CN117279950A - 一种靶向il-18bp的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
提供了一种针对IL‑18BP的抗体或其抗原结合片段，以及抗体或其抗原结合片段的生产方法及应用。具体提供了针对IL‑18BP的鼠源或嵌合单克隆抗体、人源化抗体、编码抗体的核酸分子、相应的表达载体和宿主细胞。针对IL‑18BP的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL‑18P，且具有高亲和力，能够释放体内天然IL‑18，激活IL‑18信号来增强T细胞和NK细胞对肿瘤的杀伤能力，能够用于预防/***、代谢性疾病、免疫***疾病、神经退行性疾病、心血管疾病或炎性疾病等多种疾病。
Description
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种特异性靶向IL-18BP的抗体及其抗原结合片段、其制备方法和应用。
白细胞介素18(IL-18)能够诱导免疫细胞的增殖并增强其活性，尤其是增强T细胞和NK细胞活性，在肿瘤免疫调节中发挥重要作用。IL-18通过作用于细胞膜表面的异源二聚体受体18Rα/Rβ激活下游信号通路，促进免疫细胞的激活和增殖。体内绝大部分IL-18与IL-18BP结合形成复合物，IL-18BP是天然存在的IL-18假受体，以超高亲和力(pM级)结合IL-18并阻断其与细胞表面受体的相互作用，从而起到负调控IL-18信号通路的作用。研究发现IL-18BP蛋白水平在人肿瘤组织的微环境中上调，是一个新的分泌型免疫检查点，抑制了肿瘤微环境中免疫细胞的杀伤能力。在PD-1耐药的非小细胞肺癌中IL-18BP也显著上升，是介导PD-1耐受的一个主要因素。
因此，本领域迫切需要开发IL-18BP的高亲和力抗体，释放体内天然IL-18，激活IL-18信号来增强T细胞和NK细胞对肿瘤的杀伤能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对肿瘤、代谢性疾病、免疫***疾病、神经退行性疾病、心血管疾病或炎性疾病等多种疾病的新型治疗手段。
本发明的又一目的在于提供一种针对IL-18BP的抗体及其制备方法与应用。
在本发明的第一方面，提供了一种针对IL-18BP的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合IL-18BP。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
(a)重链互补决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、3和4所示，
或者分别如SEQ ID NO:10、11和12所示，
或者分别如SEQ ID NO:18、19和20所示，
或者分别如SEQ ID NO:26、27和28所示，
或者分别如SEQ ID NO:33、34和20所示，
或者分别如SEQ ID NO:38、27和28所示，
或者分别如SEQ ID NO:42、43和44所示，
或者分别如SEQ ID NO:50、51和52所示，
或者分别如SEQ ID NO:58、59和60所示；和/或
(b)轻链互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、7和8所示，
或者分别如SEQ ID NO:14、15和16所示，
或者分别如SEQ ID NO:22、23和24所示，
或者分别如SEQ ID NO:30、15和31所示，
或者分别如SEQ ID NO:22、36和24所示，
或者分别如SEQ ID NO:40、15和31所示，
或者分别如SEQ ID NO:46、47和48所示，
或者分别如SEQ ID NO:54、55和56所示，
或者分别如SEQ ID NO:62、63和64所示；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个)氨基酸并能保留与IL-18BP特异性结合能力的衍生序列。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段具有表1中Ab001、Ab002、Ab003、Ab009、人源化Ab009(VH12VL9)、人源化Ab009(VH14VL9)、Ab010、Ab012、Ab017、Ab018或Ab020抗体的6个CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3)。
在另一优选例中，所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留与IL-18BP特异性结合能力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的CDR1、CDR2和CDR3由框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段还包括框架区FR。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO:1、9、17、25、32、37、41、49、57、65或67所示的重链可变区或与之具有至少90％或95％或98％的序列同一性，和具有如SEQ ID NO:5、13、21、29、35、39、45、53、61或66所示的轻链可变区或与之具有至少90％或95％或98％的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO:1、9、17、25、32、37、41、49、57、65或67所示的重链可变区，和具有如SEQ ID NO:5、13、21、29、35、39、45、53、61或66所示的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段有重链互补决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3，和轻链互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如：SEQ ID NO:2、3、4、6、7和8所示，或分别如SEQ ID NO:10、11、12、14、15和16所示，或分别如SEQ ID NO:18、19、20、22、
23和24所示，或分别如SEQ ID NO:26、27、28、30、15、31所示，或分别如SEQ ID NO:33、34、20、22、36、24所示，或分别如SEQ ID NO:38、27、28、40、15、31所示，或分别如SEQ ID NO:42、43、44、46、47、48所示，或分别如SEQ ID NO:50、51、52、54、55、56所示，或分别如SEQ ID NO:58、59、60、62、63、64所示；其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个)氨基酸并能保留与IL-18BP特异性结合能力的衍生序列。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段可包括单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在另一优选例中，所述二价抗体还可以是双特异性抗体。
在另一优选例中，所述多价抗体还可以是多特异性抗体。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段包括鼠源抗体、猴源抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在另一优选例中，所述鼠源抗体源自小鼠。
在另一优选例中，所述猴源抗体源自食蟹猴。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示，或分别如SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:66所示。
在另一优选例中，所述人源化抗体的重链可变区基于SEQ ID NO:25具有选自下组的突变：
Q5V、D8G、L11V、V12K、A16S、I20V、V24S、Y25S、R40A、E42G、L70M、K74T、S76T、Q82E、N84R、N84S、T87R、E89D、S91T，和L112V；
所述人源化抗体的轻链可变区基于SEQ ID NO:29具有选自下组的突变：
Q1E、A9D、I10F、M11Q、A13V、S14T、G16K、M21I、S39P、G40D、T41Q、W46L、T59S、S69D、S71T、S75N、M77L、A99Q，和L105I。
在另一优选例中，所述嵌合抗体的恒定区源自人IgG1的重链恒定区。
在另一优选例中，所述抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、重链抗体、二硫键连接的Fv(dsFv)。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5所示，或者分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13所示，或者分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21所示，或者分别如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29所示，或者分别如SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示，或者分别如SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:66所示，或者分别如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:35所示，或者分别如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:39所示，或者分别如SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:45所示，或者分别如SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:53所示，或者分别如SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:61所示。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3
或IgG4的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区选自人抗体κ链或λ链的恒定区。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人IgG1或IgG4的重链恒定区。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70所示，或分别如SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72所示，或分别如SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74所示，或分别如SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76所示，或分别如SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78所示，或分别如SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80所示，或分别如SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82所示，或分别如SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84所示，或分别如SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86所示，或分别如SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示，或分别如SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示。
在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；和
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括Fc标签、HA标签、GGGS序列、FLAG标签、Myc标签、6His标签，或其组合。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合IL-18BP。
在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体，或多聚体。
在本发明的第三方面，提供一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明第二方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，本发明的核酸可为RNA、DNA或cDNA。
在另一优选例中，所述核苷酸分子包括：如SEQ ID NO:91所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO:92所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO:93所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO:94所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO:95所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO:96所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO:97所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO:98所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO:99所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO:100所示的轻链核苷酸序列；或如SEQ ID NO:101所示的重链核苷酸序列和如SEQ ID NO:102所示的轻链核苷酸序列。
在本发明的第四方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有本发明的第三方面所述的核苷酸分子。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移***、或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺
病毒、AAV病毒、逆转录病毒、或其组合。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：pTomo慢病毒载体、plenti、pLVTH、pLJM1、pHCMV、pLBS.CAG、pHR、pLV等。
在另一优选例中，所述的表达载体中还包括选自下组的：启动子、转录增强元件WPRE、长末端重复序列LTR等。
在本发明的第五方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明的第三方面所述的核苷酸分子。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述宿主细胞为293F细胞或expi-293细胞。
在本发明的第六方面，提供一种嵌合抗原受体CAR，所述CAR的抗原结合区scFv段为特异性结合于IL-18BP的结合区，并且，所述scFv的重链可变区包括：
重链互补决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、3和4所示，或者分别如SEQ ID NO:10、11和12所示，或者分别如SEQ ID NO:18、19和20所示，或者分别如SEQ ID NO:26、27和28所示，或者分别如SEQ ID NO:33、34和20所示，或者分别如SEQ ID NO:38、27和28所示，或者分别如SEQ ID NO:42、43和44所示，或者分别如SEQ ID NO:50、51和52所示，或者分别如SEQ ID NO:58、59和60所示；和/或
所述scFv的轻链可变区包括：
轻链互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、7和8所示，或者分别如SEQ ID NO:14、15和16所示，或者分别如SEQ ID NO:22、23和24所示，或者分别如SEQ ID NO:30、15和31所示，或者分别如SEQ ID NO:22、36和24所示，或者分别如SEQ ID NO:40、15和31所示，或者分别如SEQ ID NO:46、47和48所示，或者分别如SEQ ID NO:54、55和56所示，或者分别如SEQ ID NO:62、63和64所示。
在另一优选例中，所述CAR还包括信号肽。
在另一优选例中，所述CAR还包括其他的外源蛋白。
在另一优选例中，所述的CAR具有式Ia所示结构：
L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (Ia)
式中，
L为无或信号肽序列；
scFv是特异性结合IL-18BP的结构域；
H为无或铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号结构域；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列(包括野生型、或其突变体/修饰体)；
所述“-”连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述L分别选自下组蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD28、CD137，或其突变/修饰体，或其组合。
在另一优选例中，所述scFv靶向IL-18BP。
在另一优选例中，所述scFv为IL-18BP抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述H选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、IgG，或其组合。
在另一优选例中，所述TM选自下组蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、CD278、CD152、CD279、CD233，或其突变/修饰体，或其组合。
在另一优选例中，所述C选自下组蛋白的共刺激结构域：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD-1、Dap10、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、OX40L、2B4、TLR，或其突变/修饰体，或其组合。
在本发明的第七方面，提供一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞表达外源的如本发明的第六方面所述的CAR。
在另一优选例中，所述工程化免疫细胞选自下组：
(i)嵌合抗原受体αβT细胞(CAR-T细胞)；
(ii)嵌合抗原受体γδT细胞(CAR-T细胞)；
(iii)嵌合抗原受体NKT细胞(CAR-NKT细胞)；
(iv)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。
在另一优选例中，所述工程化免疫细胞包括自体或异体的αβT细胞、γδT细胞、NKT细胞、NK细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述工程化免疫细胞为CAR-T细胞。
在本发明的第八方面，提供一种产生针对IL-18BP的抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：
(a)在适合的条件下，培养如本发明的第五方面所述的宿主细胞，从而获得含IL-18BP的抗体或其抗原结合片段的培养物；
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的针对IL-18BP的抗体或其抗原结合片段；和
(c)任选地，对步骤(b)获得的针对IL-18BP的抗体或其抗原结合片段进行纯化和/或修
饰。
在本发明的第九方面，提供一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分包括如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、治疗剂、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
在另一优选例中，所述的(a)部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188，或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177，或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分可含有至少一种治疗剂。
在另一优选例中，所述偶联部分为治疗剂。
在另一优选例中，所述治疗剂为免疫检查位点药物，该免疫检查位点选自：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR。
在另一优选例中，所述治疗剂为PD-1抗体和/或PD-L1抗体。
在另一优选例中，所述免疫检查位点药物为免疫检查位点的抑制剂或激活剂。
在另一优选例中，所述治疗剂为细胞毒性药物。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱，或其组合。
特别有用的细胞毒性药物类的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(Auristatins)、喜树碱(Camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(Duocarmycins)、依托泊甙(Etoposides)、美登木素(Maytansines)和美登素类化合物(Maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(Taxanes)、苯二氮卓类(Benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(Benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(Indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(Oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(Vinca alkaloids)，或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为毒素。
在另一优选例中，所述的毒素选自下组：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(Tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(Mitogellin)、局限曲菌素(Retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(Curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素，或其组合。
在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。
在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的相同或不同的如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)活性成分，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或其组合；和
(ii)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括0.01～99.99％的如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或其组合和0.01～99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在另一优选例中，所述活性成分中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/mL，较佳地1×104-1×107个细胞/mL。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括第二活性成分：PD-1抗体和/或PD-L1抗体。
在另一优选例中，所述药物组合物包括：
(a)第一活性成分，如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；
(b)第二活性成分，PD-1抗体和/或PD-L1抗体；和
(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
其中第一活性成分和第二活性成分的比例为5:1-1:1，优选地3:1。
在另一优选例中，所述药物组合物中活性成分的剂量为5-60mg/kg，优选地10-30mg/kg。
在另一优选例中，所述PD-1抗体的剂量为5-20mg/kg，优选地10mg/kg。
在本发明的第十一方面，提供一种活性成分的用途，所述活性成分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或其组合，所述活性成分被用于制备：
(a)预防和/或治疗疾病或病症的药物；
(b)检测IL-18BP相关疾病的试剂。
在另一优选例中，所示试剂为诊断试剂，较佳地，所述的诊断试剂为检测片或检测板。
在另一优选例中，所述诊断试剂用于：检测样品中的IL-18BP蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段作为第一活性成分与第二活性成分联用；优选地，所述第二活性成分为抗PD-1/PD-L1抗体。
在另一优选例中，所述疾病或病症为IL-18BP高表达的或IL-18通路异常的疾病或病症。
在另一优选例中，所述疾病或病症包括：肿瘤、代谢性疾病、免疫***疾病、神经退行性疾病、心血管疾病或炎性疾病。
在另一优选例中，所述疾病或病症为肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自：肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、***癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、***、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌中的一种或多种。
在本发明的第十二方面，提供了一种体外检测样品中IL-18BP蛋白或其片段的方法，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在IL-18BP蛋白或其片段的对应靶点。
在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。
本发明的第十三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗所述第一容器内容物的二抗；
或者，
所述试剂盒含有一检测板，所述检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或如本发明第十方面所述的药物组合物，或其组合。
在另一优选例中，所述第二容器中的二抗为HRP标记的羊抗人IgGκ。
在另一优选例中，所述试剂盒中还含有一说明书，根据所述的说明书记载，所述的试剂盒用于非侵入性地检测待测对象的IL-18BP的表达。
在另一优选例中，所述的试剂盒用于IL-18BP相关疾病的检测。
在另一优选例中，所述IL-18BP相关疾病为IL-18BP高表达的或IL-18通路异常的疾病或病症。
在本发明的第十四方面，提供了一种预防和/或治疗疾病或病症的方法，所述方法包括：给需要的对象施用如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白，或如本发明第七方面所述的工程化免疫细胞，或如本发明第九方面所述的免疫偶联物，或如本发明第十方面所述的药物组合物，或其组合。
在另一优选例中，所述对象包括哺乳动物，如人。
在另一优选例中，所述疾病或病症为IL-18BP高表达的或IL-18通路异常的疾病或病症。
在另一优选例中，所述疾病或病症包括：肿瘤、代谢性疾病、免疫***疾病、神经退行性疾病、心血管疾病或炎性疾病。
在另一优选例中，所述疾病或病症为肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤选自：肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、***癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、***、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的CAR免疫细胞是来源于所述对象的细胞(自体细胞)。
在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞或药物组合物中所包含的CAR免疫细胞是来源于健康个体的细胞(异体细胞)。
在另一优选例中，所述的方法可与其他治疗方法联合使用。
在另一优选例中，所述的其他治疗方法包括化疗、放疗、靶向治疗等方法。
在另一优选例中，所述的方法与PD-1抗体和/或PD-L1抗体联合使用。
在本发明的第十五方面，提供了一种针对IL-18BP相关疾病的诊断方法，包括步骤：
(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或如本发明第二方面所述的重组蛋白接触；和
(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象为IL-18相关疾病的确诊患者。
在另一优选例中，所述的样品为血液样品或咽拭子样品，或其他组织器官中的样品。
在另一优选例中，所述IL-18BP相关疾病为IL-18BP高表达的或IL-18通路异常的疾病或病症。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
图1显示了人源化抗体Ab009(VH12VL9)与人源化抗体Ab009(VH14VL9)的序列信息。
图2显示了抗IL-18BP抗体能回复IL-18诱导的KG-1细胞IFN-γ释放活性。
图3显示了人源化抗体VH12VL9回复IL-18诱导的KG-1细胞IFN-γ释放活性。
图4显示了抗IL-18BP抗体回复IL-18诱导的人外周血单个核细胞内IFN-γ释放。
图5A显示了SK-OV-3细胞刺激后IL-18BP的分泌，图5B显示了IL-18BP抗体与人肿瘤细胞来源IL-18BP结合活性。
图6显示了不同给药组小鼠肿瘤体积随时间的变化。
图7显示了不同给药组小鼠的体重变化率(％)。
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，首次意外地开发了一类对IL-18BP具有高特异性和高亲和力的抗体及其抗原结合片段，还意外地获得具有优异亲和力和特异性的抗IL-18BP的人源化抗体。本发明的抗体及其抗原结合片段能够阻断IL-18BP与IL-18的结合，释放体内天然IL-18，激活IL-18信号来增强T细胞和NK细胞对肿瘤的杀伤能力。因此，本发明的抗体及其抗原结合片段具有用于预防和/或***、炎症相关疾病和代谢相关疾病等多种疾病的潜力。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“任选地”意为随后描述的事件或情况能或不能发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及所述事件或情况没有发生的实例。
如本文所用，术语“本发明抗体”、“本发明的抗体”、“本发明的针对IL-18BP的抗体”、“针对IL-18BP的抗体”、“IL-18BP的抗体”、“IL-18BP抗体”具有相同的含义，可互换使用，均指特异性识别和结合于IL-18BP蛋白(包括人IL-18BP蛋白)的抗体。
优选地，本发明的抗体编号以及对应的序列编号如下表1所示。
表1
注：表中各个数值表示序列编号，即“1”表示“SEQ ID NO:1”，表中显示的VH、CDRH1、CDRH2、CDRH3、VL、CDRL1、CDRL2、CDRL3的序列编号为其氨基酸序列的编号。
优选地，本发明的抗体编号与对应的VH区与VL区、HC与LC的序列及编号如下表2所示。
表2
优选地，本发明的抗体编号与对应的CDR序列及编号如下表3所示。
表3
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)
或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫***细胞(例如，效应细胞)和传统补体***的第一组分(C1q)。
本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或抗原结合部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，IL-18BP蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。本发明公开的抗体、抗原结合片段或其衍生物包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、全人源、人源化、灵长目化或嵌合抗体、单链抗体、抗原结合片段。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子)(称为单链Fc(scFv))。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球
蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(Complementarity determining region,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDRH1、CDRH2、和CDRH3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链可变区包括三个互补决定区CDRL1、CDRL2、和CDRL3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、***或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合IL-18BP蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取
代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、猴源的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
本发明抗体指具有IL-18BP蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表4进行氨基酸替换而产生。
表4
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
优选地，编码本发明抗体的核苷酸序列如下：
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔
的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域，与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。所述的“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。
如本文所用，“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：治疗剂、毒素、细胞因子(Cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的针对IL18BP的抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒素；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))等。
在另一优选例中，所述治疗剂为免疫检查位点药物，所述免疫检查位点药物为免疫检
查位点的抑制剂或激活剂，该免疫检查位点选自：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFR。优选地，所述免疫检查位点为PD-1和/或PD-L1，所述治疗剂为PD-1抗体和/或PD-L1抗体。
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括抗IL-18BP的抗体与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本发明的任何一种抗人IL-18BP抗体及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如，“任选地，对步骤(b)获得的针对IL-18BP的抗体或其抗原结合片段进行纯化和/或修饰”是指“对步骤(b)获得的针对IL-18BP的抗体或其抗原结合片段进行纯化和/或修饰”此步骤可以有但不是必须有。
IL-18与IL-18BP
白介素-18(IL18，也称为干扰素-γ诱导因子)是一种被称为细胞因子的免疫***兵工厂的一部分，其在人中由IL-18基因编码。该基因编码的蛋白质是促炎细胞因子。造血细胞和非造血细胞等许多细胞类型都有产生IL-18的潜力。
近年来的研究显示：IL-18主要通过提升效应T细胞和NK细胞的活性，增加抗肿瘤效应分子的表达，从而抑制肿瘤的生长。研究者分析肿瘤浸润CD8+T细胞的细胞因子及相关受体的转录组水平表达特征发现，IL-18和其受体的两个亚单位(IL-18Rα/Rβ)在活化的和失调的肿瘤浸润CD8+T细胞中均有富集，这提示对IL-18的激动能够有效激活抗肿瘤免疫应答。
在许多类型的癌症中，存在一种叫做白介素-18结合蛋白(IL-18 Binding Protein,IL-18BP)的高水平蛋白质，它充当“诱饵受体”，阻止IL-18与免疫***细胞上的受体结合并激活免疫反应的能力。研究发现，患者在使用重组IL-18治疗后，IL-18能被IL-18BP中和，在给予IL-18治疗后，患者血清中的IL-18BP浓度增加10-100倍。这是一种分泌型的强拮抗剂，与IL-18的结合具有极强的亲和力，亲和常数KD＜1nM。因此，肿瘤微环境中的IL-18BP可能扮演了分泌型免疫检查点的角色，限制了IL-18的免疫治疗效应。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重至约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重至约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
优选地，所述药物组合物还包括第二活性成分——PD-1/PD-L1抗体，作为第一活性成分的本发明的抗体或其抗原结合片段与所述第二活性成分的比例为5:1-1:1，优选地3:1。
典型地，所述药物组合物中第一活性成分的剂量为5-60mg/kg，优选地10-30mg/kg；所述PD-1抗体的剂量为5-20mg/kg，优选地10mg/kg。
针对IL-18BP的抗体
在本发明中，所述针对IL-18BP的抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。
在本发明的一个优选例中，所述针对IL-18BP的抗体包括一条或多条具有如SEQ ID NO:1、9、17、25、32、37、41、49、57、65或67所示的重链可变区或与之具有至少90％或95％或98％的序列同一性的重链，和具有如SEQ ID NO:5、13、21、29、35、39、45、53、61或66所示的轻链可变区或与之具有至少90％或95％或98％的序列同一性的轻链。
标记的抗体
在本发明的一个优选例中，所述抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，
针对IL-18BP蛋白的抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的抗体。
本发明的针对IL-18BP的抗体能够有效结合IL-18BP蛋白。
抗体的制备
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本发明的IL-18BP抗体。例如，可以用连接或天然存在的IL-18BP蛋白或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
本发明的单克隆抗体可以通过多种技术进行制备，例如杂交瘤技术(参见，例如Kohler等人.Nature,256:495,1975)，重组DNA技术(参见，例如美国专利申请4,816,567)，或噬菌体抗体库技术(参见，例如Clackson等.Nature352：624-628,1991，或Marks等.J.Mol.Biol.222：581-597,1991)。
例如，可以如下来制备单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。动物在接受免疫后，体内将产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂，如PEG，使其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，生长杂交瘤细胞的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法包括例如，免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，可利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)描述的Scatchard分析法来测定单抗的亲和力。当确定了杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子***表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。
抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白A或蛋白G的亲和层析进行纯化。随后或作为替代，可将特异性抗原(该抗体识别的靶分子)或其抗原表位固定在柱上，并通过免疫亲合层析法来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化可参考例如D.Wilkinson(The Scientist,published by The Scientist,Inc.,Philadelphia Pa.,Vol.14,No.8(Apr.17,2000),
pp.25-28)。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指，这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力、增强免疫应答的能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。
人源化抗体既能够保留非人源供体抗体(例如鼠源抗体)的预期性质，又能够有效降低非人源供体抗体(例如鼠源抗体)在人受试者中的免疫原性，因此，是特别有利的。然而，由于供体抗体的CDR与受体抗体的FR之间的匹配问题，人源化抗体的预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)通常低于非人源供体抗体(例如鼠源抗体)。
因此，尽管本领域的研究人员已对抗体的人源化展开了深入的研究，并取得了一些进展(参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；and Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000))，但是，如何对某一供体抗体进行充分的人源化，以使得所产生的人源化抗体既具有尽可能高的人源化程度，又能够尽可能地保留供体抗体的预期性质，现有技术并没有提供详尽的指导。技术人员需要针对具体供体抗体进行摸索、探究和改造，付出大量的创造性劳动才有可能获得，既具有高人源化程度(例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的人源化程度)、又保留具体供体抗体的预期性质的人源化抗体。
在本发明中，为了使人源化抗体尽可能保留供体抗体的性质(包括例如，抗原特异性、亲和性、反应性、提高免疫细胞活性的能力和/或增强免疫应答的能力)，本发明的人源化抗体中构架区(FR)可以既包含人源受体抗体的氨基酸残基，也包含相应的非人源供体抗体的氨基酸残基。
在本申请中，本发明抗体的性质包括：(1)特异性识别/结合IL-18BP(特别是人IL-18BP)；(2)抑制和/或阻断IL-18BP与IL-18的结合。本发明的人源化抗体保留了亲本抗体(鼠源抗体或鼠-人嵌合抗体)的上述性质中的一项或多项。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。
为制备嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连接至人免疫球蛋白恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。例如，将编码VH的DNA可操作的连接至编码重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因，或将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人重链恒定区基因和轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)，包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1(例如uniprot ID P01857)、IgG2(例如uniprot ID P01859)、IgG3(例如uniprot ID P01860)、IgG4(例如uniprot ID P01861)、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是通常优选为IgG1或IgG4恒定区。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但通常优选为κ恒定区。
为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区***人源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539；Queen等人的美国专利Nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370；以及Lo,Benny,K.C.,editor,in Antibody Engineering:Methods and Protocols,volume 248,Humana Press,New Jersey,2004)。或者，还可以利用转基因动物，其能够在免疫后不产生内源性免疫球蛋白、并且能够产生完整人抗体库(参见例如，Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551；Jakobovits等，1993，Nature 362：255-258；Bruggermann等，1993，Year in Immunology 7：33；和Duchosal等，1992，Nature 355：258；Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859；WO02/43478)。其他抗体人源化改造的方法还包括噬菌体展示技术(Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.227：381；Marks等，J.Mol.Biol.1991，222：581-597；Vaughan等，1996，Nature Biotech 14：309)。
如本文中所使用的，术语“人源化程度”是用于评价人源化抗体中非人源氨基酸残基的数量的指标。人源化抗体的人源化程度例如可通过IMGT网站DomainGapAlign来预测可变区序列与人V结构域的同源性。
任何合适形式的IL-18BP都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对IL-18BP特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、杆状病毒载体、质粒和非病毒载体。
检测方法
本发明还涉及检测IL-18BP蛋白或其片段的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中IL-18BP蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测IL-18BP蛋白水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别IL-18BP蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与IL-18相关疾病的治疗，兼顾IL-18相关疾病的诊断、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对IL-18BP蛋白的临床预防和治疗。
本发明也提供了刺激靶向哺乳动物肿瘤细胞群或组织的T细胞所介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式使移植物抗宿主反应的发生概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续控制肿瘤的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳定的体内扩增并可持续数月至数年的时间。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中，CAR-T细胞可诱导对CAR抗原结合结构域所识别的抗原的高表达肿瘤细胞的特异性免疫应答。例如，本发明的CAR-T细胞引起针对IL-18BP高表达的肿瘤细胞的特异性免疫应答。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于：胃癌、肺癌、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、淋巴瘤等。
通常地，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防肿瘤等疾病。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括给予给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-T细胞。
本发明的CAR-T细胞可被单独给予或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结
合。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度等因素确定，或可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至107个细胞/kg体重的剂量(包括范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可由医学领域技术人员通过监测患者的疾病迹象容易地确定，并以此调整治疗。
对象组合物的给予可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉内注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，***或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×105个至1×1010个本发明经修饰的T细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本领域技术人员知晓，以上应用可与其他治疗方法联合使用，例如与PD-1/PD-L1抗体联用。
本发明的主要优点包括：
1.本发明的抗体为具有高亲和力、高特异性、高效价的单克隆抗体，亲和力可达pM级别。
2.本发明的抗体及其抗原结合片段不仅能够特异性识别/结合IL-18BP，而且能够阻断IL-18BP与IL-18的结合。因此，本发明的抗体及其抗原结合片段具有用于预防和/或***、炎症相关疾病和代谢相关疾病等多种疾病的潜力。
3.本发明的IL-18BP的抗体或其抗原结合片段能回复IL-18诱导的IFN-γ释放活性。
4.本发明的IL-18BP的抗体或其抗原结合片段具有较好的人肿瘤细胞分泌IL-18BP结合活性。
5.本发明的人源化抗体，可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。因此，本发明的抗体具有重大的临床价值。
6.本发明的IL-18BP的抗体或其抗原结合片段能够释放体内天然IL-18，激活IL-18信号来增强T细胞和NK细胞对肿瘤的杀伤能力。
7.本发明的抗体及其抗原结合片段可与PD-1抗体/PD-L1抗体联用，增强对肿瘤的抑制作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1.抗IL-18BP高亲和力抗体的制备
将纯化的人IL-18BP重组蛋白(抗原序列Human IL-18BP(NP_001034748)：TPVSQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPEVEVPLNGTLSLSCVACSRFPNFSILYWLGNGSFIEHLPGRLWEGSTSRERGSTGTQLCKALVLEQLTPALHSTNFSCVLVDPEQVVQRHVVLAQLWAGLRATLPPTQEALPSSHSSPQQQG，SEQ ID NO:68)与等体积完全弗氏佐剂混合，免疫8-10周龄的SJL雌鼠。
以后按间隔2周、3周、3周各加强免疫一次，共免疫4次后，ELISA检测小鼠的血清效价达到1:105时，将上述免疫后小鼠眼眶采血后脱颈处死，以75％酒精腹部消毒，手术取出脾脏和***，去除多余***。
收集脾脏和***制备细胞悬液，收集单个淋巴细胞悬液备用。在细胞融合前一天，制备小鼠腹腔巨噬细胞，作为饲养细胞，放入细胞培养箱，37℃，5％CO2条件下培养。复苏Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞，保证融合时细胞处于对数生长期。将SP2/0细胞用不完全RPMI-1640培养基洗涤2次后重悬与不完全RPMI-1640培养基重悬中备用。
将上述淋巴细胞悬液和Sp2/0-Ag14细胞，使用50％PEG4000(pH＝8.0-8.2)及电转
诱导融合。融合细胞在HAT培养液培养1-2周，吸取上清液，使用ELISA法检测上清中抗体结合活性。
采用有限稀释方法进行亚克隆化，多次筛选后得到阳性杂交瘤细胞株。提取阳性克隆杂交瘤总RNA，利用3’RACE技术与5’RACE技术，RT-PCR得到包含可变区序列的cDNA，将其中的VH与VL基因克隆到T载体中测序，对序列进行比对分析，确定可变区的基因序列。
将可变区序列和人IgG1/IgG4恒定区组合，构建嵌合抗体表达载体。将上述表达载体转染到293F细胞中，纯化得到大量嵌合抗体。将上述得到嵌合抗体命名为Ab001，Ab002，Ab003，Ab009，Ab010，Ab012，Ab017，Ab018和Ab020。
实施例2.抗IL-18BP抗体的人源化改造
抗体Ab009的人源化使用CDR移植和回复突变。应用CDRs编号规则定义FRs和CDRs区域。根据抗体序列数据库，分别对Ab009序列的VL和VH进行IGBLAST检索。
根据检索结果，选择IGHV1-18*01作为VH的模板，IGKV6-21*01作为VL的模板。将抗体的CDRs分别移植到VH和VL模板，进行同源建模。针对三维结构、免疫原性、理化性质等因素，将少数残基突变回小鼠来源的残基，并对序列进一步优化。
人源化抗体Ab009(VH12VL9)与人源化抗体Ab009(VH14VL9)的序列信息如图1所示。其中，下划线代表CDR区，双下划线并加粗代表基于IGHV1-18*01(VH模板)或IGKV6-21*01(VL模板)的突变位点，波浪线并加粗代表基于Ab009的突变位点。
人源化抗体Ab009(VH12VL9)序列的VH区基于IGHV1-18*01模板在第37位突变为M，第38位突变为K，第48位突变为I，第67位突变为K，第68位突变为A，第72位突变为A，第95位突变为F。
人源化抗体Ab009(VH12VL9)序列的VL区基于IGKV6-21*01模板在第45位突变为R，第48位突变为Y，第70位突变为Y。
人源化抗体Ab009(VH14VL9)序列的VH区基于IGHV1-18*01模板在第24位突变为V，第37位突变为M，第38位突变为K，第48位突变为I，第67位突变为K，第68位突变为A，第70位突变为L，第95位突变为F。
人源化抗体Ab009(VH14VL9)序列的VL区基于IGKV6-21*01模板在第45位突变为R，第48位突变为Y，第70位突变为Y。
人源化抗体Ab009(VH12VL9)序列的VH区基于Ab009的VH区(SEQ ID NO:25)具有以下突变：
Q5V、D8G、L11V、V12K、I20V、V24S、Y25S、R40A、E42G、L70M、K74T、S76T、Q82E、N84R、T87R、E89D、S91T，和L112V。
人源化抗体Ab009(VH12VL9)序列的VL区基于Ab009的VL区(SEQ ID NO:29)具有以下突变：
Q1E、A9D、I10F、M11Q、A13V、S14T、G16K、M21I、S39P、G40D、T41Q、W46L、T59S、S69D、S71T、S75N、M77L、A99Q，和L105I。
人源化抗体Ab009(VH14VL9)序列的VH区基于Ab009的VH区(SEQ ID NO:25)具有以下突变：
Q5V、D8G、L11V、V12K、A16S、I20V、Y25S、R40A、E42G、S76T、Q82E、N84S、T87R、S91T，和L112V。
人源化抗体Ab009(VH14VL9)序列的VL区基于Ab009的VL区(SEQ ID NO:29)具有以下突变：
Q1E、A9D、I10F、M11Q、A13V、S14T、G16K、M21I、S39P、G40D、T41Q、W46L、T59S、S69D、S71T、S75N、M77L、A99Q，和L105I。
将以上设计的人源化改造分子构建至IgG1/IgG4恒定区，转染至expi-293细胞中表达纯化人源化抗体分子。
使用Biacore 8K检测人源化抗体的亲和力，结合时间120秒，解离时间360秒，再生缓冲液为10mM甘氨酸-HCl pH 1.5。
如表5的结果显示，Ab009人源化抗体亲和力与鼠源分子保持一致。
表5 Ab009人源化改造抗体结合动力学(SPR)
实施例3.抗IL-18BP抗体的亲和力评价
使用稀释液制备1μg/mL的人IL-18BP蛋白，小鼠IL-18BP蛋白和食蟹猴IL-18BP蛋白，分别包被96孔ELISA板，4℃过夜。
将IL-18BP抗体由100nM起始，3倍梯度稀释11个浓度，与包被的人IL-18BP蛋白，小鼠IL-18BP蛋白和食蟹猴IL-18BP蛋白反应。用HRP标记的羊抗人IgGκ作为二抗后显色。以OD 450nm对抗体的浓度作图，计算EC50。
如表6所示，总结了这10个抗体与不同种属的IL-18BP蛋白的结合活性。IL-18BP抗体对人IL-18BP显示出极好的亲和力，其中Ab002，Ab003，Ab009，Ab010，Ab012，Ab017，Ab018和Ab020亲和力均在pM级别。
表6 IL-18BP抗体亲和力测试
实施例4.抗IL-18BP抗体能回复IL-18诱导的KG-1细胞IFN-γ释放活性
将3×105KG-1细胞(ATCC,#CCL-246)接种到96孔板的每个孔中。将实施例1中制备的抗体的系列稀释液添加到孔中。30分钟后，加入0.01μg/mL的人IL-18BP，再过30分钟后，使用10ng/mL IL-18，20ng/mL TNFα刺激KG-1细胞。
24小时孵育后，通过离心将细胞沉淀，并根据制造商的说明书，使用ELISA试剂盒(R&D Systems,#VAL104C)从上清中测量IFN-γ的产生量。
代表性实验结果如图2所示，Ab002、Ab003、Ab009、Ab010、Ab012和Ab017，均可回复IL-18BP抑制的KG-1细胞内IFN-γ释放，两次实验的平均EC50如表7所示。
表7抗IL-18BP抗体回复IL-18诱导IFN-γ释放的EC50
另外，如图3所示，KG-1功能试验显示人源化抗体也具有较强的活性(EC50＝12.15nM)。
实施例5.抗IL-18BP抗体回复IL-18诱导的人外周血单个核细胞内IFN-γ释放活性
人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)(TPCS,#PB025C-W)以1×105个细胞/孔的浓度接种在96孔板中。分别将小鼠来源的、IgG1亚型的和IgG4亚型的mAb003和mAb009抗体的系列稀释液添加到孔中。
30分钟后，加入0.01μg/mL的人IL-18BP，再过30分钟后，使用50ng/mL IL-18，5ng/mL IL-12刺激PBMC细胞。
孵育48小时后，根据制造商的说明书，使用ELISA试剂盒(R&D Systems,#VAL104C)从上清中测量IFN-γ的产生量。
结果如图4所示，IL-18BP抗体均可回复IL-18诱导的PBMC细胞内IFN-γ释放。
实施例6.抗IL-18BP抗体与人肿瘤细胞来源IL-18BP结合活性
人卵巢癌细胞系在IFN-g刺激下可分泌大量IL-18BP，将5×106的SK-OV-3细胞接种到10cm培养皿中，使用50ng/mL的人IFN-g刺激细胞，24小时后收集上清得到包含IL-18BP的条件培养液，使用人IL-18BPa ELISA检测试剂盒定量其中的IL-BPa的浓度。
使用稀释液制备1μg/mL的IL-18BP抗体，分别包被96孔ELISA板，4℃过夜。将包含IL-18BP的条件培养液稀释至1200pg/mL、400pg/mL和133.3pg/mL，与包被的抗IL-18BP抗体反应。用HRP标记的抗人IL-18BP抗体显色，以OD 450nm对抗体的浓度作图。
如图5的结果显示，Ab002、Ab012、Ab018、Ab009等具有较好的人肿瘤细胞分泌IL-18BP结合活性。
实施例7.通过体内药效测试PD-1抗体和IL-18BP抗体的抑瘤效果及联合给药对肿瘤抑
制的效果
细胞来源：ATCC
PD-1抗体：BioXcell BE0146 Cat#:BP0146,Clone:RMP1-14
动物：BALB/c鼠，6-8周，雌性，购自维通利华实验动物技术有限公司。
荷瘤鼠分别进行量瘤、分组、给药，具体步骤如下：
a)根据肿瘤生长情况，在接种后7-9天量瘤，并计算肿瘤大小，肿瘤体积计算按照如下公式：肿瘤体积(mm3)＝长(mm)×宽(mm)×宽(mm)/2。
b)根据荷瘤鼠体重和肿瘤大小，采用随机分组的方式进行分组。
c)根据分组结果，开始给予测试药物，具体给药信息见表8。
d)开始给予测试药物后每周三次量瘤、称重。
e)实验结束后安乐死动物。
f)用excel等软件处理数据。测试化合物抑瘤率TGI(％)的计算按照如下公式：TGI％＝[1-(处理组评估日瘤体积-处理组分组瘤体积)/(对照组评估日瘤体积-对照
组分组瘤体积)]×100。
g)实验数据见表8，实验过程中肿瘤体积和体重变化率见图6和图7。
表8不同剂量Ab002联合PD-1抗体的肿瘤抑制率(％)和体重变化率(％)
h)实验结果
从上述结果中可以看出，使用不同剂量(其中包括与PD-1单药同等的剂量)Ab002给药，对肿瘤的抑制效果均优于PD-1单药；本发明Ab002抗体联合PD-1抗体治疗后，对肿瘤的抑制效果也明显优于PD-1单药，这说明联合给药增强了肿瘤抑制作用。此外，不管是单药还是联合给药，动物体重保持增长，说明Ab002同时表现出良好的安全性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (17)
- 一种针对IL-18BP的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：(a)重链互补决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、3和4所示，或者分别如SEQ ID NO:10、11和12所示，或者分别如SEQ ID NO:18、19和20所示，或者分别如SEQ ID NO:26、27和28所示，或者分别如SEQ ID NO:33、34和20所示，或者分别如SEQ ID NO:38、27和28所示，或者分别如SEQ ID NO:42、43和44所示，或者分别如SEQ ID NO:50、51和52所示，或者分别如SEQ ID NO:58、59和60所示；和/或(b)轻链互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:6、7和8所示，或者分别如SEQ ID NO:14、15和16所示，或者分别如SEQ ID NO:22、23和24所示，或者分别如SEQ ID NO:30、15和31所示，或者分别如SEQ ID NO:22、36和24所示，或者分别如SEQ ID NO:40、15和31所示，或者分别如SEQ ID NO:46、47和48所示，或者分别如SEQ ID NO:54、55和56所示，或者分别如SEQ ID NO:62、63和64所示；
- 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO:1、9、17、25、32、37、41、49、57、65或67所示的重链可变区或与之具有至少90％或95％或98％的序列同一性，和具有如SEQ ID NO:5、13、21、29、35、39、45、53、61或66所示的轻链可变区或与之具有至少90％或95％或98％的序列同一性。
- 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段有重链互补决定区CDRH1、CDRH2、CDRH3，和轻链互补决定区CDRL1、CDRL2、CDRL3，所述CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别如：SEQ ID NO:2、3、4、6、7和8所示，或分别如SEQ ID NO:10、11、12、14、15和16所示，或分别如SEQ ID NO:18、19、20、22、23和24所示，或分别如SEQ ID NO:26、27、28、30、15、31所示，或分别如SEQ ID NO:33、34、20、22、36、24所示，或分别如SEQ ID NO:38、27、28、40、15、31所示，或分别如SEQ ID NO:42、43、44、46、47、48所 示，或分别如SEQ ID NO:50、51、52、54、55、56所示，或分别如SEQ ID NO:58、59、60、62、63、64所示。
- 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5所示，或者分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13所示，或者分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21所示，或者分别如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29所示，或者分别如SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示，或者分别如SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:66所示，或者分别如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:35所示，或者分别如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:39所示，或者分别如SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:45所示，或者分别如SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:53所示，或者分别如SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:61所示。
- 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区基于SEQ ID NO:25具有选自下组的突变：Q5V、D8G、L11V、V12K、I20V、V24S、Y25S、R40A、E42G、L70M、K74T、S76T、Q82E、N84R、T87R、E89D、S91T，和L112V；并且所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区基于SEQ ID NO:29具有选自下组的突变：Q1E、A9D、I10F、M11Q、A13V、S14T、G16K、M21I、S39P、G40D、T41Q、W46L、T59S、S69D、S71T、S75N、M77L、A99Q，和L105I；或所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区基于SEQ ID NO:25具有选自下组的突变：Q5V、D8G、L11V、V12K、A16S、I20V、Y25S、R40A、E42G、S76T、Q82E、N84S、T87R、S91T，和L112V；并且所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区基于SEQ ID NO:29具有选自下组的突变：Q1E、A9D、I10F、M11Q、A13V、S14T、G16K、M21I、S39P、G40D、T41Q、W46L、T59S、S69D、S71T、S75N、M77L、A99Q，和L105I。
- 如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示，或分别如SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:66所示；并且所述抗体或其抗原结合片段为人源化抗体。
- 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70所示，或分别如SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72所示，或分别如SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74所示，或分别如SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76所示，或分别如SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78所示，或分别如SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80所示，或分别如SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82 所示，或分别如SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84所示，或分别如SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86所示，或分别如SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示，或分别如SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示。
- 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
- 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区，优选为IgG1或IgG4。
- 一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
- 一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求10所述的核苷酸分子。
- 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求11所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求10所述的核苷酸分子。
- 权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防IL-18BP高表达或IL-18通路异常引起的疾病或病症的药物中的用途。
- 如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合片段作为第一活性成分与第二活性成分联用；优选地，所述第二活性成分为抗PD-1/PD-L1抗体。
- 如权利要求13所述的用途，其特征在于，IL-18BP高表达或IL-18通路异常引起的疾病或病症包括：肿瘤、代谢性疾病、免疫***疾病、神经退行性疾病、心血管疾病或炎性疾病；优选地，所述疾病或病症为肿瘤；优选地，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。
- 如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自：肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、卵巢癌、***癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、鼻咽癌、脑肿瘤、***、血癌、骨癌、淋巴癌、胰脏癌中的一种或多种。
- 一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：(a)第一活性成分，所述第一活性成分为如权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；(b)任选地第二活性成分，所述第二活性成分为PD-1抗体和/或PD-L1抗体；和(c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；其中，当所述药物组合物包括第二活性成分时，所述第一活性成分与所述第二活性成分的比例为5:1-1:1，优选为3:1。
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