SK287194B6

SK287194B6 - Interleukínový-18 väzbový proteín - IL-18BP, DNA, replikovateľný vektor, transformovaná hostiteľská bunka, protilátka k IL-18BP, spôsob výroby IL-18BP, prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie

Info

Publication number: SK287194B6
Application number: SK176-2000A
Authority: SK
Inventors: Daniela Novick; Charles Dinarello; Menachem Rubinstein; Soo Hyun Kim
Original assignee: Yeda Research And Development Co., Ltd.
Priority date: 1997-08-14
Filing date: 1998-08-13
Publication date: 2010-03-08
Also published as: HK1028773A1; EE05538B1; IL134523A0; DK1003781T3; ATE443719T1; CA2298855A1; US6605280B1; KR20010022900A; KR100687388B1; NO327240B1; BRPI9811940B1; EA003675B1; UA75862C2; NO20000700D0; IL125463A0; SI1003781T1; EE200000073A; DE69841175D1; AU755794B2; AU8746098A

Abstract

IL-18BP, ktorým sú (a) polypeptidy zahŕňajúce aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 6, (b) polypeptidy, ako sú uvedené v bode (a) bez vedúcej sekvencie a (c) muteíny majúce najmenej 80 % homológiu s IL-18BP uvedenom v bodoch (a) alebo (b), ich fúzované proteíny, chemicky modifikované deriváty, kruhovo permutované deriváty a zmesi, ktoré sa viažu na IL-18BP a blokujú Il-18 indukovanú produkciu IFN-gama??spôsob ich výroby, ich kódujúce DNA, ich protilátky. Ďalej je opísané použitie IL-18BP na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie ochorení súvisiacich s aktivitou IL-18BP.

Description

Vynález sa týka interleukínového-18 (IL-18) väzbového proteínu, v ďalšom texte označovaného IL-18BP, ktorý je schopný viazať IL-18. Vynález sa bližšie týka rozpustného IL-18BP, ktorý sa dá získať z telových tekutín, ďalej sa týka rozpustných IL-18BP, ktoré možno získať expresiou vhodného DNA vektora v hostiteľskej bunke, ďalej sa týka vírusom kódovaných homologov IL-18BP, ktoré možno získať expresiou vhodných DNA vektorov v hostiteľských bunkách, ďalej sa týka vektorov, exprimujúcich rôzne IL-18BP, ďalej sa týka vektorov, použiteľných na expresiu IL-18BP u ľudí a ďalších cicavcov, ďalej sa týka protilátok proti IL-18BP, ďalej sa týka terapeutického použitia uvedených IL-18BP na moduláciu a/alebo blokovanie IL-18 aktivity a na výrobu liečiva na liečenie súvisiacich ochorení, a ďalej sa vynález týka použitia uvedených protilátok.

Doterajší stav techniky

V roku 1989 bola opísaná [271 endotoxínom vyvolaná sérová aktivita, ktorá indukovala γ-interľeron (IFN-γ), získaný z buniek sleziny myši. Táto sérová aktivita nepôsobila ako priamy induktor IFN-γ, ale skôr ako ko-stimulant spolu s IL-2 alebo mitogénmi. Úsilie o čistenie aktivity z post-endotoxínového séra myši vyústilo do získania zdanlivo homogénneho 50 až 55 kDa proteínu [26]. Pretože iné cytokíny môžu pôsobiť tiež ako ko-stimulanty produkcie IFN-γ, rozlišovacím faktorom bol nedostatok neutralizujúcich protilátok k IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, alebo THF na neutralizáciu predpokladanej sérovej aktivity. V roku 1995 rovnakí autori ukázali, že endotoxínom indukovaný ko-stimulant na produkciu IFN-γ bol prítomný v extraktoch z pečene myší, na ktoré sa vopred pôsobilo P. acnes [31], V tomto modeli expandovala hepatálna makrofágová populácia (Kupfferove bunky). U týchto myší po dávke lipopolysacharidu (LPS), ktorá nebola smrteľná u myši vopred nevystavených P. acnes, sa rovnaká dávka stala smrteľnou u myší vopred vystavených P. acnes. Z 1200 g myšacej pečene po vystavení P. acnes sa izoloval faktor, označený ako INF-γ indukujúci faktor (IGIF) a neskoršie označený ako interleukín-18 (IL-18), ktorý sa čistil až do homogénneho stavu. Degenerované oligonukleotidy, odvodené z aminokyselinových sekvencií čisteného IL-18 sa použili na klonovanie myšacej IL-18 cDNA [31], Interleukin 18 je 18 až 19 kD proteín s 157 aminokyselinami, ktorý nemá zrejmú podobnosť so žiadnym peptidom z databáz. Messengerové RNA pre IL-18 a interleukin 12 (IL-12) sa ľahko určujú v Kupfferových bunkách a v aktivovaných fágoch. Rekombinantný IL-18 indukuje IFN-γ účinnejšie ako IL-12, zrejme samostatnou reakčnou cestou [31], Podobne ako endotoxínom vyvolaná sérová aktivita aj IL-18 neindukuje IFN-γ sám, ale primárne pôsobí ako ko-stimulant s mitogénmi alebo IL-2. IL-18 podporuje proliferáciu T-buniek, zrejme reakčnou cestou závislou od IL-2, podporuje produkciu Thl cytokínu in vitro a z hľadiska podpory produkcie IFN-γ vykazuje synergizmus, ak je kombinovaný s IL-2 [24],

Neutralizujúce protilátky k myšaciemu IL-18 sa ukázali ako preventívne účinné proti úmrtnosti, spôsobenej nízkymi dávkami LPS u myší, vopred vystavených P. acnes. Ďalší poukázali na dôležitosť IFN-γ ako mediátora LPS úmrtnosti u vopred vystavených myší. Napríklad, neutralizujúce anti-IFN-γ protilátky chránili proti šoku typu Shwartzmanovho šoku [16]; ošetrené myši glaktózamínom s deficitným IFN-γ receptorom boli odolné proti LPS-indukovanému úmrtiu [7]. Preto nebolo neočakávané, že neutralizujúce protilátky k myšiemu IL-18 chránili myši proti letálnemu účinku LPS, ak boli vopred vystavené účinku P. acnes, [31]. Liečba proti IL-18 myší chránila prežívajúce myši tiež proti ťažkej hepatálnej cytotoxikóze.

Po klonovaní myšacích foriem bola v roku 1996 opísaná sekvencia humánnej cDNA pre IL-18 [38]. Rekombinantný humánny IL-18 má prirodzenú IL-18 aktivitu [38]. Humánny rekombinantný IL-18 nemá priamy IFM-γ indukčný účinok na ľudské T-bunky, ale pôsobí ako ko-stimulant pri produkcii IFN-γ a ďalších cytokínov T-pomocných buniek-1 (T-helper cell-1, Thl) [38], Dodnes sa IL-18 primáme chápe ako kostimulant na produkciu Thl cytokínov (IFN-γ, IL-2 a stimulačný faktor granulocytových-makrofágových kolónií) [20] a tiež ako ko-stimulant pre FAS ligandom sprostredkovanou cytotoxickosťou klonov myšacích prírodných ničivých buniek (killer cells) [37].

Klonovaním IL-18 z vopred ovplyvnených tkanív a štúdiom expresie IL-18 génu sa zistila tesná spojitosť tohto cytokinínu s autoimunitným ochorením. Neobézna diabetická (non-obese diabctic, NOD) myš spontánne vyvíjala autoimúnnu insulitídu a diabetes, ktoré sa dali urýchľovať a synchronizovať samostatnou injekciou cyklofosfamidu. Počas ranného štádia insulitídy sa reverznou transkriptázovou PCR pankreasu NOD myši dokázala IL-18 mRNA. Po liečbe cyklofosfamidom sa hladiny IL-18 mRNA rýchlo zvyšovali a prevyšovali nárast IFN-γ mRNA a následne diabetes. Zaujímavé je, že táto kinetika je obdobná ako kinetika IL-12-p40 mRNA, čoho výsledkom je tesná korelácia hladín jednotlivých mRNA. Klonovanie IL-18 cDNA z pankreasovej RNA a nasledujúce sekvenovanie preukázalo identitu s IL-18 sekvenciou, klonovanou z Kupfferových buniek a in vivo pre-aktivovaných makrofágov. Ďalej, makrofágy NOD myši v reakcii na cyklofosfamid exprimovali gén IL-18, zatiaľ čo makrofágy z paralelne rovnako ošetrených Balb/c myší nemali uvedenú vlastnosť. Preto expresia IL-18 je u NOD myši abnormálne regulovaná a tesne spojená s vývojom diabetes [32].

IL-18 má potenciálnu úlohu v imunoregulácii alebo v zápalových stavoch rozšírením funkčnej aktivity Fas ligandu na Thl bunkách [10] IL-1S je tiež exprimovaný v adrenálnom cortexe, a preto by mohol byť sekrečný neuro-imunomodulátor, ktorý by mal dôležitú úlohu v zosúladení imúnneho systému po stresujúcej udalosti [9].

IL-18 je in vivo vytváraný štiepením pro-IL-18 a jeho endogénna aktivita vzniká na ujmu produkcie IFN-γ v prípadoch smrti, sprostredkovanej P. acnes a LPS. Blokovanie biologickej aktivity IL-18 je u ľudí terapeutickou stratégiou pri mnohých ochoreniach práve pre uvedenú aktivitu. Blokovanie sa môže uskutočňovať použitím rozpustných receptorov alebo blokovaním protilátok k bunkovo viazanému receptoru IL-18.

Cytokínové väzbové proteíny (rozpustné cytokínové receptory) zodpovedajú extracelulámym ligandovým väzbovým doménam príslušných cytokínových receptorov na povrchu bunky. Sú odvodené alebo alternatívnym strihom pre-mRNA, čo je bežné pri bunkovom povrchovom receptore, alebo proteolytickým štiepením povrchového bunkového receptora. Uvedené rozpustné bunkové receptory boli už v minulosti opísané, vrátane, medzi inými, rozpustných receptorov z IL-6 a IFN-γ [30], TNF [11, 12], IL-1 a IL-4 [21], IFN-α/β [28, 29] a ďalšie. Jeden cytokínový väzbový proteín, označovaný ako osteoprotegerín (oPG, tiež známy ako osteoklastový inhibičný faktor - OCIF), člen skupiny TNFRZFas sa javí ako prvý príklad rozpustného receptora, ktorý jestvuje iba ako sekretovaný proteín [1, 34, 39],

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je IL-18 väzbový proteín - IL-18BP, vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z: (a) polypeptidov zahŕňajúcich aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo 6; (b) polypeptidov, ako sú definované v (a) bez vedúcej sekvencie; (c)muteínov majúcich najmenej 80 % homológiu s IL-18BP, ako je definovaný v (a) alebo (b), ich fuzovaných proteínov, chemicky modifikovaných derivátov, kruhovo permutovaných derivátov a zmesí; a viažucich sa na IL-18 a blokujúcich IL-18-indukovanú produkciu IFN-γ.

Vynález sa týka tiež spôsobu izolácie IL-18BP z telových tekutín ľudí a spôsobu ich získania rekombinantným spôsobom; vynález sa ďalej týka expresných vektorov od IL-18BP, vhodných na expresiu IL-18BP u ľudí a ďalších cicavcov. Špecifické IL-18BP, vírusovo kódované IL-18BP homológy, ich fúzované proteíny, mutanty, funkčné deriváty, aktívne fragmenty a kruhovo upravené ich deriváty podľa tohto vynálezu sú užitočné na moduláciu a/alebo blokovanie biologických aktivít IL-18.

Vynález ďalej zahŕňa replikovateľné expresné nosiče, obsahujúce DNA, vhodné na expresiu rôznych IL-18BP v hostiteľských bunkách, ďalej týmto spôsobom transformované hostiteľské bunky, a expresiou uvedených hostiteľov produkované proteíny a polypeptidy.

Vynález ďalej zahŕňa farmaceutické prostriedky, obsahujúce vhodné nosiče a IL-18BP, alebo vírusové IL-18BP, alebo vektory na expresiu IL-18BP v organizme ľudí a iných cicavcov; uvedené farmaceutické prostriedky sa použijú na liečbu chorôb alebo stavov, ktoré vyžadujú moduláciu a/alebo blokovanie aktivity IL-18.

Vynález ďalej zahŕňa protilátky k IL-18BP a k vírusovému IL-18BP, vhodné na ich afinitné čistenie a imunoanalýzy.

Vynález sa vzťahuje na rôzne IL-18BP a vírusové IL-18BP ktoré sa viažu k

IL-18. Také IL-18BP môžu byť schopné modulovať a/alebo blokovať biologické aktivity interleukínu-18.

Výrazy „IL-18BP a vírusový IL-18BP“ zahŕňajú zrelý proteín (bez signálnej sekvencie), proteín obsahujúci signálne sekvencie, mutanty IL-18BP s vírusových IL-18BP, deriváty IL-18BP a vírusových IL-18BP a skrátené formy IL-18BP a vírusových IL-18BP a ich soli.

Vynález sa ďalej vzťahuje na replikovateľné expresné nosiče, vhodné na expresiu rôznych IL-18BP alebo vírusových IL-18BP v hostiteľských bunkách a hostiteľských baktériách. Vynález sa ďalej vzťahuje na expresné vektory, vhodné na expresiu rôznych IL-18BP alebo vírusových IL-18BP v organizme ľudí alebo iných cicavcov.

Vynález sa ďalej vzťahuje na DNA kódujúce rôzne IL-18BP, vírusové IL-18BP, mutanty, fúzované proteiny, funkčné deriváty a ich zmesi. Uvedené DNA môžu byť genómové DNA, cDNA, syntetické DNA, produkt PCR alebo ich kombinácie. Podľa tohto vynálezu môžu byť uvedené DNA vložené do replikovateľných expresných nosičov na expresiu rôznych IL-18BP a vírusových IL-18BP v hostiteľských bunkách. Do tohto vynálezu sa tiež zahŕňajú DNA schopné hybridizácie k uvedeným DNA v prísnych podmienkach a kódujúce proteíny alebo polypeptidy, ktoré sú tiež schopné viazať IL-18.

Jedna z uvedených DNA kóduje IL-18BP vrátane aminokyselinovej sekvencie SEQ ID No: 10 a je vybavená stop kodónom na jej 3'- konci.

Expresné vektory, vhodné na expresiu rôznych IL-18BP alebo vírusových IL-18BP u ľudí a ďalších cicavcov, napríklad na génovú terapiu, môžu byť expresné vektory alebo iné typy vektorov, do ktorých boli vložené gén IL-18BP, alebo cDNA z IL-18BP, alebo DNA, kódujúca vírusový IL-18BP takým spôsobom, ktorý umožňuje účinnú expresiu IL-18BP alebo vírusového IL-18BP v človeku alebo inom cicavcovi. V tomto vynáleze sú zahrnuté tiež molekuly DNA, hybridizujúce uvedené DNA v prísnych podmienkach a kódujúce proteíny alebo polypeptidy, ktoré sú schopné viazať IL-18.

Izolácia IL-18BP sa môže podľa tohto vynálezu vykonať napríklad prechodom telovej tekutiny, ako je moč alebo sérum, chromatografíckým stĺpcom, na ktorý je viazaný IL-18 a následne elúciou viazaného IL-18BP.

Rôzne IL-18BP a vírusové IL-18BP možno pripraviť tiež rekombinatným spôsobom, napríklad expresiou IL-18BP vo vhodnej hostiteľskej bunke, po operatívnom spojení s promótormi, enhancermi expresie, sekvenčnými regulátormi a podobnými, vhodnými v použitom príslušnom hostiteľskom prostredí, napríklad ktoré umožňujú expresiu v správnej orientácii.

Rôzne IL-18BP a vírusové IL-18BP a vektory na expresiu IL-18BP u ľudí a iných cicavcov sa môžu použiť na liečbu a/alebo zmiernenie stavov, ktorých sa zúčastňuje IL-18, alebo ktoré spôsobuje IL-18 nadbytkom exogénne prijímaného alebo endogénne produkovaného IL-18. Tieto stavy sú napríklad autoimunitné ochorenia, diabetes I. typu, reumatoidná artritída, odmietanie štepov, zápalové črevné ochorenia, sepsy, skleróza multiples, reumatoidná artritída, ischémické choroby srdca (vrátane srdcových záchvatov), ischemické choroby mozgu, chronická hepatitída, psoriáza, chronická pankreatitída, akútna pankreatitída a podobné ochorenia.

Izolácia IL-18BP sa podľa tohto vynálezu vykoná z normálného ľudského moču v jednej chromatografickej operácii. Príprava surových proteínových preparátov z ľudského moču sa vykoná skoncentrovaním 500 litrov ľudského moču a koncentrát sa nasadí na kolónu, obsahujúcu ľudský IL-18, viazaný na agarózu. Kolóna sa premyje a viazaný proteín sa eluuje pri nízkom pH. Eluované podiely sa neutralizujú a alikvotné časti sas analyzujú spôsobom SDS-PAGE (10 % akrylamid) v neredukčných podmienkach a farbením striebrom. Z eluovaných podielov sa špecificky získal proteínový pás ~40 kD (obr. 1).

V prvom kroku získaný ~40 kD proteín sa identifikoval ako IL-18 väzbový proteín podľa jeho schopnosti sa špecificky zosieťovať s ¹²⁵T-IL-18 (obr. 2). Uvedený ~40 kD proteín sa ďalej charakterizoval sekvenčnou analýzou proteínového N-terminálu. Alikvotné časti z eluovaného proteínu sa spracovali spôsobom SDS-PAGE, preniesli (elektrobloting) na PVDF membránu a podrobili sa proteínovej sekvenčnej mikroanalýze. Podobne sa vykonali proteínové sekvenčné mikroanalýzy priamo z eluovaných proteínov. V obidvoch prípadoch sa získali dve polypeptidové sekvencie; prevládajúca sekvencia a minortiná sekvencia; druhá zodpovedala fragmentu ľudského defenzínu (prístupové číslo pil 398), počínajúc aminokyselinou 65. Odpočítaním známej defenzínovej sekvencie sa zistila nasledujúca sekvencia:

T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A

... 5 .... 10 . .

v ktorej x znamená doteraz neurčenú aminokyselinu.

Aby sa určila dlhšia a presnejšia sekvencia a aby sa identifikovali možné cysteínové zvyšky, alikvotná časť eluovaného podielu sa redukovala s DTT v denaturačných podmienkach, potom sa nechala reagovať s 4-vinylpyridínom, pomocou mikroultrafiltračného zariadenia (Ultrafree, hranica 10 000 Da, Millipore) sa odstránila soľ, a vykonala sa proteínová sekvenčná mikroanalýza. Po prvom sekvenčnom kole sa zvyškový proteín nechal reagovať s o-ftalaldehydom na blokovanie všetkých nie Pro N-terminálnych peptidov a znova sa vykonalo sekvenovanie. Týmto spôsobom sa získala ďalej uvedená sekvencia samotného proteínu:

TPVSQXXXAA XASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT

10 20 30 40 (T = Thr; P = Pro; V = Val; S = Ser; Q = Gin; X = neurčené; A = Ala, R = Arg; K = Lys; D = Asp; C = Cys; F = Phe; L = Leu; E = Glu.)

Podľa vyhľadávania v bankách údajov proteínových sekvencií je výsledná sekvencia významne rozdielna od sekvencií ktoréhokoľvek zo známych proteínov. Pri prehľadávaní v banke údajov ústavu pre genómový výskum (The Inštitúte of genomic Research, TIGR) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) s použitím programu tblastn-search poskytlo súbor cDNA, označený THC123801, ktorého otvorený čítací rámec (218 kodónov), ak sa preložil, obsahoval sekvenciu s vysokou homológiou k sekvencií N-terminálnej sekvencie IL-18BP. Uvedená homológia je:

(Horná sekvencia (1 až 40) je sekvencia IL-18BP, izolovaná podľa tohto vynálezu; spodná sekvencia (51 až 100) je odvodená transláciou cDNA súboru THC123801 z TIGR).

Uvedená cDNA sekvencia, identifikovaná ako THC123801 je ale iba EST (expressed sequence tag), to znamená vybraný cDNA kloň. Nebola nikdy analyzovaná s cieľom zistiť, či EST obsahoval ORF, alebo či proteín je exprimovaný z génu, zodpovedajúcemu EST alebo z EST samotného, ani nebola nikdy identifiko vaná, že by mala funkciu proteínu, kódovaného THC123801. Nebola známa informácia, že by THC1238O1 obsahoval ORF, kódujúci pre IL-18BP.

Afinitne čistený urinámy IL-18BP si zachoval schopnosť viazať značkovaný ligand (¹²⁵I-IL-18) a s následným kovalentným zosieťovaním na komplex s molekulovou hmotnosťou 58 kD. Molekulová hmotnosť tohto komplexu zodpovedala pomeru 1 : 1 (~40 kD IL-18BP): (19 kD IL-18); (obr. 2).

Afinitne čistený urinámy IL-18BP blokoval biologickú aktivitu IL-18 u človeka, ako aj u myši. Ak sa IL-18BP pridá k ľudskému alebo myšaciemu IL-18, a ak je pridaný spolu s lipopolysacharidom (LPS) do kultúr slezinových buniek myši, potom blokuje schopnosť IL-18 indukovať produkciu interferonu γ (obr. 3).

V tomto opise používaný výraz „biologická aktivita IL-18“ znamená inter alia najmenej jednu z ďalej uvedených vlastností:

(a) indukciu IFN-γ, primáme ako ko-stimulant s mitogénmi, IL-1, IL-12, TNF-α, LPS v rôznych typoch buniek, ako sú mononukleové bunky, slezinové bunky myši, krvné periférne mononukleové bunky človeka, bunkové línie KG-1 človeka a T-bunky, (b) zosilňovanie proliferácie T-buniek, (c) zosilňovanie produkcie cytokínov Thl in vitro, primáme ako ko-stimulant, (d) syncrgický účinok s IL-12 z hľadiska zosilnenia produkcie IFN-γ, ko-stimulačný účinok naprodukciu IFN-γ a ďalších T-pomocná bunka-1 cytokínov, (e) ko-stimulačný účinok pre FAS ligandom sprostredkovanú cytotoxickosť prirodzených klonov ničivých (killer) buniek myši, (f) indukcia aktivácie NF-κΒ v ľudských KG-1 bunkách, pravdepodobne indukciou tvorby 50 NF-κΒ homodimém a p65/p50 NF-κΒ heterodiméru, (g) indukcia IL-8.

V tomto opise sa používa výraz „väzbový k IL-18“, „IL-18 väzbový“ alebo „viažuci sa s IL-18“, čo znamená schopnosť IL-18BP viazať IL-18, ako sa napríklad dokázalo jeho väzbou k značenému IL-18 pri afinitnom čistení v príklade 2.

V tomto opise sa používa výraz „modulácia aktivity IL-18“, ktorý znamená schopnosť IL-18BP modulovať akúkoľvek inú aktivitu IL-18 ako blokovanie, napríklad čiastočnú inhibíciu, zosilňovanie a podobné.

V tomto opise sa používa výraz „blokovanie aktivity IL-18“; tento výraz sa vzťahuje na aktivitu IL-18BP blokovať najmenej jednu z uvedených biologických aktivít IL-18. Ako príklad schopnosti IL-18BP blokovať aktivitu IL-18 možno uviesť schopnosť IL-18BP blokovať IFN-γ expresiu, združenú s IL-18, v splenocytoch myši. Ako bude podrobnejšie opísané ďalej, modulačná alebo blokovacia aktivita IL-18BP je čiastočne dôsledkom skutočnosti, že IL-18BP inhibuje aktiváciu NF-κΒ s IL-18. Ďalej, IL-18BP blokuje najmenej jednu z ďalej uvedených aktivít IL-18: najmä indukciu IFN-γ v bunkách človeka a myši, indukciu IL-8 a aktiváciu NF-κΒ.

DNA sonda na vytriedenie a výber (skríning) cDNA knižníc sa pripravila reverzne-transkripčnou PCR so špecifickými smerovými a protismerovými primármi a RNA z Jurkat T buniek človeka s primármi zo sekvencie TIGR. Výsledný PCR produkt sa potvrdil DNA sekvenčnou analýzou. Tento produkt PCR sa označil ³²[P] a použil sa ako sonda na výber štyroch cDNA knižníc človeka, odvodených z periférnych krvných monocytov, z línie Jurkat T-buniek, z PBMC a z ľudskej sleziny. Rôzne nezávislé cDNA klony zodpovedali štyrom variantom IL-18BP strihov (SEQ ID No: 1, 3, 5 a 7). Všetky strihové varianty kódovali pre predpokladané rozpustné sekretované proteíny. Najviac zastúpený (IL-18BPa) mal ORF z 192 kodónov, kódujúci pre signálny peptid, v tomto texte niekedy označovaný ako „vedúca sekvencia“ 28 aminokyselinových zvyškov; potom nasledoval zrelý putatívny IL-18BPa, ktorého prvých 40 zvyškov dokonale súhlasí so sekvenciou proteínového N-terminálu urinámeho IL-18BP (SEQ ID No: 2). Poloha cysteinových zvyškov vedie k názoru, že tento polypeptid náleží do imunoglobulínovej (Ig) super-skupiny. Zaujímavé je, že každý zo štyroch Gin zvyškov v zrelom IL-18BPa bol potenciálnym glykozylačným miestom. Tri ďalšie varianty IL-18BP boli menej zastúpené ako IL-18BPa. Zahŕňali kratšiu, 1 kb IL-18BPb cDNA, kódujúcu pre signálny peptid z 28 aminokyselinových zvyškov, nasledovaná zrelým proteínom z 85 aminokyselinových zvyškov (SEQ ID No: 4). Tretí variant, IL-18BPc, predstavoval 2,3 kb cDNA, kódujúcu pre signálny peptid z 28 aminokyselinových zvyškov, nasledovanú zrelým IL-18BP z 169 aminokyselinových zvyškov (SEQ ID No: 6). Štvrtý variant, IL-18BPd, kódoval pre signálny peptid z 28 aminokyselinových zvyškov, nasledovaný zrelým IL-18BP z 133 aminokyselinových zvyškov (SEQ ID No: 8).

V ďalšom štúdiu možnej existencie ďalších IL-18BP strihových variantov sa genómová knižnica človeka triedila pomocou sondy, zodpovedajúcou plnej dĺžke IL-18BP cDNA. V tejto knižnici sa identifikovalo päť genómových klonov, ktoré sa líšili dĺžkou. Tieto klony sa podrobili DNA sekvenčnej analýze s externými a internými primármi. Z týchto klonov bola zostavená spolu 7,8 kb sekvencia (SEQ ID No: 9). V uvedenej 7,8 kb sekvencii sa neidentifikoval nijaký exón, kódujúci pre transmembránový (TM) receptor. Všetky varianty obsahovali bežné translačné štartovacie miesto, kódované pre ten istý signálny peptid s 28 aminokyselinovými zvyškami a rozpustné zrelé proteíny rôznych veľkostí a C-terminálové sekvencie. Oblasť IL-18BP ob sahuje ďalší gén, kódujúci pre nukleový mitotický proteín 1 (NUMA 1) umiestený na negatívnom vlákne. Toto zistenie lokalizuje uvedený IL-18BP gén k ľudským chromozómom 1 lql3 [36].

S úplnou proteínovou sekvenciou IL-18BPa sa vykonal prieskum homológie pomocou banky údajov GenPept (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) a s použitím Smithovho Watermannovho algoritmu. Zistilo sa, že homo5 logy IL-18BP sú exprimované v niekoľkých Poxvírusoch ako sekretované proteíny s dovtedy neznámou funkciou. Už bolo uvedené, že vírusy kódujú pre rôzne cytokínové receptory a že vírusmi kódované molekuly slúžia ako návnadové receptory, ktoré inhibujú imunitné reakcie neutralizáciou im zodpovedajúcich cytokínov (prehľadný článok od: Spiggs M. K., Curr. Opin. Immunol. 6, 526 až 529 (1994)). Preto sa tento vynález ďalej týka vírusmi kódovaných homológov IL-18BP, ktoré môžu slúžiť ako blokery alebo modulátory 10 biologickej aktivity IL-18. Príklady vírusmi kódovaných homológov IL-18BP sú uvedené v tabuľke 1.

Podľa tohto vynálezu môžu byť vírusom kódované homológy IL-18BP exprimované v prokaryotickom a eukaryotickom hostiteľskom prostredí. V tomto opise sa používa výraz „vírusom kódovaný IL-18BP“, ktorý sa vzťahuje na podobnosť najmenej 50 % v sekvenciách najmenej 70 aminokyselinových zvyškov. Výhodnejšie má najmenej 50 %, najmenej 60 %, najmenej 70 %, najmenej 80 %, alebo najvýhodnejšie najmenej 15 90 % podobnosť v sekvencii 100 aminokyselinových zvyškov.

Tabuľka 1

Vírusom kódované proteíny, ktoré majú vysokú homológiu k IL-18BP človeka

Sekvencia GenPept	Typ vírusu
MCU60315 54	U60315 subtyp 1 vírusu Molluscum contagiosum
MCU60315 53	U60315 subtyp vírusu Molluscum contagiosum
SWPHLSB 12	L22013 vírus Swinepox
CV41KBPL 14	vírus Cowpox
VVCGAA 5	vírus Variola
U01161 3 174	vírus Ectromelia (Poxvírus myši)
VVU18340 6	vírus Variola
VVU18338 7	vírus Variola
VVU18337 7	vírus Variola
VACG 7 173	vírus Variola major
MCU60315 51	vírus Molluscum contagiosum
HNABV 1	vírus spojený s novou hepatitídou, nie A, nie B

IL-18BPa bol exprimovaný v bunkách COS7 opice. Na tento účel sa cDNA z IL-18BPa inzertovala do expresného vektora pEF-BOS cicavca. Kazeta, kódujúca pre sekvenciu (His)₆ sa pridala na 3'-koniec IL-18BP otvorených čítacích rámcov (oRF) v ráme, aby sa uľahčilo čistenie rekombinantného proteínu. Bunky COS7 boli prechodne transfektovanc expresným vektorom a bezsérové prostredie týchto buniek (150 ml) sa 25 skoncentrovalo a čistilo pomocou chromatografie s chelátmi kovov. IL-18BPa poskytol samostatný pás pri SDS-PAGE pri farbení striebrom v redukčných aj v nie redukčných podmienkach a mal rovnakú zdanlivú molekulovú hmotnosť ako urinámy IL-18BP. Proteínová sekvenčná analýza tohto produktu prípravy potvrdila rovnakú N-terminálovú sekvenciu ako v urinámom IL-18BP. Analýza imunopijakovaním (immunoblotting) IL-18BPa s protilátkami, v porovnaní so súčasne analyzovaným urinámym IL-18BP preukázala rovna30 ký pás pre molekulovú hmotnosť ako pri urinámom proteíne. Použitím imunoprecipitácie po SDS-PAGE a autorádiografíi bol IL-18BPa schopný tiež nahradiť urinámy ¹²⁵I-IL-18BP vo väzby s protilátkou. IL-18BPa preto štruktúrne zodpovedá IL-18BP, izolovanému z moču.

Surový aj čistený IL-18BPa sa skúšali na ich schopnosť inhibovať biologickú aktivitu IL-18. IL-18BPa inhiboval aktivitu ľudského aj myšieho IL-18 v splenocytoch myši, PBMC a KG-1 bunkovej línii človeka 35 (obr. 9). Tieto výsledky potvrdzujú identitu cDNA IL-18BPa ako kódujúcu pre biologicky aktívny IL-18BP.

Vynález sa ďalej vzťahuje na mutanty a fragmenty IL-18BP a vírusových IL-18BP, a na fuzované proteíny, obsahujúce divoký typ IL-18BP a vírusových IL-18BP, alebo na ich mutanty alebo fragmenty, fúzované k inému polypeptidu alebo proteínu, ktoré sú schopné sa viazať s IL-18 alebo jeho homológmi.

V opise používaný výraz „mutanty“ sa vzťahuje na analógy IL-18BP, alebo na analógy vírusového IL40 -18BP, v ktorom jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov prirodzeného IL-18BP alebo vírusového IL-18BP je nahradených inými aminokyselinovými zvyškami, alebo sú deletované, alebo jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov je pridaných k prirodzenej sekvencii IL-18BP, alebo vírusovej sekvencii bez toho, že by sa významne zmenila schopnosť výsledného produktu viazať sa k IL-18 v porovnaní s divokým typom IL-18BP alebo vírusovým typom IL-18BP. Uvedené mutanty sa pripravujú známymi syntéznymi postupmi 45 a/alebo postupmi techniky polohovo usmernenej mutagenézy, alebo akoukoľvek známou technikou, vhodnou na uvedený účel.

Z uvedených mutantov je výhodný ktorýkoľvek mutant, ktorý má sekvenciu aminokyselín, ktorá dostatočne kopíruje sekvenciu IL-18BP, alebo dostatočne kopíruje sekvenciu vírusového IL-18BP tak, že má v podstate podobnú aktiviru ako IL-18BP. Jedna z aktivít IL-18BP jc jeho schopnosť väzby s IL-18. Pokiaľ má mutant podstatnú väzbovú aktivitu k IL-18 možno ho použiť na čistenie IL-18, napríklad spôsobmi afmitnej chromatografie a tak ho možno považovať za mutant s podobnou aktivitou ako IL-18BP. Potom možno zaužívanými experimentálnymi spôsobmi určiť, či niektorý mutant má v podstate rovnakú aktivitu ako IL-18BP; pritom sa mutant podrobí napríklad sendvičovej porovnávacej analýze na stanovenie, či sa viaže alebo neviaže k vhodne značenému IL-18, napríklad postupmi rádioimunoanalýzy alebo analytickým spôsobom ELISA.

Vo výhodnom uskutočnení má ktorýkoľvek taký mutant najmenej 40 % identitu alebo homológiu so sekvenciou alebo IL-18BP alebo vírusom kódovaného IL-18BP homológa. Výhodnejšie má taký mutant najmenej 50 %, najmenej 60 %, najmenej 70 %, najmenej 80 %, alebo najvýhodnejšie, najmenej 90 % identitu alebo homológiu s uvedenou sekvenciou.

Mutanty IL-18BP polypeptidov alebo mutanty vírusových IL-18BP, ktoré možno použiť podľa tohto vynálezu, alebo pre nich kódujúca nukleová kyselina, zahŕňajú určitú zostavu podstatne zodpovedajúcich sekvencií ako substitučné peptidy alebo polynukleotidy, ktoré skúsený pracovník v danej oblasti môže bez zbytočného experimentovania získať na základe poznatkov a návodov z tohto opisu. Podrobný opis chémie a štruktúry proteínov pozri v: Schulz G. E., a ďalší, Principles of Proteín Structure, Springer-Verlag, New York 1978; a Creighton T. E., Proteíns, Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco 1983, ktoré sa tu zahŕňajú týmto odkazom. Nukleotidové sekvenčné substitúcie, ako sú kodónové preferencie, pozri: Ausubel a ďalší, ibid v §§ A. 1.1 až A. 1.24; a Sambrook a ďalší, ibid, v App. C a App. D.

Podľa tohto vynálezu sú výhodné také zmeny mutantov, ktoré sú známe ako „konzervatívne“ substitúcie. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie IL-18BP polypeptidov alebo proteínov alebo vírusových TL-18BP môžu zahŕňať synonýmne aminokyseliny v rozsahu skupiny, korá má dostatočne podobné fyzikálnechemické vlastnosti tak, aby sa pri substitúcii medzi členmi skupiny zachovala biologická funkcia molekuly, pozri: Grantham, Science 185, 862 až 864 (1974). Je zrejmé, že inzercie a delécie aminokyselín možno v určených sekvenciách vykonať tiež bez zmeny ich funkcie, najmä ak sa inzercie alebo delécie týkajú iba niekoľkých aminokyselín, napríklad menej ako tridsiatich, výhodne menej ako desiatich aminokyselín, a nevyžadujú odstránenie alebo nahradenie aminokyselín, ktoré sú kritické pre funkčnú konformáciu, napríklad cysteínové zvyšky, pozri: Afmsen, Principles That Govem The Folding of Proteín Chains, Science 181, 223 až 230 (1973). Proteíny a mutanty, produkované opísanými deléciami a/alebo inzerciami patria tiež do rozsahu tohto vynálezu.

Cysteínové zvyšky, ktoré nepodmieňujú biologickú aktivitu sa môžu nahradzovať inými zvyškami, napríklad preto, aby sa predišlo vzniku neželaných vnútromolekulových alebo medzimolekulových disulfidových môstikov, ktoré môžu spôsobovať znižovanie aktivity IL-18BP.

Výhodné sú tie skupiny aminokyselín, ktoré sa uvádzajú v tabuľke 1. Výhodnejšie skupiny aminokyselín sú zhrnuté v tabuľke 2; najvýhodnejšie synonymné skupiny aminokyselín sú aminokyseliny, určené v tabuľke 3.

Tabuľka 2

Výhodné skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arf, Gin, Lys, Glu, His
Leu	íle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, íle, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Lle	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, íle
Phe	Trp, Met, Tyr, íle, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, íle, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp

Aminokyselina	Synonymná skupina
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, íle, Val, Leu, Met
Trp	Trp

Tabuľka 3

Výhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, íle, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, íle
Gly	Gly
íle	íle, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, íle, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, íle, Val, Leu
Trp	12

Tabuľka 4

Najvýhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, íle, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
íle	íle, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, íle, Leu
IlP	Met

Príklady produkcie aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré sa môžu použiť na získanie mutantov IL-18BP polypeptidov alebo proteinov, alebo mutantov vírusových IL-18BP, na použitie podľa tohto vy nálezu zahŕňajú ktorékoľvek známe kroky, ako kroky, ktoré sa uvádzajú v patentoch USA RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, a 4,737,462 pôvodcu Mark a ďalší; 5,116,943 pôvodcu Koths a ďalší; 4,965,195 pôvodcu Namen a ďalší; 4,879,111 pôvodcu Chong a ďalší, a 5,017,691 pôvodcu Lee a ďalší; a lyzínom substituované proteíny, opísané v patente USA 4,904,584 (pôvodca Show a ďalší).

V inom výhodnom uskutočnení tohto vynálezu má ktorýkoľvek mutant IL-18BP alebo vírusového IL-18BP aminokyselinovú sekvenciu celkom zodpovedajúcu sekvenciám IL-18BP alebo vírusového IL-18BP. Výraz „celkom zodpovedajúcu“ sa používa v tom zmysle, že zahŕňa proteíny s malými zmenami oproti sekvencii prirodzeného proteínu; takými zmenami, ktoré neovplyvňujú základné vlastnosti prirodzených proteínov, najmä pokiaľ sa týka ich schopnosti viazať IL-18. Typy zmien, ktoré sa vo všeobecnosti považujú za také, na ktoré sa môže vzťahovať výraz „celkom zodpovedajúce“, sú také zmeny, ktoré by mohli byť výsledkom zvyčajných mutagéz DNA, kódujúcich tieto proteíny, vyúsťujúcich do niekoľko málo modifikácií a výberu podľa vyžadovanej aktivity spôsobom, opísaným skôr. Popri schopnosti viazať IL-18 môžu mutanty tiež modulovať a/alebo blokovať IL-18 aktivitu.

Mutanty podľa tohto vynálezu zahŕňajú proteíny, kódované nukleovou kyselinou, ako je DNA alebo RNA, ktorá podľa tohto vynálezu v prísnych podmienkach hybridizuje DNA alebo RNA, ktorá kóduje IL-18BP alebo vírusový IL-18BP. Vynález tiež zahŕňa takú nukleovú kyselinu, ktorá je užitočná tiež ako sonda pri identifikácii a čistení vyžadovanej nukleovej kyseliny. Ďalej, uvedená nukleová kyselina by mohla byť prvým kandidátom na určenie, či kóduje polypeptid, ktorý si zachováva íúnkčnú aktivitu IL-18BP podľa tohto vynálezu. Výraz „prísne podmienky“ sa vzťahuje na hybridizáciu a následné podmienky premývania, ktoré odborníci bežne skúsení v danom odbore označujú ako „prísne“, pozri: Ausubel a ďalší, Current Protocols in Molecular Biology, ibid, Interscience, N. Y., §§ 6.3 a 6.4 (1987 a 1992); a Sambrook a ďalší, ibid. Príklady prísnych podmienok zahŕňajú podmienky premývania 12 až 20 °C pod vypočítanou hodnotou Tm študovaného hybridu, napríklad 2 x SSC a 0,5 % SDS počas 5 minút, 2 x SSC a 0,1 % SDS 15 minút; 0,1 x SSC a 0,5 % SDS pri 37 °C počas 30 až 60 minút a potom 0,1 x SSC a 0,5 % SDS pri 68 °C po 30 až 60 minút. Uvedené príklady ale nijako neobmedzujú výber iných prísnych podmienok. Odborníkom skúseným v danej oblasti je zrejmé, že prísnosť podmienok závisí tiež od dĺžky DNA sekvencií, oligonukleotidových sond (napríklad 10 až 40 báz), alebo zmiešaných oligonukleotidových sond. Ak sa použijú zmiešané sondy je výhodné, ak sa použije chlorid tetrametylamónia (TMAC) miesto SSC, pozri: Ausubel, ibid.

Vynález ďalej zahŕňa nukleové kyseliny, ktoré kódujú pre IL-18BP podľa tohto vynálezu, ale ktoré sa líšia v sekvencií kodónu v dôsledku degenerácie genetického kódu. Taká DNA, ktorá pravdepodobne nehybridizuje v prísnych podmienkach na DNA sekvencie znázornené na obr. 4 až 7, ale aj tak je schopná kódovať IL-18BP podľa tohto vynálezu, a preto je zahrnutá v tomto vynáleze.

Výraz „fuzovaný proteín“ sa vzťahuje na polypeptid, obsahujúci 1L-18BP, alebo vírusový IL-18BP, alebo jeho mutant, fúzovaný s iným proteínom, ktorý má napríklad predĺženú zdržnú dobu v telových tekutinách. IL-18BP, alebo vírusový IL-18BP môžu sa potom fuzovať k inému proteínu, polypeptidu a podobným, napríklad s imunoglobulínom alebo jeho fragmentom. Aby sa dosiahla predĺžená zdržná doba v telových tekutinách, IL-18BP alebo vírusový IL-18BP sa môže fúzovať tiež s polyetylénglykolom (PEG).

Výraz „soli“ tu znamená oba typy solí, soli karboxylových skupín a adičné soli amínových skupín IL-18BP a vírusového IL-18BP, ich mutantov, alebo fúzovaných proteínov. Soli karboxylovej skupiny sa môžu vytvárať spôsobom, ktorý je v odbore známy a zahŕňa anorganické soli, napríklad sodné, vápenaté, amónne, železité alebo zinočnaté soli a podobné, a soli s organickými zásadami, ako sú soli, ktoré sa tvoria s amínmi, napríklad s trietanolamínom, arginínom alebo lyzínom, piperidínom, prokainom a podobnými. Adičné soli s kyselinami zahŕňajú napríklad soli s minerálnymi kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková alebo kyselina sírová, a soli s organickými kyselinami, napríklad s kyselinou octovou alebo kyselinou šťaveľovou. Každá taká soľ musí ale samozrejme v podstate mať aktivitu podobnú IL-18BP.

Výraz „funkčné deriváty“ sa v tomto opise používa tak, že zahŕňa deriváty IL-18BP alebo vírusových IL-18BP, ich mutanty a fúzované proteíny, ktoré sa môžu pripraviť napríklad z funkčných skupín, ktoré sa nachádzajú ako vedľajšie reťazce na zvyškoch alebo na N- alebo C- terminálnych skupinách; príprava sa môže vykonať spôsobmi, ktoré sú v odbore známe; funkčné deriváty sa zahŕňajú do tohto vynálezu, pokiaľ si zachovávajú svoju farmaceutickú prípustnosť, to znamená, keď neničia aktivitu proteínu, ktorá je v podstate podobná aktivite IL-18BP alebo vírusového IL-18BP a nevnáša toxické vlastnosti do prostriedkov, ktoré taký funkčný derivát obsahujú. Tieto deriváty môžu obsahovať napríklad polyetylénglykolové vedľajšie reťazce, ktoré môžu maskovať antigénne miesta a predlžovať zdržnú dobu IL-18BP alebo vírusového IL-18BP v telových tekutinách. Ďalšie deriváty zahŕňajú alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín, vznikajúce reakciou s amoniakom, primárnymi alebo sekundárnymi amínmi, N-acylové deriváty voľných amínových skupín aminokyselinových zvyškov tvorených s acylovým zoskupením (napríklad alkanoyl alebo karbocyklické aroylové skupiny), alebo O-acylové deriváty voľných hydroxylových skupín (napríklad hydroxylových skupín serylových alebo treonylových zvyškov), vytváraných s acylovým zoskupením.

Ako „aktívne podiely/fŕakcie“ alebo „aktívne časti“ IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, ich mutantov a fúzovaných proteínov sa v tomto vynáleze rozumie akýkoľvek fragment alebo prekurzor polypeptidového re ťazca proteínovej molekuly samotnej, alebo spolu s pripojenými molekulami, alebo k nim viazanými zvyškami, napríklad sacharidovými alebo fosfátovými zvyškami, alebo agregáty proteínovej molekuly, alebo sacharidových zvyškov samotných, za predpokladu, že uvedená frakcia si v podstate zachováva schopnosť viazať IL-18.

Výraz „kruhovo upravené deriváty“ sa v tomto opise používa tak, že zahŕňa lineárnu molekulu, ktorej konce sú spolu spojené, priamo alebo cez linker za vzniku kruhovej molekuly; potom sa kruhová molekula otvorí v inej polohe za vzniku novej lineárnej molekuly s inými koncami, ako boli konce pôvodnej molekuly. Kruhové úpravy zahŕňajú tie molekuly, ktorých štruktúra je ekvivalentná molekule, ktorá bola upravená na kruhovú a potom otvorená. Kruhovo upravená molekula sa môže syntetizovať de novo ako lineárna molekula a nikdy neprejde reakčným stupňom vytvárania kruhového stavu a stupňom otvárania kruhu. Príprava kruhovo upravených derivátov sa opisuje v WO95/27732.

IL-18BP alebo vírusový IL-18BP môže byť produkovaný rôznymi rekombinantnými bunkami, ako sú prokaryotické bunky, napríklad E. coli, alebo ďalšie eukaryotické bunky, ako sú kvasinky alebo bunky hmyzu. Spôsoby konštrukcie príslušných vektorov, ktoré nesú DNA kódujúcu pre IL-18BP a vhodné na transformáciu (napríklad E. coli, bunky cicavcov a kvasinkovej bunky), alebo na infekciu buniek hmyzu, aby sa produkoval rekombinantný IL-18BP alebo vírusový IL-18BP, sú v odbore dobre známe. Pozri napríklad: Ausubel a ďalší, Current Protocols in Molecular Biology (1993); Sambrook a ďalší, Molecular Clonmg: A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold. Spring Harbor Press, Spring Harbor 1989.

Na účely expresie IL-18BP proteínov alebo vírusových IL-18BP proteínov sa DNA kódujúca IL-18BP alebo vírusový IL-18BP, ich fragmenty, mutanty alebo fuzované proteíny, a operatívne spojené transkripčné a translačné regulačné signály vložia (inzertujú) do vektorov, ktoré sú schopné integrovať vyžadované génové sekvencie do chromozómu hostiteľskej bunky. Aby bolo možné selektovať bunky, ktoré stabilne integrovali vloženú DNA do ich chromozómov, použil sa jeden alebo viac markerov, ktoré umožňujú selekciu hostiteľských buniek, ktoré obsahujú expresný vektor. Marker môže byť prototrópny proti auxotrópnemu hostiteľovi, biocídne odolný, napríklad antibiotiká, alebo odolný proti ťažkým kovom, napríklad medi a podobné. Selektabilný značený gén sa môže viazať alebo priamo k exprimovateľnej DNA génovej sekvencií, alebo sa môže ko-transfekciou vložiť do rovnakej bunky. Na optimálnu syntézu jednoreťazcovej väzbovej proteínovej mRNA môžu byť potrebné aj ďalšie zložky. Tieto zložky môžu zahŕňať strihové signály, transkripčné promótory, enhancery a terminačné signály.

Uvedená molekula DNA na vloženie do vybraných buniek sa výhodne zabuduje do plazmidu alebo vírusového vektora, schopných autonómnej replikácie v prijímacom hostiteľovi. Výhodné prokaryotické plazmidy sú derivátmi pBr322. Výhodné eukaryotické vektory zahŕňajú BPV, vaccinia, SV40, 2 mikrometrové krúžky a podobné, alebo ich deriváty. Uvedené plazmidy a vektory sú v odbore dobre známe [2, 5, 22], Keď sa vektor alebo sekvencia DNA, obsahujúca konštrukt(y) pripravila naexpresiu, môže sa expresný vektor vložiť do príslušnej hostiteľskej bunky ktorýmkoľvek zo známych spôsobov, ako je napríklad transformácia, transfekcia, lipofekcia, konjugácia, protoplastová fúzia, eletroporácia, zrážaním s fosforečnanom vápenatým, priama mikroinjekcia a podobné.

Podľa tohto vynálezu možno použiť hostiteľské bunky, ktoré môžu byť alebo prokaryotické alebo eukaryotické. Výhodné prokaryoty zahŕňajú baktérie, napríklad E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia a podobné. Nyj výhodnejší prokaryotický hostiteľ je E. coli. Mimoriadne zaujímaví bakteriálni hostitelia zahŕňajú E. coli K12 kmeň 294 (ATCC 31 446), E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W 3110 (F', lambda’, fototrópny (ATCC 27 325)). V uvedených podmienkach proteín nepodlieha glykozylácii. Prokaryotický hostiteľ sa musí znášať s replikonom a kontrolnými sekvenciami expresného plazmidu.

Pretože prirodzené IL-18BP sú ale glykozylované proteíny, výhodnejší sú eukaryotickí hostitelia ako prokaryotickí. Výhodný eukaryotický hostiteľ sú bunky cicavcov, napríklad človeka, opice, myši a vaječníkové bunky čínskeho škriečka (CHO), pretože poskytujú post-translačné modifikácie k proteínovým molekulám vrátane správneho skladania, tvorby disulfidových môstikov a umožňujú aj glykozyláciu na správnom mieste. Bunky kvasiniek a bunky hmyzu môžu byť tiež nositeľmi post-translačných peptidových modifikácií vrátane vysokej glykozylácie manózy.

Jestvuje značný počet DNA stratégií, ktoré využívajú silné promótorové sekvencie a vysoký počet kópií plazmidov, ktoré môžu byť využité na produkciu vyžadovaných proteínov v kvasinkách alebo bunkách hmyzu. Kvasinky a bunky hmyzu rozoznávajú vedúce sekvencie na klonovaných génových produktoch cicavcov a vylučujú zrelý (mature) IL-18BP. Po vložení vektora rastú hostiteľské bunky v selektívnom médiu, ktorým sa podľa rastu selektujú bunky obsahujúce vektor. Výsledkom expresie klonovanej génovej sekvencie (sekvencií) je produkcia IL-18BP a vírusového IL-18BP, ich fúzových proteínov, alebo mutantov, alebo ich fragmentov. Uvedené klonovanie, izolácia klonu, identifikácia, charakterizácia a postupy sekvenovania sa podrobnejšie opisujú v časti príklady uskutočnenia.

Exprimovaný proteín sa potom izoluje a čistí niektorým bežným spôsobom, zahŕňajúcim extrakciu, zrážanie, chromatografiu, elektroforézu a podobné spôsoby, alebo ho možno čistiť afinitnou chromatografiou s použitím napríklad anti-IL-18BP monoklonových protilátok, imobilizovaných na gélovej matrici, naplnenej v kolóne. Surové preparáty, obsahujúce rekombinantný IL-18BP sa nechajú pretiecť kolónou, pričom IL-18BP sa bude v kolóne viazať špecifickou protilátkou a nečistoty budú postupovať kolónou ďalej. Po premytí sa proteín eluuj e z gélu v podmienkach, zvyčajne používaných v tomto spôsobe izolácie, napríklad pri vysokom alebo nízkom pH, napríklad pri pH 11 alebo pri pH 2.

Vynález sa ďalej týka vektorov, užitočných na expresiu IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, alebo ich derivátov v cicavcoch a špecificky v človekovi. V literatúre sú dobre známe vektory na krátkodobú alebo na dlhodobú expresiu génov v cicavcoch. Štúdiá ukázali, že dodávaním génov do napríklad kostrových svalov, hladkých svalov ciev a pečene sa dosahujú systémové hladiny terapeutických proteínov. Kostrové svaly sú užitočný cieľ, pretože majú veľkú hmotnosť, sú dobre zásobené cievami a sú dostupné. Úspešne sa využili aj iné ciele, najmä prekurzory imúnnych buniek kostnej drene. V súčasnosti dostupné vektory na expresiu proteínov napríklad v svaloch zahŕňajú plazmidovú DNA, lipozómy, konjugáty proteínu a DNA a vektory, založené na adenovíruse, adeno-združenom víruse a víruse herpes. Z hľadiska trvania a hladín génovej expresie a z hľadiska úvah o bezpečnosti bol z uvedených najúspešnejších adeno-združený vírus (adeno-associated vírus, AAV) (Kessler P. D., Proc. Natl. Ac. Sci USA 93, 14 082 až 14 087 (1996)).

Postupy konštrukcií vektora, založeného na AAV boli už podrobne opísané (Snyder a ďalší, Current Protocols in Human Genetics, kapitoly 12.1.1 až 12.1.17, J.Wiley a, Sons 1996) a sú zahrnuté do tohto vynálezu. Stručne, plazmid psub201, obsahujúci divoký typ AAV genómu sa reže reštrikčným enzýmom Xba I a liguje konštruktom, ktorý obsahuje účinný eukaryotický promótor, napríklad cytomegalo-vírusový promótor, Kozákovu súhlasnú sekvenciu, DNA sekvenciu, kódujúcu pre IL-18BP alebo vírusový IL-18BP, alebo ich mutanty alebo fúzové proteíny, alebo ich fragmenty, vhodnú 3' netranslatovateľnú oblasť a polyadenylačný signál, napríklad polyadenylačný signál z vírusu simian 40. Výsledný rekombinantný plazmid sa ko-transfektuje na pomocný AAV plazmid, napríklad pAAV/Ad do buniek cicavca, napríklad do buniek T293 človeka. Kultúry sa potom infektujú adenovírusom ako pomocným vírusom a kultivačné supematanty sa oddelia po 48 až 60 hodinách. Uvedené supematanty sa frakcionujú zrážaním síranom amónnym, čistia v gradiente hustoty roztoku CsCl, dialyzujú a potom sa zahrievajú pri 56 °C, aby sa celkom zničil adenovírus, pričom výsledný rekombinantný AAV, schopný exprimovať IL-18BP alebo vírusový IL-18BP, alebo ich mutanty alebo fúzové proteíny, ostávajú v tomto kroku stále. Fyziologická úloha rozpustných cytokínových receptorov nebola doteraz určená. Rozpustné receptory viažu špecifické ligandy a vo väčšine prípadov inhibujú ich aktivity ako je zrejmé, napríklad v systéme TNF [11, 12], Vo veľmi malom počte prípadov, napríklad v prípade IL-6, rozpustný receptor zvyšuje biologickú aktivitu. Zistilo sa, že rekombinantný rozpustný TNF receptor, známy tiež ako TBP (TNF binding proteín, TBP), účinkuje preventívne pri septickom šoku v modeli na zvieratách, kým rozpustné formy IL-1 receptora mali naopak silný inibičný účinok na vývoj aloreaktivity in vivo príjemcov aloštepov u myší.

IL-18BP a vírusové IL-18BP podľa tohto vynálezu môžu mať využitie ako modulátory IL-18 aktivity, napríklad pri I. type diabetes, v septických stavoch, pri autoimunitných poruchách, pri odmietaní štepov, reumatoidnej artritíde, zápalových črevných chorobách, skleróze multiplex, ischemickom ochorení srdca vrátane akútneho srdcového záchvatu, ischemickom poškodení mozgu, chronickej hepatitíde, psoriáze, chronickej a akútnej pankreatitíde. Možno ich teda použiť napríklad pri akejkoľvek chorobe, pri ktorej chorobu vyvoláva endogénna produkcia alebo exogénny príjem IL-18, alebo zhoršuje situáciu pacienta.

Vynález ďalej zahŕňa farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú farmaceutický prípustný nosič a IL-18BP alebo vírusový IL-18BP podľa tohto vynálezu, alebo ich aktívne mutanty, fúzované proteíny a ich soli, funkčné deriváty alebo ich aktívne frakcie.

Vynález ďalej zahŕňa farmaceutické prostriedky, obsahujúce farmaceutický prípustný nosič a napríklad vírusový vektor, napríklad niektorý z uvedených na AAD založených vírusových vektorov, alebo iný vektor, exprimujúci IL-18BP alebo vírusový IL-18BP, alebo ich mutanty, fragmenty alebo fuzové proteíny, a ktorý je vhodný na podávanie človekovi alebo inému cicavcovi s cieľom dosiahnuť expresiu in vivo IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, alebo ich matunatov, alebo fragmentov, alebo fázových proteínov podľa tohto vynálezu, napríklad na použitie v génovej terapii.

Uvedené farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu sa pripravujú na podávanie zmiešaním IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, alebo ich derivátov, alebo vektorov na expresiu 1L-18BP, alebo vírusového IL-18BP, s fyziologicky prípustnými nosičmi a/alebo stabilizátormi, a/alebo prísadami a pripravia sa v dávkovej forme, napríklad lyofilizáciou vo vhodných obaloch. Spôsob podávania môže byť ktorýkoľvek z vhodných spôsobov podávania podobných látok a bude závisieť od stavu, ktorý sa má liečiť; môže ísť o intravenózne, intra-muskuláme, subkutánne podávanie, podávanie miestnou injekciou alebo topikálne podávanie, alebo nepretržité podávanie infúziou a podobne. Množstvo podávanej účinnej zlúčeniny bude závisieť od spôsobu podávania, liečeného ochorenia a stavu pacienta. Lokálne injekcie budú napríklad vyžadovať menšie množstvo proteínu na jednotku telesnej hmotnosti ako pri intravenóznej infúzii.

Podľa uvedeného sa IL-18BP alebo vírusové IL-18BP, alebo vektory exprimujúce IL-18BP alebo vírusové IL-18BP in vivo indikujú na liečbu auto-imunitných ochorení, I. type diabetes, reumatoidnej artritíde, pri odmietaní štepov, zápalových črevných chorobách, skleróze multiplex, ischemickom ochorení srdca vrátane akútneho srdcového záchvatu, ischemickom poškodení mozgu, chronickej hepatitíde, psoriáze, chronickej a akútnej pankreatitíde a podobných chorobách, pri ktorých je nenormálna expresia IL-18, ktorá vedie k nadbytku IL-18, alebo v prípadoch komplikácií v dôsledku exogénne prijímaného IL-18.

Vynález zahŕňa tiež protilátky proti IL-18BP a vírusovému IL-18BP, ako aj proti ich mutantom, fúzovaným proteínom, soliam, funkčným derivátom a aktívnym frakciám. Výraz „protilátky“ je mienený tak, že zahŕňa polyklonové protilátky, monoklonové protilátky (AMb), chimérové protilátky, anti-idiotypvé (anti-Id) protilátky k protilátkam, ktoré môžu byť označené a môžu byť v rozpustnej alebo viazanej forme, humanizované protilátky, ako aj ich fragmenty, získané ktorýmkoľvek známym spôsobom, ako je napríklad enzymatické štiepenie, peptidová syntéza alebo rekombinantné techniky a iné.

Polyklonové protilátky sú heterogénne populácie protilátkových molekúl, odvodených zo séra zvierat, imunizovaných antigénom. Monoklonálna protilátka obsahuje v podstate homogénnu populáciu protilátok, špecifických k antigénu, ktorá obsahuje v zásade podobné epitové väzbové miesta. MAb sa môžu získať spôsobmi, ktoré sú známe odborníkom v danej oblasti, pozri napríklad: Kohler a Milstein, Náture 256, 495 až 497 (1975); patent USA 4 376 110; Ausubel a ďalší, ed. ako hore; Harlow a Lane, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan a ďalší, ed., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. a Wiley Interscience, N. Y. 1992 a 1993), ktorých obsah sa tu ako celok zahŕňa týmto odkazom. Uvedené protilátky môžu byť z niektorej imunoglobulínovej skupiny vrátane IgG, IgM, IgE, IgA, GILD a z ktorejkoľvek ich podskupiny. Hybridom produkujúci MAb podľa tohto vynálezu sa môžu kultivovať in vito alebo in vivo. Produkcia vysokých titrov monoklonových protilátok in vivo alebo in situ je v súčasnosti výhodným spôsobom ich produkcie.

Chimérové protilátky sú molekuly, ktorých rôzne časti sú odvodené z rôznych živočišných druhov, ako sú napríklad chimérové protilátky, ktoré majú premennú oblasť odvodenú z Mab myši a nemennú (konštantnú) oblasť z imunoglobulínu človeka. Chimérové protilátky sa primáme používajú na zníženie imunogénnosti a na zvýšenie výťažkov pri produkcii; humánne/myšie chimérové MAb sa napríklad použijú tam, kde monoklonové protilátky myši dávajú vyššie výťažky z hybridom, ale vyššiu imunogénnosť u ľudí. Chimérové protilátky a spôsoby ich produkcie sú v odbore známe (Cabilly a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81, 3273 až 3277 (1984); Morrison a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81, 6851 až 6855 (1984); Bouliane a ďalší, Náture 312, 643 až 646 (1984); Cabilly a ďalší, prihláška európskeho patentu 125 023 (zverejnená 14. novembra 1984); Neuberger a ďalší, Náture 314, 268 až 270 (1985); Taniguchi a ďalší, prihláška európskeho patentu 171496 (zverejnená 19. februára 1985); Morrison a ďalší, prihláška európskeho patentu 173494 (zverejnená 5. marca 1986); Neuberger a ďalší, prihláška PCT WO 8601533 (zverejnená 13, marca 1986); Kudo a ďalší, prihláška európskeho patentu 184187 (zverejnená 11. júna 1986); Sahagan a ďalší, J. Immunolog. 137, 1066 až 1074 (1986); Robinson a ďalší, prihláška WO 9702671 (zverejnená 7. mája 1987); Liu a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3439 až 3443 (1987); Sun a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 214 až 218 (1987); Better a ďalší, Science 240, 1041 až 1043 (1988); a Harlow a Lane, Antibodies: A laboratory manual, ako hore). Obsah týchto prác sa tu ako celok zahŕňa týmto odkazom.

Anti-idiotypová (anti-Id) protilátka je protilátka, ktorá rozoznáva všeobecne determinanty jedného druhu, spojené s antigénovým väzbovým miestom protilátky. Id-protilátka sa môže pripraviť imunizovaním živočícha rovnakého druhu a genetického typu (napríklad kmeň myší) ako zdroja Mab s MAb, ku ktorým sa anti-Id pripravuje. Imunizovaný živočích bude rozoznávať a vykazovať reakciu k idiotypovým determinantom imunizovanej protilátky tým, že produkuje protilátky k týmto idiotypovým determinantom (anti-Id protilátka). Pozri, napríklad: patent USA 4 699 880, ktorý sa tu ako celok zahŕňa týmto odkazom.

Uvedená anti-Id protilátka sa môže použiť tiež ako „imunogén“ na vyvolanie reakcie aj u iného živočícha tak, že produkuje takzvanú anti-anti-Id protilátku. Uvedená anti-anti-Id môže byť epitopikálne identická k pôvodne MAb, ktorá vyvolala anti-Id. Použitím protilátok k idiotypovým determinantom monoklonových protilátok je tak možné identifikovať iné klony, exprimujúce protilátky s identickou špecifickosťou.

Podľa uvedeného možno monoklonové protilátky vznikajúce proti IL-18BP a príbuzným proteínom podľa tohto vynálezu použiť na vyvolanie (indukciu) anti-Id protilátok vo vhodných živočíchoch, ako sú Balb/C myši. Slezinové bunky týmto spôsobom imunizovaných myší sa použijú na produkciu anti-Id hybridom, sekretujúcich anti-Id MAb. Ďalej, uvedené anti-Id MAb sa môžu viazať na nosič, ako je KLH (keyhole limpet hemocyanin) a použiť na imunizáciu ďalších Balb/C myší. Sérum týchto myší bude obsahovat anti-anti-Id protilátky, ktoré majú väzbové vlastnosti pôvodne MAb špecifickej pre IL-18BP epitop alebo epitopy vírusového IL-18BP.

Anti-Id monoklonové protilátky majú teda vlastné idiotypové epitopy, alebo „idiotopy“, štruktúrne podobné hodnoteným epitopom, ako je IL-18BP alebo vírusový IL-18BP.

Výraz „humanizovaná protilátka“ sa rozumie tak, že zahŕňa napríklad protilátky, ktoré sa získali manipuláciou protilátok myší spôsobmi génového inžinierstva tak, aby boli viac kompatibilné s ľudským organizmom. Uvedené humanizované protilátky v ľudskom organizme znižovali imunigenicitu a zlepšovali famakokinetiku. Humanizované protilátky možno pripraviť spôsobmi, ktoré sú v odbore známe, ako sa opisujú na príklad na prípravu humanizovaných anti-TNF protilátok v Molecular Immunology, 30,(16) 1443 až 1453 (1993).

Výraz „protilátka“ sa rozumie v tomto opise tiež tak, že zahŕňa obidve intaktné molekuly, ako aj ich fragmenty, ako sú napríklad Fab a F(ab')₂, ktoré sú schopné viazať antigén. Fab a F(ab')₂ fragmenty sú nedostatočné na Fe fragment intaktnej protilátky, miznú rýchlo z obehu a môžu mať menšiu nešpecifickú tkanivovú väzbu ako intaktná protilátka (Wahl a ďalší, J. Nucl. Med. 24, 316 až 325 (1983)). Bude výhodné, ak Fab a F(ab')₂ a ďalšie fragmenty protilátok podľa tohto patentu sa použijú na detekciu a kvantifikáciu IL-18BP alebo vírusového IL-18BP spôsobmi, ktoré sa tu uvádzajú pre molekuly intaktných protilátok. Také fragmenty sú typicky produkované proteolytickým štiepením s použitím enzýmov, ako je napríklad papaín (na produkciu Fab fragmentov) alebo pepsín (na podukciu F(ab')₂ fragmentov).

O protilátke sa hovorí, že je „schopná väzby“ molekuly, ak je schopná špecificky reagovať s uvedenou molekulou a tým viazať molekulu k protilátke. Výraz „epitop“ znamená tú časť ktorejkoľvek molekuly, ktorá je schopná byť viazaná protilátkou a ktorá môže byť tiež rozoznávaná uvedenou protilátkou. Epitopy alebo „antigénové determinanty“ zvyčajne obsahujú chemicky aktívne povrchové zoskupenia molekúl, ako sú aminokyselinové alebo sacharidové vedľajšie reťazce a majú špecifickú trojrozmernú štruktúrnu charakteristiku a aj špecifickú nábojovú charakteristiku.

„Antigén“ je molekula alebo časť molekuly schopná byť viazaná protilátkou, ktorá je navyše schopná indukovať živočícha na produkciu protilátky schopnej väzby k epitopu tohto antigénu. Antigén môže mať jeden alebo viac ako jeden epitop. Uvedená špecifická reakcia sa rozumie tak, že uvedený antigén bude reagovať vysoko selektívnym spôsobom so zodpovedajúcou protilátkou a nie s množstvom ďalších protilátok, ktoré môžu byť vyvolané inými antigénmi.

Uvedené protilátky vrátane fragmentov protilátok, užitočné podľa tohto vynálezu možno použiť na kvalitatívnu detekciu alebo kvantitatívne stanovenie IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, alebo príbuzných proteínov vo vzorke, alebo na určenie prítomnosti buniek, ktoré exprimujú proteíny podľa tohto vynálezu. Uvedené sa môže vykonať imunofluorescenčnou technikou s využitím fluorescenčné značených protilátok (pozri v ďalšom texte) v spojení so svetelnou mikroskópiou, prietokovou cytometriou alebo fluorometrickým stanovením.

Uvedené protilátky (alebo ich fargmenty), užitočné podľa tohto vynálezu sa môžu na detekciu in situ IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, alebo na detekciu príbuzných proteínov podľa tohto vynálezu spracovať histologický, ako napríklad imunofluorescenčnou alebo imunoelektrónovou mikroskopiou. Detekcia in situ sa môže vykonať odobratím histologickej vzorky z pacienta a interakciou značenej protilátky podľa tohto vynálezu so vzorkou. Protilátka (alebo jej fragment) sa výhodne použije na nanesenie alebo prekrytie biologickej vzorky značenou protilátkou (alebo jej fragmentom). Použitím tohto spôsobu stanovenia možno stanoviť nielen prítomnosť IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, alebo príbuzných proteínov, ale tiež ich distribúciu na vyšetrovanom tkanive. Odborníkom v danej oblasti bude zrejmé, že pri použití tohto vynálezu možno ktorýkoľvek z veľkého počtu používaných histologických spôsobov (napríklad farbiace postupy) upraviť tak, aby bol vhodný na detekciu in situ.

Postupy analýz na IL-18BP alebo vírusový IL-18BP, alebo na príbuzné proteíny podľa tohto vynálezu typicky zahŕňajú inkubáciu biologickej vzorky, napríklad biologickej tekutiny, extrakt tkaniva, čerstvo dopestované bunky, ako sú lymfocyty alebo leukocyty, alebo bunky, ktoré sa inkubovali v tkaninovej kultúre; inkubácia sa vykoná za účasti stanoviteľnej značenej protilátky, schopnej identifikovať IL-18BP alebo príbuzné proteíny; postupy ďalej typicky zahŕňajú detekciu protilátky niektorým z veľkého počtu v odbore dobre známych spôsobov.

Biologická vzorka sa môže spracovať s podporou tuhej fázy - s tuhým nosičom, napríklad nitrocelulózou, alebo iným tuhým nosičom, ktorý je schopný imobilizovať bunky, časti buniek alebo rozpustné proteíny. Uvedený nosič sa potom premyje vhodnými tlmivými roztokmi; nasleduje spracovanie so stanoviteľne značenou protilátkou podľa tohto vynálezu. Tuhý nosič sa potom druhý raz premyje tlmivým roztokom na odstránenie neviazanej protilátky. Množstvo viazanej značky na uvedenom tuhom nosiči sa potom môže stanoviť bežným spôsobom.

Výrazmi „podpora tuhou fázou“, „tuhý nosič“, alebo „nosič“ sa rozumie akýkoľvek nosič, schopný viazať antigén alebo protilátku. Dobre známe tuhé nosiče zahŕňajú sklo, polystyrén, polypropylén, polyetylén, dextrán, nylon, amylázy, prírodné a modifikované celulózy, polyakrylamidy, horniny žulu alebo magnetit. Na účely podľa tohto vynálezu môže byť uvedený nosič do určitej miery rozpustný alebo nerozpustný. Podporný materiál môže v skutočnosti mať akúkoľvek štruktúrnu konfiguráciu pokiaľ viazaná molekula je schopná väzby k antigénu alebo protilátke. Konfigurácia materiálu nosiča môže potom byť sférická, napríklad ako perličky, alebo valcová, ako je napríklad vnútorný povrch skúmavky, alebo vonkajší povrch tyče. Povrch môže voliteľne byť plochý, napríklad vo forme listu, skúšobného pruhu a podobné tvary. Výhodné nosiče zahŕňajú polystyrénové perličky. Odborníci v danej oblasti poznajú veľa ďalších vhodných nosičov na viazanie protilátky alebo antigénu, alebo sú schopní tieto vhodné nosiče zistiť bežnými skúškami.

Väzbová aktivita danej dávky protilátky podľa tohto vynálezu sa môže stanoviť všeobecne známymi spôsobmi. Na základe bežných pokusov sú odborníci v danej oblasti schopní určiť pracovné a optimálne podmienky analýzy na každé stanovenie.

K typickým krokom možno v procese prípravy pridať ďalšie kroky, ako je premývanie, miešanie, pretrepávanie, filtrácia a podobné operácie, ak sú v určitej situácii zaužívané alebo nevyhnutné.

Jeden zo spôsobov, ktorým možno protilátku v zhode s týmto vynálezom stanoviteľne značiť je naviazanie (linking) protilátky k enzýmu a použiť potom enzýmovú imunoanalýzu (EIA). Tento enzým, ak je neskoršie vystavený vhodnému substrátu bude reagovať so substrátom takým spôsobom, že produkuje chemické zoskupenie, ktoré možno detegovať, napríklad spektrofotometricky, fluorometricky, alebo zrakovým porovnaním. Enzýmy, ktoré možno použiť na stanoviteľné značenie protilátky zahŕňajú, ale nie sú na uvedené obmedzené: malátová dehydrogenáza, stafylokoková nukleáza, delta-5-steroidová izomeráza, kvasinková alkoholová dehydrogenáza, α-glycerofosfátová dehydrogenáza, triózová fosfátová izomeráza, chrenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, asparigináza, glukózová oxidáza, β-galaktozidáza, ribonukleáza, uráža, kataláza, glukózo-6-fosfátová dehydrogenáza, glukoamyláza a acetylcholínstearáza. Detekcia sa môže vykonať kolorimetricky, pričom sa pre enzým využije chrómogénny substrát. Detekcia sa môže vykonať tiež vizuálnym porovnávaním rozsahu enzymatickej reakcie v substráte skúšanej vzorky porovnaním s podobne pripravenými štandardmi.

Detekcia sa môže vykonať ktoroukoľvek z mnohých ďalších imunoanalýz. Napríklad rádioaktívnym značením protilátky alebo fragmentov protilátky možno stanoviť IL-18BP, alebo vírusový IL-18BP s použitím rádioimunoanalytických spôsobov (RIA). Vhodný opis RIA možno nájsť v Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology od autorov Work T. S. a ďalší, North Ilolland Publishing Company, NY 1978, s osobitným zreteľom na kapitolu s názvom „An Introduction to Radioimmuno Assay and Related Techniques“ od T. Charda, ktoré sa tu zahŕňajú týmto odkazom. Rádioaktívny izotop sa môže stanoviť pomocou γ-čítača alebo scincilačného čítača, alebo autorádiografiou.

Protilátku podľa tohto vynálezu možno značiť tiež fluorescenčnou zlúčeninou. Keď sa fluorescenčné značená protilátka vystaví svetlu s vhodnou vlnovou dĺžkou, jej prítomnosť potom možno stanovovať podľa fluorescencie. Medzi najviac používané fluorescenčné značkovacie zlúčeniny patria fluoresceín izotiokyanát, rodamín, fykoerytrín, fykokyanín, alofykokyanín, o-ftalaldehyd a fluorescamín.

Protilátku možno tiež stanoviteľne značiť použitím fluorescenciu emitujúcich kovov, ako je ^1S2Eu, alebo iných kovov zo skupiny lantanidov. Tieto kovy možno spojiť s protilátkou s využitím kovových chelátových skupín, napríklad s využitím dietyléntriamín pentaoctovej kyseliny (ETPA).

Protilátku možno ďalej stanoviteľne označiť viazaním s biotínom. Biotinylovaná protilátka sa potom môže stanoviť pomocou avidínu alebo streptavidínu, viazaných na fluorescenčnú zlúčeninu alebo k enzýmu, napríklad k peroxidáze, alebo na rádioaktívny izotop a podobne.

Protilátka sa môže stanoviteľne označiť tiež jej viazaním k chemiluminiscenčnej zlúčenine. Prítomnosť luminoscenčne značenej protilátky sa potom stanovuje pomocou luminiscence, ktorá vzniká v priebehu chemickej reakcie. Príklady veľmi užitočných chemiluminiscenčných značkujúcich zlúčenín zahŕňajú luminol, izoluminol, ester akridínu, imidazol, soľ akridínu a ester kyseliny šťavelovej.

Podobne možno na značenie protilátky podľa tohto vynálezu použiť bioluminiscenčné zlúčeniny. Bioluminiscencia je typ chemiluminiscencie, zistenej v biologických systémoch, v ktorých katalytický proteín zvyšuje účinnosť chemiluminiscenčnej reakcie. Prítomnosť bioluminiscenčného proteínu sa stanovuje na základe intenzity luminiscencie. Dôležité bioluminiscenčné zlúčeniny na tento typ značenia sú luciťerín, luciťeráza a aequorín.

Molekula protilátky podľa tohto vynálezu sa môže prispôsobiť na využitie v imunometrickej analýze, známej ako „dvojpolohová“ alebo „sendvičová“ analýza. Pri typickej imunometrickej analýze sa množstvo neznačenej protilátky (alebo fragmentu protilátky) viaže na tuhý nosič a pridá sa určité množstvo stanoviteľne značenej rozpustnej protilátky, čo umožňuje určiť prítomnosť a/alebo kvantitatívne množstvo temámeho komplexu, vytvoreného medzi protilátkou na tuhom nosiči, antigénom a značenou protilátkou.

Typické a výhodné imunometrické analýzy zahŕňajú „vpred“ („forward“) analýzu; v tomto spôsobe sa protilátka viazaná na tuhú fázu najprv privádza do styku so skúšanou vzorkou na extrakciu antigénu zo vzorky tvorbou binárneho komplexu protilátky na tuhom nosiči a antigénu. Po vhodnej inkubačnej dobe sa tuhý nosič premyje na odstránenie zvyšku tekutej vzorky vrátane nezreagovaného antigénu (ak je prítomný); potom sa privedie do styku s roztokom, ktorý obsahuje neznáme množstvo značenej protilátky, ktorá plní funkciu „spravodajskej molekuly“ („reportér molecule“). Po sekundovej inkubačnej dobe na umožnenie tvorby komplexu značenej protilátky s antigénom, viazaným na tuhý nosič cez neznačenú protilátku, sa tuhý nosič premyje druhý raz, aby sa odstránila nezreagovaná značená protilátka.

V inom type „sendvičovej“ analýzy, ktorý môže byť tiež užitočný pre antigény podľa tohto vynálezu sa použijú takzvané „simultánne“ a „reverzné“ postupy analýzy. „Simultánny“ postup zahŕňa jeden inkubačný krok, pretože sa obidve protilátky, protilátka viazaná na tuhý nosič aj značená protilátka pridajú naraz k skúšanej vzorke. Po ukončení inkubácie sa tuhý nosič premyje na odstránenie zvyšku tekutej vzorky a značenej protilátky, neviazanej do komplexu. Prítomnosť značenej protilátky spojenej s tuhým nosičom sa potom stanoví rovnako ako v bežnej „vpred“ sendvičovej analýze.

V „reverznom“ postupe analýzy sa postupne k tekutej skúšanej vzorke pridá najprv roztok značenej protilátky a po vhodnej dobe inkubácie sa pridá neznačená protilátka, viazaná na tuhý nosič. Po druhej inkubácii sa tuhá fáza premyje bežným spôsobom na odstránenie zvyšku skúšanej vzorky a roztoku nezreagovanej značenej protilátky. Stanovenie značenej protilátky, spojenej s tuhým nosičom sa vykoná obdobne ako v „simultánnom“ a „vpred“ postupoch.

Tento vynález zahŕňa tiež DNA, kódujúcu ktorýkoľvek proteín podľa tohto vynálezu, ako je určený skôr, replikovateľné expresné nosiče obsahujúce ktorékoľvek také DNA molekuly, hostiteľské bunky transformované ktorýmikoľvek takými expresnými nosičmi vrátane prokaryotických a eukaryotických hostiteľských buniek, výhodné sú CHO bunky. Vynález tiež zahŕňa spôsob produkcie expresných vektorov, kódujúcich pre niektorý z uvedených proteinov podľa tohto vynálezu na účely ich expresie v ľudskom organizme alebo v inom cicavcovi.

Vynález ďalej zahŕňa spôsob produkcie ktoréhokoľvek z proteinov podľa tohto vynálezu kultiváciou transformovanej bunky podľa tohto vynálezu a získanie proteínu, kódovaného DNA molekulou; vynález ďalej zahŕňa expresný nosič v uvedenej transformovanej hostiteľskej bunke.

Okrem použitia IL-18BP, alebo vírusového IL-18BP pri modulácii aktivity IL-18 môžu sa IL-18BP alebo vírusový IL-18BP samozrejme použiť aj na čistenie samotného IL-18. Na tento účel sa IL-18BP, alebo vírusový IL-18BP viaže na afinitný stĺpec a surový IL-18 sa nechá prechádzať kolónou. IL-18 sa potom získa zo stĺpca napríklad elúciou pri nízkom pH.

Vynález sa ďalej ozrejmuje pomocou príkladov, ktoré však nijako neobmedzujú rozsah tohto vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje SDS-PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovom géli s obsahom dodecylsulfátu sodného) liganda afinitne čisteného IL-18 väzbového proteínu. Surové proteíny moču (skoncentrované ultrafilrráciou 500 ml normálneho ľudského moču) sa nasadili na IL-18-agarózovú kolónu. Stĺpec sa premyl a viazaný proteín sa eluoval pri pH 2,2. Eluované podiely sa neutralizovali a alikvotné časti sa analyzovali spôsobom SDS-PAGE (10 % akrylamid) v neredukčných podmienkach a vyfarbením striebrom. Jednotlivé pruhy sú: 1 - surové močové proteíny 1,5 pg, nanesené na gél; 2 až 9 - eluáty 1 až 8 z kolóny s IL-18 a agarózou; 10 - značkovač molekulových hmotností v kD, uvedených na pravej strane pruhu; šípka označuje pás, zodpovedajúci IL-18BP.

Obr. 2 znázorňuje autorádiogram z SDS-PAGE (7,5 % akrylamid) komplexov, zložených z ¹²⁵I-IL-18 (zdanlivá molekulová hmotnosť 19 kD), zosieťované k nasledujúcej príprave rozpustného IL-18 väzbového proteínu: pruh 1 - premývacia tekutina IL-18 afinitnej kolóny; pruh 2 - druhá elúcia z IL-18 afinitnej kolóny; Pruh 3 - tretia elúcia z IL-18 afinitnej kolóny; značkovače molekulových hmotností sú na pravej strane (v kD); šípka vyznačuje zosieťovaný produkt (58 kD).

Obr. 3 znázorňuje inhibíciu produkcie IFN-γ, indukovanej IL-18, účinkom IL-18BP;

(A) splenocyty myši boli stimulované (24 hodín, 37 °C) s vyznačenou kombináciou LPS (1 pg.mľ¹) a ľudským IL-18 (5 ng.mľ¹), pridaným priamo, alebo po predbežnom premiešaní (1 hodina, 37 °C) s urinárnym IL-18BP. Hladina muIFN-γ v kultúre sa stanovila po 24 hodinách.

(B) splenocyty myši sa inkubovali (24 hodín) s LPS (1 pg.mľ¹) spolu s myšacím IL-18 (10 ng-mľ¹), vopred premiešané so zvyšujúcimi sa koncentráciami ľudského IL-18BP.

(C) splenocyty myši sa inkubovali (24 hodín) s LPS (10 ng.mľ¹) spolu so zvyšujúcimi sa koncentráciami ľudského IL-18BP.

(D) splenocyty myši sa inkubovali (24 hodín) s Con A (1 μg.mľ¹) spolu so zvyšujúcimi sa koncentráciami ľudského IL-18BP.

(E) ľudské KG-1 bunky sa stimulovali s TNF-a (20 ng.mľ¹) a huIL-18 (25 ng.mľ¹), pridanými samostatne po sebe, alebo spolu po predchádzajúcom premiešaní (1 hodina, 37 °C) s urinárnym IL-18BP.

Obr. 4 znázorňuje sekvenciu cDNA ľudského IL-18BPa a proieínu. Signálny peptid je podčiarknutý.

Obr. 5 znázorňuje sekvenciu sekvenciu cDNA ľudského IL-18BPb a proteínu. Signálny peptid je podčiarknutý.

Obr. 6 znázorňuje sekvenciu sekvenciu cDNA ľudského IL-18BPc a proteínu. Signálny peptid je podčiarknutý.

Obr. 7 znázorňuje sekvenciu sekvenciu cDNA ľudského IL-18BPd a proteínu. Signálny peptid je podčiarknutý.

Obr. 8 znázorňuje sekvenciu ľudského IL-18BP génu. Sekvencia ľudského genómového klonu (7,1 kb) bola stanovená a porovnaná s rôznymi cDNA klonmi, izolovanými z troch cDNA knižníc; spoločný translač ný štartovací kodón tvoria nukleotidy 683 až 685. NuMAl gén je uložený na negatívnom vlákne od nukleotidu 3 578 až po koniec.

Obr. 9 znázorňuje vplyv rekombinantného IL-18BP na aktivity ľudského a myšieho IL-18. His₆-značený IL-18BPa bol prechodne exprimovaný v bunkách COS7 a čistený.

(A) IL-18 človeka (5 ng.mľ’) sa vopred zmiešal alebo s His₆-značeným IL-18BPa, alebo s RPMI a pridal sa k bunkám sleziny myši spolu s LPS (1 Ltg.mľ¹). Stanovovala sa produkcia IFN-γ po 24 hodinách.

(B) IL-18 myši (10 ng.mľ¹) sa vopred premiešal alebo s His₆-značeným IL-18BPa, alebo s RPMI a pridal sa k bunkám sleziny myši spolu s LPS (1 Ltg.mľ¹). Stanovovala sa produkcia IFN-γ po 24 hodinách.

(C) IL-18 človeka (25 ng.mľ¹) sa vopred zmiešalo s alebo COS7-IL-18BPa alebo s RPMI a pridal sa k PBMC človeka v prítomnosti IL-12 (10 ng.mľ¹).

(D) IL-18 človeka (25 ng.mľ¹) sa vopred zmiešalo s alebo COS7-IL-18BPa alebo s RPMI a pridal sa k bunkám KG-1 človeka v prítomnosti TNF-ct (20 ng.mľ¹).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia IL-18 väzbového proteínu

E. coli IL-18 (2,5 mg, Peprotech, NJ) sa viazal na Affigel (0,5 ml, Biorad) postupom, ktorý udáva výrobca a vložil sa do kolóny. Surové urináme proteíny (1000 x skoncentrované, 500 ml) sa nasadili na kolónu s prietokom 0,25 ml.min.'¹. Stĺpec sa v kolóne premyl s 250 ml 0,5M NaCl v fosforečnanom tlmenom roztoku soli (phosphate buffered saline, PBS). Viazané proteíny sa potom eluovali 25 mM roztokom kyseliny citrónovej, pH 2,2 a benzamidínom (1 mM roztok), a roztok sa ihneď neutralizoval IM roztokom Na₂CO3. Odobrali sa podiely po 1 ml a analyzovali sa spôsobom SDS-PAGE a strieborným farbením. IL-18 väzbový proteín sa eluoval v podieloch 2 až 8 ako ~40 000 Daltonový proteín (obr. 1). ~40 kD pás, zodpovedajúci IL-18BP mal po farbení striebrom zreteľne žltú ľarbu. Jednotlivé podiely sa analyzovali zosieťovaním s ^12SI-IL-18, SDS-PAGE a autorádiografiou spôsobom, opísaným v príklade 2. IL-18 väzbový proteín sa stanovil v podieloch 2 až 8, eluovaných z IL-18-agarózového stĺpca (obr. 2).

Príklad 2

Zosieťovanie afinitne čisteného IL-18BP k IL-18

Vzorky (40 μΐ) IL-18BP po afinitnom čistení sa inkubovali (70 minút pri 4 °C) s ¹²⁵I-IL-18 (5 000 000 cpm). Potom sa pridal disuccinimidylsubcrát (DSS), rozpustený v dimetylsulfoxide (Me2SO, 20 mM) až na výslednú koncentráciu 2 mM a zmes sa nechala 20 min pri 4 °C. Reakcia sa zastavila pridaním IM Tris-HCl, pH 7,5 a IM NaCl až na výslednú koncentráciu 100 mM. Pridal sa tlmič vzorky, obsahujúci ditiotreitol (DTT, 25 mM výsledná) a zmes sa analyzovala spôsobom SDS-PAGE (7,5 % akrylamid) a následne autorádiograficky (obr. 2).

V podieloch eluovaných z IL-18 afinitného stĺpca (pruhy 2 a 3) sa pozoroval pás s molekulovou hmotnosťou 58 kD, pravdepodobne pozostávajúci z ~40 kD proteínu, zosieťovaného s ~20 kD ^I2>I-IL-18, ale nezistil sa pri premývacej kvapaline (pruh 1), ktorá obsahovala všetky ostatné surové urináme proteíny.

Príklad 3

Proteínová sekvenčná analýza

Eluované podiely z afinitnej kolóny v príklade 1 sa delili spôsobom SDS-PAGE (10 % akrylamid) v neredukčných podmienkach, spracovali sa elektro-blottingom na PVDF membráne (Pro-Blot, Applied Biosystems, USA). Membrána sa vyfarbila s „coomassie modrou“, ~40 kD pás sa oddelil a podrobil sa proteínovej sekvenčnej analýze pomocou Procise mikrosekvenátora (Applied Biosystems, USA). Získala sa nasledujúca vedúca sekvencia:

T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A

1...5....10..

v ktorej x znamená doteraz neurčenú aminokyselinu.

Navyše sa získala minoritná sekvencia:

A-x-Y-x-R-I-P-A-x-A-I-A

1...5....10..

Pre túto dvojitú sekvenciu nebolo možné získať dlhšie sekvenčné dáta. Minoritná sekvencia sa identifikovala ako fragment ľudského defenzínu (prístupové číslo pl 1398), počínajúc od aminokyseliny 65 defetizmu.

Vedúca sekvencia nemohla byť pripísaná nijakému zo známych proteínov; vyhľadávanie sa vykonávalo vo všetkých dostupných bankách údajov v NCBI a TIGR vyhľadávacími programami blastp a tblastn.

Aby sa získala dlhšia a presnejšia sekvencia a aby sa identifikovali potenciálne cysteínové zvyšky, ďalšia alikvotná časť podielu eluovaného z IL-18-agarózového stĺpca sa redukovala s DTT v 6M hydrochloride guanidínu, nechala reagovať so 4-vinylpyridínom, odsolila na mikro-ultrafiltračnom zariadení (Ultrafree, rez 10 000 Daltonov, Millipore) a podrobila sa proteínovej sekvenčnej analýze. Po 1. cykle sekvenovania sa filter nechal reagovať s o-ftalaldehydom na blokovanie N-terminálnych polypeptidov iných ako Pro. Týmto spôsobom sa získala iba vedúca sekvencia:

TPVSQXXXAA XASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT

10 20 30 40 (T = Thr; P = Pro; V = Val; S‘ Ser; Q = Gin; X = neurčené; A = Ala, R = Arg; K = Lys; D = Asp; C = Cys; F = Phe; L = Leu; E = Glu.)

V cykloch 6, 7, 8 a 11 bola nižšia úroveň signálu Thr. Vzhľadom na túto nižšiu úroveň signálu pôvodcovia tohto vynálezu nepovažujú za rozumné pripisovať ju v týchto cykloch určitému aminokyselinovému zvyšku.

Výsledná sekvencia je významne odlišná od sekvencií všetkých známych proteínov. Pri prehľadávaní v banke údajov ústavu pre genómový výskum (The Inštitúte of Genomic Research, TIGR) s použitím programu tblastn-search sa zistil súbor cDNA, označený THC123801, ktorého otvorený čítací rámec (218 kodónov), ak sa preložil, obsahoval sekvenciu s vysokou homolôgiou k sekvencií N-terminálnej sekvencie IL-18BP. Uvedená homológia je:

(Horná sekvencia (1 až 40) je sekvencia IL-18BP, izolovaná podľa tohto vynálezu; spodná sekvencia (51 až 100) je odvodená sekvencia transláciou cDNA súboru s THC123801 z TIGR).

Predpokladaná proteínová sekvencia, získaná transláciou súboru THC123801 bola nejednoznačná v zvyškoch 2 a 4 v IL-18BP. To potvrdzuje identitu aminokyselinových zvyškov 6, 7 a 8 IL-18BP ako Thr a zdá sa, že to platí pre zvyšok 11.

Príklad 4

IL-18BP je glykoproteín

Alikvotná časť (0,3 ml) eluovaných podielov z príkladu 1 sa ďalej čistila spôsobom SEC (size exclusion chromatography) na kolóne Superose 12(1 x 30 cm, Pharmacia, Švédsko). Kolóna bola vopred uvedená do rovnovážneho stavu a eluovaná fosforečnanom tlmeným roztokom soli a azidom sodným (0,02 %) s prietokom 0,5 ml.min.'¹ a odoberali sa jednominútové podiely. IL-18 väzbový proteín sa eluoval v podieloch 20 až 25 ako ~40 000 daltonový proteín, čo sa stanovilo pomocou SDS-PAGE a vyfarbením striebrom. Vzorka obsahujúca ~40 000 daltonový proteín (podiel 23, 50 μΐ, ~50 ng proteínu) sa nechala reagovať s N-glykozidázou (PNGase F, Biolab) podľa návodu výrobcu. Stručne, alikvotná časť sa denaturovala 10 minútovým varom v prítomnosti 5 % SDS, a potom hodinu pri 37 °C s 10 x G7 tlmič (2,5 μΐ), 10 % NP-40 (2,5 μΐ) a PNGase F (1 μΐ). Vzorka sa analyzovala spôsobom SDS-PAGE (10 % akrylamid) v neredukčných podmienkach a porovnávala sa s nedigerovaným IL-18BP z rovnakej frakcie z Superose 12. Zistilo sa, že ~40 000 daltonový pás IL-18BP zmizol v podieli spracovanom s PNGase. Zistili sa nové pásy, zodpovedajúce 30 kD (práve nad pásom PNGase) a 20 kD. Eliminácia ~40 kD pása ukazuje, že tento pás je N-glykozylovaný proteín.

Príklad 5

Blokovanie biologickej aktivity IL-18 pôsobením IL-18BP

Schopnosť IL-18BP, izolovaného z moču blokovať aktivitu IL-18 sa stanovovala meraním IL-18 indukovanej produkcie IFN-γ v jednojadrových bunkách. IL-18 indukuje IFN-γ, ak sa pridá spolu s nízkou koncentráciou LPS, IL-12, IL-2 alebo s inými stimulátormi. Aktivita IL-18 sa skúšala v slezinových bunkách myší, v ľudských periférnych krvných jednojadrových bunkách (PBMC) a v bunkovej línii KG-1 človeka. Slezinové bunky sa pripravili zo zdravej myši, premyli sa a suspendovali v prostredí RPMI 1640, doplnenom 10 % fetálnym bovinných sérom na 5 x 10⁶ buniek v 1 mililitri. Kultúry (1,0 ml) sa stimulovali LPS (vždy 0,5 alebo 1 pg.mľ¹) spolu s rekombinantným humánnym alebo myšacím IL-18 (vždy 0,5 alebo 5 ng.mľ¹). Humánny IL-18 väzbový proteín (0,5 alebo 50 ng.mľ) sa pridal k rekombinantnému IL-18 pred pridaním slezinových buniek. Po 24 hodinovej kultivácii sa slezinové bunky trikrát zmrazili (-70 °C) a rozmrazili (teplota miestnosti), bunkové zlomky sa odstránili odstredením a supematant sa analyzoval na IFN-γ s použitím súpravy EL1SA na myšací IFN-γ (Endogén). Ako je zrejmé z obr. 2, v slezinových bunkách myši IL-18BP blokoval aktivitu huIL-18 a to v závislosti od veľkosti dávky. Naopak, rozpustný α/β-mterferónový receptor nemal v kontrolnom pokuse nijaký účinok. Aktivita rekombinantného IL-18 myši bola podobne inhibovaná

IL-18BP človeka, čo vedie k názoru, že humánny IL-18BP rozoznáva IL-18 myši (obr. 3B). Endogénny IL-18 je indukovaný v slezinových bunkách vysokými koncentráciami LPS, čo vedie k produkcii IFN-γ. IFN-y indukcia pôsobnim LPS (10 pg.mľ¹) bola ale tiež inhibovaná urinámym IL-18BP (obr. 3C). Konkanavalín A (con A) aktivuje T-bunky na produkciu IFN-γ v neprítomnosti IL-18 [13], Indukcia IFN-γ pôsobením Con A nebola ale inhibovaná pôsobením IL-18BP ani pri vysokých koncentráciách (obr. 3D). Tieto pozorovania ukazujú, že IL-18BP bol špecifickým inhibítorom IL-18 bioaktivity skôr ako nešpecifickým inhibítorom produkcie IFN-γ. IL-18BP tiež inhiboval aktivitu ľudského IL-18 v KG-1 bunkách človeka, indukovaných kombináciou IL-18 a TNF-γ (obr. 3E).

Uvedené údaje ukazujú, že podľa merania ko-indukcie IFN-γ v ľudských aj myšacích jednojadrových bunkách urinámy IL-18BP inhibuje aktivitu ľudského, ako aj myšacieho IL-18. Koncentrácia IL-18BP, ktorá znižuje IL-18 aktivitu o >90 % bola porovnávateľná s koncentráciou samotného IL-18, čo vedie k názoru o vysokej afmitnej interakcii medzi uvedeným dvoma proteínmi.

Príklad 6

Izolácia cDNA klonov kódujúcich IL-18BP

Úplná RNA z Jurkat T-buniek (CRL 8163, Američan Type Culture Collection) bola reverzne transkribovaná s SuperScript RNase H' reverznou transkriptázou (Gibco-BRL) a náhodnými primérmi (Promega, Madison WI). Výsledné cDNA fragmenty sa potom amplifikovali spôsobom PCR s použitím Taq DNA polymerázy (Sigma) a primérov, zodpovedajúcich klonu (TIGR) THC123801, nukleotidy 24 až 44 (v smere) a 500 až 481 (proti smeru). Amplifikovalo sa v 30 cykloch temperovania (55 °C, 2 minúty) a predĺženia (70 °C, 1 minúta). Výsledné PCR produkty sa delili agarózovou (1 %) gélovou elektroforézou, eluovali a klonovali do pGEM-Teasy TA klonovacieho vektora (Promega). DNA z jednotlivých klonov sa sekvenovali s T7 a SP6 primérmi.

Výsledný 477 bp fragment bol označený pomocou ³²P náhodnou senzibilizáciou. Táto sonda sa použila na výber rôznych humánnych cDNA a genómových knižníc. Dvojité nitrocelulózové fitre sa hybridizovali uvedenou sondou pri 60 °C v tlmivom roztoku, obsahujúcom 6 x SSC, 10 x Denhardtovho roztoku, 0,1 % SDS a 100 pg.mľ¹ spermovej DNA lososa. Fitre sa premyli a cez noc pri -80 °C exponovali AXR film (Kodak). Dva pozitívne klony sa čistili plakovaním. Plazmidy sa odobrali z JpCEVQ klonov a autoligovali. cDNA klony z iných knižníc sa izolovali spôsobmi udávnými výrobcom. Automatizovaná DNA sekvenčná analýza izolovaných klonov sa vykonala na prístrojoch Model 373A a Model 377 sekvenátorov (Applied Biosystems) pri použití smerových a protismerových primérov. Na tieto klonovacie postupy sa použili štandardné protokoly [33],

Výber (skríning) sa vykonal v nasledujúcich knižniciach: knižnica jednojadrových cDNA človeka, konštruovaná v ÄpCEV9 klonovom vektore [15], láskavo poskytnutá T. Mikim; knižnica cDNA Jurkatových leukémických T-buniek človeka, knižnica cDNA ľudských periférnych krvných leukocytov a knižnica slezinových cDNA, všetky od Clontech (Palo Alto, CA). Genómová knižnica ľudskej placenty v λ FIX II vektore bola od Stratagene (La Jolla, CA).

Získali sa a charakterizovali všetky klony cDNA, ktoré zodpovedali štyrom rôznym IL-18BP strihovým variantom. Všetky strihové varianty kódovali pre putatívne rozpustné sekretované proteíny. Najviac sa vyskytujúci (IL-18BPa) mal ORF z 192 kodónov, kódujúcich pre signálny peptid z 28 aminokyselinových zvyškov, nasledoval zrelý putatívny IL-18BPa, ktorého prvých 40 zvyškov (SEQ ID No: 10) presne súhlasí s N-terminálovou proteínovou sekvenciou urinámeho IL-18BP (SEQ ID No: 2). Poloha cysteínových zvyškov vedie k názoru, že tento polypeptid patrí do imunoglobulínovej (Ig) super-skupiny. Každý zo štyroch Gin zvyškov v rámci zrelého IL-18BPa bol potenciálnym N-glykozylačným miestom. Ostatné tri strihové varianty IL-18BP boli význačne menej zastúpené.

Ďalšia 1 kb IL-18BPb cDNA kódovala pre zrelý proteín z 85 amino-kyselinových zvyškov (SEQ ID No: 4). Tretí variant, IL-18BPc bol reprezentovaný 2,3 kb cDNA, kódujúcou pre zrelý IL-18BP z 169 aminokyselinových zvyškov (SEQ ID No: 6). Štvrtý variant, IL-18BPd kódoval pre zrelý IL-18BP z 133 aminokyselinových zvyškov (SEQ ID No: 8). Vnútorný exónový strih nastal na dvoch miestach pozdĺž pro-mRNA. Tieto javy a ďalší 5' exón v IL-18BPd umožnil rast troch rôznych 5’ UTR v rôznych cDNA klonoch. Preto je celkom možné, že rôzne IL-18BP varianty môžu byť generované ako reakcia na určité transkripčné regulačné signály.

Doteraz sa nezistila nijaká cDNA kódujúca pre receptor s transmembránovou doménou.

Príklad 7

Konštrukcia expresného vektora cicavca, produkcia rekombinantného IL-18BP a hodnotenie biologických aktivít rekombinantného IL-18BP

Kódujúca oblasť IL-18BPa cDNA sa amplifikovala spôsobom PCR so smerovým primérom 5' TATATCTAGAGCCACCATGAGACACAACTGGACACCA a reverzným primérom

5' ATATCTAGATTAATGATGATGATGATGATGACCCTGCTGCTGTGGACTGC.

PCR produkty sa rezali s Xba I a klonovali do miesta Xba I expresného vektora pEF-BOS [25], čím sa získal pEF-BOS-IL-18BPa. Tento konštrukt sa potvrdil sekvenovaním DNA.

Násady 6 x 10⁷ COS7 buniek v 1,4 ml TD tlmivého prostredia, obsahujúce pEF-BOS-IL-18BPa plazmidovú DNA (10 pg) a DEAE-dextrán (120 pg) sa 30 minút inkubovali pri teplote miestnosti, ako sa opisuje v [35], Bunky sa potom premyli DMEM - 10 % FBS, 4 hodiny na platni v DMEM-10, premyli a inkubovali 3 až 5 dní v bezsérovom DMEM. Kultivačné prostredie sa oddelilo, šesťnásobne skoncentrovalo ultrafiltráciou (10 kD odrezky) a IL-18BP-His₆ sa izoloval na stĺpci Talón (Clontech) s imidazolom ako elučným činidlom podľa návodu výrobcu.

Imunulogická krížová reaktivita urmárneho a COS7-exprimovaného IL-18BP sa hodnotila nsledujúcim spôsobom: urinámy IL-18BP (5 pg) sa označil s ^l25I postupom s chlóramínom T. Supematanty z buniek (250 pl) COS7 sa miešali (hodinu pri teplote miestnosti, konečný objem 500 pl) s protilátkou k urinámemu IL-18BP, zriedili 1 : 1 000 v fosforečnanom tlmenom roztoku soli (PBS), 0,05 % Tween 20 a 0,5 % bovinného sérového albumínu (premývací tlmič). Potom sa pridal ¹²’l-značený urinámy IL-18BP (10⁶ cpm) a po hodine sa pridala proteínová G-sepharóza (20 pl). Zmes sa suspendovala (1,5 hodiny, 4 °C), perličky sa potom izolovali a 3 x premyli premývacím tlmivým roztokom a raz v PBS. Perličky sa potom eluovali vzorkovým tlmičom, oddelili spôsobom SDS-PAGE (10 % akrylamid, redukčné podmienky) a nasledovala autorádiografia.

IL-18BPa sa eluoval ako samostatný pás pri SDS-PAGE s farbením striebrom v redukčných a neredukčných podmienkach a mal rovnakú zdanlivú molekulovú hmotnosť ako urinámy IL-18BP (údaje nie sú uvedené). Proteínová sekvenčná analýza tohto preparátu potvrdila rovnakú N-terminálovú sekvenciu, aká je v urinárnom IL-18BP; potvrdzuje to, že posledne uvedený sa na N-termináli nedegradoval.

Imunopijakovanie (immunoblotting analysis) IL-18BPa s protilátkami bolo výraznejšie proti urinámemu IL-18BP a získal sa rovnaký pás pre molekulovú hmotnosť ako pre urinámy proteín. Ďalej, pri použití imuniprecipitácie a následne SDS-PAGE a audiografie bol IL-18BPa schopný nahradiť urinámy ¹²⁵I-IL-18BP vo väzbe s protilátkou. Preto štruktúrne zodpovedá IL-18BPa urinámemu IL-18BP.

Surový a čistený IL-18BPa sa skúšal na schopnosť inhibovať biologickú aktivitu IL-18. IL-18BPa v závislosti od veľkosti dávky inhiboval IFN-γ indukovanú aktivitu ľudského a myšieho IL-18 v slezinových bunkách myši, PBMC a v bunkovej línii KG-1 človeka (obr. 9).

Výsledky rôznych bioanalýz, ako aj analýza podľa posunu pohyblivosti (mobility shift assay) (príklad 8) v elektrickom poli ukázali, že inhibícia IL-18 je inherentne u vlastnosťou klonovaného IL-18BP a nie vlastnosťou sprievodných nečistôt v urinárnom IL-18BP, napríklad ko-eluovaných fragmentov defenzínu.

Príklad 8

Analýza na základe zmeny pohyblivosti v elektrickom poli (elektroforéza)

Študoval sa tiež vplyv urinámeho a rekombinantného IL-18BP na IL-18-indukovanú aktiváciu NF-κΒ v bunkách KG-1 človeka. Ľudské bunky KG-1 (4x10^s v 1 ml RMPI) sa stimulovali s huIL-18 (10 ng.mľ¹) alebo huIL-18 vopred zmiešaného s IL-18BP (20 minút, teplota miestnosti). Po 20 minútach pri 37 °C sa bunky trikrát premyli ľadovým PBS a ihneď zmrazili v tekutom dusíku. Peletky buniek sa znova suspendovali v trojnásobnom objeme tlmivého roztoku A (20 mM Tris pH 7,6, 0,4 M NaCl, 0,2 mM EDTA, glycerol (20 % objemovo), 1,5 mM MgCl2, 2 mM ditiotretiol (DTT), 0,4 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, po 2 pg.mľ¹ leupeptínu, pepstatínu a aprotinínu). Zlomky buniek sa odstránili odstredením (15 000 x g, 15 minút), alkikvóty supematantu sa zmrazili v tekutom dusíku a uložili pri -80 °C. Koncentrácia proteínu sa stanovila Bradfordovým spôsobom (Bio-Rad) s použitím bovinného albumínového séra ako štandardu. Dvojvláknový oligonukleotid, zodpovedajúci NF-κΒ väzbovému elementu (10 pmol, Promega) sa označil s [³²P]dCTP (300 Ci.mmoľ¹) a T4 polynukleotidovou kinázou (New England Biolabs). Voľné nukleotidy sa odstránili na deliacej kolóne. Extrakty (10 pg proteínu) buniek sa spracovali s IL-18 alebo IL-18 plus IL-18BP sa potom inkubovali (15 minút, teplota miestnosti) so značenou sondou (3 x 10⁴ cpm) spolu s poly dl.dC (500 ng, Pharmacia) a denaturovanou DNA spermatu lososa (100 ng, Sigma) v 20 pl tlmivého roztoku, obsahujúceho HEPES (pH 7,5, 10 mM), 60 mM KC1, 1 mM MgCl2, 2 mM EDTA, 1 mM DTT a glycerol (5 % objemovo). Zmesi sa potom naniesli na 5 % nedenaturované polyakrylátové gély. Elektroforéza sa vykonala pri 185 V v 0,5 x TBE (40 mM Tris HCI, 45 mM kyseliny boritej a 2,5 mM EDTA). Gély sa vysušili vo vákuu a cez noc autorádiografovali pri -80 °C. Zistilo sa, že IL-18 indukuje vznik p50 NF-κΒ homodiméru a p65/p50 NF-κΒ heterodiméru. Urinámy aj rekombinantný IL-18BP inhibovali aktiváciu NF-κΒ s IL-18, čo sa stanovilo posunom pohyblivosti pri elektroforéze s extraktami KG-1 buniek, viažucich rádioznačený oligonukleotid, zodpovedajúci NF-κΒ súhlasnej sekvencie.

Príklad 9

Expresia IL-18BP v E. coli, kvasinkách a bunkách hmyzu

IL-18BP môže byť produkovaný tiež ďalšími rekombinantnými bunkami, ako sú prokaryotické bunky, napríklad E. coli, alebo iné eukaryotické bunky, ako sú kvasinky a bunky hmyzu. Je známy veľký počet spôsobov na konštrukciu príslušných vektorov, ktoré nesú DNA, ktorá kóduje pre všetky IL-18BP a vhodných na transformáciu E. coli, kvasinkových buniek, alebo buniek hmyzu tak, aby sa dosiahla produkcia rekombinantného IL-18BP. Na expresiu v bunkách kvasiniek sa DNA, kódujúca pre IL-18BP (príklad 6) odreže a vloží do expresných vektorov, vhodných na transfekciu kvasinkových buniek. Na expresiu v bunkách hmyzu sa DNA, kódujúca pre IL-18BP vloží do baculovírusu a bunky hmyzu sa infektujú uvedeným rekombinantným baculovírusom. Na expresiu v E. coli sa DNA, kódujúca pre IL-18BP vystaví polohovo usmernenej mutagenéze s príslušnými oligonukleotidy tak, že iniciačný ATG kodón sa vloží práve pred prvý kodón zrelého IL-18BP. Voliteľne sa taká DNA môže pripraviť spôsobom PCR s vhodnými smerovými a protismerovými primérmi. Výsledné cDNA konštrukty sa potom vkladajú do príslušne konštruovaných prokaryotických expresných vektorov spôsobmi, ktoré sú v odbore dobre známe [23].

Príklad 10

Konštrukcia adeno-združeného expresného vektora na expresiu IL-18BPa in vivo

Funkčný gén kódujúci pre IL-18BPa je konštruovaný na základe plazmidu pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA). IL-18BP cDNA s Kozákovou súhlasnou sekvenciou na 5' zakončení sa ligovala do Xba I polohy plazmidu pcDNA3 spôsobom, ktorý ničí reštrikčné miesto. Nové Xba I miesto sa vkladá polohovo usmernenou mutagenézou pred neomycínovú kazetu (báza 2151 pôvodnej sekvencie pcDNA3) a za SV40 polyadenylačný signál (báza 3372 pôvodnej sekvencie pcDNA3). Tento konštrukt sa potom reže s Xba I a výsledný 4,7 kb minigén sa vložil do polohy Xba I polohy plazmidu psub201, ako opisuje Snyder (Snyder a ďalší, Current Protocols in Human Genetics, kapitoly 12.1.1 až 12.1.17, John Wiley & Sons 1996). Výsledný rekombinantný plazmid sa ko-transfektuje s pomocným AAV plazmidom pAAV/Ad do buniek T293 človeka. Kultúry sa potom očkovali adenovírusom ako pomocným vírusom a po 48 až 60 hodinách inkubácie sa bunky sa oddeli- li. Bunky sa vystavili trom cyklom zmrazovania - topenia, zlomky buniek sa odstránili odstreďovaním a supematant sa nasýtil na 33 % síranom amónnym. Zmes sa potom odstreďovala a rAAV sa precipituje zo supematanta zvýšením sýtenia na 50 % síranu amónneho. Vírus sa ďalej čistil s CsCl, dialyzoval a nakoniec 15 minút zahrieval pri 65 °C, aby sa rozložil adenovírus.

Príklad 11

Konštrukcia rekombinantných ružových proteínov IL-18BP

Podukcia proteínov, obsahujúcich IL-18BP, ktorý je fuzovaný k konštantnej oblasti IgG2 ťažkého reťazca sa môže vykonať nasledovne: DNA z IL-18BP sa podrobí polohovo usmernenej mutagenéze s príslušnými oligonukleotidmi tak, že sa osobitné reštrikčné miesto vloží práve pred a práve za kódujúce sekvencie. Plazmid, ktorý je nositeľom konštantnej oblasti IgG2 ťažkého reťazca, napríklad pRKCO42Fcl [6], sa podrobí podobnej polohovo usmernenej mutagenéze na vloženie toho istého osobitného reštrikčného miesta čo najbližšie k Asp 216 IgGl ťažkého reťazca spôsobom, ktorý umožňuje transláciu vo fáze fúzovaného proteínu. Fragment dsDNA, obsahujúci 5' netranslátované sekvencie a kódujúci pre IL-18BP, sa pripraví digesciou na osobitných reštrikčných miestach alebo voliteľne spôsobom PCR s príslušne navrhnutými primérmi. Mutantný pRKCD42Fcl sa digcruje obdobne, aby vznikol veľký fragment, obsahujúci uvedený plazmid a IgGl sekvencie. Uvedené dva fragmenty sa potom ligujú, aby vznikol nový plazmid, kódujúci polypeptidový prekurzor, obsahujúci IL-18BP a asi 227 C-terminálových aminokyselín IgGl ťažkého reťazca (závesná oblasť a CH₂ a CH₃ domény). Uvedená DNA, kódujúca fuzované proteiny sa môže izolovať z plazmidu digesciou s príslušnými reštrikčnými enzýmami a potom vložiť do účinných prokaryotických alebo eukaryotických expresných vektorov.

Príklad 12

Produkcia chemicky upravených IL-18BP

Na predĺženie polčasu životnosti IL-18BP v plazme sa môžu pripraviť IL-18BP, ktoré sú chemicky upravené (modifikované IL-18BP) s polyetylénglykolom (PEG). Modifikácia sa môže vykonať zosieťovaním PEG s cysteínovými zvyškami molekúl IL-18BP. Konštruovať možno mutantné IL-18BP, ktoré na amínovom zakončení obsahujú ďalší cysteínový zvyšok, glykozylačné miesta a karboxylové zakončenie každého IL-18BP. Mutagenéza sa môže vykonať spôsobom PCR s použitím oligonuklcotidov, obsahujúcich vyžadovanú mutáciu. Tieto mutantné proteiny sa exprimujú zvyčajným spôsobom, ktorý je v odbore dobre známy. Vykoná sa pegylácia týchto proteínov a stanoví sa ich aktivita.

Príklad 13

Príprava polyklonových protilátok k IL-18BP

Potkany sa najprv subkutánne injektovali z 5 pg čistého preparátu urinámeho IL-18BP, emulgovaného v úplnom Freundovom adjuvans. Po troch týždňoch sa znova subkutánne injektovali s 5 pg preparátu IL-18BP v neúplnom Freundovom adjuvans. V 10 dňových intervaloch sa podali ešte dve ďalšie injekcie IL-18BP vo forme roztoku v PBS. Potkany sa vykrvácali 10 dni po poslednej imunizácii. Vývoj hladiny protilátky sa sledoval rádioimunoanalýzou. IL-18BP značený ¹²⁵I (166 000 cpm) sa zmiešal s rôznymi riedeniami (1 : 50, 1 : 500, 1 : 5 000, a 1 : 50 000) séra potkana. Pridala sa suspenzia proteínových-G agarózových perličiek (20 pl, Pharmacia) do celkového objemu 200pl. Zmes sa nechala hodinu stáť pri teplote miestnosti, perličky sa potom trikrát premyli a vyhodnotila sa viazaná rádioaktivita. Ako negatívna kontrola sa použilo antisérum potkana k ľudskému leptínu. Titer IL-18R antiséra bol medzi 1 : 500 a 1 : 5 000, pričom titer negatívnej kontroly bol nižší ako 1 : 50.

Príklad 14

Príprava monoklonových protilátok k IL-18BP

Samičky myší Balb/C (trojmesačné) sa najprv injektovali s 2 pg IL-18BP v emulzii v úplnom Freundovom adjuvans; tri týždne neskôr sa opäť subkutánne injektovali v neúplnom Freundovom adjuvans. V 10 dňových intervaloch sa podali tri ďalšie injekcie subkutánne v PBS. Konečná zosilňovacia dávka sa podala intraperitonálne 4 a 3 dni pred fúziou myši, ktorá vykazovala najvyšší väzbový titer, stavovaný spôsobom IRIA (pozri v ďalšom texte). Fúzia sa vykonala použitím NSO/1 myelómovej bunkovej línie a lymfocytov, pripravených zo sleziny a miazgových uzlín živočícha ako fúzového partnera. Fúzované bunky sa rozdelili na mikrokultivačné platne a v DMEM, doplnenom s H AT a 15 % konského séra sa selektovali hybridómy. Hybridómy, pri ktorých sa stanovilo, že produkujú protilátky k IL-18BP sa subklonovali spôsobom obmedzeného riedenia a injektovali myšiam Balb/C, ktoré boli pred tým primátované s pristanom na produkciu ascites. Izotypy uvedených protilátok sa určovali s použitím komerčne dostupnej súpravy ELISA (Amersham, UK).

Vyhľadávanie a výber (skríning) hybridómov, produkujúcich anti-IL-18BP monoklonové protilátky sa vykonal nasledovne: hybridómové supematanty sa skúšali na prítomnosť anti-IL-18BP protilátok inverznou rádioimunoanalýzou na tuhej fáze (IRIA). Platne ELISA (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) sa pokryli Talonom čisteným IL-18BPa-His_e (10 pg.mľ¹, 100 μΐ na jamku). Po inkubácii cez noc pri 4 °C sa platne dva razy premyli s PBS, obsahujúcom BSA (0,5 %) a Tween 20 (0,05 %) a blokovali v premývacom roztoku najmenej 2 hodiny pri 37 °C. Pridali sa supematanty hybridómovej kultúry (100 μΐ na jamku) a platne sa inkubovali 4 hodiny pri 37 °C. Potom sa platne tri razy premyli a pridal sa konjugát kozej-anti-myšej chrenovej peroxidázy (HRP, Jackson Labs, 1:10 000, 100 μΐ na jamku) na dve hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa platne štyri razy premyli a vyfarbili pomocou ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etylbenztiazolin-6-sulfónová) kyselina, Sigma) s H₂O₂ ako substrátom. Platne sa čítali automatickým čitačom súpravy ELISA. Ako pozitívne vzorky sa hodnotili tie vzorky, v ktorých sa dosiahla absorbancia najmenej 5 razy vyššia, ako v bola kontrolná hodnota negatívneho pokusu.

Prílad 15

Afinitná chromatografia IL-18BP s monoklonovými protilátkami

Protilátky proti IL-18BP sa použili na čistenie IL-18BP afinitnou chromatografiou. Ascitová tekutina s obsahom monoklonovej protilátky, vylučovanej hybridómmi sa čistila zrážaním síranom amónnym pri 50 % sýtení a nasledujúcou rozsiahlou dialýzou proti PBS. Na 1 ml Affigelu 10 (BioRad USA) sa podľa údajov výrobcu viaže asi 10 mg imunoglobulínov.

250 ml urinámych proteínov človeka (ekvivalentné 250 litrom surového moču) sa nasadilo na 0,5 ml antiIL-18BP protilátkovú kolónu pri 4 °C a prietoku 0,25 ml.min.'¹. Stĺpec sa premyl s PBS až do vymiznutí reakcie na proteíny v premývacej kvapaline. Potom sa IL-18BP eluoval s 25 mM roztokom tlmiča z kyseliny citrónovej, pH 2,2 (osemnásobným objemom kolóny) a ihneď neutralizoval 1 M roztokom Na₂CO₃. Ďalšie vyčistenie tohto preparátu sa dosiahlo spôsobom SEC (size cxclusion chromatography).

Príklad 16

Analýza ELISA

Mikrotitračné platne (Dynatech alebo Maxisorb, Nunc) sa pokryli anti-IL-18BP monoklonovou protilátkou (bezsérový hybridómový supematant alebo imunoglobulíny ascitovej tekutiny) cez noc pri 4 °C. Platne sa potom premyli PBS obsahujúcom BSA (0,5 %) a Tween 20 (0,05 %) a blokovali sa v rovnakom roztoku najmenej 2 hodiny pri 73 °C. Skúšané vzorky sa zriedili do blokovacieho roztoku a pridali do jamiek (100 μΐ na jamku) na čas 2 hodín pri 37 °C. Platne sa potom tri razy premyli s PBS obsahujúcom Tween 20 (0,05 %); nasledoval prídavok anti-TL-18BP séra potkana (1:1 000, 100 μΐ na jamku) a kultivácia cez noc pri 4 °C. Platne sa trikrát premyli a pridal sa konjugát kozej-proti-potkanej chrenovej peroxidázy (HRP, Jackson Labs, 1:10 000, 100 μΐ na jamku); platne sa 2 hodiny udržiavali pri teplote miestnosti. Potom sa štyrikrát premyli a vyfarbili pomocou ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etylbenztiazolín-6-sulfónová) kyselina, Sigma) s H₂O₂ ako substrátom. Platne sa čítali automatickým čítacom súpravy ELISA.

Príklad 17

Neglykozylovaný ľudský IL-18BP je biologicky aktívny

Čistený rekombinantný IL-18BPa sa skúšal na schopnosť inhibovať biologickú altivitu IL-18. IL-18BPa v zásvislosti od veľkosti dávky inhiboval IFN-γ vyvolanú aktivitu ľudského aj myšieho IL-18 v slezinových bunkách myši, PBMC a v bunkovej línii KG-1 človeka (obr. 9).

Čistený IL-18BPa s príveskom His₆ na C-zakončení (1,5 pg, 50 μΐ) sa upravil na pH 7,5 a zmiešal s N-glykozidázou F (3 μΐ, 500 000 jednotiek.ml·¹, PNGase F, New England Biolabs). Zmes sa inkubovala 24 hodín pri 37 °C v nedenaturačných podmienkach. Alikvotné časti vzorky a z nedigerovaného IL-18PB-His₆sa analyzovali spôsobom SDS-PAGE v neredukčných podmienkach imunopijakovaním s protilátkami k IL-18BP. Zistilo sa, že v časti spracovanej PNGase sa ~40 kD pás IL-18PB-His₆ ztratil a objavil sa nový, ~20 kD pás. Molekulová hmotnosť produktu a špecifickosť PNGase F poukazujú na to, že IL-18BP-His₆ bol celkom deglykozylovaný. Podiel spracovaný s PNGase, nedigerovaný IL-18BPHis₆ a kontrolná vzorka obsahujúca PNGase v tlmivom roztoku sa oddelene absorbovali na Talonových perličkách, premyli fosfátovým tlmivým roztokom a eluovali imidazolom (100 mM). Eluované podiely sa podrobili bioanalýze s použitím ľudského IL-18 (20 ng.mľ¹), LPS (2 pg.mľ¹) a slezinových buniek myši. Výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke:

Vzorka	IFN-γ (ng.mľ¹)
Kontrolná	7,5
Nedigerovaný IL-18BP-His₆	0
s PNGase spracovaný IL-18BP-His₆	0

Z uvedeného možno vyvodzovať záver, že deglykozylovaný IL-18BP je biologicky aktívny ako modulátor aktivity IL-18.

Uvedený opis špecifických uskutočnení objasňuje všeobecnú podstatu tohto vynálezu tak, že ju možno ľahko upravovať a prispôsobovať použitím súčasných znalostí na rôzne aplikácie špecifických uskutočnení bez toho, že by sa opustila všeobecná podstata vynálezu, a preto také adaptácie a modifikácie treba chápať za zahrnuté do podstaty a rozsahu ekvivalentov opísaných uskutočnení vynálezu. Treba pripomenúť, že v tomto texte použitá frazeológia alebo terminológia slúži na opis vynálezu a nie na jeho obmedzenie.

Literatúra

1. Anderson, D.M., a ďalší, A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function, Náture 390 (6656), 175 ažl79 (1997).

2. Bollon, D. P., a ďalší, J. Clin. Hematol. Oncol. 10, 39 až48 (1980).

3. Botstein, D., a ďalší, Miami Wint. Symp. 19, 265 až274 (1982).

4. Broach, J. R., v: „The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y, strany 445 až 470 (1981).

5. Broach, J. R., Celí 28, 203 až 204 (1982).

6. Bym R. A., a ďalší, Náture (London) 344. 667 až 670 (1990).

7. Car B. D., V .M. Eng, B.Schnyder, L. Ozmen, S. Huang, P. Gallay,D. Heumann,

M. Aguet, a B. Ryffel, Interferon gamma receptor deficient mice are resistant to endotoxic shock, J. Exp. Med. 179, 1437 až 1444, íssn 0022-1007 (1994).

8. Chater, K.F. et.al., v: „Sixth Intemational Symposium on Actinomycetales Biology“, 1994, (Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), strany 45-54).

9. Conti, B., J. W. Jahng, C. Tinti, J. H. Son, and T. H. Joh., Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex, J. Biol. Chem. 272, 2035 až 2037, 1997.

10. Dao, T., K. Ohashi, T.Kayano, M. Kurimoto and H.Okamura, Interferon-gamma-inducing factor, a novel cytokine, enhances Fas, ligand-mediated cytotoxicity of murine T helper 1 cells, Cell-lmmunol. 173, 230 až 5 (1996), issn: 0008-8749.

11. Engelmann, H., D. Aderka, M. Rubinstein, D. Rotman, and D. Wallachi, A tumor necrosis factor-binding proteín purified to homogeneity from human urine protects cells Írom tumor necrosis factor toxicity, J. Biol. Chem. 264, 11974 až 11980 (1989).

12. Engelmann, H., D. Novick, and D. Wallach, Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with celí surface tumor necrosis factor receptors, J. Biol. Chem. 265, 1531 až 1536 (1990).

13. Fantuzzi, G., a ďalší, IL-18 regulation of IFN-γ production and celí proliferation as revealed in interleu kin-1 b converting enzyme-deficient mice, Blood,. 91, 2118 až 2125 (1998).

14. Gryczan, T., „The Molecular Biology of the Bacilli“, Academic Press, NY (1982), strany 307-329).

15. Gutkind, J.S., a ďalší, A novel c-fgr exon utilized in Epstein-Barr virus-infected B lymphcytes but not in normál monocytes, Molec. Celí. Biol.,. 11,1500 až 1507 (1991).

16. Heremans, H., J. Van Damme, C. Dillen, R. Dijkmans, and A. Billiau, Interferon gamma, a mediator of lethal lipopolysaccharide-induced Shwartzman-like shock reactions in mice, J. Exp. Med. 171,1853 až 1869 (1990), issn: 0022-1007.

17. Izaki K., Jpn. J. Bacteriol. 33. 729 až 742 (1978).

18. John J. F., a ďalší, Rev. Infect. Dis. 8^693 až 704 (1986).

19. Kendall K. J., a ďalší, J. Bacteriol. 169,4177 až 4183 (1987).

20. Kohno K., J. Kataoka, T . Ohtsuki, Y . Suemoto, I. Okamoto, M. Usui, M. Ikeda, M. Kurimoto, IFNgamma-inducing factor (IGIF) is a costimulatory factor on the activation of Th 1 but not Th2 cells and exerts its effect independently of IL-12, J. Immunol. 158,1541 až 1550 (1997).

21. Maliszewski, C. R., T. A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dower, J. Slack, M. P . Beckmann, K. H. Grabstein, Cytokine receptors and B celí functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4-induced B celí activities in vitro, J. Immunol. 144, 3028 až 3033 (1990).

22. Maniatis, T., v: „Celí Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3: Gene Expre-ssion“, Academic Press, NY 1980, strany 563 až 608.

23. Maniatis a ďalší, Molecular Clomng: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1982.

24. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, M. Kurimoto, Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production, Eur. J. Immunol. 26,1647 až 1651 (1996), issn: 0014-2980.

25. Mizushima S., Nagata, S., pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector, Nucleic Acid Res. 18, 5322 až 5328 (1990).

26. Nakamura, K., H. Okamura, K. Nagata, T. Komatsu, T. Tamura, Purification of a factor which provides a costimulatory signál for gamma interferon production, Infect-Immun. 61, 64 až 70 (1993), issn: 0019-9567.

27. Nakamura, K., H. Okamura, M. Wada, K. Nagata, T. Tamura, Endotoxin-induced sérum factor that stimulates gamma interferon production, Infect-Immun. 57, 590 až 595 (1989), issn: 0019-9567.

28. Novick D., B. Cohen, M. Rubinstein, The Human Interferon alpha/beta Receptor - Characterization and Molecular Cloning, Celí 77, 391 až 400 (1994).

29. Novick D., B. Cohen, M. Rubinstein, Soluble Interferon-alpha Receptor Molecules Are Present in Body Fluids, FEBS Lett. 314, 445 až 448 (1992).

30. Novick D., H. Engelmann, D. Wallach, and M. Rubinstein, Soluble cytokine receptors are present in normál human urine, J. Exp. Med. 170, 1409 až 1414(1989).

31. Okamura H., H. Tsutsui, T . Komatsu, M. Yutsudo, A. Hakura, T . Tanimoto, K. Torigoe, T. Okura, Y. Nukada, K. Hattori, K. Akita, M. Namba, F. Tanabe, K. Konishi, S. Fukuda, M. Kurimoto, Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamma production by T cells, Náture 378, 88-91 (1995).

32. Rothe H., N. A. Jenkins, N. G. Copeland, H. Kôlb, Active stage of autoimmune diabetes is associated with the expression of a novel cytokine, IGIF, which is located near Idd2, J. Clin. Invest. 99, 469 až 74 (1997), issn: 0021-9738.

33. Sambrook J., E.F. Fritsch, M. T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, New York 1989.

34. Simonet W .S., a ďalší, Osteoprotegerin: a novel secreted proteín involved in the regulation of bone density, Celí 89(2), 309 až 319 (1997).

35. Sompayrac L.H., K.L. Danna, Efficient infection of monkey cells with DNA of simian vírus, 40. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7575 až 7578 (1981).

36. Sparks C.A., a ďalší, Assignment of the nuclear mitotic apparatus proteín NuMA gene to human chromosome 11 ql3, Genomics 17, 222 až 224 (1993).

37. Tsutsui H., K. Nakanishi, K. Matsui, K. Higashino, H. Okamura, Y. Miyazawa, K. Kaneda, IFN-gammainducing factor up-regulates Fas ligand-mediated cytotoxic activity of murine natural killer celí dones, J. Immunol. 157, 3967 až 3973 (1996), issn: 0022-1767

38. Ushio S., M. Namba, T. Okura, K. Hattori, Y. Nukada, K. Akita, F. Tanabe, K. Konishi, M. Micallef, M. Fujii, K. Torigoe, T . Tanimoto, S. Fukuda, M. Ikeda, H. Okamura, M. Kurimoto, Cloning of the cDNA for human IFN-gamma-inducing factor, expression in Escherichia coli, and studies on the biológie activities of the proteín, J. Immunol. 156. 4274 až 4279.34 (1996), Okayama, H. and Berg, P . A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells, Mol. Celí. Biol. 3, 280-289 (1983).

39. Yasuda H., a ďalší, Identity of osteoclastogenesis inhibitory factor (oCIF) and osteoprotegerin (oPG): a mechanism by which OPG/OCIF inhibits osteo-clastogenesis in vitro, Endocrinology 139, 1329 až 1337 (1998).

Zoznam sekvencií <110> Novick, Daniela

Dinarello, Charles

Rubinstein, Menachem

Kim, Soo Hyun

Yeda Research and Development Co. Ltd.

< 120> Interleukínové-18 väzbové proteíny, príprava a použitie <130> IL-18 Rubinstein <140>

<141>

<150> 125463 <151> 1998-07-22 <150> 122134 <151> 1997-11-06 <150> 121869 <151> 1997-09-29 <150> 121639 <151> 1997-08-27 <150> 121554 <151> 1997-08-14 <160> 10 < 170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211>1348 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagaagagga cgttgtcaca gataaagagc caggctcacc agctcctgac gcatgcatca60 tgaccatgag acacaactgg acaccagacc tcagcccttt gtgggtcctg ctcctgtgtg120 cccacgtcgt cactctcctg gtcagagcca cacctgtctc gcagaccacc acagctgcca180 ctgcctcagt tagaagcaca aaggacccct gcccctccca gcccccagtg ttcccagcag240 ctaagcagtg tccagcattg gaagtgacct ggccagaggt ggaagtgcca ctgaatggaa300 cgctgagctt atcctgtgtg gcctgcagcc gcttccccaa cttcagcatc ctctactggc360 tgggcaatgg ttccttcatt gagcacctcc caggccgact gtgggagggg agcaccagcc420 gggaacgtgg gagcacaggt acgcagctgt gcaaggcctt ggtgctggag cagctgaccc480 ctgccctgca cagcaccaac ttctcctgtg tgctcgtgga ccctgaacag gttgtccagc540 gtcacgtcgt cctggcccag ctctgggctg ggctgagggc aaccttgccc cccacccaag600 aagccctgcc ctccagccac agcagtccac agcagcaggg ttaagactca gcacagggcc660 agcagcagca caaccttgac cagagcttgg gtcctacctg tctacctgga gtgaacagtc720 cctgactgcc tgtaggctgc gtggatgcgc aacacacccc ctccttctct gctttgggtc780 ccttctctca ccaaattcaa actccattcc cacctaccta gaaaatcaca gcctccttat840 aatgcctcct cctcctgcca ttctctctcc acctatccat tagccttcct aacgtcctac900 tcctcacact gctctactgc tcagaaacca ccaagactgt tgatgcctta gccttgcact960 ccagggccct ttcccagaca cagcagggga cagctctggc ttcactctaa tgtatctgtg aaaaaaaaaa acctgcattt gctcccactc acgctcaagc cgcattctgc tggactgttc tcatccccac aaaaaaaaaa cccacatgac ccatgtctct ctggttgaaa agacttccta cagggaaggg atgggtcctc aaaaaaaa tttctggaag gctcatttag tgctgcctct tcttcgtgct atgggggcac ataaaggatt cctcccaact tcccgtcttc tcagtgaagt gtatgttttt cagctgcttc attcaatgga attcttgctt ctcaccgccc catcctcttt tttttccccc ggatccacac aaaaaaaaaa

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1348 <210> 2 <211>192 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNÁL <222> (1)..(28) <400> 2

Met 1

Arg His

Asn

Trp 5

Thr

Pro Asp

Leu

Ser Pro 10

Leu

Trp

Val

Leu 15

Leu

Cys

Ala

His

Val

Thr

Leu

Val

Arg

Ala

Thr

Pro

Val

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Ala

Thr

Ala

Ser

Val

Arg

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

35

40

45

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Val

Phe

Pro

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

50

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Leu

Asn

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Cys

Ser

Arg

Phe

Pro

Asn

Phe

Ser

íle

Leu

85

90

95

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Gly

Ser

Phe

íle

Glu

His

Leu

Pro

Gly

Arg

Leu

100

105

110

Trp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ser

Arg

Glu

Arg

Gly

Ser

Thr

Gly

Thr

Gin

Leu

115

120

125

Cys

Lys

Ala

Leu

Val

Leu

Glu

Gin

Leu

Thr

Pro

Ala

Leu

His

Ser

Thr

130

135

140

Asn

Phe

Ser

Cys

Val

Leu

Val

Asp

Pro

Glu

Gin

Val

Gin

Arg

His

145

150

155

160

Val

Leu

Ala

Gin

Leu

Trp

Ala

Gly

Leu

Arg

Ala

Thr

Leu

Pro

165

170

175

Thr

Gin

Glu

Ala

Leu

Pro

Ser

His

Ser

Pro

Gin

Gly

180

185

190

<210> 3 <211>1038 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gagaagagga tgaccatgag cccacgtcgt ctgcctcagt ctaagcagtg ctgagggcaa cagcagggtt cctacctgtc cacaccccct cctacctaga ctatccatta aagactgttg tctggaagcc tcatttagtc ctgcctcttc ttcgtgctgt gggggcacca aaaggattat cgttgtcaca acacaactgg cactctcctg tagaagcaca tccagcattg ccttgccccc aagactcagc tacctggagt ccttctctgc aaatcacagc gccttcctaa atgccttagc tcccaactat ccgtcttcct agtgaagtca atgttttttt gctgcttcgg tcaatgga gataaagagc acaccagacc gtcagagcca aaggacccct gaagtgacct cacccaagaa acagggccag gaacagtccc tttgggtccc ctccttataa cgtcctactc cttgcactcc tcttgctttt caccgcccca tcctctttca tttccccctt atccacactg caggctcacc tcagcccttt cacctgtctc gcccctccca ggccagaggt gccctgccct cagcagcaca tgactgcctg ttctctcacc tgcctcctcc ctcacactgc agggccctac cccagacagc gcaggggaac gctctggccg cactctaatg tatctgtgtc agctcctgac gtgggtcctg gcagaccacc gcccccagtg ggaagtgcca ccagccacag accttgacca taggctgcgt aaattcaaac tcctgccatt tctactgctc ctgcatttcc tcccactccc gctcaagcct cattctgcag gactgttcca atccccacat gcatgcatca ctcctgtgtg acagctgcca ttcccagcag ctgagctggg cagtccacag gagcttgggt ggatgcgcaa tccattccca ctctctccac agaaaccacc cacatgactt atgtctctgc ggttgaaatg acttcctatc gggaagggat gggtcctcat

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1038 <210>4 <211>113 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNÁL <222> (1)..(28) <400>4

Met Arg 1

His

Asn

Trp 5

Thr

Pro Asp

Leu

Ser Pro 10

Leu

Trp

Val

Leu 15

Leu

Cys

Ala

His

Val

Thr

Leu

Val

Arg

Ala

Thr

Pro

Val

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Ala

Thr

Ala

Ser

Val

Arg

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

35

40

45

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Val

Phe

Pro

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

50

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Leu

Ser

Trp

Ala

Glu

65

70

75

80

Gly

Asn

Leu

Ala

Pro

His

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Gin

85

90

95

Ser

Thr

Ala

Gly

Leu

Arg

Leu

Ser

Thr

Gly

Pro

Ala

Gin

100

105

110

Pro <210>5 <211> 7063 <212> DNA <213> Homo sapiens <400>5 gaattcgcgg ccgcgtcgac gccagagggg ctaggatgag agacagaggg tgtgatggtg60 ggtgctggga aatgtacccg accttggggc tggtggctgg gggagtgggt agcctgggaa120 aggccaggat gtggacggac tggtatggca ttgagcctga agtggtccaa cttggggttc180 cccagtgcct aggaaagttg tccccttgaa tgtcagtgtg aaggtgaagg aggaagcaga240 tgcctgttca tatggaaaca aagacctggc tgtgaagagg ggaggcggac accaaagtcc300 tgacacttgg gcgggacaga attgatctgt gagagactca tctagttcat accctaggtg360 accctggggg tggcatgggg gtagattaga gatcccagtc tggtatcctc tggagagtag420 gagtcccagg agctgaaggt ttctggccac tgaactttgg ctaaagcaga ggtgtcacag480 ctgctcaaga ttccctggtt aaaaagtgaa agtgaaatag agggtcgggg cagtgctttc540 ccagaaggat tgctcggcat cctgcccttc ccagaagcag ctctggtgct gaagagagca600 ctgcctccct gtgtgactgg gtgagtccat attctctctt tgggtctcaa ttttgccttc660 cctaatgaag gggtaagatt ggactaggta agcatcttac aaccatttgt ggtcatgaga720 gctggggtgg ggaaggattg tcacttgacc cccccagctc tgtttctaag tgctgaaaga780 gctccaggct atgctacggg aggagaagcc agctactgag gaaaagccag ctactgagaa840 aaagcgggag tggtttacca ttctcctccc ccacctttca ccagagaaga ggacgttgtc900 acacataaag agccaggctc accagctcct gacgcatgca tcatgaccat gagacacaac960 tggacaccag acctcagccc tttgtgggtc ctgctcctgt gtgcccacgt cgtcactctc1020 ctggtcagag ccacacctgt ctcgcagacc accacagctg ccactgcctc agttagaagc1080 acaaaggacc cctgcccctc ccagccccca gtgttcccag cagctaagca gtgtccagca1140 ttggaagtga cctggccaga ggtggaagtg ccactgaatg gaacgctgag cttatcctgt1200 gtggcctgca gccgcttccc caacttcagc atcctctact ggctgggcaa tggttccttc1260 attgagcacc tcccaggccg actgtgggag gggagcacca gccgggaacg tgggagcaca1320 ggtacgcagc tgtgcaaggc cttggtgctg gagcagctga cccctgccct gcacagcacc1380 aacttctcct gtgtgctcgt ggaccctgaa caggttgtcc agcgtcacgt cgtcctggcc1440 cagctctggg tgaggagccc aaggagaggc ctccaggaac aggaggagct ctgcttccat1500 atgtggggag gaaagggtgg gctctgccag agcagcctgt gaactaatgc ccagcattcc1560 tcaaggtcag ccagacaaaa aggaacttag gtcttgggca gaggaggtgt agcctggggc1620 aaagtgatga gatgtccctc ctttccttgg ectgatcctt gtctgccttc acttccctag1680 gctgggctga gggcaacctt gccccccacc caagaagccc tgccctccag ccacagcagt1740 ccacagcagc agggttaaga ctcagcacag ggccagcagc agcacaacct tgaccagagc1800 ttgggtccta cctgtctacc tggagtgaac agtccctgac tgcctgtagg ctgcgtggat1860 gcgcaacaca ccccctcctt ctctgctttg ggtcccttct ctcaccaaat tcaaactcca1920 ttcccaccta cctagaaaat cacagcctcc ttataatgcc tcctcctcct gccattctct1980 ctccacctat ccattagcct tcctaacgtc ctactcctca cactgctcta ctgctcagaa2040 accaccaaga ctgttgatgc cttagccttg cactccaggg ccctacctgc atttcccaca2100 tgactttctg gaagcctccc aactattctt gcttttccca gacagctccc actcccatgt2160 ctctgctcat ttagtcccgt cttcctcacc gccccagcag gggaacgctc aagcctggtt2220 gaaatgctgc ctcttcagtg aagtcatcct ctttcagctc tggccgcatt ctgcagactt2280 cctatcttcg tgctgtatgt tttttttttc ccccttcact ctaatggact gttccaggga2340 agggatgggg gcagcagctg cttcggatcc acactgtatc tgtgtcatcc ccacatgggt2400 cctcataaag gattattcaa tggaggcatc ctgacatctg ttcatttagg cttcagttcc2460 actcccagga actttgcctg tcccacgagg gagtatggga gagatggact gccacacaga2520 agctgaagac aacacctgct tcaggggaac acaggcgctt gaaaaagaaa agagagaaca2580 gcccataatg ctccccggga gcagaggcca ctaatggaga gtgggaagag cctggaaaga2640 tgtggcctca ggaaaaggga tgagagaaag gaggtggtat ggaagactca gcaggaacaa2700 ggtaggcttc aaagagccta tattcctctt tttcccacac cgatcaagtc aactcagtac2760 tcacgggaga aaaatagact ttatttacaa gtaataacat ttagaaaaga tccatccccg2820 gcccttaaaa accttcccat cactccaaat cccaccccag tgcaagtctg gggaaggtag2880 ggtgtgagct gctgctgaag gctgtccccc aaccccactc ctgagacaca gggcccatcc2940 gtcctgggaa agagcatcct ctggcaggtg ctcccaccag gtcagaccca gtcctggact3000 tcaagagtga gggcccctgc tgggcccagc caccaggaca gcaggaacca gggcctactc3060 ctcttatggt cccttctaga tccagaggct aagaggaaga ctggccaggc ccaaggaccc3120 agccatcaaa accagcctca aatctggttg tgatggagaa gtgactttgc tttaagaaaa3180 aaggaggcaa ggtagggaga gcgcccacac tgtccatgct ccaggccccc tgggccagct3240 ccgagaaggc gccagtgaag gaccagggac caggccaggg tgcgggcagg catcactgtc3300 tctaggggtt tggctactgt tggcctggga gctgagagaa ggcactgaga gggacagtag3360 gcggaggacc aggtgacggc agcatcgggg acacaggtgg ggccactcac tggtactggc3420 cctttagtgc tttgcctgaa agagacacag tcacatggcc agatgagaac ttgcgatact3480 agcctgcacc cactggctgg gaagatctct tcctgctccc acgcccctgt ctggatcccc3540 tcccttgtga gccccagggt tatcagttgc tggctgtgcc tgagcagctc tgggtgctct3600 ccatgagaat ctcttacccc gcggtctggg taccttgccc ggtggtggca cagggccttc gaggatgctg ggagacccaa cgccagggcg gctgctttct gtcatggggc gcagacagta tggaccttgt cttcccaaca tgagggaagg agtgctggag gggctctagg ctggattggc ctcatctgtg gaccatagct cgacacttat tgttctgctt tcctctctga gttccacctg gccctagtgc cctgcacagt ggggcacact aggctcatcc gggaacaaat tgctgccacc tgcaggagta ggagagggca cttggtggcc ctggtgccca cccatcaccg gggaatcccg ggcaggtaag aaggaggcca ttccagtcta ctggacaccc aagctgagca gaggaggtgg gagttggcgc agtgtacagt cacggcacat gaaatgggcc tacgcatttt atcggcccat ctaggaagta cagcctctgc ccaacttctt ccccctctcc cagcctgtca ggaggcacag gtgctacgca gcctttttct tcccactgta aaagatgccc ggggccatct acaccctcca gggtgcccat ttggctcgag atgcgcggag tttgaggctc aaggccatcg tgctgccttc tcgcttcatc tctgggcctc gtgggaaaca gcaagaggag aagtcaacgt gttcccatcc agagagaagg taacacccag gagacccgtt tgcatgctgg atggtgccca gtatggagat ggtcgggacc tctacctaag gctcctgcct gaacatgaga tcaggctaga gaccccaggc cgattgcgct tggcaagtgc gagcctggag taccccataa cggcacacag gaagaggtca aacacccaga aaggacaaga cctgagaagg ggcccttaac gaaggccctg gccttggatt attttggggt cggcctggga gggctgagtt ctcgcaggct tgtctggctc ccctggcact ccatgtattc ttgtcgacag tttcatggag tttggagatg tcagagctgg tgtccctcag ggtagcaggg cctcctccca ggcagtccac gatgggctgc tggagagaat tcagaagtgc acatggactg ttgagaggaa gtcttctctc gcagcctggc gctctcatcg gggtggcacc aacggcgggt cccgccgcag actggcgccg ccaggccagc ccccttaagc agtagtgctc gctggtggcc tcacatctga gcaacctgct atgggtcagg ctccctttag gagccaccgc tgcgctgctg ctcggcgcag ggctcaggga ggaggaggac cttcctgcct ccctgggcaa acccccaggg aggtcacccc tcagcaggtg ctcaccctgg gctgcagctc ccatgtagaa tcggcaggtc acttgaagcc actatttcta cacgcagaga ggaacaaatt gcttccaaga gcatggagga tctggctaag aggctgcagg tttaaaaagc atagtaagtc acgacgagca gccataatcg agcctgggaa ttccacatct gtacagaagc ccaactgctt aagccctcac tctattcata aagtgcaaag ggctaggccc tccaaacttc ggcaccctaa aacctcccct tgggcagcaa agcttcgcca gctagcctta ccttaaccaa gctgctcatc gtgggaattg cttggagagg gtggccccat ggtttccctc aatggcggca tccactgcga aaggctgttc gtcagcctgc gtgctgtgcc cccagcctca tgtttgcgcc ttcttagact agccaggtgt ccccttccca cccttggaga tccttggtga gcctacctca ccgggtggtg ggtctcttgg aggctgcatg ctggggctgt acgaggtaga atggcacaag acttcacccc ttcccctctt ggattccaag actccaggga tgcaatgcgg gctgttcctt acctcctggc cggcacacca tcctaggggc ctgctactac aaggaccggg agagtctggc ctccccacag agtgccccca aaggaggggc tttcctcttt cctgtagtcc gaactgcgag ggagaaccca gcaggagcag agcttctgga ttcccattcc tgcaaaggtc aaggtggtgc atgctttgag aaataaagtg catgtctcct cagggccctt acacacaggt tcaagatgtg caatgcctct cgttctctcc gtcaggaggc gtcactgccc cctccctgct ctgacctgtc agctaccagg cttggatgct ccccatcctg gcagtggcgg gtgttggggg cctagcttct aaggaagggc acgctgtacc cctgtttagt cttcatgtcg atggagaaga cttgtcctct actctgggcc gagggaaaga gctgggcctg ggagttccag atgccagtgc gggtctccag ggtggaagag tccagaactc aagacacaag cagtgcagtc tgagtgccct cggccagtca gaagggcagg tagcaggtct ttccagtcat cctgtggaag cctggcatct gtctgattca ttgctcacca atcttattca aattaattcc cagcctggcc ctaagtgtca acacagccag aggtggagct tccctgtgcc cctcacctgg tggtggggcg ggcgagctag accgcgtgct agacagagtg cttccgaagc cttaaagtgt tgatgttgtc gtagggaatg actagcccca gactagtcag accatgttcc cccccctgct gaaacaaagg cagctgcatg cttcaccctg agggatctaa tttttaagac cctgactgag gac acagggacac acttggtggg ccagtgcctc cgctggctgt aagccttgga tgggtgtgtt tgtcagaccg agcaaggtcc agaagctgga gtctcgggga ggacagttag cagagctgag agatccttcc gagggggaag acctgagcac ggccctggtg cctcggctat ttttcatctc gtggtcagtg tacactcgcc cctcctttcc ctgaccagat ccagctgtct gtgatccagg gatgggaggc tcagatgtgg ccagctgctc gcagggaagt tgccagcctt gtgccgcagg ccttctccct cctgccaagg caggggctcc tttccagcag caattgtgct cccctagatg ggatggtagc acgatccacc aggggcccca gtagccaggc agactgagta gtagaacgat aatctgttgc cctcagatcc gtgtctgcaa aagactcttc cagagtgttt aatcacactg gctcatccca agaacttccc gtaccagggg caagggcctg gggcatgctg cacaggctca tcctagccct ctctcagctt tgcccagtgc

3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7063 <210>6 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNÁL <222> (1)..(28) <400> 6

Met 1

Arg His

Asn

Trp Thr Pro 5

Asp

Leu

Ser Pro 10

Leu

Trp

Val

Leu 15

Leu

Cys

Ala

His

Val

Thr

Leu

Val

Arg

Ala

Thr

Pro

Val

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Ala

Thr

Ala

Ser

Val

Arg

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

35

40

45

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Val

Phe

Pro

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

50

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Leu

Asn

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Cys

Ser

Arg

Phe

Pro

Asn

Phe

Ser

íle

Leu

85

90

95

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Gly

Ser

Phe

íle

Glu

His

Leu

Pro

Gly

Arg

Leu

100

105

110

Trp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ser

Arg

Glu

Arg

Gly

Ser

Thr

Gly

Thr

Gin

Leu

115

120

125

Cys

Lys

Ala

Leu

Val

Leu

Glu

Gin

Leu

Thr

Pro

Ala

Leu

His

Ser

Thr

130

135

140

Asn

Phe

Ser

Cys

Val

Leu

Val

Asp

Pro

Glu

Gin

Val

Gin

Arg

His

145

150

155

160

Val

Leu

Ala

Gin

Leu

Trp

Val

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

Leu

Gin

165

170

17 5

Glu

Gin

Glu

Leu

Cys

Phe

His

Met

Trp

Gly

Lys

Gly

Leu

180

185

190

Cys Gin Ser Ser Leu 195 <210> 7 <211>1360 <212>DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcggccgcgt aagcttctgg acagataaag tggacaccag ctggtcagag cgaccacgca aaaggaaggc agccaggctc acctcagccc ccacacctgt gctaaacaca tcttcaggac accagctcct tttgtgggtc ctcgcagacc gctaacttga gtcttggagc tcctaaaggg 60 ctcttaggag ccaaagaaga ggacgttgtc 120 gacgcatgca tcatgaccat gagacacaac 180 ctgctcctgt gtgcccacgt cgtcactctc 240 accacagctg ccactgcctc agttagaagc 300 acaaaggacc cctgcccctc ccagccccca gtgttcccag cagctaagca gtgtccagca360 ttggaagtga cctggccaga ggtggaagtg ccactgaatg gaacgctgag cttatcctgt420 gtggcctgca gccgcttccc caacttcagc atcctctact ggctgggcaa tggttccttc480 attgagcacc tcccaggccg actgtgggag gggagcacca gccgggaacg tgggagcaca540 ggctgggctg agggcaacct tgccccccac ccaagaagcc ctgccctcca gccacagcag600 tccacagcag cagggttaag actcagcaca gggccagcag cagcacaacc ttgaccagag660 cttgggtcct acctgtctac ctggagtgaa cagtccctga ctgcctgtag gctgcgtgga720 tgcgcaacac accccctcct tctctgcttt gggtcccttc tctcaccaaa ttcaaactcc780 attcccacct acctagaaaa tcacagcctc cttataatgc ctcctcctcc tgccattctc840 tctccaccta tccattagcc ttcctaacgt cctactcctc acactgctct actgctcaga900 aaccaccaag actgttgatg ccttagcctt gcactccagg gccctacctg catttcccac960 atgactttct ggaagcctcc caactattct tgcttttccc agacagctcc cactcccatg1020 tctctgctca tttagtcccg tcttcctcac cgccccagca ggggaacgct caagcctggt1080 tgaaatgctg cctcttcagt gaagtcatcc tctttcagct ctggccgcat tctgcagact1140 tcctatcttc gtgctgtatg tttttttttt cccccttcac tctaatggac tgttccaggg1200 aagggatggg ggcagcagct gcttcggatc cacactgtat ctgtgtcatc cccacatggg1260 tcctcataaa ggattattca atggaggcat cctgacatct gtccatttag gcttcagttc1320 cactcccagg aactttgcct gtcccacgag ggagtatggg1360 <210>8 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> SIGNÁL <222> (1)..(28) <400>8

Met 1

Arg His

Asn

Trp 5

Thr

Pro Asp Leu

Ser Pro 10

Leu

Trp

Val

Leu 15

Leu

Cys

Ala

His

Val

Thr

Leu

Val

Arg

Ala

Thr

Pro

Val

Ser

20

25

30

Gin

Thr

Ala

Thr

Ala

Ser

Val

Arg

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro

35

40

45

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro

Val

Phe

Pro

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

50

55

60

Leu

Glu

Val

Thr

Trp

Pro

Glu

Val

Glu

Val

Pro

Leu

Asn

Gly

Thr

Leu

65

70

75

80

Ser

Leu

Ser

Cys

Val

Ala

Cys

Ser

Arg

Phe

Pro

Asn

Phe

Ser

íle

Leu

85

90

95

Tyr

Trp

Leu

Gly

Asn

Gly

Ser

Phe

íle

Glu

His

Leu

Pro

Gly

Arg

Leu

100

105

110

Trp

Glu

Gly

Ser

Thr

Ser

Arg

Glu

Arg

Gly

Ser

Thr

Gly

Trp

Ala

Glu

115

120

125

Gly

Asn

Leu

Ala

Pro

His

Pro

Arg

Ser

Pro

Ala

Leu

Gin

Pro

Gin

130

135

140

Ser

Thr

Ala

Gly

Leu

Arg

Leu

Ser

Thr

Gly

Pro

Ala

Gin

145

150

155

160

Pro <210>9 <211> 7812 <212> DNA <213> Homo sapiens <400 9 gtcgacggta ctgtgagaga tagagatccc ccactgaact tgaaagtgaa cttcccagaa ccatattctc ggtaagcatc gaccccccca agccagctac tcccccacct tcctgacgca cgcatgggca gagccttcac gcagatattg taaggggtgg atctctgggc cctgtaactg gtcgtcactc tcagttagaa cagtgtccag agtggtggag cagtcccctt ccctccccaa aaataggaca gcagtggacc ggagcagcag cactagaaaa gaccattcct gtaacggacg ggactggggg tctgaagagc ctgcagccgc gcacctccca gtgggaagga gaacgtggga gccctgcaca cacgtcgtcc gagctctgct aatgcccagc ggtgtagcct ccttcacttc tccagccaca aaccttgacc gtaggctgcg caaattcaaa ctcctgccat ctctactgct cctgcatttc ctcccactcc cgctcaagcc gcattctgca cccccgggaa ctcatctagt agtctggtat ttggctaaag atagagggtc gcagctctgg tctttgggtc ttacaaccat gctctgtttc tgaggaaaag ttcaccagag tgcatcatga ggcggggtag tccaaggcaa tagctctggc gtgctgaggg tggagttaca tcctttcctc tcctggtcag gcacaaagga cattggaagt ggtgggctat ctgcccatgt cccagtgtca gagaactcaa ccaaggccag ccatccagca ggtcatcctg cacattcccc ttcccaccta gagctggcag taactgctgc ttccccaact ggccgactgt agccttctgc gcacaggtac gcaccaactt tggcccagct tccatatgtg attcctcaag ggggcaaagt cctaggctgg gcagtccaca agagcttggg tggatgcgca ctccattccc tctctctcca cagaaaccac ccacatgact catgtctctg tggttgaaat gacttcctat agatttaata tcatacccta cctctggaga cagaggtgtc ggggcagtgc tgctgaagag tcaattttgc ttgtggtcat taagtgctga ccagctactg aagaggacgt ccatgagaca ggtgaggtct accacccagc tccagtctaa gtccctcttc tccttacccg agacctcagc agccacacct cccctgcccc gacctggcca gggcacagag accaccagct tgggtgcagg gacataagta cccctccacc ctgcctctgt aggagacagg gtgtttaggg ggtggtgtgc agagggcaca ctgtgtccct tcagcatcct gggaggggag ggccttctca gcagctgtgc ctcctgtgtg ctgggtgagg gggaggaaag gtcagccaga gatgagatgt gctgagggca gcagcagggt tcctacctgt acacaccccc acctacctag cctatccatt caagactgtt ttctggaagc ctcatttagt gctgcctctt cttcgtgctg cgactcacta ggtgaccctg gtaggagtcc acagctgctc tttcccagaa agcactgcct cttccctaat gagagctggg aagagctcca agaaaaagcg tgtcacacat caactggaca atgaacagaa gcacctggtg agcttctctg ccgctctgat ggcagcccac cctttgtggg gtctcgcaga tcccagcccc gaggtggaag gttcccaggg gagccagctg cttggcgcag atggtcacag cagagcctgc cacctgggct ttcagaagag ctagggcctc agagcagttc gcagagcagg agatggaacg ctactggctg caccaggtga tgacctttcc aaggccttgg ctcgtggacc agcccaagga ggtgggctct caaaaaggaa ccctcctttc accttgcccc taagactcag ctacctggag tccttctctg aaaatcacag agccttccta gatgccttag ctcccaacta cccgtcttcc cagtgaagtc tatgtttttt tagggcggga ggggtggcat caggagctga aagattccct ggattgctcg ccctgtgtga gaaggggtaa gtggggaagg ggctatgcta ggagtggttt aaagagccag ccaggtaggc tggagcaatg ctgttgcttt tactctgttc tccctggcta tctgtctcca tcctgctcct ccaccacagc cagtgttccc tgccactgag tcgggttgac ggctgagcac ctcccaagat gacctcccag tggcctctgg cccaagtcac gattcatcac tcggagacaa tctaggttcc gtaggggaag ctgagcttat ggcaatggtt gggtcgcagc ttcccttccg tgctggagca ctgaacaggt gaggcctcca gccagagcag cttaggtctt cttggcctga ccacccaaga cacagggcca tgaacagtcc ctttgggtcc cctccttata acgtcctact ccttgcactc ttcttgcttt tcaccgcccc atcctctttc ttttccccct cagaattgat gggggtagat aggtttctgg ggttaaaaag gcatcctgcc ctgggtgagt gattggacta attgtcactt cgggaggaga accattctcc gctcaccagc cttggggcta ggctaacccg aagaacctgg aataaagggc gaacccagac gagccgctga gtgtgcccac tgccactgcc agcagctaag taagaagcac tcctgagcgc gcaccattct gctccctatc agccttggtt ccatctcaga cgaggctggg gtgaaccaag ctgcacttct agatgcatgg ggcctgctct cctgtgtggc ccttcattga agccaggtgg ctccagccgg gctgacccct tgtccagcgt ggaacaggag cctgtgaact gggcagagga tccttgtctg agccctgccc gcagcagcac ctgactgcct cttctctcac atgcctcctc cctcacactg cagggcccta tcccagacag agcaggggaa agctctggcc tcactctaat

120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 ggactgttcc catccccaca ttaggcttca ggactgccac agaaaagaga aagagcctgg actcagcagg aagtcaactc aaagatccat gtctggggaa acacagggcc acccagtcct aaccagggcc caggcccaag tttgctttaa ccccctgggc gcaggcatca tgagagggac ctcactggta agaacttgcg cctgtctgga agctctgggt ccaggacagg atgctacttg tcctgccagt ggcggcgctg gggggaagcc cttcttgggt agggctgtca gtaccagcaa ttagtagaag tgtcggtctc gaagaggaca cctctcagag gggccagatc aaagagaggg gcctgacctg tccagggccc agtgccctcg tccagttttc aagaggtggt aactctacac acaagcctcc cagtcctgac gccctccagc agtcagtgat gcagggatgg ggtcttcaga gtcatccagc ggaaggcagg catcttgcca attcagtgcc caccaccttc attcacctgc attcccaggg tggcctttcc tgtcacaatt gccagcccct gagctggatg gtgccacgat cctggagggg agggaaggga tgggtcctca gttccactcc acagaagctg gaacagccca aaagatgtgg aacaaggtag agtactcacg ccccggccct ggtagggtgt catccgtcct ggacttcaag tactcctctt gacccagcca gaaaaaagga cagctccgag ctgtctctag agtaggcgga ctggcccttt atactagcct tcccctccct gctctccatg gacacctctt gtggggcggt gcctctacct gctgtggtgg ttggacaggg gtgttgagga gaccgggaga ggtcccgcca ctggagctgc ggggagtcat gttaggcaga ctgagtggac cttcccttcc ggaagtgagg agcacagtgc tggtggggct gctatctgga atctcctcat cagtggacca tcgcccgaca tttcctgttc cagattcctc tgtctgttcc ccagggccct gaggccctgc tgtggggggc tgctcaggct gaagtgggaa gcctttgctg gcaggtgcag tccctggaga caaggcttgg gctccctggt agcagcccat gtgctgggaa agatgggcag gtagcaagga ccaccttcca ccccactgga tgggggcagc taaaggatta caggaacttt aagacaacac taatgctccc cctcaggaaa gcttcaaaga ggagaaaaat taaaaacctt gagctgctgc gggaaagagc agtgagggcc atggtccctt tcaaaaccag ggcaaggtag aaggcgccag gggtttggct ggaccaggtg agtgctttgc gcacccactg tgtgagcccc agaatggggc accccacacc ctggggggtg tgcccttggc tggcaatgcg ccttctttga tgctgaaggc cccaatgctg gggcgtcgct tttcttctgg ggggcgtggg cagtagcaag cttgtaagtc caacagttcc gaaggagaga tggagtaaca ctagggagac ttggctgcat ctgtgatggt tagctgtatg cttatggtcg tgctttctac tctgagctcc acctggaaca agtgctcagg acagtgaccc acactcgatt catcctggca caaatgagcc ccacctaccc gagtacggca gggcagaaga tggccaacac gcccaaagga caccgcctga tcccgggccc gtaaggaagg ggccagcctt gtctaatttt caccccggcc agctgcttcg ttcaatggag gcctgtccca ctgcttcagg cgggagcaga agggatgaga gcctatattc agactttatt cccatcactc tgaaggctgt atcctctggc cctgctgggc ctagatccag cctcaaatct ggagagcgcc tgaaggacca actgttggcc acggcagcat ctgaaagaga gctgggaaga agggttatca catctgtctt ctccagcagc cccatgctct tcgaggggtg cggagaacgg ggctccccgc catcgactgg ccttcccagg tcatccccct gcctcagtag aaacagctgg aggagtcaca aacgtgcaac catccatggg gaaggctccc cccaggagcc ccgtttgcgc gctggctcgg gcccaggctc gagatggagg ggacccttcc ctaagccctg tgcctacccc tgagaaggtc ctagatcagc caggcctcac gcgctgctgc agtgcccatg tggagtcggc cataaacttg cacagactat ggtcacacgc ccagaggaac caagagcttc gaagggcatg ttaactctgg ccctgaggct ggatttttaa ggggtatagt tgggaacgac gatccacact gcatcctgac cgagggagta ggaacacagg ggccactaat gaaaggaggt ctctttttcc tacaagtaat caaatcccac cccccaaccc aggtgctccc ccagccacca aggctaagag ggttgtgatg cacactgtcc gggaccaggc tgggagctga cggggacaca cacagtcaca tctcttcctg gttgctggct ctctccttgg ctggcgtggc catcgggttt gcaccaatgg cgggttccac cgcagaaggc cgccggtcag ccagcgtgct tcagccccag tgctctgttt tggccttctt tctgaagcca ctgctcccct tcaggccctt tttagtcctt accgcgccta tgctgccggg cgcagggtct agggaaggct aggacctggg tgcctacgag ggcaaatggc cagggacttc accccttccc aggtgggatt cctggactcc agctctgcaa tagaagctgt aggtcacctc aagcccggca ttctatccta agagactgct aaattaagga caagaagagt gaggactccc ctaagagtgc gcaggaagga aaagctttcc aagtccctgt gagcagaact gtatctgtgt atctgttcat tgggagagat cgcttgaaaa ggagagtggg ggtatggaag cacaccgatc aacatttaga cccagtgcaa cactcctgag accaggtcag ggacagcagg gaagactggc gagaagtgac atgctccagg cagggtgcgg gagaaggcac ggtggggcca tggccagatg ctcccacgcc gtgcctgagc agaggagcta cccatcttgg ccctccccca cggcagcagt tgcgagtgtt tgttccctag cctgcaagga gtgccacgct cctcacctgt gcgcccttca agactatgga ggtgtcttgt tcccaactct ggagagaggg ggtgagctgg cctcaggagt tggtgatgcc cttgggggtc gcatgggtgg gctgttccag gtagaaagac acaagcagtg acccctgagt ctcttcggcc ccaaggaagg agggatagca tgcggttcca tccttcctgt ctggccctgg caccagtctg ggggcttgct actacatctt ccgggaatta ctggccagcc cacagctaag ccccaacaca ggggcaggtg tcttttccct agtcccctca gcgagtggtg

3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 gggcggtagc caggcaagct gagcagggct gagttgccat gctagagact gagtagagga ggtggctcgc aggctagcct gtgctgtaga acgatgagtt ggcgctgtct ggctcttcca gagtgaatct gttgcagtgt acagtccctg gcactgtaca gaagccctca gatcccacgg cacatccatg tattcccaac agtgtgtgtc tgcaagaaat gggccttgtc gacagaagcc ttgtcaagac tcttctacgc atttttttca tggagtctat gaatgcagag tgtttatcgg cccattttgg agatgaagtg ccccaaatca cactgctagg aagtatcaga gctggggcta gtcaggctca tcccacagcc tctgctgtcc ctcagtccaa gttccagaac ttcccccaac ttcttggtag cagggggcac ctgctgtacc aggggccccc tctcccctcc tcccaaacct aaaggcaagg gcctgcagcc tgtcaggcag tccactgggc gcatggggca tgctgggagg cacaggatgg gctgcagctt ccctgcacag gctcagtgct acgcatggag agaatgctag tctaatccta gccctgcctt tttcttcaga agtgccctta aagacctctc agctttccca ctgtaacatg gactggctgc ctgagtgccc ag aatcgggaga gggaagcagg catctagctt gaagcttccc tgctttgcaa ctcacaaggt tcataatgct caaagaaata ggccccatgt acttccaggg cctaaacaca ccccttcaag agcaacaatg cgccacgttc ccttagtcag accaagtcac tcatccctcc acccaggcga 6840 agcagaccgc 6900 ctggaagaca 6960 attcccttcc 7020 aggtccttaa 7080 ggtgctgatg 7140 ttgaggtagg 7200 aagtgactag 7260 ctcctgacta 7320 cccttaccat 7380 caggtccccc 7440 atgtggaaac 7500 cctctcagct 7560 tctcccttca 7620 gaggcaggga 7680 tgcccttttt 7740 ctgctcctga 7800 7812 <210> 10 <211> 40 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Thr 1

Pro

Val

Ser

Gin 5

Thr

Ala

Ala 10

Thr

Ala

Ser

Val

Arg 15

Ser

Thr

Lys

Asp

Pro 20

Cys

Pro

Ser

Gin

Pro 25

Pro

Val

Phe

Pro

Ala 30

Ala

Lys

Gin

Cys

Pro

Ala

Leu

Glu

Val

Thr

40

Claims

1. IL-18 väzbový proteín - IL-18BP, vybraný zo skupiny, ktorá pozostáva z:

(a) polypeptidov zahŕňajúcich aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2 alebo 6;

(b) polypeptidov, ako sú definované v (a) bez vedúcej sekvencie;

(c) muteínov majúcich najmenej 80 % homológiu s IL-18BP, ako je definovaný v (a) alebo (b), ich fúzovaných proteinov, chemicky modifikovaných derivátov, kruhovo permutovaných derivátov a zmesí; a viažucich sa na IL-18 a blokujúcich IL-18-indukovanú produkciu IFN-γ.

2. IL-18BP podľa nároku 1, ktorým je nevírusový proteín.

3. IL-18BP podľa nároku 2, ktorým je ľudský proteín.

4. IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, ktorý má molekulovú hmotnosť okolo 40 kD.

5. IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorým je fuzovaný proteín zahŕňajúci imunoglobulín alebo jeho fragment.

6. IL-18BP podľa nároku 5, pričom fúzovaný proteínje vybraný z IL-18BP fuzovaného s konštantnou oblasťou IgG2 ťažkého reťazca.

7. IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, pričom chemicky modifikované deriváty zahŕňajú polyetylénglykolové bočné reťazce.

8. IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, ktorý je v rozpustnej forme.

9. IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, ktorý je glykozlovaný.

10. IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, ktorý je neglykozlovaný.

11. DNA molekula kódujúca IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10.

12. DNA molekula podľa nároku 11, vybavená stop kodónom na svojom 3' konci.

13. DNA molekula zahŕňajúca DNA sekvenciu SEQ ID NO: 1 alebo 5, pričom kóduje IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10.

14. DNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13, operatívne spojená s ďalšími DNA sekvenciami uľahčujúcim expresiu, ako sú promótory alebo enhancery.

15. DNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14, ktrou je genomická DNA.

16. DNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 15, ktorou je cDNA.

17. cDNA molekula podľa nároku 16, zahŕňajúca cDNA sekvenciu vybranú zo skupiny DNA sekvencii SEQ IDNO: 1 a 5.

18. cDNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 17, ktorá je prispôsobená na expresiu v bakteriálnom hostiteľovi.

19. Replikovateľný vektor zahŕňajúci DNA molekulu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 18.

20. Transformovaná hostiteľská bunka zahŕňajúca vektor podľa nároku 19.

21. Transformovaná hostiteľská bunka podľa nároku 20, ktorou je eukaryotická bunka.

22. Transformovaná hostiteľská bunka podľa nároku 21, ktorou je cicavčia bunka.

23. Transformovaná hostiteľská bunka podľa nároku 22, ktorá je vybraná zo skupiny obsahujúcej humánne, opičie, myšacie bunky a vaječnikové bunky čínského škrečka - CHO.

24. Transformovaná hostiteľská bunka podľa nároku 20, ktorou je prokaryotická bunka.

25. Spôsob výroby IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultivovanie hostiteľskej bunky podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 24 v podmienkach vhodných na expresiu IL-18BP.

26. Spôsob výroby IL-18BP podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa izoláciu IL-18BP.

27. Protilátka špecificky reagujúca so sekvenciou uvedenou v SEQ ID NO: 2 alebo 6.

28. Protilátka podľa nároku 27, ktorou je polyklonálna protilátka.

29. Protilátka podľa nároku 27, ktorou je monoklonálna protilátka.

30. Protilátka podľa nároku 29, ktorou chiméma protilátka.

31. Protilátka podľa nároku 30, ktorou je humanizovaná protilátka.

32. Anti-idiotypová protilátka proti protilátke podľa nároku 27.

33. Spôsob izolácie IL-18BP podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa tým, že zahŕňa:

(a) prechod ľudskej telovej tekutiny chromatografickým stĺpcom, na ktorý je viazaný IL-18, (b) elúciu proteínu schopného viazať sa k IL-18, a (c) čistenie uvedeného proteínu.

34. Prostriedok na farmaceutické použitie, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo vírusom kódovaný homológ IL-18BP, ktorý sa viaže na IL-18 a blokuje IĽ-18-indukovanú produkciu IFN-y.

35. Prostriedok na farmaceutické použitie, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa DNA kódujúcu IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo DNA kódujúcu vírusom kódovaný homológ IL-18BP, ktorý sa viaže na IL-18 a blokuje IL-18-indukovanú produkciu IFN-y.

36. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie autoimunitných ochorení.

37. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie diabetu I. typu.

38. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie sepsy.

39. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie odmietnutia štepu.

40. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie reumatoidnej artritídy.

41. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie zápalového ochorenia vnútorností.

42. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie sklerózy multiplex.

43. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie ischemického srdcového ochorenia vrátane infarktu myokardu.

44. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie ischemického poranenia mozgu.

45. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie psoriázy.

46. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie akútnej alebo chronickej hepatitídy.

47. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, alebo jeho vírusom kódovaného homológu, 5 ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie akútnej alebo chronickej pankreatitídy.

48. Použitie IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 na purifikáciu IL-18.

49. Použitie protilátok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 31 v teste na detekciu IL-18BP.

50. Použitie DNA molekuly kódujúcej IL-18BP podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10 alebo jeho víru10 som kódovaného homológu, ako je definovaný v nároku 34, na prípravu farmaceutického prostriedku na génovú terapiu.