MXPA03006315A

MXPA03006315A - Dispositivo que se puede implantar y que contiene un material matriz que se puede reabsorber y medicamentos antiproliferativos para prevenir o tratar fallas de acceso vascular por hemodialisis y de otros injertos vasculares.

Info

Publication number: MXPA03006315A
Application number: MXPA03006315A
Authority: MX
Inventors: V Nikolaychik Victor
Original assignee: Vascular Therapies Llc
Priority date: 2001-01-16
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2004-12-03
Also published as: US20190201383A1; AU2002249958B2; DK2314293T3; PT2314293T; US20150209334A1; JP4584537B2; EP2314293A1; US20030113359A1; CA2434972C; EP1351681A2; ES2621652T3; US8858982B2; RU2345719C2; WO2002062335A2; WO2002062335A3; DE60237671D1; RU2003125357A; US10272073B2; CA2434972A1; CY1119109T1

Abstract

Se describe un implante terapeutico, el aparato y metodos utiles para prevenir, suprimir (inhibir) o tratar fallas del acceso vascular por hemodialisis y otros injertos vasculares desde el exterior de la luz vascular o del injerto y a traves de la pared vascular (extravascular o perivascular). El dispositivo que puede ser implantado contiene un material matriz que se puede reabsorber (por ejemplo colageno, fibrina, quitosana) y compuesto (s) antiproliferativo (s), por ejemplo rapamicina, paclitaxel, tacrolimo, etc., y otros inhibidores del ciclo celular o compuestos que funcionen del mismo modo.

Description

DISPOSITIVO QUE SE PUEDE IMPLANTAR Y QUE CONTIENE UN MATERIAL MATRIZ QUE SE PUEDE REABSORBER Y MEDICAMENTOS ANTI ROLIFERATIVOS PARA PREVENIR O TRATAR FALLAS DE ACCESO VASCULAR PARA HEMODIALISIS Y DE OTROS INJERTOS VASCULARES REFERENCIA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS No aplica DECLARACIÓN RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADA POR EL GOBIERNO FEDERAL No aplica ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La falla del acceso vascular para hemodiálisis y de otros injertos vasculares se hace evidente como un compromiso de la luz del vaso (vena o arteria) natural o del conducto protésico en o lejos del sitio anastomótico. El compromiso de la luz se manifiesta como estenosis u oclusión y es resultado de trom ointraluminal y/o una respuesta vasculoproliferativa . La causa de fallas de injerto puede estar relacionada con una variedad de estímulos físicos (por ejemplo esfuerzo cortante causante de trastornos hemodinámicos) , químicos y/o biológicos, así como infección y rechazo de cuerpos extraños que pueden explicar porque las fístulas que no incluyen un cuerpo extraño (en este caso, por ejemplo, politetrafluoroetileno, PTFE) permanecen permeables durante mayor tiempo en comparación con los injertos para acceso vascular que incluyen la interposición de un injerto de PTFE.

La presente invención se refiere, en general, a los implantes terapéuticos, al aparato y métodos útiles para prevenir, suprimir (inhibir) o tratar fallas del acceso vascular para hemodiálisis y de otros injertos vasculares .

Los injertos para acceso vascular, específicamente, los injertos de accesos para hemodiálisis son bien conocidos en la técnica. Aproximadamente 100,000 procedimientos de acceso vascular se realizan cada año en Estados Unidos. El acceso vascular para hemodiálisis se puede realizar en una de varias formas: como una fístula arteriovenosa (por ejemplo, Precisa-Cimino) , o como injerto, interponiendo tejido protésico (por ejemplo PTFE) o biológico (por ejemplo vena) entre la arteria y la vena. Estos injertos por lo regular se construyen utilizando un segmento tubular o cilindrico de material biocompatible, substancialmente inerte como puede ser politetrafluoroetileno (PTFE) . De hecho, el PTFE es el material que se utiliza con mayor frecuencia en accesos protésicos para diálisis. En un enfoque, un segmento de PTFE se interpone a través de cirugía entre una arteria y una vena en el brazo, antebrazo o el muslo. Luego el injerto se hace disponible para acceso vascular repetido para realizar hemodiálisis .

Después de la colocación del injerto para el acceso los sitios suturados en la arteria y la vena se curan. Sesenta por ciento de estos injertos fallan cada año, por lo regular debido al estrechamiento (estenosis) en el extremo venoso. Lesiones semejantes se desarrollan en los injertos de PTFE colocados en la circulación arterial, donde hay una tendencia semejante de que el extremo distante del injerto sea afectado. La disfunción o falla de los injertos venosos y/o otros conductos injertados que se utilizan en la cirugía de injerto de derivación de la arteria coronaria o en cirugía vascular periférica (por ejemplo aorta-iliaca, femoral-femoral, femoral-poplítea, femoral-tibia, etc.) son bien conocidas. La aparición de estenosis del injerto del acceso arterial no es tan rápida como el desarrollo de estenosis de injerto de acceso en el extremo venoso. La proliferación y migración de las células del músculo liso que dan origen a hiperplasia intimal en la vena y el orificio del injerto adyacente se ha descrito en estenosis del acceso para- diálisis en humanos. Cuando la estenosis en el injerto se hace cada vez más grave, el injerto se vuelve disfuncional y es subóptima la hemodiálisis . Si no se trata la estenosis en el injerto, finalmente conduce a oclusión y falla del injerto.

Son multifactoriales las razones por las que los extremos venosos del injerto para el acceso tienen tal propensión notable para el estrechamiento. Las características únicas para esta ubicación incluyen la exposición a presiones arteriales y tasas de flujo arterial, disipación de la energía acústica (vibración) en la pared del vaso y el tejido adyacente, punción repetida del injerto e infusión de sangre procesada. Además, el extremo venoso del injerto puede estar bañado de mitógenos liberados durante el paso de la sangre a través de la tubuladura para diálisis o durante la activación de las plaquetas en el sitio de la punción de la aguja.

Las muestras de tejido recolectadas desde el sitio de la anastomosis injerto-vena de injertos PTFE estenósicos durante la revisión quirúrgica mostraron estrechamiento importante de la luz y fueron caracterizadas por: (i) la presencia de células del músculo liso, (ii) acumulación de la matriz extracelular, (iii) angiogénesis dentro de la neointima y la adventicia, y (iv) la presencia de una capa de células de macrofagos activos revistiendo el material injertado de PTFE. Una gran variedad de citocinas y factores estimuladores del crecimiento celular tipo factor del crecimiento proveniente de plaquetas (PDGF) , el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y el factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF) fueron expresados por las células del músculo liso/miofibroblastos dentro de la neointima venosa, por macrofagos revistiendo ambos sitios del injerto PTFE, y por los vasos de la neointima y la adventicia. Se ha sugerido que los macrofagos, citocinas especificas (bFGF, PDGF y VEGF) , y la angiogénesis dentro de la neointima y la adventicia probablemente contribuyen a la patogénesis de la hiperplasia neointimal venosa (V H) una manifestación de la respuesta vasculoproliferativa en injertos para diálisis de PTFE.

La supervivencia de pacientes con insuficiencia renal crónica depende del funcionamiento regular óptimo de la diálisis. Si esto no es posible (por ejemplo como resultado de la disfunción o falla del acceso vascular) , esto conduce al rápido deterioro clínico y, a menos que se remedie la situación, estos pacientes morirán. La disfunción del acceso vascular es la causa más importante de morbilidad y hospitalización en la población de hemodiálisis en Estados Unidos con un costo calculado de aproximadamente 1000 millones de dólares estadounidenses por año. La hiperplasia neointimal venosa caracterizada por estenosis y trombosis ulterior representa la arrolladora mayoría de la patología que da origen a la falla del injerto para diálisis PTFE. A pesar de la magnitud del problema y de la enormidad del costo, actualmente no hay tratamientos eficaces para la prevención o tratamiento de hiperplasia de la neoíntima venosa en injertos para diálisis PTFE. En consecuencia, las intervenciones dirigidas a los mediadores y procesos específicos pueden dar buenos resultados en la reducción de los costos humanos y económicos tan importantes de la disfunción del acceso vascular.

Una vez que se ha presentado la estenosis, uno de los métodos actuales de tratamiento incluye la reducción u obliteración del estrechamiento y el restablecimiento del flujo sanguíneo a través del injerto (permitiendo el funcionamiento adecuado de la hemodiálisis) por medio de tratamientos no quirúrgicos basados en catéter percutáneo como puede ser angioplastia de balón. La angioplastia de balón, en un aspecto, se refiere al despliegue de un catéter balón en el sitio del bloqueo e inflar el balón para aumentar el diámetro luminar mínimo (MLD) del vaso comprimiendo el material que causa la restricción contra el interior de la pared del vaso, dilatando por este medio el vaso. Dependiendo de la longitud y gravedad de la restricción, el procedimiento se puede repetir varias veces (inflando y desinflando el balón) . Cuando se termina, el catéter balón se retira del sistema.

Aunque la angioplastia de balón se puede utilizar como un procedimiento "independiente", con frecuencia se acompaña por el despliegue de lo que se conoce como un stent. Un stent es un dispositivo de andamiaje o de soporte que se puede extender y que se coloca dentro de la vasculatura para prevenir el retroceso mecánico y reducir la oportunidad de un nuevo estrechamiento (restenosis) en el sitio de la restricción original. Los stents son "balón expandible" o "de auto-expansión" y cuando se despliegan endovascularmente, se empalman contra la pared interna del vaso . Se coloque el stent o no, esta forma de tratamiento tiene un alto riesgo de falla, es decir, el riesgo de un nuevo estrechamiento (restenosis) en el sitio del tratamiento es muy elevado. A menos que la estenosis dentro del injerto para el acceso se pueda tratar de manera eficaz y permanente, la falla del injerto tiende a seguir. En el caso de falla de injerto, el paciente tiene que someterse a un procedimiento endovascular, es decir, un procedimiento percutáneo no quirúrgico, basado en catéter, repetir la cirugía vascular, por ejemplo, trombectomía para "descoagular" el injerto o colocar otro injerto para acceso vascular o una derivación (como en ocasiones se conoce) en un sitio diferente, a menos que el paciente reciba un trasplante de riñon. Dado los problemas evidentes de repetir cirugía (s) y la disponibilidad limitada de los trasplantes, existe la necesidad de un tratamiento que sea eficaz y duradero para la prevención y tratamiento de estenosis de injerto para diálisis.

La gran mayoría de los métodos actuales para reducir o prevenir la respuesta vasculoproliferativa (considerada como la base fisiopatológica de la restenosis), se basa en opciones de tratamiento que se originen desde dentro de la vasculatura o la luz del injerto. Un enfoque actual y novedoso utiliza stents recubiertos con medicamento o impregnados con medicamento los cuales luego se despliegan dentro de la luz del vaso sanguíneo. Los ejemplos de los medicamentos que se utilizan para recubrir los stents incluyen Rapamicina disponible en el comercio de Wyeth Ayerst company (Sirolimus®) y Paclitaxel disponible en el comercio de Bristol-Myers Squibb Company (Taxol®) . En este enfoque basado en el stent, la Rapamicina o Paclitaxel se eluyen gradualmente desde el stent y se difunden hacia la pared del vaso desde la intima (la capa más interna de la pared del vaso) a la adventicia (la capa más externa de la pared del vaso) . Los estudios han demostrado que Rapamicina y Paclitaxel tienden a inhibir la proliferación de las células del músculo liso.

Se ha sugerido el suministro desde el espacio perivascular o extravascular a través de la pared arterial o vascular utilizando un material matriz sintético (copolimero de etileno-acetato de vinilo, EVA) junto con un anticoagulante que tenga también propiedades antiproliferativas como la heparina. Hay dos desventajas de este enfoque: la heparina es una sustancia soluble y desaparece rápidamente de la pared vascular y, el copolimero de etileno-acetato de vinilo no es biodegradable originando potencialmente problemas respecto a los efectos de largo plazo, in vivo.

Si se suministra un agente terapéutico localmente utilizando un sistema a base de un material matriz, el material matriz de preferencia deberá tener las siguientes características: 1. El material matriz tendrá que permitir la carga de la cantidad adecuada del agente terapéutico. 2. El material matriz debe eluir el agente terapéutico a una velocidad adecuada y bien definida . 3. El material matriz preferentemente debe poderse implantar y biodegradar. Así pues, no sería necesaria la separación física del material matriz a partir del tejido del receptor después del suministro del medicamento y evitaría aspectos relacionados con los efectos de largo plazo de la matriz residual. 4. Ni el material matriz ni sus productos de la biodegradación deben provocar una respuesta inflamatoria o proliferativa importante en el tejido, ni deben alterar o interferir con los sistemas de defensa naturales del receptor o la curación. 5. El dispositivo (que consista en el material matriz y el medicamento) debe ser muy flexible para moldear los contornos de la vasculatura, y 6. El dispositivo debe ser manejable para fijarse en el lugar evitando su migración a un lugar no propuesto .

Los materiales matriz poliméricos que se utilizan para el suministro de medicamentos dentro del contexto de los dispositivos implantables pueden ser naturales o sintéticos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a polímeros compuestos de sustancias químicas como ácido poliglicólico o polihidroxibutirato, EVA o polímeros naturales como colágeno, fibrina o polisacáridos tipo quitosana. No obstante, no todos estos materiales matriz son ideales; las características inadecuadas incluyen deficientes características mecánicas, inmunogenicidad potencial y costo. Además, algunos pueden producir productos de degradación tóxicos e inducir reacciones inflamatorias o una respuesta proliferativa.

Un material matriz biocompatible, biodegradable, y que se puede reabsorber, bien conocido, para el suministro de medicamentos es el colágeno. El uso de colágeno como material para la fabricación de dispositivos médicos biodegradables ha sido sometido y sigue siendo sometido a escrutinio. US 6,323,184, 6,206,931; 4,164,559; 4,409,332; 6,162,247. Un enfoque actual es el suministro de agentes farmacéuticos que incluyen antibióticos y proteínas con actividad fisiológica y péptidos como factores de crecimiento.

Bajo el microscopio de barrido electrónico, la matriz de colágeno tiene una morfología de película laminada, condensada, con una superficie texturizada y un intervalo de tamaños de poros. Se puede producir en una amplia variedad de tamaños de poros efectivos desde 0.001 mieras hasta 100 mieras o incluso más grandes. Esta red de poros internos (material poroso) crea una elevada área superficial y sirve como un microreservorio para el almacenamiento y suministro del agente terapéutico. Algunas peculiaridades hacen del colágeno un material matriz excelente e ideal para el suministro de medicamentos. El colágeno muestra un elevado grado de flexibilidad y durabilidad mecánica, así como capacidad intrínseca para la humectación con agua, semipermeabilidad y características de flujo consistentes. Lo que es más importante, el colágeno, una sustancia que se encuentra en la naturaleza es biodegradable y no tóxico. Además, el colágeno tiene características de biodegradación favorables y se puede modificar el tiempo para completar la degradación o reabsorción, es decir, la duración de la matriz de colágeno para el suministro de medicamentos.

Una segunda matriz de proteína conveniente para el suministro de medicamentos es la fibrina. Una matriz de fibrina está compuesta de unidades reticuladas de fibrina que son una red reticulada de moléculas de fibrinógeno modificadas con trombina. Esta matriz es muy parecida a un coágulo sanguíneo natural. Contrario al coágulo natural, el tamaño de los poros en una matriz de fibrina se puede regular y varía desde 0.001 milimicras a 0.004 milimicras, los denominados microporos. Las diferencias en los tamaños de poro entre las matrices de colágeno y fibrina permite la unión de los agentes terapéuticos con diferentes velocidades de liberación del medicamento. La capacidad para controlar la hemorragia, para permanecer firmemente fija en el lugar y por ser naturalmente biodegradables han hecho de la fibrina un buen material matriz para el suministro de medicamentos y confiere a la fibrina algunas ventajas sobre matrices sintéticas. La mayor parte de las primeras aplicaciones de fibrina como matriz fueron para el suministro de antibióticos y otros biológicos.

Las matrices de fibrina se preparan en una forma granulada anhidra. (Véase PCT/EP99/08128) . Esta formulación, fabricada por HyQ Sol elopment, Bühlmhle, Alemania, contiene D-manitol, D-Sorbit, solución acuosa de fibrinógeno y una suspensión orgánica de trombina. La formulación se fabrica por granulación en lecho fluidificado. Son múltiples las aplicaciones para la fibrina anhidra: cierre de heridas, potenciación de la curación y homeostasis. No obstante, la aplicación para el suministro de medicamentos es limitada dado que una formulación como ésta no permite una conformación orientada al objetivo de partículas sólidas alrededor de la pared del vaso y es difícil el suministro de dosis exactas. La porosidad y capacidad de las partículas de fibrina anhidras es baja, la estabilidad física es deficiente.

Otro grupo de material matriz polímero natural, que se puede reabsorber, potencialmente útil es la quitosana. La quitosana ha demostrado ser un aminopolisacárido biocompatible, útil, y una matriz para liberación controlada del agente para el suministro local. Los implantes de quitosana no provocan efectos colaterales sistémicos ni locales, ni respuestas inmunológicas, y son adecuadamente biodegradables . La quitosana se puede preparar a partir de la degradación de quitina (peso molecular 1 x 10 ) utilizando hidrólisis con hidróxido de sodio a temperatura elevada para un peso molecular de 5 x 105. La imposibilidad para controlar la porosidad es una desventaja de este material matriz.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA PRESENTE INVENCIÓN La presente invención es única en al menos dos aspectos: 1) mientras que la mayor parte de los métodos actuales para la prevención, supresión o tratamiento de la respuesta vasculoproliferativa (hiperplasia de las células del músculo liso, restenosis, oclusión vascular) lo hacen desde el interior de la luz vascular (es decir, vena y/o arteria) o el injerto, la presente invención es un método para hacerlo en forma extravascular o perivascular, es decir, desde el exterior de la luz vascular o del injerto a través de la pared vascular. 2) Todos los enfoques de tratamiento actuales son pertinentes solo después de que se ha manifestado realmente el estrechamiento o estenosis. La invención actual, en un aspecto, es un método para la prevención o supresión de la enfermedad vasculoproliferativa, contrario a su curación.

En otra modalidad, la presente invención es un dispositivo protésico que puede implantarse en la superficie externa del vaso o injerto y que luego eluye medicamentos o agentes antivasculoproliferativos como Rapamicina, Paclitaxel, Tacrólimo y otros agentes inhibidores del ciclo celular o con un funcionamiento semejante. Además de un material matriz que puede reabsorberse, por ejemplo, proteina, y un agente antiproliferativo, este dispositivo implantable contiene, como una opción, agentes que inhiben la acumulación de colágeno en las túnicas media y adventicia de la pared vascular y los farmacéuticos que ayudan a reducir la calcificación de la pared vascular. Esta invención proporciona un método para la prevención o tratamiento de hiperplasia neointimal (una expresión de la respuesta vasculoproliferativa) y la calcificación o el suministro extravascular de una cantidad eficaz de un compuesto antiproliferativo con baja solubilidad en agua solo o en combinación con adyuvantes, y otros compuestos antiproliferativos . La Rapamicina es un medicamento con propiedades antiproliferativas particularmente preferido para uso con la presente invención. Se puede utilizar una mezcla de los medicamentos convenientes. La rapamicina se difunde desde el exterior y a través de la pared del vaso y/o injerto hacia el interior de la vena y/o arteria y/o injerto. La elusión de rapamicina (y otros medicamentos con efecto antiproliferativo) hacia y a través de la pared vascular desde el exterior comienza poco después de que se implanta el dispositivo y el medicamento inhibirá la proliferación de las células del músculo liso dentro de la hemodiálisis y otros injertos vasculares y/o en sus sitios anastomóticos . Asi pues, en un aspecto, la presente invención es un método para inhibir la proliferación de las células del músculo liso de un injerto para acceso vascular o derivación por la elusión gradual o liberación sincronizada de un medicamento desde el exterior de la pared de los vasos en el sitio de acceso vascular hacia el interior del vaso, es decir, por suministro extravascular o perivascular .

En otro aspecto, la presente invención es un dispositivo protésico que consiste en una capa interior de proteina, cilindrica, embebida con un antiproliferativo y, como una opción, un soporte exterior o estructura esqueletal o capa. En una modalidad, la capa de proteina embebida es colágeno y la estructura de soporte esqueletal exterior es una lámina de PTFE.

En esta modalidad, el medicamento antiproliferativo preferentemente es rapamicina. Para la modalidad de la invención, Paclitaxel (o Taxol) es otro medicamento o agente antiproliferativo muy adecuado.

Una tercera modalidad de la presente invención es un método para inhibir la estenosis del injerto del acceso para hemodiáli'sis que consiste en el método de colocar un dispositivo protésico (antes descrito) sobre un injerto o estructura vascular y/o en el sitio de la anastomosis y anclar el dispositivo protésico en el sitio deseado (por ejemplo mediante suturación) .

Un dispositivo de esta invención puede emplear un material matriz biocompatible como colágeno, fibrina o quitosana. Un factor importante en la elección de un material matriz especifico es la porosidad del material y una velocidad de biodegradación que pueda ser controlada. El uso de un material matriz es importante porque crea un reservorio de alimentación y controla la cinética de suministro del compuesto.

Un dispositivo preferido de esta invención consiste en un material matriz de colágeno embebido con rapamicina, el cual se coloca en posición para el suministro extravascular del compuesto.

En una modalidad preferida, se combina aproximadamente 120 microgramos/cm2 de rapamicina (intervalo: 50 microgramos a 10 mg/cm2) con una hoja del material matriz de colágeno con un espesor en el estado anhidro entre 0.3 y 2.0 mm de la hoja que luego se implanta o se envuelve sobre el exterior de la pared vascular o del injerto.

Otro aspecto de la presente invención es la "auto fijación" del dispositivo que suministra el medicamento o agente a la superficie externa de la pared vascular o del injerto. El dispositivo de colágeno podría hacer más adhesivo a la pared vascular si en la etapa final el colágeno se combina con grupos foto-reactivos como FITS (isotiocianato de fluoresceína) o Rosa de bengala del proveedor Sigma Chemicals, St Lous, MO. La estimulación del dispositivo con luz ultravioleta activará estos grupos foto-reactivos y aumentará la adhesión. También se ha encontrado que el sellante fibrina y el colágeno acetilado aumentan la adhesión del material matriz de colágeno a la pared vascular externa.

Los primeros trabajos mostraron una relación entre el trauma local de los vasos y la calcificación acelerada. En fechas recientes un estudio en humanos ha mostrado que la Gla-proteina de matriz (proteina-carboxilasa dependiente de vitamina K carboxilada) se expresa constitutivamente por las células del músculo liso vascular normal y las células óseas. En tejidos de vasos ateroscleróticos se encontraron elevados niveles de mRNA de la Gla-proteina y no proteina carboxilada. Esta proteina carboxilada [sic] es necesaria para prevenir o posponer el comienzo de la calcificación vascular (Price, P. y col., "Warfarin causes rapad calcification of the elastic lamellae in rat arteries and heart valves", Atheroscler Thromb Vasc Biol, (1998) 18: 1400-1407). Estos datos indican que la calcificación causada por lesión debe ser inhibida activamente. La introducción de farmacéuticos que prevengan la acumulación de calcio ayuda a posponer la calcificación y ayuda a prevenir, suprimir o tratar los procesos vasculoproliferatxvos . En un aspecto de esta invención, el suministro local de vitamina K contrarresta el efecto de calcificación asociado con lesión de los vasos por la activación oportuna de la carboxilasa (en este caso Gla-proteina) y garantiza que otras proteínas que se unen al calcio funcionen adecuadamente y no unan excesos dé calcio (Hermann, S. M. y col., "Polymorphisms of the human matriz Gla-protein gene (MGP) vascular calcification and myocardial infarction", Arterioscler Thromb Vasc Biol., (2000) 20: 2836-2893. Es posible utilizar una mezcla de vitamina K y otros fármacos antiproliferativos .

La respuesta aguda, caracterizada por una reacción inflamatoria,- es un intento para limitar los trastornos en la homeostasis . Las señales distintivas de esta reacción inflamatoria incluyen acumulación de leucocitos, aumento en el depósito de fibrina y liberación de citocinas. La adición de glucocorticoides sintéticos tipo dexametasona disminuye esta respuesta inflamatoria y finalmente puede disminuir el proceso vasculoproliferativo . Dado que los mecanismos de acción farmacológica de los agentes antiproliferativos y los glucocorticoides sintéticos son diferentes, se puede esperar que los agentes con diferentes "mecanismos de acción" actúen de manera sinérgica. Por tanto, puede ser útil combinar dos o más de estos agentes.

Esta invención, de este modo, proporciona un método para prevenir, suprimir o tratar hiperplasia neointimal por suministro extravascular (por ejemplo peri ascular) local de una cantidad eficaz de un agente antivasculoproliferativo con baja solubilidad en agua (por ejemplo rapamicina) solo o en combinación con otros agentes antiproliferativos y adyuvantes.

En un aspecto, la presente invención es un dispositivo protésico que consiste en una matriz de proteina que se puede reabsorber combinada con un fármaco, colocado en la superficie externa de un vaso sanguíneo o injerto. El dispositivo entonces eluye el fármaco que inhibe la proliferación de las células del músculo liso (anti-vasculoproliferativo) . Los ejemplos de estos fármacos incluyen rapamicina, Paclitaxel, Tacrólimo, otros inhibidores del ciclo celular o agentes que funcionen de un modo semejante. Se puede utilizar una mezcla de medicamentos y/o aditivos convenientes. Además de la matriz de proteina reabsorbible y un agente antiproliferativo, este dispositivo implantable contiene, como una opción, agentes que inhiben la acumulación de colágeno en la pared vascular y los farmacéuticos que ayudan a reducir la calcificación de la pared vascular.

La rapamicina es un fármaco particularmente preferido para utilizarlo con la presente invención. La rapamicina [u otro(s) fármaco (s) ] eluye desde el exterior y se difunde a través del vaso y/o la pared del injerto hacia el interior de la vena y/o arteria y/o injerto. La elusión de rapamicina (o un fármaco que actúe igual o un fármaco que tenga propiedades semejantes) hacia y a través de la pared vascular desde el exterior toma lugar durante la fase de curación de los sitios anastomósicos y el fármaco prevendrá, suprimirá/inhibirá o tratará la proliferación de las células del músculo liso que acompañan tal curación. Asi pues, en un aspecto, la presente invención es un método para inhibir la respuesta vasculoproliferativa en los extremos anastomósicos de un injerto para acceso vascular o derivación por la elusión progresiva o liberación sincronizada de un fármaco desde el exterior hacia el interior del vaso, es decir, por suministro transvasvular utilizando una fuente extravascular.

En otro aspecto, la presente invención es un dispositivo protésico que consiste en una capa interna de proteina embebida con un antiproliferativo y, como una opción, un soporte exterior o estructura esqueletal o capa. En una modalidad, la capa de proteina embebida es colágeno y la estructura del material de soporte esqueletal exterior es una hoja de PTFE. El fármaco antiproliferativo, en esta modalidad, de preferencia es rapamicina u otros fármacos que funcionen del mismo modo .

Otra modalidad de la presente invención es un método para inhibir la estenosis del injerto de acceso para heme-diálisis cuyo método comprende la colocación del dispositivo protésico (antes descrito) sobre una estructura de injerto o vascular y/o en el sitio de la anastomosis y anclar el dispositivo protésico en el sitio deseado (por ejemplo por suturación) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las FIGURAS 1A, IB, 2A y 2B muestran modalidades preferidas de la presente invención.

Las FIGURAS 2A y 2B muestran otra modalidad de la presente invención en la que se emplea un soporte exterior o estructura esqueletal.

Las FIGURAS 3A-3C muestran una modalidad con auto-enclavamiento de esta invención.

La FIGURA 4 es otro ejemplo de un diseño para auto enclavamiento de la presente invención.

La FIGURA 5 muestra el dispositivo básico que se muestra en las FIGURAS 1A-1B/2A-2B e incluye un soporte o bastidor de alambre exterior que ayuda a la retención de la forma de la manga.

Las FIGURAS 6-13 muestran algunos despliegues posibles de la manga que eluye el fármaco de la presente invención en el contexto de diversas necesidades de reparación de vasos.

La FIGURA 14 muestra las velocidades de liberación de colágeno saturado con tetraciclina y rapamicina. La rapamicina se combinó con un material matriz de colágeno utilizando cuatro diferentes métodos.

La FIGURA 15 es una comparación de la inhibición del crecimiento de las células del músculo liso utilizando matrices de colágeno combinadas con diferentes agentes antiproliferativos .

La FIGURA 16 es una comparación del efecto de rapamicina, tacrólimo y tres dosis de Paclitaxel en tres dosificaciones sobre células del músculo liso humano.

La FIGURA 17 es una comparación del efecto de rapamicina, tacrólimo y tres dosis de Paclitaxel en tres dosificaciones, sobre células endoteliales humanas.

Las FIGURAS 18A, 18B, 19A, 19B y 20 muestran algunos resultados obtenidos utilizando la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente Invención es un dispositivo protésico adaptado para el suministro extravascular de un fármaco o agente, que consiste en un material matriz que eluye el fármaco o el agente combinado con un fármaco (s) que puede prevenir, suprimir o tratar la vasculoproliferación.

Materiales matriz: El material para la matriz puede proceder de fuentes naturales o puede ser fabricado en forma sintética o puede ser una combinación de las dos. Un dispositivo de esta invención puede emplear un material matriz biocompatible, biodegradable, que se pueda reabsorber como colágeno, fibrina o quitosana. También es posible utilizar una matriz no biodegradable, biocompatible, conveniente. Para el material matriz se puede seleccionar una combinación de sustancias degradables y no biodegradables o dos o más biodegradables (por ejemplo colágeno más fibrina) o dos o más sustancias no biodegradables. Un factor importante en la selección de un material matriz especifico es la porosidad del material y, según sea pertinente, una velocidad de biodegradación controlable. Las características del material matriz son importantes porque el material crea un depósito de suministro o reservorio y controla la cinética del suministro del agente. Las características con respecto al espesor, porosidad, velocidad de biodegradación, etc., no necesitan ser idénticas a lo largo de la matriz. También es posible que al crear un polímero a partir del fármaco (por ejemplo, el antiproliferativo) , la matriz y el fármaco sean uno y el mismo y, conforme se degrade el polímero éste libere el fármaco.

El colágeno (tipo I) es un material biocompatible, biodegradable y que se puede reabsorber, preferido, para la matriz de la manga que eluye el fármaco de la presente invención. La fuente de colágeno puede ser animal o humana o se puede producir utilizando las técnicas del DNA recombinante . Se pueden utilizar otros tipos de colágeno como los tipos II, III, V, XI, en forma individual o en combinación con el tipo I. Aunque la matriz de colágeno en forma de una hoja o membrana es la modalidad preferida de esta invención, también es posible utilizar otras formas de colágeno como gel, fibrillas, esponja, tubular, etc. Como es bien sabido, la velocidad a la cual ocurre la reabsorción del colágeno se puede modificar por la reticulación de la proteína.

Agentes terapéuticos : Para prevenir, suprimir o tratar la respuesta proliferativa del músculo liso que contribuye primordialmente para la hiperplasia neointimal, en esta invención se utilizarán agentes terapéuticos que tengan propiedades antivasculoproliferativas importantes. Se debe entender que, como ya se mencionó, es la proliferación del músculo liso que se considera primordialmente responsable de la estenosis y el compromiso luminar que originan la falla del injerto. No se debe interpretar que la presente invención requiere de este mecanismo de falla para su funcionamiento. Dicho de otro modo, los solicitantes no desean apegarse a ninguna teoría de falla de injerto, lo cual tendería a reducir el alcance de su invención. Los ejemplos de los fármacos con efectos antiproliferativos importantes incluyen, pero no se limitan a, rapamicina, paclitaxel, otros taxanos, tacrólimos, actinomicina D, angiopeptina, vasenoides, flavopefidol, hormonas como estrógeno, halofuginona, inhibidores de la metaloproteinasa de matriz, ribosimas, interferones y compuestos antisentido. Los análogos del compuesto precursor, por ejemplo, los de rapamicina, paclitaxel y tacrólimo también pueden utilizarse. Los ejemplos de otros agentes terapéuticos incluyen los compuestos antiinflamatorios, dexametasona y otros esteroides, agentes antiplaquetarios incluida la aspirina, clopidogrel, antagonistas de IIBIIIA, antitrombinas, anticoagulantes incluida la heparina no fraccionada y fraccionada, estatinas, bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de proteasas, alcohol, toxina botulinica y material genético. También es posible utilizar células vasculares, de médula ósea y primordiales .

Estos agentes se pueden combinar con la matriz en forma individual o en combinación. Dependiendo del agente terapéutico, el agente se puede combinar con la matriz utilizando métodos físicos, químicos y/o biológicos. Se puede utilizar una combinación de estas técnicas. También se apreciará que la concentración del fármaco no necesita ser (y con frecuencia no será) la misma a lo largo de la matriz .

Se entenderá que el proceso de elusión del fármaco a partir del material matriz (manga) a a través de la pared del vaso es solo un ejemplo de un posible proceso de suministro del fármaco. Por ejemplo, un fármaco puede ser liberado por aplicación de un estímulo o un activador, por ejemplo luz, variación de temperatura, presión, energía de ionización-ultrasonido, campo electromagnético o magnético. Asimismo/ el fármaco puede residir en la matriz como un profármaco o en una forma inactiva. La aplicación del estimulo antes mencionado activa la conversión a la forma activa del fármaco que luego se libera. Como un ejemplo de esta aplicación, se sabe que las porfirinas y psoralenos se activan y se pueden liberar de una matriz en la que estos están absorbidos o unidos, por la aplicación de luz visible o ultravioleta. La aplicación de luz modifica la estructura del fármaco provocando la asociación entre el fármaco y el reservorio o fuente de proteína que se va a romper. Así pues, el fármaco se libera de su matriz o reservorio y eluye a y a través de la pared del vaso y hacia la luz del vaso de acuerdo con esta invención.

Adyuvantes : Un dispositivo de esta invención opcionalmente incluye agentes que realicen otros objetivos, por ejemplo, que inhiban la acumulación de colágeno y ayuden a reducir la calcificación de la pared vascular. Los primeros estudios de Selye y sus colaboradores mostraron una relación entre trauma local de los vasos y calcificación acelerada. En fechas recientes, un estudio en humanos ha demostrado que la matriz Gla-proteína (proteína carboxilasa dependiente de vitamina K carboxilada) se expresa constitutivamente por las células del músculo liso vascular normales y las células óseas. En tejidos de vasos ateroscleróticos se encontraron elevados niveles de mRNA de la Gla-proteina y no proteina carboxilada. Esta proteina carboxilada es necesaria para prevenir o posponer el comienzo de la calcificación vascular (Price P. y col... "Warfarin causes rapad calcification of the elastic lamellae in rat arteries and heart valves", Atheroscler Thromb. Vasc. Biol. (1998); 18: 1400-1407). Estos datos indican que la calcificación causada por lesión debe inhibirse activamente. La introducción de farmacéuticos que prevengan la acumulación de calcio ayuda a posponer la calcificación y los procesos restenóticos . En esta invención, el suministro local de vitamina K contrarresta el efecto de calcificación asociado con lesión de los vasos por la activación oportuna de la carboxilasa (en este caso Gla-proteina) y garantiza que otras proteínas que se unen al calcio funcionen adecuadamente y no se unan a excesos de calcio (Hermann S. M. y col., "Polymorphisms of the human matriz Gla-protein gene (MGP) vascular calcification and myocardial infarction", Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (2000); 20: 2836-93). Se puede utilizar una mezcla de vitamina K junto con otros fármacos antiproliferativos .

La respuesta aguda a cualquier lesión (en este caso, trauma quirúrgico) caracterizada por reacción inflamatoria, es un intento para limitar los trastornos en la homeostasis . Las señales importantes de esta reacción inflamatoria incluyen acumulación de leucocitos, aumento en el depósito de fibrina y liberación de citocinas. Además, glucocorticoides sintéticos tipo dexametasona disminuyen esta respuesta inflamatoria y pueden disminuir finalmente el proceso restenótico. Puesto que son diferentes los mecanismos de acción farmacológica de los agentes antiproliferativos y los glucocorticoides sintéticos, se podría esperar que los agentes con diferentes "mecanismos anti-restenóticos" actúen de manera sinérgica. Por tanto, puede ser útil combinar dos o más de estos agentes.

Otros numerosos fármacos antiproliferativos y antiestenósis y otros terápicos y adyuvantes convenientes podrá tomar en cuenta un experto en la técnica a la luz de la presente descripción.

Método para preparar la manga En vista de la descripción anterior, un experto en la técnica ideará algunos procesos potenciales para fabricar el dispositivo protésico y para su aplicación.

Dispositivo individual o unicapa En una modalidad preferida de esta invención, la matriz de proteina es una hoja o membrana de colágeno bovino I y el fármaco es rapamicina. El colágeno es un ejemplo particularmente preferido para la matriz porque tiene la propiedad de ser biodegradable y reabsorbible . La durabilidad de la matriz manifiesta el tiempo para la reabsorción completa del colágeno, la porosidad influye en la capacidad de unión al fármaco de la matriz de colágeno, ambas características pueden ser controladas y modificadas. Como un ejemplo, una hoja relativamente plana de colágeno se impregna, absorbe, satura, dispersa o inmoviliza con rapamicina. Aproximadamente 120 mierogramos/cm2 (intervalo: 50 microgramos-2 miligramos/cm2) de rapamicina se combinan con el material matriz de colágeno que en la forma anhidra está en forma de una hoja de 0.3 a 2.0 mm de espesor. Esta hoja de colágena (manga) combinada con el fármaco, modificada en un tubo (cilindro) u otras formas geométricas, se asegura directamente al exterior del vaso natural, en el sitio de la anastomosis del injerto y/o sobre la vena, arteria o el propio injerto. El dispositivo se puede asegurar por suturas o grapas. El propio material de la sutura se puede combinar con un fármaco antivasculoproliferativo . En este aspecto, el agente antiproliferativo elegido permea a través de la pared del vaso, la velocidad de elusión del fármaco desde la membrana puede variar y puede continuar hasta que se reabsorbe por completo el material matriz de colágeno. Es posible utilizar tacrólimo, paclitaxel u otros taxanos, flavoperidol, compuestos antisentido, análogos de paclitaxel, rapamicina y tacrólimo, y otros adyuvantes bien conocidos para el experto en la técnica.

Dispositivo doble, dual o multicapa: En otro aspecto, la presente invención es un dispositivo protésico de capa doble que comprende una matriz interna embebida con antiproliferativo, y una estructura esqueletal o capa de soporte externa. En esta modalidad, el material matriz interno es una hoja o membrana de colágeno tipo I y la estructura del material de soporte esqueletal exterior es una hoja de PTFE. El fármaco antiproliferativo, en esta modalidad, es rapamicina. La hoja de colágeno se unirá a la hoja de PTFE utilizando diversas técnicas como las físicas con suturas, adhesivos, grapas o las dos pueden ser unidas químicamente. El compuesto de dos vainas entonces se enrollaría para crear una estructura tubular o variaciones geométricas de esta. El dispositivo o manga compuesto entonces se recorta adecuadamente para aplicarlo sobre el sitio (s) deseado: arteria, vena, sitio anastomósico del injerto, etc., y las orillas libres de la manga de PTFE se unen entre si por adhesivo, suturas, grapas, etc. Esto estabiliza todo el dispositivo en el exterior de la estructura vascular o injerto. El fármaco entonces permea a través de la pared vascular o del material protésico y cuando está en la pared el fármaco inhibe la proliferación de las células del músculo liso, una parte integrante de la respuesta de sanación que sigue a la construcción quirúrgica del injerto.

Tras la colocación en el exterior de un vaso o superficie protésica, después de un tiempo el cuerpo absorbe el colágeno dejando intacto su esqueleto o estructura de soporte exterior. Un experto en la técnica apreciará que el concepto de reabsorbible por el cuerpo de la capa de proteina elegida para embeber el fármaco es una práctica preferida opcional de la presente invención. El PTFE no siendo bioabsorbible, tiende a mantener la capa de proteina reabsorbible en el lugar durante un tiempo suficiente para que el fármaco permee a través de la pared vascular o del injerto o del material protésico. Además de ser valiosa para soportar la membrana interna o material matriz que eluye el fármaco, hay otras ventajas potenciales de la capa externa. Aunque el efecto deseado de los fármacos es su capacidad para inhibir la respuesta proliferativa de las células del músculo liso, es esta respuesta proliferativa la que contribuye a la formación de una cicatriz quirúrgica de buena calidad (firme) . Una cicatriz débil en el sitio de la anastomosis quirúrgica puede potencialmente dar origen al rompimiento del injerto o formación de aneurisma. Con un esqueleto de PTFE externo funciona como otra capa de refuerzo y dirige el tratamiento profiláctico para problemas relacionados con una cicatriz débil, el rompimiento del injerto o formación de aneurismas. La capa de PTFE externa sirve para mantener el fármaco en una posición cercana con el aspecto externo de la pared del vaso o injerto y limita su difusión a los tejidos adyacentes y la piel. También dentro del campo de aplicación de la presente invención se contempla que el aspecto del esqueleto o soporte exterior del dispositivo protésico podría ser biodegradable . Así pues, una estructura esqueletal, externa, reabsorbible, con una capa de colágeno que eluya el fármaco, interna, reabsorbible, las dos capas con la misma velocidad o diferente de degradabilidad y reabsorción, produciría una estructura vascular o de injerto cicatrizada sin la necesidad de que permanezca material extraño después del procedimiento . Un experto en la técnica comprenderá en vista de esta descripción que en esta invención es posible utilizar otros numerosos materiales como estos. Por ejemplo, para la estructura de soporte externa, el poliéster Dacron® también puede ser un material conveniente .

Otro objetivo de la presente invención es la autofijación del dispositivo a la superficie externa de la pared vascular. -El dispositivo se podría hacer más adhesivo a la pared vascular sin en la etapa final el colágeno se combina con grupos foto-reactivos como FITS (isotiocianato de fluoresceína) o rosa de bengala ambos de Sigma Chemicals, St Louis, MO, EUA. La estimulación del dispositivo con luz ultravioleta activa los grupos foto-reactivos y aumentará la adhesión. Se ha encontrado que el sellante fibrina y el colágeno acetilado aumentan la adhesión del material matriz de colágeno a la pared vascular externa.

Otra modalidad de la presente invención es un método para inhibir la estenosis del injerto del acceso para hemodiálisis que comprende el método de colocar el dispositivo protésico (antes descrito) sobre un injerto o estructura vascular y/o en el sitio de la anastomosis, y anclar el dispositivo protésico en el sitio deseado (por ejemplo por suturación) .

Las FIGURAS 1A, IB, 2A y 2B ilustran modalidades preferidas de la presente invención 1. En la FIGURA 1A se muestra una hoja rectangular de un material matriz 2 con un agente 3 de la presente invención (punteado) distribuido en esta) . La FIGURA IB ilustra otra modalidad de la invención mostrado en la FIGURA 1A en la cual se ha creado un agujero 4 en el material matriz que contiene el fármaco 3,2. Un experto en la técnica comprenderá que el diámetro del agujero 4 se ajustará para albergar el diámetro externo de cualquier estructura vascular o de injerto que pase a través de éste. En una modalidad, el diámetro del agujero 4 es de 6 milímetros.

Las FIGURAS 2A y 2B muestran otra modalidad de la presente invención en la cual se emplea un soporte exterior o estructura esqueletal o medio 5. El soporte 5 es exterior a la hoja de material matriz 2 cuando la hoja 2 se enrolla en una forma cilindrica. El medio esqueletal exterior, como puede ser politetrafluoroetileno (PTFE) y hoja de dacron son algunos de los materiales de soporte actualmente contemplados. Un experto en la técnica ideará muchos otros medios de soporte esqueletal exterior. Como se muestra, la FIGURA 2B ilustra una modalidad de la invención en la que se emplea un agujero 4 (que puede ser de diferente diámetro) .

Las FIGURAS 3A, 3B y 3C ilustran una modalidad de la invención empleando un diseño de enclavamiento en el que una orilla de la hoja rectangular que eluye el agente o material matriz enclava adyacente la orilla contraria. Más específicamente, la FIGURA 3A muestra un material matriz rectangular 2 con el agente 3 (mostrado punteado) colocado o distribuido en éste. También se muestra en la hoja que se ilustra en la FIGURA 3A una serie de muescas en forma de v 6 ubicadas aproximadamente junto a una orilla 7 del material matriz que contiene el agente. Cooperando con las muescas 6 en la orilla contraria 8 está una serie de salientes 9. Las salientes 9 tienen forma de cabeza de flecha. No obstante, en esta invención se contemplan otras combinaciones de salientes 9 y ranuras 6. Asi pues, el montaje de una modalidad de manga de la presente invención incluye enrollar la orilla 8 hacia la orilla 7 (mostrada en la FIGURA 3B) e insertar las salientes 9 en las ranuras 6. Como se muestra en la FIGURA 3C las salientes 9 han sido insertadas en las ranuras 6 desde el interior de la estructura tubular, entendiéndose que los puntos 10 de las salientes 9 sobresalen del interior al exterior de la estructura. Como se muestra, las siguientes orillas 11 de la saliente 9 cooperan con las ranuras en forma de v 6 para enclavar la estructura plana en una manga cilindrica con dimensiones vasculares 12. La manga vascular 12 además entonces define una luz 14. La luz 14 es de una dimensión vascular de modo que la superficie interior de la manga 12 esté en contacto con la superficie exterior de una estructura vascular a la cual se une la manga 12. En este modo, la manga con dimensión vascular que eluye el fármaco o agente se despliega sobre y alrededor de la estructura vascular con la cual se puede utilizar esta invención.

Las FIGURAS 4A y 4B ilustran una segunda modalidad de enclavamiento de la presente invención. En la modalidad, se utiliza una forma de tira de la presente invención. La manga que eluye el agente 16 comprende un material matriz que eluye el fármaco o el agente, alargado 17 (solo o junto con medios de soporte externos, no se muestran) . En el material matriz 17 se han creado dos candados 18 ubicados en extremos opuestos de éste. Cooperando con el candado 18 están las ventanas 19 en las cuales se insertan los candados 18 de modo que la manga 16 se despliegue contra y en el exterior de la estructura vascular operante. Como se muestra en la FIGURA 4B, el candado 18 se puede insertar en la ventana 19 desde el interior hacia el exterior. En una modalidad alternativa, el candado 18 se puede insertar en la ventana 19, desde el exterior hacia el interior de la estructura de la manga. En la FIGURA 4A también se muestra un orificio de derivación representativo 20 que incluye dos alas o aletas de contacto de la derivación 21.

La FIGURA 5 muestra otra modalidad de la presente invención en la cual se emplea un soporte de alambre o bastidor externo. El bastidor de alambre externo 20 rodea una modalidad preferida de la presente invención, es decir, un PTFE y el material matriz de colágeno recubierto con fármaco 22 colocado alrededor del vaso 24.

Las FIGURAS 6-13 muestran algunas fístulas arteriovenosas . Una manga o material matriz que eluye el fármaco de la presente invención 26 se muestra implantado, envuelto o colocado alrededor de las diferentes fístulas 32 mostradas en algunas figuras. En cada una de estas figuras las estructuras venosas están designadas 28 y las estructuras arteriales están designadas con 30. Las flechas 34 muestran la dirección del flujo sanguíneo.

Las FIGURAS 10-13 ilustran otra modalidad de la invención en la cual se utiliza un injerto, por ejemplo un injerto de PTFE 36 junto con la presente invención.

Como se muestra en la FIGURA 13, el injerto 36 puede incluir un material matriz con un fármaco o agente 36 (punteado) de esta invención.

Otra aplicación de la manga presente incluye la utilización de la capa de proteína interior embebida con el fármaco como una fuente del fármaco o reservorio de fármaco. En esta aplicación el fármaco elegido puede ser reabastecido periódicamente, por ejemplo, mediante punción de la manga con una aguja y suministrando más fármaco a este o creando un reservorio para el fármaco dentro de la manga a partir del cual éste puede eluir progresivamente .

EJEMPLOS Se proporcionan los siguientes ejemplos del dispositivo y el método de preparación de las matrices para el suministro de fármaco (s) antiproliferativo (s) y otros terápicos. Los ejemplos se establecen solo para ejemplificar y no se pretende un sentido limitante.

Ejemplo 1: Efecto inhibitorio de los diferentes agentes antiproliferativos Se colocaron matrices de colágeno prefabricadas en diferentes soluciones de fármaco antiproliferativo hasta que ocurrió saturación completa. Los fármacos antiproliferativos fueron elegidos para representar los compuestos más activos capaces de inhibir células del músculo liso y fibroblastos sin inhibir las enzimas colagenasa y elastasa. (La colagenasa y elastasa inhiben enzimáticamente la acumulación de colágeno —una causa de restenosis) . Las matrices de colágeno fueron saturadas con estos compuestos a una concentración de 25 g/mL del liofilizado, se lavaron con búfer de fosfatos 0.066 M (pH 7.4) a 37 °C durante 24 horas y se cortaron en la forma de un disco con densidad del compuesto alrededor de 5 g por cm2. Después del lavado los discos estériles de 15 mm de diámetro se colocaron en placas de cultivo de 24 pozos y se sembraron células con una densidad de 5000 por cm2. Cinco días después se midió el número de células y se evaluó la actividad enzimática en las alícuotas de medios por hidrólisis de sustratos cromogénicos y espectrofotometría . Estos datos se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1. Efecto inhibidor de los diferentes agentes antiproliferati os En esta prueba comparativa in vitro, entre los agentes probados, paclitaxel y rapamicina funcionaron del mismo modo.

Ejemplo 2: Capacidad de los diferentes tipos de matrices para la unión de rapamicina En el siguiente estudio in vitro se probó la habilidad de las diferentes matrices para unir rapamicina. Una matriz de colágeno prefabricada (BioMend, Sulzer Calcitek, Inc., o Biopatch, Ethicon Inc., conteniendo colágeno, al.ginato) con rapamicina se preparó como está descrito en el Ejemplo 1 a una concentración inicial de rapamicina de 250 Ilg/mL. Matrices prefabricadas de quitosana (utilizando la técnica descrita en: Almin, C, Chunlin, H. Juliang, B. y col., "Antibiotic loaded chitosan bar. In vitro, in vivo study of a posible treatment for osteomielitis" C Orthop pp. 239-247 (sep. 1999) y fibrina (utilizando la técnica mencionada en el Ejemplo 5) también se colocaron en 250 üg/rnL de rapamicina en solución de DMSO hasta que se observó saturación completa. Después de la evaporación del disolvente, las matrices combinadas con los fármacos se lavaron con búfer de fosfatos 0.066 M (pH 7.4) a 3 °C durante 24 horas. ' Para comparar la capacidad de las matrices, se utilizó el derivado rapamicina fluorescente cargado en la superficie de la matriz de 1.88 cm2 del mismo espesor. Después de la incubación con solución de NaCl 0.14 M, se extrajo la rapamicina residual con dimetilsulfóxido (DMSO) y se midió el producto utilizando espectroscopia fluorescente. Estos datos se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2: Capacidad de la matriz para rapamicina Como se esperaba, se encontró la capacidad de las matrices de proteína mayor que la matriz de quitosana, la utilidad de fibrina o colágeno como matriz terapéutica para suministro de fármacos antiproliferativos puede depender de la combinación específica o los componentes adicionales o los requisitos de duración de la matriz.

Ejemplo 3: Sistemas de suministro utilizando liposomas Los liposomas representan una forma de sistema de suministro de fármacos, y ofrecen liberación controlada de los agentes con actividad biológica. Estos se utilizan en formulaciones farmacéuticas especialmente para fármacos insolubles en agua. La rapamicina es un ejemplo común. El apresamiento liposomal ha mostrado tener efecto considerable sobre la farmacocinética y distribución en tejido de los fármacos administrados. Las formulaciones probadas incluyeron formulación liposomal no iónica compuesta de dilaurato de glicerilo (Sigma Chemical, St Louis, MO) , colesterol (Sigma Chemical, St Louis, MO) y polioxileno-10-estearilo (Sigma Chemical, St Louis, MO) en una relación en peso de 56:12:32 (fórmula 1) o emulsión liposomal aceite en agua, 40% hidroalcohólica, no iónica que contenia miristato de isopropilo (Sigma Chemical, St Louis, MO) y aceite mineral (Sigma Chemical, St Louis, MO) (Fórmula 2) . La rapamicina fue atrapada en cada formulación en una concentración de 250 g/mL en dimetilsulfóxido o isopropanol y los liposomas formados fueron fabricados sobre las superficies de hojas de colágeno prefabricadas para crear la densidad superficial máxima de rapamicina. Las muestras se lavaron con búfer de fosfatos 0.066 M (pH 7.4) a 37 °C durante 24 horas. Para comparar la capacidad de la matriz, se utilizaron liposomas cargados con derivado de rapamicina fluorescente colocado sobre discos de 1.88 cm2. Después de incubación con una solución de NaCl 0.14 M, las matrices con rapamicina remanente fueron extraídas con dimetilsulfóxido (DMSO) y se midió el producto fluorescente .

TABLA.3: Sistema de suministro liposomal Los sistemas de suministro liposomal no tienen ventajas importantes sobre la matriz de colágeno saturada en cuanto a la habilidad para unir rapamicina. No obstante, el enfoque liposomal puede ser útil para otros fármacos antiproliferativos .

E emplo 4 : Preparación de una película laminada de colágeno Para preparar una película de colágeno laminada, de superficie neutra, texturizada, se obtuvo una suspensión isotónica de colágeno fibrilar insoluble. Tres litros de suspensión de colágeno enfriada a una concentración de 5 a 18% (de preferencia 12%) se hinchó durante la noche en ácido acético 0.3-0.6 M (de preferencia 0.52 M) , a 4°C.

La suspensión hinchada se dispersó con 3 litros de hielo triturado durante 10-20 minutos (preferido 12 minutos) en una licuadora y después se homogeneizó durante 30 minutos en un aparato Ultra-Turrax (Alfa, Suecia) . La lechada resultante se filtró a través de una serie de filtros (Cellectro, Bélico, RU) con tamaños de poros decrecientes desde 250 m hasta 20 m [sic] , instalados en un soporte de filtro (Millipore) . Después de la desgasificación a 0.04-0.09 mbar, de preferencia 0.06 mbar, la lechada se mezcló con dos litros de MaOH 0.1-0.05 M enfriado, el pH final se ajustó a 7.4 ± 0.3. La suspensión neutralizada se puede almacenar a 4-6°C solo durante algunas horas antes de la formación de la matriz. Esta suspensión neutralizada sirve como base para la preparación de una forma saturada o dispersada de una matriz que contenga rapamicina. La lechada neutralizante puede ser colada directamente como una película húmeda con un espesor de 3 mm en una superficie hidrofóbica plana a temperatura ambiente. Se forma una película seca con un espesor de aproximadamente 60-70 m [sic] . De 3 a 5 mL de lechada cubren un área de 10 cm2. En la parte superior de esta superficie se pueden formar algunas capas. Las capas servirán como base para la preparación de la forma saturada del agente antiproliferativo sumergiendo la película de colágeno en soluciones de rapamicina, Taxol, o combinaciones de estos . La combinación simultánea de la lechada neutralizada y rapamicina u otros agentes en suspensión se puede utilizar para la preparación de la película con la forma dispersada de los ingredientes activos .

Un factor importante en la preparación del material matriz es la porosidad del portador proteínico a partir del cual se va a formar el dispositivo. La porosidad se puede regular por la velocidad de secado, temperatura y las características del colágeno inicial. La porosidad es importante porque regula la cinética de la liberación del fármaco. Se desea que la matriz sea suficientemente porosa para unir moléculas pequeñas como rapamicina (peso molecular 914.2) y muy durable para mantener la forma del dispositivo. Se sometieron a prueba muestras de la matriz de colágeno con tamaño de poro efectivo de 0.002 a 0.1 mieras. Se observó mayor capacidad de unión (para unir rapamicina en experimentos de saturación) con la matriz que tenía el tamaño de poro de 0.004 mieras. Además, las matrices de colágeno con tamaños de poro más grandes son frágiles. Dado que la capacidad de unión de la matriz al agente antiproliferativo es crucial para esta aplicación, se utilizaron tres diferentes concentraciones de rapamicina para preparar una combinación rapamicina-matriz de colágeno a partir de colágeno comercial preparado con una densidad óptima de poros . Las tres diferentes concentraciones marcadas como alta, media y baja, fueron 120 ± 5 g/cm2, 60 ± 4 g/cm2 y 30 ± 3 g/cm2, respectivamente. Ninguna de estas matrices fueron frágiles ni tuvieron distribución de rapamicina no uniforme. Las diferentes densidades permiten regular la cinética de liberación del fármaco.

Ejemplo 5: Preparación de un dispositivo matriz de fibrina implantable, combinado con un agente antiprolif rativo En general, para preparar un dispositivo a base de matriz de fibrina cargado con un agente antiproliferativo, se preparan soluciones acuosas de fibrinógeno y trombina como se describe a continuación. El fibrinógeno comercial se puede adquirir de algunos vendedores como Sigma, American Red Cross o se puede preparar a partir de plasma por las técnicas bien conocidas. De otro modo, el fibrinógeno preparado por los métodos recombinantes es conveniente para este uso. La trombina activa comercial se puede adquirir de Sigma o de Johnson y Johnson como trombina tópica USP, Thrombogen. Para preparar las soluciones de fibrinógeno y trombina que se utilizan para preparar la matriz, se miden los componentes necesarios, se pesan y disuelven en aproximadamente 900 mL de agua deionizada. Las Tablas 4 y 5 describen las composiciones preferidas que se utilizan para preparar soluciones de fibrinógeno y trombina para prefabricar la matriz, respectivamente.

El glicerol en la Tabla 4 se utiliza como plastificador . Para la presente invención también serian convenientes otros plastificadores . El búfer Tris se utiliza para ajusfar el pH. Alternativas convenientes para Tris incluyen HEPES, trizina y otras soluciones amortiguadoras con una pKa entre 6.8 y 8.3. El Tritón X-100 es un detergente no iónico y estabilizador y se puede sustituir por otros detergentes y estabilizadores. El ácido caprilico se puede sustituir por otros agentes que proporcionen protección contra desnaturalización, por ejemplo el ácido alginico.

TABLA. . Composición de la solución de fibrinogeno El fibrinogeno convertido en fibrina es el reactivo más importante en la matriz porque regula las propiedades del material matriz, como flexibilidad, tamaño de poro y densidad másica de la fibra. Estas características determinan la facilidad con la que otras moléculas pueden difundirse dentro de la matriz y el tiempo que la matriz puede permanecer intacta antes de ser reabsorbida.

En la Tabla 5 la albúmina es un estabilizador de trombina. La trombina regula la velocidad de formación de la matriz de fibrina. Se prefiere la presencia del factor XIII, pero no es necesaria. El factor XIII retícula en forma covalente la fibrina, haciendo más estable la matriz. Los iones calcio son necesarios para la activación de la trombina. El Troglitozone (Sankyo, Japón) es un derivado de tiazolidiona [sic] que disminuye la acumulación de colágeno en la pared vascular. (Yao L, Mizushige , Murakami K y col., Troglitozone decreases collagen accumulation in prediabetic stage of a type II diabetic rat model. Heart 2000: 84: 209-210.

Es preferible disolver por completo cada componente antes de adicionar el siguiente componente. Si es necesario, después de que se disuelve el último componente, se ajusta el pH a 7.0-7.4 y se ajusta el volumen de la solución a un litro con agua. Las soluciones entonces se desgasifican. Ambas soluciones se distribuyen por bomba a través de la cámara de la mezcla sobre una superficie no adherente, de preferencia hidrofóbica, para formar una película de aproximadamente 2 mm de espesor. Luego la película se seca durante aproximadamente 3 a 6 horas a temperatura en el intervalo de aproximadamente 20°C a 60°C, a una presión de alrededor de 30 Torr. La humedad residual de la película es alrededor de 10%, de preferencia menor que 3% del peso húmedo total .

Sobre esta superficie se adiciona Rapamicina sólida, anhidra para crear la densidad en el intervalo de 100 a 500 g por cm2 de película. Una segunda capa de matriz de fibrina se forma sobre esta superficie de modo que el fármaco queda intercalado entre las dos capas de fibrina.

En una modalidad de la presente invención se podría adicionar un agente antiproliferativo/antirestenósico tipo rapamicina o taxol, un fármaco anti-rechazo tipo rapamicina o tacrólimo, un fármaco antiinflamatorio y/o un oligonucleótido antisentido para potenciar los efectos antirestenósicos . Estos materiales sólidos serían adicionados para complementar el complejo fibrina-rapamicina tipo sandwich antes descrito.

Ejemplo 6: Método para reticular la matriz de quitosana Para aumentar la capacidad de unión de una matriz de quitosana para el medicamento antiproliferativo se utiliza reticulación de la fibra. 50 mL de suspensión de quitosana enfriada, con una concentración desde 10% hasta 25% (de preferencia 12%) se mezcló suave y lentamente con 5 a 25 mL de cloranhidrido de ácido acrilico [sic] durante 30 minutos para acetilar este polímero. Después de este tiempo sea adicionó una solución de rapamicina en DMSO a una concentración de 250 g/mL, se mezcló vigorosamente y se vertió sobre la superficie de la matriz de quitosana para la reticulación espontánea y formación de rapamicina conjugada. Este método, por la estructura microporosa de la quitosana, permite aumentar la capacidad de unión de la matriz desde 15% hasta 45%.

Ejemplo 7 ; Incorporación de rapamicina en la matriz de colágeno por dispersión, inmovilización e inmovilización-dispersión Además de la técnica de saturación, la rapamicina se incorporó en la matriz de colágeno por tres métodos diferentes: dispersión, inmovilización e inmovilización-dispersión.

Técnica de dispersión: se preparó una lechada acuosa de colágeno insoluble en agua utilizando colágeno de piel de bovino liofilizado, altamente purificado, anhidro, no reticulado obtenido de Elastin Product Co, Inc., (Owensville, MO) . Este colágeno y el búfer solubilizador se enfriaron a una temperatura de 2-8°C, de preferencia 4°C, y se mezcló vigorosamente para preparar la lechada de colágeno que contenia 10-21% (de preferencia 12%) de la proteina colágeno. Esta lechada contiene 9% de plastificador, 15% de glicerol o rapamicina en DMSO a una concentración de 250 g/mL y agua. La solución tuvo una viscosidad de 50, 000 cps. Inmediatamente después de mezclar con rapamicina, se adiciona 8% de glutaraldehxdo a la lechada (100-350 mL por litro de lechada) . La lechada acuosa debe ser homogénea y desgasificada, el pH se ajusta a 6.0-7.1. La solución se mezcla constantemente con agitación vigorosa y se dispersa por bomba sobre una superficie no adherente para formar una película de alrededor de 2 mm de espesor. Todos los procedimientos se llevan a cabo a una temperatura de 4°C. La película luego se seca durante aproximadamente 3-7 horas a temperaturas alrededor de 45°C, y una presión de 15 Torr hasta que su humedad residual es menor que aproximadamente 10% del peso total. La aplicación de la solución del fármaco y los pasos de secado se repiten tres veces más .

II) Técnica de inmovilización: Se realiza la misma preparación de colágeno de Elastin Product Co. Un volumen de 12% de lechada de colágeno se enfria y se combina con rapamicina por esterificación del fármaco antiproliferativo . La esterificación se lleva a cabo con N-hidroxisuccinimida 0.9 M (Pierce Biochemical, Rockford, IL) en presencia de N-diciclohexilcarbodiimida 0.9 M {Pierce Pierce Biochemical, Rockford, IL) a 2-4 °C durante 2 días. Los conjugados se preparan por titulación del éster N-hidroxisuccinimida activo de rapamicina en DMSO bajo la superficie de la suspensión de colágeno en agitación, el pH de la reacción se mantiene entre 7.0 y 8.5, de preferencia 7.8. Después del secado, las películas con la rapamicina conjugada se lavan con NaCl 0.15 M con un contenido de bicarbonato de sodio 0.02 M a un pH de 7.4. La HPLC muestra que no hay rapamicina libre en la matriz. El éster de rapamicina reacciona con los grupos amino o hidroxilo de los residuos aminoácidos formando un enlace covalente con el colágeno. Después de esta inmovilización, la rapamicina se libera como resultado de una degradación-erosión in vivo o in vitro de la matriz. Nakano y col., hacen referencia a la degradación de colágeno (SM-10500) y la reabsorción por un proceso metabólico natural en monos resus durante 6 meses. Ref: Nakano M, Nakayama Y, Kohda A y col. Acute subcutaneus toxicity of SM-10500 in rats. isoto Rinsho (reporte clínico) 1995/ 29: 1675-1699] .

Para estudiar la velocidad de liberación de rapamicina a partir de la matriz, las muestras se lavan con búfer de fosfatos 0.066 M (pH 7.4) a 37 °C durante 24 horas y se cortan para dar una forma de disco con un área de 1.88 cm2 y se colocan en placas de cultivo de 24 pozos conteniendo NaCl 0.14 M, búfer Tris 0.05 M, 0.5% de albúmina y 0.1 mg/mL de colagenasa a pH 7.0. La colagenasa se adiciona para aumentar la erosión de la matriz de colágeno y facilitar la liberación de rapamicina. De los pozos se recolectan alícuotas en diferentes intervalos de tiempo.

También se prepara una combinación de las formas dispersada y conjugada. En todas estas formas, el contenido de rapamicina es 5.0 g por cm2. Las muestras se colocan en los pozos y se adiciona 1 mL del medio de elusión que contiene suero. Se toman las alícuotas cada hora.

El contenido de rapamicina se mide de conformidad con el procedimiento de Ferron y col., (Ferron GM, Conway WD y Jusko WJ. Lipophilic benzamide and anilide derivatives as high-performan e liquid chromatography internal standard: application to sirolimus (rapamycin) determination. J. Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997; Dec703: 243-251) . Estas mediciones se hacen utilizando ensayos en lotes y, por tanto, representan velocidades de liberación a una velocidad de flujo de 0 mL/min. Los resultados se muestran en la Tabla 6 y se grafican en la Figura 14; las concentraciones del fármaco antiproliferativo están en g/mL.

Tabla 6 ; Velocidad de liberación de colágeno saturado con tetraciclina y rapamicina. La rapamicina se combinó con la matriz de colágeno utilizando 4 métodos diferentes Tiempo Colágeno Colágeno Rapamicina Colágeno Ccrobinación (hora) saturado con saturado dispersada conjugado de las tetraciclina con en el con formas rapamcina colágeno rapamicina dispersada y conjugada 1 0.06 0.01 0.01 0 0.01 2 0.4 0.05 0.03 0 0.02 3 0.96 0.09 0.06 0.01 0.07 4 0.54 0.15 0.08 0.02 0.09 5 0.15 0.19 0.12 0.05 0.17 6 0.08 0.28 0.18 0.07 0.26 Tabla 6 (Continuación) Estos datos muestran que las diferentes formas de embeber el fármaco y los fármacos con diferente solubilidad tienen distintas cinéticas. En el caso de tetraciclina con una solubilidad comparable, después de saturación de la matriz de colágeno con la base libre, la liberación máxima ocurre en un periodo de tiempo corto, mientras que para rapamicina menos soluble este máximo se pospone durante varias horas. Se ha demostrado en experimentos in vitro que el colágeno saturado con antibióticos solubles como gentamicina, cefotaxina, tetraciclina o clindamicina suministra estos antibióticos en concentraciones eficaces durante 4 días [Wackol-Drewek Z, Pfeifer M, Scholl E. "Comparative investigation of drug delivery of collagen implants saturated in antibiotic solutions and sponge containing gentamicin" (Biomaterials 1996/ 17: 1733-1738) ] . En otros laboratorios también se mostró in vivo que, el colágeno saturado con gentamicina a una concentración de 3 g/g e implantado en el tejido muscular es capaz de suministrar antibiótico a la sangre a través del dia 28 [sic].. No obstante, la concentración fue menos que óptima. (Mehta S. Humphrey JS, Schenkman DI y col., "Gentamycin distribution from a collagen carrier" J Orthop . Res., 1996; 14: 749-754). En teoría, si se conoce la concentración baja de colagenasa en el espacio perivascular y el flujo bajo del fluido perivascular (solo algunos mililitros por día) un material matriz saturado con rapamicina podría producir in vivo la cinética del suministro, lo cual soportaría la concentración local eficaz del fármaco antiproliferativo durante un periodo de varias semanas para prevenir y combatir el avance de la proliferación de las CML. Las concentraciones inhibitorias para CML serían en el intervalo de 0.001 hasta 0.005 g/mL de medios de cultivo. Estos niveles se cumplen o exceden in vitro durante 3 semanas. Además, la rapamicina dispersada en la matriz de colágeno puede mostrar un efecto antiproliferativo durante un mes o más. Por último, las formas conjugada y combinada pueden soportar el tratamiento hasta la erosión completa de la matriz .

Ejemplo 8: Actividad biológica de rapamicina en la matriz de rapamicina-colágeno El parámetro más importante cuando se evalúa la combinación de rapamicina y colágeno es la inhibición del crecimiento de las células del músculo liso (CML) . Para evaluar este parámetro, las CML a una densidad de 5000 células por cm2 se siembran sobre una superficie de cultivo tisular control y matrices de prueba (Tabla 7) . Las curvas del crecimiento celular se representan en la Figura 15.

La actinomicina D se libera rápidamente de la matriz del fármaco y suprime el crecimiento celular solo durante un periodo de tiempo corto. Un cambio de medios retira la actinomicina soluble y después de varios lavados no está presente, ningún antibiótico en los medios ni en la matriz. Como resultado, las células comienzan a proliferar como es normal. Debido a una liberación progresiva, lenta de rapamicina, la supresión del crecimiento celular continuará a lo largo del periodo de observación.

Tabla 7 : Comparación de la inhibición del crecimiento de las células del músculo liso utilizando matrices de colágeno saturadas con actinomicina D y rapamicina Número de células Ejemplo 9 Dos diferentes tipos de matrices, colágeno y fibrina, combinadas con diferentes agentes antiproliferativos (en forma individual o en combinación) junto con la vitamina K se adicionan al medio de cultivo celular en diferentes proporciones. Se siembran las células a la misma densidad, el día 5 se mide el número de células viables por el ensayo de azul de Alamar. Los datos se presentan en la Tabla 8.

Tabla 8: Inhibición del crecimiento celular (%) Ejemplo 10: Efecto antiproliferativo de la combinación de rapamicina y heparina combinadas en una matriz de colágeno Los efectos antiproliferativos de diferentes componentes combinados dentro de una matriz pueden mostrar sinergia. Se utiliza una combinación de rapamicina dispersada, heparina soluble e inmovilizada. Para inmovilizar la heparina, se mezclan 5 mL de solución enfriada de heparina en una concentración de 1 mg/mL a 10 mg/mL (de preferencia 5 mg/mL) con 5 a 20 mL (de preferencia 11.4 mL) de cloranhidrido de ácido acrilico a la tasa de aproximadamente 1 L por min (de preferencia 2.5 L por min) . Después de la adición, se agita la mezcla durante 30 minutos a una temperatura de 4-8 °C. El colágeno heparinizado se lava intensamente con salina amortiguada con fosfato de sodio pH 7.4. Se utiliza un ensayo colorimétrico con eosina A para determinar la concentración de la heparina inmovilizada en la matriz. Utilizando este método, se puede ligar covalentemente a la matriz entre 0.01 mg/cm 2 y 0.1 mg/cm2.

Una combinación como esta combinada con rapamicina tiene efecto inhibidor sobre el crecimiento de las CML en cultivos si se adiciona en forma de dispersión en el medio a una proporción 1:100, mientras que las formas individuales tienen menores efectos; la relación 1:25 para heparina sola a 1:65 para rapamicina dispersada. Cada uno de estos fármacos puede mostrar restenosis por diferentes mecanismos, de aquí que es razonable esperar el efecto sinérgico cuando se utiliza en combinación. La heparina también se puede utilizar en una forma saturada en la matriz en combinación con antiproliferativos .

Ejemplo 11 El suministro local sostenido de dexametasona en combinación con rapamicina (u otros agentes antiproliferativos) se puede utilizar para inhibir simultáneamente la restenosis asi como reacciones inflamatorias. Se prepara una lechada de colágeno al 20% (peso/peso) , a la cual se adiciona una suspensión al 25 (peso/peso) de dexametasona. Esta mezcla se asperja sobre una superficie de plástico para formar la película. El espesor final de la película abarca desde 1.92 hasta 2.14 mm (promedio 2 mm) . Esta hoja es flexible y mecánicamente estable. La cinética de la elusión de dexametasona a partir de la matriz (colágeno más rapamicina) se caracterizó en un sistema in vitro. Hojas de 15 mm de diámetro se colocaron en los pozos y se sumergieron en 2.5 mL de solución amortiguada de fosfatos. En los puntos de tiempo que abarcaban desde los días 1 hasta 7, la concentración de dexametasona en las alícuotas del búfer para elusión se midió por espectrofotometrí . Se confirmó por HPLC la estabilidad química, de la dexametasona a lo largo del proceso de formación de la hoja, almacenamiento en el estado anhidro y elusión. La elusión acumulada in vitro de la dexametasona se muestra en la Tabla 9.

Más de 50% de la elusión de dexametasona ocurrió en el transcurso de los primeros 3 días, con una desnivelación de las curvas de elusión después de 6 días. La dexametasona puede prevenir respuesta inflamatoria grave, la cual es máxima durante este periodo y puede actuar en forma sinérgica con rapamicina para reducir restenosis. Contrario a un stent que eluye dexametasona, el suministro perivascular no inhibe la regeneración de las células endoteliales y actúa directamente sobre los fibroblastos y las células del músculo liso.

Tabla 9: Elusión acumulada in vi ro de dexametasona a partir de una matriz de colágeno Ejemplo 12 La combinación de la macro y microporosidad puede aumentar la capacidad del dispositivo. Matrices de colágeno y fibrina se mezclaron para obtener una combinación como esta. Además, las buenas características mecánicas del colágeno mejoraron la estabilidad de fibrina. Para preparar la matriz cargada con fibrina-rapamicina (densidad de rapamicina 150 ug/cm ) se utilizaron las composiciones descritas en las Tablas 4 y 5. Después de la formación de la primera capa anhidra de fibrina, se formó la segunda capa de colágeno, rapamicina y heparina como se describe en el Ejemplo 4 (densidad de rapamicina de 128 ug/cm , densidad de la heparina 5000 U/cm2) . Las vainas de colágeno fibrina cargadas con medicina (espesor 2 mm) se formaron como estructuras tubulares y se reticularon externamente utilizando alta concentración de glutaraldehído (25%) durante un minuto. Después del secado se preparó la forma espiral de la manga como se muestra en la Figura 4. Esta manga se hizo plana en 10 ocasiones, la forma de espiral se restableció cada vez. La capacidad de la rapamicina de la manga final fue de 143 ug/cm2. La elusión in vitro de la heparina continúa durante 7 días.

Se midió la concentración de heparina como en el Ejemplo 10, la solución amortiguadora para la dilución se reabasteció cada dia. Los datos se muestran en la Tabla 10.

Se sabe que la concentración eficaz de heparina para inhibir la proliferación de las CML es en el intervalo de 100 u/mL. En este ejemplo, la heparina puede inhibir significativamente la proliferación de las CML durante al menos 4 dias. Además de la difusión de la forma de la heparina la manga puede prevenir episodios trombóticos en la superficie interna de la derivación y las paredes de los vasos dañados durante periodos de tiempo más prolongados. Además, la concentración de heparina soluble puede aumentarse hasta 20,000 unidades/cm2 sin cambiar las características mecánicas de la matriz. Por tanto, se puede prolongar el efecto antiproliferación de las células del músculo liso asi como los antitrombóticos .

Tabla 10: Perfil de la elusión de heparina a partir de una matriz de colágeno combinada con rapamicina y heparina Ejemplos 13 y 14: Comparación del efecto in vitro de rapamicina, tacrólimo y paclitaxel en las células del músculo liso y endoteliales humanas Se sembraron células de músculo liso y células endoteliales humanas (Clonetics, EUA) (100,000 células) en placas de 24 pozos durante la noche. Ambos tipos de células fueron crecidos y se mantuvieron en OPTI-MEM (Gibco, Long Island, NY) y 5% de suero bovino fetal en una atmósfera de 5% dióxido de carbono y 95% de aire atmosférico. Las células se expusieron a un intervalo de concentraciones de rapamicina (10-100 nM) , paclitaxel (0.1-10 iriM) y tacrólimo (10-10 nM) . Cada tipo de célula se dejó crecer durante 24 horas, las 3 últimas 4 horas en presencia de [ H] -timidma . Se cuantificó la proliferación de las células como nueva síntesis de DNA utilizando el ensayo de captación de [3H] -timidina. Después de 72 horas de cultivo, las células se lavaron dos veces con salina amortiguada con fosfatos fria (PBS) y 1 mL de metanol se adicionó a los contenidos de cada pozo, las placas se mantuvieron a 4°C durante 60 minutos, luego se lavaron las células una vez con PBS fría y 500 microlitros de NaOH 0.2 M [sic] se adicionaron a cada pozo y las placas se mantuvieron a 4°C durante 30 minutos. El contenido de cada pozo fue transferido a viales para centelleo y se adicionó el líquido de centelleo para cuantificar la radioactividad utilizando un contador de centelleo líquido y los resultados se expresan como cuentas por minuto .

Los resultados se muestran en las Tablas 11 y 12 y las Figuras 16 y 17 correspondientes, respectivamente. Rapamicina y Paclitaxel inhiben la proliferación de las células de músculo liso y endoteliales humanas (nueva síntesis de DNA) . El tacrólimo parece inhibir preferentemente nueva síntesis de DNA en las células de músculo liso humanas, escaseando en células endoteliales . Este efecto diferencial puede ser extremadamente importante y se puede explotar benéficamente si se utilizara tacrólimo para la inhibición de la proliferación de las células del músculo liso.

Tabla 11: Comparación del efecto de rapamicina, tacrólimo y paclitaxel (tres dosis) en células de músculo liso humanas Ensayo de captación de [¾] -timidina P Promedio {p DE) No tratado 17434 (1822) (control) Rapamicina 6498 (245) 0.01 tacrólimo 11995 (1850) 0.05 Paclitaxel 2421 (206) 0.001 Paclitaxel 2527 (195) 0.001 Paclitaxel 2710 (162) 0.001 Tabla 12: Comparación del efecto de rapamicina, tacrólirno Y paclitaxel (tres dosis) sobre células endoteliales humanas Estudios en animales Se realizó una prueba del estudio utilizando un modelo porcino. Se estudió un total de 6 cerdos, dos se utilizaron como controles y 4 fueron tratados. Un injerto vascular de PTFE, de 6 mm, fue anastomosado entre la arteria carótida en un lado y la vena yugular contralateral, esto creó un bucle arteriovenoso (AV) semejante en construcción al bucle de acceso para hemodiálisis en humanos. Se colocó una manga de colágeno combinada con una dosis conocida de rapamicina (aproximadamente 500 microgramos/cm ) alrededor del extremo distante del injerto vascular de PTFE muy próximo a la anastomosis venosa en el grupo tratado .

Después de 30 dias se realizó un angiograma para demostrar la permeabilidad del paso y el injerto. Los animales fueron sacrificados y se disecaron los segmentos pertinentes. El efecto inhibitorio de rapamicina sobre el progreso del ciclo celular se considera que es por la inducción de los inhibidores de ciclina. De aquí que, la expresión de p21 aumentará en los tejidos obtenidos de los animales tratados con rapamicina pero no de los controles. En otras palabras, la presencia de p21 es la confirmación de que el efecto observado se puede atribuir a la rapamicina. Se obtuvieron los tejidos de los animales tratados y no tratados, se preparó RNA y se llevó a cabo el método con la transcriptasa inversa para obtener cDNA, el cual se amplificó para el gen de mantenimiento (house keeping) b-actina y p21 por PCR.

Resultados Ambos controles tuvieron estrechamiento luminar causado por hiperplasia neointimal grave en el sitio de la anastomosis venosa (Figura 18A y 19A) . Los cuatro animales tratados tuvieron mucho mayor permeabilidad luminar de la vena y el injerto, con hiperplasia neointimal mínima o ausente (Figuras 18B y 19B) . Se observó expresión de mRNA de p21 en tejido venoso en el sitio perianastomótico obtenido de los animales tratados con rapamicina (Figura 20) pero no de los animales control . Esto demuestra que la rapamicina contenida en la matriz de la manga fue responsable de la reducción/casi anulación de la hiperplasia neointimal (una expresión de la respuesta vasculoproliferativa) un efecto mediado a través de la inhibición inducida por rapamicina de la proliferación celular.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la prevención o tratamiento de enfermedades vasculoproliferativas en estructuras vasculares, el cual comprende los pasos de: administrar extravascular y localmente una cantidad eficaz antiproliferativa de un agente antiproliferativo para la estructura vascular.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente consiste en rapamicina.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente proliferativo se administra por via perivascular .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la administración extravascular, local se lleva a cabo por medio de una manga vascular, perivascular, que eluye el agente antiproliferativo, y puede ser implantada, la manga consiste en un material matriz embebido con el agente.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la manga es prácticamente circunvascula .

6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el material matriz consiste en fribrina.

7. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el agente consiste en rapamicina y heparina.

8. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el material matriz consiste en colágeno .

9. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el material matriz consiste en quitosana .

10. Una manga perivascular que administra el agente antiproliferativo y puede ser implantada, adaptada para colocarse en contacto con el exterior de una estructura vascular, comprende: a) un material matriz que eluye el agente, bioabsorbente, cilindrico, flexible, el material tiene una luz de tamaño vascular que pasa prácticamente a través del material matriz, el material matriz tiene dispersado en este: b) un agente antiproliferativo.

11. La manga de la reivindicación 10 que además incluye un medio de soporte, el medio se coloca circunferencialmente alrededor del exterior del material matri .

12. Un método para tratar enfermedades vasculoproliferativas en sitios de acceso para hemodiálisis el cual comprende los pasos de: administrar extravascular y localmente una cantidad antiproliferativa eficaz de un agente antiproliferación en el sitio de acceso.

13. Un método para suprimir la respuesta vasculoproliferativa en una estructura vascular, el método comprende el paso de: la administración vascular extravascular y local de una cantidad eficaz antiproliferativa de un agente antivasculoproliferativo a la estructura vascular.

14. Un método para tratar hiperplasia de las células del músculo liso (CML) en estructuras vasculares el cual comprende el paso de: administrar extravascular y localmente una cantidad anti CML eficaz de un agente anti-CML a la estructura vascular.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la estructura vascular es un sitio de acceso para hemodiálisis .

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la estructura vascular es un injerto vascular.

17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la estructura vascular es un sitio anastomósico para el injerto .

18. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la estructura vascular es una vena .

19. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la estructura vascular es un conducto venoso o sitio anastomósico.

20. Un método para la prevención o retardo de la falla de un sitio de acceso para hemodiálisis mediante la administración extravascular y local de agentes que previenen, suprimen o tratan la respuesta vasculoproliferativa o hiperplasia de CML.

21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el modo de la falla del acceso vascular para hemodiálisis se selecciona del grupo que consiste en trombosis, infección, reacción a cuerpos extraños, angostamiento luminar u oclusión de los sitios anastomósieos, estrechamiento u oclusión de la vena, arteria o conductos protésicos .

22. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque la administración extravascular, local del agente se lleva a cabo suministrando el fármaco desde una manga que eluye el fármaco colocada en contacto con el sitio de acceso.

23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la manga se coloca en contacto con el sitio de acceso por las técnicas de aseguramiento seleccionadas del grupo que consiste en suturación, engrapado, encolado o utilizando un mecanismo de autoenclavamiento .

24. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque el agente que se utiliza para prevenir, suprimir o tratar enfermedad vascular hiperproliferativa se selecciona del grupo que consiste en rapamicina o análogo de rapamicina, paclitaxel, análogo (s) de paclitaxel, otros taxanos, tacrólimo, análogo (s) de tacrólimo, actinomicina D, dexametasona, esteroides, heparina fraccionada, heparina no fraccionada, inhibidores de la metaloproteinasa, flavoperidol, antólogos humanos, células de médula ósea, vasculares, heterólogas, otras células, células primordiales, células humanas genéticamente modificadas, antagonistas de IIBIIIA y antibióticos.

25. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la manga se fabrica de polímeros naturales o sintéticos que sean biodegradables .

26. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la manga se fabrica de colágeno tipo I .

27. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la manga consiste en fibrina.

28. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la manga consiste en quitosana.

29. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque la manga consiste en un material bxodegradable.

30. El método de la reivindicación 22, caracterizado porgue la manga consiste en un material no biodegradable.

31. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el fármaco se combina con el material matriz de la manga utilizando el método seleccionado del grupo que consiste en saturación, dispersión e inmovilización.

32. El método de la reivindicación 23, caracterizado porque la sutura que se utiliza para asegurar la manga que eluye el fármaco al sitio de acceso se recubre con un fármaco antiproliferativo .

33. Un aparato para la administración local de agentes para la prevención o retardo de la falla de un sitio de acceso vascular para hemodiálisis .

34. El aparato de la reivindicación 33 que contiene un material matriz de colágeno formado combinado con un fármaco, el material matriz se forma en la configuración de una espiral.

35. El aparato de la reivindicación 34 con una característica de enclavamiento .

36. Un aparato que contiene un injerto vas combinado con uno. o más fármacos antiproliferativos .