胞の除去を反映する。
【００７３】 特発性血小板減少性紫斑病及び他の臨床的設定では免疫媒介血小板減少症、血
小板破壊／除去を含む自己免疫性血小板減少症は、抗体又は補体の血小板への接
着及びそれに続く補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ-レセプター媒介機構による除去
の結果として生ずる。 グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎
を含む甲状腺炎は、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果であり、甲状腺に存
在し、多くはそれに特異的であるタンパク質と反応する抗体の産生を伴う。存在
する実験的モデルは、自発性モデル：ラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びニワ
トリ（肥満ニワトリ株）；誘発性モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソー
ム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）での動物の免疫化を含む。 Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は、膵島β細胞の自己免疫破壊
であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞によって媒介される。インシ
ュリン又はインシュリンレセプターの抗体も、インシュリン-非-反応性の表現型
を生成できる。 糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫媒介腎疾患は、腎臓抗原に対する
自己反応性抗体又はＴ細胞の産生の結果として直接的な、あるいは他の非腎臓抗
原に対して反応性の抗体及び／又は免疫複合体の腎臓内での沈積の結果として間
接的な腎臓組織への抗体又はＴリンパ球媒介傷害の結果である。よって、免疫複
合体の形成をもたらす他の免疫媒介疾患も免疫媒介腎疾患を後遺症として誘発し
うる。直接的及び間接的免疫機構の両方とも病変の進行を生ずる／誘発する免疫
反応をもたらし、結果的に器官機能の障害、或る場合には腎不全の進行を生ずる
。体液性及び細胞性免疫機構はともに、傷害の病原に含まれる。
【００７４】 多発性硬化症；特発性脱髄性多発性ニューロパシー又はギヤン‐バレー症候群
；及び慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシーを含む中枢及び末梢神経系の脱髄
性疾患は、自己免疫性の基礎を持ち、オリゴデンドログリア又はミエリンに直接
生じた損傷の結果としての神経脱髄をもたらす。ＭＳにおいては、疾患誘発及び
進行がＴリンパ球依存性であることを示唆する証拠がある。多発性硬化症は脱髄
性疾患、即ちＴリンパ球依存性であり、再発-軽減経路又は慢性進行性経路を有
する。病因は未知だが；ウイルス感染、遺伝子的素因、環境、及び自己免疫性は
全て寄与する。病変部は主にＴリンパ球媒介の浸潤、小グリア細胞及び浸潤性マ
クロファージを含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は病変部の主要な細胞型である。オリ
ゴデンドログリア細胞死及びそれに続く脱髄の機構は知られていないが、Ｔリン
パ球駆動性と思われる。 好酸球性肺炎、特発性肺性線維症、及び過敏性肺炎を含む炎症性及び線維症性
肺疾患は、制御不能な免疫反応を含みうる。その反応の阻害は治療的に有益であ
る。 水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎を含む自己免疫性又は免疫媒介皮
膚疾患は、自己抗体に媒介され、その病因はＴリンパ球依存性である。 乾癬はＴリンパ球媒介炎症性疾患である。病変部はＴリンパ球、マクロファー
ジ及び抗原処理細胞、及び幾つかの抗中球の浸潤を含む。 喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びじんま疹を含む
アレルギー性疾患はＴリンパ球依存性である。これらの疾患は、主にＴ細胞誘発
性炎症、ＩｇＥ媒介炎症、又はこれら両方の組み合わせによって媒介される。 移植拒絶及び対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患はＴリンパ球
依存性であり；Ｔリンパ球機能の阻害は寛解的である。
【００７５】 免疫及び／又は炎症反応の介入が有益性を持つ他の疾患は、こられに限られな
いが、ウイルス感染（限定されないが、ＡＩＤＳ、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及び
ヘルペスを含む）、細菌感染、真菌感染、及び原生生物及び寄生虫感染（ＭＬＲ
を刺激する分子（又は誘導体／アゴニスト）は感染薬に対する免疫反応を促進す
るために治療的に使用できる）、免疫不全の疾患（ＭＬＲを刺激する分子／誘導
体／アゴニストは、生得的、獲得的、感染誘発的（ＨＩＶ感染など）、又は医原
性（例えば、化学治療薬から）の免疫不全の状態に対する免疫反応を促進するた
めに治療的に使用できる）、及び腫瘍形成を含む感染性疾患である。 或るヒト癌患者では、腫瘍形成細胞上の抗原に対する抗体及び／又はＴリンパ
球反応が進行することが示された。また、腫瘍形成の動物モデルにおける免疫反
応の促進が、その特定の腫瘍の拒絶又は退行をもたらしうることも示された。Ｍ
ＬＲにおいてＴリンパ球反応を促進する分子は、インビボで腫瘍形成に対する免
疫反応を促進に利用性を有する。Ｔリンパ球増殖反応を促進する分子（又は同じ
レセプターに反発的な形式で影響する小分子アゴニスト又は抗体）は、癌の治療
のために治療的に使用できる。またＭＬＲでリンパ球反応を阻害する分子は、イ
ンビボで腫瘍形成の間、腫瘍に対する免疫反応を抑制する用に機能し；そのよう
な分子は腫瘍細胞自身によって発現されるか、又はそれらの発現が他の細胞の腫
瘍によって誘発されうる。そのような阻害性分子の拮抗作用（抗体、小分子アン
タゴニスト又は他の手段による）は、免疫媒介腫瘍拒絶を促進する。 さらに、プロ炎症特性を持つ分子の阻害は、外傷；発作；心筋梗塞；アテロー
ム製硬化症、急性肺傷害、出血性ショック；火傷；敗血症／敗血性食；急性腎尿
細管壊死；子宮内膜症；変性関節疾患及び膵炎の再灌流において治療的有益性を
持つ。 本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒト
に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静
脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局
所、又は吸入（鼻内、肺内）経路などにより投与される。ポリペプチド及び抗体
の静脈内又は吸入投与が好ましい。
【００７６】 イムノアジュバント療法では、他の治療的養生法、例えば抗癌剤の投与を本発
明ののタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わせてもよい。例えば、本発
明のイムノアジュバントで治療される患者は、抗癌剤（化学治療薬）又は放射線
治療も受けてよい。このような化学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製
造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。
そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy S
ervice M.C. Perry編, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載
されている。化学治療薬は、イムノアジュバントの投与に先立って、又は続いて
投与してもよく、あるいはそれと同時に投与してもよい。さらに、タモキシフェ
ン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（EP 6
16812参照）等の化合物を、それらの分子について知られた用量で与えてもよい
。 また、他の免疫疾患又は腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１
１ａ、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内
皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。あるいは、又は
それに加えて、ここに開示するのと同じ又は２又はそれ以上の異なる抗原に結合
する２又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。ときどきは、患者に一
又は複数のサイトカインを投与することも有利である。一実施態様では、本発明
のポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投
与し、続いて本発明のポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、最初
に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられ
ている量であるが、成長阻害剤と本発明のポリペプチドとの組み合わせ（相乗）
作用により減少させ得る。 免疫関連疾患の治療又は重篤さの低減のための、本発明の化合物の適切な用量
は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、薬剤が
防止又は治療目的で投与されるか、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対
する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一
連の治療に渡って投与される。 例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（
例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチド又は抗体が、例えば、１又は
それ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するため
の最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μ
ｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し
投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続
けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進
行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
【００７７】 １２．製造品 本発明の他の実施態様では、上記の免疫関連疾患の診断又は治療に有用な物質
を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備してなる。好適
な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガ
ラス又はプラスチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治
療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、
容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイア
ルであってよい）。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド又は抗体で
ある。容器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療の
ために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及
びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を
具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ
、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地か
ら望ましい他の材料を含んでもよい。
【００７８】 １３．免疫関連疾患の診断及び予知 或る種の免疫関連疾患で過剰発現されるタンパク質等の細胞表面タンパク質は
候補薬剤又は疾患治療の優れた標的である。同じタンパク質は免疫関連疾患状態
で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに、これらの疾患の診
断及び予知に更なる用途が見出される。例えば、多発性硬化症、慢性関節リウマ
チ、又は他の免疫関連疾患で増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は
診断学又は予後判定として使用できる。 例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅された遺伝子にコードされるタンパク質
（「マーカー遺伝子産物」）の発現の定性的又は定量的検出に用いることができ
る。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡
、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術
によって監視できる。これらの技術は、増幅された遺伝子が細胞表面タンパク質
をコードする場合に特に好ましい。このような結合アッセイは、上記に実質的に
記載されたように実施される。 マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又
は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者
から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体を
それに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物
の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組
織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
【００７９】 以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り
込む。 （実施例） 実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の
使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体
を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、１０８０１ユニヴァーシティー・ビルディング、マナッサス、ＶＡ２
０１１０−２２０９である。特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書
に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いた：Sambrook
等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y
., 1989; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publis
hing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis等, PCR Protoco
ls: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y.., 19
90; Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, 1988; Gait, Oligonucleotide synthesis, IRL Press, O
xford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Curren
t Protocols in Immunology, 1991。
【００８０】 実施例１ ヒトＰＲＯＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ
３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６をコードするｃＤＮＡクローンの単離 Ｉ．ヒトＰＲＯ２４５クローンをコードするｃＤＮＡの単離 ヒトＰＲＯ２４５をコードするｃＤＮＡクローンの単離 Swiss-Protデータベースからの約950の公知の分泌タンパク質からの細胞外ド
メイン（ＥＣＤ）配列（あるとすれば分泌シグナル配列を含む）を発現配列タグ
（ＥＳＴ）データベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは公的なＥＳＴ
データベース（例えばGenBank）及び個人的なＥＳＴデータベース（LIFESEQ(商
品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュー
タプログラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460
-480(1996)］を用い、ＥＳＴ配列の6フレーム翻訳に対するＥＣＤタンパク質配
列の比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコアが70（9
0の場合もある）又はそれ以上となる比較物を、プログラム「phrap」（Phil Gre
en, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ
配列に集団化して構築した。 ＰＲＯ２４５をコードするコンセンサスＤＮＡ配列は他のＥＳＴ配列に対して
構築し、このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３０９５４と命名し、ポリペプ
チドは膜タンパク質レセプターチロシンキナーゼタンパク質と幾分の構造総合性
を示した。 ＤＮＡ３０９５４コンセンサス配列に基づいて、ＰＣＲにより対象とする配列
を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯ２４５の全長コード化配
列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを
合成した。 ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した： 正方向ＰＣＲプライマー： 5'-ATCGTTGTGAAGTTAGTGCCCC-3'(配列番号：１５) 逆方向ＰＣＲプライマー： 5'-ACCTGCGATATCCAACAGAATTG-3'(配列番号：１６) さらに、次のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成
プローブをコンセンサスＤＮＡ３０９５４配列から構築した： ハイブリッド形成プローブ： 5'-GGAAGAGGATACAGTCACTCTGGAAGTATTAGTGGCTCCAGCAGTTCC-3'(配列番号：１７)
【００８１】 全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするため
に、ライブラリからのＤＮＡを上記のようの同定したＰＣＲプライマー対でのＰ
ＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブ
オリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いたＰＲＯ２４５をコードする
クローンの単離に使用した。 ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡをヒト胎児肝臓組織から単離した
。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、Invitrog
en, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成し
た。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキ
ナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でお
よそのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫ
Ｂ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体
である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)）に独特のＸｈｏｌ及びＮ
ｏｔＩ部位においてクローン化した。 上記のように単離されたクローンのＤＮＡ配列は、全長ＰＲＯ２４５ポリペプ
チドについての全長ＤＮＡ配列［ここでＵＮＱ２１９（ＤＮＡ３５６３８）と命
名する］及び当該ＰＲＯ２４５ポリペプチドの誘導タンパク質配列を与えた。 ＵＮＱ２１９（ＤＮＡ３５６３８）の全長ヌクレオチド配列をＦｉｇ３（配列
番号：１）に示す。クローンＵＮＱ２１９（ＤＮＡ３５６３８）は、単一のオー
プンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８９
−９１に見かけの翻訳開始部位を持ち［Kozak等, 上掲］、ヌクレオチド位置１
０２５−１０２７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ３）。予測されるポリペプチ
ド前駆体は３１２アミノ酸長である（Ｆｉｇ４：ＰＲＯ２４５；配列番号：２）
。クローンＵＮＱ２１９（ＤＮＡ３５６３８）は1997年9月17日にＡＴＣＣに寄
託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２６５が付与されている。 全長ＰＲＯ２４５配列のアミノ酸配列分析は、それがヒトｃ-ｍｙｂタンパク
質と60%のアミノ酸同一性を持ち、よって膜貫通タンパク質レセプターチロシン
キナーゼファミリーの新規のメンバーであることを示唆した。
【００８２】 ＩＩ．ヒトＰＲＯ２１７をコードするｃＤＮＡクローンの単離 Swiss-Protデータベースからの約950の公知の分泌タンパク質からの細胞外ド
メイン（ＥＣＤ）配列（あるとすれば分泌シグナル配列を含む）をＥＳＴデータ
ベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは公的なＥＳＴデータベース（例
えばGenBank）及び個人的なＥＳＴデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pha
rmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST
又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480(1996); thhp:
//blast.wustl/edu/blast/README.html）を用い、ＥＳＴ配列の6フレーム翻訳に
対するＥＣＤタンパク質配列の比較として実施した。公知のタンパク質をコード
せず、BLASTスコアが70（90の場合もある）又はそれ以上となる比較物を、プロ
グラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washingt
on; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap/docs/phrap.html）でコンセン
サスＤＮＡ配列に集団化して構築した。 ＥＧＦ様相同体をコードするコンセンサスＤＮＡ配列はphrapを用いて構築し
た（ＤＮＡ２８７２６、ＤＮＡ２８７３０及びＤＮＡ２８７６０）。幾つかの場
合には、コンセンサス配列はblast及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長さ
せ、コンセンサス配列を上記３つのＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長
させた。 このコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃ
ＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２４０の全長コード化配列の
クローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成
した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマー（各々*.f及び*.rで表示）の対は、２
０〜３０（典型的には２４）ヌクレオチドの範囲であり、１００−１０００ｂｐ
長のＰＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列（*.pで表記）は典型
的には４０-５５（典型的には５０）ｂｐ長である。幾つかの場合には、コンセ
ンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きな場合には更なるオリゴヌクレオチド
を合成する。全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニン
グするために、ライブラリからのＤＮＡをAusubel等, Current Protocols in Mo
lecular Biologyのように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリー
ニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及び
プライマー対の一方を用いたインビボクローニング法による興味ある遺伝子をコ
ードするクローンの単離に使用した。このライブラリをＤＮＡ３２２７９、ＤＮ
Ａ３２２９２及びＤＮＡ３３０９４の単離に使用し、各々胎児腎臓、胎児肺及び
胎児肺であった。
【００８３】 ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡは、標準的な方法、例えばAusube
l等, Current Protocols in Molecular Biologyを用いて、組織又は細胞系供給
源から単離するか、又は市販の供給源（例えばClontech）から購入した。ｃＤＮ
Ａクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、市販試薬（例えば
Invitrogen）用いて標準的方法（例えば、Ausbel等）によって形成した。ｃＤＮ
Ａは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナーゼアダ
プターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイ
ズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫ５Ｂ又はｐ
ＲＫ５Ｄ等）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。 ｃＤＮＡクローンの全体を配列決定した。ＥＧＦ様相同体ＰＲＯ２１７の全ヌ
クレオチド配列をＦｉｇ５（配列番号：３）に示す。予測されるポリペプチドは
３７９アミノ酸長であり（ＰＲＯ２１７：Ｆｉｇ６（配列番号：４）、約41.52
ｋＤａの分子量を持つ。 上記の方法に使用したオリゴヌクレオチド配列は以下の通り： ２８７２６.p（ＯＬＩ５００）(配列番号：１８) GGGTACACCTGCTCCTGCACCGACGGATATTGGCTTCTGGAAGGCC ２８７２６.f（ＯＬＩ５０２）(配列番号：１９) ACAGATTCCCACCAGTGCAACC ２８７２６.r（ＯＬＩ５０３）(配列番号：２０) CACACTCGTTCACATCTTGGC ２８７３０.p（ＯＬＩ５１６）(配列番号：２１) AGGGAGCACGGACAGTGTGCAGATGTGGACGAGTGCTCACTAGCA ２８７３０.f（ＯＬＩ５１７）(配列番号：２２) AGAGTGTATCTCTGGCTACGC ２８７３０.r（ＯＬＩ５１８）(配列番号：２３) TAAGTCCGGCACATTACAGGTC ２８７３０.p（ＯＬＩ６１７）(配列番号：２４) CCCACGATGTATGAATGGTGGACTTTGTGTGACTCCTGGTTTCTGCATC ２８７３０.f（ＯＬＩ６１８）(配列番号：２５) AAAGACGCATCTGCGAGTGTCC ２８７３０.r（ＯＬＩ６１９）(配列番号：２６) TGCTGATTTCACACTGCTCTCCC
【００８４】 ＩＩＩ．ヒトＰＲＯ３０１をコードするｃＤＮＡクローンの単離 Swiss-Protデータベースからの約950の公知の分泌タンパク質からの細胞外ド
メイン（ＥＣＤ）配列（あるとすれば分泌シグナル配列を含む）をＥＳＴデータ
ベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは公的なＥＳＴデータベース（例
えばGenBank）及び個人的なＥＳＴデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pha
rmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST
又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480(1996); thhp:
//blast.wustl/edu/blast/README.html］を用い、ＥＳＴ配列の6フレーム翻訳に
対するＥＣＤタンパク質配列の比較として実施した。公知のタンパク質をコード
せず、BLASTスコアが70（90の場合もある）又はそれ以上となる比較物を、プロ
グラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washingt
on; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap/docs/phrap.html）でコンセン
サスＤＮＡ配列に集団化して構築した。 ＤＮＡ３５９３６をコードするコンセンサスＤＮＡ配列はphrapを用いて構築
した。幾つかの場合には、コンセンサス配列はblast及びphrapの繰り返しサイク
ルを用いて伸長させ、コンセンサス配列を上記のＥＳＴ配列の３つの供給源を用
いて可能な限り伸長させた。 このコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃ
ＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）全長コード化配列のクローンを単離
するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及
び逆方向ＰＣＲプライマー（各々*.f及び*.rで表示）の対は、２０〜３０（典型
的には２４）ヌクレオチドの範囲であり、１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物
を与えるように設計される。プローブ配列（*.pで表記）は典型的には４０-５５
（典型的には５０）ｂｐ長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約１
−１．５ｋｂｐより大きな場合には更なるオリゴヌクレオチドを合成する。全長
クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ラ
イブラリからのＤＮＡをAusubel等, Current Protocols in Molecular Biology
のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次い
でポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一
方を用いたインビボクローニング法による興味ある遺伝子をコードするクローン
の単離に使用した。 全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするため
に、ライブラリからのＤＮＡを上記のようの同定したＰＣＲプライマー対でのＰ
ＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブ
オリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いたＰＲＯ３０１をコードする
クローンの単離に使用した。
【００８５】 ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓から単離した。ｃ
ＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、市販試薬（例
えば、Invitrogen, San Diego, CA; Clontech）を用いて標準的方法によって形
成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘ
ミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動
でおよそのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐ
ＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前
駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)）に独特のＸｈｏｌ及
びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。 ｃＤＮＡクローンの全体を配列決定した。天然配列ＰＲＯ３０１の全長ヌクレ
オチド配列をＦｉｇ７（配列番号：５）に示す。クローンＤＮＡ４０６２８は、
単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチ
ド位置５２−５４に見かけの翻訳開始部位を持つ［Kozak等, 上掲］（Ｆｉｇ７
）。予測されるポリペプチド（ＰＲＯ３０１：Ｆｉｇ８；配列番号：６）は２９
９アミノ酸であり、３２５８３の予測分子量及び８．２９のｐＩを有する。クロ
ーンＤＮＡ４０６２８はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３２が
付与されている。 全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、ＰＲＯ３０１
は、Ａ３３抗原前駆体（30%）及びコクサッキー及びアデノウイルスレセプター
タンパク質（29%）とのアミノ酸配列同一性を示した。 上記の方法に使用したオリゴヌクレオチド配列は以下の通り： ＯＬＩ２１６２（３５９３６.f1） (配列番号：２７) TCGCGGAGCTGTGTTCTGTTTCCC ＯＬＩ２１６３（３５９３６.p1） (配列番号：２８) TGATCGCGATGGGGACAAAGGCGCAAGCTCGAGAGGAAACTGTTGTGCCT ＯＬＩ２１６４（３５９３６.f2） (配列番号：２９) ACACCTGGTTCAAAGATGGG ＯＬＩ２１６５（３５９３６.r1） (配列番号：３０) TAGGAAGAGTTGCTGAAGGCACGG ＯＬＩ２１６６（３５９３６.f3） (配列番号：３１) TTGCCTTACTCAGGTGCTAC ＯＬＩ２１６７（３５９３６.r2） (配列番号：３２) ACTCAGCAGTGGTAGGAAAG
【００８６】 ＩＶ．ヒトＰＲＯ２６６をコードするｃＤＮＡクローンの単離 Swiss-Prot公的データベースからの約950の公知の分泌タンパク質からの細胞
外ドメイン（ＥＣＤ）配列（あるとすれば分泌シグナル配列を含む）を発現配列
タグ（ＥＳＴ）データベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは公的なＥ
ＳＴデータベース（例えばGenBank）及び個人的なＥＳＴＤＮＡデータベース（L
IFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、
コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology
, 266: 460-480(1996)）を用い、ＥＳＴ配列の6フレーム翻訳に対するＥＣＤタ
ンパク質配列の比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTス
コアが70（90の場合もある）又はそれ以上となる比較物を、プログラム「phrap
」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington; http://bo
zeman.mbt.washington.edu/phrap/docs/phrap.html）でコンセンサスＤＮＡ配列
に集団化して構築した。 発現配列タグに基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡラ
イブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２６６の全長コード化配列のクローン
を単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正
方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０〜３０ヌクレオチドの範囲であ
り、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるように設計される
。プローブ配列は典型的には４０-５５ｂｐ長である。幾つかの場合には、コン
センサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きな場合には更なるオリゴヌクレオチ
ドを合成する。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングする
ために、ライブラリからのＤＮＡをAusubel等, Current Protocols in Molecula
r Biologyのように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニング
した。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライ
マー対の一方を用いたインビボクローニング法により興味ある遺伝子をコードす
るクローンの単離に使用した。 ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した： 正方向ＰＣＲプライマー： 5'-GTTGGATCTGGGCAACAATAAC-3'(配列番号：３３) 逆方向ＰＣＲプライマー： 5'-ATTGTTGTGCAGGCTGAGTTTAAG-3'(配列番号：３４) さらに、次のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成
プローブを構築した： ハイブリッド形成プローブ： 5'-GGTGGCTATACATGGATAGCAATTACCTGGACACGCTGTCCCGGG-3'(配列番号：３５) 全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライ
ブラリからのＤＮＡをＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニング
した。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライ
マー対の一方を用いてＰＲＯ２６６遺伝子をコードするクローンの単離に使用し
た。
【００８７】 ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡをヒト胎児脳組織から単離した。
ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、Invitrogen
, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した
。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナ
ーゼアダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよ
そのサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ
又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体で
ある；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏ
ｔＩ部位においてクローン化した。 上記のように単離されたクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ２６６の全長ＤＮＡ
配列（ここでＵＮＱ２３３（ＤＮＡ３７１５０）と命名する）及びＰＲＯ２６６
の誘導タンパク質配列を与えた。 ＵＮＱ２３３（ＤＮＡ３７１５０）の全長ヌクレオチド配列をＦｉｇ９（配列
番号：７）に示す。クローンＵＮＱ２３３（ＤＮＡ３７１５０）は、単一のオー
プンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１−
３に見かけの翻訳開始部位を持ち［Kozak等, 上掲］、ヌクレオチド位置２０８
８後の停止コドンで終端する。予測されるポリペプチド前駆体は６９６アミノ酸
長でありる（Ｆｉｇ１０；ＰＲＯ２６６；配列番号：８）。クローンＵＮＱ２３
３（ＤＮＡ３７１５０）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４０１
が付与されている。 全長ＰＲＯ２６６ポリペプチドのアミノ酸配列分析は、その一部がＳＬＩＴタ
ンパク質と有意な相同性を持ち、よってＰＲＯ２６６が新規なロイシンリッチ反
復タンパク質であることを示唆している。
【００８８】 Ｖ．ヒトＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６をコードするｃＤＮＡク
ローンの単離 Swiss-Prot公的データベースからの約950の公知の分泌タンパク質からの細胞
外ドメイン（ＥＣＤ）配列（あるとすれば分泌シグナル配列を含む）を発現配列
タグ（ＥＳＴ）データベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは公的なＥ
ＳＴデータベース（例えばGenBank）及び個人的なＥＳＴデータベース（LIFESEQ
(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピ
ュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology, 266:
460-480(1996)）を用い、ＥＳＴ配列の6フレーム翻訳に対するＥＣＤタンパク
質配列の比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコアが7
0（90の場合もある）又はそれ以上となる比較物を、プログラム「phrap」（Phil
Green, University of Washington, Seattle, Washington; http://bozeman.mb
t.washington.edu/phrap/docs/phrap.html）でコンセンサスＤＮＡ配列に集団化
して構築した。 コンセンサスＤＮＡ配列は、他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて構築した
。コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮ
Ａライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ
３２６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために
、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的
に２０〜３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長の
ＰＣＲ産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０-５５ｂ
ｐ長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大
きな場合には更なるオリゴヌクレオチドを合成する。全長クローンについて幾つ
かのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡをAusube
l等, Current Protocols in Molecular Biologyのように、ＰＣＲプライマー対
でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プ
ローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いたインビボクローニン
グ法により興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。 全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするため
に、ライブラリからのＤＮＡをＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリ
ーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及
びプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６遺
伝子をコードするクローンの単離に使用した。
【００８９】 ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＰＲＯ３
３５及びＰＲＯ３２６）及びヒト胎児脳（ＰＲＯ３３１）から単離した。ｃＤＮ
Ａクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、Invitrogen, San
Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。ｃＤ
ＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキナーゼア
ダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサ
イズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐ
ＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；
Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)）に独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部
位においてクローン化した。 上記のように単離されたクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３３５（Ｆｉｇ１１
；配列番号：９）、ＰＲＯ３３１（Ｆｉｇ１３；配列番号：１１）又はＰＲＯ３
２６（Ｆｉｇ１５；配列番号：１３）の全長ＤＮＡ配列及びＰＲＯ３３５（Ｆｉ
ｇ１２；配列番号：１０）、ＰＲＯ３３１（Ｆｉｇ１４；配列番号：１２）又は
ＰＲＯ３２６（Ｆｉｇ１６；配列番号：１４）の誘導タンパク質配列を与えた。
ＰＲＯ３３５をコードする核酸は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ
寄託番号２０９９２７が付与され；ＰＲＯ３３１をコードする核酸は1997年11月
7日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３９が付与され；ＰＲＯ
３２６をコードする核酸は1997年11月21日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託
番号２０９４８９が付与されている。 全長ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドのアミノ酸配
列の分析は、それがＬＩＧ-１タンパク質との有意な相同性を持ち、よってＰＲ
Ｏ３３５、ＰＲＯ３３１及びＰＲＯ３２６が新規なＬＩＧ-１関連タンパク質で
あることを示唆している。
【００９０】 実施例２ 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（２４番）における刺激活性 この実施例は、本発明のポリペプチドが、刺激されたＴリンパ球の増殖の刺激
装置として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫反
応の促進が有益である場合に治療的に有用である。リンパ球の増殖を阻害する化
合物は、免疫反応の抑制が有益である場合に治療的に有用である。治療薬は、本
発明のポリペプチドのアンタゴニストの形、例えば、ポリペプチドに対するマウ
ス-ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体としてよい。 このアッセイの基本的プロトコールは、J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H.
Marglies, E.M. Shevach, W. Stober編集, National Institutes of Health, J
ohn Wiley and Sons, Inc.発行によるCurrent Protocols in Immunology, unit
3.12に記載されている。 より詳細には、末梢血液単球細胞（ＰＢＭＣ）は、哺乳動物個体、例えばヒト
志願者からロイコフェレーシスにより単離する（一方のドナーは刺激性ＰＢＭＣ
を供給し、他方のドナーはレスポンダーＰＢＭＣを供給する）。必要ならば、単
離の後に細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結させる。凍結細胞を終夜アッ
セイ用バッファー中で解凍し（37℃、5%ＣＯ２）、次いで洗浄して、アッセイ用
媒体（ＲＰＭＩ：10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン／ストレプトアビジン、1%グ
ルタミン、1%ＨＥＰＥＳ、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸塩）中に3x10６細胞
/mlで懸濁する。
【００９１】 刺激性ＰＢＭＣは、細胞を放射線処理（約3000Rads）することにより調製する
。アッセイは、次の混合物を3回蒔くことにより調製した： 1%又は0.1%に希釈した試験試料100μl 放射線処理した刺激性細胞50μl、及び レスポンダーＰＢＭＣ細胞50μl。 100マイクログラムの細胞培養培地又は100マイクロリットルのＣＤ４-ＩｇＧを
対照として用いた。次いでウェルを37℃、5%ＣＯ２で4日間インキュベートした
。5日目に、ウェルをトリチウム化チミジン（i.0mC/ウェル；Amersham）でパル
スした。6時間後に細胞を3回洗浄し、取り込みレベルを見積もった。 このアッセイの他の変形法では、ＰＢＭＣをＢａｌｂ／ｃ及びＣ５７Ｂ６マウ
スから単離する。細胞は、新たに回収した脾臓からアッセイ用媒体（ＲＰＭＩ；
10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン／ストレプトアビジン、1%グルタミン、1%ＨＥ
ＰＥＳ、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸塩）で処理し(teased)、これらの細胞
をリンパ球Ｍ（Organon Teknika）上に被せ、2000rpmで20分間遠心分離し、アッ
セイ用媒体中の単核細胞を回収して洗浄し、細胞をアッセイ用媒体の1x10７細胞
/mlに再懸濁することによりＰＢＭＣを単離する。次いで、ストック溶液の希釈
で得たＰＲＯ濃度を持つ試料を用いて上記のようにアッセイを実施する。本発明
の化合物について、このアッセイの結果を以下に示す。対照を越える正の増大を
ポジティブと考え、180%以上の増大を持つポジティブが好ましい。しかしながら
、対照よりも大きな全ての値が試験タンパク質に対する刺激性効果を示している
。
【００９２】
【００９３】 実施例３ 皮膚血管透過性アッセイ（６４番） このアッセイは、或る種の本発明のポリペプチドが、動物の注入部位において
免疫反応を誘発し、単核細胞、好酸球及びＰＭＮ浸潤を誘発することにより炎症
を誘発することを示す。この皮膚血管透過性アッセイは次のように実施する。35
0グラム以上の体重の無毛モルモットを、ケタミン（75-80mg/Kg）及び5mg/Kgキ
シラジンで筋肉内（ＩＭ）麻酔する。本発明の精製ポリペプチド又は条件培地試
験試料を、注入部位当たり100μLで試験動物の背に経皮注射する。動物当たり約
10-30、好ましくは約16-24の注入部位を持つことができる。1mLのエバンスブル
ー染料（生理食塩水中1%）を噴門内注入する。次いで、注入部位における斑点を
注入の1時間及び6時間後に測定する（mm直径）。注入後6時間で動物を犠牲にす
る。各皮膚注入部位を生検とし、フォルマリン中に固定する。次いで皮膚を組織
病理学的評価のために調製した。各部位を、炎症性細胞の皮膚への浸潤について
評価した。目視可能な炎症性細胞浸潤を持つ部位にポジティブというスコアを付
けた。炎症性細胞は、好中球、好酸球、単球又はリンパ球でありうる。本発明の
化合物に関するこの試験の結果を以下に示す。 下記の表において、注入部位での少なくとも最小の血管周囲浸潤にポジティブ
のスコアをつけ、浸潤の無い注入部位をネガティブとスコア付けした。
【００９４】 実施例４ ヒト同時刺激アッセイ Ｔ細胞レセプターに媒介されるシグナルの活性化に加えて、Ｔ細胞活性化は同
時刺激シグナルを必要とする。一つの同時刺激シグナルはＢ７（ＣＤ３）とＣＤ
２８との相互作用によって生成される。このアッセイにおいては、96ウェルプレ
ートをＣＤ２８有又は無のＣＤ３で被覆し、次いでヒト末梢血リンパ球、次いで
試験タンパク質を添加する。リンパ球の増殖は、トリチウム化チミジン取り込み
により決定する。ポジティブなアッセイは、試験タンパク質がリンパ球増殖に刺
激性シグナルを提供したことを示す。 材料： １）カルシウム、マグネシウムを含まないハイクローン(Hyclone)Ｄ-ＰＢＳ ２）Nunc96ウェル認定プレート#4-39454 ３）好-ヒトＣＤ３Amac 0178 200μg/mlストック ４）好ヒトＣＤ２８Biodesgn P42235M ５）媒体：GibcoＲＰＭＩ1640＋Intergen#1020-90ＦＢＳ、1%Ｇｌｕ、1%Ｐ／Ｓ
、50μg/mlゲンタマイシン、10mMＨｅｐｅｓ。各アッセイ毎に新鮮。 ６）トリチウム化チミジン ７）ロイコフェレーシス法を介して収集された凍結ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ
）。 プレートは、96ウェル平底プレートを、カルシウム及びマグネシウムを含まな
いハイクローンＤ-ＰＢＳ中の抗-ＣＤ３抗体（Amac）又は抗-ＣＤ２８抗体（Bio
design）又は両方で被覆することにより調製する。抗ＣＤ-３抗体は10ng/ウェル
（200ng/mlの50μl）、抗-ＣＤ２８抗体は25ng/ウェル（0.5μg/mlの50μl）で1
00μlの全容量で使用した。 ＰＢＬは、ヒトドナーから標準的なロイコフェレーシス法を用いて単離した。
細胞調製物は、アッセイを実施するまで50%のウシ胎児血清及び50%のＤＭＳＯ中
で凍結させた。細胞は、媒体中で解凍してＰＢＬで洗浄し、ＰＢＬを25mlの媒体
中に再懸濁して37℃、5%ＣＯ２で終夜インキュベートした。 アッセイ法において、被覆プレートをＰＢＳで2回洗浄し、ＰＢＬを洗浄して1
00μL/ウェルを用いて1x10６細胞/mlに再懸濁した。試験タンパク質又は対照媒
体の100μlをプレートに添加してウェル当たりの全容量を200μLとした。プレー
トを72時間インキュベートした。次いでプレートをトリチウム化チミジン（1mC/
ウェル；Amersham）で6時間パルスし、プレートからＰＢＬを回収してトリチウ
ム化チミジンの取り込みを見積もった。
【００９５】 実施例５ インサイツハイブリッド形成 インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及
び位置測定のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部
位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び位置測定、特定ｍ
ＲＮＡ合成及び染色体マッピングにおける変化の追跡に有用である。 インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1
994)のプロトコールの最適な変形に従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボプロー
ブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を
切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で15分間37℃で脱タン
パクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリッ
ド形成する。［３３-Ｐ］ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物か
ら生成し、55℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2核トラック
エマルションに浸漬して4週間露出する。 ３３Ｐ-リボプローブ合成 6.0μl（125mCi）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）
をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む管に以下の成分を添加し
た： 2.0μlの5ｘ転写バッファー 1.0μlのＤＴＴ（100mM） 2.0μlのＮＴＰ混合物（2.5mM: 10μl; 10mMのGTP, CTP及びATP+10μlのH2O） 1.0μlのＵＴＰ（50μM） 1.0μlのＲｎａｓｉｎ 1.0μlのＤＮＡテンプレート（1μg） 1.0μlのＨ２Ｏ 管を37℃で1時間インキュベートし、1.0μLのRQ1 ＤＮａｓｅを添加し、次い
で37℃で15分間インキュベートした。90μLのＴＥ（10mMトリスpH7.6／1mMのＥ
ＤＴＡpH8.0）を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMicroco
n-50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（6分間
）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（3
分間）。最終回収スピンの後、100μlのＴＥを添加した。1μlの最終生成物をDE
81紙にピペットし6mlのBiofluor IIで数えた。 プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。1-3μLのプローブ又は5μLのＲＮ
Ａ Ｍｒｋ ＩＩＩを3μLの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で95℃に
3分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし
、試料を負荷し、180-250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラッ
プし、-70℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに1時間から終夜露
出した。
【００９６】 ３３Ｐ-ハイブリッド形成 凍結切片の前処理： スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに
配置して室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して
凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で
10分間固定し、0.5ｘＳＳＣで5分間、室温で洗浄した（25ml 20xSSC + 975ml SQ
H2O）。0.5μg/mlのプロテイナーゼＫ中、37℃で10分間の脱タンパクの後（250
mlの予備加温ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の10mg/mlストック12.5μL
）、切片を0.5ｘＳＳＣで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタ
ノール中、各2分間脱水した。 パラフィン包埋切片の前処理： スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中
に配置し、2ｘＳＳＣで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/ml
のプロテイナーゼＫ（250ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中10mg/ml
を500μｌ；37℃、15分間）−ヒト胚又は8xプロテイナーゼＫ（250mlのＲＮａｓ
ｅバッファー中100μL、37℃、30分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続
く0.5ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。 プレハイブリッド化： スライドをＢｏｘバッファー（4ｘＳＳＣ、50%ホルム
アミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μl
のハイブリッド形成バッファー（3.75gデキストラン硫酸＋6mlＳＱ Ｈ２Ｏ）で
被覆し、ボルテックスし、キャップを外して2分間マイクロ波で加熱した。氷上
で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75ｍｌの20ｘＳＳＣ及び9mlのＳＱ
Ｈ２Ｏを添加し、組織を良くボルテックスし、42℃で1-4時間インキュベートし
た。 ハイブリッド形成： スライド当たり1.0ｘ10６cpmのプローブ及び1.0μLのｔ
ＲＮＡ（50mg/mlストック）を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、
スライド当たり48μlのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックス
の後、50μlの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド化50μLに添加した
。スライドを55℃で終夜インキュベートした。 洗浄： 洗浄は、2ｘ10分間、2ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（400mlの2
0ｘSSC＋16mlの0.25M EDTA、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を37℃で30
分間行った（250mlＲＮａｓｅバッファー中10mg/mlを500μL＝20μg/ml）。スラ
イドを2ｘ10分間、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通
り：55℃で2時間、0.1ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（20mlの20ｘSSC＋16mlのEDTA、Ｖｆ
＝４Ｌ）。
【００９７】 ＤＮＡ３５６３８（１ ＴＭレセプター） 発現は、胎児サブセットの内皮内面及び胎盤血管において観察された。内皮発
現はこれらの組織ブロックに限定されていた。また発現は、胎盤の中間栄養膜細
胞に渡っても観察された。 オリゴC-120N：（配列番号：３６） GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGC GGC GGC TCA GGT CTT CAG TT オリゴc-120P：（配列番号：３７） CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GCA TGG GAT GGG GAG GGA TAC GG ＤＮＡ３３０９４（ＥＧＦ相同体） 高度な識別性の発現パターンが観察された。ヒト胚では、発現はＧＩ管の外部
平滑筋層、呼吸器軟骨、分枝呼吸器内皮、骨芽細胞、腱、生殖腺、視覚神経頭及
び発達中の真皮で観察された。成人では、発現はチンパンジー舌の表皮ペッグ(p
egs)、胎盤及び膀胱の基底内皮／筋上皮細胞で観察された。また、成人肺の肺胞
内面細胞、陰茎の***組織に近接して並んだ間葉細胞及び大脳皮質（おそらくグ
リア細胞）でも発現が見られた。腎臓では、発現は疾患においてのみ、甲状腺化
尿細管を囲む細胞において見られた。 オリゴD-200V：（配列番号：３８） CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA ATA GCA GGC CAT CCC AGG ACA オリゴD-200Z：（配列番号：３９） CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGT CTT CCA TGC CAA CCT TC
【００９８】 実施例６ 細胞及び疾患組織でのインサイツハイブリッド形成 実施例のインサイツハイブリッド形成方法を、遺伝子発現の決定、転写物の組
織分布、及び特定疾患に罹患したヒト個体から単離した疾患組織における本発明
の遺伝子／ＤＮＡ及びタンパク質の合成のための特定のｍＲＮＡにおける変化の
追跡に用いた。これらの結果は、疾患組織の何処において本発明の遺伝子がより
特異的に発現されるか、及び疾患における本発明の阻害性又は刺激性化合物（及
びそのアゴニスト又はアンタゴニスト）の治療効果の特定位置をより予測的に示
す。ハイブリッド形成は、以下の組織及び細胞試料の一又は複数を使用して実施
例５の方法に従って実施した。 （ａ）リンパ球及び抗原提示細胞（樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロフ
ァージ及び単球、ＮＫ細胞）； （ｂ）リンパ組織：正常及び反応性リンパ節、胸腺、気管支関連リンパ組織（
ＢＡＬＴ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）； （ｃ）ヒト疾患組織 ・関節炎及び変性関節疾患を持つ患者の滑膜及び関節 ・潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患を持つ患者からの大腸 ・乾癬及び他の型の皮膚炎からの皮膚病変部 ・慢性及び急性気管支炎、肺炎、肺、胸膜炎からのＢＡＬＴを含む肺組織及
び組織リンパ節 ・喘息からのＢＡＬＴを含む肺組織及び組織リンパ節 ・鼻炎又は副鼻腔炎を持つ患者からの鼻及び副鼻腔組織 ・多発性硬化症、アルツハイマー病及び発作からの脳及び脊髄 ・腎炎、糸球体腎炎及び全身性エリテマトーデスからの腎臓 ・感染性及び非感染性肝炎からの肝臓 ・腫瘍／癌からの組織 発現は一又は複数の細胞又は組織試料で観察され、これらの細胞又は組織試料
に関連する疾患における本発明の化合物（及びそのアゴニスト又はアンタゴニス
ト）の治療的効果の位置を示している。 ＤＮＡ３５６３８（ＰＲＯ２４５）は、炎症ヒト組織（乾癬、炎症性腸疾患（
ＩＢＤ）、炎症腎臓、炎症肺、肝炎（肝臓ブロック）、正常扁桃腺、成人及びチ
ンパンジー（多ブロック）での発現が見られた。発現は、慢性炎症に罹患した肺
の大血管の内皮／内膜、乾癬皮膚の表皮血管表面、慢性硬化性腎炎の試料、及び
扁桃腺の毛包周囲洞を含む毛細管に存在した。これらの結果は、ＰＲＯ２４５が
免疫刺激性（ＭＬＲ及び同時刺激でＴリンパ球増殖を促進する）であり、プロ炎
症特性（好中球のインビボへの浸潤を誘発）を持つことを示している。
【００９９】 実施例７ ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、Ｐ
ＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６のハイブリッド形成プローブとしての使用 以下の方法は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、
ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６をコードするヌクレオチド配列の
ハイブリッド形成プローブとしての使用を記述する。 全長又は成熟ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、Ｐ
ＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６（Ｆｉｇ４、６、８、１０、１２、
１４及び１６に示す）のコード化配列を含むＤＮＡを、同種ＤＮＡ（ＰＲＯ２４
５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１
又はＰＲＯ３２６の天然発生変異体など）をヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒ
ト組織ゲノムライブラリでのスクリーニングのためのプローブとして用いる。 ハイブリッド形成及びいずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターの洗浄は
、以下の高い緊縮性条件下で実施される。放射性標識ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１
７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２
６-誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xＳ
Ｓｃ、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハー
ド液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で42℃で20時間実施した。フィルター
の洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳ水溶液中で、42℃で実施した。 全長天然配列ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、Ｐ
ＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６をコードするＤＮＡと所望の同一性
を持つＤＮＡは、次いでこの分野で知られた標準的技術を用いて同定できる。
【０１００】 実施例８ 大腸菌におけるＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、Ｐ
ＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の発現 この実施例は、大腸菌での組換え発現による非グリコシル化形態のＰＲＯ２４
５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１
又はＰＲＯ３２６の調製を例示する。 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、
ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６をコードするＤＮＡ配列を、選択したＰＣＲプラ
イマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限
酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクター
が用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたも
の；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイ
クリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され脱リン酸
される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いでベクターに結合させる。ベクターは、好
ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初
の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含
む）、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３
５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６コード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒ
ｇＵ遺伝子を含む。 ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用い
た選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレー
トで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。
プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認される。 選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜
成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。
次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。 更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた
細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化Ｐ
ＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲ
Ｏ３３１又はＰＲＯ３２６タンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク
質を緊密に結合させる条件下で精製した。
【０１０１】 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１及びＰＲＯ２６６は、以下の手法
を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態で発現させた。ＰＲＯ２４５、Ｐ
ＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１及びＰＲＯ２６６をコードするＤＮＡを選択したＰＣ
Ｒプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクター
の制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、
金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解
的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓ
タグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon gal
E rpoHts(htpRts) cllpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。
形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ中、30℃で振盪
しながら3-5のＯ.Ｄ.６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培
地（3.57gの（ＮＨ４）２ＳＯ４、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのＫ
Ｃｌ、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのShefield hycase SF、並び
に110mMのＭＰＯＳ、pH7.3、0.55%（w/v）のグルコース及び7mMのＭｇＳＯ４の
混合で調製）中に50-100倍希釈し、30℃で振盪させながら約20-30時間成長させ
た。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥにより発現を確認し、バルク培地を遠心
分離して細胞のペレットとした。細胞細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで
凍結させた。 0.5から1Lの発酵（6-10gペレット）からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン
、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量（w/v）で再懸濁させた。固体硫酸ナ
トリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02
Mとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、亜硫酸によりブロックさ
れたシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultr
acentrifuge中で40,000rpmで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッ
ファー（6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4）の3-5容量で希釈し、0.22ミク
ロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカ
ラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに負荷し
た。カラムを50mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッ
ファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッフ
ァーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した
。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて28
0nmにおけるその吸収により見積もった。
【０１０２】 試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのＮａＣｌ、2.5Mの尿素、5mMのシステイ
ン、20mMのグリシン及び1mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再折りたたみバ
ッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせた。リフ
ォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlと
なるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で12-36時間ゆっくり撹拌
した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度0.4%（約３のｐＨ）で添加す
ることにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロ
ンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10%で添加した。再
折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%ＴＦＡの移動バ
ッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにか
けた。A280吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析
し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的
に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコン
パクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので
、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセト
ニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形
態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。 所望の折りたたまれたＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１及びＰＲＯ
２６６タンパク質各々を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流
を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで
平衡化したG25 Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、
0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのＨＥＰＥＳ、pH6.8に
調製した。
【０１０３】 実施例９ 哺乳動物細胞におけるＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６
６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の発現 この実施例は、哺乳動物細胞での組換え発現によるグリコシル化形態のＰＲＯ
２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３
３１又はＰＲＯ３２６の調製を例示する。 発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照
）を用いた。場合によっては、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、Ｐ
ＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ＤＮＡを選択した制
限酵素でｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたような結合方法を
用いてＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３
５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、
ｐＲＫ５-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ
３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６と呼ばれる。 一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト
２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分又
は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長さ
せて集密化した。約10μgのｐＲＫ５-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０
１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ＤＮＡを約1
μgのＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (
1982))］と混合し、500μLの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mMのＥＤＴＡ、0.227MのＣ
ａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μLの50mMのＨＥＰＥＳ（pH
7.35）、280mMのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ４を添加し、25℃で10分間析出物を
形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。
培養培地を吸引し、2mlのＰＢＳ中20%グリセロールを30秒間添加した。２９３細
胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキ
ュベートした。 形質移入の約24時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は200μCi/ml
の３５Ｓ-システイン及び200μCi/mlの３５Ｓ-メチオニンを含む培養培地で置換
した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルター
で濃縮し、15%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯ２４５
、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又
はＰＲＯ３２６ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムに
暴露した。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（
無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０１０４】 これに換わる技術において、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、Ｐ
ＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６は、Somparyac等, P
roc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用
いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最
大密度まで成長させ、700μgのｐＲＫ５-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ
３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ＤＮＡを
添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳ
で洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベ
ートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組
織培養培地、5μｇ/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを
含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾
過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１
７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２
６を含む試料を濃縮し、透析又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法に
よって精製した。 他の実施態様では、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６
６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６をＣＨＯ細胞で発現させるこ
とができる。ｐＲＫ５-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２
６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡ
Ｅ-デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することがで
きる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）
又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。Ｐ
ＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲ
Ｏ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清
培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで
条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ
３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６を含む培
地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
【０１０５】 また、エピトープタグＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２
６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６は、宿主ＣＨＯ細胞におい
て発現させてもよい。ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６
６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６はｐＲＫ５ベクターからサブ
クローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウ
イルス発現ベクター中のポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ
枠に融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１
、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６挿入物は、次い
で、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘
導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベク
ターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標
識化を行ってもよい。発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７
、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６
を含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグ
ラフィー等の選択された方法により精製できる。 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７及びＰＲＯ３０１は、一過性及び安定発現法の両
方でＣＨＯ細胞において発現された。 ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質
は、それは対応するタンパク質の可溶化形態及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態の
コード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ
２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）と
して発現された。 ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of
Molecular Biology, Unit 3.26, John Wiley and Sons (1997)に記載されたよう
な標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現
ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤ
ＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nuc
l. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発
現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ
）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ
発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。 所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfec
t(Quiagen), Dosper及びFugene（Boehringer Mannheim）約一千万のＣＨＯ細胞
に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約3ｘ
10−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させ
た。
【０１０６】 プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより
混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで５分間
遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地（0.2μm濾過ＰＳ２０、5%
の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選
択培地を含む100mlスピナーに分けた1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たし
た250mLスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに2-3日後、250mL
、500mL及び2000mLのスピナーを3ｘ10５細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分
離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地
を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行の米国特許第5,122,469号に記
載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2ｘ10６細胞/mLで播種した
。0日目に、細胞数とｐＨを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空
気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、5
00g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤（例えば35%ポリジメチルシロキサンエ
マルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の30mLとした。生産を
通して、ｐＨは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るま
で、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過
物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷した。 ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はNi-NTAカラム(Qiagen)を用い
て精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。
条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7
.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムに4-5ml/分の流速で４℃において
ポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質
を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタン
パク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトールを
含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、-8
0℃で貯蔵した。 イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製し
た。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlの
プロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファ
ーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質
は、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することによ
り即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグ
タンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリ
アクリルアミドゲルで試験し、エドマン(Edman)分解によりＮ-末端アミノ酸配列
決定した。 ＰＲＯ３２６もＣＯＳ細胞における一過性発現により産生された。
【０１０７】 実施例１０ 酵母菌でのＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ
３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の発現 以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、Ｐ
ＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の組換え発現を記載
する。 第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１
７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２
６の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯ２４５
、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又
はＰＲＯ３２６をコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適
当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲ
Ｏ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の細胞内発現を指示す
る。分泌のために、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６
、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６をコードするＤＮＡを選択した
プラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ
２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ
３２６シグナルポリペプチド又は他の哺乳類シグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａ、又は、例えば酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要
ならば）ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３
３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の発現のためのリンカー配列とともにクロ
ーニングすることができる。 酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し
、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリク
ロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブ
ルー染色でゲルの染色をすることができる。 続いて組換えＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、Ｐ
ＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６は、発酵培地から遠心分離により酵
母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃
縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ
３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６を含む濃
縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよ
い。
【０１０８】 実施例１１ バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１
、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の発現 以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯ２４５、ＰＲ
Ｏ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲ
Ｏ３２６の組換え発現を記載する。 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、
ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６をコードする配列は、バキュロウイルス発現ベク
ターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグ
は、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む
。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導される
プラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ２
４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３
１又はＰＲＯ３２６コード化配列又はＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０
１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６コード化配列
の所定部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）が、５
'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマ
ーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、
次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされ
る。 組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold（商品名）ウイ
ルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATC
C CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入
することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出され
たウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は
、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxfo
rd: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。 次いで、発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３
０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６は、例えば
、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精製
される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているよ
うに、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細
胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mlのＨｅｐｅｓ、pH7.9；12.5mMのＭ
ｇＣｌ２；0.1mMのＥＤＴＡ；10%のグリセロール；0.1%のＮＰ-４０；0.4MのＫ
Ｃｌ）中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分
離で透明化し、上清を負荷バッファー（50mMリン酸塩、300mMＮａＣｌ、10%のグ
リセロール、pH7.8）で50倍希釈し、0.45μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋-
ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mlの総容積で調製し、25mlの水
で洗浄し、25mlの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.
5mlでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベー
スラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非
特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMのリン酸塩；300mMのＮａＣｌ、10%
のグリセロール、pH6.0）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した
後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMのイミダゾール勾配で展開した
。1mlの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ
（Qiagen）に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶
離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２
６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６を含む分画をプールし、負
荷バッファーで透析した。 あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ
３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６の精製は
、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知
のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１０９】 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ３０１及びＰＲＯ２６６は、バキュロウイルス感染した
Ｓｆ９昆虫細胞で発現された。発現は実際には0.5-2Lのスケールであったが、容
易により大きな（例えば8L）調製にスケールアップできる。タンパク質はＩｇＧ
作成物（イムノアドヘシン）として発現され、そこではタンパク質細胞外領域が
ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態を含むＩｇ
Ｇ１定常領域配列に融合している。 ＰＣＲ増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター
（ＩｇＧ融合物に対するpb.PH.IgG及びポリＨｉｓタグタンパク質に対するpb.PH
.His.c）にサブクローニングし、そのベクター及びBaculogold(登録商標)バキュ
ロウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を１０５スポドプテラグルヒペルダ（Spodopte
ra frugiperda）（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）にリポフェクチン（Gibc
o BRL）を用いて同時形質移入した。pb.PH.IgG及びPH.His.cは、市販のバキュロ
ウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmingen）の修飾物であり、Ｈｉｓ又
はＦｃタグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、10%
のＦＢＳ（Hyclone）を添加したHinkのＴＮＭ-ＦＭ培地で成長させた。細胞は、
28℃で5日間インキュベートした。上清を回収し、続いて10%ＦＢＳを添加したHi
nkのＴＮＭ-ＦＨ培地におけるＳｆ９細胞感染による約10の感染効率（ＭＯＩ）
での最初のウイルス増幅に用いた。細胞を２８℃で３日間インキュベートした。
上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、1mlの
上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ-ＮＴＡビーズ（QIAGEN）又は
ＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースCL-4Bビーズ（Pharmacia）
へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準
と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定した。 第１の増幅ウイルス上清をＥＳＦ-９２１培地（Expression System LLC）で成
長させたＳｆ９細胞のスピナー培地（500ml）の約0.1のＭＯＩでの感染に使用し
た。細胞は28℃で3日間インキュベートした。上清を回収して濾過した。バッチ
結合及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、スピナー培地の発現が確認されるまで、必要
に応じて繰り返した。
【０１１０】 形質移入細胞からの条件培地（0.5〜3L）を、遠心分離により細胞を除去し0.2
2ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ-Ｈｉｓタグ作
成物については、配列を含むタンパク質をＮｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）を用い
て精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条
件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7.4
バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムに4-5ml/分の流速で4℃においてポン
プ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.
25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク
質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトールを含む
貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し
、-80℃で貯蔵した。 タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培
地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平
衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを
平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離し
たタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収
することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ
-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。タンパ
ク質の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動及びエドマン
(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定により評価できる。 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、
ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６は、バキュロウイルス感染ｈｉｇｈ５細胞におい
ても同様の手法を用いて発現された。
【０１１１】 実施例１２ ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、Ｐ
ＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６に結合する抗体の調製 この実施例は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、
ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６に特異的に結合できるモノクロー
ナル抗体の調製を例示する。 モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば
、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ２４５、
ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又は
ＰＲＯ３２６、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、Ｐ
ＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６を含む融合タンパク質、細胞表面に
組換えＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３
５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当
業者が過度の実験をすることなくなすことができる。 Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は
腹腔内に1-100マイクログラムで注入したＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ
３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６免疫原で
免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochem
ical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫
化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付
加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追
加免疫する。抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、
ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体の検出のためのＥＬＩＳＡア
ッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周
期的に採取してもよい。
【０１１２】 適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ」な動物に、ＰＲＯ２４
５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１
又はＰＲＯ３２６静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、
マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（35%ポリエチレングリ
コールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３Ａ
ｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させた。融合によりハイブリ
ドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及
びチミジン）培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫
ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。 ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ
２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６に対する反応性について
のＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３
０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６に対する所
望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ」ハイブリドーマ細胞の決定は
、技術常識の範囲内である。 ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、
抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５
、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。
あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長
させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸ア
ンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことがで
きる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフ
ィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１１３】 材料の寄託 次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １０８０１
ユニバーシティ ブルバード マナッサス、バージニア、２０１１０−２２０９
米国(ＡＴＣＣ)に寄託した： 材料 ATCC寄託番号 寄託日 DNA40981 209439 1997年11月 7日 DNA37140 209489 1997年11月21日 DNA41388 209927 1997年 6月 2日 DNA35638 209265 1997年 9月17日 DNA37150 209401 1997年10月17日 DNA33094 209256 1997年 9月16日 DNA32292 209258 1997年 9月16日 DNA32279 209259 1997年 9月16日 DNA40628 209432 1997年11月 7日
【０１１４】 この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付
から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の
合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうと
も、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄
託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法
第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３
７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定し
た者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。 本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に
死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座
に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる
政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスである
とみなされるものではない。 上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本
発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものでは
ないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈される
ものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変す
ることは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の
範囲内に入るものである。
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１Ａ-Ｄ】 ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いた％ア
ミノ酸配列同一性（Ｆｉｇ１Ａ-Ｂ）及び％核酸配列同一性（Ｆｉｇ１Ｃ-Ｄ）を
決定するために下記の方法を使用した仮説的例示を示す図であり、「ＰＲＯ」は
対象とする仮説的ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質
」は対象とする「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配
列を示し、「ＰＲＯ-ＤＮＡ」は対象とする仮説的ＰＲＯポリペプチドコード化
核酸配列を示し、「比較ＤＮＡ」は対象とする「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子が比
較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は各々
異なる仮説的アミノ酸残基を示し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は各々異なる仮説
的ヌクレオチドを示す。
【Ｆｉｇ２Ａ-Ｐ】 ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムの完全なソー
スコードを与える図である。このソースコードはUNIXオペレーティングシステム
で使用するために日常的にコンパイルでき、ALIGN-2配列比較コンピュータプロ
グラムを与える。
【Ｆｉｇ３】 天然配列ＰＲＯ２４５（ＵＮＱ２１９）をコードするヌクレ
オチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図であり、当該ヌクレオチ
ド配列（配列番号：１）はここで「ＤＮＡ３５６３８」と命名されるクローンで
ある。また、太字及び下線フォントで示したのは、各々開始及び停止コドンであ
る。
【Ｆｉｇ４】 Ｆｉｇ３のコード化配列から誘導された天然配列ＰＲＯ２４
５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。また、種々の
他の重要なドメインの位置も知られている場合には表示した。
【Ｆｉｇ５】 天然配列ＰＲＯ２１７（ＵＮＱ１９１）をコードするヌクレ
オチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図であり、当該ヌクレオチ
ド配列（配列番号：３）はここで「ＤＮＡ３３０９４」と命名されるクローンで
ある。また、太字及び下線フォントで示したのは、各々開始及び停止コドンであ
る。
【Ｆｉｇ６】 Ｆｉｇ５のコード化配列から誘導された天然配列ＰＲＯ２１
７ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４）を示す図である。また、種々の
他の重要なドメインの位置も知られている場合には表示した。
【Ｆｉｇ７】 天然配列ＰＲＯ３０１（ＵＮＱ２６４）をコードするヌクレ
オチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図であり、当該ヌクレオチ
ド配列（配列番号：５）はここで「ＤＮＡ４０６２８」と命名されるクローンで
ある。また、太字及び下線フォントで示したのは、各々開始及び停止コドンであ
る。
【Ｆｉｇ８】 Ｆｉｇ７のコード化配列から誘導された天然配列ＰＲＯ３０
１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６）を示す図である。また、種々の
他の重要なドメインの位置も知られている場合には表示した。
【Ｆｉｇ９】 天然配列ＰＲＯ２６６（ＵＮＱ２３３）をコードするヌクレ
オチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図であり、当該ヌクレオチ
ド配列（配列番号：７）はここで「ＤＮＡ３７１５０」と命名されるクローンで
ある。また、太字及び下線フォントで示したのは、各々開始及び停止コドンであ
る。
【Ｆｉｇ１０】 Ｆｉｇ９のコード化配列から誘導された天然配列ＰＲＯ２
６６ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：８）を示す図である。また、種々
の他の重要なドメインの位置も知られている場合には表示した。
【Ｆｉｇ１１】 天然配列ＰＲＯ３３５（ＵＮＱ２８７Ｖ）をコードするヌ
クレオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図であり、当該ヌクレ
オチド配列（配列番号：９）はここで「ＤＮＡ４１３８８」と命名されるクロー
ンである。また、太字及び下線フォントで示したのは、各々開始及び停止コドン
である。
【Ｆｉｇ１２】 Ｆｉｇ１１のコード化配列から誘導された天然配列ＰＲＯ
３３５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す図である。また、
種々の他の重要なドメインの位置も知られている場合には表示した。
【Ｆｉｇ１３】 天然配列ＰＲＯ３３１（ＵＮＱ２９２）をコードするヌク
レオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図であり、当該ヌクレオ
チド配列（配列番号：１１）はここで「ＤＮＡ４０９８１」と命名されるクロー
ンである。また、太字及び下線フォントで示したのは、各々開始及び停止コドン
である。
【Ｆｉｇ１４】 Ｆｉｇ１３のコード化配列から誘導された天然配列ＰＲＯ
３３１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す図である。また、
種々の他の重要なドメインの位置も知られている場合には表示した。
【Ｆｉｇ１５】 天然配列ＰＲＯ３２６（ＵＮＱ２８７）をコードするヌク
レオチド配列を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図であり、当該ヌクレオ
チド配列（配列番号：１３）はここで「ＤＮＡ３７１４０」と命名されるクロー
ンである。また、太字及び下線フォントで示したのは、各々開始及び停止コドン
である。
【Ｆｉｇ１６】 Ｆｉｇ１５のコード化配列から誘導された天然配列ＰＲＯ
３２６ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す図である。また、
種々の他の重要なドメインの位置も知られている場合には表示した。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/16 ４Ｈ０４５ 1/16 5/14 5/14 5/18 5/18 7/04 7/04 7/06 7/06 9/00 9/00 11/00 11/00 11/06 11/06 13/12 13/12 17/04 17/04 17/06 17/06 19/02 19/02 21/02 21/02 21/04 21/04 25/02 25/02 25/14 25/14 27/14 27/14 29/00 １０１ 29/00 １０１ 37/06 37/06 37/08 37/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/577 Ｂ 33/53 33/68 33/577 Ｃ０７Ｋ 16/18 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゴッダード，オードリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131， サン フランシスコ，コンゴ ストリート 110 (72)発明者 ガーニー，オースティン，エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002， ベルモント，デビー レーン １ (72)発明者 タマス，ダニエル ビー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94563， オリンダ，レイ アベニュー ３ (72)発明者 ウッド，ウィリアム，アイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， ヒルスボロー，サウスダウン コート 35 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BB20 BB22 CB01 CB02 CB17 CB21 CB26 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB04 FB05 FB06 FB08 JA20 4B024 AA01 AA11 CA04 CA09 CA11 DA02 DA06 DA12 EA02 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ43 QR32 QR35 QR56 QR62 QR72 QS03 QS25 QS34 QS36 QX02 QX07 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA27 BA01 BA08 BA17 BA18 BA19 BA20 BA21 BA22 BA35 BA41 BA42 CA04 CA05 CA18 CA19 CA23 CA36 CA49 CA53 CA56 DA08 DA09 DA10 DA25 DA29 DA32 DA39 DC50 MA01 MA17 MA24 MA66 NA14 ZA201 ZA221 ZA331 ZA341 ZA361 ZA531 ZA551 ZA681 ZA751 ZA911 ZA941 ZA961 ZB022 ZB072 ZB082 ZB092 ZB112 ZB132 ZB152 ZB261 ZC54 4C085 AA08 AA14 AA15 AA16 AA17 AA19 AA26 AA27 AA33 AA34 AA37 AA38 BA42 BA43 BB11 BB17 BB23 BB31 CC05 CC13 CC22 CC23 CC29 DD22 DD23 DD24 DD33 DD35 DD37 DD62 DD63 DD86 DD88 EE01 EE06 FF03 FF17 FF20 GG01 HH15 JJ02 JJ03 JJ05 KA01 KA04 KA05 KA16 4H045 AA30 CA40 DA76 EA22 EA50 FA74

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６
    、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド、アゴニスト又は
    それらの断片及び担体又は賦形剤を含んでなり、抗原に応答して （ａ）それを必要とする哺乳動物の組織への炎症性細胞の浸潤を増大させ、 （ｂ）それを必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は促進し、又は （ｃ）それを必要とする哺乳動物におけるＴリンパ球の増殖を増大させるのに
    有用な組成物。
  2. 【請求項２】 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６
    、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド、アゴニスト又は
    それらの断片の、抗原に応答して （ａ）それを必要とする哺乳動物の組織への炎症性細胞の浸潤を増大させ、 （ｂ）それを必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は促進し、又は （ｃ）それを必要とする哺乳動物におけるＴリンパ球の増殖を増大させるのに
    有用な組成物を調製するための使用。
  3. 【請求項３】 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６
    、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド、アンタゴニスト
    又はそれらの断片及び担体又は賦形剤を含んでなり、抗原に応答して （ａ）それを必要とする哺乳動物の組織への炎症性細胞の浸潤を減少させ、 （ｂ）それを必要とする哺乳動物における免疫反応を阻害又は低下させ、又は （ｃ）それを必要とする哺乳動物におけるＴリンパ球の増殖を減少させるのに
    有用な組成物。
  4. 【請求項４】 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６
    、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド、アンタゴニスト
    又はそれらの断片の、抗原に応答して （ａ）それを必要とする哺乳動物の組織への炎症性細胞の浸潤を減少させ、 （ｂ）それを必要とする哺乳動物における免疫反応を阻害又は低下させ、又は （ｃ）それを必要とする哺乳動物におけるＴリンパ球の増殖を減少させるのに
    有用な組成物を調製するための使用。
  5. 【請求項５】 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６
    、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド、その抗体、それ
    に対するアンタゴニスト、又はそれらの断片の有効量を哺乳動物に投与すること
    を含んでなる、Ｔ細胞媒介疾患等の免疫関連疾患を、それを必要とする哺乳動物
    において治療する方法。
  6. 【請求項６】 疾患が、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、若年
    性慢性関節炎、脊髄関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性ミオパシー
    （皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性脈管炎、サルコイドー
    シス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、
    甲状腺炎（グレーヴズ病、橋本甲状腺炎若年性リンパ球甲状腺炎、萎縮性甲状腺
    炎）、真性糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、多発性
    硬化症、特発性脱髄性多発性ニューロパシー又はギヤン‐バレー症候群及び慢性
    炎症性多発性ニューロパシー等の脱髄性疾患、感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ
    及び他の非肝向性ウイルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、
    肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎等の肝臓胆管疾患、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸
    炎：クローン病）、グルテン感受性腸炎、及びホウィップル病等の炎症性及び線
    維症性肺疾患、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎を含む自己免疫性又
    は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物
    過敏症及びじんま疹等のアレルギー性疾患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び
    過敏性肺炎等の肺の免疫性疾患、移植拒絶及び対宿主性移植片病を含む移植関連
    疾患から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１又は３に記載の
    組成物又は請求項２又は４に記載の使用。
  8. 【請求項８】 抗体が抗体断片又は一本鎖抗体である、請求項１又は３に記
    載の組成物又は請求項２又は４に記載の使用。
  9. 【請求項９】 抗体が、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及びヒトフレ
    ームワーク領域（ＦＲ）残基を持つ、請求項１又は３に記載の組成物又は請求項
    ２又は４に記載の使用。
  10. 【請求項１０】 ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６
    ６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドを含有すると推
    測される細胞を、抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６
    ６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体に暴露し、抗体の細胞へ
    の結合を測定することを含んでなる、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０
    １、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド
    の存在を測定する方法。
  11. 【請求項１１】 哺乳動物における免疫関連疾患を診断する方法において、
    （ａ）当該哺乳動物から得た組織細胞の試験試料中、及び（ｂ）同じ細胞型の知
    られた正常細胞の対照試料中におけるＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０
    １、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチド
    をコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含んでなり、試験試料中での
    高い発現レベルが、当該試験組織細胞を得た哺乳動物における免疫関連疾患の存
    在を示す方法。
  12. 【請求項１２】 哺乳動物における免疫関連疾患を診断する方法において、
    （ａ）抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ
    ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体を当該哺乳動物から得た組織細胞の
    試料と接触させ、そして（ｂ）試験試料中での抗体とポリペプチドとの間の複合
    体形成を検出することを含んでなる方法。
  13. 【請求項１３】 抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ
    ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体又はその断片及び担
    体を適当な包装中に具備してなる免疫関連疾患の診断キット。
  14. 【請求項１４】 抗体をＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲ
    Ｏ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドの検出に
    使用するための説明書をさらに具備する、請求項１３に記載のキット。
  15. 【請求項１５】 容器； 当該容器上のラベル；及び 当該容器内に収容された活性剤を含有する組成物とを具備し、当該組成物が哺乳
    動物における免疫反応を刺激又は促進するのに有効であり、容器上のラベルが当
    該組成物は免疫関連疾患の治療に使用できることを表示し、組成物中の活性剤が
    ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、Ｐ
    ＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する薬剤
    である製造品。
  16. 【請求項１６】 前記薬剤が抗-ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０
    １、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６抗体である請
    求項２１に記載の 製造品。
  17. 【請求項１７】 候補化合物をＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ３０１
    、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプチドと
    、これら２成分を相互作用させる条件下及び十分な時間で接触させることを含ん
    でなるＰＲＯ２４５ポリペプチドの発現又は活性を阻害することのできる化合物
    の同定方法。
  18. 【請求項１８】 候補化合物あるいはＰＲＯ２４５、ＰＲＯ２１７、ＰＲＯ
    ３０１、ＰＲＯ２６６、ＰＲＯ３３５、ＰＲＯ３３１又はＰＲＯ３２６ポリペプ
    チドが固体支持体上に固定化される請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 非固定化成分が検出可能な標識を担持する請求項１８に記
    載の方法。
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