UA75862C2 - Виділений поліпептид, що зв'язується з il-18 (il-18bp) (варіанти), виділена молекула нуклеїнової кислоти, що його кодує (варіанти), антитіло, що зв'язується з даним поліпептидом, спосіб очищення il-18bp та композиція, що його містить - Google Patents

Виділений поліпептид, що зв'язується з il-18 (il-18bp) (варіанти), виділена молекула нуклеїнової кислоти, що його кодує (варіанти), антитіло, що зв'язується з даним поліпептидом, спосіб очищення il-18bp та композиція, що його містить Download PDF

Info

Publication number
UA75862C2
UA75862C2 UA2000031437A UA200031437A UA75862C2 UA 75862 C2 UA75862 C2 UA 75862C2 UA 2000031437 A UA2000031437 A UA 2000031437A UA 200031437 A UA200031437 A UA 200031437A UA 75862 C2 UA75862 C2 UA 75862C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
protein
antibody
zeo
Prior art date
Application number
UA2000031437A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Даніела Новік
Чарльз Дінарелло
Менахем Рубінштейн
Соо Хіун Кім
Original Assignee
Йєда Рісерч Енд Дівелопмент Ко. Лтд
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IL12155497A external-priority patent/IL121554A0/xx
Priority claimed from IL12163997A external-priority patent/IL121639A0/xx
Application filed by Йєда Рісерч Енд Дівелопмент Ко. Лтд filed Critical Йєда Рісерч Енд Дівелопмент Ко. Лтд
Publication of UA75862C2 publication Critical patent/UA75862C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/834—Urine; urinary system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

Винахід належить до поліпептидів, що зв’язуються з IL-18 (IL-18BP), ДНК, що їх кодує, способу очищення даних білків, антитіл, що з ними зв’язуються. Винахід належить також до композиції, що містить зазначені поліпептиди, та композиції, що містить антитіло, яке зв’язується з IL-18BP. Дані композиції придатні для лікування захворювань або станів, при яких необхідне модулювання або блокування активності IL-18.  

Description

Опис винаходу
Даний винахід стосується інтерлейкін-18-зв'язувального білка (І/-18), надалі ІІ/-18ВР, що здатний 2 зв'язувати ІЇ/-18. Зокрема, цей винахід стосується розчинного ІЇ/-188Р, одержуваного з біологічних рідин, розчинних І -ВР, які одержують в результаті експресії відповідних ДНК-векторів в клітинах-хазяїнах, кодованих вірусом гомологів ІЇ/-188Р, що їх одержують шляхом експресії відповідних ДНК-векторів в клітинах-хазяїнах, векторів, які експресують різні І -ВР, векторів, що є застосовними для експресії І-18ВР у людей та інших ссавців, антитіл проти ІІЇ-18ВР, терапевтичного застосування зазначених ІЇ-188Р шляхом модулювання і/або 70 блокування активності ІІ -18, терапевтичного застосування зазначених експресуючих векторів для модулювання і/або блокування активності ІІ -18 та застосування антитіл.
В 1989 році було описано індуковану ендотоксином сироваткову активну речовину, що стимулює вироблення інтерферону-гамма (ІЄМ-), виділену з клітин селезінки миші (27). Ця сироваткова активна речовина діє не як безпосередній індуктор ІЕМ-, а скоріше як ко-стимулятор разом з ІІ-2 або мітогенами. Спроба виділити активну 79 речовину з сироватки мишей, попередньо оброблених ендотоксином, дозволила виявити, по-видимому, гомогенний білок масою 50-55кДа (26). Оскільки інші цитокіни здатні діяти як ко-стимулятори продукції ІЄМ-, неможливість нейтралізації сироваткової активної речовини нейтралізуючими антитілами проти 1-1, 1-4, 1-5,
І/-6 або ТМЕ дозволяє припустити, що вона є відмінним фактором. У 1995р. ті ж самі дослідники показали, що індукований ендотоксином ко-стимулятор продукції ІЕМ- наявний в екстрактах печінки мишей, попередньо оброблених Р. аспез (31). В цій моделі, популяція макрофагів печінки (клітини Купфера) збільшується, і для цих мишей стає летальною низька доза бактеріального ліпополісахариду (ІР5), яка не є летальною для необроблених мишей. Фактор, названий ІЄМ--індукуючим фактором (ІСІР), пізніше позначений як інтерлейкін-18 (П/-18), виділили в гомогенному стані з 1200 грам печінки мишей, оброблених Р. аспез. Вироджені олігонуклеотиди, одержані з амінокислотних послідовностей очищеного ІІ-18, застосовували для клонування с
КДНК 1-18 миші (31). /-18 являє собою білок масою 18-19кДа з 157 амінокислот, що не має жодної явної Ге) гомології з будь-яким пептидом з баз даних. Месенджерні РНК 1-18 та інтерлейкіну-12 (1-12) легко виявити в клітинах Купфера і активованих макрофагах. Рекомбінантний ІІ -18 стимулює вироблення ІЄМ- більш потужно, ніж 1-12, по-видимому, за допомогою окремого механізму (31). Подібно індукованій ендотоксином сироватковій активній речовині сироватки, ІЇ/-18 сам по собі не індукує ІЄМ-, а діє, головним чином, як ко-стимулятор з с мітогенами або 1/-2. /-18 посилює проліферацію Т-клітин, по-видимому, за допомогою 1./-2-залежного «о механізму, і збільшує іп міго продукцію цитокінів-ТИ-1 та у випадку сумісної дії з ІЇ/-12 виявляє синергізм, збільшуючи продукцію ІЕМ- (24). со
Було показано, що нейтралізуючі антитіла проти 1-18 миші відвертають летальну дію низьких доз ІР5 на дю мишей, попередньо оброблених Р. аспез. Інші дослідники повідомляли про значення ІБМ- як медіатора летальної дії І Р5 у попередньо оброблених мишей. Наприклад, нейтралізуючі анти-ІЕМ- - антитіла запобігали в розвитку у мишей генералізованої реакції Шварцмана (16), а оброблені галактозаміном миші з дефіцитом
ІЕМ--рецептора, виявляються резистентними до загибелі, викликаної І РБЗ (7). Отже, не є несподіваним, що нейтралізуючі антитіла проти 1-18 миші захищають мишей, попередньо оброблених Р. аспез, від летальної дії «
ІРБ (31). До того ж обробка антитіла проти мишачого ІІ -18 відвертає тяжку печінкову цитотоксичність у мишей, З 70 які вижили. с Після того, як клонували мишачу форму, в 1996 році описали послідовність КДНК 1-18 людини (38).
Із» Рекомбінантний ІІ -18 людини виявляє активність нативного ІІ -18 (38). Рекомбінантний ІІ -18 людини не виявляє безпосередньої індукуючої ІЕМ- активності в Т-клітинах людини, а діє як ко-стимулятор продукції ІЄМ- і інших цитокінів Т-хелперів-1ї (ТИ-1) (38). Нині, І/-18 розглядають головним чином як ко-стимулятор продукції цитокінів Тй-1 (ІЕМ-, І/-2 їі колонієстимулюючого фактора гранулоцитів-макрофагів) (20), а також як і ко-стимулятор для РАз-ліганд-опосередкованої цитотоксичності клонів натуральних-кілерів миші (37). 4! В результаті клонування ІЇ/-18 з пошкоджених тканин і вивчення експресії гена ІЇ-18, виявлено тісний зв'язок цього цитокіну з аутоїмунним захворюванням. У неогрядних діабетичних (МОЮ) мишей спонтанно бо розвивається аутоїмунний інсуліт і цукровий діабет, які посилюють і синхронізують однократною ін'єкцією
Ге»! 20 циклофосфаміду. За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (РСК) із зворотною транскриптазою виявляють
МРНК 1-18 в підшлунковій залозі мишей-МОЮ на ранніх стадіях інсуліту. Після обробки циклофосфамідом із швидко збільшується вміст мРНК 1І-18 і це передує зростанню мРНК ІРМ-Г і далі розвитку цукрового діабету.
Цікаво, що ці кінетичні параметри подібні до кінетики мРНК 1/-12-р40, що веде в результаті до тісної кореляції з вмістом окремих мРНК. Клонування кДНК 1//-18 з РНК підшлункової залози з подальшим 52 секвенуванням дозволило виявити ідентичність з послідовністю ІІ -18, клонованою з купферових клітин і іп мімо
ГФ) з попередньо активованих макрофагів. Макрофаги мишей-МОО відповідають на циклофосфамід експресією гена
І/-18, тоді як макрофаги паралельно оброблених мишей Ваїр/с не реагують. Тому, експресія ІІ-18 регулюється о аномально у аутоїмунних мишей-МО0О та тісно асоційована з розвитком цукрового діабету (32).
І/-18 відіграє істотну роль в імунорегуляції або запаленні шляхом збільшення функціональної активності 60 Еаз-ліганду на Тр-1 клітинах (10). 1-18 також експресується в корі надниркової залози і тому є секретованим нейроімуномодулятором, що відіграє важливу роль в настройці імунної системи після впливу стресу (9).
Іп мімо, І/-18 утворюється в результаті розщеплення рго-ІІ-18 і, як виявилося, його ендогенна активність пояснює продукцію ІЄМ- в випадках летальності, опосередкованої Р. аспез та І Р5. Внаслідок його активності, блокування біологічної активності ІЇ-18 при захворюванні людини є терапевтичною стратегією при численних бо хворобах. Цього досягають використанням розчинних рецепторів або блокуючих антитіл до зв'язаного з клітиною рецептора ІІ -18.
Білки, що зв'язують цитокіни, (розчинні рецептори цитокінів) відповідають позаклітинним лиганд-зв'язувальним доменам відповідних їм рецепторів клітинної поверхні цитокінів. Їх одержують або шляхом альтернативного сплайсинга перед-мРНК, притаманної рецептору клітинної поверхні, або шляхом протеолітичного розщеплення рецептора клітинної поверхні. Такі розчинні рецептори були описані раніше, включаючи зокрема розчинні рецептори 1-6 і ІЄМ- (30), ТМЕ (11, 12), 1-1 та 1-4 (21), ІЕМ-/«к (28,29) та інші.
Один цитокінзв'язувальний білок, названий остеопротегерин (ОРОС, також відомий як фактор, що інгібує остеокласти - ОСІГ)УУчлен ТМЕК/Раз сімейства, є першим прикладом розчинного рецептора, який існує лише як 7/0 секретований білок (1, 34, 39).
Даний винахід стосується ІІ-18-зв'язувальних білків, (І -188Р) та кодованих вірусами гомологів ІІ-188Р (надалі, вірусні І/-18ВР), та рекомбінантних білків, мутеїнів, функціональних похідних, активних фрагментів і їх перетворених через циклізування похідних, здатних зв'язувати ІЇ/-18. Винахід також стосується способу виділення ІЇ/-18ВР. з рідин організму людини, і способу одержання їх за допомогою рекомбінантних методик. 7/5 Винахід також стосується векторів, що експресують 1І-188Р, підхожих для експресії ІЇ-18В8Р у людей та інших ссавців. Окремі ІЇ/-18ВР, кодовані вірусами гомологи ІІ-18ВР, гібридні білки, мутеїни, функціональні похідні, активні фрагменти та їх перетворені через циклізування похідні відповідно до цього винаходу можуть застосовуватись для модулювання і/або блокування активності ІІ -18.
Також забезпечені репліковувані експресуючі вектори, що містять послідовності ДНК, підхожі для експресії різних ІІЇ-18ВР в клітинах-хазяїнах, трансформованих ними, і білки та поліпептиди, що продукуються шляхом експресії такими хазяїнами.
Крім того, винахід стосується фармацевтичних композицій, які складаються з прийнятних носіїв і І/-18ВР, або вірусних ІІ -18ВР чи векторів, що експресують їх у людей та інших ссавців, для лікування захворювань або станів, при яких необхідне модулювання або блокування активності ІІ -18. с
Далі винахід стосується антитіл проти І/-18ВР і вірусних І./-18ВР, підхожих для їх афінної очистки та імуноаналізу. о
Фігура 1 зображує 505-РАСЕ (електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію) ІІ -18-зв'язувального білка, очищеного за афінною методикою. Неочищені білки сечі (500л сечі здорових людей, сконцентрованої ультрафільтруванням) наносять на колонку з ІІ-18-агарозою. Колонку промивали, а Га
Зо зв'язані білки елюювали при рН 2,2. Елюйовані фракції нейтралізовували і аліквоти аналізували за допомогою 5ОЗ-РАСЕ (1095 акриламід) в невідновлювальних умовах і при забарвленні сріблом. Доріжки являють собою: 1: о неочищені білки сечі (1,5мкг наносять на гель); 2-9: елюати 1-8, відповідно, з колонки з ІЇ-18-агарозою; 10: Ге) маркери молекулярних мас в кДа, подані праворуч. Стрілка вказує зону, яка відповідає ІІ -188ВР.
Фігура 2 зображує авторадіограму 5ЗО5-РАСЕ (7,596 акриламід) комплексів, які складаються з /7251-ІІ -18 о (уявна молекулярна маса 19кДа), поперечно-зв'язаного з такими препаратами розчинного ІІ -18-зв'язувального їч- білка: Доріжка 1: Промивання з ІІ -18-афінної колонки. Доріжка 2: Елюція 2 з ІІ -18-афінной колонки. Доріжка 3:
Елюція З з ІЇ/-18-афінной колонки. Праворуч вказані маркери молекулярних мас (в кДа). Стрілка вказує поперечно-зшитий продукт (58кДа). «
Фігура З зображує інгібування індукованої ІІ -18 продукції ІЕМ- за допомогою ВІ -188Р. (А) Спленоцити миші стимулюють (24 години, 372) зазначеними поєднаннями І РЗ (мкг/мл) і /-18 людини -- с (бнг/мл), доданими або безпосередньо, або після попереднього змішування (1 година, 37 2) з І/-18ВР. сечі. м Рівень тиїЕМ- (миші) в культурі визначають через 24 години. я (В) Спленоцити миші інкубують (24 години) з ГРБ5 (мкг/мл) разом з 1І/-18 миші (1Онг/мл), попередньо змішаний (1 година, 372) із зростаючими концентраціями ІІ -18ВР людини. (С) Спленоцити миші інкубують (24 години) з І РЗ (1Омкг/мл) разом з зростаючими концентраціями ІІ -188Р. - людини. с (0) Спленоцити миші інкубують (24 години) з Соп А (конканаваліном А) (мкг/мл) разом з зростаючими концентраціями ІІ -18В8Р. людини. бо (Е) КО-1 клітини людини стимулюють ТМЕ- (2Онг/мл) і пи -18 (людини) (25нг/мл), доданих або самих, або
Ге» 20 після попереднього змішування (1 година, 372С) з ІІ -18ВР сечі.
На Фігурі 4 подано послідовність КДНК ІІ -18ВРа людини і білка. Сигнальний пептид підкреслено. їз На Фігурі 5 подано послідовність КДНК ІІ -Я8ВРЬ людини і білка. Сигнальний пептид підкреслено.
На Фігурі 6 подано послідовність КДНК ІІ -А8ВРС людини і білка. Сигнальний пептид підкреслено.
На Фігурі 7 подано послідовність КДНК ІІ -І8ВРа людини і білка. Сигнальний пептид підкреслено. 29 На Фігурі 8 зображено послідовність гена І/-188Р людини. Визначають послідовність геномного клону (ФІ (7,1т.п.н.) людини і порівнюють з послідовностями різних клонів кКДНК, виділених з З кКДНК бібліотек. Спільний стартовий кодон трансляції являє собою нуклеотиди 683-685. МиИМАЇ ген локалізується на негативному ланцюзі ді від нуклеотиду 3578 до кінця.
Фігура 9 показує вплив рекомбінантного ІІ -188Р на активність ІІ -18 людини і миші. бо Нівзео-мічений ІІ -18О8Ра короткочасно експресують в клітинах СО57 і очищають. (А) І--18 людини (5нг/мл) попередньо змішують з або Нізо-міченим-ІІ-18ВРа, або КРМІ та додають до клітин селезінки миші разом з І РБ (мкг/мл). Продукцію ІЄМ- вимірюють через 24 години. (В) 1-18 миші (1Онг/мл) попередньо змішують або з Нізо-міченим-ІІ-18ВРа, або з КРМІ і додають до клітин селезінки миші разом з І РБ (мкг/мл). Продукцію ІЄМ- вимірюють через 24 години. бо (С) 1-18 людини (25нг/мл) попередньо змішують або з СО57-ІІ,-18ВРа, або з КРМІ і додають до РВМС
(мононуклеарні клітини периферійної крові) людини в присутності ІІ -12 (1Онг/мл). (0) 1-18 людини (25нг/мл) попередньо змішують або з СО57-ІІ -18ОВРа, або з ЕРМІ і додають до КО-1 клітин людини в присутності ТМЕ-' (2Онг/мл).
Даний винахід стосується різних ІІ-18ВР та вірусних ІІ -18ВР»з, які зв'язують ІІ -18. Такі І. -188Р. модулюють мабо блокують біологічні активності ІЇ/-18. Термін "ПІ -18ВР і вірусні І/-188" включає в себе зрілий білок (без сигнальної послідовності), білок, що містить сигнальну послідовність, мутеїни І/-18ВР і вірусних
І--188Р, похідні ІІ -188Р і вірусних ІІ -18ВР та усічені форми ІІ -188Р і вірусних ІІ-188ВР та їх солі.
Далі винахід стосується ДНК, що кодують різні І/-18ВР, вірусні І -18ВР, мутенни, рекомбінантні білки, 70 функціональні похідні, активні фракції та їх суміші. Зазначена ДНК являє собою геномну ДНК, кКДНК, синтетичну
ДНК, продукт РСК або їх поєднання. Ці ДНК вставляють в репліковувані носії експресії для експресії різних
І/-18ВР та вірусних І/-18ВР в клітинах-хазяїнах згідно з цим винаходом. ДНК здатні гібридизуватись з зазначеними ДНК за жорстких умов, а кодування білків або поліпептидів, що зв'язують ІІ -18, також включають до цього винаходу.
Одна така ДНК кодує І/-18В8Р, який включає амінокислотну послідовність ЗЕС І МО: 10, їі містить термінуючий кодон на її 3'-кінці.
Експресуючі вектори, підхожі для експресії різних ІЇ-18ВР або вірусних ІІЇ-18ВР у людей або інших ссавців, тобто для генної терапії, являють собою вірусні вектори або інші типи векторів, в які включають ген ІІ-188Р або кДНК 1 -18ВР чи ДНК, що кодує 1І-18ВР у спосіб, який дозволяє здійснити ефективну експресію ІІ -18ВР або
Вірусного ІІ-18ВР у людей та інших ссавців. Даний винахід також включає молекули ДНК, які гібридизуються з зазначеними ДНК за жорстких умов і кодують білки і поліпептиди, що зв'язують ІЇ -18.
Виділення І/-188Р. проводять згідно з даним винаходом, наприклад, шляхом пропускання рідин організму людини таких як сеча або сироватка через хроматографічну колонку, до якої приєднаний ІІ -18, і подальшої елюції ІІ -188В Р. с
Різні ІІ-18ВР і вірусні І -18В8Р одержують за допомогою рекомбінантних методик, тобто шляхом експресування ІЇ/-18В8Р. в відповідному хазяїні, слідом за оперативним приєднанням промоторів, енхансерів о експресії, регуляторних послідовностей тощо, прийнятних для даного використовуваного хазяїна, що, наприклад, передбачає експресію в правильній орієнтації.
Різні І -18ВР і вірусні І -18ВР, та вектори для експресування ЕЇ/-188Р у людей та інших ссавців Га зо застосовують для лікування і полегшення станів, в які втягнутий ІІ-18 або які викликані надлишком екзогенно введеного або ендогенно утвореного ІЇ-18. Такими станами є, наприклад аутоїмунні захворювання, цукровий о діабет | типу, ревматоїдний артрит, відторгнення трансплантата, запальне захворювання кишечнику, сепсис, со розсіяний склероз, ішемічна хвороба серця (включаючи серцевий напад), ішемічне ураження мозку, хронічний гепатит, псоріаз, хронічний панкреатит, гострий панкреатит і таке інше. о
Відповідно до цього винаходу, І/-188Р виділяють з сечі здорової людини за допомогою однієї ї- хроматографічної стадії. Препарат неочищеної сечі людини, сконцентрованої з 500л сечі здорових людей, наносять на колонку, що містить ІЇ-18 людини, зв'язаний з агарозою. Колонку промивають, а зв'язаний білок елююють при низькому значенні рН. Елюйовані фракції нейтралізують, а аліквоти аналізують за допомогою
ЗО5-РАСЕ (електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію) (1095 акриламіду) за « невідновлювальних умов і при забарвленні сріблом. Зокрема, в елюйованих фракціях виявлена білкова зона шщ с 40кДа (Фіг.1). й Білок «40кДа, одержаний на першій стадії, ідентифікують як ІІ -18-зв'язувальний білок, за його здатністю, ,» зокрема, поперечно зв'язувати /7292І-Ї-18 (Фіг2). До того ж, білок «40кДа характеризують, аналізуючи
М-кінцеву послідовність білка. Аліквоти з елюйованого білка піддають ЗЮО5-РАСЕ, електроблотингу на РМОБ-мембрані та проводять аналіз первинної структури короткого фрагменту послідовності білка. Аналогічно, - І аліквоти елюйованого білка піддають прямому аналізу первинної структури короткого фрагменту послідовності білка. В обох випадках, одержані дві поліпептидні послідовності. Головна послідовність і мінорна і-й послідовність, остання відповідає фрагменту дефенсину людини (номер доступу р11398), починаючи з (ее) амінокислоти 65. Віднімання відомої послідовності дефенсину дає таку послідовність: др - Му шк дрож лег а. й ди. дну ця
Ф одн ши кож жін в
Ко) (Ф) де х являє собою ще невизначені амінокислоти. ко Щоб одержати більш довгу і більш точну послідовність і щоб ідентифікувати можливі залишки цистеїну, аліквоти елюйованої фракції відновлюють ДТТ (дитіотрейтолом) за денатуруючих умов, проводять реакцію з во 4-вінілліридинон, знесолюють за допомогою мікро-ультрафільтраційного пристрою (ОПгаїгтеє, сціоїй 1000017,
МіШіроге) і проводять аналіз первинної структури короткого фрагменту послідовності білка. Після циклу Мої секвенування, проводять реакцію залишкового білка з о-фталевим альдегідом, щоб блокувати всі М-концеві поліпептиди окрім Рго, а потім продовжують секвенування. У цей спосіб одержано таку одноланцюжкову білкову послідовність: б5
"тТрРУІВШКИКАА ХАБУВОТЕОР СРБОРРУЕРА. АКОСРАЦЕУТ - о т ве с
ІТ-Тавие Бе-Рко; МеуУаї; БеВех, чл невідома; АНА 70 ниви КнНцуд; ВеАвв: бебувл КеВдЕ; берем: Бебі
Одержана послідовність значно відрізняється від послідовності будь-якого іншого відомого білка, що встановлено дослідженням баз даних за структурою білка. Однак дослідження бази даних Те Іпвійше ої
Сепотіс Кезеагсп (ТОСК) (НТТР:/Лимлиу. порі. піт. пій.доу) за допомогою (Бріазіп програми дослідження дало файл
КДНК, позначений ТНС12801, відкрита рамка зчитування (128 кодонів) якої, коли транслюється, містить послідовність високо гомологічну М-кінцевій послідовності ІІ -18ВР. Таким чином представляють гомологію:
В я кіки» «КЕМВОККХААХАОУВОТКОКСВЗОРБУКВААКОСВАТЕМТ. с. ЙО
І г КАЛІ ВЕС ЕЕ КІТ 81 УТІЕУВАТХУКОТТТААТАЗУНВТКОРСВВО УКР ААКОСРАДЕЧТИВЕ. 100 7 (Верхня послідовність (1-40) є послідовністю ІІ-18ВР, виділеною згідно з винаходом; нижню послідовність (51-100) одержано трансляцією КДНК файлу ТНС123801 ТІСК).
Послідовність КДНК, ідентифікована як ТНС 12801, є, однак, тільки Е5Т (експресована (ад послідовність), тобто випадково вибраним клоном кДНК. Ніколи не досліджували, чи містить Е5Т відкриту рамку зчитування, або с об чи експресується білок з гена, який відповідає ЕЗТ, або з самого ЕТ, не ідентифікували будь-коли будь-яку функцію білка, що кодується ТНС12801. Взагалі немає інформації про те, що ТНС123801 містить відкриту рамку і) зчитування, що кодує ІІ -188ВР.
Афінно-очищений І/-18В8Р сечі зберігає здатність зв'язувати його мічений ліганд ( 7125І-П/-18) , і після ковалентного поперечного зв'язування утворює комплекс з молекулярною масою 58кДа. Молекулярна маса Ге комплексу відповідає співвідношенню 1:1 І -18ВР. «40кДа та ІІ -18 19кДа (Фіг.2).
Афінно-очищений ІІ -18ВР. блокує біологічну активність ІЇ-18 людини, так само як і миші. Таким чином, коли іш
І/-188Р додають до 1/-18 або людини, або миші, він блокує здатність І/-18 викликати продукцію сб інтерферона-гамма, якщо додають разом з ліпополісахаридом (І РБ) до культур клітин селезінки миші (Фіг.3).
З метою даного опису вираз "біологічна активність ІЇ/-18" стосується принаймні однієї з поданих нижче юю біологічних властивостей: рч- (І) індукція ІЄМ-, головним чином, в якості ко-стимулятора з мітогенами, 1І-1, 1-12, ТМЕ-", ГРЗ в різних типах клітин таких як мононуклеарні клітини периферійної крові людини, лінія КО-1 клітин людини і Т-клітини, (ії) збільшення проліферації Т-клітин, « (ії) збільшення утворення цитокіну ТН-1 іп міго, головним чином в якості ко-стимулятора, (ім) синергізм з І/-12 щодо збільшення продукування ІЕМ-, дія ко-стимулятора щодо продукції ІЄМ- та інших - с цитокінів Т-хелперів-1, "з (М) ко-стимулююча дія відносно ЕРАз-ліганд-опосередкованої цитотоксичності клонів натуральних-кілерів " миші, (мі) індукція активації МЕ-КВ в КО-1 клітинах людини, ймовірно шляхом індукування утворення гомодимеру 50
МЕ-КВ і гетеродимеру рб5/рб5о МЕ-КВ, -і (мії) індукція 1-8. сл Вживаний в описі вираз "зв'язування з 1-18" означає здатність ІЇ/-18ВР зв'язувати 1ІІ-18, що доводять, наприклад шляхом зв'язування ІІ -18ВР з міченим ІІ--18 при афінній очистці, як описують в Прикладі 2 опису. (ее) Вживаний в описі вираз "модулювання активності ІЇ-18" означає здатність І -18ВР змінювати будь-яку б» 50 активність ІІ -18, а не блокування, наприклад часткове інгібування, підсилення і таке інше.
Вживаний в описі вираз "блокування активності ІІЇ-18" стосується активності ІІ -18ВР, що блокує принаймні до) одну з наведених вище біологічних активностей І/-18. Активність І/-18ВР, що блокує І/-18, є прикладом здатності І -18ВР. блокувати асоційовану з ІЇ-18 експресію ІЕМ- в спленоцитах миші. Як буде показане більш докладно нижче, модулювання або блокування активності ІЇ-188Р. частково зумовлене тим, що ІІ -18ВР інгібує викликану 1-18 активацію МЕ-КВ. До того ж, ІЇ-188Р. блокує принаймні одну з таких активностей ІІ -18, а саме індукцію ІЕМ- в клітинах людини і миші, індукцію ІІ -8 і активацію МЕ-КВ. о ДНК-зонд для скринінга кКДНК бібліотек одержують шляхом РСЖК з зворотною транскриптазою зі іме) специфічними смисловим і антисмисловим праймерами і РНК з Т-клітин людини ДигКкаї з праймерами з ТІСК послідовності. Одержаний продукт РСЕ. підтверджують аналізом послідовності ДНК. Продукт РСЕ. мітять РІ і 60 використовують в якості зонда для скринінга чотирьох КкКДНК бібліотек людини, одержаних з моноцитів периферійної крові, з лінії Т-клітин Уигкаї з РВМС (мононуклеарних клітин, периферійної крові) та з селезінки людини. Різні незалежні клони кДНК відповідають чотирьом варіантам сплайсинга ІІ -18ВР (5ЕО ІЮ МО: 1, 3, 5 1 7). Всі варіанти сплайсинга кодують передбачувані розчинні секретовані білки. Найбільш багатий варіант (ІІ-188Ра) має відкриту рамку зчитування з 192 кодонів, яка кодує сигнальний пептид, що раніше 65 згадується як "лідер-послідовність" з 28 амінокислотних залишків, за яким йде зрілий передбачуваний ІІ -18ВРа, перші 40 залишків якого ідеально відповідають М-кінцевій білковій послідовності І/-18ВР. сечі (ЗЕО ІЮ МО: 2).
Положення залишків цистеїну дозволяє припустити, що цей поліпептид належить до суперсімейства імуноглобулінів (14). Цікаво, що кожен з чотирьох залишків (Іп в зрілому І/-188Ра є ділянкою можливого
М-глікозилування. Три інші варіанти І/-18ВР. наявні в меншій кількості, ніж І -18ВРа. Вони включають в себе більш коротку 1т.п.н. КДНК 1І/-18ВРБЬ, що кодує сигнальний пептид з 28 амінокислотних залишків з подальшим зрілим білком з 85 амінокислотних залишків (ЗЕСО ІЮО МО: 4). Третій варіант, І -18В8РС, являє собою кКДНК 2,3т.п.н., що кодує сигнальний пептид з 28 амінокислотних залишків з подальшим зрілим ІІ/-188Р з 169 амінокислотних залишків (ЗЕО ІО МО: 6). Четвертий варіант, І/-188РЯ, кодує сигнальний пептид з 28 амінокислотних залишків з подальшим зрілим ІІ -188Р з 1 амінокислотних залишків (ЗЕО ІЮ МО: 8). 70 Для подальшого дослідження можливого існування додаткових варіантів сплайсинга ІІ-18ВР, проводять скринінг геномної бібліотеки людини зондом, який відповідає повній довжині кКДНК І/-18ВР. П'ять геномних клонів, що відрізняються за довжиною, ідентифіковані в цій бібліотеці. Проводять аналіз послідовності ДНК цих клонів з використанням зовнішнього і внутрішнього праймерів. Всього з цих клонів зібрана послідовність 7,бт.п.н. (ЗЕО І МО: 9). Не ідентифікують ніякого екзона, що кодує трансмембранний (ТМ) рецептор з /5 послідовністю 7,8т.п.н. Всі варіанти, розподілені в звичайному ініцюючому сайті трансляції, кодують той самий сигнальний пептид з 28 амінокислотних залишків і розчинні зрілі білки, які відрізняються за величиною та С-кінцевими послідовностями. ІІ -18ВР-локус містить додатковий ген, що кодує білок 1 ядерного мітотичного апарату (МОМАТ), який знаходиться на мінус ланцюга. Ці дані локалізують ген ІІ -18ВР в хромосомі ІІд 13 (36).
Дослідження гомології проводять на повній білковій послідовності І/-18ВРа і СепРері базі даних 20. (НТТРУЛУМЛУ. порі. піт.пій. дому), використовуючи Зтіїй УмМаїегтапп-алгоритм. Виявлено, що гомологи 1І-188Р експресуються в деяких поксо-вірусах у вигляді секретованих білків з раніше невідомою функцією. Раніше повідомляли, що віруси кодують різні рецептори цитокінів і що такі кодовані вірусами молекули служать в якості пасток-рецепторів, що інгібує імунні відповіді шляхом нейтралізації їх відповідного цитокіну (розглядають Зргіддз, МК, 1994, Сшт, Оріп. Іттипої!., 6, 526-529). Тому винахід далі стосується кодованих сч 2гв Вірусами гомологів ІІ-188Р, які також є блокаторами або модуляторами біологічної активності ІІ -18. Приклади кодованих вірусами гомологів ІІ-18ВР подані в Таблиці 1. і)
Згідно з даним винаходом, кодований вірусом гомолог експресують в прокаріотичному або еукаріотичному хазяїні. Вживаний в описі вираз "кодований вірусом гомолог ІЇ/-188Р" означає схожість принаймні 5095 в послідовності з принаймні 70 амінокислотних залишків. Більш прийнятно, схожість становить принаймні 5095, с зо принаймні 6095, принаймні 7095, принаймні 8095 або ще більш прийнятно принаймні 9095 схожості в послідовності з 100 амінокислотних залишків. ікс, с й виявляють високу гомологію з І/-188Р. людини зв т « й - с :» в - п (ее) й й -
І-18ВРа експресують в клітини СО57 мавпи. З цією метою кДНК ІІ -18В8Ра включають в експресуючий вектор (22) 50 РЕБ-ВО5 ссавців. Касету, що кодує (Нівз)с-послідовність, приєднують до 3-кінця ОКЕ 1І/-188Р. в рамці, щоб
Кз полегшити очистку рекомбінантного білка. Клітини СО57 короткочасно трансфікують експресуючим вектором, а безсироваткове середовище цих клітин (15О0мл) концентрують і очищають шляхом метал-хелатуючої хроматографії. І/-18ВРа рухається у вигляді однієї смуги при 505-РАСЕ з забарвленням сріблом при відновлювальних та невідновлювальних умовах і має таку ж уявну молекулярну масу, як маса І/-18ВР. сечі.
Аналіз білкової послідовності цього препарату виявляє таку ж М-кінцеву послідовність як послідовність І/-188Р
ГФ) сечі. Аналіз ІЇ-18ВРа за допомогою імуноблотинга з антитілами, одержаними проти ІІ-188ВР сечі, виявляє зону з з такою ж молекулярною масою як маса білка сечі. Крім того, використовуючи імунопреципітацію з подальшими
З0О5-РАСЕ і авторадіографією, встановлюють, що ІІ-І5ВРа витісняє 7125І-І-18В8Р сечі з сполуки з антитілом. во Тому І-18ВРа структурно відповідає ІІ -18ВР, виділеному з сечі.
Були проведені дослідження здатності сирого і очищеного ІІ-18ВРа інгібувати біологічну активність ІЇ-18.
І/-18ВРа інгібує активність ІЇ/-18 людини і миші в спленоцитах миші, РВМС і лінії КО-1 клітин людини (Фіг.9).
Ці результати підтверджують справжність кКДНК ІІ -18ВРа, як кКДНК, що кодує біологічно активний ІІ -188Р.
Далі даний винахід стосується мутеїнів і фрагментів ІЇ-18ВР та вірусних ІІ/-188ВР, і рекомбінантних білків, в5 які складаються з ІЇ/-18В8Р. дикого типу та вірусних І/-18ВР або їх мутеїнів або фрагментів, злитих з іншим поліпептидом або білком і які характеризуються здатністю зв'язувати ІІ -18 або його гомологи.
Вживаний в описі термін "мутеїни" стосується аналогів ІІ-18ВР або аналогів вірусного ІІ -18ВР, в яких один чи більше амінокислотних залишків нативного 1І/-188Р або вірусного І/-188Р заміщають різними амінокислотними залишками або вилучають, або один чи більше амінокислотних залишків приєднують до послідовності нативного І/-188Р або вірусного І/-18ВР без значної зміни здатності одержаних продуктів зв'язувати ІІ -18 порівняно з Ії -18ВР дикого типу або вірусним ІІ -18ВР. Ці мутеїни одержують шляхом відомого синтезу і/або методами сайт-спрямованого мутагенезу, або будь-якого іншого відомого методу, прийнятного для цього.
Більш прийнятно будь-який такий мутеїн має послідовність амінокислот, яка суттєво повторює послідовність 7/0. 11-188Р, яка суттєво повторює послідовність вірусного 1І-188Р, таку, щоб мати по суті однакову активність з
І/-18ВР. Однією активністю є його здатність зв'язувати І/-18. Оскільки мутеїн характеризується значною
І/-18-зв'язувальною активністю, його використовують для очистки ІЇ/-18, як наприклад шляхом афінної хроматографії, і таким чином вважають, що він має активність, подібну до активності І/-18ВР. Так, чи має будь-який даний мутеїн по суті таку ж активність як І/-188Р можна визначити за допомогою рутинних /5 експериментів, в яких такий мутеїн піддають, наприклад простому конкурентному сендвіч-аналізу, щоб виявити чи зв'язує він або ні відповідно мічений 1І/-18, і таким як радіоїмуноаналіз та Е5БА (твердофазний імуноферментний аналіз).
В більш прийнятному втіленні будь-який такий мутеїн має принаймні 4095 ідентичності або гомології з послідовністю або ІІ/-18ВР, або кодованого вірусом гомолога ІІ-18В8Р. Ще більш прийнятно, він має принаймні 5095, принаймні 6095, принаймні 7 095, принаймні 8095 або найбільш прийнятно, принаймні 9095 ідентичності або гомології з нею.
Мутеїни поліпептидів І -18ВР або мутеїни вірусних ІЇ/-18ВР, застосовні згідно з даним винаходом, або нуклеїнова кислота, що їх кодує, включають в себе певний набір істотно відповідних послідовностей, як пептиди заміщення або полінуклеотиди, які рутинно одержують за допомогою одного з звичайних способів на даному с ов рівні техніки без зайвих експериментів на основі інструкцій і порадника, наведених в описі. Докладний опис хімії і структури білка див. |ЗспціІ2 (5. Е. еї аї., Ргіпсіріез ої Ргоївіп Зігисіцге, Зргіпо-Мегпад, Мем Ммогк, і) 1978; і Стедпіоп, Т. Е., Ргоїеіпв: Зігисішге апа Моїіесціаг Ргорегіев, МУ. Н. Егеетап 5: Со., Зап Егапсівзсо, 1983), які цитують в описі. Для ознайомлення з замінами в нуклеотидній послідовності, наприклад такими як кодонні переваги, див. І(Аизирбеї еї аї., вирга, аг А,1.1-А.1.24, і Затрьгоок еї а!., зирга, в Додатках С і 0). с зо Більш прийнятними замінами щодо мутеїнів відповідно до цього винаходу є заміни, відомі як консервативні.
Консервативні заміни поліпептидів або білків І -18ВР або вірусних І/-188Р включають в себе синонімічні ісе) амінокислоти, групи яких характеризуються достатньо схожими фізико-хімічними властивостями, що при со заміщеннях між членами групи зберігається біологічна функція молекули, |(Сгапійат, Зсіепсе, Мої. 185, рр.862-864 (1974)). Ясно, що вставки і делеції амінокислот в зазначених послідовностях можна здійснювати без о зміни їх функції, особливо якщо вставки та делеції втягують лише кілька амінокислот, наприклад менше ї- тридцяти, і більш прийнятно менше десяти, і не вилучають або заміщають амінокислоти, які є істотними для функціональної конформації, наприклад залишки цистеїну, |(Апіїпзеп, "Ргіпсіріег Тпагї Сомегп Те Роїдіпд ої
Ргоївіп Саїпв"; Зсіепсе, Мої. 181, рр.22-20 (1973)). Білки і мутеїни, утворені за допомогою таких делецій і/або вставок, входять до компетенції даного винаходу. «
Однак залишки цистеїну, які не є істотними для біологічної функції, заміщають на інші залишки, наприклад, з с щоб уникнути утворення небажаних внутрішньомолекулярних і міжмолекулярних дисульфідних містків, які викликають зниження активності ІІ -188Р. ;» Більш прийнятні синонімічні амінокислотні групи подані в Таблиці І. Ще більш прийнятно, синонімічні амінокислотні групи являють собою групи, наведені в Таблиці ІІ; і найбільш прийнятно синонімічні амінокислотні групи являють собою групи, названі в Таблиці ІП. -І о, со щи їз ов о ю 6 мертустне увів во вв
Авр СІМ, Авп, Авр групи синонімічних амінокислот д й 6 теме тів мартео ся ; о сч р р со со в групи синонімічних амінокислот зв М « щ З с хз»
Ле фееменівш щі -І с
ФО о зв о г Приклади здійснення амінокислотних замін в білках, що використовують для одержання мутеїнів поліпептидів або білків І/-18ВР, або мутеїнів вірусних ІЇ/-18ВР, для застосування в даному винаході, включають будь-які во відомі стадії способів таких як наведені в патентах США КЕ 33653, 4959314, 4588585 і 4737462 Мак еї аї.; 5116943 Коїйз еї аї!., 4965195 Матеп еї а1|.; 4879111 Спопд еї аї.; і 5017691 І ее еї аї; і білки з заміщеним лізином представляють в патентах США Мо4904584 (ЗНаму еї а!.).
В іншому більш прийнятному напрямку даного винаходу мутеїн І/-188Р або вірусного І/-188Р має амінокислотну послідовність, яка по суті відповідає послідовності І/-18В8Р або вірусного ІІ/-18ВР. Термін "по ве суті відповідає" призначено для розглядуваних білків з мінорними змінами в послідовності природного білка, які не порушують основні характеристики природних білків, особливо, що стосується їх здатності зв'язувати
І/-18. Вважають, що тип змін, які звичайно відносять до "по суті відповідають", є такими змінами, що відбуваються в результаті узвичаєних методів мутагенезу ДНК, які кодують ці білки, що приводять в результаті до нечисленних мінорних модифікацій, і скринінгу необхідної активності у описаний вище спосіб. Окрім зв'язування ІІ -18 мутеїни також модулюють і/або блокують активність ІІ -18.
Відповідно до цього винаходу, мутеїни включають в себе білки, що кодуються нуклеїновою кислотою такою як
ДНК або РНК, які гібридизуються з ДНК або РНК, які кодують ІІ -18ВР або кодують вірусний ІІ -18ВР відповідно до цього винаходу за жорстких умов. Винахід також включає в себе таку нуклеїнову кислоту, що також може застосовуватись в якості зонда при ідентифікації і очистці необхідної нуклеїнової кислоти. Крім того, така /о нуклеїнова кислота є основним кандидатом для визначення, чи кодує вона поліпептид, що зберігає функціональну активність І/-188Р даного винаходу. Термін "жорсткі умови" стосується гібридизації і умов подальшого промивання, що є звичайними на даному рівні техніки і узвичаєно називаються "жорсткими". Див. (АХ!изибеї еї аї., Ситепі Ргоїосоіїв іп Моїіесшаг Віоіоду, зирга, Іпіегесіепсе, М. М., 6.3 і 6.4 (1987, 1992), та Затрьгоок еї аї!., зирга)|. Без обмеження приклади жорстких умов включають в себе умови промивання 12-209 75 нижче від розрахованої температури гібриду при дослідженні в, наприклад 2 х ЗЗС і 0,596 додецилсульфаті натрію протягом 5 хвилин, 2 х 55 і 0,1,960 505 протягом 15 хвилин; 0,1 х 550 0,595 5005 при 372. протягом 30-60 хвилин, а потім 0,1 х З5С і 0,595 505 при 682С протягом 30-60 хвилин. Фахівці у цій галузі розуміють, що жорсткі умови також залежать від довжини послідовності ДНК, олігонуклеотидних зондів (як, наприклад, 10-40 основ) або змішаних олігонуклеотидних зондів. Якщо застосовують змішані зонди, більш прийнятно використовують хлорид тетраметиламонію (ТМАС) замість 550. Див. А!йзибеї, вище.
Далі винахід стосується нуклеїнових кислот, які кодують ІЇ/-188Р. відповідно до цього винаходу, але які відрізняються за послідовністю кодону внаслідок виродженості генетичного коду. Винахід також стосується таких
ДНК, які, можливо, не гібридизуються за жорстких умов з послідовностями ДНК, наведеними на Фігурах 4 до 7, але, проте, кодують ІІ -18ВР відповідно до цього винаходу. Ге
Термін "гібридний білок" стосується поліпептиду, що містить ІІ-18ВР або вірусний ІІ-188Р, або їх мутеїни, о злиті з іншим білком, який, наприклад має тривалий час циркуляції в рідинах організму. Таким чином, І -188Р. або вірусний ІІ -18ВР. можуть бути злиті з іншим білком або поліпептидом тощо, наприклад імуноглобуліном або його фрагментом. Він також може бути злитий з поліетиленгліколем (РЕС) для пролонгування часу циркуляції.
Термін "солі", що використовується в описі, стосується як солей карбоксильних груп, так і солей Ге приєднання кислот аміногруп І/-18ВР, вірусного І/-18ВР, мутеїнів або їх рекомбінантних білків. Солі карбоксильної групи, утворені у способі, відомі у цій галузі, включають неорганічні солі; наприклад солі ї-о натрію, кальцію, амонію, заліза або цинку тощо, та солі, утворені з органічними основами, наприклад амінами, (оо) такими як триетиламін, аргінін або лізин, піперидин, новокаїн і подібні. Солі приєднання кислот включають, наприклад солі мінеральних кислот такі як, наприклад хлористоводнева кислота або фосфорна кислота, і солі о органічних кислот такі як, наприклад оцтова кислота або щавлева кислота. Звичайно, будь-які такі солі повинні ч- мати активність, подібну до ІІ -18ВР.
Термін "функціональні похідні", що вживається в описі, означає похідні І/-18В8Р або вірусного І/-18ВР та їх мутеїнів і рекомбінантних білків, які одержують, наприклад з функціональних груп, існуючих у вигляді « бокових ланцюгів на залишках або М- або С-кінцевих групах, згідно з методиками, відомими в даній галузі, та їх включають у винахід, оскільки вони залишаються фармацевтично прийнятними, тобто вони не руйнують - с активність білка, яка по суті подібна до активності І -18ВР або вірусного І/-18ВР, і не надають токсичних а властивостей композиціям, що їх містять. Ці похідні включають в себе, наприклад бокові ланцюги "» поліетиленгліколю, які маскують антигенні ділянки та подовжують перебування ІІ -18ВР або вірусного ІІ -188Р в біологічних рідинах. Інші похідні включають аліфатичні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп шляхом реакції з аміаком або з первинними чи вторинними амінами, М-ацильні похідні вільних аміногруп -і залишків амінокислот, утворених з адильними компонентами (наприклад, алканоїльними або карбоциклічними сл ароїльними групами), або О-ацильні похідні вільних гідроксильних груп (наприклад, груп залишків серину і треоніну), сформованих з ацильними компонентами. (о) В якості "активних фракцій" І/-18В8Р. або вірусного ІІ/-18ВР, мутеїнів або рекомбінантних білків в даному б» 50 винаході розглядають будь-який фрагмент або попередники поліпептидного ланцюга білкової молекули одних або разом з асоційованими молекулами або зв'язаними з ними залишками, наприклад залишками цукру або що) фосфату, або агрегатами білкової молекули, або самими залишками цукру за умови, що названа фракція по суті зберігає здатність зв'язувати ІЇ -18.
Термін "перетворені через циклізування похідні? що використовується в описі, стосується лінійної молекули, кінці якої з'єднують разом або безпосередньо, або через лінкер, щоб утворити кільцеву молекулу, а потім кільцеву молекулу розкривають в іншій ділянці, щоб утворити нову лінійну молекулу з кінцями, що о відрізняються від кінців вихідної молекули. Перетворення через циклізування включає ті молекули, структура іме) яких еквівалентна молекулі, яку циклізують, а потім відкривають. Так, перетворена циклізуванням молекула синтезується де помо як лінійна молекула, і ніколи не проходить Через стадію утворення кільця і стадію 60 розкриття. Одержання перетворених через циклізування похідних описують в міжнародній заявці УМО 95/27732.
Різні рекомбінантні клітини такі як прокаріотичні клітини, наприклад, Е. соїї, або еукаріотичні клітини, такі як дріжджі або клітини комах, продукують ІІ/-18ВР або вірусні І/-18ВР. Способи конструювання підхожих векторів, що несуть ДНК, які кодують ІІ -18ВР, та прийнятні для трансформування (наприклад, Е. соїї, клітини ссавців та клітини дріжджів) або інфікування клітин комах для того, щоб продукувати рекомбінантні ІІ -18В8Р. або 65 вірусний І/-18ВР, добре відомі у цій галузі. Див. наприклад, (Аизиреї! еї аї., едв. "Сцтепі Ргоїосоїів, 1993; та Затрьгоок еї а!., еав. "Моїесціаг Сіопіпод: А І арогагу Мапиаї!", 279 ед., Соїа Зргіпд Нагрог Ргезв, 1989).
Для експресії І/-18ВР білків або вірусних І/-18ВР, ДНК, що кодують ІЇ/-188Р або вірусний ІІ/-188ВР, їх фрагменти, мутеїни або рекомбінантні білки, і оперативно приєднані регуляторні фактори транскрипції і трансляції включають у вектори, що здатні інтегрувати необхідні генні послідовності в хромосоми клітини-хазяїна. Щоб вибрати клітини, які стабільно інтегрують введену в їх хромосоми ДНК, використовують один чи більше маркерів, що передбачаються відбір клітин-хазяїв, що містять експресуючий вектор. Маркер забезпечує прототрофію ауксотрофному хазяїну, біоцидну резистентність, наприклад до антибіотиків, або резистентність до важких металів, таких як мідь і подібні. Селектований ген-маркер або безпосередньо зв'язують з ДНК послідовності гена, щоб експресувати, або вводять в ту саму клітину шляхом ко-трансфекції. 70 Додаткові елементи також необхідні для оптимального синтезу МРНК одноланцюжкового зв'язувального білка. Ці елементи включають фактори сплайсинга, а також промотори транскрипції, енхансери і сигнали термінації.
Названу молекулу ДНК, щоб ввести в клітини вибору, більш прийнятно включають в плазмідний або вірусний вектор, здатний до автономної реплікації в реципієнті-хазяїні. Більш прийнятні прокаріотичні плазміди є похідними рВК322. Більш прийнятні еукаріотичні вектори включають в себе ВРМ (вірус папіломи великої рогатої худоби). Вірус вісповакцини, ЗМ40, 2-мікронний кільцевий вірус, тощо та їх похідні. Такі плазміди і вектори добре відомі у цій галузі (2-5, 22). Якщо вектор або послідовність ДНК, що містить конструкцію, одержують для експресії, експресуючий вектор вводять у відповідну клітину-хазяїна за допомогою будь-якого з численних прийнятних способів, таких як трансформація, трансфекція, ліпофекція, кон'югування, протопластне злиття, електропорація, осадження фосфатом кальцію, пряма мікроїін'єкція тощо.
Використовувані в цьому винаході клітини-хазяїни є або прокаріотичними, або еукаріотичними. Більш прийнятні прокаріотичні хазяїни включають в себе бактерії такі як ЕЕ. соїї, Васійи5, бігеріотусев,
Рзейдопотаз, ЗаІтопейа, Зегтайа тощо. Найбільш прийнятні прокаріотичні хазяїни являють собою Е-соїї.
Особливо цікаві бактеріальні хазяїни включають штам 294 Е. соїї К1І2 (АТСС 31446), Е. соїї Х1776 (АТСС 3157),
Е. соїї МУ3110 (Е", лямбда", фототрофні (АТСС 27325). За таких умов білок не глікозилується. Прокаріотичний Га хазяїн повинен бути сумісним з репліконом і контрольними послідовностями в експресуючій плазміді.
Однак оскільки природні І./-18В8Р є глікозилованими білками, еукаріотичні хазяїни є більш прийнятними і9) порівняно з прокаріотичними. Більш прийнятні еукаріотичні хазяїни являють собою клітини ссавців, наприклад людини, мавпи, миші і клітини яєчників китайського хом'яка (СНО), оскільки вони забезпечують пост-трансляційні модифікації білююовим молекулам, які включають правильну укладку, правильне утворення Ге дисульфідних зв'язків, а також глікозилування в правильних сайтах. Клітини дріжджів і клітини комах також виконують пост-трансляційні модифікації пептидів, включаючи високоманозне глікозилування. о
Існує ряд технологій рекомбінантних ДНК, які утилізують послідовності сильних промоторів та високе число ее) копій плазмід, котрі використовують для продукції потрібних білків у клітинах дріжджів і клітинах комах.
Клітини дріжджів і комах розпізнають лідерні послідовності на клонованих генних продуктах ссавців і вибирають о 3з5 Зрілий І.-18ВР. Після введення вектора, клітини-хазяїни вирощують на селективному середовищі, якевибирають для вирощування клітин, що містять вектор. Експресія клонованої генної послідовності(ей) приводить до продукції ІІ-18ВР, вірусного ІІЇ-18ВР, рекомбінантних білків або їх мутеїнів чи фрагментів. Зазначені способи клонування, виділення клону, ідентифікації, характеристики і секвенування описують більш докладно далі в «
Прикладах.
Експресовані білки потім виділяють і очищають за допомогою будь-яких узвичаєних методик, включаючи 8 с екстракцію, осадження, хроматографію, електрофорез чи подібне, або за допомогою афінної хроматографії, ц використовуючи, наприклад анти-І-188Р моноклональні антитіла, імобілізовані на гелевому матриксі, "» приміщеному в колонку. Неочищені препарати, що містять названий рекомбінантний ІІ -18ВР, пропускають через колонку, де ІЇ/-18ВР зв'язується на колонці специфічними антитілами, тоді як домішки проходять. Після промивання, білок елююють з гелю за умов, які звичайно застосовуються з цією метою, тобто при високому або -І низькому рН, наприклад рН 11 або рнН 2.
Крім того, винахід стосується векторів, які корисні для експресії І -18ВР або вірусного ІІ-188ВР, або їх і-й похідних у ссавців, а точніше у людей. Вектори для короткочасної і довгочасної експресії генів у ссавців (ее) добре відомі по літературі. Дослідження показують, що доставка гена до, наприклад, скелетного м'язу, гладкого м'язу судин і печінки приводить в результаті до системних рівнів терапевтичних білків. Скелетний м'яз є б зручною мішенню через її велику масу, кровопостачання і доступність. Однак успішно використовують і інші
Кз мішені і, зокрема кістовомозкові попередники імунних клітин. Зараз доступні вектори для експресії білків, наприклад в м'язі, включають плазмідну ДНК, ліпосоми, кон'югати білок-ДНК і вектори, на основі аденовірусу, аденоасоційованого вірусу і вірусу герпесу. З них вектори на основі аденоасоційованого вірусу (ААМ)
ВвиЯВЛЯЮюТьЬСЯ найбільш ефективними щодо тривалості і рівнів експресії гена і у відношенні безпеки |Кеззеї, Р.
О. 1996, Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 93, 14082-14087).
Ф, Способи конструювання вектора на основі ААМ докладно описують |Зпуаег еї аї., 1996, Ситепі Ргоосоїв іп ко Нитап Сепеїїсв, Спаріеге 12,1.1-12.1.17, дойп ММйеу б Бопв| і цитують в цьому патенті. Коротко, плазміду рзиб201, що містить геном ААМ дикого типу розрізають ферментом рестрикції Хба І та зшивають з конструкцією, бо яка складається з ефективного еукаріотичного промотору, наприклад цитомегаловірусного промотору, Когак погодженої послідовності, послідовності ДНК, що кодує І./-188Р або вірусний І/-18ВР, або їх мутеїни, або рекомбінантні білки, чи їх фрагменти, відповідної 3 нетрансльованої області і сигналу поліаденілування, наприклад сигналу поліаденілування вірусу мавпи 40. Одержану рекомбінантну плазміду ко-трансфікують з хелпер ААМ-плазмідою, наприклад рдАМ/Ай, в клітини ссавців, наприклад 12 93 клітини. Потім культури 65 інфікують аденовірусом в якості хелпер-вірусу, а культуральні супернатанти збирають через 48-60 годин.
Супернатанти фракціонують осадженням сульфатом амонію, очищають в градієнті щільності С8сСі, діалізують, а потім нагрівають при 562С, щоб знищити будь-який аденовірус, в той час як одержаний рекомбінантний ААМ, здатний експресувати І/-188Р або вірусний І/-18ВР, або їх мутеїни або рекомбінантні білки, залишається стабільним на цій стадії.
Досі не встановлено фізіологічну роль розчинних рецепторів цитокінів. Розчинні рецептори зв'язують свої специфічні ліганди і в більшості випадків інгібують їх біологічну активність, як показано на системі ТМЕ (фактор некрозу пухлини) (11, 12). В дуже нечисленних випадках, наприклад 1-6, розчинний рецептор збільшує біологічну активність. Показано, що рекомбінантний розчинний рецептор ТМЕ, також відомий як ТВР (ТМЕ-зв'язувальний білок), запобігає септичному шоку на моделях тварин, тоді як виявлено, що розчинні форми 7/0 рецептора ІЇ-1 справляють повне інгібування розвитку іп мімо алогенної реактивності у мишей-реципієнтів алотрансплантату.
Аналогічно виявлено, що ІІ-188ВР і вірусний ІІЇ-18В8Р. даного винаходу використовують в якості модуляторів активності І/-18, наприклад при діабеті типу !, сепсисі, аутоїмунних захворюваннях, при відторгненні трансплантату, ревматоїдному артриті, запальному захворюванні кишечнику, сепсисі, хронічному гепатиті, 75 псоріазі, хронічному гепатиті та гострому гепатиті. Таким чином, їх можна застосовувати, наприклад при будь-якому захворюванні, при якому ендогенна продукція або екзогенне введення |/-18 викликають захворювання або погіршення стану пацієнта.
Крім того, даний винахід стосується фармацевтичних композицій, які містять фармакологічно прийнятний носій та І/-18ВР або вірусний І/-188Р винаходу, або їх активні мутеїни, рекомбінантні білки і їх солі, функціональні похідні або їх активні фракції.
Далі даний винахід стосується фармацевтичних композицій, які містять фармацевтично прийнятний носій і, наприклад вірусний вектор, такий як будь-який один з названих вірусних векторів на основі ААМ або інший вектор, які експресують ІІ/-188Р або вірусний ІІ/-18ВР чи їх мутеїни, фрагменти або їх рекомбінанті білки і є прийнятними для введення людям та іншим ссавцям з метою досягнення експресії іп мімо ІІ-18ВР або вірусного с 1І-18ВР або їх мутеїнів чи фрагментів або рекомбінантних білків винаходу, тобто для застосування в генній терапії. о
Фармацевтичні композиції винаходу готують для введення змішуванням ІІ -18ВР або вірусного ІІ -18ВР або їх похідних, або векторів, їх експресуючих, з фізіологічними прийнятними носіями і/або стабілізаторами і/або наповнювачами, та готують в дозованій формі, наприклад ліофілізацією в дозованих ампулах. Спосіб введення с зо являє собою будь-який з прийнятих способів введення для подібних агентів і залежить від стану, який лікують, наприклад внутрішньовенно, внутрішньом'язово, підшкірно, шляхом локальної ін'єкції або місцевої аплікації, о або безперервно шляхом вливань і так далі. Кількість активної сполуки, яку вводять, залежить від способу Ге) введення, захворювання, що лікують, і стану пацієнта. Для локальної ін'єкції, наприклад вимагається більш низька кількість білка на вагу тіла, ніж при внутрішньовенному вливанні. о
Відповідно, ІЇ/-18В8Р. або вірусні І/-18ВР, або вектори, які експресують їх іп мімо, показані для лікування ї- аутоїмунних захворювань, діабету | типу, ревматоїдного артриту, відторгнення трансплантата, запального захворювання кишечнику, сепсису, розсіяного склерозу, ішемічної хвороби серця, включаючи гострий серцевий напад, ішемічного ураження мозку, хронічного гепатиту, псоріазу, хронічного і гострого панкреатиту та подібних захворювань, при яких є аберантна експресія ІЇ/-18, що веде до надлишку 1ІІ/-18, або у випадках « 70 ускладнень, зумовлених екзогенно введеним 1-18. шщ с Винахід також включає антитіла проти І/-188Р або вірусного І/-18ВР, а також проти їх мутеїнів, й рекомбінантних білків, солей, функціональних похідних і активних фракцій. Термін "антитіло" означає включення и? поліклональних антитіл, моноклональних антитіл (МАТ), химерних антитіл, ангіїідіотипових (анти-і4) антитіл до антитіл, які мітять в розчинній або зв'язаній формі, і гуманізовані антитіла, а також їх фрагменти, забезпечені за допомогою будь-яких відомих методів, таких як, але не обмежених ними, ферментативне -і розщеплення, пептидний синтез або рекомбінантні технології.
Поліклональні антитіла являють собою гетерогенні популяції молекул антитіл, одержаних з сироватки тварин, іні імунізованих антигеном. Моноклональні антитіла містять по суті гомогенну популяцію антитіл, специфічних до о антигенів, до яких популяція містить в основному однакові епітоп-зв'язувальні ділянки. МАТ одержують у 5ор способи, відомі фахівцям у цій галузі. Див. наприклад, (Копіег апа Міївієїп, Маїшге 256:495-497 (1975); іа Патент США Мо4376110; А!Їйзибреї еї аї., едв., вирга, Нагпом/ апа І апе, Апііродіев: А І арогаїюгу Мапиаї, Соїа з Зргіпд Нагрог І арогаїогу (1988); і Соїїїдап еї аї., едв., Ситепі РгоїосоЇїв іп Іттипоіоду, Сгеепе Рибіїзпіпа
Аввос. апа УМПеу Іпіегесіепсе, М. У., (1992, 1993)), вміст яких наводять в повному обсязі шляхом цитування.
Такі антитіла можуть належати до будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи ІдсС, ДМ, ЧЕ, ЧА, СО і будь-яких їх підкласів. Гібридому, що продукує МАТ даного винаходу, культивують іп мійго, іп зйи або іп мімо. Продукція високих титрів МАТ іп мімо або іп зйши робить це зараз більш прийнятним способом одержання. іФ) Химерні антитіла являють собою молекули, різні частини яких одержують від різних видів тварин, такі як ко молекули, що мають варіабельну область, одержану від МАТ миші, і констатну область імуноглобуліну людини.
Химерні антитіла використовують головним чином для відновлення імуногенності при застосуванні і для бо Збільшення виходу при продукції, наприклад, коли МАТ миші мають більш високий вихід з гібридом, але більш висока імуногенність у людей, так що застосовують химерні МАТ людина-миша. Химерні антитіла і способи їх одержання відомі у цій галузі. (Сарійу еї а, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 81: 3273-3277 (1984); Могтізоп еї аі., Рос. Май. Асад. Зсі. ОБА 81: 6851-6855 (1984); Воціаппе еї аїЇ., Майте 312: 643-646 (1984); Сабрійу еї аі., Заявка на Європейський Патент 125023 (опублікована 14 листопада, 1984); Мецбрегдег еї аї!., Майшге 314: бе 268-270 (1985); Тапідисні еї ам. Заявка на Європейський Патент 171496 (опублікована 19 лютого, 1985);
Моїгтізоп еї аІ., Заявка на Європейський Патент 173494 (опублікована 5 березня, 1986); Меийибегдег еї аІ., РСТ міжнародна Заявка УУО 8601533, (опублікована 13 березня, 1986); Кидо еї аіІ., Заявка на Європейський Патент 184187 (опублікована 11 червня, 1986); Могтізоп еї аІ., Заявка на Європейський Патент 173494 (опублікована 5 березня, 1986); Западап еї аї., 9У. Іттипії. 137: 1066-1074 (1986); Кобріпзоп еї аІЇ., Міжнародна Заявка УУО 9702671 (опублікована 7 травня 1987); Пе еї аїЇ., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 84: 3439-3443 (1987); З!йп еї аІ., Ргос. Май). Асайд. Зсі. ОБА 84: 214-218 (1987); Вецег еї аї., Зсіепсе 240: 1041-1043 (1988); і Нагіом 5. Іапе,
Апііродієг: А І арогаїгу Мапаиаї, зирга). Ці посилання вводять в опис в повному обсязі шляхом цитування.
Антиідіотипове (анти-І4) антитіло є антитілом, що розпізнає унікальні детермінанти, звичайно асоційовані з ангиген-зв'язувальним сайтом антитіла. Ід-антитіло одержують імунізацією тварини того ж виду і генетичного 7/0 типу (наприклад, лінія мишей) в якості джерела МАТ з МАТ, до якого анти-Іід одержаний. Імунізована тварина розпізнає і відповідає на ідіотипові детермінанти імунізуючого антитіла шляхом продукування антитіл до цих ідіотипових детермінантів (анти-Ід-антитіло). Див., наприклад, Патент США Мо4699880, який наводять в описі шляхом цитування.
Анти-Ід-антитіло також використовують в якості "імуногену", щоб викликати імунну відповідь у ще іншої /5 тварини, що продукує так зване анти-анти-Ід-антитіло. Анти-анти-Іа є ідентичним за епітопом до вихідного МАТ, що індукує анти-І4. Таким чином, шляхом використання антитіл до ідіотипових деремінантів МАТ можливо ідентифікувати інші клони, які експресують антитіла ідентичної специфічності.
Відповідно, МАТ одержані проти І/-18ВР і споріднених білків даного винаходу, використовують, щоб індукувати анти-М-антитіла у відповідних тварин таких як ВАЇВ/с миші. Клітини селезінки від таких імунізованих мишей застосовують для одержання анти-і4 гібридом, що секретують анти-Ій МАТ. До того ж, анти-Ід МАТ зв'язують з носієм таким гемоціанін лімфи слимака (КІН) і застосовують для імунізації додаткових
ВАГ В/с мишей. Сироватка від цих мишей містить анти-анти-І4 антитіла, які мають зв'язувальні властивості вихідного МАТ специфічного відносно епітопу ІІ -18ВР або епітопів вірусного ІІ -18ВР.
Анти-ІА МАТ, таким чином, мають власні ідіотипові епітопи або "ідіотопи" структурно подібні до сч ов оцінюваного епітопу, такому як 1ІІ.-18вР або вірусний ІІ -18В Р.
Термін "гуманізоване антитіло" означає включення, наприклад антитіл, які одержують маніпулюванням з і) антитілами миші за допомогою способів генетичної інженерії для того, щоб вони виявилися більш сумісними з організмом людини. Такі гуманізовані антитіла характеризуються зниженою імуногенністю і покращеною фармакокінетикою у людей. Їх одержують за допомогою технологій, відомих у цій галузі, таких як описують, с зо Наприклад для гуманізованих анти-ТМЕ антитіл в |МоІесціаг Іттипо|оду, Мої. 30, М 16, 1443-1453, 1993).
Термін "антитіло" також означає включення обох інтактних молекул, а також їх фрагментів таких як, ісе) наприклад Раб і К(аб)2, що зв'язують антиген. Фрагменти Раб і К(ар)2, без фрагмента Ес інтактного антитіла, со швидше вилучаються з циркуляції і характеризуються меншим неспецифічним тканинним зв'язуванням, ніж інтактне антитіло (МуУані еї аїЇ., 9У. Мисі. Мей. 24: 316-325 (1983). Слід оцінити, що Рар і Р(абр)2 та інші о фрагменти антитіл, корисні в даному винаході, використовують для визначення і кількісної оцінки ІЇ/-188Р. або ї- вірусного ІЇ/-18ВР, згідно з способами, наведеними в описі для інтактних молекул антитіл. Такі фрагменти звичайно одержують шляхом протеолітичного розщеплення, використовуючи ферменти такі як папаїн (для одержання фрагментів Раб) або пепсин (для одержання фрагментів Е(аб)2).
Як зазначено, антитіло є "здатним зв'язувати" молекулу, якщо воно здатне специфічно взаємодіяти з « молекулою, щоб внаслідок цього зв'язати молекулу з антитілом. Термін "епітоп" означає, що частина будь-якої пт») с молекули здатна бути зв'язаною антитілом, яка також розпізнається таким антитілом. Епітопи або "антигенні детермінанти" звичайно складаються з хімічно активних поверхневих груп молекул таких як амінокислоти або ;» бокові ланцюги цукрів, і мають особливі характеристики тривимірної структури, а також певні характеристики заряду. "Антиген" являє собою молекулу або частину молекули, здатну бути зв'язаною антитілом, яке додатково -І індукує тварину до продукції антитіла, здатного зв'язувати епітоп такого антигену. Антиген може мати один чи більше епітопів. Зазначена специфічна реакція призначена, щоб вказати, що антиген взаємодіє у високо 1 вибірний спосіб з йому відповідним антитілом і не взаємодіє з множиною інших антитіл, які викликаються іншими о антигенами.
Антитіла, включаючи фрагменти антитіл, корисні в даному винаході, використовують для кількісного і
Ме, якісного визначення І/-188Р або вірусного І/-188Р або споріднених білків у зразку або для визначення
Ге присутності в клітинах, що експресують такі білюи даного винаходу. Це здійснюють імунофлуоресцентними методами, що застосують флуоресцентно мічені антитіла (див. нижче), в поєднанні з світловою мікроскопією, проточною цитометрією і флуориметричним визначенням.
Антитіла (або їх фрагменти), корисні в даному винаході, застосовують гістологічно для імунофлуоресцентної та імуноелектронної мікроскопії, для визначення іп зіш ІЇ-18ВР або вірусного ІЇ-188Р. або споріднених білків
Ф) даного винаходу. Визначення іп зіш включає взяття гістологічного зразка у пацієнта і забезпечення такого ка зразка міченим антитілом даного винаходу. Більш прийнятно антитілом забезпечують нанесенням або приєднанням міченого антитіла (або фрагменту) до біологічного зразка. Застосування такого способу зробило бо Можливим визначення не тільки присутності 1ІІ-188Р або вірусного І/-18В8Р. або споріднених білків, але також визначення його розподілу в досліджуваній тканині. Застосовуючи спосіб даного винаходу кожен з фахівців у цій галузі швидко помітить, що будь-який з великої різноманітності гістологічних методів (таких як процедури забарвлення) можна модифікувати для проведення подібного визначення іп зйи.
Такий аналіз для ІІ-18ВР або вірусного ІІ-18ВР або споріднених білків даного винаходу звичайно включає в 65 себе інкубацію біологічного зразка такого як біологічна рідина, екстракт тканини, свіжоодержані клітини такі як лімфоцити або лейкоцити або клітини, які інкубують в культурі тканини, в присутності ефективно міченого антитіла, здатного ідентифікувати ІІ-18ВР або споріднені білки, і визначення антитіла за допомогою будь-якої з ряду технологій, добре відомих у цій галузі.
Біологічний зразок обробляють твердофазною підкладкою або носієм таким як нітроцелюлоза або твердою підкладкою або носієм, які імобілізують клітини, клітинні частинки або розчинні білки. Підкладку або носій потім промивають відповідним буфером з подальшою обробкою ефективно міченим антитілом відповідно до цього винаходу. Твердофазну підкладку або носій потім промивають буфером другий раз, щоб вилучити незв'язані антитіла. Кількість зв'язаної мітки на твердій підкладці або носії визначають узвичаєними методами.
Терміни "твердофазна підкладка", "твердофазний носій", "тверда підкладка", "твердий носій", "підкладка" 70 або "носій" означають будь-яку підкладку або носій, здатні зв'язувати антиген або антитіла. Добре відомі підкладки або носії включають скло, полістирол, поліпропілен, поліетилен, декстран, найлон амілази, природні і модифіковані целюлози, поліакриламіди, габро і магнетид. Для цілей даного винаходу, носій може бути розчинним деякою мірою або нерозчинним. Матеріал підкладки має будь-яку можливу структурну конфігурацію такої довжини, що сполучена молекула здатна зв'язувати антиген або антитіло. Так, конфігурація підкладки або 7/5 носія є сферичною як шарик, або циліндричною як внутрішня поверхня дослідної пробірки, або як зовнішня поверхня стрижня. Альтернативно, поверхня є плоскою як аркуш, тест-смужка тощо. Більш прийнятні підкладки і носії включають гранули полістиролу. Фахівцям в цій галузі відомі численні інші носії для зв'язування антитіла або антигену, або вони зможуть встановити те ж саме шляхом звичайного експериментування.
Зв'язувальну активність даної партії антитіл відповідно до цього винаходу визначають згідно з добре 2о Відомими способами. Фахівці у цій галузі встановлюють ефективні і оптимальні умови дослідження для кожного визначення шляхом звичайного експериментування.
Інші стадії, такі як промивання, перемішування, струшування, фільтрування і таке інше додають до дослідження, коли необхідно в певній ситуації.
Одним з способів, у який відповідно до цього винаходу антитіло ефективно мітять, є зв'язування антитіла з сч ов ферментом і застосування в імуноферментному аналізі (ЕІА). Цей фермент, в свою чергу, при експозиції з відповідним субстратом, взаємодіє з субстратом з утворенням хімічного компонента, який визначають, і) наприклад за допомогою спектрофотометричного, флуориметричного або візуального способів. Ферменти, які використовують для ефективного мічення антитіл, включають, але не обмежуються, малатдегідрогеназу, стафілококову нуклеазу, дельта-5-стероїд-ізомеразу, алкогольдегідрогеназу, су зо альфа-гліцерофосфатдегідрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, аспарагіназу, піранозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, ікс, глюкозо-6-фосфат-дегідрогеназу, глюкоамілазу і ацетилхолінеестеразу. Визначення здійснюють со колориметричними методами, в яких застосовують хромогенний субстрат для ферменту. Визначення також проводять шляхом візуального порівняння міри ензиматичної реакції субстрату порівняно з аналогічно о з5 приготованими стандартами. ча
Визначення виконують, використовуючи будь-який з цілого ряду інших імунологічних аналізів. Наприклад, радіоактивним міченням антитіл або фрагментів антитіл, визначають І,/-188Р. або вірусний ІЇ/-188Р. шляхом застосування радіоїмунного аналізу (КІА). Гарний опис КІА є в (І арогаїгу Тесппідциез апа Віоспетівігу іп
Моїіесшіаг Віоіоду, Бу МУогК, Т. 5. еї аіІ.,, Мой Нойапа Рибіїзпіпд Сотрапу, ММ (1978) з особливим посиланням « 70 на главу, що має назву "Ап Іпігодисіоп ю Кадіоїттипо Авзау апа Кеїаїей Тесппіднез" Бу Спага, т.) введену У с до опису цитуванням. Радіоактивний ізотоп визначають за допомогою таких засобів як застосування гамма-лічильника або сцинтиляційного лічильника або шляхом авторадіографії. ;» Відповідно до цього винаходу антитіло мітять флуоресцентною сполукою. Коли флуоресцентно мічене антитіло піддають дії світла, належної довжини хвилі, його присутність визначають за флуоресценцією. Звичайно найбільш використовуваними сполуками для флуоресцентного мічення є флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін, -І фікоеритрин, фікоціанін, алофікоціанін, о-фталевий альдегід та флуорескамін.
Антитіла також ефективно мітять, використовуючи метали, що емітують флуоресценцію, такі як 792Еу або і-й інші з серії лантанидів. Ці метали приєднують до антитіла, використовуючи такі метал-хелатуючі групи як (ее) діетилентриамінпентаоцтова кислота (ЕТРА).
Антитіло ефективно мітять зв'язуванням його з біотином. Біотиніловане антитіло потім визначають за б допомогою авідину або стрептавідину, приєднаних до флуоресцентної сполуки або ферменту, такому як
Кз пероксидаза, або до радіоактивного ізотопу і подібних.
Також антитіло ефективно мітять, приєднуючи його до хемілюмінесцентної сполуки. Присутність хемілюмінесцентноміченого антитіла потім визначають, детектуючи люмінесценцію, що виникає в ході хімічної реакції. Прикладами особливо корисних люмінесцентно мічених сполук є лумінол, ізолумінол, тероматичний ефір акридину, імідазол, сіль акридину і ефір щавлевої кислоти.
Ф, Подібним чином, біолюмінесцентну сполуку використовують для мічення антитіла даного винаходу. ко Біолюмінесценція являє собою вид хемілюмінесценції, виявленої в біологічних системах, в яких каталітичний білок збільшує ефективність хемілюмінесцентної реакції. Присутність біолюмінесцентного білка визначають за бо наявністю люмінесценції. Для мічення важливими біолюмінесцентними сполуками є люциферин, люцифераза і екворин.
Молекулу антитіла даного винаходу адаптують для застосування в кількісному імуноаналізі, також відомому як "два-сайти" або "сендвіч-аналіз". В типовому кількісному імуноаналізі велика кількість немічених антитіл (або фрагменту антитіла) зв'язують з твердою підкладкою або носієм і додають ефективно мічені розчинні 65 антитіла, щоб зробити можливим виявлення і/або кількісний аналіз потрійного комплексу, утвореного між твердофазним антитілом, антигеном і міченим антитілом.
Типовий і більш прийнятний кількісний імуноаналіз включає "прямий" аналіз, в якому антитіло, зв'язане з твердою фазою, спочатку контактує з тестованим зразком, щоб витягти антиген з зразка шляхом утворення подвійного комплексу твердофазне антитіло-антиген. Після відповідного періоду інкубації тверду підкладку або носій промивають для вилучення залишків рідкого зразка, включаючи антиген, що не прореагував, якщо це взагалі вимагається, а потім здійснюють контакт з розчином, що містить невідому кількість мічених антитіл (що функціонує як "репортерна група"). Після другого періоду інкубації, протягом якого мічене антитіло утворює комплекс з антигеном, зв'язаним з твердою підкладкою або носієм за допомогою неміченого антитіла, тверду підкладку або носій промивають другий раз для вилучення мічених антитіл, що не прореагували. 70 В іншому типі імуноаналізу - "сендвіч-аналізі? який успішно проводять з антигеном даного винаходу, використовують так звані "одночасний" і "зворотний" аналіз. "Одночасний" аналіз включає в себе одну стадію інкубації, коли антитіло, зв'язане з твердою підкладкою або носієм, і мічене антитіло - обидва додають до тестованого зразка водночас. По завершенні інкубації, тверду підкладку і носій промивають для вилучення залишку рідкого зразка і міченого антитіла, не включеного до комплексу. Присутність міченого антитіла, асоційованого з твердою підкладкою або носієм, визначають за допомогою узвичаєного "прямого" сендвіч-аналізу.
У "зворотному" аналізі використовують ступінчасте додання спочатку розчину міченого антитіла до рідкого зразка, за яким йде додання неміченого антитіла, зв'язаного з твердою підкладкою або носієм, після відповідного періоду інкубації. Після другої інкубації тверду фазу промивають узвичаєним способом для 2о вилучення залишку досліджуваного зразка розчину міченого антитіла, що не прореагувало. Визначення міченого антитіла, зв'язаного з твердою підкладкою або носієм, здійснюють як у випадку "одночасного" і "прямого" аналізів.
Даний винахід також передбачає молекули ДНК, які кодують будь-які з білків даного винаходу, що описані вище, репліковувані носії експресії, що містять будь-які такі молекули ДНК, клітини-хазяїни, трансформовані сч будь-яким таким експресуючим носієм, включаючи прокаріотичні і еукаріотичні клітини-хазяїни, більш прийнятно клітини СНО. Винахід також включає в себе спосіб для продукції експресуючих векторів, що кодують будь-який з і) білків даного винаходу, з метою їх експресії у людей та інших ссавців.
У винахід також включають спосіб одержання будь-якого з білків даного винаходу шляхом культивування трансформованої клітини відповідно до цього винаходу і повернення білка, кодованого молекулою ДНК, і с зо експресуючого носія в таку трансформовану клітину-хазяїна.
Окрім використання ІІ -18ВР або вірусного ІІ -18ВР для модулювання активності ІІ -18, їх також застосовують ісе) для очистки самого ІЇ/-18. З цією метою І/-188Р або вірусний І/-188Р зв'язують з афінною колонкою і со пропускають неочищений ІІ -18. Потім ІІ -18 витягають з колонки шляхом, наприклад елюції при низькому рН.
Далі винахід ілюструють наведеними нижче необмежувальними прикладами: о
Приклад 1 ї-
Виділення білка, що зв'язує ІІ -18
І/-18 ЕЕ. соїї (2,5мг, Рергоїесп, Му) приєднують до АйЙідеІ-10 (0О,бмл, ВіоКасд), згідно з інструкціями виробника, і упаковують в колонку. Неочищений білок сечі (сконцентрованої в 1000 разів, 5Х0Омл) наносять на колонку при низькій швидкості О0,25мл/хвилину. Колонку промивають 250мл 0,5М Масі в фосфатному буферному « розчині (РВБ5). Зв'язані білки потім елююють 25ММ лимонної кислоти рН 2,2 і бензамідином (1мММ), негайно з с нейтралізують 1М Ма»СОз. Збирають фракції по 1Імл. Фракції аналізують за допомогою 5О5-РАСЕ і забарвлення сріблом. Білок, що зв'язує ІЇ/-18, елююється в фракціях 2-8 у вигляді білка 40000 Дальтон (Фіг.1). В зоні ;» 40кДа, що відповідає І/-188Р, при забарвленні сріблом виявляється чіткий жовтий колір. Аналізують різні фракції шляхом поперечного зв'язування з 125І-ІЇ -18, 505-РАСЕ і авторадіографії, як описують в Прикладі 2.
Білок, що зв'язує ІІ--18, виявляють в фракціях 2-8, елюйованих з колонки з ІІ-18-агарозою (Фіг.2). -І Приклад 2
Поперечне зв'язування афінно-очищеного ІІ -18ВР З міченим 1-18 і-й Зразки (4Омкл) ІІ-188Р після першої стадії очистки інкубують (70 хвилин при 42) з 7251-ІЇ -18 (5000000 срт - (ее) кількість імпульсів на хвилину). Дисукцинімідил суберат (055), розчинений в диметилсульфоксиді (Ме»50, б 50 20ОММ) , додають до залишкової концентрації 2мММ і суміш залишають протягом 20 хвилин при 42. Реакцію зупиняють доданням 1 трис-НСЇ, рН 7,5, і 1М Масі до залишкової концентрації 100мММ. Додають зразок буферу,
Ко) що містить дитіотрейтол (ОТТ, 25мМ кінцева) і суміші аналізують в ЗО5-РАСЕ (7,595 акриламід) з подальшою авторадіографією (Фіг.2).
Особливу зону з молекулярною масою 58кДа, яка ймовірно містить білок «40кДа поперечно-зв'язаний 3 1251-41-18 -20кДа, виявляють в фракціях, елюйованих з ІІ/-18- афінної колонки (Доріжки 2 і 3), але не в
ГФ! промивній рідині з колонки (Доріжка 1), що містить всі інші неочищені білки сечі.
Приклад З ю Аналіз послідовності білка
Елюйовані фракції з афінної колонки Прикладу 1 поділяють за допомогою 505-РАСЕ (1095 акриламід) за 60 невідновлювальних умов, електроблотингу на РМОЕ мембрані (Рго-Віої, Арріїєї Віозувіетв, О5А). Мембрану забарвлюють кумасі блакитним, вирізають зону «40ОкДа і проводять аналіз білкової послідовності за допомогою мікросеквенатора Ргесізе (Арріїей Віозувіетв, ОБА.). Одержано таку основну послідовність: б5 рр НВ. 9 Ях жожсжожежоя Ж 19 де х являє собою ще не встановлені амінокислоти. Крім того, одержано мінорну послідовність: ю Ан Ж кН ВАК В,
Через цю подвійну послідовність неможливо одержати дані відносно більш довгої послідовності. Мінорну 75 послідовність ідентифікують як фрагмент дефенсину людини (Мо доступу р11398), починаючи з 65 амінокислоти дефенсину. Основну послідовність не зв'язують з жодним відомим білком, грунтуючись на дослідженнях всіх доступних баз даних в МУВІ і ТІК за допомогою біавзір і їріазіп програм дослідження.
Для того, щоб одержати більш довгу і більш точну послідовність і для того, щоб ідентифікувати передбачувані залишки цистеїну, іншу аліквоту фракції, елюйованої з колонки ІІ -18-агарози, відновлюють ОТ в
М гуанідині НСІ, проводять реакцію з 4-вінілліридином, знесолюють за допомогою мікроультрафільтраційного пристрою (ШІгаїгее, сшіої 10000 Юаййопз, МійПроге) і проводять визначення первинної структури короткого фрагменту молекули білка. Після циклу Мо1 секвенування, фільтер взаємодіє з о-фталевим альдегідом, щоб блокувати всі М-кінцеві поліпептиди інші, ніж Рго. У цей спосіб одержують лише основну послідовність, як таке: 2 ТРувохххАа ХАБУВОТКОР СРБОРЕУКВА. АКОСОАТЕИЄ о - 18. 25 "0 12 фй-йвте ЖеУбуої У-Маї; В-бєв» Шебіп, Хнйе ветайовленої «со -Аїат ВеАжЯІ Кедуви Педяри СеОуво БеБре; Серед ЖеСІШ со
В циклах 6, 7, 8 і 11 одержують низький рівень сигналу Тиг. Через цей низький рівень його розглядають Іс) більш обережно, щоб не позначити даний амінокислотний залишок в названих циклах. їм
Одержана послідовність значно відрізняється від послідовності будь-якого іншого відомого білка, що встановлено дослідженням баз даних за структурою білка. Однак дослідження бази даних ТІК за допомогою іріазіп програми дослідження забезпечило файл кДНК, позначений ТНС12801, відкрита рамка зчитування (218 кодон) якого, коли транслюється, містить послідовність високо гомологічну М-кінцевій послідовності ІІ -188Р. « 20 Цим подана гомологія: ш-в с Я хна ТРУЗОХККАКХАВУВЯТКОРСРООРРУКРААКОСВАВЕУВ. ся 00
З МІТЛУКАТЯУХОТТТААТАЗУВВТКОРСВВОВРУКРАДКОСТАСЕУТИВЕ 300 -І (Верхня послідовність (1-40) являє собою послідовність ІІЇ-18ВР, виділеного згідно з винаходом; нижня послідовність (51-100) одержана трансляцією кКДНК з файлу ТНС123801 ТІСК). о Гадана білкова послідовність, одержана транслюванням файлу ТНС12801, викликає сумніви щодо залишків
Го) 2 і 4 І-188Р. Вона підтверджує ідентичність амінокислотних залишків 6, 7 і 8 ІЇ/-18В8Р як ТиНг і, по-видимому, підходить також для залишку 11.
Ме. Приклад 4
ГЯ6) І--188Р є глікопротеїном
Аліквоту (О0,Змл) елюйованих фракцій Прикладу 1 очищають далі гель-хроматографією на колонці З!ирегозе 12 (130см, Рпагтасіа, Зм'едеп). Колонку попередньо врівноважують іелююють фосфатним буферним розчином і вв азидом натрію (0,0275) при швидкості потоку 0,5мл/хвилину і збирають фракції по мл. Білок, що зв'язує 1Ї-18, елююється в фракціях 20-25 як білок 740000 Дальтон, що встановлюють методом 5ЗО5-РАСЕ і забарвленням
Ф) сріблом. Зразок, що містить білок «40000 Дальтон (фракція 23, 5Омкл, 5Онг білка) взаємодіє з М-глікозидазою Е ко (РМО-азе КЕ, ВіоКаай) згідно з інструкцією. Коротко, аліквоту денатурують кип'ятінням в присутності 590 ЗО5 протягом 10 хвилин, 1007 буферу (2,5мкл), 1095 МР-40 (2,5мкл) і РМІСавзе Е (мкл), 1 година при 3720. Зразок бо аналізують методом 5О5-РАСЕ (1095 акриламід) за невідновлювальних умов і порівнюють з негідролізованим
І/-18ВР з такої ж фракції з Зирегозе 12. Показано, що зона 40ОкДа ІІ -18ВР зникає з фракції, обробленої РМСазе.
Виявляють нові зони, які відповідають ЗОкДа (навіть вище зони РюбСавге) і 20кДа. Зникнення зони 4ОкДа вказує, що ця зона є М-глікозилованим білком.
Приклад 5 65 Блокування біологічної активності ІІ -18 за допомогою ІІ -188Р
Здатність І/-18ВР, виділеного з сечі, блокувати активність І/-18 визначають шляхом вимірювання індукованої ІЇ/-18 продукції ІЕМ- в мононуклеарних клітинах. ІЇ/-18 індукує ІЕМ-, якщо додають разом або з низькими концентраціями І Р, ІІ -12, 1-2, або з іншими стимуляторами. Активність ІІ-18 тестують в спленоцитах миші, в мононуклеарних клітинах периферійної крові (РВМС) людини і в лінії КО-1 клітин людини. Клітини селезінки одержують від здорових мишей, промивають, суспендують в середовищі КРМІ 1640, доповненому 1095 фетальною бичачою сироваткою при 5102 клітин/мл. 1,0мл культури стимулюють І РЗ (або 0,5 або мкг/мл) разом з рекомбінантним 1-18 людини або миші (або 0,5 або 5нг/мл). ІІ -18-зв'язувальний білок людини (0/5 або
БОнг/мл) додають до рекомбінантного ІІ-18 перед доданням до клітин селезінки. Після культивування протягом 24 годин, клітини селезінки піддають трьом циклам заморожування (-702С) і танення (кімнатна температура), 70 клітинний дебріс вилучають центрифугуванням, а супернатант аналізують щодо ІЕМ-, використовуючи
ЕПІЗА-набори для ІЄМ- миші (Епдодеп). Як показують на Фіг.ЗА, І/-18ВР. блокує активність пи -18 (людини) в спленоцитах миші у доза-залежний спосіб. На відміну від цього, використовуваний в якості контролю розчинний рецептор інтерферона-/« не справляє ніякої дії. Аналогічно, І/-188р людини інгібує активність рекомбінантного ІЇ/-18 миші, дозволяючи припустити, що І/-188Р людини розпізнає І/-18 миші (Фіг.3В). В 75 спленоцитах миші високі концентрації І Р5 індукують ендогенний 1-18, приводячи до продукції ІРМ-. Дійсно, індукція ІМЕ- за допомогою І! РБ5 також інгібується І/-18ВР сечі (Фіг.3С). Конканавалін А (Соп А) активує
Т-клітини, щоб продукувати ІБМ- за відсутності І/-18 (13). Дійсно, індукція ІРЕМ- конканаваліном Ф не інгібується ІЇ-18ВР навіть при високих концентраціях (Фіг.ЗД). Ці дані демонструють, що ІЇ/-18ВР. є специфічно інгібітором біоактивності І/-18 скоріше, ніж неспецифічним інгібітором продукції ІЕМ-. І /-18ВР також інгібує активність ІЇ-18 людини в КО-1 клітинах людини, індуковану поєднанням ІІ -18 і ТМЕ-' (Фіг.ЗЕ).
Наведені вище дані демонструють, що І/-18ВР. сечі інгібує активність І/-18 людини, а також миші, що оцінюють шляхом ко-індукції ІЕМ- в мононуклеарних клітинах людини і миші. Концентрація ІІЇ-18ВР, що знижує активність І/-18 на 29095, є порівнянною з концентрацією самого ІЇ-18, дозволяючи припустити високу спорідненість взаємодії між цими двома білками. с
Приклад 6 о
Виділення клонів кКДНК, що кодують ІІ -188Р.
Тотальна РНК з юркатних Т-клітин (СКІ 8163, Атегісап Туре Сийиге СоПесіоп) зворотно-транскрибована з
Зирегзсгірі Кпазе Н зворотною транскриптазою (Сірсо-ВКІ) і довільними праймерами (Рготеда, Мадізоп УМІ).
Потім одержані фрагменти кКДНК ампліфікують шляхом РСК, використовуючи Тад-ДНК полімеразу (Зідта) і с праймери, що відповідають нуклеотидам 24-44 (смисловий) і 500-481 (зворотний) клону ТНС12801 ТІК. «со
Ампліфікацію проводять в ЗО циклах відпалу (552С, 2 хвилини) і елонгації (702С, 1 хвилина). Одержані продукти
РСВ поділяють методом електрофорезу в агарозному гелі (195), елююють і клонують з РОЕМ-Теазу ТА вектором 00 клонування (Рготеда). ДНК з індивідуальних клонів секвенують з 17 і ЗРб праймерами. ю
Одержаний фрагмент 477 пар основ мітять ЗР шляхом рендом-праймування. Цей зонд використовують для скринінга різних КДНК людини і геномних бібліотек. Подвійні нітроцелюлозні фільтри піддають гібридизації з - зондом при 602С в буфері, що містить 6 х З55С, 10х розчин Денхардта, 0,196 ЗО5 і 100мкг/мл ДНК сперми лосося.
Фільтри промивають і витримують протягом ночі при -809С на плівці Кодак ХАК. Подвійні позитивні клони очищають з колоній. Плазміди вирізаються з лямбда-рРСЕУ9О клонів і плазміди самолігуються. КДНК з інших « бібліотек виділяють згідно з інструкціями авторів. Автоматизований аналіз послідовності ДНК з виділених 7 70 клонів проводять на секвенаторах моделей 373А і 377 (Арріїей Віозузіетв), використовуючи смисловий і с антисмисловий праймери. Використовують стандартні протоколи для цих процедур копіювання (33). "з Проведено скринінг таких бібліотек: бібліотека КДНК моноцитів людини, сконструйована в лямбда-рСЕУ9 векторі клонування (15), люб'язно надана Т. Мікі бібліотека кКДНК юркатних лейкозних Т-клітин людини, бібліотека КДНК лейкоцитів периферійної крові людини, всі від Сіопіесп (Раю АКо«СА). Геномна бібліотека 75 плаценти людини в лямбда- РІХ ІІ векторі одержана від бігаіадепе (І а ХдоїІа, СА). ї Одержані і охарактеризовані всі клони кКДНК, які відповідають чотирьом різним варіантам сплайсинга 1 І/-18ВР. Всі варіанти сплайсинга кодують завбачені розчинні секретовані білки. Найбільш переважний варіант ((/-18О8Ра) має відкриту рамку зчитування з 192 кодонів, що кодує сигнальний пептид з 28 амінокислотних залишків з подальшим зрілим гаданим ІІ-18ВРа, перші 40 залишків якого (ЗЕО ІЮ МО: 10) повністю сумісні з (є) 50 М-кінцевою білковою послідовністю І/-188Р сечі (ЗЕО ІЮО МО: 2). Положення залишків цистеїну дозволяє припустити, що цей поліпептид належить до суперсімейства імуноглобулінів (Ід). Кожен з чотирьох залишків сіп їз в зрілому ІІ -18ВРа є можливою ділянкою М-глікозилування. Інші три варіанти сплайсинга ІІ -18ВР наявні в значно меншій кількості.
Інша кДНК 1/-188РБЬ 1т.п.н. кодує зрілий білок з 85 амінокислотних залишків (ЗЕО ІО МО: 4). Третій 25 варіант, І. -18ВРс, представляється 2,3т.п.н. КДНК, що кодує зрілий ІІ -18ВР з 169 амінокислотних залишків (ЗЕ
ГФ) ІО МО: 6). Четвертий варіант, ВІ -18ВРа, кодує зрілий ІІ-18ВР. з 133 амінокислотних залишків (ЗЕО ІЮ МО: 8). т Внутрішньоекзонний сплайсинг відбувається у двох сайтах вздовж про-мРНК. Ці явища і додатковий 5' екзон в
І-18ВРа приводять до З різних 5 ОТ в різних клонах кКДНК. Тому цілком можливо, що різні варіанти І/-18В8Р утворюються у відповідь на певні сигнали регулювання транскрипції. 60 Досі не виявлено жодної кДНК, що кодує рецептор з трансмембранним доменом.
Приклад 7
Конструкція експресуючого вектора ссавців, продукція реком-бінантного І/-18ВР і оцінка біологічних активностей рекомбінантного ІІ -188Р в5 Кодуючу область кКДНК ІІ -18В8Ра ампліфікують шляхом РСК з смисловим праймером
Ж ТАТЕТСТАВАВССАССВІСАСАСАСЛАЄТОВАСАССИА та зворотним праймером: | о
Б'АТАТСТАВАЯ ТАТ ОАТОВ СВТ СА ТОАТ ОА ТоТ ост тоРОВАСТОС
Продукти РСК вирізають за допомогою Хба 1 та клонують в сайті Хба І РЕР-ВО5 експресуючого вектора (25), щоб одержати рРЕБ-ВО5-1ІІ -18ВРа. Конструкції підтверджують секвенуванням ДНК. 70 Серії 6107 СО57 клітин в 1ї4мл ТО-буферу, що містить плазмідну ДНК рЕБ-ВОЗ8-ІІ-18ВРа (1Омкг) і
ДЕАЕ-декстран (12Омкг), інкубують протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, як описують (35). Клітини потім промивають ДМЕМ-1095 фетальна бичача сироватка, культивують протягом 4 годин в ДМЕМ-10, промивають та інкубують протягом 3-5 днів в безсироватковому середовищі ДМЕМ. Культуральне середовище збирають, концентрують в 6 разів ультрафільтруванням (10 КО сцоїй) і виділяють ІІ -І8ВР-НізЗ на колонці Таоп 75 (Сіопіесі) з імідазолом в якості елюенту згідно з інструкцією авторів.
Імунологічну перехресну реактивність сечового і СО57-експресованого ІІЇ-18В8Р оцінюють так: ІЇ/-18ВР. сечі (Бмкг) мітять 725| у спосіб з хлораміном Т. Супернатанти СО57 клітин (250мкл) змішують (1 година, кімнатна температура) з антитілами до ІІ-18ВР сечі, розбавляють 1:1000 в забуференому фосфатом розчині (РВ5), 0,0595 твіні 20 і 0,595 бичачому сироватковому альбуміні (Ууазп Вийег). Потім додають ІІ-18ВР. сечі (109 імпульсів на хвилину) і через 1 годину додають білок-С-зерпагозе (20мкл). Суміш суспендують (1,5 години, 42С), потім гранули ізолюють і промивають Зх У/азп Випбег і раз в РВ5. Гранули елююють буфером для зразка, поділяють методом ЗОБ-РАСЕ (1095 акриламід) у відновлювальних умовах з подальшою авторадіографією.
І/-188Ра рухається у вигляді однієї зони на 50О5-РАСЕ з забарвленням сріблом за відновлювальних і сч невідновлювальних умов та має таку ж уявну молекулярну масу, як маса ІІ -18ВР сечі (дані не наведено). При аналізі послідовності білка цього препарату виявляють таку ж М-кінцеву послідовність як послідовність ІІ -188Р. (о) сечі, вказуючи, що останній не деградується на М-кінці.
Імуноблотинговий аналіз ІЇ-18ВР. з антитілами, одержаними проти І/-18В8Р сечі, виявляє зону з такою ж молекулярною масою як маса білка сечі. Крім того, використовуючи імунопреципітацію з подальшими ЗОЗ-РАСЕ сч зо | авторадіографією, показують, що 1ІІ-198Ра здатний витісняти 729І-/-188Р сечі з комплексу з антитілами.
Тому, І--18ВРа структурно відповідає ІІ -18ВР сечі. ісе)
Досліджують здатність неочищеного і очищеного ІІ-18ВРа інгібувати біологічну активність 1-18. ІЇ-188Ра со інгібує у доза-залежний спосіб індукувальну ІЕМ- активність ІІ -18 людини і миші в спленоцитах миші, РВМС та в лінії КО-1 клітин людини (Фіг.9). о
Результати різних біодосліджень, а також аналіз зміни рухливості (Приклад 8) показують, що інгібування ї- активності ІЇ-18 є властивістю, притаманною клонованому ІЇ-18ВР, а не властивістю супутніх домішок в І/-188Р сечі, таких як фрагмент дефенсину, що ко-елююється.
Приклад 8
Аналіз зміни електрофоретичної рухливості «
Вивчають вплив сечового і рекомбінантного ІІ-18ВР на індуковану ІЇ-18 активацію МЕ-КВ в КО-1 клітинах ств) с людини. КО-1 клітини людини (4109 в їмл ЕМРІ) стимулюють або ни -18 (людини) (1Онг/мл), або пи -18, ц попередньо змішаним з ІІ-18ВР (20 хвилин, кімнатна температура). Після 20 хвилин при 372С, клітини три рази ,» промивають охолодженим льодом РВ5 і негайно заморожують в рідкому азоті. Клітинні осади повторно суспендують в трикратному пакувальному колонковому об'ємі буферу А (20мММ трис рН 7,6, 0,4М масі, 0,2мМмМ ЕОТА, гліцерин (2095 за об'ємом), 1,5мММ Масі», 2ММ дититрейтол (00), 04ММ РМ5Е, 1мММ МазМоО, 2мкг/мл - І кожного з лейпептину, пепстагіну і апротиніну). Клітинний дебріс вилучають центрифугуванням (15000 х ад, 15 с хвилин), аліквоти супернатанту заморожують в рідкому азоті і зберігають при -80 «С. Концентрацію білка визначають за методом Бредфорда (Віо-Кад), використовуючи бичачий сироватковий альбумін в якості (ее) стандарту. Дволанцюжковий олігонуклеотид, який відповідає елементу, що зв'язує МЕ-КВ (1Опмол, Рготеда) ,
ФО 50 мітять (Р)ЯСТР (З00Ки/ммол) і Т4 полінуклеотидкіназою (Мем Епдіапіа Віоіабв). Вільні нуклеотиди вилучають центрифугуванням з нанесенням препарату на спін-колонку. Екстракти (1Омкг білка) клітин, оброблені ІІ -18 або г» І.-184І-18ВР, інкубують (15 хвилин, кімнатна температура) з міченим зондом (3107 імпульсів на хвилину) разом з полі аІ.аС (5О0Онг, Рнагтасіа) і денатурованою ДНК сперми лосося (1О0Онг, Зідта) в 20мкл буферу, що містить НЕРЕЗ (рН 7,5, 10мММ), бОмМ КСІ, їмМ Масі», 2ММ ЕОТА, 1мМ ТТ і гліцерин (595 за об'ємом). Потім 22 суміші наносять на 595 неденатуруючі поліакриламідні гелі. Електрофорез проводять при 185Вт в 0,5 х ТВЕ
ГФ) (40мМ трис НОСІ, 45мММ борної кислоти і 2,5мММ ЕОТА). Гелі висушують під вакуумом і проводять авторадіографію всю ніч при -802С. Виявлено, що ІІ -18 індукує утворення гомодимеру рб5о МЕ-КВ і гетеродимеру рбб5/рбо МЕ-КВ. о Сечовий, а також рекомбінантний І/-18ВР інгібує активацію МЕ-КВ, викликану ІЇ/-18, що встановлюють за аналізом зміни електрофоретичної рухливості з екстрактами КО-1 клітин, що зв'язують радіоактивний бо олігонуклеотид, який відповідає погодженій послідовності МЕ-КВ.
Приклад 9
Експресія ІІ -188Р в Е. сої, клітинах дріжджів і комах
І-18ВР. також продукується іншими рекомбінантними клітинами, такими як прокаріотичні клітини, наприклад
Е. соїї, або іншими еукаріотичними клітинами, такими як клітини дріжджів і комах. Є добре відомі способи для бо конструювання відповідних векторів, що несуть ДНК, які кодують будь-який І/-18ВР, і придатні для трансформування Є. соїї і клітин дріжджів, або інфікування клітин комах для того, щоб продукувати рекомбінантний ІЇ-18ВР. Для експресії в клітинах дріжджів, ДНК, що кодує ІІ/-18В8Р. (Приклад 6) вирізають і вставляють в експресуючі вектори, підхожі для трансфекції клітин дріжджів. Для експресії в клітинах комах,
ДНК, що кодує 1ІІ-18ВР, вставляють в бакуловірус, а клітини комах інфікують названим вище рекомбінантним бакуловірусом. Для експресії в Е. соїї, ДНК, що кодує ІЇ/-188Р, піддають сайтспрямованому мутагенезу з відповідними олігонуклеотидами для того, щоб АТО кодон ініціації вставити саме до першого кодона зрілого
І-18ВР. Альтернативно, таку ДНК одержують шляхом РСК з відповідними смисловим і антисмисловим праймерами. Одержані ДНК-конструкції потім вводять в прокаріотичні експресуючі вектори, відповідно 70 сконструйовані з використанням технологій, добре відомих на даному рівні техніки (23).
Приклад 10
Конструкція експресуючого вектора, асоційованого з аденовірусом, для експресії ІІ -18ВРа іп мімо
Функціональний ген, що кодує ІЇ-18ВРа, конструюють на основі плазмідної рсоОМАЗ (Іпийгодеп, Зап Оівдо
СА). кКДНК 1ІІ-18В8Р. з Когак-погодженою послідовністю на 5' кінці зшивають в сайті Хба рсОМАЗ у спосіб, що руйнує сайт рестрикції. Нові Хба 1 сайти вставляють шляхом сайт-спрямованого мутагенезу до неоміцинової касети (основа 2151 вихідної послідовності рсОМАЗ) і після сигналу поаденілування 5М40 (основа 3372 вихідної послідовності рсОМАЗ). Цю конструкцію вирізають шляхом Хра! і одержаний 4,7т.п.н. мініген вставляють в
Хбваї-сайт плазмідної ргир201, як описують |Зпудег еї а!., 1996, Ситепі РгоїосоЇв іп Нитап Сепеїйїісв, Спаріег5 12.1.1-12.1.17, допп У/іІеу 4 Зопв)|. Одержану рекомбінантну плазміду ко-трансфікують з хелпер ААМ плазмідою 2о ВААМІАйЙ в 1293 клітини людини. Культури потім інфікують аденовірусом в якості хелпер-вірусу і клітини збирають після 48-60 годин інкубації. Клітини піддають З циклам заморожування-танення, клітинний дебріс вилучають центрифугуванням, а супернатант насичують суфатом амонію 3395 насичення. Потім суміш центрифугують, а ГААМ осаджують з супернатанту сульфатом амонію при 5095 насичення. Далі вірус очищають за допомогою СзсСЇі, діалізують і нарешті нагрівають протягом 15 хвилин при 562С, щоб знищити будь-який вірус. сч
Приклад 11
Конструкція рекомбінатних білків злиття ІІ -188Р. о
Одержання білків, що містять ІІ -18ВР, злитих з константною областю важкого ланцюга Ідс2, проводять так:
ДНК 1І/-18ВР. піддають сайтспрямованному мутагенезу з відповідними олігонуклеотидами для того, щоб ввести унікальний сайт рестрикції безпосередньо перед і після кодуючих послідовностей. Плазміду, що несе константну є область важкого ланцюга Ідс2, наприклад рАКСО42Есі (6), піддають подібному сайтспрямованному мутагенезу, щоб ввести той самий унікальний сайт рестрикції у спосіб, що допускає трансляцію в фазі злитого білка. о
Фрагмент азОМА, що складається з 5'нетранслованих послідовностей і кодує І/-188Р, одержують шляхом Ге) розщеплення в унікальних сайтах рестрикції або, альтернативно, шляхом РОК з відповідно сконструйованими праймерами. Аналогічно розщепляють мутантний РККСО42ЕсіІ, щоб утворити великий фрагмент, що містить о
Зз5 плазміду і послідовності ДОІ. Потім два фрагменти лігують з утворенням нової плазміди, яка кодує ї- поліпептидний попередник, що складається з ІІ -18ВР і приблизно 227 С-кінцевих амінокислот Ід (область петлі
Її СН2 та СНЗ домени). ДНК, що кодує рекомбінантні білки, виділяють з плазміди шляхом рестрикції відповідними ферментами рестрикції, а потім вводять в ефективні прокаріотичні і еукаріотичні експресуючі вектори.
Приклад 12 «
Одержання хімічно модифікованих ІІ -Я8ВР. шщ с Для збільшення періоду напів-життя І/-188Р в плазмі, одержують І/-18ВР, які хімічно модифікують й поліетиленгліколем (РЕС). Модифікацію здійснюють поперечним зшиванням РЕС з залишком цистеїну молекули «» І-18ВР. Конструюють мутантні ІЇ-18ВР, що містять додатковий залишок цистеїну на амінокінцях, в ділянках глікозилування та на карбоксильних кінцях кожного |І/-188Р. Мутагенез здійснюють методом РОК,
Використовуючи олігонуклеотиди, що містять потрібну мутацію. Ці мутантні білки експресують у звичайний -І спосіб, добре відомий в цій галузі. Проводять редуїайоп цих білків і визначають активність.
Приклад 13 о Одержання поліклональних антитіл до ІІ -188Р. о Кроликам спочатку вводять підшкірно 5мкг чистого препарату ІІ -18ВР сечі, емульгованого в повний ад'ювант Фрейнда. Через три тижні їм знову вводять підшкірно 5мкг препарату І-188Р в неповному ад'юванті Фрейнда. іа Дві додаткові ін'єкції І -18ВР, розчиненого в РВ5, проводять з 10-денними інтервалами. У кроликів забирають з кров через 10 днів після останньої імунізації. Зростання рівня антитіл визначають за допомогою радіоїмуноаналізу. 7125І-мічений ІІ-18ВР (166000 імпульсів на хвилину) змішують з різними розведеннями (1:50, 1:500, 1:5000 і 1:50000) сироватки кролика. Суспензію гранул білок-с-агарози (20мкл, Рпагтасіа) додають в загальному об'ємі 200мкл. Суміш залишають протягом 1 години при кімнатній температурі, потім гранули промивають З рази і рахують зв'язану радіоактивність. Антисироватку кролика до лептину людини
ІФ) використовують в якості негативного контролю. Титр ІІЇ-18ВР- антисироватки виявляється між 1:500 і 1:5000, у ко той час як негативний контроль менший від 1:50.
Приклад 14 60 Одержання моноклональних антитіл до ІІ -188Р.
Самицям ВаїрБ/С мишей (у віці З місяців) вводять спочатку 2мкг очищеного ІЇ/-188Р. в емульсії повного ад'юванту Фрейнда, а через три тижні підшкірно в неповному ад'юванті Фрейнда. Три додаткові ін'єкції роблять з 10-денними інтервалами підшкірно в РВ5. Кінцеві бустер-ін'єкції здійснюють внутрішньочеревно за 4 і 3 дні до злиття мишам, які показують найвищий тирт зв'язування, що визначають шляхом ІКІА (див. нижче). Злиття 65 проводять, використовуючи М5О/1 лінію клітин меланоми і лімфоцити, одержані як з селезінки, так і з лімфатичних вузлів тварин, в якості клітин, що зливаються. Злиті клітини розподіляють в багатолункові планшети для мікрокультури і гібридоми селектують в ДМЕМ, доповненим НАТ і 1595 сироваткою коня.
Гібридоми, котрі, як виявлено, продукують антитіла до ІІ -18ВР, субклонують за методом лімітуючих розведень і вводять ВаіБ/С мишам, яким введений пристан для утворення асциту. Ізотипи антитіл визначають,
Використовуючи комерційно доступний ЕОЗА-набір (Атегзпат, ОК).
Скринінг гібридом, що продукують анти-І/-188Р моноклональні антитіла, проводять так: Гібридомні супернатанти тестують щодо присутності анти-І/-188Р антитіл за допомогою інвертного твердофазного радіоїмуноаналізу (ІКІА). ЕГІЗА-планшети (Рупаїйесі І арогафгіез, АіІехапагіа, МА) покривають Таіоп-очищеним
І. -18вРа-Ніве (1Омкг/мл, 10Омкл/лунку). Після інкубації протягом ночі при 42С, планшети промивають двічі РВ5, 7/0 що містять ВЗА (бичачий сироватковий альбумін) (0,590) і твін-20 (0,0595) та блокують промивальним розчином протягом принаймні 2 годин при 372С. Додають гібридомні культуральні супернатанти (1О0Омкл/лунку) і планшети інкубують протягом 4 годин при 372С. Планшети промивають З рази, та додають кон'югат пероксидази хріну з антитілами кози до антитіл миші (НКР, дасКкзоп І арв, 1:10000, 10Омкл/лунку) протягом 2 годин при кімнатній температурі Планшети промивають 4 рази, а забарвлення проявляють шляхом АВТ 75 (2,2-азино-біс(З-етилбензтіазолін-б-сульфокислота, Зідта) з НьО»о в якості субстрату. Планшети зчитують за допомогою автоматичного ЕІ ІЗА-планшет-рідера. Зразки, що дають ОО, яке принаймні в 5 раз вище, ніж величина негативного контролю, вважають позитивними.
Приклад 15
Афінна хроматографія ІІ -18ВР з моноклональними антитілами 20 Антитіла проти І/-188Р використовують для очистки ІЇ/-188Р за допомогою афінної хроматографії.
Секретовану гібридомою асцитну рідину, що містить моноклональні антитіла, очищають осадженням суфатом амонію при 5095 насичення з подальшим екстенсивним діалізом проти РВ5. Приблизно 10мг імуноглобулінів зв'язують з мл Айіде! 10 (Віо Кай О5А), як рекомендує виробник. 25Омл білків сечі людини (еквівалентних 250л неочищеної сечі) наносять на 0О,бБмл колонку з Ге 25 анти-І,-18ВР-антитілами при 42С при швидкості потоку 0,25мл/хвилину. Колонку промивають РВ5, аж доки не о перестане визначатися білок в промивній рідині. І -18В8Р. елююють 25мММ буфером лимонної кислоти, рН 2,2, (81 колонка, об'єм фракцій) і негайно нейтралізують ТМ Ма»2СОз. Подальшу очистку цього препарату здійснюють за допомогою гель-фільтрації.
Приклад 16 с 30 ЕПІЗА-тест (метод твердофазного імуноферментного аналізу) со
Титраційні мікропланшети (Оупаїеспй ог Махізого, ру Мипс) покривають анти-І/-188Р моноклональними антитілами (безсироватковий гібридомний супернатант або імуноглобуліни асцитної рідини) протягом ночі при (ее) 42С. Планшети промивають РВ5, що містить ВЗА (0,595 та твін 20 (0,0595) та блокують тим самим розчином ю протягом принаймні 2 годин при 372С. Тестовані зразки розбавляють блокуючим розчином і додають в лунки 35 (100мкл/лунку) протягом 4 годин при 372С. Потім планшети З рази промивають РВ5, що містить твін 20 (0,0596) з - подальшим доданням анти-1ІІ-18ВР. сироватки кролика (1:1000, 10Омкл/лунку) для подальшої інкубації протягом ночі при 42. Планшети промивають З рази і додають кон'югат пероксидази хріну з антитілами кози до антитіл кролика (НКР, дасквоп І арв, 1:10000, 10О0мкл/лунку) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Планшети « промивають 4 рази, а забарвлення проявляють з використанням АВТ З7З (2,2'-азино-біс(З-етилбензтіа-золін-б-сульфокислоти, Зідта) з НьО» в якості субстрату. Планшети зчитують за с допомогою автоматичного апарату для зчитування планшетів. "з Приклад 17
Неглікозилований ІІ-18ВР людини біологічно активний
Досліджують здатність очищеного рекомбінантного ІІ-18ВРа інгібувати біологічну активність ІІ -18. ІЇ-188Ра інгібує у доза-залежний спосіб індукуючу ІЄМ- активність І/-18 людини і миші в спленоцитах миші, РВМС та - лінії КО-1 клітин людини (Фіг.9). с Очищений І/-188Ра, що має Нівзв ад на С-кінці (1,5мкг, 5Омкл) приводять до рН 7,5 та змішують з
М-глікозидазою Е (Змкл, 500000 О/мл РюСазвзе Е, Мем Епадіапа Віоіарв). Суміш інкубують протягом 24 годин при со 372 за невідновлювальних умов. Аліквоти з зразка і з негідролізованного ІІ-18ВР-Нізв аналізують шляхом
Ге) 50 ЗО5-РАСЕ за невідновлювальних умов з подальшим імуноблотингом з антитілами до ІІ-18ВР. Виявляють, що "з зона 40ОкДа ІІ -А8ВР-Ніво зникає в РюСавзе- обробленої фракції, і виявляють нову зону 20кДа. Молекулярна маса продукту і специфічність РЮІСавзе Е вказують, що ІІ -188Р-НІ156 є повністю деглікозилованим.
РМСавзе-оброблені фракції, негідролізований ІІ/-188Р-Нізве і контрольний зразок, що містить РМОСазе в буфері, нарізно адсорбують на Таіоп-гранулах, промивають фосфатним буфером та елююють імідазолом (100мММ). Елюйовані фракції піддають біоаналізу, використовуючи ІЇ/-18 людини (2Онг/мл), Р (2мкг/мл) та
ГФ) спеноцити миші. Результати наведені у таблиці нижче: з в Непдролюваний СевРНь 000
Оброблений РМСесе СВВРНяЄ 0
Зроблено висновок, що деглікозилований ІІ -18ВР біологічно активний як модулятор активності ІІ -18.
Наведений вище опис окремих напрямків виявляє основну суть винаходу так, що інші, застосовуючи сучасні бо знання, легко модифікують і/або пристосують для різних застосувань такі конкретні напрямки без відступу від основних уявлень і тому такі пристосування і модифікації повинні бути та призначені для включення до значень та галузі еквівалентів описаних напрямків. Зрозуміло, що фразеологія і термінологія служать для опису, а не обмеження.
Кеїегепсез 1. Апаегзоп, О.М., еї аІ, А ПпПотоіодце ої (Ше ТМЕ гесеріог апа йбв Одапа еппапсе Т-сеїЇ дгоули апа депагікс-сеї! Тоипсіоп. Майцге, 1997. 390(6656): р.175-179. 2. ВоїІоп, 0. Р., еї аї. (1980) у. Сііп. Нетайо!. Опсої. 10:39-48.
З. Воївівїп, О., еї а). (1982) Міаті М/іпі. Зутр. 19:265-274. 70 4. Вгоасі, 9. К., іп "пе Моїесшаг Віоїрду ої (Ше Меаві бЗасспаготусев: Ше Сусіе апа Іппегіапсе", Соїа
Зргіпд Нагбог І арогаюгу, Соїа Зргіпд Нагрог, МУ, рр.445-470 (1981). 5. Вгоаси, . К., (1982) СеїІ 28:203-2-04. 6. Вут К. А. еї аї., 1990, Майшге (І опдоп) 344:667-670. 7. Саг, В. О0., М. М. Епо, В. Зсппуаег, Її. О2теп, 5. Ниапо, Р. Саїїау, ОЮО. Нештапп, М. Адиеї, апа В. 7/5 КУйеЇ. 1994. Іпіепегоп датта гесеріог деїйсіепі тісе аге гевівіапі о епдоїхіс взпосК. 3. Ехр. Меа. 179:1437-44 івзп: 0022-1007. 8. Спабег, К. Р. еї аї.,, іп "Біхй Іпіегпайопа! Зутрозвішт оп АсііпотусейаІез Віоіоду", АКадетіаї Каїадо,
Видаревзі, Нипдагу (1986), рр.45-54. 9. Сопії, В., У. МУ. Чайпо, Со Тіпі, 9. Н. Боп, апа Т. Н. доп. 1997. Іпдис(іоп ої іпіепегоп-датта іпаисіпу Тасюг іп (Пе аагепаї! согпех. у. Віої. Спет. 272:2035-2037. 10. Оао, Т., К. ОНавії, Т. Кауапо, М. Кигітоїю, апа Н. ОКатига. 1996. Іпіепегоп-датта-іпацйсіпуд Тасіог, а поме! суюКіпе, еппапсез Раз ІІдапа-тедіайей суюіохісйу ої тигіпе Т Пеїрег 1 сеїЇв. СеїІ-Іттипої. 173:230-5 івзп: 0008-8749, 11. ЕпдеІтапп, Н., О. Адегка, М. Кибіпвівіїпй, О. Коїтап, апа ОО. МУаінзси. 198 9. А Штог песговів сч ов Тасіог-ріпайпу ргоївїп ригійвеа о Потодепейу йот итап ицгіпе ргоїесів сейв фот іШтог пеосговів Тасіог іохісіку. У. Віої. Спет. 264:11974-11980. і) 12. ЕпдеІтапп, Н., О. Моміск, апа О. МУайаси. 1990. Тмжо їшШтог песговів Тасіог-ріпаіпо ргоїеіпв ригійеа їот Ппитап цгіпе. ЄЕмідепсе ог іттипоіодіса! сговзв-геасіїмйу м/йй се випасе (штог песговів Тасіог гесеріогв. ). Віої. Спет. 265: 1531-1536. с зо 13. Рапіцагі, (., ей аї.,, 1-18 гедшціайоп ої ІЕМ-д оргодисіоп апа сеї! ргоІйегайоп аз гемеаїей іп іпєепеикіп-Ір сопмегііпд епгуте-адеїісіепі тісе. Віоса, 1998. 91: р.2118-2125. ісе) 14. Огусгап, Т., "пе Моіесціаг Віоіоду ої Пе Васіїї", Асадетіс Ргезв, МУ (1982), рр.307-329. со 15. ОСщшбКіпа, 9.5. еї а), А помеі! с-їдг ехоп шШілей іп Ервзіеіп-Вагтг мігив-іптесіей В Іутрисуїез ри пої іп тогта! топосу(ев. Моїес. СеїІ. Віої!., 1991. 11: р.1500-1507. о 16. Негетапе, Н., )У. Мап ЮОатте, С. Оеп, К. Оі)Ктапе, апа А. Війац. 1990. Іпіепегоп датта, а ї- тедіаюг ої ІДІеїйа! Ііророїузасспагіде-іпдиседй Зпулагілтап-йКе 5посК геасіопе іп о тісе. У. Ехр. Мед. 171:1853-69 івзп: 0022-1007. 17. Ігакі, К. (1978) Орп. 9. Васіегіа). 33:729-742. 18. доп, У. Е., еї аї. (1986) Кем. ІпТесі. Рів. 8:693-704. « 19. Кепааї, К.. еї аі. (1987) 9: Васіегіа!. 169:4177-4183. в с 20. Коппо, К., У. КайїваоКа, Т. ОпНівикі, М. Бцетоїйо, І. ОКатої, М. Овиїі, М. ІКеда, апа М. Кигітоїю. 1997. . ІРМ-датта-іпадисіпуд Тасіог (ІСІ) ів а совійтиціайгу Тасіог оп (Ше асіїмайоп ої ТІ Биї пої Тп2 сеїЇв апа и?» ехегіз їїз еПесі іпдерепдепйу ої ІІ -12. 9). Іттипої. 158:1541-1550. 21. МаїївгемузКі, С. К., Т. А. За, Т. Мапдеп Вовз, 5. Муацой, 5. К. Юоуег, у). ЗіасК, М. Р. ВесКтапп, апа
КК. Н. Огарв-еї. 1990. СуюКкіпе гесеріог5 апа В сеї їТопойоп5. І. Кесотріпапі зоїшріе гесеріогв -І зресіїіса|Пу іпріріє 1 -1- апа ІІ -4-іпдисеа В сеї! асіїміев іп міго. У). Іттипої. 144:3028-3033. 22. Мапіаййв, Т., іп "Се! Віоюду: А Сотргепепзіме Тгеайве, МоІ.3: Сепе Ехргезвіоп", Асадетіс Ргезв, о МУ, рр.563-608 (1980).
Го! 23. Мапіаїз еї. аіІ., Моіесшаг Сіопіпо: А І арогаїогу Мапиаї, Соїд Зргіпуд Нагброг І арогаїгу, Мем Хогк, 1982. 24. МісайПеї, М. 9., Т. Опівикі, К. Коппо, Р. Тапаре, 5. О5Ппіо, М. Матра, Т. Тапітоїо, К. Тогідое, М.
Ме, Еціїї, М. Ікеда, 5. РиКида, апа М. Кигітоїо. 1996. Іпіепегоп-датта-іпдисіпуд Тасіог еппапсез Т Пеїрег 1
Ге суюКіпе ргодисіоп ру вітціайбй Ппитап Т сеїЇв: вупегдівт м/йА іпіепецйкіп-12 ог іпепегоп-датта ргодисійоп. Ешиг-О-ІПтипо! 26:1647-51 іввп: 0014-2980. 25. Мігизпіта, 5. апа Мадаїа, 5. (1990) рЕР-ВО5, а рожепи! таттаїйап ехргезвіоп месіог. Мисіевїс Асій вв ев. 18:5322-532 8. 26. МаКатига, К., Н. ОКатига, К. Мадаїа, Т. Котаїви, апа Т. Татига. 1993. Ригійсайоп ої а Тасіог м/пісп
Ф) ргомідез а созіїтиагу зідпа! г датта іпіепегоп ргодисіоп. Іптесі-ттип 61:64-70 іввп: 0019-9567. ка 27. Макатига, К., Н. ОКатига, М. УУада, К. Мадайїа, апа Т. Татига. 1989. Епдоїюохіп-іпдисед зегит Тасіог їпа: зіітиа(ез датта іпіепегоп ргодисііоп. ІпТесі-іІттип 57:590-5 іввп: 0019-9567. во 28. Моміск, 0О., В. Сопеп, апа М. Кибіпвівії. 1994. Те Нитап Іпіепегоп аїЇрпа/беа Кесеріог -
Спагасіегіганйоп апа Моїіесшціаг Сіопіпд. Сеїї 77:391-400. 29. Моміск, О., В. Сопеп, апа М. "Кибіпвівій. 1992. Боі|шріеє Іпіепегоп-адрпа Кесеріог Моіесціев Аге
Ргезепі іп Воду Ріцідв. РЕВ5 І ей 314:445-448.
З0. Моміск, ОЮ., Н. Епдеітапп, Ю. УУайаси, апа М. Кибіпвівіпй. 1989. БоЇШріє суїоКіпе гесеріоге аге ргезепі 65 іп погта! питап ишгіпе. У). Ехр. Меа. 170:1409-1414.,
З1. ОКатига, Н., Н. Твицївиії, Т. Котаїви, М. Миївидо, А. НаКкига, Т. Тапітоїо, К. Тогідое, Т. ОКига, У.
МиКада, К. Нацйогі, К. АКіа, М. Матбра, Р. Тапаре, К. Копівзпі, 5. Рикида, апа М. Кигітоїо. 1995. Сіопіпд ої а пем/ суїокКіпе (паї іпаисез ІЕМ-датта ргодисіп Бу Т сеїЇв. Маїиге 378:8 8-91. 32. Коїйе, Н., М. А. ЧдепКіп5, М. б. Сореїапа, апа Н. Кор. 1997. Асіїме віаде ої ашіоіїттипе аїіабеїйев ів азвосіаїей м/йй (пе оехргезвіоп ої а опоме! осуїоКіпе, ІСІР, м/піспй ів осаїей пеагоІдаг. 0-Сііп-Іпмев( 99:469-74 іввп: 0021-9738. 33. ЗатбргооК, 9У., Е.Р. Егіївсп, апа М. Т., МоїІесшаг Сіопіпд: А Іарогайїогу тапиаЇ. 2пй ей. ей. 1989, Соїй
Зргіпд Еаг-рох, Мем/ Хогк: Соїд Зргіпуд Нагбог І арогайогу. 34. Зітопеї, МУ.5., еї аїЇ., Овіеоргоїедегіп: а поме! зесгебїей ргоївіп іпмоїмей іп (Ше гедшціайоп ої ропе 7/0 депзйу. СеїЇ, 1997. 89(2): р.309-319.
З5. Ботраугас, Ї.Н. апа К.Г. ОЮОаппа, ЕПісіепі іпїесіоп ої топКеу сеїЇїв м/йй ОМА ої вітіап мігив 40.
Ргос. Маг. Асад. сі. ОБА, 1981. 78: р. 7575-7578.
Зб. Зрагк5, С.А., еї аїЇ., Аввідптепі ої (йе писіеаг тійоііс аррагай5 ргоївіпй МИиМА депе Юю ПпПитап спготозоте ІІдІЗ. Сепотісв, 1993.17: р.222-224. 37. Твцівиії, Н., К. МакКапізпі, К. Маївиї, К. Нідазпіпо, Н. ОКатига, М. Міуагажа, апа К. Капеда. 1996.
ІРМ-датпа-іпаисіпу Тасіог р-гедшіайев Раз ІІдапа-тедіайвй суйоїохіс асімйцу ої тигіпе пайга! КіШег сеї сіопев. У. Іттипої. 157:3967-73 іззп: 0022-1767. 38. Ов5піо, 5., М. Матбра, Т. ОКига, К. Найогі, М. МиКада, К. АКіїа, ЕР. Тапаре, К. Копізнпі, М. МісайПетї,
М. Еції, К. Тогідое, Т. Тапітоїо, 5. РиКида, М. Ікеда, Н. ОКатига, апа М. Кигітоїо. 1996. Сіопіпд ої (пе 2о сОМА того йпитап о ІРМ-датта-іпаисіпу Тасіог, ехргеззіоп іп Евспегіспіа соїї, апа війдіеєз оп (Ше бБіоіодіс асімйев ої (Ше ргоїеіп. 9. ІттипоїЇ. 156:4274-4279.34. ОКауата, Н. апа Вего, Р. (1983) А сОМА сіопіпд месіог паї регтіїв ехргезвіоп ОТСОМА іпзегіз іп таттаїіанп сеїІв. Мої. СеїІ. Вісі. 3:280-289. 39. Мавида, Н., еї аїЇ., Ідепійу ої овіеосіазіодепевів іппірйогу Тасіог (ОСІБ) апа овіеоргоїедегіп (ОРО): а теспапізт ру м пісп ОРО/ОСІР іппіріїв овіеосіавіодепезів іп міго. Епдосгіпоіоду, 1998. 139: р.1329-1337. сч о

Claims (1)

  1. Формула винаходу
    1. Виділений поліпептид, що включає амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з с зо (а) амінокислотної послідовності, вибраної з групи, що складається з АА1-ААТ192 ЗЕО ІЮ МО: 2, АА29-АА192 ЗЕО ІЮ МО: 2, АА1Т-ААТ97 ЗЕО ІЮ МО: 6 ії АА29О-ААТ97 ЗЕО ІЮ МО: 6, |се) (Б) мутеїну будь-якої послідовності, вказаної в підпункті (а), де ідентичність амінокислотної со послідовності вказаного мутеїну і принаймні однієї послідовності, вказаної в підпункті (а), складає щонайменше 7096; Іс) 35 де поліпептид, охарактеризований у підпункті (а) або (Б), зв'язується з ЇЇ -18. чн
    2. Поліпептид за п. 1, де будь-які зміни амінокислотної послідовності мутеїну, охарактеризованого в підпункті (Б), являють собою заміни консервативних амінокислот в амінокислотних послідовностях, охарактеризованих у підпункті (а).
    3. Поліпептид за п. 1, де амінокислотна послідовність містить АА1-АА192 5ЕО ІЮО МО: 2 або АА29-АА192 5ЕО « ІО МО: 2. ш-в с 4. Поліпептид за п. 1, де поліпептид глікозильований в одному або декількох положеннях.
    5. Поліпептид за п. 1, де поліпептид неглікозильований. :з» 6. Поліпептид за п. 1, де поліпептид додатково містить принаймні один радикал, приєднаний до однієї або декількох функціональних груп, що є одним або декількома бічними ланцюгами амінокислотних залишків М- або С-кінцевих груп. -І 7. Поліпептид за п. 1, де поліпептид зазнав циклічної перестановки.
    8. Поліпептид за п. 1, де поліпептид являє собою невірусний білок.
    о 9. Поліпептид за п. 1, де поліпептид являє собою людський білок. оо 10. Поліпептид за п. 1, де поліпептид являє собою злитий білок.
    11. Поліпептид за п. 10, де поліпептид злитий з Ід. (о) 12. Поліпептид за п. 1 або 11, де поліпептид є розчинним. ГЕ 13. Поліпептид за п. 1, де поліпептид є пегільованим.
    14. Поліпептид за п. 6, де вказаний принаймні один радикал являє собою поліетиленгліколевий радикал.
    15. Виділений поліпептид, що містить у собі амінокислотну послідовність АА1Т-192 5ЕО ІЮО МО: 2 або АА29-АА192 ЗЕО ІО МО: 2 або їхні варіанти, що містять консервативні амінокислотні заміни, і зв'язується з ІІ -18.
    16. Виділений поліпептид, що містить у собі амінокислотну послідовність АА1-197 5ЕО І МО: 6 або (Ф) АА29-АА1Т97 ЗЕО ІЮО МО: 6 або їхні варіанти, що містять консервативні амінокислотні заміни, і зв'язується з ІІ -8. ГІ 17. Виділений поліпептид, що включає амінокислотну послідовність АА29-40 5ЕО ІЮО МО: 10 або ДАА1-АА4О ЗЕО ІЮ МО: 10, де поліпептид зв'язується з ІІ -18 і модулює або блокує біологічну активність ІЇ -18. во 18. Поліпептид за п. 17, де поліпептид містить Ід-домен.
    19. Очищений ІІ -18-зв'язуючий білок (ІІ -8ВР), де білок характеризується наступним: (а) молекулярна маса білка складає приблизно 40 кДа за даними 50О5-РАСЕ у вихідній глікозильованій формі; (Б) білок зв'язується з ІІ -18 і модулює або блокує активність ІІ -18; і 65 (с) білок містить М-кінцеву послідовність, що включає амінокислотну послідовність АА29-40 5ЕО ІЮ МО: 10 або АА1-АА4О ЗЕО ІО МО: 10 або їхні варіанти, що містять консервативні амінокислотні заміни.
    20. Активний фрагмент білка І/-18ВР за п. 1 або 19, де активний фрагмент зв'язується з 1-18 і модулює або блокує активність ІІ -18.
    21. Виділений поліпептид ІІ-18ВР, що має М-кінцеву послідовність, що включає амінокислотну послідовність 0 АА2г9-40 ЗЕО Ю МО: 10 або АА1-ААЯ4О ЗЕО ІО МО: 10 або їхні варіанти, що містять консервативні амінокислотні заміни, і Ід-домен, де поліпептид зв'язується з ІІ -18 і модулює або блокує активність ІІ -18.
    22. Суміш будь-яких поліпептидів, охарактеризованих у пп. 1, 15-17, 19 і 20.
    23. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з амінокислотної послідовності, вибраної 7/о З групи, що складається з АА1-АА192 5ЕО ІЮО МО: 2, АА29-АА1Т92 5ЕО ІО МО: 2 і АА29-АА1Т97 5ЕО ІЮО МО: 6.
    24. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з (а) нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1, що кодує АА1-АА192 5ЗЕО ІЮО МО: 2 або АА29-АА192 5ЗЕО ІЮ МО: 2; (Б) нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮО МО: 5, що кодує АА1-АА197 ЗЕО ІЮО МО: 6 або АА29-АА197 ЗЕО ІЮ МО: 6; (с) нуклеотидної послідовності, комплемент якої зв'язується в умовах високої жорсткості з будь-якою з нуклеотидних послідовностей, охарактеризованих у підпунктах (а) або (Б), і яка кодує амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з АА1-ААТ92 5ЕО ІЮО МО: 2, АА29-ААТ192 ЗЕО ІЮО МО: 2, АА1Т-ААТ97 ЗЕО ІЮ МО: 6 ї АА29-ААТ97 ЗЕО ІО МО:6.
    25. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 9 або нуклеотидну послідовність, комплемент якої зв'язується з нею в умовах високої жорсткості.
    26. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО: 1 і 3, або область ЗЕО ІЮО МО: 1 або 3, що кодує зрілий білок. с
    27. Спосіб визначення, виділення або ампліфікації нуклеотидної послідовності, що кодує І/-18В8Р, що включає застосування нуклеїнових кислот, охарактеризованих у будь-якому з пп. 23-26, як праймера або зонда. і)
    28. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, охарактеризованої у будь-якому з пп. 23-26.
    29. Вектор за п. 28, що додатково містить промотор, оперативно зв'язаний із вказаною молекулою нуклеїнової кислоти. с зо 30. Клітина, генетично модифікована для продукування поліпептиду, охарактеризованого в будь-якому із пп. с 1-21.
    З1. Клітина за п. ЗО, де клітина генетично модифікована вектором, охарактеризованим у п. 28. со
    32. Клітина за п. ЗО, де клітина є еукаріотичною.
    33. Клітина за п. ЗО, де клітина є прокаріотичною. Щео,
    З4. Клітина за п. 32, де клітина є клітиною ссавця. ї-
    35. Спосіб одержання поліпептиду, охарактеризованого в будь-якому із пп. 1-21, що включає культивування клітини, охарактеризованої в будь-якому із пп. 30-34, в умовах, що забезпечують експресію вказаного поліпептиду.
    36. Антитіло, що імуноспецифічно зв'язується з поліпептидом, охарактеризованим у будь-якому із пп. 1-21. «
    37. Антитіло за п. 36, де антитіло являє собою моноклональне антитіло. з с 38. Антитіло за п. 37, де антитіло являє собою гуманізоване антитіло.
    39. Спосіб визначення І/-188Р у зразку, що передбачає взаємодію вказаного зразка з антитілом, ;» охарактеризованим у п. Зб, і подальше визначення наявності зв'язаного антитіла.
    40. Спосіб очищення поліпептиду І/-188Р, що передбачає взаємодію зразка І/-18В8Р. з антитілом проти 1І-188Р, охарактеризованим у п. 36, видалення білка, що не зв'язався, зі зразка з наступною елюцією ІІ -188ВР, -І що зв'язався.
    41. Спосіб виділення або очищення ІІ -18ВР, охарактеризованого в будь-якому із пп. 1-21, що включає о (а) пропускання зразка через хроматографічну колонку, з якою зв'язується І! -18; Го! (Б) промивання колонки для видалення білка, що не зв'язався, зі зразка, і (с) елюцію ІІ -188Р, який зв'язався. Ме, 42. Спосіб виділення або очищення ІІ/-18ВР, охарактеризованого в будь-якому із пп. 1-21, що включає Ге взаємодію зразка із субстратом, з яким зв'язаний І/-18, видалення білка, що не зв'язався, зі зразка з наступною елюцією ІІ -188ВР, який зв'язався.
    43. Спосіб одержання похідного І/-18ВР, що включає одержання ДНК-конструкта, що кодує поліпептид, охарактеризований у будь-якому із пп. 1, 15-17 і 19-21, лігованого з нуклеїновою кислотою, що кодує другий поліпептид, де при експресії вказаний ДНК-конструкт кодує злитий білок, що містить поліпептид, Ф) охарактеризований у будь-якому із пп. 1, 15-17 і 19-21, злитий із другим поліпептидом. ка 44. Спосіб за п. 43, де вказаним другим поліпептидом є Ід.
    45. Спосіб одержання похідного ІІ -18ВР, що включає хімічну модифікацію поліпептиду, охарактеризованого в во будь-якому із пп. 1 і 15-17, із включенням принаймні одного модифікуючого радикала.
    46. Спосіб за п. 45, де модифікуючий радикал являє собою поліетиленгліколевий радикал.
    47. Композиція, що містить поліпептид, охарактеризований в будь-якому із пп. 1-21, або суміш поліпептидів за п. 22 ії фармацевтично прийнятний носій.
    48. Композиція, що містить нуклеїнову кислоту, охарактеризовану в будь-якому із пп. 23-26, і 65 фармацевтично прийнятний носій.
    49. Композиція, що містить антитіло, охарактеризоване в будь-якому із пп. 36-38, і фармацевтично прийнятний носій.
    50. Набір, що містить в одній або декількох пляшечках фармацевтичну композицію, охарактеризовану в п. 47.
    51. Набір, що містить в одній або декількох пляшечках фармацевтичну композицію, охарактеризовану в п. 48.
    52. Набір, що містить в одній або декількох пляшечках фармацевтичну композицію, охарактеризовану в п. 49.
    53. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з (а) амінокислотної послідовності, вибраної з групи, що складається з АА1-ААТ192 ЗЕО ІЮ МО: 2, АА29-АА192 ЗБЕО ІЮО МО: 2, АА1-АА1Т97 5ЕО ІЮО МО: 6, АА29-АА1Т97 ЗЕО ІЮ МО: 6; 70 (Б) мутеїну будь-якої послідовності, вказаної в підпункті (а), де амінокислотна послідовність вказаного мутеїну має принаймні 7095-у ідентичністю принаймні з одною послідовністю, вказаною в підпункті (а); де вказана молекула нуклеїнової кислоти кодує поліпептид, що зв'язується з ІІ -18.
    54. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з (а) нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1, що кодує АА1-АА192 5ЗЕО ІЮО МО: 2 або АА29-АА192 5ЗЕО ІЮ МО: 2; (Б) нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮО МО: 5, що кодує АА1-АА197 ЗЕО ІЮО МО: 6 або АА29-АА197 ЗЕО ІЮ МО: 6; (с) нуклеотидної послідовності, комплемент якої зв'язується в умовах високої жорсткості з кожною з НУклеотидних послідовностей, охарактеризованих у підпунктах (а)-(Б); де вказана нуклеїнова кислота кодує поліпептид, що зв'язується з ЇЇ -18.
    55. Рекомбінантна молекула ДНК, що включає молекулу нуклеїнової кислоти, охарактеризовану в п. 53 або 54, ліговану з другою нуклеїновою кислотою, що кодує другий поліпептид, де при експресії вказана рекомбінантна молекула ДНК кодує злитий білок, що містить поліпептид, охарактеризований у будь-якому з пп. сч 1, 15-17 і 19-21, злитий з другим поліпептидом. (8) с «со с ІС)
    м. ші с з -І 1 (ее) б 50 Ко) Ф) іме) 60 б5
UA2000031437A 1997-08-14 1998-08-13 Виділений поліпептид, що зв'язується з il-18 (il-18bp) (варіанти), виділена молекула нуклеїнової кислоти, що його кодує (варіанти), антитіло, що зв'язується з даним поліпептидом, спосіб очищення il-18bp та композиція, що його містить UA75862C2 (uk)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IL12155497A IL121554A0 (en) 1997-08-14 1997-08-14 Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
IL12163997A IL121639A0 (en) 1997-08-14 1997-08-27 Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
IL12186097A IL121860A0 (en) 1997-08-14 1997-09-29 Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
IL12213497A IL122134A0 (en) 1997-08-14 1997-11-06 Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
IL12546398A IL125463A0 (en) 1997-08-14 1998-07-22 Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
PCT/IL1998/000379 WO1999009063A1 (en) 1997-08-14 1998-08-13 Interleukin-18 binding proteins, their preparation and use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA75862C2 true UA75862C2 (uk) 2006-06-15

Family

ID=27517687

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2000031437A UA75862C2 (uk) 1997-08-14 1998-08-13 Виділений поліпептид, що зв'язується з il-18 (il-18bp) (варіанти), виділена молекула нуклеїнової кислоти, що його кодує (варіанти), антитіло, що зв'язується з даним поліпептидом, спосіб очищення il-18bp та композиція, що його містить

Country Status (29)

Country Link
US (4) US6605280B1 (uk)
EP (1) EP1003781B1 (uk)
JP (1) JP4272348B2 (uk)
KR (1) KR100687388B1 (uk)
CN (1) CN1243021C (uk)
AR (2) AR013422A1 (uk)
AT (1) ATE443719T1 (uk)
AU (1) AU755794B2 (uk)
BG (1) BG65519B1 (uk)
BR (1) BRPI9811940B8 (uk)
CA (1) CA2298855C (uk)
CY (1) CY1109664T1 (uk)
CZ (1) CZ300818B6 (uk)
DE (2) DE69841175D1 (uk)
DK (1) DK1003781T3 (uk)
EA (1) EA003675B1 (uk)
EE (1) EE05538B1 (uk)
ES (1) ES2149149T3 (uk)
HK (1) HK1028773A1 (uk)
HU (1) HU226698B1 (uk)
IL (5) IL121860A0 (uk)
NO (1) NO327240B1 (uk)
NZ (1) NZ502392A (uk)
PL (1) PL206070B1 (uk)
PT (1) PT1003781E (uk)
SI (1) SI1003781T1 (uk)
SK (1) SK287194B6 (uk)
UA (1) UA75862C2 (uk)
WO (1) WO1999009063A1 (uk)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7393663B2 (en) * 1997-08-01 2008-07-01 Serono Genetics Institute S.A. Expressed sequence tags and encoded human proteins
IL121860A0 (en) * 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
CA2276216A1 (en) 1998-06-24 1999-12-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo An artificial peptide capable of neutralizing the biological activity of interleukin-18
EP1110969A4 (en) * 1998-09-01 2002-01-09 Hayashibara Biochem Lab INTERLEUKIN 18 BINDING PROTEIN
AR022952A1 (es) * 1999-03-19 2002-09-04 Smithkline Beecham Corp ANTICUERPO MONOCLONAL DE ROEDOR ESPECIFICAMENTE NEUTRALIZANTE PARA LA INTERLEUQUINA-18 HUMANA , UN FRAGMENTO FAB NEUTRALIZANTE o FRAGMENTO F(AB')2, UNA REGION DE COMPLEMENTARIEDAD DE CADENA LIGERA DE INMONOGLOBULINA(CDR), UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO, COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LO COMPRENDE, EL
IL131047A0 (en) * 1999-07-22 2001-01-28 Yeda Res & Dev Use of il-18 inhibitors
EP1101772B1 (en) * 1999-11-16 2009-01-21 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Antibody specific to interleukin 18 precursor
KR101111103B1 (ko) * 2000-02-10 2012-02-13 아보트 러보러터리즈 사람 인터류킨-18에 결합하는 항체 및 이를 제조하고 사용하는 방법
HU227752B1 (en) * 2000-02-21 2012-02-28 Yeda Res & Dev Use of il-18 inhibitors
MXPA02010895A (es) * 2000-05-05 2003-03-27 Applied Research Systems Uso de inhibidores de interleucina 18 para el tratamiento y/o prevencion de aterosclerosis.
AU2005211606B2 (en) * 2000-05-05 2007-02-22 Inserm - Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Use of IL-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of atherosclerosis
EP2357002A1 (en) 2000-10-11 2011-08-17 Viron Therapeutics, Inc. Nucleic acid molecules and polypeptides for immune modulation
US7718368B2 (en) * 2000-12-04 2010-05-18 Viron Therapeutics Inc. Immunomodulatory protein and useful embodiments thereof
RS51125B (sr) * 2001-01-29 2010-10-31 Laboratoires Serono Sa. Upotreba inhibitora il-18 za lečenje i/ili prevenciju srčanih oboljenja
ES2334773T3 (es) * 2001-05-16 2010-03-16 Yeda Research And Development Co. Ltd. Uso de inhibidores de il-18 para el tratamiento o prevencion de la sepsis.
AU2002314103B2 (en) * 2001-05-25 2007-07-12 Ares Trading S.A. Use of il-18 inhibitors for treating or preventing cns injuries
PT2087908T (pt) 2001-06-26 2018-07-16 Amgen Inc Anticorpos contra opgl
UA78516C2 (en) * 2001-08-10 2007-04-10 Applied Research Systems Use of inhibitors of il-18 for treatment and/or prevention of hypersensitivity disorders, and in particular of delayed-type hypersensitivity
BRPI0308663B8 (pt) * 2002-03-22 2021-05-25 Applied Res Systems Ars Holding N V uso de inibidores de il-18 para o tratamento e/ou prevenção de doenças vasculares periféricas
MXPA05002219A (es) 2002-08-28 2005-07-05 Immunex Corp Composiciones y metodos para tratar una enfermedad cardiovascular.
KR101015682B1 (ko) * 2002-10-08 2011-02-22 아레스 트레이딩 에스.에이. Ｉｌ-18ｂｐ에 결합할 수 있고 제 2 사이토킨의 활성을저해할 수 있는 사이토킨의 용도
IL152232A0 (en) * 2002-10-10 2003-05-29 Yeda Res & Dev Promoter to il-18bp, its preparation and use
CA2523912A1 (en) 2003-04-30 2004-11-11 Japan Science And Technology Agency Human antihuman interleukin-18 antibody, fragment thereof and method of using the same
EP1622939B1 (en) * 2003-05-13 2012-03-14 Merck Serono SA Active variants of the il-18 binding protein and medical uses thereof
SI1689777T1 (sl) * 2003-11-05 2007-08-31 Ares Trading Sa Postopek za äśiĺ äśenje il-18 vezavnega proteina
AU2004290049B2 (en) * 2003-11-12 2011-09-29 The Regents Of The University Of Colorado Compositions and methods for regulation of tumor necrosis factor-alpha
US7968684B2 (en) * 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
US20050100965A1 (en) 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
IL159670A0 (en) * 2003-12-31 2004-06-01 Yeda Res & Dev Use of il-18 binding protein in inflammations
AU2005217154B2 (en) * 2004-03-01 2010-02-18 Ares Trading S.A. Use of a serum-free cell culture medium for the production of IL-18BP in mammalian cells
WO2005097998A2 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-18 specific polypeptides and therapeutic uses thereof
US7439336B2 (en) 2004-06-29 2008-10-21 Ares Trading S.A. Process for the purification of IL-18 binding protein
SI1885753T1 (sl) * 2005-06-03 2011-12-30 Ares Trading Sa Proizvodnja rekombinantnega il-18 vezavnega proteina
AU2006254106B2 (en) * 2005-06-03 2012-04-26 Merck Serono Sa Use of IL-18BP isoforms for the treatment and/or prevention of neurological inflammatory diseases
JP5091127B2 (ja) * 2005-06-10 2012-12-05 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｉｌ−１８結合タンパク質の精製のための方法
CN101003812B (zh) * 2006-01-17 2011-01-05 温州医学院 一种用于制备重组人egf-il18融合蛋白的方法
SG172625A1 (en) 2006-05-25 2011-07-28 Glaxo Group Ltd Modified humanised anti-interleukin-18 antibodies
WO2010040736A2 (en) * 2008-10-07 2010-04-15 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against il18 and/or the il-18 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and/or disorders associated with il-18 mediated signaling
WO2014107530A1 (en) * 2013-01-02 2014-07-10 Wilsa, Inc. Method and apparatus for conditioning fluids
MX2016002719A (es) * 2013-09-05 2016-09-06 Ab2 Bio Sa Proteina de union a interleucina 18 (il-18bp) en enfermedades inflamatorias.
EP3265807A1 (en) * 2015-03-05 2018-01-10 AB2 Bio SA Il-18 binding protein (il-18bp) and antibodies in inflammatory diseases
EP3943097A1 (en) 2020-07-24 2022-01-26 AB2 Bio SA Car-t cell therapy
WO2023143535A1 (zh) * 2022-01-28 2023-08-03 和径医药科技（上海）有限公司 一种靶向il-18bp的抗体及其应用
WO2023178192A1 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Compugen Ltd. Il-18bp antagonist antibodies and their use in monotherapy and combination therapy in the treatment of cancer
CN114605521A (zh) * 2022-04-06 2022-06-10 内蒙古农业大学 一种细胞免疫调节蛋白及其应用
CN114891125B (zh) * 2022-06-16 2023-04-11 广东医科大学 一种长效重组白细胞介素-18结合蛋白及其生产方法与应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985863A (en) * 1996-09-12 1999-11-16 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for decreasing IGIF and IFN-γ production by administering an ICE inhibitor
GB9214857D0 (en) * 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Human nucleic acid fragments and their use
US5744451A (en) 1995-09-12 1998-04-28 Warner-Lambert Company N-substituted glutamic acid derivatives with interleukin-1 β converting enzyme inhibitory activity
US5776731A (en) 1996-02-21 1998-07-07 Immunex Corporation DNA encoding type-I interleukin-I receptor-like protein designated 2F1
EP0936923B1 (en) 1996-11-15 2003-12-17 Kennedy Institute Of Rheumatology SUPPRESSION OF TNFalpha AND IL-12 IN THERAPY
WO1998024804A2 (en) 1996-12-06 1998-06-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated INHIBITORS OF INTERLEUKIN-1β CONVERTING ENZYME
US7141393B2 (en) 1996-12-26 2006-11-28 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Interleukin-18-receptor proteins
US6087116A (en) * 1997-03-12 2000-07-11 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Interleukin-18 (IL-18) receptor polypeptides and their uses
PL336464A1 (en) 1997-03-18 2000-06-19 Basf Ag Method of and compositions for modulating reactivity in respect to corticosteroids i
CA2297157A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Genset 5' ests for secreted proteins expressed in testis and other tissues
PT1375514E (pt) 1997-08-01 2006-10-31 Serono Genetics Inst Sa Ests 5' para proteinas secretadas expressas em varios tecidos
IL121860A0 (en) * 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
KR100622796B1 (ko) 1998-04-28 2006-09-13 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. 폴리올-ｉｆｎ-베타 공액체
CA2276216A1 (en) 1998-06-24 1999-12-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo An artificial peptide capable of neutralizing the biological activity of interleukin-18
EP1110969A4 (en) 1998-09-01 2002-01-09 Hayashibara Biochem Lab INTERLEUKIN 18 BINDING PROTEIN
AR022952A1 (es) 1999-03-19 2002-09-04 Smithkline Beecham Corp ANTICUERPO MONOCLONAL DE ROEDOR ESPECIFICAMENTE NEUTRALIZANTE PARA LA INTERLEUQUINA-18 HUMANA , UN FRAGMENTO FAB NEUTRALIZANTE o FRAGMENTO F(AB')2, UNA REGION DE COMPLEMENTARIEDAD DE CADENA LIGERA DE INMONOGLOBULINA(CDR), UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO, COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LO COMPRENDE, EL
WO2001003719A2 (en) 1999-07-09 2001-01-18 Amgen Inc. Combination therapy for conditions leading to bone loss
WO2001019373A2 (en) 1999-09-17 2001-03-22 Basf Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids

Also Published As

Publication number Publication date
US7101689B2 (en) 2006-09-05
JP2001514876A (ja) 2001-09-18
AR062867A2 (es) 2008-12-10
EA003675B1 (ru) 2003-08-28
CN1243021C (zh) 2006-02-22
HK1028773A1 (en) 2001-03-02
NO20000700D0 (no) 2000-02-11
US8436148B2 (en) 2013-05-07
PT1003781E (pt) 2009-10-26
BRPI9811940B1 (pt) 2011-10-04
IL134523A0 (en) 2001-04-30
IL122134A0 (en) 1998-04-05
US7799541B2 (en) 2010-09-21
ES2149149T1 (es) 2000-11-01
BRPI9811940B8 (pt) 2021-07-06
NZ502392A (en) 2002-12-20
US20100010200A1 (en) 2010-01-14
NO20000700L (no) 2000-04-14
IL121860A0 (en) 1998-02-22
PL206070B1 (pl) 2010-06-30
IL125463A0 (en) 1999-03-12
US20060154294A1 (en) 2006-07-13
US20040037829A1 (en) 2004-02-26
EA200000216A1 (ru) 2000-08-28
ES2149149T3 (es) 2009-12-01
SK1762000A3 (en) 2000-09-12
BRPI9811940A (pt) 2000-09-05
HUP0003533A2 (hu) 2001-01-29
CA2298855A1 (en) 1999-02-25
DE69841175D1 (de) 2009-11-05
KR100687388B1 (ko) 2007-02-26
KR20010022900A (ko) 2001-03-26
IL134523A (en) 2011-09-27
EE200000073A (uk) 2000-10-16
CA2298855C (en) 2014-05-27
AU8746098A (en) 1999-03-08
EP1003781B1 (en) 2009-09-23
HUP0003533A3 (en) 2003-08-28
CY1109664T1 (el) 2014-08-13
US6605280B1 (en) 2003-08-12
CN1267307A (zh) 2000-09-20
DK1003781T3 (da) 2010-01-25
WO1999009063A1 (en) 1999-02-25
PL338647A1 (en) 2000-11-06
SI1003781T1 (sl) 2009-12-31
AR013422A1 (es) 2000-12-27
CZ2000490A3 (cs) 2000-08-16
JP4272348B2 (ja) 2009-06-03
DE1003781T1 (de) 2001-01-11
CZ300818B6 (cs) 2009-08-19
BG65519B1 (bg) 2008-10-31
AU755794B2 (en) 2002-12-19
EE05538B1 (et) 2012-04-16
EP1003781A1 (en) 2000-05-31
BG104149A (en) 2000-08-31
SK287194B6 (sk) 2010-03-08
ATE443719T1 (de) 2009-10-15
NO327240B1 (no) 2009-05-18
HU226698B1 (en) 2009-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA75862C2 (uk) Виділений поліпептид, що зв'язується з il-18 (il-18bp) (варіанти), виділена молекула нуклеїнової кислоти, що його кодує (варіанти), антитіло, що зв'язується з даним поліпептидом, спосіб очищення il-18bp та композиція, що його містить
JP3746790B2 (ja) 抗ヒトＶＥＧＦ受容体Ｆ１ｔ―１モノクローナル抗体
KR19980064719A (ko) 인터로이킨-18-수용체 단백질
JP2008169227A (ja) Ｉｌ８阻害剤
WO1999059636A1 (fr) Inhibiteurs de l'activite du facteur de croissance endothelial vasculaire (vegf)
EA002543B1 (ru) Антитела против рецептора интерферона-альфа/бета
WO1999040118A1 (fr) Anticorps diriges contre le recepteur kdr humain du vegf
US5679772A (en) Mammalian retinol-binding protein receptors
RU2362781C2 (ru) Антитело против интерферон-альфа/бета-связывающего белка ii (ifnab-bpii)
JP2001500724A (ja) Ｔ１レセプター様リガンドｉｉ
US5606027A (en) Antibodies to a neutrophil chemotactic protein
EP1367123A1 (en) Neurotonin and use thereof
AU2021207010A1 (en) Prophylactic or therapeutic agent for dementia
KR100436092B1 (ko) 신규단백질및그제조방법
WO2000052470A1 (fr) Moyen de diagnostic et de traitement de la leucemie
WO1997002345A1 (en) Tnf modulation
JP2002514051A (ja) Ｔ１レセプター様リガンドｉ